RECOMENDACIONES EN LA TOMA DE MUESTRAS PARA MONITORIZACIÓN DE NIVELES PLASMÁTICOS DE FÁRMACOS Esther M Pozo Gómez Enfermera Hospital Virgen de la Victoria de Málaga
¿POR QUÉ MONITORIZAR EL TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO? La monitorización de fármacos en terapéutica o control del tratamiento farmacológico es la evaluación de la eficacia y de la toxicidad de los fármacos en la práctica clínica. Cuando se prescribe un fármaco lo que se pretende es producir un efecto beneficioso sobre la enfermedad del paciente. El objetivo primario de la monitorización es conseguir un mejor cuidado del paciente mediante la individualización del tratamiento farmacológico; es decir, consiguiendo el mayor beneficio terapéutico en el menor tiempo posible y disminuyendo los riesgos de toxicidad para cada paciente en particular. JUSTIFICACIÓN Esta monitorización no está justificada para todos los fármacos ni en todos los pacientes o circunstancias, sino sólo en aquellos casos en que el beneficio de la determinación supera su coste. Para que la monitorización de un fármaco esté justificada debe haber una necesidad de controlar el tratamiento mediante los niveles, unos requisitos que justifiquen que esta determinación va a ser útil y una garantía de que se realiza e interpreta correctamente. En la Tabla 1 se muestran aquellos fármacos habitualmente monitorizados en el Servicio de Farmacología Clínica y en la Tabla 2 los niveles plasmáticos correspondientes al nivel terapéutico de algunos de ellos. INDICACIONES
La monitorización de los niveles de fármacos tiene las siguientes indicaciones en la práctica clínica: - Individualización de la dosis de los fármacos. - Control del cumplimiento terapéutico. - Por falta de respuesta. - Por sospecha de toxicidad. OBJETIVO Toma de muestra de sangre y/u orina para la determinación de los niveles de fármacos. QUIEN LO REALIZA Enfermero/a. MATERIAL Toma de muestra de sangre: • Batea. • Algodón. • Antiséptico. • Jeringas (10cc y 5cc). • Aguja I.V. • Ligadura. • Esparadrapo. • Tubos de recogida de muestra: Bioquímica y/o Hemograma. Obligatorio tubo de Hemograma para niveles de Ciclosporina y Tacrolimus. • Guantes (no estériles). Toma de muestra de orina: Enfermo sin sonda: • Recipiente (no estéril). • Guantes. Enfermo con sonda: • Pinza de Kocher. • Antiséptico. • Jeringa. • Aguja de insulina o de calibre 16/26. • Recipiente (no estéril). • Guantes.
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PROCEDIMIENTO • Explicar el procedimiento al enfermo. • Reunir el material necesario. • Lávese las manos. • Proceder a la toma de muestra de sangre u orina siguiendo los protocolos: Toma de muestras de sangre mediante punción venosa y Toma de muestra de orina, teniendo en cuenta las siguientes indicaciones:
Se cortará la infusión y a los 15 minutos se extraerá: 1) Muestra de vena periférica del brazo contralateral por el que se esté administrando la ciclosporina. 2) Si el paciente porta vía central de 3 luces, sacar muestra de la luz por la que no está pasando la ciclosporina, desechando los primeros 10 cc. No obtener la muestra de la luz bloqueada
Muestras de sangre: LUGAR DE EXTRACCIÓN.- Deben obtenerse por venopunción directa. En caso de pacientes con vía central de varias luces con imposibilidad de extracción por venopunción extraer de catéter distinto al utilizado en la administración del fármaco. En este último caso desechar 10 cc de la muestra. TIEMPO DE EXTRACCIÓN.- Obtener la muestra justo antes de administrar la dosis (nivel basal o valle*). En el caso de los aminoglucósidos además del nivel valle es necesario extraer una muestra pico* para poder realizar un ajuste adecuado de la dosis. Esta muestra se extrae 30 minutos después del final de la infusión. *El muestreo en suero de los niveles de un fármaco puede hacerse cuando éstos son máximos, mínimos o cuando se ha conseguido un estado estable. Por lo que respecta a los niveles séricos de un fármaco, los tiempos de nivel máximo se refieren a las determinaciones efectuadas cuando el nivel sérico se halla en su valor más alto; los tiempos de nivel mínimo o residual representan los niveles séricos más bajos. El nivel mínimo o residual (basal o valle) de un fármaco se determina inmediatamente antes de administrar la siguiente dosis. El momento de efectuar un muestreo de nivel máximo (pico) requiere conocer cuándo presentará el valor máximo en el suero cada fármaco concreto. TIPO DE MUESTRA.- Se deben extraer 3-5ml de sangre en un tubo seco (Bioquímica) o con EDTA (Hemograma). En el caso de las ciclosporinas* y tacrolimus utilizar tubo de Hemograma. *Ciclosporinas.- Infusión continua intravenosa:
