INDUCCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE INTERFERÓN GANMA (IFN-γγ) EN CULTIVOS DE LINFOCITOS T DE BOVINOS CON HIPODERMOSIS MODULATORY EFFECT OF THE HIPODERMIN A ON THE SECRETION OF GAMMA INTERFERON (IFN-γ) IN CULTURES OF LYMPHOCITES FROM CATTLE WITH HIPODERMOSIS DACAL V., PANADERO R., LÓPEZ C., VÁZQUEZ L., MORRONDO P., DÍEZ P. Parasitología y Enfermedades Parasitarias. Dpto. Patología Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad de Santiago de Compostela. 27002. Lugo. ABSTRACT The effect of the antigen hipodermin A (HA) on the secretion of gamma interferon (IFN-γ) by lymphocytes of cattle infested and non infested by Hypoderma lineatum and its effect on the activity of the mitogens concanavalin A (Con A) and phytohemaglutinin (PHA) were studied. Cows that presented warbles on their back were used as positive animals and calves 6 months old as negative. The lymphocytes was isolated from those animals and they were cultivated for 24, 48 and 72h with 11µg of HA and different concentrations of both mitogens (Con A and PHA). The stimulation of lymphocytes with HA without mitogen, did not induce the secretion of INF-γ. The coincubation with Con A increased considerably the secretion of IFN-γ in the infested animals, with a maximum at 48 h. On the contrary, in cultures from negative animals the presence of HA diminished notably the effects of Con A. Something similar happened to PHA, so the negative animals showed basal levels. In cultures of positive animals incubated with 20 µg/ml of PHA, IFN-γ levels raised when increasing the culture time. In conclusion, differences between negative and positive animals showed an inhibition on the secretion of IFN-γ in the first ones, which could be interpreted as an evasion strategy that would explain the survival of larvae in primo infected animals. INTRODUCCIÓN La hipodermosis es una miasis cutánea del ganado vacuno que guarda mucha relación con la edad y el estado inmunitario de los animales. Está comprobado, que el ganado vacuno desarrolla cierta resistencia tras repetidas exposiciones a las larvas de Hypoderma spp., como lo demuestra el hecho repetido de que los animales más jóvenes presenten, por lo general, un número de nódulos larvarios significativamente superior a los de más edad (GINGRICH, 1982). Esta resistencia constituye un factor importante en el control de las poblaciones del parásito, comprobándose que es dependiente del número de exposiciones previas y del número de larvas que infesten al hospedador (COLWELL, 1985). La respuesta humoral se ha estudiado ampliamente, permitiendo el desarrollo de técnicas de diagnóstico precoces, encaminadas a detectar anticuerpos y antígenos parasitarios (PANADERO y col., 2002; COLWELL y col., 2003). No obstante, es manifiesta la ausencia de relación directa entre los niveles de inmunoglobulinas séricas y el grado de resistencia alcanzado por los animales (PRUETT y BARRETT, 1985; PANADERO, 1996), por lo que se sospecha que la respuesta celular, que ha sido menos investigada hasta el momento, desempeña un papel muy importante en la respuesta protectora frente a esta parasitosis.
