Riarrangiamenti del gene NTRK nei tumori solidi

TEST E TERAPIE TARGET IN ONCOLOGIA

Riarrangiamenti del gene NTRK nei tumori solidi Il primo modello di test e di terapia target “agnostica” A cura di Nicola Normanno e Carmine Pinto

Test e terapie target in Oncologia

Riarrangiamenti del gene NTRK nei tumori solidi Il primo modello di test e di terapia target “agnostica” A cura di Nicola Normanno e Carmine Pinto

Prima edizione ottobre 2021 © 2021 Il Pensiero Scientifico Editore Via San Giovanni Valdarno 8, 00138 Roma Tel. (+39) 06 862821 - Fax (+39) 06 86282250 pensiero@pensiero.it www.pensiero.it - www.vapensiero.info www.facebook.com/PensieroScientifico twitter.com/ilpensiero www.pinterest.com/ilpensiero Tutti i diritti sono riservati per tutti i Paesi Stampato in Italia da Ti Printing S.r.l Via delle Case Rosse 23, 00131 Roma Impaginazione e copertina Doppiosegno S.n.c.

Immagine in copertina © iStock by Getty Images Coordinamento editoriale Bianca Maria Sagone e Martina Teodoli ISBN 978-88-490-0719-0 Il progetto è stato realizzato grazie al supporto di

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Autori

CURATORI Nicola Normanno SC Biologia Cellulare e Bioterapie Istituto Nazionale Tumori IRCCS Fondazione G. Pascale Napoli

Carmine Pinto UO di Oncologia Medica Comprehensive Cancer Centre AUSL-IRCCS di Reggio Emilia

AUTORI Enrico Berrino Dipartimento di Scienze Mediche Università degli Studi di Torino Anatomia Patologica FPO-IRCCS Istituto di Candiolo Torino Benedetta Ferro Centro di Diagnostica Molecolare Oncologica, Università degli Studi di Chieti-Pescara Stefano Fogli Unità di Farmacologia Clinica e Farmacogenetica Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale Università degli Studi di Pisa Antonio Marchetti Centro di Diagnostica Molecolare Oncologica, Università degli Studi di Chieti-Pescara Caterina Marchiò Dipartimento di Scienze Mediche Università degli Studi di Torino Anatomia Patologica FPO-IRCCS Istituto di Candiolo Torino

Maria Paola Pasciuto Centro di Diagnostica Molecolare Oncologica, Università degli Studi di Chieti-Pescara Giancarlo Pruneri Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori Anatomia Patologica, Università degli Studi di Milano Andrea Sartore Bianchi SS Oncologia Clinica Molecolare Grande Ospedale Metropolitano Niguarda Dipartimento di Oncologia ed Emato-Oncologia Università degli Studi di Milano Claudia Zampacorta Centro di Diagnostica Molecolare Oncologica, Università degli Studi di Chieti-Pescara

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Indice

Introduzione IX Nicola Normanno, Carmine Pinto 1.

I riarrangiamenti dei geni NTRK e il loro significato biologico 1 Enrico Berrino, Caterina Marchiò Introduzione 1 Descrizione dei prodotti di fusione che coinvolgono i geni NTRK1, NTRK2 e NKTR3 in ambito oncologico 2 Impatto sui metodi di identificazione di fusioni di NTRK 4 Impatto su algoritmi diagnostici 8 2.

Il significato agnostico e la prevalenza nelle diverse sedi tumorali 11 Antonio Marchetti, Benedetta Ferro, Maria Paola Pasciuto, Claudia Zampacorta Introduzione 11 Agnosticismo e prevalenza nei tumori solidi 12 Carcinoma della tiroide 17 Carcinoma del colon-retto 19 Carcinoma del polmone non a piccole cellule 21 Sarcomi, tumori pediatrici e tumori stromali gastrointestinali 24 Lesioni melanocitarie di Spitz e melanoma 28 Tumori del tratto bilio-pancreatico 30 3.

Metodiche di analisi e algoritmo diagnostico 35 Giancarlo Pruneri Introduzione 35 Metodi di valutazione delle fusioni dei geni NTRK 37 Algoritmo diagnostico 43 4.

I farmaci NTRK inibitori 49 Stefano Fogli Introduzione 49

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

Proprietà farmacodinamiche Proprietà farmacocinetiche Reazioni avverse Interazione tra farmaci Meccanismi di resistenza

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Le fusioni di NTRK come bersaglio terapeutico nei tumori solidi 61 Andrea Sartore Bianchi Introduzione 61 Gli inibitori di TRK approvati per utilizzo clinico 62 La resistenza farmacologica acquisita e i nuovi inibitori in grado di superarla 66 Impatto dei farmaci TRK inibitori 68

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Introduzione

Questo terzo volume della collana Test e terapie target in Oncologia, “Riarrangiamenti del gene NTRK nei tumori solidi.

Il primo modello di test e di terapia target agnostica”, viene pubblicato in una fase di profonda innovazione per la profilazione genica e le terapie a target molecolare dei tumori. Per la prima volta dall’inizio dell’era dell’Oncologia di precisione abbiamo a disposizione sia un target molecolare, quale i riarrangiamenti del gene NTRK, che farmaci attivi nei pazienti con qualsiasi tipo di tumore che presenti queste alterazioni molecolari, che introducono il concetto di strategia terapeutica “agnostica”, cioè indipendente dalla sede e dall’istotipo della neoplasia. Nel nostro Paese l’Agenzia Italiana del Farmaco (AIFA), con pubblicazione della Gazzetta Ufficiale del 7 settembre del 2021, ha riconosciuto la rimborsabilità e l’innovatività di due farmaci con indicazione agnostica “per il trattamento di pazienti adulti e pediatrici affetti da tumori solidi che presentino una fusione di geni del Recettore TirosinChinasico Neurotrofico (Neurotrophic Tyrosine Receptor Kinase, NTRK), che abbiano una malattia localmente avanzata, metastatica oppure nel caso in cui la resezione chirurgica possa determinare una severa morbidità, e che non dispongano di opzioni terapeutiche soddisfacenti”.

Si apre uno scenario completamente nuovo che richiede insieme: 1) l’approfondimento e lo sviluppo delle conoscenze e delle evidenze biologiche e cliniche; 2) la definizione dei criteri e delle modalità di selezione dei pazienti oncologici da testare per questo target molecolare e quindi per l’indicazione al trattamento con i farmaci già disponibili e rimborsabili dal nostro Sistema Sanitario Nazionale (SSN); e 3) l’identificazione dei più adeguati test da utilizzare nell’ambito di appropriati percorsi diagnostico-terapeutici.

In questo volume verranno passati in rassegna i riarrangiamenti dei geni NTRK ed il loro significato biologico, descri-

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

vendo la struttura dei geni NTRK, le alterazioni genomiche che determinano la formazione di fusioni e gli effetti delle proteine di fusione sui meccanismi di trasduzione del segnale. Si affronterà la tematica del significato di biomarcatore agnostico, della prevalenza delle fusioni di NTRK nei diversi tumori solidi dell’adulto e dell’età pediatrica e delle implicazioni che ne derivano sia dal punto di vista diagnostico che terapeutico.

Le metodiche di analisi e l’algoritmo diagnostico verranno descritti in maniera analitica riportando i vantaggi e gli eventuali svantaggi delle diverse tecnologie diagnostiche impiegate per l’individuazione delle fusioni di NTRK. Questi elementi, che sono anche alla base delle linee-guida e delle raccomandazioni internazionali, sostengono la proposta di un algoritmo diagnostico da utilizzare nella pratica clinica.

I farmaci NTRK inibitori saranno descritti nelle caratteristiche farmacologiche, evidenziandone le specificità, e quindi verranno analizzate le attuali conoscenze sui principali meccanismi di resistenza acquisita individuati. Verranno poi illustrati i risultati dei principali studi clinici attualmente disponibili che hanno valutato l’efficacia di inibitori di NTRK con approccio agnostico nei tumori solidi dell’adulto e dell’età pediatrica, analizzando in maniera sistematica i dati di efficacia e di tollerabilità considerati sia globalmente che per le singole neoplasie.

Inizia per la pratica clinica una nuova fase con una strategia e un approccio “agnostico” nella cura dei tumori, ma questi nuovi orizzonti aprono anche rilevanti problematiche, a cominciare dai percorsi per garantire l’accesso dei pazienti al test e quindi, quando richiesto, ai farmaci già disponibili.

I riarrangiamenti del gene NTRK devono essere testati di default nei tumori “rari” dell’adulto e dell’età pediatrica per i quali queste alterazioni molecolari sono presenti con elevata frequenza. Le fusioni di NTRK sono inoltre già incluse nei pannelli di next generation sequencing (NGS) impiegati in quelle neoplasie, quali l’adenocarcinoma del polmone ed i carcinomi delle vie biliari, per le quali, come riportato nelle raccomandazioni internazionali, è richiesta una profilazione molecolare estesa per la scelta del trattamento dei pazienti con malattia avanzata. Per le altre neoplasie, è indispensabile un’attenta e appropriata valutazione nell’ambito dei gruppi multidisciplinari per valutare quali pazienti sottoporre al test

Introduzione

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per le fusioni di NTRK, ed in quest’ambito un ruolo rilevante avrà sempre di più la strutturazione istituzionale dei Molecular Tumor Board (MTB) nell’ambito delle Reti Oncologiche Regionali. Per quanto riguarda l’approccio diagnostico, lo screening mediante immunoistochimica seguito da eventuale conferma molecolare appare la strategia più adeguata per i tumori a bassa frequenza, mentre le tecniche di biologia molecolare sono indicate nei tumori ad alta frequenza e nei casi in cui sia appropriata una profilazione genomica estesa.

Tutti questi argomenti e criticità verranno sviluppati in questo terzo volume della collana Test e terapie target in Oncologia, che nella nostra intenzione potrà contribuire ad implementare una cultura e un percorso comune nella nuova fase “agnostica” dell’Oncologia di precisione che oggi stiamo affrontando.

Nicola Normanno, Carmine Pinto

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1.

I riarrangiamenti dei geni NTRK e il loro significato biologico ENRICO BERRINO, CATERINA MARCHIÒ

Introduzione Definizione di gene di fusione Un gene di fusione rappresenta l’unione di unità cistroniche differenti, inizialmente indipendenti, che danno origine a un gene ibrido. Questo gene di fusione, sottoposto ai normali processi di trascrizione e traduzione, codificherà per un prodotto proteico chimerico con caratteristiche funzionali legate ai domini espressi.1 Un gene di fusione può formarsi a seguito di un evento genetico di riarrangiamento cromosomico, sia esso bilanciato o sbilanciato. Tra queste alterazioni, le più diffuse sono: • traslocazione: trasferimento di segmenti di DNA tra differenti cromosomi, solitamente bilanciato; • inserzione: aggiunta di un segmento di DNA in una nuova posizione interstiziale, intra- o inter-cromosomica; • inversione: rotazione a carico di un segmento cromosomico di 180 gradi, che ne comporta l’inversione di sequenza; • delezione interstiziale: delezione di un segmento cromosomico, con perdita di materiale genetico.2 Come conseguenza di queste modificazioni, porzioni di genoma inizialmente distanti vengono appaiate originando cromosomi derivati. In tal senso, un gene di fusione costituito dal locus genico A e dal B può essere associato a una deregolamentazione dell’espressione di uno o di entrambi i geni coinvolti. Il meccanismo classico prevede la presenza di sequenze regolatorie di uno dei due partner di fusione che controllano l’espressione del secondo gene coinvolto (figura 1.1).3 Un risultato alternativo dei riarrangiamenti cromosomici è la formazione di un gene tronco, con conseguente aploinsufficienza o isoforme dominanti-negative.

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

Partner genico al 5’ 5’

Porzione 3’ del gene NTRK1/ NTRK2/NTRK3 3’ 5’

5’

3’

Gene di fusione I geni NTRK sono “promiscui”: diversi partner genici sono stati descritti

3’

Gene di fusione «in-frame»

Trascrizione 5’

3’

Traduzione

Espressione della proteina chimerica

Figura 1.1 Rappresentazione schematica della formazione dei geni di fusione coinvolgenti i geni NTRK1/2/3. Diversi partner di fusione sono descritti (porzione al 5’) per i geni NTRK (porzione al 3’ coinvolta nella fusione). Quando il gene di fusione è “in-frame” avviene trascrizione e traduzione in proteina TRK chimerica che può essere espressa nel nucleo, nel citoplasma e/o sulla membrana citoplasmatica. Nella figura sono presenti in basso a sinistra due esempi di casi con fusione confermata a livello molecolare (pannello NGS targeted, a RNA) che presentano espressione citoplasmatica e di membrana (campione di carcinoma del colon a sinistra) oppure nucleare (campione di adenocarcinoma del polmone a destra).

Questi riarrangiamenti portano solitamente alla formazione di due possibili geni di fusione (A-B e B-A) dei quali solo uno genera un trascritto che mantiene il frame di lettura.2

Descrizione dei prodotti di fusione che coinvolgono i geni NTRK1, NTRK2 e NKTR3 in ambito oncologico Nella patologia tumorale, aberrazioni cromosomiche possono indurre la formazione di numerosi geni di fusione.4 Nell’ottica della medicina di precisione, le fusioni che coinvolgono i geni NTRK1, NTRK2 e NTRK3 hanno acquisito importanza a seguito dell’approvazione di inibitori di TRK con indicazione agnostica (cioè indipendenti dal tipo di lesione e dalla sede tumorale) diretti contro le proteine chimeriche da essi generate.5-8 I geni NTRK (neurotrophic tyrosine receptor kinase) codificano per proteine con dominio tirosin-chinasico della famiglia delle chinasi neurotrofiche correlate alla tropomiosina (TRKA, TRKB e TRKC), che espletano la funzione di recettori della neurotrofina e sono fisiologi-

I riarrangiamenti dei geni NTRK e il loro significato biologico

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camente coinvolte nello sviluppo neuronale. Queste proteine di membrana sono costituite da un dominio extracellulare che coordina il legame con il ligando, una regione transmembrana e il dominio intracellulare, che svolge la funzione chinasica. La polimerizzazione (solitamente oligo-dimerizzazione) dei recettori ne induce la fosforilazione causando l’attivazione di vie di trasduzione del segnale che regolano la proliferazione, la differenziazione e la sopravvivenza fisiologica nelle cellule nervose e, in caso di espressione aberrante, nelle cellule neoplastiche.9 10 La funzione di tali proteine si svolge principalmente durante lo sviluppo delle sinapsi neuronali e nei processi legati alla memoria. Il picco di espressione presente durante il processo di embriogenesi è seguito da un’espressione sitospecifica nelle cellule somatiche adulte, essenzialmente concentrato al sistema nervoso, dove queste proteine regolano la propriocezione e una serie di risposte al dolore e all’appetito. In ambito patologico a seguito di eventi ischemici, è stata riportata la riattivazione della codifica di queste proteine.9 L’espressione non controllata e derivata da alterazioni geniche è un evento driver in ambito neoplastico.11 Se da una parte le mutazioni puntiformi dei tre geni sono piuttosto frequenti, ma con un impatto limitato e parzialmente sconosciuto nei processi oncogenetici,12-14 dall’altra le meno frequenti fusioni geniche rappresentano meccanismi chiave dell’attivazione patologica delle proteine TRK.15 La struttura di base di questi trascritti chimerici è fortemente mantenuta: la parte al 5’ della fusione contiene una regione regolatoria di un gene trascrizionalmente forte che modula l’espressione di tutto il costrutto che al 3’ presenta la sequenza codificante il dominio tirosin-chinasico delle proteine TRK. Sebbene gli eventi cromosomici e i partner di fusione siano molto eterogenei, questa struttura chimerica si ripropone, provocando sovraespressione di proteine con il dominio chinasico di TRK costitutivamente attivato.15 I partner di fusione noti sono più di 50, con punti di rottura (breakpoint, punti di congiunzione tra i geni) vari. Indipendentemente dal partner, queste proteine chimeriche svolgono la loro attività oncogenetica tramite l’attivazione a valle di alcune vie di segnalazione, tra cui la via della proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK) e la via PI3K/AKT.16-18 I tumori che presentano fusioni dei geni NTRK1/2/3 si possono suddividere in due categorie a seconda della prevalenza delle alterazioni: tumori in cui tali fusioni sono definibili patognomiche e tumori a bassa prevalenza, in cui i riarrangiamenti dei geni NTRK sono ascrivibili a eventi rari. La fusione tra il gene ETV6 e NTRK3, che induce over-espressione e attivazione della proteina TRKC, rappresenta l’alterazione driver nel >95% dei carcinomi secretori della mammella e delle ghiandole salivari.17 19 20 La prevalenza di questa fusione è inoltre alta nel fibrosarcoma congenito e nei nefromi mesoblastici cellulari, mentre la stessa coppia di geni ma con punti di fusione differenti è stata riportata frequentemente nella leucemia mieloide acuta.21 Per quanto riguarda le neoplasie a bassa frequenza, una pletora di neoplasie molto più comuni in termini di frequenza quali il carcinoma polmonare, il mela-

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noma, il carcinoma del colon-retto, il tumore bilio-pancreatico e molti altri presentano una prevalenza media sotto l’1% (circa 0,3%).22 Nonostante ciò, recenti studi hanno dimostrato che queste fusioni si identificano con maggior frequenza in lesioni prive di altri driver oncologici, come ad esempio le mutazioni dei geni RAS e RAF, o in un contesto somatico di alta instabilità microsatellitare per i carcinomi del colon.23-25 Questo tipo di informazione, unito all’approvazione agnostica dei farmaci a bersaglio molecolare indirizzati contro le fusioni dei geni NTRK, può influenzare significativamente le metodiche e gli algoritmi diagnostici di identificazione dei pazienti potenzialmente candidabili al trattamento con TRK-inibitori.

Impatto sui metodi di identificazione di fusioni di NTRK Le fusioni geniche possono essere identificate sulla base di differenti molecole, a partire dal DNA tramite analisi di sequenza o ibridazione fluorescente in situ (FISH), passando per l’RNA analizzabile tramite sequenziamento o metodiche di PCR quantitativa associata alla retro-trascrizione (qRT-PCR) per arrivare alla valutazione del prodotto peptidico con l’immunoistochimica.

Immunoistochimica Questa metodica che sfrutta il legame antigene-anticorpo può essere utilizzata per identificare l’espressione di proteine TRK (riarrangiate o meno). Esistono anticorpi specifici per le proteine TRKA e TRKB, o anticorpi pan-TRK che identificano antigeni comuni tra le tre differenti proteine.13 26 27 Questi ultimi sono i più utilizzati perché permettono uno screening dei tre geni con una sola reazione.

Diversi parametri permettono di valutare la qualità della reazione. L’utilizzo di controlli positivi è imperativo vista la scarsa espressione di TRK in tessuti dell’adulto (figura 1.2). In tale contesto si possono utilizzare linee cellulari tumorali portatrici di fusioni note (ad esempio linee KM-12, MO91 e CUTO-3.29) oppure campioni di tessuto nervoso o campioni di appendice che presentino delle terminazioni neuronali periferiche.28 29 L’espressione di proteine TRK chimeriche nelle cellule tumorali varia dal nucleo, al citoplasma e alla membrana citoplasmatica (figura 1.1).8 Per quanto riguarda la localizzazione del segnale di positività, vi sono evidenze riguardo a una certa specificità associata al tipo di partner genico,27 30 31 tuttavia il solo risultato di immunoistochimica non può essere utilizzato come diagnosi definitiva della presenza di un riarrangiamento a carico di uno dei geni NTRK. Sebbene la maggior parte degli studi abbia dimostrato una sensibilità molto elevata (vicina al 100%) e una buona specificità,27 30 31 una quota di campioni tumorali che risultano positivi in immunoistochimica non presenta una fusione di NTRK. La

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Campione di tessuto cerebrale Espressione fisiologica delle proteine TRK

Core di TMA come controllo esterno

Linea cellulare KM12 Espressione della proteina TRKA chimerica codificata dal gene di fusione TPM3-NTRK1

Figura 1.2 Esempi di espressione delle proteine TRK evidenziati da reazioni di immunoistochimica su tessuti. In questi esempi è stato utilizzato un anticorpo pan-TRK su sezioni di tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina. È messo in evidenza un controllo esterno dato da un core di tessuto effettuato con TMA (Tissue Micro-Array), che possono anche essere multipli. Esempi di controlli positivi utilizzabili nella pratica clinica sono campioni di tessuto cerebrale (in alto), dove è presente espressione fisiologica delle proteine TRK anche nel tessuto dell’adulto. In alternativa, si possono utilizzare linee cellulari di tumori che presentano una fusione a carico di uno dei geni NTRK: in questa immagine è messa in evidenza la colorazione citoplasmatica nella linea cellulare di carcinoma del colon KM12 (fusione in-frame TPM3-NTRK1).

presenza di over-espressione di queste proteine è solo suggestiva della presenza di riarrangiamenti a carico dei geni, che necessitano di una validazione strutturale,26 pertanto l’immunoistochimica deve essere utilizzata come un approccio “a doppio step”, dove ogni campione identificato come positivo viene valutato dal punto di vista molecolare per confermare o meno la presenza di una fusione genica a carico di uno dei tre geni NTRK. Una problematica associata all’approccio immunoistochimico è la presenza di positività diffusa nel tessuto nervoso, e quindi in patologie tumorali di derivazione neuronale. Stesso scenario si ha nelle lesioni tumorali che presentano una differenziazione neuroendocrina. In tali contesti l’uso dell’immunoistochimica non è consigliato perché non sarebbe un efficace screening, identificando troppe lesioni positive e potenzialmente portatrici di fusione. Infine, sempre riguardo alla performance di tale metodica, si è notato come fusioni che coinvolgono i partner di NTRK3 presentino una localizzazione nucleare e una colorazione sostanzialmente più debole rispetto al segnale intenso e citoplasmatico dei riarrangiamenti dei geni NTRK1/2,27 31 con un più alto tasso di reazioni falso positive.