ENVIO DE LAS MUESTRAS.- Las muestras obtenidas serán enviadas al Servicio de Farmacología Clínica. Aquellos fármacos disponibles para su determinación de urgencias podrán ser enviadas además al Servicio de Farmacia. CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS.- En el caso de las muestras de sangre conservarlas en nevera (nunca congelar) si va a pasar mucho tiempo entre la extracción y el envío de la muestra. HOJAS DE PETICIÓN.- Las peticiones se realizarán en vales de Farmacología Clínica cumplimentando a ser posible los diferentes apartados. Datos necesarios para interpretar correctamente una determinación de niveles séricos de fármacos que se recogen en la hoja de petición: • Datos del paciente: Edad, sexo, peso, talla y enfermedades que padece. • Datos sobre la enfermedad (a rellenar por el médico): Enfermedad de base, motivo concreto por el que se administra el fármaco, estado clínico del paciente y respuesta al tratamiento. • Datos sobre el tratamiento (a rellenar por enfermería): Dosis, intervalo y vía de administración, duración del tratamiento. • Datos sobre la muestra (a rellenar en el momento de la extracción):
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Fecha, hora de administración de la muestra y hora de administración de la última dosis. • Motivo por el que se necesita la determinación (a rellenar por el médico): Para individualizar la dosis, para controlar el cumplimiento terapéutico, por ineficacia, por sospecha de toxicidad. Los errores o las omisiones en los datos de estas hojas pueden dar lugar a informes incompletos e incluso erróneos. DETERMINACIÓN ANALÍTICA.- Los resultados deben estar disponibles lo más rápidamente posible, preferiblemente en las primeras 24 horas después de la recepción de la muestra, ya que los usos más importantes de la monitorización son el ajuste de las dosis y el diagnóstico de toxicidad, que requieren una rápida toma de decisiones. INFORME.- En el informe se realiza una interpretación farmacocinética y farmacodinámica del resultado analítico teniendo en cuenta las características del paciente, su enfermedad y su tratamiento, así como las condiciones en que se han extraído las muestras. De acuerdo con ambas, se da una orientación terapéutica sobre los cambios de tratamiento que se consideran necesarios teniendo en cuenta la evolución de la enfermedad y la respuesta del paciente al tratamiento actual y a los tratamientos previos. Tabla 1.- TÉCNICAS DE DETERMINACIÓN CUANTITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE FÁRMACOS EN MUESTRAS ORGÁNICAS DISPONIBLES EN EL SERVICIO DE FARMACOLOGÍA CLÍNICA. A. Análisis cuantitativo en muestras de sangre: 1. Anticonvulsivantes: - Fenitoína.* - Fenobarbital.* - Carbamazepina. - Ac. Valproico. 2. Aminoglucósidos: - Gentamicina. - Tobramicina. - Amikacina. 3. Vancomicina 4. Teofilina.* 5. Digoxina.* 6. Metrotexate. 7. Paracetamol. 8. Ciclosporina. 9. Tacrolimus 10. Etanol.* B. Drogas de abuso; análisis semicuantitativo: 1. En muestras de sangre: - Benzodiacepinas. - Antidepresivos tricíclicos. 2. En muestras de orina, NO estéril: - Opiáceos.* - Anfetaminas. - Barbitúricos. - Benzodiacepinas. - Cannabis. - Cocaína. - Metadona. - Opiáceos.
Con un * se señalan aquellas muestras que pueden ser determinadas además en el Servicio de Farmacia.
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Tabla 2.- RANGO TERAPÉUTICO DE LOS FÁRMACOS MÁS FRECUENTEMENTE MONITORIZADOS. Los/as enfermeros/as deben conocer los valores normales de referencia del centro donde trabajan para poder informar sobre la observación de variaciones antes de administrar al paciente las dosis del fármaco. En la siguiente tabla se muestra el rango terapéutico de los fármacos más frecuentes monitorizados. FÁRMACO VALLE PICO__ - FENITOÍNA 10-20 ug/ml - FENOBARBITAL 15-40 ug/ml - CARBAMAZEPINA 4-12 ug/ml - AC. VALPROICO 50-1OO ug/ml - GENTAMICINA <2 ug/ml 5-10 ug/ml - TOBRAMICINA <2 ug/ml 5-10 ug/ml - AMIKACINA <10 ug/ml 20-30 ug/ml - VANCOMICINA 5-10 ug/ml - TEOFILINA 10-20 ug/ml - DIGOXINA 0,8-2 ng/ml - PARACETAMOL 10-20 ug/ml
BIBLIOGRAFÍA 1. Abad Santos, F.; Soto Matos-Pita, A.; Frías Iniesta, J. Farmacocinética clínica: monitorización de concentraciones séricas de fármacos. Medicine 1995; 6(91): 4045-4053. 2. Armijo, J.A. Farmacología clínica: objetivos y metodología. Farmacología Humana. Masson, S.A. Flores, J. Tercera Edición. Barcelona, 2000. 3. Gross, A.S. Best practice in therapeutic drug monitoring. British Journal of Clinical Pharmacology. Volume 52. Supplement 1-2001. Therapeutic Drug Monitoring. 4. Rodriguez-Mendizábal, M.; Lucena, M.I.; Cabello, M.R.; Blanco, E.; LópezRodriguez, B.; Sánchez de la Cuesta, F. Variations in Blood Levels of Aminoglycosides Related to In Vitro Anticoagulant Usage. Therapeutic Drug Monitoring. 5. Lippincott-Raven Publisher. Philadelphia, 1998. 6. Velasco Martin, J.L. Farmacología y Terapéutica Clínica. S.A. de Ediciones. Primera Edición. Madrid,1993. 7. Vincent Carbett, J. Control de los niveles de fármacos y pruebas toxicológicas. Pruebas de laboratorio, exploraciones y diagnósticos de enfermería. Ediciones Doyma. 1990. 8. Boletín Hospital Universitario, Vol.4, nº 11-12. Noviembre- diciembre, 1991.Servicio de Farmacología Clínica. 9. Boletín Hospital Universitario, Vol.5, nº 2-3. Febrero-Marzo, 1992. Servicio de Farmacología Clínica. AGRADECIMIENTOS Al personal del Servicio de Farmacología Clínica del Hospital Universitario Virgen de la Victoria, especialmente a la Dra. Mª Isabel Lucena por la documentación aportada y la revisión realizada del presente manuscrito.
