100781336

Rozdział

Rozdział

Ryc. 4. Aktograf skonstruowany przez Szymańskiego (1914) do rejestracji dobowej aktywności owadów. W skład tego aparatu wchodzi zawieszona na odpowiednio zbalansowanej dźwigni klatka na owada oraz kimograf

W zmodyfikowanej wersji (ryc. 5) aktografy rejestrujące ruchy zwierząt były używane do badań aktywności wielu stawonogów (Cloudsley-Thompson 1951, 1952, 1953, Azaryan i Tyshchenko 1970).

Ryc. 5. Prosty w budowie aktograf służący do rejestracji dobowej aktywności drobnych bezkręgowców. W jego skład wchodzi zawieszona na podstawie (1) komora (2), do której jest przymocowana dźwignia pisząca (3). Ruchy zwierzęcia są zapisywane na okopconym, obracającym się walcu kimografu (4)

Jeden z pierwszych aktografów działających na zasadzie elektrycznej został wykorzystany do badań aktywności ruchowej owadów przez Lutza (1932). Aparat ten był zbudowany z dwu komór połączonych ze sobą wąskim przejściem, w poprzek którego przebiegała cienka nić połączona z wyłącznikiem rtęciowym. Owad przechodzący przez ten korytarz naciskał swoim ciężarem nić, powodując włączanie obwodu prądu, co było rejestrowane przez specjalne urządzenie działające na zasadzie elektromagnesu.

W dalszym ciągu zostanie podany opis bardzo prostego w budowie i obsłudze aparatu do oznaczania aktywności ruchowej owadów, pomysłu autora, który może być z powodzeniem wykonany w każdym laboratorium. Był on używany do rejestracji rytmu aktywności ruchowej świerszczy domowych (Cymborowski 1969b, 1970a,b).

Rozdział 2. Metodyka badań rytmów dobowych

Ryc. 6. Ogólny plan budowy aparatu do rejestracji aktywności lokomotorycznej owadów. 1 – termostat, 2 – aktograf, 3 – zegar programowy, 4 – termometr kontaktowy, 5 – otwory wentylacyjne, 6 – żarówka, 7 – naczynia z wodą (wg Cymborowskiego 1972a)

W skład tego aparatu wchodzi termostat z płaszczem wodnym, aktograf oraz urządzenie rejestrujące. Ogólny schemat budowy zamieszczony jest na rycinie 6 (Cymborowski 1972a).

Najważniejszą częścią aparatu jest aktograf, który umieszcza się w termostacie w celu zapewnienia określonych warunków doświadczalnych. Ciągła wentylacja w termostacie zachodzi dzięki znajdującemu się w nim otworowi, odpowiednio umieszczonemu i zabezpieczonemu przed przechodzeniem światła z zewnątrz. Nad aktografem umieszczone jest źródło światła, którego natężenie można zmieniać przez stosowanie żarówek o różnej mocy, a także przez zmianę wysokości zawieszenia. Żarówka jest połączona z zegarem programowym, za pomocą którego można zmieniać dobowe warunki oświetlenia (długość fotoperiodu, ilość faz świetlnych itp.). Określoną wilgotność w termostacie, a tym samym i w aktografie, utrzymuje się dzięki umieszczeniu w nim pojemników z wodą.

Ryc. 79. Dobowe wahania stężenia prolaktyny (linia ciągła) i hormonu wzrostowego (linia przerywana) we krwi łososi (Oncorhynchus nerka) hodowanych w warunkach LD 12:12 (wg Leatherlanda i in. 1974)

Podobnie szczyt stężenia prolaktyny we krwi szczurów przypada w środku lub w drugiej połowie okresu ciemności (Batcher i in. 1972, Freeman i Neill 1972). Do tej pory nie potrafimy jeszcze wyjaśnić wyżej opisanych zmian. W okresie maksymalnego stężenia hormonów przysadkowych we krwi łososi obserwuje się stosunkowo niską aktywność tych ryb; ich maksymalna aktywność przypada na pierwsze godziny po wystąpieniu okresu światła. Wydaje się więc, że obserwowany wzrost stężenia hormonów przysadkowych we krwi badanych zwierząt powstaje w następstwie ich wzmożonej aktywności ruchowej. Z drugiej strony, co już podkreślano, hormon wzrostowy powoduje uruchomienie rezerw tłuszczowych organizmu, co wykazano w badaniach przeprowadzonych na przeżuwaczach (Hartelendy i Kipnis 1973) i ludziach (Blackaird i in. 1971). Sugeruje to istnienie ujemnego sprzężenia zwrotnego blokującego dalszy wzrost stężenia tego hormonu przy wzroście poziomu wolnych kwasów tłuszczowych, co istotnie obserwuje się u łososi. Wzrostowi wolnych kwasów tłuszczowych we krwi tych zwierząt towarzyszy spadek poziomu hormonu wzrostu (Leatherland i in. 1974).