NELSON y WEINTRAUB (1972) denunciaron que la respuesta celular estaba implicada en la inmunidad frente a Hypoderma, como lo demostraba la fuerte reacción celular producida tras la penetración de las larvas, en especial en los animales reinfestados. Tras esta primera aproximación, BARON y WEINTRAUB (1986) estudiaron la respuesta linfoproliferativa en animales primo y reinfestados tras la activación con distintos mitógenos. Estos autores sugierieron que la resistencia adquirida frente a la hipodermosis era de base celular y en ella participaban células T y B. Sin embargo, todavía se desconoce el patrón exacto de secreción de distintas citoquinas por parte de los linfocitos activados, de modo que es importante conocer si la protección se debe al predominio de la respuesta linfocitaria tipo I (Th1), y a la consiguiente liberación de citoquinas que tienen un efecto estimulador de la inmunidad celular, o bien se trata de la respuesta tipo II (Th2), donde predomina la liberación de citoquinas cuyo efecto principal es la regulación de la producción de anticuerpos. Dentro de la respuesta celular Th1 destaca el IFN-γ, que es una citoquina producida por linfocitos T y células NK (ROMAGNANI, 1997). A parte de su clara actividad antiviral y reguladora del crecimiento celular, sus propiedades inmunomoduladoras son con toda probabilidad las más importantes. El IFN-γ es el principal activador de la función de los macrófagos y también regula el proceso de diferenciación de las células mieloides (BOEHM y col., 1997). Además, juega un papel importante en el crecimiento y diferenciación de los linfocitos citotóxicos, activa las células NK y actúa como un factor de maduración de los linfocitos B. Su papel exacto en el desarrollo de ciertas enfermedades y en la terapia todavía no está muy claro; se sabe que está implicado en la defensa frente a parásitos, patógenos intracelulares y posiblemente también ante células tumorales (STARK y col., 1998). El presente trabajo se realizó con objeto de estudiar el efecto de la hipodermina A (HA), sobre la secreción de IFN-γ, por los linfocitos de bovinos infestados y no infestados por Hypoderma lineatum observando la acción moduladora de esta sobre la actividad de los mitógenos concanavalina A y fitohemaglutinina. MATERIAL Y MÉTODOS La obtención del antígeno de Hypoderma se llevó a cabo a partir de larvas 1 de H. lineatum recogidas de la submucosa esofágica de bovinos sacrificados en matadero. Las L1 permanecieron congeladas a -20ºC hasta el momento de obtener el antígeno. La hipodermina A (HA) se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico empleando DEAE (diethylaminoetil) ligado a celulosa (DEAE-celulosa, Whatman) como intercambiador aniónico. Posteriormente, se determinó la concentración proteica de esta mediante la técnica del BCA de Pierce. La concentración observada fue de 0,11 mg/ml. Para obtener sangre de animales infestados se emplearon como animales positivos 3 vacas de 4 a 8 años, las cuales presentaban nódulos larvarios de Hypoderma en el dorso durante el periodo de la toma de muestras. Ante la dificultad de encontrar ganado vacuno adulto que no hubiera estado nunca en contacto con las larvas parásitas (negativos) , tomamos la sangre de terneros procedentes de una explotación de ganado vacuno de la provincia de Lugo. La edad de los terneros escogidos fue de aproximadamente 6 meses. Las muestras sanguíneas se tomaron por punción de la vena caudal en tubos de vidrio heparinizados. En ambos casos (infestados y no infestados), la sangre procedente de distintos animales se mezcló para evitar posibles variaciones individuales. Posteriormente
se aislaron los linfocitos depositando en tubos de vidrio 6 ml de una solución comercial (Biocoll δ 1,077) a la que se le añadió cuidadosamente 4 ml de sangre heparinizada y a continuación se centrifugó a 400 g durante 30 minutos (Esquema 1). Esquema 1: Protocolo de aislamiento linfocitario
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Después del aislamiento se realizó un análisis de la viabilidad celular con azul tripán, y a continuación se ajustó la concentración a 5 x 106 linfocitos/ml usando para ello medio de cultivo completo que contenía RPMI-1640®, suero fetal bovino (SFB) descomplementado, 100 UI/ml de penicilina, 20 µg/ml de estreptomicina y 1 µl/ml de anfotericina B. Posteriormente se añadieron los mitógenos concanavalina A (Con A, Biochrom) y fitohemaglutinina (PHA-L, Biochrom) a razón de 5, 10 y 20 µg/ml, dejando un pocillo sin estimular al que se le añadieron 100 µl de PBS. Al mismo tiempo se sensibilizaron los linfocitos con 11µg de HA. De esta forma se cultivaron los linfocitos de los animales positivos y negativos a Hypoderma. Después de 24, 48 y 72 horas de incubación, a una temperatura de 37ºC, en una atmósfera de CO2 al 5% y con un 95 % de humedad, se recogió el sobrenadante de cada pocillo centrifugándolo a 800 g durante 10 minutos y se congeló a -80ºC. La cuantificación del interferón-γ se llevó a cabo mediante el ensayo comercial IFN-γ-Bovine EASIA (BIOSOURCE). RESULTADOS Y DISCUSIÓN La estimulación de los linfocitos con la hipodermina A en ausencia de mitógenos, no induce la secreción de INF-γ. Estos resultados coinciden con los de MOIRÉ y col. (1997) quienes demostraron que esta proteasa de la familia de las tripsinas degrada los marcadores de superficie implicados en la activación de los linfocitos, inhibiendo por tanto la secreción de determinadas citoquinas, entre las que se encuentra el INF-γ. De acuerdo con estos autores, el efecto de la HA sobre los linfocitos comenzaría en las fases tempranas de la estimulación y los efectos pueden revertirse retirando la HA. Esta actividad enzimática también podría estar implicada en la inhibición de la proliferación linfocitaria. FISHER y col. (1991) y CHABAUDIE y BOULARD (1992) fueron los primeros en sugerir el papel de esta enzima en la inmunosupresión observada en los animales infestados. Así, la HA actúa degradando el componente C3 del complemento implicado en la respuesta antígeno-
específica y en el control de la linfoproliferación (BOULARD, 1989; BARON, 1990; ERDEI y col., 1991).