E.D.T.A.
E.D.T.A.
Sinónimos:
Acido etilendiamino tetraacético; Acido edético; Acido tetracémico.
Descripción:
Polvo cristalino blanco, inodoro.
Fórmula empírica:
C10H16N2O8
Peso molecular: 292.24
Punto fusión:
aprox. 220 ºC (desc.)
pH sol. acuosa 0.2%
aprox. 2.2
Solubilidad:
Agua
Soluble (1:500)
Etanol
Prácticamente insoluble
Cloroformo
Prácticamente insoluble
NaOH 0.1N
Soluble
E.D.T.A. Disódico
Sinónimos:
Edetato disódico; Edetato sódico; Tetracemato disódico; Etilendiaminotetraacetato disódico; Acido etilendiaminotetraacético sal disódica 2-hidrato.
Descripción:
Polvo cristalino blanco, inodoro.
Fórmula empírica:
C10H14N2Na2O8 . 2 H2O
Peso molecular:
372.24
Punto fusión:
248 - 254 ºC (desc.)
pH sol. acuosa 5%
4.0 - 6.0
Solubilidad:
Agua
Soluble (1:11)
Etano Ligeramente soluble l
Eter
Prácticamente insoluble
Una solución al 4.44% es isoosmótica con el plasma.
Propiedades y usos:
El EDTA y sus sales se utilizan principalmente como agentes quelantes en la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria. Debido a esta acción quelante se utiliza para disminuir la dureza del agua, secuestrando iones calcio y magnesio, presentes en las aguas duras. También se utilizan como antioxidantes, sólos o como sinérgicos de otros antioxidantes, por secuestrar trazas de iones metálicos (cobre, hierro y manganeso, que pueden catalizar reacciones de oxidación). Aunque los edetatos no tienen acción antimicrobiana, también se utilizan como sinérgicos de conservantes debido a que ejercen una acción bacteriostática al secuestrar metales necesarios para el crecimiento bacteriano. El EDTA se utiliza también como anticoagulante en investigaciones hematológicas, debido a que previene la coagulación de la sangre in vitro. La sal disódica se utiliza por vía IV en el tratamiento de emergencia de la hipercalcemia y en el control de arritmias cardíacas inducidas por digitálicos, debido a que forma un complejo estable y soluble con el calcio, fácilmente excretado por el riñón. También se ha usado en la terapia de opacidades calcificadas de la córnea y de quemaduras por cal del ojo, bien tópicamente después de eliminar el área epitelial, o por iontoforesis. El edetato disódico se emplea también en irrigaciones, para el tratamiento de lesiones oculares con cloruro de cinc, aunque puede ser ineficaz si no se trata durante los dos primeros minutos.
Así mismo se emplea en la limpieza de lentes de contacto.
Efectos adversos:
Por inhalación producen broncoconstricción, por lo que no deben estar presentes como conservantes en nebulizadores para el tratamiento de la broncodilatación. Pueden provocar hipocalcemia cuando se administran por infusión intravenosa muy rápida, o en soluciones demasiado concentradas, causando tetania, convulsiones, parada respiratoria y arritmias cardíacas. Cuando se usan por vía oral, pueden causar descalcificación de los dientes. El uso de la sal disódica como hipocalcémico está limitado, a pesar de ser muy eficaz, debido a las complicaciones nefrotóxicas que puede ocasionar (necrosis tubular renal). Pueden aparecer también náuseas y calambres. Cuando se administra por infusión intravenosa puede provocar tromboflebitis. Otras reacciones adversas incluyen fiebre, mialgia, respuestas parecidas a la histamina como estornudos, congestión nasal y lagrimeo, erupciones cutáneas, hipotensión transitoria y alteraciones en el electrocardiograma.