Obserwowane dobowe zmiany poziomu różnych substancji występujących we krwi są odzwierciedleniem rytmicznego funkcjonowania różnych narządów i tkanek. O tym, że tak jest w istocie, świadczą wyniki obszernych badań przeprowadzonych przez Surowiaka (1969). Autor ten badał poziom kwaśnej fosfatazy u myszy jako wskaźnik stanu funkcjonalnego takich narządów jak podwzgórze, przysadka, nadnercza i tarczyca.

Pomiarów ilościowych tego enzymu dokonywano metodą cytofotometryczną na skrawkach histologicznych, po zastosowaniu barwienia Gomoriego. We wszystkich badanych tkankach stwierdzono istnienie wyraźnej rytmiki dobowej stężenia kwaśnej fosfatazy.

Podobnie stwierdzono istnienie dobowych zmian w aktywności niektórych enzymów działających na terenie wątroby. Hardeland i Rensing (1968) badali aktywność pirolazy tryptofanowej wątroby szczurów i wykazali istnienie dobowych wahań. Najniższa aktywność tego enzymu występuje w pierwszych godzinach po zapaleniu

światła, natomiast maksimum obserwuje się w pierwszych godzinach ciemności (ryc. 80A). Zastanawiano się, jaki może być mechanizm tych zależności. Wiadomo, że zmiany aktywności enzymów mogą być spowodowane różnymi czynnikami: syntezą de novo, stopniem rozkładu, działaniem inhibitorów itp. W przypadku pirolazy tryptofanowej stwierdzono, że wstrzyknięcie szczurom substratu, a więc tryptofanu, w ilości 1,8 ml 5% roztworu w 0,9% NaCl całkowicie zmienia charakter krzywej aktywności tego enzymu (ryc. 80C). Krzywa na rycinie 80B obrazuje wyniki kontrolne po iniekcji odpowiedniej ilości 0,9% roztworu NaCl, w którym był rozpuszczony tryptofan. Aktywność jest tylko nieco wyższa bez zmian jej charakteru. Po wstrzyknięciu tryptofanu obserwuje się gwałtowny wzrost aktywności pirolazy tryptofanowej w okresie światła. Ponieważ tryptofan nie wpływa na syntezę de novo badanego enzymu, a tylko powoduje jego indukcję, można wyciągnąć wniosek, że w normalnych warunkach w organizmie stopniowy wzrost aktywności pirolazy tryptofanowej przed zapadnięciem ciemności jest spowodowany jej syntezą de novo. Natomiast w okresie ciemności, wtedy gdy obserwuje się dużą aktywność pirolazy, dodanie tryptofanu bardzo

Ryc. 80. A – dobowe zmiany aktywności pirolazy tryptofanowej w wątrobie szczurów hodowanych w warunkach LD 12:12; B – szczury kontrolne (po iniekcji 0,9% roztworu NaCI); C – szczury po iniekcji tryptofanu. Linie pionowe oznaczają odchylenie standardowe. Obszar szary to okres ciemności (wg Hardelanda i Rensinga 1968)