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

FISH La metodica di ibridazione in situ fluorescente è applicata per la determinazione di altri prodotti di fusione in ambito diagnostico, tra i quali i riarrangiamenti dei geni ALK, ROS1 e RET. La metodica si basa sull’utilizzo di sonde break-apart, cioè sonde che cadono su uno dei geni target del test diagnostico che risultano in un unico segnale fluorescente in situazioni di mancato riarrangiamento o in segnali separati in caso di fusione genica.32 33 La positività del test è definita se i segnali vengono identificati in almeno il 10-15% delle cellule analizzate.32 34 La metodica FISH, così come l’IHC, non permette l’identificazione del partner di fusione. La metodica FISH può avere un ruolo nei contesti di fusione ETV6-NTRK3 patognomonica di quelle rare istologie citate, mentre è sconsigliato l’utilizzo come metodica di screening perché vi sarebbe la necessità di effettuare analisi in parallelo per ogni singolo gene (NTRK1/2/3) per ciascun caso con un alto carico di lavoro. qRT-PCR La metodica di PCR quantitativa associata alla retro-trascrizione si basa sulla formazione di cDNA in vitro partendo dall’RNA estratto dalla sezione in analisi.

La metodica permette di individuare le reali fusioni dei geni NTRK1/2/3 e i partner ad essi associati, ma solo per il numero e il tipo di fusioni definite a priori.

Questo impedisce l’individuazione di fusioni con partner non noti o associate a punti di rottura alternativi.35 La qRT-PCR si è rivelata essere piuttosto sensibile e specifica nell’ambito delle fusioni dei geni NTRK1/2/3, con un numero minimo necessario di molecole alterate molto basso. Come nel caso della FISH, l’impiego della PCR quantitativa può essere legato all’identificazione di fusioni note in patologie ad alta prevalenza, oppure come metodo ortogonale di validazione della IHC,36 tenendo però in considerazione che le multitarget RT-PCR disponibili permettono di identificare solo fusioni note definite a priori nel disegno dei primer.

L’approccio con qRT-PCR riduce l’informatività spaziale della fusione, così come la sua reale espressione, ed è inoltre strettamente dipendente dalla qualità dell’acido nucleico (RNA) estratto dal campione, solitamente molto frammentato in campioni d’archivio.

Sequenziamento massivo parallelo basato su pannelli genici targeted a RNA L’acido nucleico “RNA” può essere substrato di metodiche di analisi di fusione più ampie. In particolare, per i geni di fusione sono stati sviluppati pannelli genici per il sequenziamento di nuova generazione (next generation sequencing, NGS) o sequenziamento massivo parallelo (massive parallel sequencing, MPS).

Sebbene metodiche di valutazione dell’RNA totale siano state applicate,37 l’au-

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mentata fattibilità metodologica dei pannelli multigenici mirati ha incrementato la loro diffusione.38 Tali pannelli si basano su protocolli di preparazione dei campioni che si differenziano in: • metodiche a cattura, nelle quali sonde specifiche catturano e arricchiscono le sequenze dei geni selezionati;39 40 • metodiche ad ampliconi, basate su PCR multiple.41 42 In questo ultimo protocollo sono stati sviluppati protocolli ad ampliconi standard, che amplificano e sequenziano solamente le regioni predefinite e, in caso delle fusioni, solo i riarrangiamenti noti, e metodiche con PCR ad ancora (AMP) che permettono l’individuazione di partner di fusioni a priori non noti tramite l’utilizzo di adattatori semi-funzionali.43 In particolare, quest’ultima chimica di preparazione del campione è stata impiegata in studi sia su casistiche retrospettive che su ampie coorti prospettiche, le quali hanno dimostrato che le metodiche di sequenziamento a RNA richiedono materiale di partenza di alta qualità, testato e controllato per i parametri di quantità e frammentazione.44 Metodiche e chimiche differenti richiedono input eterogenei: questo suggerisce di modulare il tipo di approccio alla tipologia di campione, al fine di selezionare il corretto work-flow di analisi. Oltre alle caratteristiche preanalitiche, è importate definire quale sia il reference range, cioè il numero e il tipo di fusioni identificabili con un saggio.

Sequenziamento massivo parallelo basato su pannelli genici targeted a DNA Tutte le metodiche che sfruttano il DNA come molecola bersaglio per l’individuazione di fusioni geniche si basano su protocolli di preparazione del campione a cattura, che sfruttano l’abilità di esche molecolari nel catturare regioni specifiche del genoma.45 Tali metodiche, che richiedono spesso un input di DNA molto elevato, hanno dato origine a pannelli specifici molto diffusi nello studio delle patologie tumorali. Tra questi, il pannello di MSK-IMPACT permette la valutazione simultanea di SNVs, indel, CNV e fusioni di circa 400 geni onco-relati.31 Per quanto riguarda i geni NTRK1/2/3, il pannello copre alcune regioni introniche ed esoniche dei geni NTRK, anche se la dimensione di numerosi introni, superando il limite massimo catturabile dalle sonde (circa 25 kb), non è analizzabile. Questo aumenta il rischio di risultati falsi negativi per regioni non catturate e di conseguenza non coperte. Inoltre, l’identificazione di un riarrangiamento a livello genomico non rappresenta una prova certa della reale espressione del potenziale prodotto di fusione.46 Tecnologia NanoString La tecnologia NanoString si basa sulla lettura di un codice fluorescente digitale, la cui chimica lavora tramite coppie di sonde, e permette la misurazione di-

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retta degli analiti (DNA o RNA) mediante la rilevazione di centinaia di molecole uniche in una singola reazione. La metodica non richiede enzimi o preparazione di librerie per eseguire il test.47 Nel contesto delle fusioni geniche è disponibile un pannello a 64 sonde che definisce la presenza di 35 fusioni note (compresi i geni NTRK1/2/3), oltre alla possibilità di personalizzare il pannello con un disegno specifico. Nonostante l’alta qualità della metodica, non sono stati sviluppati studi che sfruttano questa tecnologia per la valutazione dei riarrangiamenti dei geni NTRK.

Impatto su algoritmi diagnostici La presenza di metodologie di identificazione estremamente variegata, sia per tipo di processo sperimentale che per l’output del dato, richiede una definizione ben precisa del flusso diagnostico e del processo atto alla definizione della positività o negatività relativa alle fusioni dei geni NTRK1/2/3.

Nel 2019, il gruppo di lavoro Precision medicine and translational research dell’ESMO, dopo un’attenta revisione della letteratura, ha definito un albero decisionale cohort-driven, cioè strettamente dipendente dal tipo di casistica che deve essere analizzata.8 In un contesto di semplice validazione di una predefinita fusione di ETV6-NTRK3 in quelle rare neoplasie dove tale fusione è alterazione patognomonica, metodiche robuste come qRT-PCR e FISH sono preferibili a una metodica meno specifica come l’immunoistochimica. In questo caso, pannelli a DNA o RNA, pur mantenendo lo status di metodo gold standard, possono risultare eccessivi anche a causa del rapporto costi/benefici.

In un contesto di popolazione non selezionata deve essere effettuata una prima valutazione, l’approccio bi-decisionale è correlato alle metodiche, alle competenze e alle risorse a disposizione. Per ottimizzare sensibilità e specificità, è consigliato a priori un approccio molecolare con pannelli a RNA (quando questo è definito di buona qualità) o a DNA. Questa scelta deve essere ottimizzata come approccio di screening sulla base del tipo e della dimensione del prelievo e contestualizzata all’input di acido nucleico richiesto. La validazione tramite IHC della presenza della proteina chimerica è consigliata, visto che è la proteina chimerica il bersaglio farmacologico, anche se questa conferma non è richiesta per la prescrivibilità del farmaco.

In mancanza di una metodica genomica in prima istanza, per lo screening la scelta dovrebbe ricadere sull’immunoistochimica, data la sua ampia diffusione e la semplicità di applicazione. Tutti i casi valutati come positivi, e potenzialmente quindi anche i casi con colorazione “aspecifica”, richiederebbero una validazione molecolare, generando un work-flow a due fasi, ma riducendo il numero di casi testati con i saggi a DNA o RNA (anche esternalizzabili).

I riarrangiamenti dei geni NTRK e il loro significato biologico

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

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11

2.

Il significato agnostico e la prevalenza nelle diverse sedi tumorali ANTONIO MARCHETTI, BENEDETTA FERRO, MARIA PAOLA PASCIUTO, CLAUDIA ZAMPACORTA

Introduzione L’oncologia mutazionale ha rivoluzionato, negli ultimi anni, il concetto di terapia in ambito neoplastico permettendo la nascita di un nuovo paradigma diagnostico-terapeutico. In questo contesto è nato il concetto di terapia antitumorale con farmaci agnostici: si tratta di una scelta terapeutica che prevede l’utilizzo di farmaci sulla base della mutazione driver che caratterizza la neoplasia.

L’indicazione terapeutica diviene, quindi, indipendente dalla sede e dal tipo di tumore e strettamente guidata dal profilo mutazionale.

L’evoluzione dell’oncologia di precisione con trattamenti agnostici è stata resa possibile dal recente sviluppo di nuove tecnologie come il sequenziamento di nuova generazione (NGS), oltre che dai progressi in campo genomico che hanno permesso una profilazione genica del tumore in grado di guidarne l’approccio terapeutico. Nell’ambito di questo nuovo paradigma in oncologia, gli aspetti istologici e morfologici del tumore sono integrati e arricchiti dalle informazioni ottenute grazie alla profilazione genomica. Il dato mutazionale, quindi, resta da integrarsi necessariamente con i dati morfologici e istologici, dei quali rappresenta, però, un’ulteriore importante chiave di lettura nell’ambito di una caratterizzazione a tutto tondo della neoplasia.

L’iter che ha condotto a questa nuova definizione degli schemi terapeutici in ambito oncologico è partito dal cosiddetto “modello istologico” secondo il quale la localizzazione del tumore e la sua definizione istopatologica guidavano, in ogni sua parte, la strategia terapeutica; giungendo a un vero e proprio “modello mutazionale” il quale, grazie all’evoluzione di molecole a impatto agnostico, è centralizzato sulla profilazione genomica come fulcro del piano terapeutico a completamento delle informazioni ricavate dalla morfologia istopatologica.1 In tal senso, la genomica, in particolare quella agnostica, ha permesso di sviluppare un modello centrato sul paziente e sulle caratteristiche genotipiche della

12

RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

neoplasia così da ottenere piani terapeutici sempre più personalizzati e, conseguentemente, efficaci.

Agnosticismo e prevalenza nei tumori solidi Il concetto di agnosticismo in oncologia trova piena realizzazione nell’ambito delle neoplasie a più elevata prevalenza, nelle quali, seppur in piccole percentuali, possono riscontrarsi mutazioni potenziali bersagli molecolari di farmaci agnostici. Si tratta di neoplasie di frequente riscontro nelle quali raramente si osserva la presenza di alterazioni geniche per cui sarebbe possibile un trattamento mirato ed efficace ma che non vengono routinariamente analizzate per tali mutazioni, restando al di fuori delle nuove prospettive diagnostico-terapeutiche in ambito oncologico.

In queste forme tumorali si rende necessaria l’applicazione del nuovo paradigma diagnostico-terapeutico che apre alle neoplasie con mutazioni geniche rare la possibilità di terapie a bersaglio molecolare con prospettive di qualità di vita e sopravvivenza del tutto nuove per i malati oncologici.

Naturalmente, trattandosi di mutazioni che, seppur presenti anche nei tumori più diffusi, ne rappresentano solo una piccola quota, è di primaria necessità rendere possibile lo studio genico su un elevato numero di pazienti contemporaneamente, anche ricorrendo ad approcci innovativi come, ad esempio, l’applicazione di test immunoistochimici su Tissue Micro Array (TMA), al fine di applicare nella pratica clinica il concetto di screening delle mutazioni rare in ambito oncologico.2 Per gli approcci metodologici e gli algoritmi diagnostici, si rimanda al prossimo capitolo.

Nell’ambito dell’oncologia mutazionale e della terapia agnostica un esempio emblematico è rappresentato dalle fusioni dei geni NTRK (neurotrophic tyrosine receptor kinase): mutazioni driver e potenziali bersagli farmacologici, presenti trasversalmente alle differenti forme tumorali. Questa particolare caratteristica delle fusioni di NTRK di essere indipendenti dalle diverse istologie tumorali, non comune tra le mutazioni driver, rende i geni NTRK modelli paradigmatici di indicazione al trattamento con farmaci agnostici in oncologia.

I riarrangiamenti di questi geni hanno una peculiare doppia modalità di distribuzione: la prima, ad alta frequenza nell’ambito di alcune neoplasie molto rare, la seconda con frequenze estremamente minori nel contesto di tumori molto diffusi. Tra le forme tumorali rare frequentemente mutate per i geni NTRK vi sono il fibrosarcoma infantile, il mesonefroma congenito, il carcinoma mammario secretorio e l’analogo di tale neoplasia a livello delle ghiandole salivari (figura 2.1).

Il concetto di agnosticismo, tuttavia, si applica soprattutto a quelle tipologie tumorali di più comune riscontro in cui la mutazione dei geni NTRK risulta meno frequente.

Il significato agnostico e la prevalenza nelle diverse sedi tumorali

13

Melanoma 3,70% Sarcoma dei tessuti molli 4,02%

Glioma 1,16%

Condrosarcoma 8,30%

Tiroide 20%

Tumore fibroso solitario 50%

Mammella 25%

Ghiandole salivari 37%

Figura 2.1 Frequenza di fusione dei geni NTRK nei tumori più rari. Modificata da Westphalen et al.6

Analisi su larga scala di tipo retrospettivo applicate a un programma di screening genomico sono state effettuale presso il Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC, NY, USA) con lo scopo di studiare l’incidenza, la distribuzione e il contesto genomico delle fusioni di NTRK nelle differenti forme tumorali. Si tratta, in particolare, di due studi condotti rispettivamente da Solomon et al. nel 2019 e da Rosen et al. nel 2020.3 4 Lo studio condotto nel 2019 dall’équipe di Solomon ha coinvolto 33.997 pazienti per un totale di 38.095 campioni, individuando 87 pazienti con fusioni dei geni NTRK (0,25%).

Nelle forme tumorali più comuni la prevalenza di NTRK è risultata compresa tra il 5,08% per le neoplasie delle ghiandole salivari e lo 0,13% per il carcinoma mammario invasivo. È stato, inoltre, osservato che fusioni dei geni NTRK appaiono mutualmente esclusive rispetto alle mutazioni driver di più comune riscontro, quali KRAS, BRAF, NRAS ed EGFR.3 Dal successivo studio condotto nel 2020 da Rosen et al., su una coorte di 26.000 casi appartenenti alla stessa coorte di riferimento di Solomon et al., sono emerse 76 fusioni di NTRK con una prevalenza complessiva dei riarrangiamenti dei geni NTRK dello 0,28%. È stato osservato, inoltre, che tumori NTRK-mutati mostrano

14

RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

un carico mutazionale (TMB) generalmente basso, fatta eccezione per i carcinomi del colon-retto con instabilità dei microsatelliti (MSI-H).4 Da entrambi gli studi è emerso che l’eterogeneità tumorale, punto di forza della terapia agnostica in ambito oncologico, può rappresentare un elemento di criticità nei trial clinici in quanto le coorti oggetto di studio potrebbero non risultare rappresentative della popolazione di riferimento (referral bias).

Dati simili erano stati ottenuti nel 2019 anche in uno studio condotto da Gatalica et al. su 11.502 campioni tessutali valutati mediante NGS con un pannello di 592 geni che ha permesso l’analisi di 53 fusioni geniche. Dei casi analizzati, 31 sono risultati positivi per fusioni di NTRK (0,27% dell’intera coorte). Le più comuni mutazioni rilevate, concordemente con i risultati di altri studi, sono state ETV6/NTRK3 e TPM3/NTRK1.5 Nel 2021, Westphalen et al. hanno compiuto un fondamentale passo avanti verso l’ampliamento della coorte oggetto di studio, con lo scopo di limitare le conseguenze di bias di selezione e quindi produrre dei risultati quanto più possibile validi nella pratica clinica.6 Si tratta del più grande studio prodotto sui riarrangiamenti di NTRK1, 2 e 3 nell’ambito dei tumori solidi. Westphalen et al. hanno, infatti, raccolto dati provenienti da una popolazione di 295.676 pazienti, in età adulta e pediatrica, con differenti forme neoplastiche a partire da un database di FoundationCORE® (Foundation Medicine Inc., Cambridge, MA, USA). Lo scopo dello studio era quello di valutare la prevalenza dei riarrangiamenti dei geni NTRK, la coesistenza di alterazioni a carico di altri driver oncogenici e l’associazione con differenti partner di fusione, tipologie e istologie tumorali. Sono stati rilevati 889 (0,3%) casi positivi per fusioni di NTRK corrispondenti a 45 differenti tipi tumorali per un totale di 134 differenti sottotipi istologici. Nella popolazione adulta (>18 anni) la prevalenza dei tumori positivi alla fusione è risultata pari a 0,28%; in quella pediatrica pari a 1,34% con il picco di incidenza (2,28%) nei bambini al di sotto dei 5 anni di età. Negli adulti, le forme tumorali con maggiore prevalenza di fusioni di NTRK sono risultate: il tumore delle ghiandole salivari (2,43%), i sarcomi dei tessuti molli (1,27%) e i tumori della tiroide (1,25%) (figura 2.2). Inoltre, tutti i tumori positivi alla fusione di NTRK sono stati analizzati per tipologia tumorale e rispettiva frequenza di fusione NTRK. Il non-small cell lung cancer (NSCLC) è risultato essere il più comune tumore degli adulti con mutazione di NTRK con un totale di 136 casi, di cui 95 costituiti da adenocarcinomi, seguito dai tumori mammari (117 casi di cui 71 carcinomi non altrimenti specificati e 42 carcinomi duttali invasivi), sarcomi dei tessuti molli (79 casi di cui 37 sarcomi non altrimenti specificati e 13 liposarcomi), carcinoma del colon-retto (CRC) (77 casi di cui 73 adenocarcinomi del colon) (figura 2.3).6 Nel dettaglio, sono stati rilevati 88 possibili riarrangiamenti con differenti partner di fusione di cui 58 (65,9%) mai riscontrati prima. Tra questi ETV6NTRK3 è risultata la fusione più comune sia tra gli adulti (78/295 casi: 26,4%) che

Il significato agnostico e la prevalenza nelle diverse sedi tumorali

Colangiocarcinoma 0,20% CRC 0,22%

Vie biliari 0,22%

NSCLC 0,24%

Cervice 0,17%

Pancreas 0,17%

15

Stomaco 0,16%

Ghiandole salivari 2,43%

Melanoma 0,24%

Esofago 0,24% CUP 0,26% Sarcoma di Ewing 0,28% Ovaio 0,31% Sarcoma dei tessuti molli 1,27%

Sarcoma osseo 0,32% Vescica 0,34% Glioma 0,34% Utero 0,35% Angiosarcoma 0,36%

Tiroide 1,25%

Mammella 0,39% Leiomiosarcoma 0,47%

GIST 0,56%

Sarcoma uterino 1,01%

Rabdomiosarcoma 0,63%

Figura 2.2 Prevalenza delle fusioni dei geni NTRK nei tumori nella popolazione adulta. Modificata da Westphalen et al.6

tra i bambini (17/52 casi: 32,7%) per un totale di 95 casi su 349 (27,2%), seguita da TPM3-NTRK1 (21,5%) e LMNA-NTRK1 (9,5%) (figura 2.4).6 Una peculiarità riscontrata è che raramente mutazioni di NTRK coesistono con mutazioni come quelle di KRAS, APC, TP53 e PIK3CA. Le fusioni di NTRK appaiono essere mutualmente esclusive anche con i più comuni driver tumorali (EGFR, ERBB2, RET, ALK, MET), in particolare nella mammella, nel colon e nel polmone. Un altro aspetto degno di nota è il rapporto con il carico mutazionale del tumore che è risultato simile nei tumori con e senza fusioni di NTRK, soprattutto nel NSCLC, risultando invece aumentato nei carcinomi del colon-retto NTRK-fusion-positive.6 Un ulteriore approfondimento dello studio di Westphalen et al. è stato il confronto tra i propri risultati e quelli ottenuti nell’ambito dei trial clinici di fase I e II volti a validare la sicurezza ed efficacia di entrectinib in pazienti con tumori solidi in stadio avanzato o metastatici positivi alle fusioni di NTRK (ALKA-372001, STARTRK-1, STARTRK-2).7-10 Ciò con lo scopo di confermare la validità dei risultati ottenuti nella popolazione generale. I pazienti di età adulta del database

2,03

1,69

1,36

1,02

1,02

1,02

1,02

1,02

1,02

0,68

0,68

0,68

0,68

0,68

IRF2BP2 (N=6)

PEAR1 (N=5)

BACN (N=4)

ARHGEF11 (N=3)

LRRC71 (N=3)

PLEKHA6 (N=3)

STRN3 (N=3)

EML6 (N=3)

SQSTMI1 (N=3)

KIRREL1 (N=2)

ACO1 (N=2)

GATAD2B (N=2)

ERC1 (N=2)

TFG (N=2)

TPR (N=17)

5,76

10,17

22,03

26,44

NSCLC

NTRK1 NTRK2

0,60

0,60

Utero Sarcoma uterino

0,80 0,60

Salpingi

1

Vie biliari

Stomaco

1 1

GIST

1,30 1,10

Leiomiosarcoma Colangiocarcinoma Testa-collo

1,90 1,60

Endometrio

2,20

Esofago

Vescica

2,30 2,20

Prostata Melanoma

3,40 2,50

Tiroide Pancreas

4,10 3,50

Glioma

4,20

Ghiandole salivari

CUP

Ovaio

CRC

Sarcoma NOS

Mammella

4,80

9,30

9,60

%

LMNA (N=30)

TPM3 (N=65)

ETV6 (N=78)

14,10

16,40

16 RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

Figura 2.3 Prevalenza delle differenti tipologie tumorali nell’ambito di tutti i tumori positivi alle fusioni dei geni NTRK nella popolazione adulta. Modificata da Westphalen et al. 6

NTRK3

%

Figura 2.4 Principali partner di fusione dei geni NTRK nella popolazione adulta riportati per frequenza. Modificata da Westphalen et al.6

17

Il significato agnostico e la prevalenza nelle diverse sedi tumorali

FoundationCORE sono stati comparati con gli 11 gruppi di pazienti positivi alle fusioni di NTRK coinvolti nei tre trial clinici. Ne è emerso che la frequenza dei pazienti con sarcoma, NSCLC, carcinomi pancreatici, colangiocarcinomi e carcinomi endometriali è risultata simile nelle due coorti. Al contrario, la frequenza di carcinoma secretorio della mammella è risultata maggiore nella coorte di pazienti coinvolti nei trial clinici, con ogni probabilità per via di bias di screening.

