Citometría de flujo
Bibliografía: Flow Cytometry: Principles and Applications Editado por Marion G. Macey, PhD. (capítulos 1 y 11)
http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/
Para qué queremos contar y clasificar células? Un ejemplo: Infección por HIV
• El virus se une a receptores de membrana (CD4) de ciertos linfocitos T (que son parte del sistema inmunológico), se replica y finalmente los destruye. • El número de estos linfocitos nos informa del estado inmunológico del enfermo
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Cómo sabemos cuáles son linfocitos T CD4+?
Para clasificar y contar células específicas necesitamos: a. Diferenciar los linfocitos del resto de las células de la sangre b. Usar una sonda que se una específicamente a proteínas de membrana únicas en las células de interés y que pueda ser observada con facilidad.
Anticuerpos o Inmunoglobulinas Intervienen en la respuesta inmune de los organismos ante la presencia de un patógeno • Se unen al antígeno y lo inactivan • Esta unión ayuda a activar la respuesta inmune
región a la que se une el antígeno La región variable es la zona de reconocimiento del antígeno
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Un ejemplo: anticuerpos en infecciones bacterianas
Unión antígeno-anticuerpo Ag + Ac Ag-Ac K= 104-1011 M-1 Fab
Fc
también puede haber unión al Fc pero con menor afinidad
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5 clases de anticuerpos que se diferencian por la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada
Propiedades
IgM
IgD
IgG
IgA
IgE
cadena pesada
μ
δ
γ
α
ε
número de unidades
5
1
1
1 or 2
1
% en sangre
10
<1
75
15
<1
Marcación con anticuerpos Los anticuerpos presentan alta afinidad y especificidad por un antigeno dado sondas muy específicas Indirecta
Directa
Ac
Simple y rápida
• se puede usar un Ac marcado para muchas marcaciones distintas • se amplifica la respuesta (varios Ac secundarios se unen a uno primario)
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Uso de anticuerpos para microscopía de fluorescencia
Figure 1 Primary rat hippocampus neurons. Immunofluorescence detection of primary neuronal cells stained with mouse anti-MAP2 antibody (green) and astrocytes stained with rabbit anti-GFAP antibody (red). Nuclei are stained with DAPI (blue)
Otras aplicaciones: ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay )
Biochemistry. 5th edition. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L.
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Aplicaciones de ELISA: Test de embarazo Se detecta gonadotrofina coriónica humana (hCT) producida en la placenta
Los anticuerpos pueden usarse para detectar proteínas expecíficas de células
Cómo las contamos y clasificamos rápidamente?
Citometría de flujo
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Para qué queremos contar y clasificar células? Un ejemplo: Infección por HIV
• El virus se une a receptores de membrana (CD4) de ciertos linfocitos T (que son parte del sistema inmunológico), se replica y finalmente los destruye. • El número de estos linfocitos nos informa del estado inmunológico del enfermo
Objetivos de citometría: 1. Realizar medidas (de fluorescencia y dispersión de luz) sobre células individuales para clasificarlas. Las células se estudian individualmente pero se realizan los análisis en una población grande (104) de células 2. Separar distintas subpoblaciones de acuerdo a sus propiedades
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Citometría de flujo Surge a mediados de la década del ´70 Resulta de avances en: • Microscopía • Tinciones citoquímicas – Tinciones fluorescentes (1880) – Anticuerpos conjugados (1950) – Anticuerpos monoclonales (1975) • Electrónica – Fotomultiplicador (1945) • Computación
Esquema general de un citómetro de flujo
celda de flujo
óptica para la separación de señales
detectores fuente de excitación
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La celda de flujo Sample Sheath
Flow chamber
Laser optics
Laser Beam
Se estudian 5000- 50000 células/s
El punto de interrogación
laser
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Cómo sabemos cuáles son linfocitos T CD4+? Podemos reconocer los linfocitos por sus propiedades únicas de tamaño y granulosidad
Qué señales colectamos? Dispersión de luz: Forward scattering
Se mide la dispersión de luz para ángulos entre 0.5–10° (proporcional a r2) http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/
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Qué señales colectamos? Dispersión de luz: Side scattering
La dispersión va a depender del “contenido” de la célula: granulosidad o complejidad http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/
Representación de los datos: Histogramas y dot plots
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Este tipo de representación simplifica la detección de poblaciones celulares
separamos los linfocitos!
Cómo sabemos cuáles son linfocitos T CD4+? Se pueden utilizar anticuerpos para reconocer ciertas proteínas de membrana características de tipos específicos de linfocitos
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Esquema general de un citómetro de flujo
celda de flujo
óptica para la separación de señales
detectores fuente de excitación
Además de la información de dispersión de luz colectamos la fluorescencia de cada célula Podemos seleccionar una población y analizar la distribución de fluorescencia de esa población
analizamos únicamente la distribución de fluorescencia de los linfocitos
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Cómo sabemos cuáles son linfocitos T CD4+?: tenemos que saber 1. cuales son linfocitos T? 2. cuales de estos linfocitos son CD4+? CD3= marcador de linfocitos T: anticuerpos anti CD3 linfocitos T
Cómo sabemos cuáles son linfocitos T CD4+?: tenemos que saber 1. cuales son linfocitos T? 2. cuales de estos linfocitos son CD4+? Anticuerpos anti CD4 que emitan a otra
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Controles y calibraciones 1. Coeficiente de variación (CV): el ruido experimental se determina con microesferas de tamaño uniforme CV = (SD/promedio) × 100 SD= desvío standard de la distribución
2. Control de isotipo: se necesita conocer la unión inespecífica del anticuerpo. Se usa anticuerpo de igual Fc y distinto Fab
Controles y calibraciones 3. Compensación La emisión de fluorescencia de una (o varias) de las sondas se ve en más de 1 detector
s1 =fa,1.sa+(1-fb,2).sb s2 =(1-fa,1).sa +fb,2.sb 1 y 2 = número de detectores a y b = sondas fluorescentes
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Cell sorting: separación y clasificación de células Objetivo: separar una población celular en una muestra compleja para estudiarla posteriormente
deflection plates
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