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Al cultivar en presencia del mitógeno concanavalina observamos el siguiente comportamiento: En la figura 1A se aprecia que la 4 co-incubación de la HA con 5 µg/ml Testigo (+) Testigo (-) A de Con A produjo, en los cultivos de Negativo Positivo 3 animales no infestados, una disminución de la respuesta al 2 mitógeno. Así, la presencia de Con A 1 provocó un aumento en los niveles de INF-γ que alcanzó niveles 0 máximos (D.O. 1,70) tras 48h de 24h 48h 72h incubación; mientras que la adición de HA disminuyó los niveles de esta 4 citoquina. Por el contrario, en los B 3 cultivos de animales infestados la exposición a la HA no redujo la 2 respuesta a la Con A, excepto en los incubados durante 24h. 1 Al aumentar la concentración de mitógeno a 10 µg/ml observamos 0 24h 48h 72h de nuevo que en los cultivos procedentes de animales negativos la 4 presencia de HA disminuyó notablemente los efectos de la Con A. C 3 En cambio, en los cultivos de animales infestados la secreción de 2 INF-γ aumentó notablemente con 1 respecto a sus testigos, con valores máximos (D.O. 3.90) alcanzados tras 0 48h de cultivo. 24h 48h 72h Finalmente, al añadir 20 µg/ml de Horas de cultivo mitógeno vemos que el Fig 1.- Niveles de IFN-γ en linfocitos comportamiento de los linfocitos de estimulados con HA y en presencia de 5 (A), terneros sin infestar fue similar a los 10 (B) y 20 µg/ml de Con A casos anteriores. Los cultivos de vacas infestadas reprodujeron el mismo comportamiento que en casos anteriores, obteniéndose mayores diferencias con respecto a los testigos a las 48 h de cultivo (D.O. 3,36 vs 1,93). Es de destacar el hecho de que en los cultivos de animales negativos la HA ejerce un papel inmunosupresor que produce una disminución en los efectos del mitógeno y que se traduce en una disminución de la secreción de INF-γ. Estos resultados contrastan con los de CHABAUDIE y BOULARD (1992) quienes no encontraron una actividad moduladora de
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esta hipodermina sobre la actividad blastogénica de la concanavalina A, aunque sí al emplear la fitohemaglutinina. No obstante, tenemos que señalar que de acuerdo con varios estudios llevados a cabo con Fasciola hepatica no existe una relación entre los índices de estimulación (linfoproliferación) y los niveles de INF-γ (CLERY y col., 1996; BOSSAERT y col., 2000) Por el contrario, en cultivos de animales infestados la presencia de HA estimula la secreción de esta citoquina. De acuerdo con BARON y WEINTRAUB (1987) el ganado expuesto repetidamente a la infestación por Hypoderma presenta una cierta resistencia que se manifiesta por un menor número de barros en el dorso. Estos animales resistentes presentaron una mayor respuesta a los antígenos y a los mitógenos Con A y PWM. Al cultivar en presencia del mitógeno fitohemaglutinina observamos el siguiente comportamiento: Los linfocitos de animales 4 Testigo (+) Testigo (-) negativos incubados con HA y 5 µg/ml A Negativo Positivo de PHA mantuvieron niveles muy bajos 3 de INF-γ, con excepción de los incubados durante 72h. Estos últimos, 2 no incubados con HA, presentaron un 1 ligero aumento en los niveles de esta citoquina. En los cultivos de vacas con 0 hipodermosis el nivel máximo de INF-γ 24h 48h 72h se alcanzó a las 48 h con un valor de 4 D.O. de 0,99 que se mantuvo casi B constante en los cultivos incubados 3 durante 72 h. 2 Al co-incubar con 10 µg/ml de fitohemaglutinina observamos que en 1 los cultivos de animales negativos los niveles de INF-γ fueron muy bajos en 0 todo el estudio, manteniéndose en 24h 48h 72h 4 valores de D.O. inferiores a 0,27. En los cultivos de vacas infestadas C 3 observamos niveles máximos a las 48h con un valor de D.O. de 1,52 y no se 2 observaron diferencias con respecto a los testigos, por lo que podemos 1 deducir que la presencia de HA no modifica la respuesta a la PHA. 0 24h 48h 72h Finalmente, con la Horas de cultivo concentración de 20 µg/ml de PHA Fig 2.