Tendenza opposta è stata dimostrata dai tumori mammari, del colon-retto e ovarici. Similare nei diversi studi è risultata la distribuzione per sesso e per età.10 Nella tabella 2.1 è riportata la frequenza delle fusioni di NTRK nei tumori solidi a maggiore prevalenza o in assoluto più studiati per questo marcatore.

Tabella 2.1 Prevalenza delle fusioni dei geni NTRK nei tumori più comuni nell’ambito degli studi citati ISTOTIPO

Westphalen et al.

(2021) (n=290.431)

Rosen et al.

(2020) (n=26.312)

n

%

Carcinoma delle ghiandole salivari

35/1440

2,43%

12/227 5,29% 13/256 5,08%

Sarcoma NOS

79/6216

1,27%

9/770

Carcinoma della tiroide

29/2314

Sarcoma uterino

5/5494

Carcinoma mammario Melanoma Adenocarcinoma polmonare Tumori del tratto biliare

%

/

/

1,17% 13/1915 0,68%

1/478

0,2%

1,25%

10/451 2,22% 13/571 2,28%

4/70

6%

1,01%

2/174

1/478

0,2%

1/769

0,1%

19/8028

0,24%

136/56440 0,24%

%

1,15%

n

/

%

Gatalica et al.

(2019) (n=11.502) n

117/30075 0,39%

n

Solomon et al.

(2019) (n=33.997)

/

3/3775 0,08% 6/4458 0,13% 5/932

0,54% 4/1125 0,36%

/

6/3658 0,16% 9/3993 0,23% 4/4073

7/3150

0,22%

2/553

0,36%

2/787

0,25%

/

Carcinoma del colon-retto

77/34590

0,22%

8/2306 0,35% 9/2929 0,31% 2/1272

Adenocarcinoma pancreatico

28/16769

0,17%

4/1315 0,30% 5/1492 0,34%

/

/ 0,1% / 0,2% /

Carcinoma della tiroide Tra le forme tumorali ad alta prevalenza in cui è possibile riscontrare la fusione dei geni NTRK è riportato il carcinoma della tiroide. In particolare, tali riarrangiamenti sono stati riscontrati in diversi istotipi quali il carcinoma papillare (PTC), il carcinoma a cellule di Hürtle (HCC), il carcinoma scarsamente differenziato (PDTC), il carcinoma anaplastico (ATC). Una caratteristica peculiare è la differente

18

RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

frequenza riscontrata nei pazienti adulti (tra il 2,3% e il 3,4%) rispetto a quelli pediatrici, dove la fusione risulta otto volte più comune (tra il 18,3% e il 25,9%).

I geni maggiormente interessati dalla mutazione sono NTRK1 e NTRK3, nello specifico le fusioni di NTRK3 risultano cinque volte più frequenti di quelle di NTRK1. In particolare, nell’ambito del database Cancer Genome Atlas, è stato dimostrato che il riarrangiamento ETV6-NTRK3 è il più frequente, soprattutto nell’ambito dei carcinomi papillari correlati alla radio-esposizione.11 Recentemente tali mutazioni, essendo un significativo evento oncogenico nel carcinoma tiroideo, hanno destato un crescente interesse ai fini del possibile utilizzo dei farmaci a bersaglio molecolare divenendo oggetto di studio. Pekova et al. hanno analizzato una coorte di 989 pazienti con carcinoma tiroideo di cui 59 (6%) sono risultati positivi alla mutazione di NTRK (57 casi di PTC e 2 casi di PDTC).12 Dai suddetti casi sono emerse delle differenze tra i tumori con fusione di NTRK1 rispetto a quelli con fusione di NTRK3: i primi presentano un pattern di crescita misto (sia papillare che follicolare) rispetto ai secondi che hanno un pattern di crescita prevalentemente follicolare; inoltre, le mutazioni di NTRK1 sono associate ad alta frequenza di multifocalità, estensione extra-tiroidea, invasione vascolare, metastasi a distanza e linfonodali (80% vs 49% per NTRK3).12 In conclusione, i tumori con mutazione di NTRK1 sembrano differire da quelli con mutazione NTRK3 per una maggiore aggressività tumorale. Da ciò è possibile considerare la fusione di NTRK1 come un indice prognostico che, insieme alle dimensioni della neoplasia, alla presenza di metastasi e agli eventi mutazionali tardivi, risulta rilevante ai fini della valutazione dell’outcome del paziente.

Dunque, lo studio di NTRK può essere di supporto per la diagnosi e per la scelta della tipologia di intervento chirurgico e farmacologico.

Nella tabella 2.2 sono elencate le tipologie di fusione più frequentemente riportate nei tumori tiroidei.

Tabella 2.2 Tipologie di fusione dei geni NTRK più frequentemente riportate nei tumori tiroidei. Modificata da Pekova et al.12 Fusione NTRK

Frequenza (%)

ETV6-NTRK3

64,4%

TPM3-NTRK1

8,4%

SQSTM1-NTRK3

6,8%

EML4-NTRK3

6,8%

RBPMS-NTRK3

5,1%

IRF2BP2-NTRK1

5,1%

SQSTM1-NTRK1

1,7%

TPR-NTRK1

1,7%

Il significato agnostico e la prevalenza nelle diverse sedi tumorali

19

Carcinoma del colon-retto Un altro tumore comune con coinvolgimento di NTRK è il carcinoma del colon-retto (CRC): la prima fusione riscontrata è stata TPM3-NTRK1 più di 35 anni fa13 e successivamente è stata riportata una bassa prevalenza di riarrangiamenti di NTRK1 o NTRK3. Nonostante la scarsità dei dati clinico-patologici disponibili, recenti studi più ampi su CRC metastatici hanno permesso di identificare differenti mutazioni driver, comprese quelle coinvolgenti NTRK. In particolare, nel 2020 Lasota et al. hanno pubblicato uno studio di coorte randomizzato al fine di individuare diverse fusioni di NTRK attraverso metodiche di immunoistochimica (IHC) e di biologia molecolare: su un campione totale di 7008 pazienti sono risultati positivi per la mutazione 16 casi di CRC (0,23%).14 Il campione era costituito da pazienti che avevano subito una colectomia parziale successivamente analizzati mediante IHC su Tissue Micro Array (TMA). La maggior parte dei tumori mutati per NTRK era stata diagnosticata in donne (13 casi su 16, 81%) con un’età media di 63 anni.

Per quanto riguarda la localizzazione, i tumori con mutazione di NTRK hanno coinvolto diverse porzioni del grosso intestino. Dei casi esaminati, dodici neoplasie erano in stadio T3 e quattro in stadio T4. Inoltre, la mutazione coinvolgeva frequentemente tumori che mostravano un grado di differenziazione basso o moderato, una crescita solida di tipo focale o estesa, presenza di invasione linfovascolare e numerosi linfociti infiltranti il tumore. Infine, in otto casi si riscontrava una focale componente mucinosa.14 Dal punto di vista molecolare l’81% dei casi positivi alla fusione di NTRK era caratterizzato anche da mutazione dei geni coinvolti nel mismatch repair (MMR), in particolare MLH1 e PMS2. Il riarrangiamento più comunemente riscontrato era quello di TPM3-NTRK1 (60%), a seguire LMNA-NTRK1 (20%) e TPR-NTRK1 (13%). Esistono altri partner di fusione, quali PLEKHAG e SCYL3, che non sono emersi da questo studio ma da antecedenti lavori presenti in letteratura.14 Le fusioni di NTRK3 sono molto rare nel CRC e si annoverano solo pochi casi che hanno coinvolto i geni ETV6 (il più comune), COX5A, EML4, VPS18.

Le tipologie di fusione più frequentemente riportate nel CRC sono elencate nella tabella 2.3.

Da tutti questi dati è anche emerso che la maggior parte dei CRC con fusione di NTRK mostra caratteristiche in comune con quelli con instabilità dei microsatelliti: predominanza nel sesso femminile, maggior frequenza di localizzazione nel colon destro, presenza di differenziazione mucinosa, alto livello di linfociti infiltranti il tumore.

Da sottolineare anche la copresenza di mutazioni di Wnt/β-catenina e p53. Un altro dato di rilievo è l’assenza di mutazione di BRAF, KRAS, NRAS e PIK3CA, motivo per cui è consigliato effettuare uno studio immunoistochimico ed eventual-

20

RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

Tabella 2.3 Tipologie di fusione dei geni NTRK più frequentemente riportate nel CRC. Modificata da Lasota et al.14 Fusione NTRK

N. casi

LMNA-NTRK1

6

PLEKHAG-NTRK1

1

SCYL3-NTRK1

1

TPM3-NTRK1

22

TPR-NTRK1

3

COX5A-NTRK3

1

ELM4-NTRK3

2

ETV6-NTRK3

6

VPS18-NTRK3

1

Totali

43

mente delle indagini molecolari per NTRK in tutti i pazienti con CRC avanzato o metastatico wild-type per BRAF e RAS. L’associazione della fusione di NTRK con l’instabilità microsatellitare è emersa in molti altri studi condotti sui carcinomi del colon-retto. Ne è un esempio uno studio del 2017 in cui sono stati presi in considerazione 26 casi di CRC con MSI-H e 558 non MSI-H: il riarrangiamento di NTRK è stato rilevato nel 40% dei CRC con mutazione di MSH2/MLH1 rispetto al 16% dei pazienti con CRC non MSI-H.15 Analogamente Yamashiro et al. hanno riscontrato la fusione del gene NTRK1 in tre casi di CRC (0,31%) con instabilità dei microsatelliti: lo studio è stato eseguito su un totale di 971 campioni effettuando una prima colorazione immunoistochimica e poi un’ulteriore analisi dei casi positivi con sequenziamento mirato dell’RNA.16 In conclusione, dato che alcuni casi di CRC, soprattutto quelli caratterizzati da instabilità microsatellitare, presentano diverse fusioni dei geni NTRK1 e NTRK3 con differenti partner, alcuni dei quali responsivi a target therapy, è consigliabile inserire l’IHC come indagine di screening e successivamente l’NGS, al fine di identificare i casi che possano giovarsi della terapia a bersaglio molecolare.17

Il significato agnostico e la prevalenza nelle diverse sedi tumorali

21

Carcinoma del polmone non a piccole cellule Fusioni dei geni NTRK nell’ambito del carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) sono state riscontrate per la prima volta nel 2013 da Vaishnavi et al. per mezzo di un’analisi NGS di 36 campioni provenienti da pazienti con NSCLC privi di alterazioni genetiche conosciute che ha permesso di individuare due mutazioni di NTRK1 con due diversi partner di fusione: MPRIP e CD74.18 A seguito di questo primo studio, ne sono stati portati avanti numerosi altri che hanno coinvolto, tra le differenti tipologie tumorali, anche casi di NSCLC, rivelando una frequenza della mutazione dei geni NTRK complessivamente inferiore all’1% (tabella 2.4).19 Tabella 2.4 Frequenza e tipologia di fusioni dei geni NTRK in pazienti con NSCLC in vari studi. Modificata da Russo et al.19 Studio

Popolazione (n)

Frequenza (%)

NTRK

Partner di fusione

NSCLC (4872)

0,23%

NTRK1 NTRK3

SQSTM1, TPR, IRF2BP2, TM3, MPRIP, ETV6

Vaishnavi, 2013

ADK (91)

3,3%

NTRK1

MPRIP, CD74

Stransky, 2014

ADK (513)

0,19%

NTRK2

TRIM24

NSCLC (non squamoso) (4874)

0,05%

NTRK3

NR

ADK (4073)

0,1%

NTRK1 NTRK3

TPM3, SQSTM1, ETV6

Ou, 2019

NSCLC (42791)

0,1%

NTRK1 NTRK3

IRF2BP2, TPM3

Xia, 2019

NSCLC (21155)

0,056%

NTRK1

CD74, IRF2BP2, LMNA, PHF20, SQSTM1, TPM3, TRP

Farago, 2018

Miyamoto, 2019 Gatalica, 2018

Uno dei primi studi in grado di fare chiarezza riguardo al ruolo di NTRK nel NSCLC è stato condotto da Farago et al. nel 2018 e ha raccolto dati a partire da 4872 pazienti con NSCLC studiati per la fusione di NTRK con un pannello NGS.20 Tale studio ha rivelato una frequenza della mutazione pari a 0,23%. Riarrangiamenti di NTRK sono risultati, quindi, meno frequenti delle mutazioni di ALK (4-6%), ROS1 (1-2%) e RET (1-2%). Rispetto a queste ultime, tuttavia, la fusione di NTRK sembra trasversale a diverse istologie tumorali e indipendente dall’abitudine al fumo di tabacco. Inoltre, le fusioni di NTRK appaiono avere un maggior ruolo di mutazione driver rispetto ad ALK, ROS1 e RET, tanto che l’inibizione del

22

RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

suo segnale con terapie target in modelli preclinici ha determinato morte cellulare e regressione del tumore.20 Pur coinvolgendo un numero limitato di pazienti con NSCLC e fusione di NTRK, questo studio ha permesso di costruire un primo database sugli aspetti clinico-patologici legati a questa alterazione genica. Sono state riscontrate, infatti, 7 fusioni di NTRK1 con cinque differenti partner di fusione e 4 fusioni di NTRK3 con due differenti partner di fusione; il 55% dei pazienti coinvolti era di sesso maschile con un’età mediana alla diagnosi di circa 47 anni e una variabile storia di tabagismo; il 73% dei pazienti aveva un tumore metastatico alla diagnosi. Non è stata riscontrata copresenza di mutazioni di KRAS, EGFR, ALK, ROS1 o di altri driver oncogenici noti. Per quanto riguarda gli istotipi rilevati, 9 pazienti avevano un adenocarcinoma e tra questi due adenocarcinomi mucinosi invasivi e un adenocarcinoma con aspetti neuroendocrini (quest’ultimo con fusione di TPR-NTRK1); tra i pazienti con adenocarcinoma sono stati riscontrati, inoltre, diversi sottotipi istologici, tra cui forme scarsamente differenziate a pattern solido e cellule ad anello con castone. Un paziente NTRK mutato aveva un carcinoma squamoso confermato dall’espressione di p40 e negatività per TTF1 (ETV6-NTRK3). Inoltre, è stato riscontrato un carcinoma neuroendocrino ben differenziato con alto indice mitotico e metastasi cerebrale classificato come carcinoma neuroendocrino a grandi cellule (SQSTM1NTRK3) (tabella 2.5).20 Tabella 2.5 Tipologia di fusioni dei geni NTRK in pazienti con NSCLC. Modificata da Farago et al.20 Casi

Fusione NTRK

Istotipo

Tabagismo

1

NTRK1-SQSTM1

ADK

30 pack-years

2

NTRK1-TPR

ADK/NE

/

3

NTRK1-IRF2BP2

ADK

/

4

NTRK1-TPM3

ADK

2 pack-years

5

NTRK1-MPRIP

ADK

/

6

NTRK3-ETV6

ADK

/

7

NTRK1-IRF2BP2

ADK

30 pack-years

8

NTRK3-ETV6

SCC

58 pack-years

9

NTRK1-SQSTM1

ADK

/

10

NTRK3-ETV6

ADK

/

11

NTRK3-SQSTM1

NE

1 pack-years

Il significato agnostico e la prevalenza nelle diverse sedi tumorali

23

Uno studio del 2021 condotto da Zhao et al. ha raccolto dati a partire da 4619 campioni di adenocarcinomi polmonari di pazienti cinesi sottoposti a biopsia o resezione polmonare presso lo Shanghai Cest Hospital dal 2017 al 2019 (2651 campioni chirurgici e 1968 piccole biopsie).21 In un primo momento tutti i campioni sono stati studiati in NGS per i riarrangiamenti di NTRK1; successivamente, i casi positivi per NTRK1 e quelli risultati negativi per le mutazioni driver più comuni sono stati studiati per NTRK1/2/3 tramite TNA-NGS (Total Nucleic AcidNGS) e immunoistochimica.21 In totale sono state rilevate fusioni di NTRK1 in sette pazienti (0,15%). Tra queste, due hanno presentato come partner di fusione TPM3, mentre cinque hanno presentato una mutazione con partner di fusione non comuni (tabella 2.6). Le due mutazioni, per così dire, canoniche sono risultate mutualmente esclusive rispetto alle altre potenziali mutazioni driver; al contrario tre delle cinque fusioni con partner non comuni sono state rilevate in concomitanza con mutazioni di EGFR o KRAS. Elemento degno di nota è la comparsa di una mutazione non canonica di NTRK in un paziente a seguito di terapia con EGFR-TKI, verosimilmente indotta dalla terapia.21 Un’altra caratteristica rilevante è stata quella di aver riscontrato due fusioni di NTRK (TPM3-NTRK1 e KIF5B-NTRK2) rispettivamente in un caso di adenocarcinoma in situ e in uno di adenocarcinoma in fase precoce. Si tratta di un dato nuovo rispetto agli studi precedenti che hanno individuato mutazioni di NTRK solo in stadi tumorali avanzati o in forme poco differenziate. È generalmente riconosciuto che le fusioni di geni driver si manifestino più frequentemente nei Tabella 2.6 Tipologia di fusioni dei geni NTRK in pazienti con NSCLC. Modificata da Zhao et al.21 Casi

Sesso

Età

Fusione NTRK

Istotipo

Tabagismo

1

M

53

NTRK1-C14orf2

ADK

/

2

M

41

NTRK1-RRNAD1

ADK (papillare)

/

3

F

64

NTRK1-NBPF25P

ADK (acinare)

/

4

M

54

NTRK1-ARHGEF11

ADK

30 pack-years

5

F

56

NTRK1-FMN2

ADK

/

6

F

31

NTRK1-TPM3

ADK in situ

/

7

M

51

NTRK1-TPM3

ADK (papillare)

/

8

F

39

/

ADK (acinare)

/

9

M

36

/

ADK minimamente invasivo

/

24

RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

soggetti giovani. Dal confronto con ALK e ROS1 è emerso che l’età media della coorte di pazienti con mutazioni di NTRK in questo studio è stata significativamente più bassa (39 anni versus 54 per ALK e 56 per ROS1).21 La coesistenza tra NTRK e altre mutazioni driver resta un aspetto controverso.