Dosificación:
Agente quelante: dosis de 0.005 0.1%
Sinérgico de antioxidantes: dosis de 0.005 - 0.1%
Sinérgico de conservantes: dosis de 0.01 - 0.1%
Como hipocalcémico: o Adultos: dosis de 50 mg/kg de peso diario por vía IV lenta, hasta un máximo de 3 g/día. El inyectable debe ser diluido en 500 ml de suero fisiológico o una solución glucosada al 5%, perfundido preferentemente entre 4 - 6 horas. o Niños: dosis de 40 - 70 mg/kg de peso diarios. El inyectable debe ser diluido en 500 ml de suero fisiológico o una solución glucosada al 3%, perfundido preferentemente entre 4 - 6 horas.
Contra opacidades de córnea: soluciones al 0.35 - 1.85%.
Limpieza lentes contacto: concentraciones de 0.1%.
Como anticoagulante in vitro: 0.1 0.3%.
Incompatibilida Incompatible con agentes oxidantes des: fuertes, bases fuertes e iones metálicos polivalentes como el cobre, níquel y aleaciones de cobre. Se comporta como un ácido débil, desplazando el dióxido de carbono de los carbonatos y reaccionando con los
metales para formar hidrógeno. Disminuye el efecto antimicrobiano del timerosal.
Precauciones:
EDTA disódico: Está contraindicado en insuficiencia renal. Debe usarse con precaución en pacientes con tuberculosis, insuficiencia cardíaca o historial de convulsiones. Es necesario el control de las concentraciones de electrolitos en plasma, en particular la del ion calcio.
Observaciones: EDTA:
Reposición:
Bibliografía:
EDTA disódico:
IRRITANTE
NOCIVO.
R: 36
R: 22
En envases bien cerrados.
- The Merck Index, 13ª ed. (2001).
- Martindale "The complete drug reference", 32 ed. (1999).
- Monografías Farmacéuticas, C.O.F. de Alicante (1998).
- Handbook of Pharmaceutical Excipients, The Pharmaceutical Press (1986).
El Ácido etilendiaminotetracético, conocido comercialmente como EDTA, es uno de los agentes orgánicos más importantes para la obtención de Quelatos. Su fórmula es (HOOCCH2)2NCH2CH2N(CH2COOH)2.
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1 Propiedades
2 Aplicaciones
3 Ver también
4 Fuentes
Propiedades Es un sólido cristalino, incoloro que se descompone a 240°C. Poco soluble en agua e nsoluble en los disolventes orgánicos comunes. Es neutralizado por los hidróxidos que forman los Metales alcalinos, dando lugar a una serie de sales solubles en agua que contienen de 1 a 4 cationes del metal.
Se obtiene por:
Adición de Cianuro de Sodio y Metanal (Formaldehído) a una solución básica de Etilendiamina, formando la sal trisódica.
Calentamiento de Tetrahidroxietilendiamina con Hidróxido de sodio o Hidróxido de potasio usando un catalizador de Óxido de Cadmio.
Aplicaciones
Detergentes, jabones líquidos y champúes.
Pulverizaciones químicas para la agricultura.
productos alimenticios para combatir la deradación catalizada por trazas de metales.
Tratamiento de metales en operaciones de limpieza y plateado.
Tratamiento de la Clorosis.
Descontaminación de superficies radioactivas.
Desactivador de metales en aceites vegetales.
Mejorar las propiedades de teñido de tejidos y las operaciones de descrudado y lavado.
Antioxidante.
Clarificación de líquidos.