- Niveles de IFN-γ en linfocitos B vemos, al igual que en los casos estimulados con HA y en presencia de 5 (A), anteriores, que la presencia de este 10 (B) y 20 µg/ml de PHA mitógeno en cultivos de animales negativos no provoca un aumento en los niveles de INF-γ y que la presencia del antígeno HA no modifica los patrones de secreción de esta citoquina. Por el contrario, en los cultivos
de linfocitos de vacas infestadas co-estimulados con el mitógeno y la HA, el nivel de INF-γ aumentó al incrementar el tiempo de cultivo hasta llegar a un valor de 3,16 (72h). Sus testigos, incubados en ausencia de antígeno, presentaron un máximo a las 48 h. En este apartado llama la atención la ausencia de respuesta a la PHA por parte de los linfocitos de terneros no infestados, tanto en presencia como en ausencia de la HA. Por el contrario, en los cultivos de animales positivos se observó una marcada respuesta dosisdependiente frente a este mitógeno; no obstante, no se observó ningún efecto de la HA sobre la respuesta inducida por la PHA, excepto en los cultivos incubados durante 48h. En estos, la presencia de la HA originó un descenso en la secreción de INF-γ por parte de los linfocitos. El efecto modulador de la HA sobre el mitógeno PHA ha sido ampliamente estudiado por diversos autores. CHABAUDIE (1990) señaló que la acción moduladora se ejerce sobre los linfocitos y no sobre los mitógenos, de acuerdo con sus resultados la HA inhibe los linfocitos estimulados por la PHA. En este sentido, NICOLAS-GAULARD y col. (1995) observaron un descenso en la producción de IL-2 por linfocitos estimulados por la PHA en presencia de la HA. Estas autoras relacionan la baja producción de esta citoquina con un aumento en la secreción de prostaglandinas (PGE2), potentes moléculas antiproliferativas producidas por monocitos y macrófagos que inhiben la secreción de IL-2 y la síntesis de INF-γ por los linfocitos T en infecciones experimentales con parásitos tales como Leishmania o Trypanosoma cruzy (TARLETON, 1988). CONCLUSIONES La fracción antigénica hipodermina A produce un efecto modulador sobre la actividad de los mitógenos fitohemaglutinina y concanavalina A, inhibiendo la secreción de INF-γ por los linfocitos de animales jóvenes no infestados. Por el contrario, en los cultivos correspondientes a animales infestados la respuesta fue más variable. Las diferencias encontradas entre los niveles de secreción de INF-γ por parte de los cultivos de animales negativos y positivos, ponen en evidencia un efecto inhibidor de la secreción de esta citoquina lo que se interpretaría como un mecanismo de evasión que explicaría la buena supervivencia de las larvas en animales primoinfestados. AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido financiado por el Proyecto de Investigación AGL-2004-01827/GAN del MCYT y gracias a la concesión al autor principal del trabajo de una beca FPU (19072004 del MECD). REFERENCIAS BARON, R.W.; WEINTRAUB, J. (1986). Immunization of cattle against hypodermatosis (Hypoderma lineatum (De Vill.) and H. bovis (L.) using H. lineatum antigens. Veterinary Parasitology, 21: 43-50. BARON, R.W.; WEINTRAUB, J. (1987). Lymphocyte responsiveness in cattle previously infested and uninfested with Hypoderma lineatum (De Vill.) and Hypoderma bovis (L.) (Diptera: Oestridae). Veterinary Parasitology, 21: 43-50.
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