Lo studio di Ruiying et al. propende per la mutuale esclusività. Al contrario Xia et. al hanno suggerito che la mutazione di NTRK1 possa emergere come meccanismo di resistenza in pazienti EGFR mutati trattati con TKI.22 Anche nello studio di Ruiying et al. è stato trovato un caso di mutazione di NTRK1 in un paziente trattato con EGFR-TKI, si tratta in particolare di una mutazione non funzionale ossia che non coinvolge il dominio tirosin-chinasico. Pertanto, si sospetta che la pressione terapeutica e il microambiente possano favorire l’insorgere di mutazioni non funzionali e non mutualmente esclusive, al contrario delle mutazioni di NTRK mutualmente esclusive che fungono da driver funzionali e indipendenti.

Sarcomi, tumori pediatrici e tumori stromali gastrointestinali I sarcomi sono un gruppo di neoplasie di origine mesenchimale che rappresenta, nel complesso, l’1% dei tumori dell’adulto e fino al 20% dei tumori pediatrici. Tali neoplasie originano frequentemente dai tessuti molli (80%) o dal tessuto osseo (20%) e comprendono circa 70 sottotipi, ciascuno con caratteristiche biologiche e cliniche ben definite:23 i sottotipi di sarcomi dei tessuti molli di più frequente riscontro sono il liposarcoma, il leiomiosarcoma, il sarcoma indifferenziato dei tessuti molli, il fibrosarcoma e il sarcoma sinoviale, mentre i sarcomi ossei più frequenti sono il sarcoma di Ewing e l’osteosarcoma.24 I sarcomi con riarrangiamenti dei geni NTRK insorgono più frequentemente nel contesto dei tessuti molli superficiali o profondi delle estremità, con maggior incidenza in età pediatrica e puberale, e prevalenza di alterazioni del gene NTRK1. La classificazione del 2020 dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO) dei tumori dei tessuti molli include nella categoria cosiddetta “neoplasie a cellule fusate con riarrangiamenti dei geni NTRK” due entità sarcomatose che, a causa della loro morfologia ed espressione immunofenotipica, possono indurre a sospettare la presenza di fusione: • Il tumore neurale con aspetti simil-lipofibromatosi (LLNT), caratterizzato da elementi cellulari monomorfi, fusati, infiltranti il tessuto adiposo sottocutaneo con immunoreattività per S100 e CD34.

• Le neoplasie simil-tumori maligni delle guaine nervose periferiche, costituiti da cellule fusate in un contesto di ialinizzazione stromale e perivascolare frammiste a uno stroma con ampia deposizione di collagene ialinizzato.25 26

Il significato agnostico e la prevalenza nelle diverse sedi tumorali

25

I riarrangiamenti dei geni NTRK sono presenti in meno dell’1% dei sarcomi, sia pediatrici che dell’adulto, e la fusione ETV6-NTRK3, una delle prime scoperte e la meglio caratterizzata, è presente nel 90% dei fibrosarcomi infantili, appare ricorrente anche nel nefroma mesoblastico cellulare ed è stata riscontrata, altresì, in un sottogruppo di GIST (tumori stromali gastrointestinali) del piccolo intestino e del retto insorti in età adulta negativi per le classiche mutazioni driver.27 Un’altra fusione di frequente riscontro nei sarcomi, soprattutto nelle varianti a cellule fusate, è l’alterazione LMNA-NTRK1, la quale appare insorgere con maggior prevalenza in età pediatrica e nei giovani adulti con neoplasie mesenchimali a localizzazione periferica. La stessa alterazione genomica è stata riportata in sarcomi di basso grado con aspetti miopericitoma-like, sarcomi uterini a cellule fusate, istiocitosi eruttiva generalizzata e anche in neoplasie di origine epiteliale come l’adenocarcinoma del colon.27 Vista la prevalenza delle fusioni dei geni NTRK soprattutto in età pediatrica, Zhao et al. hanno analizzato 1347 tumori di 1217 pazienti pediatrici identificando alterazioni dei geni NTRK in 29 tumori di 27 pazienti con maggior frequenza delle fusioni del gene NTRK3 nei sarcomi dei tessuti molli (tabella 2.7): alcuni di

Tabella 2.7 Fusioni dei geni NTRK e relative prevalenze nei tumori pediatrici. Modificata da Zhao et al.28 Diagnosi istologica

Prevalenza delle fusioni dei geni NTRK

Fusioni dei geni NTRK

Carcinoma papillare della tiroide (CPT)

13% (10/76)

ETV6-NTRK3 IRF2BP2-NTRK1 SQSTM1-NTRK1 TPR-NTRK1

Tumori del sistema nervoso centrale (SNC)

1,9% (7/364)

KANK1-NTRK2 C2orf44-NTRK2 QKI-NTRK2 KCTD16-NTRK2 TRIM24-NTRK2 SPECC1L-NTRK2 ETV6-NTRK3

Tumori solidi non SNC, non CPT, comprendenti sarcomi dei tessuti molli

1,8% (8/435)

TFG-NTRK3 RBPMS-NTRK3 ETV6-NTRK3 SPECC1L-NTRK3 STRN3-NTRK3 PRDX1-NTRK1

Tumori ematologici

0,4% (2/472)

RBPMS-NTRK3 TPM3-NTRK1

26

RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

questi mostravano la tipica morfologia del fibrosarcoma infantile, densamente cellulato con pattern di crescita fascicolato e infiltrante, mentre altri presentavano aspetti istologici e immunofenotipici caratteristici del sarcoma miofibroblastico.28 Nel complesso, il lavoro di Zhao et al. si qualifica come uno dei maggiori studi nell’ambito delle neoplasie pediatriche con riarrangiamenti dei geni NTRK evidenziando come tali fusioni siano presenti, nella coorte in studio, nel 2,22% di tutti i tumori e nel 3,08% delle neoplasie solide: tali dati supportano l’idea che le alterazioni genomiche dei geni NTRK siano più frequenti nei tumori pediatrici rispetto a quelli dell’adulto e incoraggiano a valutare l’utilità clinica dello screening dei riarrangiamenti dei geni NTRK in tutte le neoplasie pediatriche.28 Da tali osservazioni emerge l’importanza primaria, per il patologo, di dare una definizione istologica e molecolare circostanziata per tali neoplasie così da poter coadiuvare il clinico nella scelta della terapia a bersaglio molecolare soprattutto nei casi di eccessiva morbilità post-intervento o di impossibilità di escissione della massa neoplastica.28 I riarrangiamenti dei geni NTRK sono stati ricercati anche in neoplasie stromali note per il riscontro di tipiche mutazioni driver: tra queste, di particolare interesse i GIST cosiddetti wild-type, tumori non corredati delle caratteristiche mutazioni oncogeniche. In particolare, nell’ambito del trial NCT02576431 è stata eseguita un’analisi genomica di circa 190 GIST wild-type identificando due casi con riarrangiamento ETV6-NTRK3 in pazienti adulti, maschi, rispettivamente con neoplasia localizzata nel piccolo e nel grosso intestino.29 È stata proposta, inoltre, una classificazione dei GIST con fusioni di NTRK, suddividendoli in: • Tumori con fusioni del gene NTRK3, inclusi i tumori infantili di alto grado fibrosarcoma-like.

• Tumori con fusione del gene NTRK1, suddivisi a loro volta in: – neoplasie di basso grado positive per CD34 e S100; – sarcomi di alto grado non classificati.29 Nel complesso, è stato osservato che, rispetto alle neoplasie stromali scarsamente cellulate con fusioni del gene NTRK1, i sarcomi con riarrangiamenti del gene NTRK3, anche nelle forme di grado basso/intermedio, mostrano comportamento biologico più aggressivo con atteggiamento metastatizzante.29 L’importanza dei riarrangiamenti dei geni NTRK nelle neoplasie stromali è ancora in fase di definizione e grandi sforzi si stanno compiendo per comprendere il ruolo di queste mutazioni nello sviluppo e nel comportamento biologico e clinico di tali tumori.

Numerose ricerche sono state condotte anche sul sarcoma uterino, che rappresenta circa il 3% dei tumori maligni dell’utero.30 La forma di alto grado, con incerta origine dallo stroma endometriale, risulterebbe correlata, secondo re-

Il significato agnostico e la prevalenza nelle diverse sedi tumorali

27

centi osservazioni, a riarrangiamenti dei geni NTRK, in particolare i geni NTRK1 e NTRK3.31 Lo studio pilota che ha per primo messo in luce questa correlazione è quello condotto da Chiang et al. nel 2018 identificando, tramite sequenziamento dell’RNA di quattro sarcomi uterini, diversi partner di fusione dei geni NTRK, quali: • RBPMS-NTRK3; • TPR-NTRK1; • LMNA-NTRK1; • TPM3-NTRK1.32 Le fusioni dei geni NTRK di più frequente riscontro nei sarcomi uterini di alto grado sono riportate nella tabella 2.8.

Successivamente è stato riportato un legame tra i riarrangiamenti dei geni NTRK e l’insorgenza del sarcoma della cervice uterina: in particolare, in cinque casi il riarrangiamento coinvolgeva l’esone 6 del gene TPM3 e l’esone 10 del gene NTRK1; in un caso la fusione, invece, ha coinvolto l’esone 4 del gene TPM3 e l’esone 10 del gene NTRK1. Nell’unico caso dello studio in cui si è riscontrato il riarrangiamento del gene NTRK3, il punto di fusione riguardava l’esone 2 del gene EML4 e l’esone 14 del gene NTRK3.33 Ciò che spicca dagli studi finora condotti è la netta prevalenza di riarrangiamenti dei geni NTRK in forme di sarcoma uterino insorti nella cervice uterina, neoplasie con morfologia fibrosarcoma-like caratterizzate da cellule fusate, o raramente epitelioidi, con nuclei ovoidali e scarso citoplasma accompagnatorio il quale può presentare, talora, focali vacuolizzazioni. Il grado di atipia nucleare è, generalmente, lieve/moderato con attività mitotica che appare estremamente variabile, così come la presenza di necrosi.34 Tabella 2.8 Riarrangiamenti dei geni NTRK nei sarcomi uterini di alto grado-sarcomi dello stroma endometriale. Modificata da Akaev et al.31 Geni coinvolti

Fusione/riarrangiamento genico/alterazioni più frequenti

Traslocazioni

TPR-NTRK1

1q31.1-1q23.1

LMNA

LMNA-NTRK1

1q22-1q23.1

TPM3

TPM3-NTRK1

1q21.3-1q23.1

RBPMS

RBPMS-NTRK3

t(8;15)(p12;q25.3)

EML4

EML4-NTRK3

t(2;15)(p21;q25.3)

STRN

STRN-NTRK3

t(2;15)(p22.2;q25.3)

TPR

28

RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

A seguito di ulteriori indagini immunoistochimiche, Croce et al. suggeriscono un algoritmo diagnostico per le pazienti con sarcoma uterino che preveda di valutare l’assetto immunofenotipico della neoplasia e candidare, in particolare, a valutazione dei riarrangiamenti dei geni NTRK quei casi con negatività per i marcatori ormonali e del muscolo liscio e positività per S100 e, non costantemente, per CD34.34 Essendo le pazienti affette da questa forma tumorale generalmente giovani, in età premenopausale e con tendenza ad andare incontro a malattia avanzata, sarebbe auspicabile una diagnosi precoce delle fusioni dei geni NTRK sia per procedere al trattamento con inibitori di TRK sia, con una più ampia visione, per dare la possibilità a queste pazienti di accedere a una terapia neoadiuvante volta all’inibizione del pathway di TRK e alla preservazione della fertilità.32

Lesioni melanocitarie di Spitz e melanoma Il melanoma e le lesioni melanocitarie sono stati oggetto di numerose ricerche, soprattutto a seguito della scoperta delle mutazioni driver che li caratterizzano e della possibilità di definire terapie target per migliorare l’outcome clinico dei pazienti: nonostante l’acceso interesse, in particolare nella comprensione del ruolo dei geni NTRK nella patogenesi del melanoma, gli studi in merito sono attualmente limitati.

Nell’ambito delle lesioni melanocitarie, particolare interesse è stato posto nei riguardi del melanoma e delle neoplasie spitzoidi, soprattutto dei tumori di Spitz atipici e del melanoma spitzoide, in quanto forme neoplastiche che non esprimono, per la maggior parte, mutazioni oncogeniche tipiche del melanoma convenzionale.39 Sulla base di tali osservazioni, la ricerca si è focalizzata sullo studio della prevalenza delle fusioni dei geni NTRK nelle lesioni melanocitarie cercando, al tempo stesso, di comprendere il ruolo di tali riarrangiamenti nella genesi tumorale.

Uno dei primi studi condotti in merito è quello svolto nel 2014 da Wiesner et al., che hanno valutato la frequenza di fusione dei geni NTRK in una coorte di 140 neoplasie spitzoidi evidenziando una prevalenza di riarrangiamenti del gene NTRK1 nel 10,7% dei nevi di Spitz, nel 25% dei tumori di Spitz atipici e nel 21% dei melanomi spitzoidi;38 quest’ultimo dato appare del tutto simile a quello evidenziato da Wu et al. nei tumori spitzoidi maligni/biologicamente indeterminati in cui la prevalenza di fusioni del gene NTRK1, nella limitata coorte di casi, è del 28%.41 Ai dati di questo studio si associano quelli relativi al lavoro di Yeh et al. del 2016 in cui viene riscontrata, in una coorte di 1202 casi di tumori melanocitari di difficile classificazione, la presenza di riarrangiamenti del gene NTRK3 nello 0,7% dei casi e vengono identificati, oltre alla nota fusione ETV6-NTRK3, altri riarrangia-

Il significato agnostico e la prevalenza nelle diverse sedi tumorali

29

menti, quali MYO5A-NTRK3, già descritto nei tumori di Spitz, e MYH9-NTRK337 a cui si deve aggiungere la fusione TUBGCP3-NTRK3 evidenziata successivamente nel melanoma acrale.36 Le osservazioni poste dagli autori suggeriscono che nei melanomi primari wild-type per BRAF e NRAS le fusioni del gene NTRK3 insorgono in una fase precoce della progressione neoplastica, presentandosi in maniera mutualmente esclusiva rispetto ai classici oncogeni del melanoma.37 Fusioni ricorrenti del gene NTRK3 sono state identificate, inoltre, da Wang et al. in quattro tumori melanocitari dell’infanzia, tre dei quali con morfologia spitzoide suggerendo, in ogni caso, che nonostante i riarrangiamenti dei geni NTRK siano prevalenti nei melanomi spitzoidi, questi possono essere identificati altresì in neoplasie melanocitarie dell’infanzia non inquadrabili necessariamente in una morfologia Spitz-like: questi dati supportano l’idea che tumori melanocitari con riarrangiamenti del gene NTRK3 possano definire una categoria diagnostica addizionale per via del potenziale target farmacologico rappresentato dalle proteine TRK mutate anche nel setting delle lesioni neviche e melanocitarie spitzoidi dei pazienti pediatrici nei quali le fusioni del gene NTRK3 appaiono ricorrenti.39 Nell’ambito degli studi di correlazione tra fusioni dei geni NTRK e melanoma, di particolare interesse è quello condotto da Lezcano et al. nel 2018 con il quale sono stati identificati, in una coorte di 751 casi, quattro melanomi amelanotici metastatici con riarrangiamento dei geni NTRK, tre dei quali di origine cutanea e uno di origine perianale, con prevalenze rispettive dello 0,8% e dello 0,9%, accomunati dalla presenza di elementi neoplastici di aspetto epitelioide.35 È stato proposto che le fusioni dei geni NTRK nel melanoma, in particolare quando coesistenti con mutazioni driver, rappresentino un evento mutazionale con carattere passeggero e, quindi, un evento non strettamente necessario alla crescita tumorale, seppure i partner di fusione identificati siano primariamente coinvolti nei meccanismi responsabili di tumorigenesi e sopravvivenza tumorale. Tuttavia, il riscontro di riarrangiamenti dei geni NTRK nei melanomi metastatici potrebbe rivelarsi un elemento cruciale per le possibili implicazioni terapeutiche.35 I dati relativi alla frequenza di fusione dei geni NTRK nelle tipologie di melanoma e ai riarrangiamenti evidenziati negli studi finora condotti sono riportati nella tabella 2.9.

I dati finora riportati nell’insieme supportano l’importanza della rilevazione dei riarrangiamenti dei geni NTRK come valore diagnostico aggiuntivo, consentendo al patologo di guidare il clinico nelle scelte terapeutiche dei pazienti con melanoma metastatico, soprattutto in considerazione dell’alto tasso di risposta alla terapia con inibitori di TRK nelle forme che albergano queste fusioni geniche.35 36 40

30

RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

Tabella 2.9 Frequenza e tipologia di fusione dei geni NTRK negli studi riportati. Modificata da Forschner et al.40 Tipologia di melanoma

Frequenza delle fusioni dei geni NTRK

Fusioni dei geni NTRK

Melanoma spitzoide (Wiesner et al.

2014)

21,2%

7/33

LMNA-NTRK1 TP53-NTRK1

Melanoma spitzoide (Wu et al. 2016)

28,5%

2/7

TPM3-NTRK1

Melanoma acrale (Yeh et al. 2019)

2,5%

3/122

MYO5A-NTRK3 TUBGCP3-NTRK3

Lesioni melanocitarie di difficile classificazione (Yeh et al. 2016)

1,8%

22/1202

ETV6-NTRK3 MYO5A-NTRK3 MYH9-NTRK3

Melanoma mucoso/paramucoso amelanotico metastatico (Lezcano et al. 2018)

0,9%

1/751

TRIM63-NTRK1 DDR2-NTRK1

Melanoma cutaneo amelanotico metastatico (Lezcano et al. 2018)

0,8%

3/751

GON4L-NTRK1 TRAF-NTRK2

Tumori del tratto bilio-pancreatico Le patologie maligne del tratto bilio-pancreatico sono rappresentate prevalentemente dai carcinomi delle vie biliari, in particolare il colangiocarcinoma, e dall’adenocarcinoma del pancreas. In tale ambito sono stati effettuati vari studi che, nell’insieme, hanno rilevato una bassa prevalenza (0,67%) delle fusioni dei geni NTRK. Demols et al. hanno preso in considerazione 162 campioni d’archivio fissati in formalina e inclusi in paraffina da resezioni chirurgiche, biopsie o campioni citologici di tumori delle vie biliari tra cui il colangiocarcinoma intraepatico, quello extraepatico, quello peri-ilare e i tumori della colecisti. Sono stati analizzati attraverso una prima fase di screening immunoistochimico, seguita da un test NGS con un pannello basato su RNA, al fine di determinare la prevalenza e le caratteristiche molecolari delle fusioni dei geni NTRK in questi pazienti.42 All’indagine immunoistochimica sono risultati positivi 17 campioni: l’intensità della colorazione era debole in 16 campioni e moderata in uno. Inoltre, la positività della colorazione era frequentemente citoplasmatica e il pattern diffuso piuttosto che focale.

L’analisi NGS di questi campioni risultati positivi all’IHC ha rilevato un singolo riarrangiamento di NTRK3 con il partner di fusione ETV6. Il tumore corrispondeva a un caso di colangiocarcinoma peri-ilare con debole e focale colorazione IHC, sia citoplasmatica che nucleare.42

Il significato agnostico e la prevalenza nelle diverse sedi tumorali

31

Per quanto riguarda l’adenocarcinoma pancreatico, invece, sono stati analizzati 319 campioni di cui 19 sono risultati positivi all’indagine immunoistochimica. Anche in questi pazienti l’intensità della colorazione era frequentemente debole, la positività citoplasmatica e il pattern diffuso. Nessuna fusione è stata rilevata all’analisi NGS.42 Nell’ambito dei tumori del pancreas, è stato riportato il singolo caso di una paziente di 61 anni con adenocarcinoma duttale pancreatico con metastasi epatica.43 Dopo aver effettuato cicli di chemioterapia standard, la biopsia epatica ha rilevato la fusione CTRC-NTRK1 che ha permesso alla paziente di iniziare la terapia con larotrectinib: il farmaco è stato ben tollerato con una parziale risposta al trattamento ed eccellente qualità della vita. Dopo sei mesi, la paziente ha sviluppato una resistenza al farmaco associata all’insorgenza di una nuova mutazione oncogenica (BRAF-V600E). Nonostante l’associazione dabrafenib + trametinib, il tumore ha continuato a progredire fino alla morte della paziente dopo due mesi.43 Dunque, l’inibizione mirata di TRK con larotrectinib nell’adenocarcinoma duttale pancreatico con fusione CTRC-NTRK1 è ben tollerata e può migliorare la qualità della vita del paziente. Tuttavia, può emergere una resistenza al trattamento la cui frequenza è ancora da determinare.