Procedimientos - Inmunidad Celular Fenotipificación de Celulas CD3, CD4, CD8, CD19 y CD56 por CFTres Colores Ciclo Celular Apoptosis Proliferación Celular Fagocitosis Producción de Perioxido de Hidrógeno H2O2 Referencias Ingestión y Muerte de Levaduras por Monocapas de Polimorfonucleares Introducción La identificación y determinación del número de células y/o linfocitos con diferentes marcadores de membrana de importancia diagnóstica en el laboratorio clínico se lleva a cabo actualmente a través de una metodología de alta sensibilidad, precisión y rapidez. La citometría de flujo detecta la cantidad de anticuerpos monoclonales fluorescentes unido a cada célula individual que facilita la identificación y tipificación de diferentes grupos y sub grupos de poblaciones celulares. En el citómetro de flujo cada célula atraviesa un rayo láser. Las células deflectan o dispersan la luz del láser de una forma estrechamente relacionada con su tamaño y granularidad que es registrada en un detector. La molécula de fluorocromo unida al anticuerpo monoclonal absorbe luz del láser y emite, en otra longitud de onda en que su intensidad es captada por otro detector que está en ángulo recto al rayo. Ambos fenómenos identifican correctamente las poblaciones celúlares. Reactivos y Materiales Sangre con anticoagulante, de preferencia EDTA o heparina (2 a 5 mL) Conjugados: Anti-CD45-FITC / CD4-PE / CD3-PC5 Anti-CD45-FITC / CD8-PE / CD3-PC5 Anti-CD45-FITC / CD19-PE / CD3-PC5 Anti-CD45-FITC / CD56-PE / CD3-PC5 Equipo preparador muestra. "Q-Prep Coulter" u otro. Reactivo "Immunoprep Coulter" u otro (soluciones lisante, estabilizadora y fijadora). Citómetro de Flujo. "Coulter Epics XL" u otro. Desarrollo del proceso Añadir a tubos diferentes 50µL de sangre con anticoagulante (muestra paciente y una muestra control). Agregar 5 µL de cada conjugado a cada tubo, debidamente rotulado. Mezclar e incubar por 15 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. Llevar la muestra al "Q-Prep Coulter" y trabajar en el ciclo de 35 segundos. Se adicionan automáticamente con agitación las soluciones de lisis, estabilizadora
Ciclo Celular Introducción
Una de las propiedades más importante de los organismos vivos es la capacidad de replicarse, que es definido por el ciclo celular. La célula no involucrada en la división celular se mantiene en estado G0, al gatillarse la división, la célula entra en la fase G1, que corresponde a un período de actividad biosintética encaminada a sintetizar toda una serie de proteínas necesarias para la progresión a la fase S. La fase S se caracteriza por tener lugar la replicación del material genético, pasando la célula con una dotación cromosómica 2n (diploide) a 4n (tetraploide), la fase G2 corresponde a un segundo intervalo que precede a la fase M, en la cual acontece la división nuclear y citoplasmática. La cuantificación de ácidos nucleicos por citometría de flujo se utiliza con dos finalidades básicas: 1) identificar la existencia o no de alteraciones cuantitativas de DNA o aneuploidia y 2) conocer la distribución de una determinada población celular (por ejemplo, tumoral) a lo largo de las distintas fases del ciclo celular. Reactivos y Materiales Placa Petri. Pepsina al 0.5 % (PBS 0,01MipH 7.2. Ajustar a pH = 1,5 con HCl1N. Tubo siliconizado 15 ml. Agujas, jeringa. Filtro de 50 y 30 µm Tampón de tinción (50µg/mL de yoduro de propidio, 20µg/mL de RNAasa A, 0.1% citrato de sodio y 0.3% Nonidet P-40) Solución de lisis ( 150mM cloruro de amonio, 10mM KHCO3 y 1mM EDTA) Control glóbulo rojo de pollo. Control linfocitos de sangre periferica.
Desarrollo del proceso Tejido Fresco La muestra es recolectada asépticamente y mantenida en medio RPMI 1640 o equivalente. La disgregación de la muestra se realiza en presencia de 1 mL de pepsina al 0.5% en PBS en una placa de petri. Luego, la preparación se transfiere a un tubo siliconizado y se incuba a 37ºC por 30 a 60 min con agitación períodica. Filtrar por una malla o filtro de 50 µ. Centrifugar. Las células se marcan con 0.5 mL de tampón de tinción, se agitan por 10 segundos y se incuban por 2 horas en fríoa 4°C. Adquirir en el Citómetro de Flujo. El análisis de DNA se lleva a cabo utilizando un software denominado "Multicycle AV". En un histograma con más de una población, se debe considerar la existencia de un nuevo ciclo celular, que debe ser cuantificado si presenta una mínima sobreposición. Sangre Total Tomar 100µL de sangre en EDTA
Lisar los glóbulos rojos con 2 mL de solución de lisis. Lavar dos veces con PBS. Resuspender con 0.5 mL de tampón de tinción. Incubar por 2 horas en frío a 4°C. Apoptosis Introducción La apoptosis se define como muerte celular programada codificada genéticamente, que es morfológica y bioquímicamente distinta a la necrosis o muerte celular accidental. La apoptósis programada se caracteriza por cierto cambios morfológicos, que incluyen, una condensación del citoplasma y núcleo y la pérdida de asimetría en los fosfolípidos de la membrana plasmática. Además, de cortes intranucleosomales del DNA. El resultado final es una compleja cascada bioquímica, por tanto, es una parte integral de la homeostasis fisiológica. El estudio de la poptósis por citometría de flujo se basa en las propiedades de unión de la Annexin V-FITC, con la fosfatidilserina. Un lípido cargado negativamente, normalmente restringido a la cara interna de la membrana plasmática, pero externalizado en una etapa temprana de la apoptósis a la superficie celular, generando un cambio estructural de la membrana plasmática. La adición de yoduro de propidio (IP) permite determinar la viabilidad de la célula.