Badania chronofarmakologiczne

Dobowe zmiany wrażliwości organizmów na substancje hormonalne i narkotyki

W ostatnich latach niezmiernie dużo uwagi poświęca się badaniom wpływu różnych substancji chemicznych na organizm z uwzględnieniem jego naturalnej rytmiki dobowej. Powstała oddzielna gałąź chronobiologii zwana chronofarmakologią, której zadanie polega między innymi na ustalaniu reakcji organizmu, czy określonych jego tkanek, na tę samą dawkę substancji farmakologicznych stosowanych w różnych porach doby. Zagadnienie to ma ogromne znaczenie praktyczne i różne jego aspekty zostały przedstawione w pracach Reinberga i Halberga (1971), Reinberga (1973) oraz w materiałach zjazdowych przygotowanych przez Schevinga i Halberga (1980). Jednym z przykładów dobowych zmian wrażliwości narządów organizmu na substancje wprowadzone z zewnątrz jest wpływ tej samej dawki hormonu adrenokortykotropowego (ACTH) na reakcję nadnerczy w warunkach in vitro (Ungar i Halberg 1962). W doświadczeniach przeprowadzonych przez tych badaczy określano poziom kortykosteronu uwalnianego w ciągu 2 godzin przez nadnercza pobrane od myszy w różnych okresach doby i inkubowane z tą samą dawką ACTH dodawaną do medium. Nadnercza pobierano od myszy hodowanych w warunkach LD 12:12.

Stwierdzono, że największa wrażliwość nadnerczy wyrażająca się ilością uwalnianego kortykosteronu występuje ok. godziny 4 w nocy, najmniejsza zaś o godzinie 16 w dzień (ryc. 135). Na rycinie tej przedstawiono również dobowe zmiany poziomu kortykosteronu w surowicy krwi tych myszy w warunkach normalnych. Obserwuje się tu również wyraźny rytm dobowy, lecz jego faza jest przesunięta o 180° w stosunku do wrażliwości nadnerczy na działanie ACTH. A więc wtedy, gdy występuje maksymalne stężenie kortykosteronu w surowicy krwi (godz. 16), wtedy reakcja nadnerczy na ACTH w warunkach in vitro jest najmniejsza.

Otrzymane wyniki wskazują, że nadnercza posiadają endogenny rytm dobowych zmian wrażliwości na ACTH, który nie zostaje zakłócony przez wyizolowanie tych narządów z organizmu, a więc po odcięciu wszelkich połączeń nerwowych i humoralnych. Świadczyłoby to również o istnieniu rytmu dobowego procesów metabolicznych nadnerczy.

Z metodycznego punktu widzenia stwierdzenie istnienia zmian dobowych w reakcji narządu w warunkach in vitro, z dającymi się przewidzieć zmianami jego stanu fizjologicznego, sugeruje, że tego typu badania mogą znaleźć szersze zastosowanie w endokrynologii.

Podobne badania in vitro zostały przeprowadzone na wyizolowanych przedsionkach serca szczurów w celu określenia ich dobowych zmian wrażliwości na działanie acetylocholiny (ACh) (Spoor i Jackson 1966). Badacze ci wycinali w różnych okresach doby przedsionki serca szczurów hodowanych w warunkach LD 12:12 (początek światła o godz. 6) i po umieszczeniu ich w płynie fizjologicznym stosowali określoną dawkę ACh. Stwierdzono, że po dodaniu do środowiska ACh w ilości 1 i 10 μg/g

Ryc. 135. Zmiany dobowe stężenia kortykosteronu w surowicy myszy hodowanych w warunkach LD 12:12 (linia ciągła) oraz zmiany wrażliwości nadnerczy w warunkach in vitro na tę samą dawkę hormonu adrenokortykotropowego (ACTH) – linia przerywana. Stopień reakcji nadnerczy określono ilością uwalnianego w jednostce czasu kortykosteronu (wg Ungara i Halberga 1962) roztworu największe zahamowanie częstotliwości skurczów obserwowano wtedy, gdy przedsionki były wyizolowane o godzinie 11, najmniejsze zaś, gdy narządy te pobierano o godzinie 23.

Innym przykładem ilustrującym dobowe zmiany wrażliwości narządów i tkanek organizmów na substancje hormonalne wprowadzone z zewnątrz jest wpływ adrenaliny i ACh na rytmikę dobową ruchów przedżołądków u przeżuwaczy (Gili 1972). Stwierdzono, że w warunkach LD szybkość ruchów żwacza i czepca jest mniejsza w ciągu nocy niż w ciągu dnia. U krów największe nasilenie ruchów przedżołądków przypada na godziny: 10–11; 16–17. Natomiast wyraźnie zaznaczający się spadek ruchów czepca i żwacza następował w nocy także dwukrotnie w godzinach: 22–24; 2–4 nad ranem.

Wprowadzenie do krwiobiegu tych samych dawek adrenaliny lub acetylocholiny w różnych okresach w ciągu doby powodowało różną reakcję czepca i żwacza