In conclusione, le fusioni del gene NTRK sono rare nei tumori bilio-pancreatici ma restano di grande interesse grazie alla possibilità di trattamento con inibitori specifici di TRK. Alcuni risultati supportano l’uso dell’IHC come screening diagnostico prima dell’analisi NGS. BIBLIOGRAFIA 1. Beretta G, Capoluongo E, Chiari R, et al. The tumoragnostic treatment for patients with solid tumors: a position paper on behalf of the AIOM-SIAPEC/IAP-SIBIOCSIF Italian Scientific Societies, 2020.

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35

3.

Metodiche di analisi e algoritmo diagnostico GIANCARLO PRUNERI

Introduzione I geni dei recettori tirosin-chinasici della neurotropina (neurotrophic tyrosine receptor kinase, NTRK1, localizzato sul cromosoma 1q21-q22; NTRK2, 9q22.1; e NTRK3, 15q25) codificano per una famiglia di recettori tirosin-chinasici (TRKA, TRKB e TRKC) implicati nella regolazione dei meccanismi di sopravvivenza, proliferazione e differenziazione cellulare dello sviluppo e differenziazione neurale, espressi fisiologicamente durante l’embriogenesi. I corrispondenti recettori TRKA, TRKB e TRKC hanno una struttura simile, un’attività per specifiche neurotropine e sono implicati in differenti pathway biologici intracellulari. In particolare, TRKA e TRKB, in seguito al legame con NGF (nerve growth factor) e BDGF (brain-derived growth factor), attivano i pathway MAPK/RAS/ERK, PLC-gamma e PI3K, implicati nella proliferazione, differenziazione e sopravvivenza neuronale. TRKC, il cui ligando è NTF3, esercita un’attività anti-apoptotica attraverso il pathway PI3K/AKT.1 Fisiologicamente, le proteine TRK sono espresse in modo prevalente nel sistema nervoso centrale e nel tessuto muscolare liscio. L’attivazione fisiologica del recettore è iniziata dal legame del fattore di crescita neurotropina, che determina la dimerizzazione e fosforilazione del recettore, con conseguente attivazione a valle di numerosi pathway biologici quali fosfolipasi C, Ras/MAPK/ERK e PI3K. La fusione dei geni NTRK1, NTRK2 e NTRK3 rappresenta il meccanismo più frequente di attivazione oncogenica di TRK. Generalmente, il riarrangiamento intracromosomico o intercromosomico determina la formazione di geni ibridi nei quali le sequenze 3’ di NTRK1, NTRK2 e NTRK3, comprendenti il dominio chinasico, risultano giustapposte alle sequenze 5’ di un gene differente. Il prodotto di questa fusione è un’oncoproteina chimerica, caratterizzata da un’attivazione costitutiva delle chinasi TRK in modo indipendente dalla presenza del ligando.2 La maggior parte dei partner di fusione upstream ai geni NTRK con-

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

tiene domini di oligomerizzazione, quali i domini coiled-coil, zinc finger o WD repeats, che sono richiesti nei processi di fusione genica per una completa attivazione chinasica. Tuttavia, sono stati riportati esempi di partner di fusione dei geni NTRK privi dei domini di dimerizzazione: in questi casi, è ipotizzabile che il gene partner upstream contribuisca all’attivazione di NTRK sostituendo i domini auto-inibitori presenti nella porzione extracellulare delle proteine TRK. Le proteine di fusione determinano l’attivazione degli stessi pathway attivati dalle proteine full-lenght in seguito al legame con neurotropina, come ad esempio MAPK e PI3K nel caso di riarrangiamento ETV6-TRKC.3 Il riarrangiamento dei geni NTRK, originariamente dimostrato in tumori del colon-retto e tiroidei, è presente in numerosi istotipi tumorali, nei pazienti adulti e in età pediatrica. La prevalenza delle fusioni dei geni NTRK è elevata in un setting di neoplasie rare e molto bassa nella maggior parte dei tumori più frequenti: ad esempio, la fusione ETV6-NTRK3 è considerata patognomonica nel carcinoma mammario di tipo secretorio, nel mammary analogue secretory carcinoma (MASC)4 delle ghiandole salivari, nel nefroma mesoblastico congenito e nel fibrosarcoma infantile, con una prevalenza superiore al 90% nelle serie riportate.

Il gene di fusione è il prodotto della traslocazione t(12;15)(p13;q25), che risulta in un trascritto chimerico che include gli esoni 4-6 di ETV6 e il domino chinasico di NTRK3, il quale determina un’attivazione costitutiva del dominio chinasico TrkC con attivazione a valle dei pathway PI3K/AKT e MAPK.5 Per contro, i riarrangiamenti dei geni NTRK sono estremamente rari (con una prevalenza inferiore a 1%) nei carcinomi polmonare, mammario, del colon-retto, pancreatico, renale e del distretto testa-collo, nel colangiocarcinoma e melanoma, nei tumori pediatrici del sistema nervoso centrale e nei tumori dei tessuti molli. In questi setting, il riarrangiamento dei geni NTRK è mutualmente esclusivo rispetto alle alterazioni di ulteriori geni appartenenti al pathway MAPK (ad esempio KRAS, NRAS e BRAF).6 Nel carcinoma del colon-retto, le fusioni dei geni NTRK sono più frequenti nei casi con instabilità dei microsatelliti. Infine, una frequenza intermedia (5-25% dei casi) di fusioni di NTRK è stata riportata nel carcinoma papillare della tiroide, nelle neoplasie melanocitarie di tipo spitzoide, nei tumori gastrointestinali stromali (GIST) a genotipo wild-type per KIT, PDGFR e RAS, e in un setting di gliomi pediatrici. A circa 20 anni dalla loro prima descrizione, l’identificazione delle fusioni dei geni NTRK in campioni clinici tumorali ha assunto un particolare rilievo a seguito dell’approvazione da parte della Food and Drug Administration (FDA) degli inibitori di TRK entrectinib e larotrectinib.7 8 Queste due molecole hanno infatti dimostrato una convincente efficacia clinica in pazienti adulti e pediatrici con tumori solidi localmente avanzati o metastatici con riarrangiamento dei geni NTRK, indipendentemente dall’istotipo, dal gene coinvolto e dal tipo di fusione. È perciò di fondamentale importanza promuovere uno screening adeguato ed efficiente per le fusioni dei geni NTRK nei laboratori di patologia, al fine di applicare una terapia personalizzata.

Metodiche di analisi e algoritmo diagnostico

37

Metodi di valutazione delle fusioni dei geni NTRK Il riarrangiamento dei geni NTRK può essere evidenziato con differenti metodiche nella pratica clinica, quali immunoistochimica (IHC), ibridizzazione in situ a fluorescenza (FISH), reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RTPCR) e next generation sequencing (NGS).

Immunoistochimica Sono disponibili diversi anticorpi per rilevare l’espressione di TRK in campioni di tessuto FFPE. Possono essere utilizzati anticorpi diretti contro specifiche proteine TRK (TRKA o TRKB), come gli anticorpi policlonali TRKA (A785) e TRKB (V509), anticorpi diretti contro una sequenza amminoacidica comune a TRKA, B e C (anticorpi pan-TRK), come l’anticorpo Anti-TRK B-3 e panTRK (EPR17341), oppure “cocktail” di anticorpi TRK.9 L’anticorpo commerciale EPR17341 (Abcam e Roche/Ventana), immunoreattivo per una sequenza peptidica C-terminale altamente conservata di TRKA, B e C, ha dimostrato una sensibilità del 75-100% e una specificità del 93-100% nell’identificazione di fusioni dei geni NTRK, sebbene in studi su popolazioni relativamente esigue. L’immunoreattività è generalmente di tipo citoplasmatico, ma sono descritti pattern specifici associati alla fisiologica sede subcellulare delle proteine codificate dai geni partner di fusione a 5’: ad esempio, l’immunoreattività è nucleare nei casi con fusione ETV6-NTRK3,10 perinucleare nei casi LMNA-NTRK1, e di membrana nei casi NTRK-TPM. Presso l’Istituto Nazionale Tumori, l’analisi IHC è eseguita con l’anticorpo primario monoclonale di coniglio VENTANA pan-TRK (EPR17341) (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), diretto contro la regione C-terminale delle proteine TRK A, B e C, nota per essere conservata nelle proteine di fusione wild-type e chimeriche. L’immunocolorazione viene effettuata su una piattaforma BenchMark Ultra (Ventana Medical Systems) utilizzando il kit di rilevamento OptiviewDAB (Ventana Medical Systems) su sezioni di tessuto FFPE di 3 μm. In ogni corsa sono sempre inclusi i controlli negativo (Rabbit Monoclonal Negative Control Ig, Ventana Medical Systems) e positivo (sezioni di tessuto di appendice normale o comprendenti tessuto nervoso). Risulta da quanto esposto che IHC pan-TRK rappresenta un valido strumento per l’identificazione delle neoplasie con fusioni dei geni NTRK, in considerazione dei suoi ridotti costi, della sensibilità e specificità, della relativa semplicità e velocità di esecuzione, e conseguente alta distribuzione nei laboratori di patologia. La figura 3.1 illustra alcuni risultati di IHC ottenuti presso l’Istituto Nazionale Tumori.

Per contro, la tecnica IHC è associata ad alcune limitazioni nell’identificazione delle fusioni dei geni NTRK, quali la variabilità delle condizioni preanalitiche, le difficoltà interpretative associate all’espressione fisiologica dei geni NTRK nel

38

RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

A

B

C

D

Figura 3.1 Esempi di immunocolorazione con l’anticorpo pan-TRK (EPR17341) (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) in differenti casi di tumore analizzati presso l’Istituto Nazionale Tumori. A. Adenocarcinoma del colon con riarrangiamento del gene NTRK1 e immunoreattività intensa citoplasmatica e di membrana. B. Carcinoma secretorio della mammella con riarrangiamento del gene NTRK3 e intensa immunoreattività nucleare. C. Sarcoma NOS, con riarrangiamento di NTRK1 e intensa immunoreattività citoplasmatica e di membrana. D. Carcinoma papillare della tiroide con riarrangiamento di NTRK1 e intensa immunoreattività citoplasmatica.

tessuto neurale e muscolare liscio, e la possibilità di falsi positivi nel caso di tumori a differenziazione muscolare liscia e nervosa.

Ibridazione in situ a fluorescenza La metodica FISH è utilizzata diffusamente nei laboratori di patologia per identificare varianti strutturali e numeriche del DNA in campioni FFPE. Per l’analisi dei riarrangiamenti dei geni NTRK possono essere utilizzate sonde commerciali (Zytolight) o sviluppate nei laboratori. Presso l’Istituto Nazionale dei Tumori, sono stati identificati specifici cloni BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) adiacenti ai geni NTRK mediante un’accurata analisi dei database genomici (ad esempio, UCSC ed Ensemble Genome) e della letteratura. Dopo espansione in colture batteriche, il DNA plasmidico, estratto con Qiagen Midi Prep e quantificato mediate spettrofluorometria, è stato marcato con fluorocromi mediante

Metodiche di analisi e algoritmo diagnostico

39

Nick Translation per produrre sonde break-apart: in particolare, sono stati utilizzati i fluorocromi Spectrum Green per i BACs posti all’estremità 5’, e Spectrum Orange per i BACs posti all’estremità 3’. Le sonde sono state validate su metafasi da coltura di sangue periferico. L’esito del test FISH su campioni clinici viene considerato positivo quando nel 10-15% delle cellule tumorali (a seguito della valutazione di almeno 50 nuclei da parte di due operatori indipendenti) è presente uno split dei segnali fluorescenti, indicativo di una traslocazione bilanciata, oppure un segnale isolato relativo al clone BAC al 3’ del gene NTRK. Va sottolineato che l’esito positivo in FISH con sonde break-apart indica la presenza di una variante strutturale del gene testato, ma, come per l’IHC, non è informativo del gene partner di fusione al 5’ e della reale formazione di un trascritto chimerico di fusione in-frame. Oltre all’approccio descritto con sonde break-apart, che rappresenta la procedura utilizzata più frequentemente nei laboratori di patologia, è possibile utilizzare sonde disegnate per individuare specifiche fusioni, quali ETV6-NTRK3 e TPM3-NTRK1, patagnomoniche di specifici istotipi tumorali (MASC e fibrosarcoma infantile).10 I vantaggi della metodica FISH sono rappresentati dalla sua ampia distribuzione nei laboratori di patologia, il costo contenuto dei reagenti, l’identificazione in situ della lesione molecolare e l’esigua quantità di materiale per l’analisi (una/due sezioni FFPE a 4 micron di spessore).

Per contro, la sensibilità della metodica FISH nell’identificazione delle fusioni dei geni NTRK può essere limitata in caso di riarrangiamenti criptici, quali inserzioni o fusioni coinvolgenti partner adiacenti a NTRK (ad esempio LMNANTRK1), che possono dare luogo a un risultato falso negativo. Inoltre, poiché la metodica multiplex FISH non è di comune applicazione nei laboratori di patologia per le difficoltà di analisi e di interpretazione, per l’analisi delle fusioni NTRK è necessario eseguire tre differenti test in parallelo con conseguente incremento dei costi e del turnaround time (TAT). Per questi motivi, la metodica FISH ha un utilizzo limitato nello screening, mentre può essere raccomandata come test di elezione, insieme a PCR, per la conferma di fusioni note (ad esempio ETVSNTRK3) negli istotipi ad alta prevalenza di fusione.

Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) RT-PCR rappresenta un metodo basato sull’analisi di RNA, qualitativo o quantitativo (real-time qPCR) per l’identificazione di trascritti di fusione dei geni NTRK.11 La metodica prevede l’identificazione di un trascritto di fusione di cui sono noti il gene partner e i breakpoint esonici. Pertanto, sebbene RT-PCR sia utilizzabile per identificare fusioni canoniche quali ETV6 esone 5-NTRK3 esone 15, la numerosità dei partner di fusione e la variabilità dei breakpoint e degli esoni coinvolti rendono RT-PCR poco utilizzabile nella pratica clinica come metodica di screening delle fusioni dei NTRK. Le metodiche FISH e RT-PCR costituiscono alternative analiticamente valide alle metodiche di comprehensive genomic

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

profiling soprattutto nel setting di neoplasie con alta prevalenza di fusioni dei geni NTRK coinvolgenti geni partner noti, quali ad esempio MASC, carcinoma mammario secretorio, fibrosarcoma infantile e nefroma mesoblastico. Rispetto alle metodiche NGS, questo approccio ha il vantaggio di una maggiore sostenibilità economica e distribuzione nei laboratori di patologia, ma è limitato dalla possibilità di evidenziare una singola alterazione driver (single-gene test).

Next generation sequencing (NGS) DNA-NGS L’analisi delle fusioni dei geni NTRK può essere condotta mediante test NGS su DNA (DNA-NGS), RNA (RNA-NGS) o ibrido DNA/RNA (DNA/RNA NGS).6 La metodica DNA-NGS utilizza DNA genomico tumorale per identificare simultaneamente lo stato mutazionale di numerosi geni (targeted DNA-NGS), dell’intero esoma (whole-exome sequencing, WES) o dell’intero genoma (whole genome sequencing, WGS). A questo scopo, sono utilizzabili numerose piattaforme con chimiche differenti, diversi pannelli e strumenti di analisi bioinformatica. Il principale fattore limitante la sensibilità della metodologia targeted DNA-NGS nell’identificare le fusioni dei geni NTRK è rappresentato dal coverage del pannello analizzato: ad esempio, MSK-IMPACT è un pannello NGS hybridization capture-based approvato da FDA, che copre l’intera regione esonica di 468 geni e regioni introniche selezionate: in particolare, MSK-IMPACT identifica le regioni introniche 3,7-12 di NTRK1, 15 di NTRK2 e 4,5 di ETV6 per l’identificazione delle fusioni ETV6-NTRK3. È importante sottolineare che alcune fusioni dei geni NTRK potrebbero non essere identificate perché troppo estese per un approccio DNA capture, che ha un limite superiore di circa 25 kb. Il pannello FoundationOne CDx (Foundation Medicine), approvato da FDA, interroga 315 geni e alcune fusioni selezionate, incluse quelle dei geni NTRK1-3. La metodica targeted DNA-NGS ha anche un limite nella specificità analitica: il rilevamento di una variante strutturale dei geni NTRK potrebbe infatti non risultare nell’espressione in-frame di una proteina di fusione, che può essere confermata solo da metodiche complementari (ad esempio, immunoistochimica). L’applicazione della metodica DNA-NGS è infine influenzata dalla necessità di ottenere una sufficiente quantità di tessuto con una percentuale sufficiente di cellularità tumorale e dal turnaround time di circa due settimane per l’esecuzione e l’interpretazione dei risultati. Sebbene i pannelli a DNA si siano dimostrati efficaci nell’identificare le fusioni dei geni NTRK, va sottolineato come la loro sensibilità sia ridotta nel caso di riarrangiamenti di NTRK2 e 3 che coinvolgano ampie regioni introniche.

Inoltre, gli approcci basati sul DNA non forniscono informazioni funzionali, e pertanto richiedono ulteriori analisi con metodiche basate su RNA e/o con immunoistochimica, quali Archer AMP, per dimostrare che la fusione identificata a livello di DNA risulti effettivamente in un trascritto di fusione.

Metodiche di analisi e algoritmo diagnostico

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RNA-NGS La metodica RNA-NGS è basata sull’estrazione di RNA da campioni tumorali FFPE, cui conseguono la preparazione di cDNA e il sequenziamento. La ricerca di trascritti di fusione per i geni NTRK può essere condotta a partire da un’esigua quantità di RNA estratto. Questa metodica, basata su multiplex PCR da cDNA ottenuto dopo retrotrascrizione, permette di verificare simultaneamente la presenza di eventuali trascritti di fusione dei geni NTRK mediante primers specifici per la porzione C terminale del trascritto codificante i corrispettivi recettori TRK A-C conservata nella proteina chimerica. Il sequenziamento dei prodotti di amplificazione permette l’identificazione del gene partner del trascritto di fusione (figura 3.2).

Tra le metodiche potenzialmente utilizzabili per l’identificazione dei prodotti di fusione dei geni NTRK,12 vi sono la multiplexed amplicon-based sequencing e l’anchored multiplex PCR. In uno studio comparativo con metodiche FISH, RT-PCR, Sanger sequencing e NGS, la tecnologia multiplexed amplicon-based sequencing ha dimostrato una sensibilità dell’86% con almeno 10 reads normalizzate nell’identificazione di trascritti di fusione coinvolgenti 19 geni driver e 94 possibili partner; la riduzione del numero di reads normalizzate di fusione richieste e l’inclusione nell’analisi del rapporto 3’/5’ ha permesso di raggiungere il 100% di sensibilità.13 La tecnologia anchored multiplex PCR, ad esempio su piattaforma Archer FusionPlex, ha il vantaggio rispetto alle metodiche ampliconbased di poter identificare le fusioni anche quando è noto uno solo dei geni coinvolti: in questo metodo due primers ibridizzano con la sequenza di un adattatore in 3’ a valle del partner di fusione in due cicli di amplificazione; creata la library

NACC2 AGBL4

NTRK3

NTRK2

ETV6

PAN3

BTBD1

QKI

TPR

TRIM24

TPM3

VCL

TP53

BCAN

TFG

CD74

RABGAP1L

LMNA

NTRK1 MPRID

NFASC

Figura 3.2 Schema dei principali partner di fusione dei geni NTRK.