Reactivos y Materiales Kit ANNEXIN V FITC. Solución de Ficoll-Hypaque.d:1.077(solución A: Hypaque, diatrizoato de sodio, al 37.77% en agua destilada y solución B: Ficoll, 400.000 daltons, al 9% en agua destilada. Mezclar una parte de A y tres partes de B. Ajustar densidad) PBS 0.01M;pH 7.2 Agua Destilada. Baño de Hielo
Desarrollo del proceso Tomar 8 ml de sangre en heparina. Separar los linfocitos por gradiente de Ficoll-Hypaque. Lavar las células dos veces con PBS Centrifugar y resuspender las células en el tampón del Kit de tal forma de obtener una concentración de 106 céls./ml. Agregar 5 µl de Annexin V FITC y 5 µL de IP a 490 µl de la suspensión celular. Colocar los tubos en frío y oscuridad por 10 min. Adquirir la muestra por Citometría de Flujo.
Proliferación Celular Introducción La determinación de la proliferación celular juega un rol fundamental en el estudio de la biología celular, investigación clínica e inmunología. Actualmente la proliferación celular se basa en la detección de marcadores como los antígenos Ki-67 y PCNA (antigeno nuclear de proliferación celular). El Ki-67 es un antígeno nuclear que está estrictamente correlacionado con la proliferación. Durante la interfase el antígeno puede ser exclusivamente detectado en el núcleo, mientras que en la mitosis mucha proteína es relocalizada en la superficie de los cromosomas. A pesar de estar bien caracterizado a nivel molecular, la significancia funcional aún no está del todo clara. La proteína Ki-67 está presente durante toda la fase activa del ciclo celular, es decir, en las etapas G1, S, G2 y mitosis, pero está ausente en G0, por lo tanto no es detectable durante la reparación del DNA. La forma de evaluar un marcador de proliferación, es a través del índice de proliferación, que combinado con otras determinaciones, como por ejemplo el índice de DNA, permite predecir el pronóstico de una enfermedad.
Reactivos y Materiales Kit anticuerpo monoclonal anti- Ki-67. (Almacenar 2-8ºC). Tampón PBS con BSA al 0,5% y Tween 20 al 0,05%. Tubos siliconizados. Solución de Ficoll-Hypaque.d:1.077(solución A:Hypaque, diatrizoato de sodio, al 37.77% en agua destilada y solución B: Ficoll, 400.000 daltons, al 9% en agua destilada. Mezclar una parte de A y tres partes de B. Ajustar densidad) PBS 0.01M;pH 7.2. Yoduro de propidio: 20 ug/mL (IP).
Desarrollo del proceso Colectar 8 ml de sangre en heparina Separar los linfocitos por gradiente de Ficoll-Hypaque. Lavar las células con PBS 0.01M;pH 7.2 Ajustar y fijar las células a 1*107 con 2 ml de etanol al 70 % a 4ºC por 5 min. Centrifugar 1000 x g por 10 min. Eliminar el sobrenadante.a 4ºC. Lavar dos veces con 2 mL de PBS con BSA y Tween 20. Ajustar a 1-3x106 céls/prueba. Centrifugar a 1000 x g por 10 min. Aspirar al máximo el sobrenadante. Agregar 20 µl de monoclonal Ki-67 y 80 m L de PBS con BSA y Tween 20. Incubar por 30 min a 4ºC. Agregar 2 ml de PBS con BSA y Tween 20. Centrifugar a 1000 x g. por 10 min. Resuspender y agregar 2 mL de PBS. Centrifugar a 1000 x g. por 10 minutos Al pellet agregar 250 µl de PBS más 1 ml de IP (20 µg/mL). Incubar 30 minutos Adquirir en el Citometro de Flujo.
Algunos inmunocomplejos solubles (p.ej., los formados con toxinas Fagocitosis contienen pocas IgG, de modo que directamente no bacterianas) Introducción pueden ser reconocidos por receptores FcR en la superficie de los fagocitos. Estos inmunocomplejos desencadenan su propia La fagocitosis es un proceso característico sólo de neutrófilos, monocitos y macrófagos, eliminación activando directamente el complemento: se une C3b y y en menor grado de eosinófilos y basófilos. Este proceso es favorecido cuando los C4b, que son reconocidos porpor CR1 la superficie de eritrocitos, que microorganismos están recubiertos IgG,en subclases 1 ó 3 y/o fracciones del complemento los (C3b pasan al hígado alneutrófilos, bazo, donde sony macrófagos capturados porreceptores macrófagos. y C4b), debido a y que monocitos poseen para estas opsoninas. Precisamente, cuando por alguna razón este sistema no funciona adecuadamente, los complejos Ag-Ac yseMateriales acumulan en tejidos, dando lugar a enfermedades por hipersensibilidad de Reactivos tipo II. Las personas con lupus eritematoso sistémico con deficiencias en los componentes C1, C2 y C4, forman inmunocomplejos a los que se une poca C3b, por lo que no pueden ser Tampón Carbonato/bicarbonato 0.5 M; pH 9.5 eliminados, ocasionando ello reacciones hipersensibles de tipos II y III. Levaduras: Candida albicans en tampón carbonato/bicarbonato para marcar las levaduras (5 mg/mL). 16.6.4 FITC Mejora de la respuesta inflamatoria Solución de lisis de glóbulos rojos. (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 y 1 mM EDTA). 1) Conceptos generales DNasa tipo I (2000 unidades Kunitz). Disolver el contenido del frasco en 5 mL de acetato de sodio 20mM. Solución DNasa I (100 µL de DNasa I más 900 µL de PBS). Los pequeños péptidos difusibles C3atipo y C5a, liberados durante la