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

con le procedure di PCR, vengono eseguiti i passaggi di sequencing e analisi per quantificare i trascritti. Le metodiche di RNA-NGS permettono di caratterizzare con precisione i geni e gli esoni coinvolti nel trascritto di fusione, anche quando siano presenti riarrangiamenti che coinvolgono multipli geni.14 L’efficacia dell’identificazione del riarrangiamento dei geni NTRK con metodiche NGS basate su DNA può essere ridotta in alcuni casi dalla presenza, in particolare in NTRK2 e NTRK3, di grandi regioni introniche. A questo riguardo, soprattutto in considerazione della estrema rarità delle fusioni di NTRK, è preferibile utilizzare metodiche complementari, quali ad esempio anchored multiplex PCR, un approccio di sequenziamento targeted dell’RNA di tipo unidirezionale che permette l’identificazione di partner genici upstream non noti di varie estensioni. La limitazione principale è invece rappresentata dalla disponibilità di RNA di sufficiente qualità, una fattispecie non sempre possibile nei tessuti FFPE in specie ottenuti molto tempo prima dell’analisi: è pertanto di fondamentale importanza utilizzare adeguati controlli di qualità quantitativi e qualitativi, che includano la valutazione della distribuzione delle dimensioni dei frammenti di RNA, la proporzione delle reads di sequenziamento, e il coverage e la profondità media di analisi; inoltre, la gestione delle fasi dell’RNA-NGS, come la preparazione delle librerie e la gestione dei campioni, richiede reagenti, strumenti e know-how che non sono al momento sufficientemente distribuiti nei laboratori di patologia. L’utilizzo combinato delle tecniche di PCR e sequenziamento è in grado di identificare anche lo skipping di alcuni esoni dei NTRK, un meccanismo di attivazione del recettore non rilevabile con altre metodologie quali la FISH. Presso l’Istituto Nazionale Tumori è stato ampiamente utilizzato il kit Archer “Lung fusion panel” con certificazione CE-IVD, su tecnologia Ion Torrent, che identifica possibili fusioni dei geni NTRK ALK, RET e ROS. DNA/RNA NGS Recentemente sono stati sviluppati pannelli che permettono l’analisi simultanea di RNA e DNA estratti dal medesimo campione FFPE. A seguito della preparazione di librerie separate per DNA ed RNA, viene eseguito il sequenziamento in un’unica corsa. Ad esempio, il pannello TruSight Tumor 170 sviluppato da Illumina identifica con chimica hybrid capture fusioni, varianti splicing, indels e mutazioni puntiformi in 170 geni comunemente alterati nel cancro, inclusi NTRK1, 2 e 3. Analogamente, il pannello Oncomine Comprehensive interroga DNA ed RNA di 161 geni associati al cancro su piattaforma Ion Torrent; poiché questo pannello utilizza la chimica amplicon-based, la metodica identifica esclusivamente le fusioni di cui si conoscono i partner riportati in letteratura al momento del suo rilascio. Il pannello ibrido DNA/RNA FoundationOne Heme interroga 236 geni frequentemente alterati nel cancro e 19 geni comunemente riarrangiati, inclusi NTRK1-3. Considerata la natura chimerica dei trascritti di fusione dei geni NTRK,

Metodiche di analisi e algoritmo diagnostico

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il sequenziamento a RNA rappresenta un approccio ideale per l’identificazione de novo delle fusioni geniche trascritte. Le problematiche associate a questa metodica sono rappresentate dall’instabilità dell’RNA, soprattutto se ottenuto da campioni FFPE: la frammentazione dell’RNA dovuta alla fissazione in formalina può produrre un templato troppo piccolo per poter essere informativo nella preparazione delle librerie e/o nel sequenziamento. Le limitazioni dell’utilizzo delle metodiche NGS, e in particolare RNA-NGS, sono rappresentate pertanto dalle complessità logistica di produzione e interpretazione dei dati, dalla necessità di ottenere RNA di sufficiente quantità e qualità, dai costi e dall’elevato TAT. Presso l’Istituto Nazionale Tumori è attualmente utilizzato il pannello DNA/RNA Oncomine Comprehensive Assay Plus (TermoFisher), disegnato per identificare fusioni geniche, CNV, TMB e instabilità dei microsatelliti.

DNA-NGS in cfDNA (biopsia liquida) Questa metodica permette la profilazione molecolare dei tumori metastatici, il monitoraggio della malattia residua minima e della recidiva molecolare, e l’identificazione di mutazioni di resistenza nei geni target durante un trattamento personalizzato.15 Analogamente a quanto accade per altri inibitori tirosin-chinasici, l’insorgenza di mutazioni dei geni NTRK, quali la mutazione puntiforme del dominio chinasico di TRKA/NTRK1 (p.G667C) e TRKC/NTRK3 (p.G696A), è associata a resistenza al trattamento con larotrectinib. Pertanto, la biopsia liquida può essere uno strumento efficace nel monitorare l’insorgenza delle mutazioni di resistenza alla terapia, soprattutto nei casi in cui l’esecuzione di un prelievo bioptico della recidiva sia complesso o potenzialmente dannoso. L’utilizzo della biopsia liquida ha ancora alcune limitazioni, relative in particolare alla sensibilità nell’identificare le mutazioni e, soprattutto, le fusioni geniche. La tecnologia Guardant360 può identificare mutazioni puntiformi dei geni NTRK1 e 3, ma solo le fusioni di NTRK1.

Il pannello AVENIO Extended ctDNA copre esclusivamente le fusioni di NTRK1 e il pannello Oncomine Pan-Cancer Cell-Free (ThermoFisher) utilizza una singola libreria per identificare fusioni selezionate dei geni NTRK1 e NTRK3. Il pannello FoundationOne Liquid CDx interroga i geni della famiglia NTRK.

Algoritmo diagnostico Le fusioni dei geni NTRK sono presenti in numerosi tumori, con una prevalenza alta in istotipi rari e molto bassa nei tumori più frequenti. Poiché la loro identificazione permette l’utilizzo di farmaci estremamente efficaci nei pazienti con tumore avanzato e metastatico, è essenziale stabilire un algoritmo diagnostico che permetta l’identificazione delle fusioni dei geni NTRK con elevata sensibilità e specificità. Sebbene sia ragionevole ipotizzare una certa variabilità nella strate-

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

gia diagnostica in funzione dell’organizzazione e della tecnologia disponibile in ciascun laboratorio, le società scientifiche hanno elaborato specifiche linee-guida sulla base della distribuzione, sensibilità e specificità dei metodi disponibili.

L’identificazione delle alterazioni dei geni NTRK è fortemente integrata con il modello più recente dell’oncologia di precisione, che si basa sull’azionabilità clinica delle alterazioni molecolari: in questo contesto, le metodiche e le procedure per identificare le fusioni di NTRK sono comprese nel contesto più generale della profilazione molecolare dei campioni clinici. Sebbene idealmente ogni paziente dovrebbe essere testato per la presenza di riarrangiamenti dei geni NTRK, nella pratica viene applicato un triage con algoritmi creati sulla base della prevalenza nota di fusioni nella popolazione oncologica esaminata. Ad esempio, nel Dipartimento di Patologia dell’Istituto Tumori, è stata creata una procedura ibrida, basata cioè sui modelli istologico e mutazionale agnostico. In breve: 1. i casi istologicamente sospetti per un istotipo ad alta prevalenza di fusione di NTRK sono caratterizzati in prima istanza con FISH e, nel caso di positività e quando il Molecular Tumor Board ritenga potenzialmente possibile una terapia con larotrectinib o entrectinib, confermati con metodica RNA-NGS; 2. i casi per cui è prevista dalle linee-guida ESMO una caratterizzazione upfront con metodica NGS (ad esempio carcinoma polmonare, colangiocarcinoma) sono caratterizzati con un pannello ibrido RNA/DNA (vedi sopra) che interroga i geni NTRK1-3 e, se positivi, confermati con IHC; 3. i casi con bassa prevalenza di fusioni del gene NTRK, per i quali non è prevista un’analisi upfront RNA-NGS (ad esempio carcinoma mammario metastatico), su indicazione del Molecular Tumor Board sono caratterizzati con IHC per espressione di TRK e, se positivi, confermati con RNA-NGS. La figura 3.3 illustra un caso di tumore miofibroblastico caratterizzato con metodiche IHC, FISH e RNA-NGS (Archer) presso l’Istituto Nazionale Tumori.

Recentemente, il Translational Working Group e il Precision Medicine Group dell’ESMO hanno rilasciato un algoritmo per l’identificazione delle fusioni dei geni NTRK nei campioni clinici (figura 3.4).16 Qualora siano valutati istotipi con alta prevalenza di fusione dei geni NTRK, in cui l’identificazione della lesione è di fondamentale ausilio diagnostico e/o patognomonica, in teoria è consentito l’utilizzo di qualunque metodica, ma è sempre preferibile utilizzare FISH e RT-PCR. Quando invece le fusioni di NTRK sono analizzate in una popolazione non selezionata (modello agnostico), il metodo di elezione è rappresentato da DNA-NGS o RNA-NGS. In particolare, qualora l’RNA da analizzare sia ottimale dal punto di vista quantitativo e qualitativo, le metodiche RNA-NGS rappresentano il gold standard per lo screening. Qualora sia identificata la presenza di una fusione in uno dei geni NTRK con le metodiche descritte, è sempre opportuno effettuare anche un test IHC, al fine di confermare l’espressione della protein-chinasi chimerica, che rappresenta il reale bersaglio

Metodiche di analisi e algoritmo diagnostico

A

45

B

C

Esone: 10

Esone: 5

NTRK3

ETV6

Figura 3.3 Tumore miofibroblastico infiammatorio con (A) intensa positività nucleare per pan-TRK. Nel pannello B le cellule tumorali mostrano segnali di fusione del gene ETV6 (in rosso) con il gene NTRK3 (in verde). Nel pannello C è rappresentata schematicamente la fusione del gene ETV6 (esone 5) con il gene NTRK3 (esone 10) evidenziata mediante RNA-NGS (Fusion Plex Lung Cancer panel, Archer).

Campione da testare per la presenza di fusioni di NTRK

Come tecnica confermatoria utilizzare FISH, RT-PCR o RNA-NGS targeted con specifiche sonde per le fusioni di NTRK

Sì

Il tipo di tumore presenta un’elevata prevalenza di fusioni di NTRK?

No

È disponibile una piattaforma per sequenziamento?

No

Utilizzare IHC come metodo di screening

Nessuna espressione TRK

Utilizzare IHC per confermare l’espressione di proteine in caso di positività

Sì

Utilizzare NGS come prima tecnica per identificare le fusioni di NTRK, considerando preferibilmente test RNA quando possibile

Individuazione dell’espressione di TRK

Figura 3.4 Schema del Translational Working Group e del Precision Medicine Working Group ESMO per l’identificazione delle fusioni dei geni NTRK1-3. Modificata da Marchiò et al.16

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

farmacologico. In considerazione della scarsa diffusione delle metodiche NGS nei laboratori di patologia, può essere percorso un approccio combinato, che prevede come analisi frontline IHC e, in caso di qualsiasi segnale di positività, una conferma con DNA-NGS o RNA-NGS. L’approccio combinato (IHC -> NGS) è stato utilizzato con successo anche nel trial clinico registrativo STATRK. Questo approccio è relativamente affidabile in considerazione dell’alto valore predittivo negativo dell’IHC per NTRK nel predire la presenza di fusioni geniche.

A questo proposito, è necessario sottolineare l’importanza della creazione di reti di laboratori organizzate in un modello hub-spoke, nelle quali la valutazione IHC venga condotta nei centri locali seguendo specifici protocolli di analisi e interpretazione del dato, mentre l’analisi NGS venga centralizzata in istituti specializzati e dotati di Molecular Tumor Board accessibili da remoto agli oncologi e patologi locali che hanno in carico il paziente. Questo tipo di organizzazione deve essere basata su criteri logistici e modalità di analisi strutturati, che permettano l’esecuzione del ciclo di analisi e l’interpretazione dei dati in tempi adeguati. La procedura tecnica dei laboratori di patologia e delle loro reti deve comunque essere armonizzata con le esigenze cliniche: per questo motivo è essenziale che la strategia per l’identificazione delle fusioni dei geni NTRK, come più in generale l’oncologia di precisione, sia gestita da un Molecular Tumor Board che identifichi la popolazione da analizzare e la metodica più adeguata, anche tenendo in considerazione la disponibilità di materiale biologico e il timing dell’analisi. Al momento presente, infatti, la valutazione delle fusioni dei geni NTRK non viene effettuata upfront in tutti i pazienti con malattia metastatica. Alcune linee-guida, come ad esempio quella elaborata dal National Comprehensive Cancer Network (NCCN),17 hanno già incluso le fusioni dei geni NTRK tra i biomarcatori da valutare nei pazienti con malattia metastatica. Le linee-guida ESMO sottolineano come le fusioni di NTRK siano da ricercare in tutti i pazienti con malattia avanzata, indipendentemente dall’istotipo (approccio agnostico), in particolare in assenza di ulteriori biomarcatori azionabili e in età precoce.

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In NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN GuidelinesVR). NCCN Evidence BlocksTM, Version 5.2019.

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4.

I farmaci NTRK inibitori STEFANO FOGLI

Introduzione Le chinasi neurotrofiche legate alla tropomiosina (Trk) sono recettori tirosinchinasici ad alta affinità codificati dai geni NTRK (neurotrophic tyrosine receptor kinase), che sono fisiologicamente attivati da un gruppo di fattori di crescita solubili chiamati neurotrofine (NT). La famiglia dei recettori TRK ha tre isoforme altamente omologhe: TRKA (NTRK1), TRKB (NTRK2) e TRKC (NTRK3). Le neurotrofine coinvolte nella stimolazione di questi recettori sono: • il fattore di crescita delle cellule nervose (nerve growth factor, NGF), che attiva TRKA; • il fattore neurotrofico cerebrale (brain derived neurotrophic factor, BDNF) e il fattore NT-4/5, che attivano TRKB; • il fattore NT-3, che attiva TRKC. Ciascun recettore contiene un dominio extracellulare (legame con il ligando), una regione transmembrana e un dominio intracellulare (incluso il dominio della chinasi). Dopo il legame con il ligando, il recettore ad attività tirosin-chinasica intrinseca catalizza la propria fosforilazione e attiva le vie di trasduzione del segnale a valle.1 Le fusioni geniche che interessano i recettori NTRK1-3 sono uno degli esempi più importanti di alterazione driver dominante nei tumori solidi. La formazione della proteina TRK chimerica, infatti, determina l’attivazione costitutiva del recettore, favorendo la crescita del tumore e rappresentando un bersaglio farmacologico trasversale a diverse istologie tessutali.1 Sono disponibili diversi composti attivi sui recettori TRK.2 Queste molecole possono essere classificate sulla base della loro maggiore o minore selettività d’azione nei confronti del target (tabella 4.1). Il blocco dell’attività TRK, in vitro e in vivo comporta l’inibizione di diverse vie di segnalazione tra cui quelle mediate dalla proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK), dalla fosfatidilino-

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

Tabella 4.1 Selettività dei TRK inibitori e attività sulle forme mutate del recettore Molecola

Bersagli

Attività su TRK mutato

Entrectinib

TRKA-C, ROS1, ALK

No

Larotrectinib

TRKA-C

No

Taletrectinib

TRKA-C, ROS1

ND

Repotrectinib

TRKA-C, ROS1, ALK, JAK2

Sì

Selitrectinib

TRKA-C

Sì

AZD7451

TRKA-C

ND

ND: Dato non disponibile.

sitolo-3-chinasi (PI3K-AKT), dalla proteina chinasi C (PKC), e dal trasduttore del segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT3), con il conseguente arresto della crescita di cellule tumorali che presentano fusioni geniche NTRK.

Proprietà farmacodinamiche Larotrectinib (ARRY-470; LOXO-101) è un potente pan-TRK inibitore, attivo per via orale, che compete con l’adenosina trifosfato (ATP) per il sito catalitico della chinasi. Il farmaco agisce selettivamente sui recettori TRK con valori IC50 tra 5 e 11 nM, nei saggi enzimatici contro tutte e tre le isoforme e con selettività almeno 1000 volte maggiore rispetto ad altre chinasi.2-4 L’inibizione dei recettori TRK da parte del farmaco ne impedisce l’attivazione determinando, a concentrazioni nanomolari, l’inibizione della proliferazione cellulare e l’induzione dell’apoptosi nei tumori dipendenti da questa via di segnalazione. 2 4 In vitro e in vivo, larotrectinib ha mostrato una notevole attività antitumorale in cellule con attivazione costitutiva delle proteine TRK risultante da fusioni geniche o delezioni nei domini di regolazione della proteina, e in cellule con elevati livelli di espressione del recettore. 4 Entrectinib (RXDX-101, NMS-E628) è un TRK inibitore che agisce anche su ROS1 e ALK con valori di IC50 compresi tra 1 e 7 nM.2 5 Entrectinib blocca selettivamente la proliferazione delle linee cellulari ALK-dipendenti e induce autofagia in cellule di neuroblastoma.5 Il farmaco inibisce anche la crescita del tumore al polmone non a piccole cellule recante il riarrangiamento EML4-ALK.6 Repotrectinib (TPX-0005) è un TKI di nuova generazione progettato e sviluppato per inibire l’attività enzimatica nelle chinasi con mutazioni puntiformi nei geni ROS1, TRKA-C e ALK che comportano sostituzioni aminoacidiche nella proteina mutata (rispetto alla controparte wild-type), conferendo resistenza

I farmaci NTRK inibitori

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ai farmaci di prima generazione.7 Repotrectinib inibisce l’attività della chinasi ROS1, TRKA-C e ALK, sia wild-type che mutata, con valori di IC50 nell’intervallo tra 0,07 e 4,5 nM. Sulla base dell’elevata potenza contro ROS1/TRKA-C/ALK, la concentrazione-soglia di selettività per l’inibizione dell’attività chinasica da parte di repotrectinib è stata stabilita pari a 100 nM. Saggiato su 395 distinte chinasi, repotrectinib ha mostrato un’elevata potenza contro ROS1 e TRKA-C, con una selettività di circa 15 volte rispetto a ALK e ancora maggiore nei confronti degli altri enzimi; dati confermati anche nei test di fosforilazione cellulare. Nella linea Ba/F3, caratterizzata da recettori TRKA-C wild-type, repotrectinib si è dimostrato più potente (IC50 <0,2 nM) di larotrectinib ed entrectinib.7 In topi atimici trapiantati con cellule tumorali NIH3T3 LMNA-TRKA wild-type, la somministrazione di una formulazione cristallina micronizzata di repotrectinib alla dose di 15 mg/kg, due volte al giorno, determinava una concentrazione plasmatica di valle (Ctrough), misurata prima della somministrazione della dose successiva, pari a 22,7 nM; tale concentrazione era associata a un’inibizione della crescita tumorale maggiore di quella prodotta da entrectinib somministrato alla stessa dose (128% e 98%, rispettivamente). Nel modello in vivo con tumore mutato TRKAG595R, il trattamento con repotrectinib alla dose di 15 mg/kg per due volte al giorno portava a un’attività inibitoria del 97% mentre entrectinib, a dosi 4 volte superiori, aveva un effetto inibitorio del 78%.7 Selitrectinib (LOXO-195) è un inibitore di seconda generazione selettivo per i recettori TRK, sviluppato parallelamente agli studi clinici con larotrectinib per creare una molecola in grado di agire sui tumori resistenti a larotrectinib. Non essendo state ancora identificate nei tumori dei pazienti mutazioni di resistenza a larotrectinib, la progettazione della molecola di selitrectinib si è basata principalmente su esperimenti di mutagenesi diretta per mutazioni nel dominio chinasico dei geni NTRK potenzialmente associate a farmaco-resistenza, analogamente a quanto fatto per gli oncogeni ALK e ROS1. Nei saggi enzimatici, selitrectinib e larotrectinib hanno dimostrato una potente attività inibitoria (IC50 <3 nM).8 Selitrectinib mantiene una notevole attività inibitoria a concentrazioni nell’intervallo nanomolare, anche in presenza di mutazioni di resistenza (TRKAG595R, TRKCG623R, TRKAG667C, e TRKCG696A) con valori di IC50 da 2 a 9,8 nM, mentre larotrectinib mostra un’attività inibitoria significativamente ridotta nelle cellule che esprimono queste mutazioni con valori di IC50 da 17 a 77 volte superiore rispetto agli stessi recettori nella forma wild-type.2 8 Taletrectinib (DS-6051b/AB-106) è un inibitore di ROS1/TRK che ha mostrato una certa efficacia nel tumore al polmone non a piccole cellule con mutazioni nel gene ROS1, nei pazienti non responsivi a crizotinib.9 Taletrectinib ha mostrato una potente attività inibitoria in vitro, con valori di IC50 contro ROS1 e TRKA-C compresi nell’intervallo di concentrazioni nanomolare. 10 AZD7451 è un derivato 4-aminopirazolilpirimidinico,11 selettivo per i recettori TRK, che ha dimostrato di inibire l’auto-fosforilazione del recettore TRKC

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promossa dal fattore di crescita NT-3 a concentrazioni nanomolari, bloccando la migrazione, la motilità, l’invasione e la crescita di cellule di carcinoma adenoidocistico.12 Altri farmaci inibitori non selettivi dei recettori TRK includono crizotinib, cabozantinib, lestaurtinib, altiratinib, foretinib, ponatinib, nintedanib, merestinib, belizatinib e sitravatinib.13 14

Proprietà farmacocinetiche La dose orale raccomandata di larotrectinib nei pazienti adulti e nei pazienti pediatrici con una superficie corporea (BSA) ≥1 m2 è di 100 mg, due volte al giorno, mentre in quelli con una BSA <1 m2 è di 100 mg/m2, due volte al giorno. La presenza di cibo non influenza in modo significativo la biodisponibilità del farmaco.4 Larotrectinib mostra una farmacocinetica proporzionale alla dose somministrata nell’intervallo tra 100 e 400 mg. Nei pazienti adulti trattati con larotrectinib, alla dose di 100 mg, due volte al giorno, il tempo necessario a raggiungere il picco plasmatico (Tmax) è di 1 ora, mentre i livelli di farmaco allo stato stazionario si possono riscontrare dopo circa 3 giorni.4 Larotrectinib è principalmente metabolizzato dal CYP3A4 (figura 4.1).