activación PBS del 0.01M; complemento, cumplen la importante función de pH 7.2. anafilotoxinas: reclutan células al sitio de infección (sitio PBS 0.01M; pH 7.2 con EDTAinflamatorias al 0.02%. de inflamación) y activan sus funciones efectoras. PBS 0.01M; pH 7.2 con Tritón X 100 0.5 %. Solución de Bromuro de Etidio en PBS. Stock 1 mg/mL. Se utiliza en una
La inflamación agudadeya concentración 50había µg/mL. sido descrita pertinentemente (en sus manifestaciones por los (siglo Solución visibles) Yoduro de Propidio enromanos PBS. Stock 1 mg/mL.I), Seque utilizala en una concentración de 100 µg/mL. caracterizaban por los llamados cuatro signos cardinales: rubor (enrojecimiento), tumor (hinchazón), calor y dolor. Estos signos reflejan algunos de los mecanismos fisiológicos puestos en juego: la Desarrollo del proceso vasodilatación provoca un eritema (de ahí el color rojo); el aumento a) Tinción de las levaduras. de la permeabilidad capilar supone un aflujo de fluido rico en Utilizar material y reactivos esteriles proteínas (lo de que explica hinchazón) Producción Perioxido dela Hidrógeno H2O2 y con abundantes leucocitos fagocíticos (que al dañar a células vecinas puede originar pus). El calor y dolor son manifestaciones de sendos sistemas fisiológicos destinados a ayudar a la destrucción del patógeno y a la recuperación del individuo. Hay que aclarar que la inflamación no sólo se pone en marcha por infecciones, sino en general cuando hay daño en tejidos. Lo que caracteriza la inflamación asociada a infecciones es la implicación masiva de elementos del sistema inmune, y la regulación por citoquinas. Además, la inflamación ante infección se inicia en ausencia de activación del complemento; lo que aporta ésta es una gran potenciación de los efectos benéficos de la inflamación. La reacción inflamatoria aguda incluye dos tipos de respuesta, una localizada y otra sistémica.
En la respuesta localizada se produce la activación de tres tipos de cascadas enzimáticas: la de coagulación, la de quininas (cininas), y la de fibrinolisis (que seguramente el alumno habrá estudiado en la asignatura de Fisiología Animal). Si la respuesta es ante una infección, además, veremos otros fenómenos que vamos a estudiar enseguida. La respuesta sistémica se suele conocer como respuesta de fase aguda. En ella se produce la inducción de fiebre, aumenta la síntesis de ACTH y glucocorticoides, aumenta la leucocitosis, y el hígado produce las llamadas proteínas de fase aguda.
La respuesta de inflamación aguda restringe el daño al sitio de infección o al lugar de la herida, evitando su diseminación a otras partes del organismo. 2) La reacción local antes del complemento: eventos moleculares y celulares
Cuando entra el microorganismo al tejido, la primera célula defensiva que lo detecta suele ser un macrófago tisular. Al engullir y procesar al patógeno, el macrófago libera varias citoquinas: TNF- , IL-1 e IL-6, que son responsables, como vamos a ver, de muchas de las reacciones localizadas y sistémicas. Veamos sus actuaciones a nivel local: las tres actúan sobre los fibroblastos y las células endoteliales cercanas, induciendo dos fenómenos: el inicio de la coagulación (por deposición de matriz de fibrina), y el incremento de la permeabilidad capilar. Inducen la aparición de gran número de moléculas de adhesión intercelular en las células del endotelio cercano: ELAM (que va a permitir la extravasación de neutrófilos), ICAM (que hará lo propio con los linfocitos) y VCAM (que promueve la extravasación de monocitos, que al entrar al tejido, se diferencian a macrófagos). El TNF- y la IL-1 provocan la secreción de la quimioquina IL-8 por parte de macrófagos y células endoteliales. Esta IL-8 es un potente factor quimiotáctico, que aumenta el influjo de neutrófilos.
Por otro lado, el IFN- (producido por linfocitos TH) y el TNF- del macrófago activan a más fagocitos (macrófagos y neutrófilos), que mejoran sus cualidades de fagocitosis y liberan enzimas líticas. Los macrófagos activados fabrican elementos del complemento, que pueden actuar localmente. Al mismo tiempo, el aumento de permeabilidad capilar permite la entrada al tejido de anticuerpos y componentes del complemento: es
ahora cuando se activa el complemento, una de cuyas consecuencias es la liberación de los pequeños péptidos C3a y C5a, cuya acción potencia y mejora la respuesta local de inflamación. 3) Acción de las anafilotoxinas derivadas de la activación del complemento
De los pequeños péptidos con actividad de anafilotoxinas liberados durante la activación del complemento, el más potente es el C5a, seguido por el C3a (1/20 de la de C5a). El C4a tiene poca actividad (sólo 1/2500 del C5a). De ellos, sólo se ha caracterizado el receptor de C5a (ver apartado 16.5.2). Nos referiremos conjuntamente los dos primeros (aunque no producen los dos la misma gama de efectos). Sus efectos son: activación de células mieloides. En neutrófilos esto se refleja en la potenciación de sus mecanismos matadores: estallido respiratorio, que les permitirá producir grandes cantidades de radicales libres. Se producen prostaglandinas (PG), sobre todo por los mastocitos en presencia de IgE, y eicosanoides como los leucotrienos (LT), con efectos diversos en la respuesta sistémica y en la local (uno de los leucotrienos actúa de factor quimiotáctico para fagocitos). Los neutrófilos aumentan sus moléculas de adhesión, lo que les permite adherirse a las células endoteliales, y finalmente pasar por diapédesis al tejido. Quimiotaxis sobre PMN neutrófilos, monocitos/macrófagos, eosinófilos y mastoscitos y basófilos. Degranulación de mastocitos tisulares: se libera el contenido, con histamina, serotonina y otros mediadores farmacológicamente activos, que promueven más contracción de la musculatura lisa e incremento de la permeabilidad capilar. La potenciación de la vasodilatación provoca la salida de fluido al tejido, lo cual a su vez acelera el paso del patógeno a alguno de los ganglios regionales, con lo que iniciará la respuesta inmune adaptativa. 4)
Respuesta sistémica (respuesta de fase aguda)
Las respuestas sistémicas ante una infección dependen principalmente de las tres citoquinas segregadas por el macrófago en las primeras fases de la inflamación (IL-1, IL-6 y TNF- ): actúan sobre el hipotálamo, y junto con las prostaglandinas intervienen en los mecanismos fisiológicos de la fiebre y el dolor. La fiebre es una respuesta adaptativa de aumento de la temperatura corporal mediante
un aumento del metabolismo de grasas y de proteínas en el tejido adiposo, hepático y muscular. En principio pues, la fiebre es una medida positiva para el individuo, ya que inhibe el crecimiento de muchos patógenos y mejora la respuesta inmune. Provocan la liberación de ACTH, que al actuar sobre las corteza suprarrenal induce la producción y secreción de glucocorticoides, con un papel en la protección frente a situaciones de peligro y estrés.
Conforme estas citoquinas se van acumulando, a las 12-24 horas, inducen la producción por los hepatocitos de las proteínas de fase aguda: proteína C-reactiva (CRP). Esta proteína aumenta unas 1000 veces desde su nivel basal. Se une a las cubiertas de ciertas bacterias y hongos que en principio son resistentes al complemento, permitiendo la deposición de éste. De esta forma el C3b ahora puede ser reconocido por el receptor CR1 de los fagocitos, que podrán intentar la destrucción del microorganismo. Proteína de unión a mananos (MBP). proteína amiloide A sérica fibrinógeno.
El TNF- también actúa sobre las células endoteliales y los macrófagos, que producen citoquinas hematopoyéticas (GM-CSF, MCSF, G-CSF), que al llegar a la médula ósea inducen un aumento de la generación de leucocitos (leucocitosis). El TNF-, la IL-6 y la IL-1 estimulan la producción de casi todas las proteínas del complemento (sobre todo las de la vía alternativa), mientras que el IFN- estimula la producción de todos los componentes del complemento. 5)
Regulación de la inflamación y reparación del tejido dañado
La respuesta inflamatoria está limitada en cuanto a su duración y a su intensidad (de otra forma, llegaría a agredir al propio hospedador), y esta regulación permite la reparación del tejido dañado. Uno de los factores que limitan la respuesta es el TGF- , que a su vez promueve la acumulación y proliferación de fibroblastos. Los fibroblastos van depositando una matriz extracelular de fibrina (coágulo de sangre), que evita la diseminación de la infección.
Cuando la infección remite, y la mayoría de restos celulares y del patógeno han sido eliminados por los fagocitos, comienza la reparación del tejido: crecen capilares en el coágulo de fibrina (angiogénesis) la acumulación de fibroblastos y fibrina se manifiesta como una cicatriz.
(C) 1999 Enrique Iáñez Pareja. Prohibida la reproducción con fines comerciales.
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El EDTA disódico, también conocido como EDTA o ácido etilendiaminotetraacético, tiene una amplia gama de usos en productos de consumo, especialmente en alimentos procesados, cosméticos, productos de limpieza y productos para el cuidado personal.
Aplicaciones médicas El EDTA disódico tiene varios usos médicos. Se utiliza para tratar el envenenamiento por mercurio y otros metales pesados y para eliminar el exceso de hierro y calcio del cuerpo. También es un efectivo anticoagulante, que se utiliza en transfusiones sanguíneas y en análisis de sangre.