Dopo somministrazione orale di una dose radiomarcata di 100 mg in volontari sani, il farmaco immodificato e il metabolita O-glucuronide rappresentano, rispettivamente, il 19% e il 26% della radioattività nel plasma. Il 58% e il 39% del farmaco viene escreto nelle feci e nelle urine, di cui il 5% e il 20% nella forma immodificata.4 Dopo una dose orale in volontari sani, la clearance media di laro-

Figura 4.1 Schema delle caratteristiche farmacocinetiche e farmacodinamiche dei TRK inibitori.

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trectinib è di 98 l/ora e l’emivita di eliminazione (t1/2) di 2,9 ore. La farmacocinetica di larotrectinib non è influenzata in misura rilevante da età (fascia di età 28 giorni-82 anni), sesso, peso corporeo o insufficienza renale. Rispetto ai pazienti con funzionalità epatica normale, l’esposizione a larotrectinib è aumentata da 1 a 3 volte in modo direttamente proporzionale al grado di insufficienza epatica (classe A-C di Child-Pugh); per questo, il dosaggio iniziale di larotrectinib deve essere ridotto del 50% nei pazienti con insufficienza epatica da moderata a grave.4 L’esposizione a larotrectinib dopo somministrazione orale a dosi comprese tra 50 e 200 mg aumenta all’aumentare della dose. Larotrectinib viene rapidamente eliminato e la t1/2 è compresa tra 3 e 4 ore, indipendentemente dalla dose somministrata, senza fenomeni di accumulo.15 Entrectinib è una molecola lipofila con caratteristiche debolmente basiche e una solubilità dipendente dal pH. A digiuno, la dissoluzione di entrectinib nello stomaco è pressoché completa quando il pH dello stomaco si trova a valori fisiologici. L’elevata solubilità in queste condizioni comporta un completo assorbimento del farmaco nel distretto gastrico.16 Il farmaco viene metabolizzato dal CYP3A4 e il primo passaggio intestinale limita la frazione di dose che raggiunge il circolo portale (figura 4.1). Sulla base della radioattività totale rilevata nelle urine e nelle feci, si stima che la biodisponibilità orale di entrectinib sia almeno del 50%.16 17 Dopo somministrazione orale di una dose di 600 mg, la Tmax di entrectinib varia da 4 a 6 ore.17 Il farmaco e il suo metabolita attivo sono entrambi legati per una quota >99% alle proteine plasmatiche e i rapporti tra volume di distribuzione e biodisponibilità (Vd/F) sono rispettivamente 551 l e 81,1 l. La t1/2 per entrectinib e per il suo metabolita attivo è stata stimata, rispettivamente, di 20 e 40 ore. Dopo somministrazione orale di una singola dose di entrectinib radiomarcato, l’83% della radioattività veniva riscontrato nelle feci (il 36% come forma immodificata e il 22% come metabolita attivo) e il 3% nelle urine. 17 In uno studio first-in-human realizzato in pazienti con tumori solidi in fase avanzata, dopo somministrazione orale di taletrectinib a dosi giornaliere comprese tra 50 e 800 mg, la concentrazione massimale allo stato stazionario (Cmax) e l’esposizione interna, in termini di area sottesa dalla curva concentrazionetempo (AUC) del farmaco, aumentavano in modo dose-dipendente. L’AUC non variava in modo sostanziale nei pazienti che assumevano entrectinib con una dieta a basso contenuto di grassi, rispetto al valore riscontrato in quelli a cui il farmaco veniva somministrato a digiuno.9 Studi effettuati su microsomi epatici hanno evidenziato che taletrectinib subisce sia un metabolismo di fase I, che comprende la N-dealchilazione, la O-dealchilazione e la deaminazione ossidativa, sia un metabolismo di fase II, caratterizzato dalla coniugazione con acido glicuronico.10 Alcuni studi hanno valutato la capacità di penetrazione di entrectinib, crizotinib e larotrectinib nel sistema nervoso centrale (SNC) utilizzando cellule che esprimevano elevati livelli di P-glicoproteina (P-gp). In modelli murini, entrecti-

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nib presentava un rapporto tra le concentrazioni misurate nel CSF e quelle plasmatiche (CSF/Cu,p) più elevato rispetto a crizotinib e larotrectinib. In accordo con i risultati in vitro, il trattamento con entrectinib induceva un’estesa riduzione del tumore e un significativo aumento della sopravvivenza in un modello murino di tumore intracranico; tali effetti si manifestavano a concentrazioni sistemiche simili a quelle riscontrate nei pazienti oncologici trattati con entrectinib.18 Una spiegazione plausibile del diverso tropismo dei farmaci nel SNC potrebbe consistere nella diversa affinità dei TRK inibitori per la P-gp: infatti entrectinib è un più debole substrato della P-gp rispetto a crizotinib e larotrectinib. Questa proprietà di entrectinib ne faciliterebbe la diffusione nel SNC e il mantenimento di livelli di concentrazione adeguati ad esplicare l’effetto antitumorale. Ciò è coerente con l’efficacia preclinica e clinica del farmaco nei tumori del SNC ROS1 positivi e nelle metastasi secondarie del SNC.18 In pazienti con tumori solidi TRK positivi e metastasi cerebrali o tumori primari del SNC è stata comunque osservata un’importante attività antitumorale con larotrectinib, suggerendo che anche questo farmaco possa raggiungere livelli clinicamente rilevanti nel distretto centrale.19 Studi effettuati integrando parametri farmacocinetici di selitrectinib e valutazioni in vitro e in vivo della potenza inibitoria della molecola su mutanti TRK resistenti agli inibitori NTRK di prima generazione hanno permesso di identificare livelli-soglia di esposizione coerenti con un’inibizione significativa del target nel paziente oncologico: almeno il 90% di inibizione del recettore TRK alla Cmax, il 50% di inibizione alla Cmin e un valore AUC sufficiente a produrre un’inibizione del target per la durata dell’intervallo di somministrazione.8

Reazioni avverse Il profilo di tossicità di entrectinib è favorevole, indipendentemente dal profilo molecolare, dall’età o dalla tipologia di tumore. In due studi clinici di fase I, nei pazienti in trattamento con entrectinib la maggior parte delle reazioni avverse al farmaco riscontrate era di grado 1-2. Quelle di qualsiasi grado più comuni comprendevano astenia, mialgie, disgeusia, parestesie, nausea e diarrea, tutti effetti reversibili con modifiche della dose somministrata. Le rare tossicità dose-limitanti che si sono manifestate alla dose di 800 mg (disturbo cognitivo, affaticamento e miocardite eosinofila) sono state risolte con la sospensione del trattamento. Non sono stati riportati eventi avversi di grado 5.20 Il deterioramento cognitivo, l’aumentato appetito, le vertigini e i disturbi del sonno riscontrati nei pazienti in trattamento con entrectinib riflettono, indirettamente, sia la capacità del farmaco di attraversare la barriera ematoencefalica, sia il ruolo dei recettori TRK nella regolazione delle funzioni del sistema nervoso (figura 4.1).21 L’aumento dei livelli di creatinina è un effetto non correlato all’inibizione di TRK (off-target) che è stato riscontrato nei pazienti trattati con entrectinib. Tale effet-

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to, è probabilmente dovuto all’inibizione del trasporto della creatinina mediato dal trasportatore MATE1 (multidrug and toxin extrusion 1), un meccanismo riportato anche per altri inibitori tirosin-chinasici.21 In accordo con tali osservazioni, uno studio recente, sulla base dei dati contenuti nel sistema di farmacovigilanza della Food and Drug Administration (FDA Adverse Event Reporting System, FAERS), suggerisce di porre particolare attenzione al rischio potenziale di danno renale per entrectinib.22 In uno studio dose-finding nel quale larotrectinib veniva somministrato nell’intervallo di dosi tra 50 e 200 mg, una o due volte al giorno, la dose massima tollerata non è stata raggiunta.15 Le reazioni avverse evidenziate nello studio erano prevalentemente di grado 1, con nessun caso di tossicità di grado 4 o 5 riscontrato. La reazione avversa di grado 3 più comunemente osservata nei pazienti trattati con larotrectinib era l’anemia (6% dei pazienti). Per gli studi di fase II è stata raccomandata una dose di 100 mg, da somministrare due volte al giorno sulla base della tollerabilità e dell’attività antitumorale.15 Le reazioni avverse più comunemente riscontrate per taletrectinib erano nausea (47,8%), diarrea (43,5%) e vomito (32,6%). Una tossicità dose-limitante (aumento delle transaminasi di grado 3) si è verificata in due pazienti dopo somministrazione di taletrectinib alla dose di 1200 mg, una volta al giorno. La dose massima tollerata è stata quindi selezionata a 800 mg, una volta al giorno.9

Interazione tra farmaci È stato dimostrato che l’aumento del pH gastrico diminuisce la solubilità di entrectinib (figura 4.1).16 Se co-somministrato a digiuno con lansoprazolo (30 mg al giorno), l’AUC e la Cmax di entrectinib sono diminuite, rispettivamente, del 25% e del 23%, e quelle del metabolita attivo del 16% e del 17%.17 L’impiego di formulazioni di entrectinib contenenti un agente acidificante come eccipiente riduce la variabilità legata alla presenza di alimenti o a variazioni del pH gastrico.16 Entrectinib può quindi essere somministrato indipendentemente dalla presenza di cibo, e non sono necessari aggiustamenti di dose nei pazienti che assumono inibitori di pompa protonica.17 Studi in vitro hanno dimostrato un certo effetto inibitorio di entrectinib e del suo metabolita su vari trasportatori (ad esempio P-gp, BCRP, OATP1B1 e MATE1). Tale effetto non sembra, comunque, essere rilevante dal punto di vista farmacocinetico e clinico, poiché la somministrazione di entrectinib, in dose singola di 600 mg, aumenta l’AUC e la Cmax della digossina (noto substrato della P-gp), rispettivamente del 18% e del 28%. Non risulta, quindi, necessario alcun aggiustamento di dose per farmaci substrati della P-gp quando co-somministrati con entrectinib.17 Essendo altamente legato alle proteine plasmatiche (≥90%), entrectinib potrebbe teoricamente interagire con farmaci aventi le stesse caratteristiche (ad esempio, fenitoina e warfarin). Le

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interazioni tra farmaci dovute allo spostamento dai siti di legame alle proteine plasmatiche non sono però, in genere, clinicamente rilevanti; questo poiché l’incremento della quota libera di farmaco, a seguito dello spiazzamento, determina un aumento della clearance, riducendo quindi la quota libera di farmaco effettivamente presente in circolo.

La somministrazione di itraconazolo aumenta l’AUC di entrectinib e del metabolita attivo, rispettivamente del 504% e del 152%. È stato, inoltre, stimato che la somministrazione di eritromicina aumenta l’AUC di entrectinib e del metabolita attivo del 240% e del 108%. La somministrazione di entrectinib con inibitori del CYP3A è controindicata nei pazienti pediatrici di età ≥12 anni con una superficie corporea >1,5 m2. Se la co-somministrazione si rendesse necessaria, la dose giornaliera di entrectinib dovrebbe essere pari a 100 mg o 200 mg, in presenza di inibitori forti o moderati del CYP3A4.17 La rifampicina aumenta la clearance di entrectinib con relativa diminuzione dell’AUC di entrectinib e del metabolita attivo, rispettivamente del 77% e dell’87%. Si prevede che l’uso concomitante di efavirenz riduca l’AUC e la Cmax di entrectinib del 56% e del 43% e diminuisca l’AUC e la Cmax del metabolita attivo, rispettivamente del 47% e del 28%. Sulla base di questi dati, la somministrazione concomitante di entrectinib con induttori moderati o forti del CYP3A deve essere evitata. In vitro, entrectinib e il suo metabolita attivo hanno mostrato un potenziale inibitorio verso CYP3A4/5, CYP2D6 e CYP2C8/9. Uno studio clinico di interazione tra farmaci ha mostrato che la somministrazione giornaliera di entrectinib aumenta l’AUC del midazolam del 50% riducendo, al contempo, la Cmax del 21%. Sulla base di questi dati, non si ritiene necessario un aggiustamento di dose per i farmaci substrati del CYP3A, quando co-somministrati con entrectinib.

La farmacocinetica di larotrectinib non è influenzata, in misura clinicamente rilevante, dalla presenza di cibo, età (fascia 28 giorni-82 anni), sesso, peso corporeo o insufficienza renale. L’esposizione a larotrectinib è aumentata nei pazienti con insufficienza epatica da moderata a grave (classe B e C di Child-Pugh) e il dosaggio iniziale del farmaco deve essere ridotto del 50%.4 Possono verificarsi interazioni farmacologiche clinicamente rilevanti quando larotrectinib è cosomministrato con potenti inibitori del CYP3A4 (ad esempio, itraconazolo) o induttori (ad esempio, rifampicina); la somministrazione concomitante di questi farmaci con larotrectinib deve, quindi, essere evitata. In alternativa, la dose di larotrectinib deve essere dimezzata o raddoppiata in presenza un potente inibitore o induttore del CYP3A4.4

Meccanismi di resistenza Studi effettuati mediante analisi longitudinale del DNA circolante, in un paziente con carcinoma del colon-retto che ha sviluppato resistenza a entrectinib,

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hanno evidenziato due mutazioni puntiformi nel sito catalitico dell’enzima codificato dal gene NTRK1: p.G595R e p.G667C.23 Successive valutazioni effettuate in modelli preclinici hanno dimostrato che la mutazione G595R (quella più comune) conferisce farmaco-resistenza non solo a entrectinib, ma anche a larotrectinib e cabozantinib. Al contrario, cellule con mutazione TRKAG667C risultavano altamente resistenti a entrectinib e larotrectinib, ma molto sensibili a cabozantinib, con un valore di IC50 circa 10 volte inferiore a quello ottenuto in cellule con il recettore wild-type.24 La resistenza acquisita a larotrectinib nei pazienti oncologici risultava essere anche conseguenza di mutazioni nel gene che codifica per il recettore TRKC (G632R, G696A e FD617L). 4 Studi di cristallografia a raggi X hanno chiarito che le mutazioni G595R e G623R, comportando sostituzioni aminoacidiche glicina-arginina nel sito di legame dell’ATP dei recettori TRKA e TRKC, introducono un ingombro sterico tra la catena laterale dell’arginina e il gruppo idrossipirrolidinico di larotrectinib, compromettendone la capacità di legame con il target. Allo stesso modo, le sostituzioni TRKAG667C o TRKCG696A rendono più difficile l’interazione di larotrectinib con il target, a causa dell’impedimento sterico della catena laterale della cisteina o dell’alanina sul gruppo difluorofenilico del farmaco, potendo ridurne l’efficacia antitumorale.8 Di fatto, larotrectinib mostra un’attività inibitoria significativamente ridotta nelle cellule che esprimono queste mutazioni con valori di IC50 da 17 a 77 volte superiore rispetto agli stessi recettori nella forma wild-type.8 Repotrectinib ha dimostrato di mantenere una potente attività inibitoria sui recettori TRK in cellule tumorali con mutazioni di resistenza a larotrectinib ed entrectinib, tra cui TRKAG595R (IC50: 0,4 nM), TRKBG639R (IC50: 0,6 nM), TRKCG623R (IC50: 0,2 nM) e TRKCG623E (IC50: 1,4 nM). Inoltre, repotrectinib risulta essere 46 volte più potente di entrectinib e 62 volte più potente di larotrectinib nell’inibire la proliferazione di cellule KM12 (IC50: 0,2 nM), una linea di carcinoma del colonretto ampiamente utilizzata per lo screening dei farmaci e per l’identificazione di bersagli molecolari.7 Anche selitrectinib rimane attivo in presenza di mutazioni di resistenza (TRKAG595R, TRKCG623R e TRKAG667C) con valori di IC50 da 2 a 9,8 nM.8 Sono stati pubblicati i risultati di due pazienti con tumori TRK positivi in progressione di malattia dopo iniziale risposta a larotrectinib.25 Nel paziente adulto con carcinoma del colon-retto, positivo per la mutazione TRKAG595R, selitrectinib induceva una rapida risposta e un controllo del quadro clinico nei 6 mesi successivi. La paziente pediatrica con fibrosarcoma infantile e mutazione TRKCG623R dimostrava una risposta parziale, rimanendo stabile per 4 mesi, prima della nuova progressione di malattia.8 I domini tirosin-chinasici di TRK fluttuano dinamicamente tra due principali forme strutturali che sono indicate come conformazioni di tipo I o di tipo II. In modelli preclinici, con l’impiego di larotrectinib (inibitore di tipo I) e altiratinib (inibitore di tipo II), è stato dimostrato che un sottoinsieme di mutazioni nel

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gene NTRK1 resistenti a larotrectinib (V573M, F589L e G667C) risultava ancora sensibile ad altiratinib. Inoltre, le mutazioni V573M e G667C sono risultate altamente responsive anche ad altri inibitori di tipo II, tra cui cabozantinib e foretinib. Con l’impiego di modelli molecolari, è stato dimostrato che la presenza di un gruppo solfuro nella tasca di legame dell’enzima, a seguito di sostituzioni con gli aminoacidi metionina o cisteina, renderebbe le chinasi mutate ipersensibili agli inibitori di tipo II.26 Alcune evidenze hanno dimostrato che un sottogruppo di pazienti può sviluppare anche meccanismi off-target di resistenza all’inibizione di TRK (ad esempio, mutazioni BRAF V600) che non rispondono ai TRK inibitori di nuova generazione, ma sono invece sensibili ai MEK inibitori.27 Inoltre, è stato dimostrato che l’impiego di taletrectinib può indurre una mutazione associata a resistenza nel gene ROS1 (L2086F) che risulta, invece, sensibile a cabozantinib.9

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Le fusioni di NTRK come bersaglio terapeutico nei tumori solidi ANDREA SARTORE BIANCHI

Introduzione Gli inibitori di TRK rappresentano un nuovo capitolo nel modo in cui vengono autorizzate le terapie antitumorali dagli enti internazionali regolatori. Larotrectinib, infatti, è stato il primo agente a ricevere l’approvazione per il trattamento di tumori che presentino uno specifico target molecolare indipendentemente da quale sia il tipo istologico di origine, all’insegna di un paradigma di cosiddetta terapia “istologia-agnostica”.1 L’unico confronto possibile è con pembrolizumab, che aveva precedentemente ottenuto l’autorizzazione iniziale dalla FDA per il trattamento di pazienti con adenocarcinoma gastrico o gastroesofageo metastatico in pazienti con tumori PD-L1 positivi nel 2017, approvazione successivamente aggiornata a includere il trattamento di qualsiasi tipo di tumore che esprima instabilità dei microsatelliti o deficit del mismatch repair. Questo cambiamento di vedute rappresenta certamente uno spartiacque nel trattamento farmacologico dei tumori. Il movimento coordinato degli organismi regolatori internazionali nell’accettare terapie istologia-agnostiche ha il potenziale per cambiare radicalmente il modo in cui big pharma affronta le sperimentazioni di nuovi agenti, nonché l’approccio con cui gli enti regolatori commissionano e autorizzano nuovi farmaci e infine la gamma di trattamenti a cui i pazienti possono accedere all’interno dei diversi tipi di tumore. Ciò avrà probabilmente l’impatto più eclatante nel trattamento mirato ad alterazioni molecolari che si presentano in più tipi tumorali ma con bassa incidenza, come è il caso delle fusioni geniche NTRK.

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

Gli inibitori di TRK approvati per utilizzo clinico Larotrectinib Noto anche come ARRY-470, LOXO-101 e Vitrakvi®, è un inibitore orale altamente selettivo di TRKA, TRKB e TRKC, con valori IC50 nel range 5.3-11.5 nM.2 È stato il primo inibitore TRK approvato al mondo, dalla FDA nel 2018 e successivamente da EMA nel 2019 (https://www.fda.gov/drugs/fda-approves-larotrectinib-solid-tumors-ntrk-gene-fusions) (figura 5.1).3 Larotrectinib ha dimostrato una potente capacità inibitoria in cellule tumorali che presentano proteine di fusione TRK in vitro e in vivo 2 e sulla base dell’efficacia preclinica gli studi clinici con questo farmaco sono iniziati nel 2014. L’approvazione per la terapia nei tumori solidi si basa su tre trial clinici: uno studio di fase 1 su adulti (NCT02122913; LOXO-TRK-14001), lo studio pediatrico di fase 1/2 SCOUT (NCT02637687; LOXO-TRK-15003) e lo studio basket di fase 2 per adulti/adolescenti NAVIGATE (NCT02576431; LOXO-TRK-15002). I dati tratti da queste sperimentazioni cliniche hanno dato luogo nel complesso a cinque pubblicazioni.2 4-7 In particolare, l’analisi combinata dei tre studi clinici LOXOTRK-14001, SCOUT e NAVIGATE su 55 pazienti è stata inizialmente pubblicata nel 2018 e il farmaco è stato approvato da FDA sulla base di questi risultati, 2 mentre i dati sempre su questa casistica congiunta ma con un numero più ampio di 159 pazienti totali, trattati sino al 2019, sono stati riportati nel 2020 4 (tabella 5.1). Inoltre, Doebele et al. 5 hanno descritto il caso di un paziente con sarcoma dei tessuti molli trattati con larotrectinib nello studio LOXO-TRK-14001,5 casi di cinque pazienti nello studio clinico SCOUT sono stati discussi nell’articolo di Dubois et al.,6 e i risultati dello studio di fase 1 SCOUT con 24 pazienti pediatrici con tumore solido sono stati pubblicati da Laetsch et al. 7

Scoperta della fusione TPM3-NTRK1 in carcinoma del colon

Scoperta di TRKA come recettore tirosin-chinasico

Avvio della sperimentazione clinica di larotrectinib

Approvazione FDA di larotrectinib

1982

1989

2014

2018

1991

2012

2019

Caratterizzazione di TRKA come recettore per Nerve Growth Factor

Avvio della sperimentazione clinica di entrectinib

Approvazione FDA di entrectinib

Figura 5.1 Pietre miliari nello sviluppo clinico degli inibitori di NTRK per i tumori solidi.

Le fusioni di NTRK come bersaglio terapeutico nei tumori solidi

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Nella pubblicazione di riferimento, con la casistica più ampia e aggiornata disponibile (Hong et al. 2020),4 i pazienti inclusi avevano un’età da meno di 1 mese a 84 anni. Larotrectinib è stato somministrato per via orale (capsula o formulazione liquida), in continuo, secondo una schedula di 28 giorni; nello studio di fase 2 tutti i pazienti adulti e adolescenti hanno ricevuto la dose iniziale raccomandata di 100 mg due volte al giorno, mentre negli studi di fase 1 sono stati inclusi diversi pazienti dalla fase di dose escalation. La proporzione di pazienti con una risposta obiettiva secondo la valutazione dello sperimentatore è stata di 121/153 valutabili (79%, 95% IC 72-85), con 24 (16%) risposte complete. Sebbene l’imaging cerebrale di base nei pazienti asintomatici non fosse richiesto, 13 (8%) su 159 pazienti erano noti per avere metastasi cerebrali prima dell’arruolamento e i tipi di tumore in questi pazienti includevano cancro ai polmoni (n=6), tiroide (n=4), melanoma (n=2) e carcinoma mammario (n=1). In un’analisi esplorativa post-hoc di pazienti valutabili che avevano anche metastasi cerebrali, il tasso di risposta è stato di 9/12 (75%) (un paziente non era valutabile a causa del tempo insufficiente in studio). Solo 3/12 pazienti avevano una malattia intracranica misurabile al basale; in questi pazienti, le migliori risposte intracraniche hanno incluso una risposta completa, una risposta parziale e una malattia stabile (riduzione del 14% delle dimensioni del tumore target). Un paziente con malattia intracranica non bersaglio al basale è progredito a livello encefalico dopo due mesi di trattamento.

Per quanto concerne i dati di sopravvivenza, la sopravvivenza libera da progressione mediana è stata di 28,3 mesi (95% IC 22-1-NE) con un follow-up mediano di 11,1 mesi, mentre la percentuale stimata di pazienti liberi da progressione a 12 mesi è stata del 67% (95% IC 58-76). A un follow-up mediano di 13,9 mesi (IQR 6,5-24.9), 23/159 (14%) erano deceduti e la sopravvivenza globale mediana è stata di 44,4 mesi (95% IC 36,5 - NE), mentre la percentuale stimata di pazienti sopravvissuti a 12 mesi è stata dell’88% (95% IC 83-94).

La sicurezza di larotrectinib è stata valutata nella popolazione più ampia di 260 pazienti esposti al farmaco (Hong et al. 2020), 4 trattati indipendentemente dallo stato di fusione TRK. Gli eventi avversi più comuni correlati al trattamento di grado 3 o 4 sono stati aumento dell’alanina aminotransferasi (otto [3%] /260), anemia (sei, 2%) e diminuzione della conta dei neutrofili (cinque [2%]).

Gli eventi avversi gravi correlati a larotrectinib più comuni sono stati aumento dell’alanina aminotransferasi (due [<1%] /260 pazienti), aumento dell’aspartato aminotransferasi (due [<1%]) e nausea (due [<1%]). Non si sono verificati decessi correlati al trattamento.

I dati di efficacia e sicurezza di larotrectinib in tumori primitivi del SNC sono stati recentemente presentati al Congresso Annuale ASCO 2021.8 Sono stati identificati 33 pazienti con tumori primari del SNC dagli studi SCOUT e NAVIGATE: 19 gliomi di alto grado, 8 gliomi di basso grado, 2 tumori glioneuronali, 2 tumori neuroepiteliali, 1 neuroblastoma del SNC e 1 piccolo tumore a cellule rotonde blu.

L’Overall Response Rate (ORR) in tutti i pazienti è stato del 30% (95% IC 16-49): 3

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

risposte complete (tutte in pazienti pediatrici), 7 risposte parziali (2 in attesa di conferma), 20 stabilizzazioni di malattia (inclusi 15 pazienti con SD>6 mesi) e 3 progressioni. La sopravvivenza libera da progressione mediana è stata di 18,3 mesi (95% IC 6,7 – NE) con un follow-up mediano di 16,5 mesi. La sopravvivenza globale mediana non è stata raggiunta (95% IC 16,9 – NE) a un follow-up mediano di 16,5 mesi, con un tasso di OS a 12 mesi dell’85% (95% IC 71-99). Gli eventi avversi correlati al trattamento sono stati riportati da 20 pazienti e sono stati di grado 3-4 in 3 pazienti (9%). Non ci sono state interruzioni del trattamento dovute a TRAE. È stata recentemente presentata infine anche un’analisi separata dell’efficacia e sicurezza di larotrectinib in 18 pazienti con tumori del tratto gastroenterico provenienti dallo studio NAVIGATE:9 10 pazienti avevano un tumore del colonretto, dei quali 7 erano ad alta instabilità dei microsatelliti (MSI-H), mentre gli altri tipi di tumore erano colangiocarcinoma (n=3), pancreatico (n=2), appendicolare (n=1), esofageo (n=1) e carcinoma epatocellulare (n=1). L’ORR nei 17 pazienti valutabili è stata del 41% (95% IC 18-67): 1 risposta completa, 6 risposte parziali (1 in attesa di conferma), 7 stazionarietà di malattia, 2 progressioni e 1 risposta non determinata. La sopravvivenza mediana libera da progressione è stata di 5,4 mesi (95% IC 2,2-11,6) a un follow-up mediano di 20,3 mesi. La sopravvivenza globale mediana (OS) è stata di 14,1 mesi (95% IC 2,8-33,4) a un follow-up mediano di 7,8 mesi.

Entrectinib Chiamato anche RXDX-101, NMS-E628 e Rozlytrek®, è un inibitore orale multichinasico di TRKA/B/C, ROS1 e ALK scoperto in Italia.10 Presenta attività chinasica in vitro per questi bersagli con valori IC50 tra 1 nM e 5 nM e la penetrazione attraverso la barriera emato-encefalica è stata dimostrata preclinicamente con un rapporto cervello/plasma nel modello murino di 0,43.10 Il farmaco ha ricevuto approvazione agnostica FDA nel 2019 e da EMA nel 2020 per la terapia dei tumori solidi con fusione genica NTRK, unitamente ad approvazione per la terapia dei tumori del polmone NSCLC metastatici con fusione ROS1.11 Gli studi clinici che hanno dimostrato l’efficacia di entrectinib sono il trial ALKA-372-001 (EudraCT 2012-000148-88), STARTRK-1 (NCT02097810) e STARTRK-2 (NCT02568267).

ALKA-372-001 e STARTRK-1 sono studi di dose escalation di fase 1, mentre STARTRK-2 è uno studio basket di fase 2. I risultati preliminari di ALKA-372-001 e STARTRK-1 in 119 pazienti sono stati pubblicati nel 2017,12 mentre nel 2021 sono state riportate le analisi integrate dei tre studi clinici con un cut-off dei dati al 202027 (tabella 5.1). In quest’ultima pubblicazione, i pazienti valutabili per l’efficacia includevano 54 adulti con tumori solidi NTRK positivi. Sono stati inclusi dieci diversi tipi di tipi di tumore, prevalentemente sarcoma (13 [24%] pazienti) e non-small cell lung cancer (NSCLC) (10 [19%]). 31 pazienti (57%) hanno presentato una risposta obiettiva, incluse 4 (7%) risposte complete e 27 (50%) risposte

Le fusioni di NTRK come bersaglio terapeutico nei tumori solidi

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parziali, mentre 9 pazienti (17%) hanno mostrato una malattia stabile. La durata media della risposta è stata di 10 mesi. Fra i 54 pazienti, 12 (22%) avevano interessamento del SNC al basale e tra gli 11 pazienti con metastasi cerebrali al basale, 6 pazienti avevano una malattia misurabile per risposta intracranica: 4 con risposta completa o risposta parziale, 1 con malattia stabile e 1 con malattia progressiva. La popolazione complessiva valutabile per la sicurezza del farmaco era di 355 pazienti, e gli eventi avversi di grado 3 o 4 più comuni sono stati l’aumento di peso e l’anemia. Gli eventi avversi più gravi sono stati disturbi del sistema nervoso, riportati in 10 (3%) dei pazienti.

Infine, analogamente a quanto riportato per larotrectinib, è disponibile un’analisi separata dell’efficacia e sicurezza di entrectinib in pazienti con tumori del tratto gastroenterico NTRK-positivi provenienti dagli studi ALKA-372-001, STARTRK-1 e STARTRK-2.14 Questa coorte di pazienti comprendeva 12 adulti (1 colangiocarcinoma; 7 carcinomi del colon-retto; 3 tumori del pancreas; 1 altra istologia) di età compresa tra 31 e 75 anni (mediana 59,5). A un follow-up mediano di 20,4 mesi, l’ORR era del 50,0% (95% IC 21,1-78,9) consistente in tutte risposte parziali. La mediana di durata della risposta, sopravvivenza libera da progressione e sopravvivenza globale sono state rispettivamente (95% IC): 12,9 (7,1-15,1), 7,1 (2,4-16,0) e 16,0 (11,2 – NE) mesi.

Tabella 5.1 Principali caratteristiche cliniche dei due farmaci anti-TRK approvati per uso clinico: larotrectinib ed entrectinib4 13 27

Posologia raccomandata

Entrectinib

Larotrectinib

600 mg/die

100 mg/bid (100 mg/m2/die fino a 100 mg bid in pazienti pediatrici)

Numero di 121 (solo ≥18 anni, con almeno pazienti valutabili 12 mesi di follow-up)

159 (0-18 anni: 52 pazienti; ≥18 anni: 107 pazienti)

Tipi tumorali

Sarcomi 21%, MASC 20%, polmone 18%, tiroide 11%, colon-retto 8%, mammella 6%, tumori neuroendocrini 5%, pancreas 3%, ovaio/endometrio 2%, vie biliari 2%, altro 5%

Sarcomi 45% (FSI 18%, GIST 3%, altri 24%), tiroide 16%, ghiandole salivari 13%, polmone 8%, colon-retto 5%, melanoma 4%, mammella 3%, vie biliari 1%, pancreas 1%, altro 3%

ORR

61,2%*

79% (0-18 anni: 92%; ≥18 anni: 73%)

SD

10,7%*

12% (0-18 anni: 8%; ≥18 anni: 15%)

DOR

20 mesi*

35,2 mesi

PFS

13,8 mesi*

28,3 mesi

Pazienti con interessamento SNC

19 (11 con malattia misurabile)*

12 (3 con malattia misurabile)

IC ORR

10/19 (7/11)*

2/3

*Valutato da BICR (blinded independent central review)

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

Altri inibitori di TRK Altri agenti multichinasici già in utilizzo clinico o in sperimentazione presentano nel loro spettro vari gradi di attività contro TRKA/B/C. Questi includono cabozantinib, crizotinib, nintedanib e ponatinib, che hanno ricevuto approvazione normativa in varie indicazioni, e gli agenti sperimentali altiratinib, foretinib, lestaurtinib, merestinib, MGCD516, PLX7486, DS-6051b e TSR-011.15 È importante notare che molti di questi farmaci sono meno potenti contro TRK (con IC50 nel range da 50 a >200 nM per nintedanib e ponatinib)16 rispetto a larotrectinib o entrectinib. Inoltre, mentre l’attività preclinica di alcuni di questi farmaci contro i modelli contenenti fusione TRK è stata descritta, la loro attività clinica non è stata ben caratterizzata come quella di larotrectinib ed entrectinib.

La resistenza farmacologica acquisita e i nuovi inibitori in grado di superarla Il problema fondamentale che impedisce di ottenere risultati duraturi per tutte le terapie oncologiche a bersaglio molecolare è la resistenza acquisita.17 Questo fenomeno di adattamento permette alle cellule tumorali di superare in modo darwiniano la pressione farmacologica, e nel caso degli inibitori di TRK si realizza principalmente attraverso meccanismi on-target, ovvero per acquisizione di mutazioni del gene NTRK che portano a modificazioni del recettore che impediscono il blocco esercitato dall’inibitore, mentre il tumore continua a dipendere dalla via di segnalazione di TRK. Il primo caso di resistenza acquisita all’inibizione di TRK è stato descritto nel 2016 dal nostro gruppo in un paziente con CRC metastatico che presentava una fusione LMNA-NTRK1 dopo 4 mesi di trattamento con entrectinib.18 Il DNA libero plasmatico (cfDNA) è stato raccolto longitudinalmente durante il trattamento e il suo sequenziamento al momento della progressione tumorale ha rivelato l’emergere di due mutazioni determinanti sostituzioni nel dominio della chinasi di TRKA - G595R e G667C.19 La sostituzione G595R in particolare si trova nella regione solvent-front del dominio della chinasi TRK e diversi studi hanno confermato che mutazioni in questo dominio conducono a modificare stericamente il sito di legame dei farmaci anti-TRK diminuendone le proprietà inibitorie e la potenza. Oltre alle mutazioni nel solvent-front, sono state riportate anche mutazioni nelle regioni gatekeeper e xDFG, come accade nei casi di resistenza acquisita agli inibitori tirosino-chinasici di ALK e ROS120 (tabella 5.1). Queste mutazioni sono state associate alla resistenza a larotrectinib ed entrectinib in diversi report e sono in sviluppo clinico inibitori TRK di seconda generazione in grado di superare questi meccanismi di resistenza. Oltre a tali fenomeni di resistenza on-target, similmente a quanto avviene per i tumori polmonari ALK e ROS1 positivi,21 nei tumori con fusione NTRK

Le fusioni di NTRK come bersaglio terapeutico nei tumori solidi

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si possono sviluppare anche fenomeni di resistenza off-target. Questi meccanismi prendono la forma di alterazioni genomiche che coinvolgono altri recettori tirosino-chinasi o mediatori nel pathway a valle (tabella 5.2). Terapie di combinazione razionali hanno dimostrato efficacia in casi di resistenza off-target, ad esempio l’utilizzo di una combinazione di un inibitore TRK e uno di MET ha permesso di ottenere una risposta in un paziente con tumore positivo alla fusione di TRK che aveva dimostrato resistenza acquisita a un inibitore di TRK di prima generazione associata ad amplificazione di MET.22

Tabella 5.2 Meccanismi di resistenza agli inibitori di TRK Meccanismi on-target

Meccanismi off-target

Mutazioni nella regione solvent front: TRKA G595R, TRKB G639R, TRKC G623R Mutazioni nella regione gatekeeper: TRKA F589L, TRKB F633L e TRKC F617L Mutazioni xDFG: TRKA G667C, TRKB G709C e TRKC G696A

Mutazioni KRAS Amplificazione MET Mutazioni BRAF Attivazione IGF1R

Nuovi inibitori in via di sviluppo Gli inibitori TRK di nuova generazione sono stati specificamente progettati per superare la resistenza acquisita on-target dovuta all’insorgenza delle mutazioni prima descritte, mantenendo una potente capacità inibitoria nei confronti di TRKA wild-type/B/C. I due principali farmaci attualmente in fase di sviluppo sono selitrectinib (Loxo-195) e repotrectinib (TPX-0005). Il vantaggio di questi inibitori è quello di avere piccole dimensioni e basso peso molecolare, il che permette di impegnare la tasca di legame dell’ATP evitando di essere penalizzati dal punto di vista sterico in caso di sostituzioni aminoacidiche nel dominio chinasico del recettore.23 Entrambi i farmaci hanno una maggiore attività contro TRKA/ B/C rispetto a larotrectinib ed entrectinib e hanno potente attività inibitoria anche in caso di mutazioni a livello di solvent front, gatekeeper o xDFG.23 24 In una casistica con selitrectinib proveniente dallo studio di fase 1 e da expanded access program di FDA, 31 pazienti con tumori positivi alla fusione TRK e pretrattati con un precedente inibitore di TRK (larotrectinib, entrectinib o PLX7486) hanno ricevuto questo inibitore di seconda generazione.25 Le istologie più comuni erano sarcoma (16%), GIST (13%) e adenocarcinoma pancreatico, mammary analogue secretory e carcinoma mammario (10% ciascuno). Nei pazienti con mutazioni nel dominio tirosino-chinasico di NTRK (la maggior parte delle quali a livello di solvent front), l’ORR è stato del 45% (9/20), mentre non si sono osservate risposte

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

nei casi in cui la resistenza alla precedente terapia anti-TRK fosse dovuta a meccanismi di bypass o sconosciuti.

Impatto dei farmaci TRK inibitori Larotrectinib ed entrectinib, che hanno ricevuto in Italia il 7 settembre 2021 la rimborsabilità ed il requisito di innovatività con un’indicazione agnostica, aprono la strada a nuovi scenari che ampliano gli orizzonti di cura per alcuni tumori rari in cui la fusione genica NTRK è frequente così come per rari sottogruppi di pazienti che presentano invece tumori frequenti. I dati provenienti dalle analisi congiunte più aggiornate dei trial clinici che hanno portato a registrazione questi due inibitori di prima generazione,4 13 unitamente ad altre casistiche e studi recenti, forniscono tre importanti elementi che caratterizzano questi farmaci e ne indirizzano l’utilizzo.

Primo, si conferma la potente attività istologia-agnostica nei tumori con fusione di NTRK, con elevate percentuali di pazienti con una risposta obiettiva (5779%), che si dimostra durevole nel tempo come ci si aspetterebbe dall’inibizione di un’alterazione da cui il tumore è strettamente dipendente. In particolare, la durata del controllo di malattia è paragonabile ad esempio a quella ottenuta da altri inibitori della tirosin-chinasi in tumori che presentano oncogene addiction, come ad esempio i pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule positivo alla fusione di ALK.26 Inoltre, sebbene la maggior parte dei tipi di tumore con fusione NTRK non presenti in genere un tropismo alla metastatizzazione a livello del SNC, una minoranza lo fa, tra cui il cancro ai polmoni, tiroide e melanoma. In questi tumori i dati suggeriscono che sia larotrectinib che entrectinib siano attivi a livello del SNC, producendo risultati terapeutici complessivamente simili a quelli che si osservano nei pazienti che non presentano metastasi al SNC, mentre per quanto riguarda i tumori primitivi cerebrali, i dati disponibili hanno dimostrato risposte rapide e durature, un alto tasso di controllo della malattia e un profilo di sicurezza favorevole.

Secondo, i dati più recenti forniscono maggiori informazioni sull’efficacia in diversi tipi di tumore comuni che erano sottorappresentati nel set di dati iniziale.

Nelle analisi congiunte più aggiornate e nei report differenziati per istotipo più recenti sono infatti maggiormente rappresentati, oltre ai tipi istologici che sono noti per essere arricchiti per la presenza di fusione NTRK come alcuni tumori infantili o i rari istotipi di tumore MASC delle ghiandole salivari o secretorio della mammella, anche big killer come il tumore del colon, polmone e mammella, verosimilmente dovuto alla sempre crescente disponibilità di diagnostica molecolare NGS che permette di rilevare alterazioni a bassa incidenza come le fusioni NTRK, rendendo di fatto l’applicabilità di questa terapia più tangibile per la pratica clinica oncologica comune.

Le fusioni di NTRK come bersaglio terapeutico nei tumori solidi

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Terzo, anche se la resistenza acquisita limita l’efficacia della terapia con larotrectinib ed entrectinib, il progresso delle conoscenze dei meccanismi molecolari sottostanti ha già permesso di delineare strategie farmacologiche ad hoc con lo sviluppo di nuovi inibitori immuni dalle vulnerabilità più frequenti o la progettazione di combinazioni razionali mirate su base individuale.

Ringraziamenti Ringrazio il Dr. Elio Gregory Pizzutilo per la tabella 5.1.

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Finito di stampare nel mese di ottobre 2021 da Ti Printing S.r.l.

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