9 sequenciamento de dna e hibridização

Sequenciamento de DNA Professor: Felipe Vieira de Souza

• Métodos ou tecnologias • Determinar – base nitrogenadas • Ordem – sequência

• Evolução • Mais rápidos e preciso

• Determinar • Sequência exata – nucleotídeos • Gerações • Sanger • 454 • Solid • Ion Torrent

1ª Geração (clonagem)

Sanger 454 (Roche)

2ª Geração (amplificação clonal)

HiSeq2000, HiSeq2500, MiSeq Illumina SOLiD (Life Technologies)

HeliScope (Helicos Bioscience)

3ª Geração (single molecule)

4ª Geração (Post-Light)

Single Molecule Real Time – SMRT (Pacific Bioscience)

Ion Torrent- PGM, Proton (Life Technologies) GridION-Oxford Nanopore

PLATAFORMAS

Genetic Analyser 3130

• Entendimento do Dogma Central da Biologia • Sequências

• Previsão de demais moléculas • Mutações

Objetivos para sequenciamento genômico Exemplo Sequenciamento de novo

Resequencia-mento

Transcriptoma

Sequenciamento genômico

Sequenciamento de >1000 genomas de influenza

DNA de org. extinto

Homo neanderthalenses

Metagenômica

Intestino humano

Genomas completos

Indivíduos humanos

Regiões genômicas

Detecção de rearranjos ou regiões associados à doenças

Mutações somáticas

Em câncer

mRNA

Definir regulação da transcrição

Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)

Epigenética

RNAs não codificadores

Identificar e quantificar microRNAs

Padrão de Metilação

Avaliar padrão de metilação em câncer

Sanger • “Técnica de desoxi” • Terminadores de cadeia

• Síntese de DNA • Início – oligonucleotídeo • Continuada – enzima DNA polimerase • Nova fita

• 2 tipos de marcadores nucleotídeos • “Normais” (deoxi) – dATP, dGTP, dCTP e dTTP • Dideoxinucleotídeos –ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP • Sem hidroxila no carbono 3’ • Marcados com material fluorescente

Sanger • Polimerização do DNA • DNA polimerase – insere um dideoxinucleotídeo

• Interrompe a polimerização • Fragmentos de tamanhos distintos

• Gel • Migração dos fragmentos.

Amplificação do fragmento alvo por PCR

Purificação do produto

Reação de Sequenciamento

Purificação do produto

Obtenção da sequência do fragmento desejado

PCR

Sequenciamento

• DNA molde + dNTPs e ddNTPs + DNApolimerase + Primer

• Amplificação - PCR

• Eletroforese em gel de acrilamida

Normalized Fluorescence Emission (Excitation at 488 nm)

100% 90% 80% 70%

60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 500

550

600

Wavelength (nm)

650

700

NATURE Vol 464 1 April 2010

2001: Human Genome Project 2.7G$, 11 years 2007: 454 1M$, 3 months 2001: Celera 2008: ABI SOLiD 100M$, 3 years 60K$, 2 weeks 2009: Illumina, Helicos 40-50K$ 2010: 5K$, a few days?

2012: 1000$, <24 hrs?

2ª Geração de Sequenciamento • 454 - (Roche) • Pirosequenciamento • Genome Analyser – Illumina-Solexa • Seqüenciamento por término reversível • SOLiD • Seqüenciamento por ligação de sondas (Applied Biosystems -

Life)

Pirosequenciamento 454 • 2004 • Etapas • Ligação de Adaptadores • PCR em Emulsão • Sequenciamento

Pirosequenciamento 454 • Liberação – fosfato • Add desoxinucleotídeo

• Pirofosfato – conversão • ATP • Utilizado – Luciferase • Sinal de luz

*dNTP – só um deles

Pirosequenciamento â&#x20AC;&#x201C; 454/Roche Resultado

Illumina Solexa • HiSeq 2000 • ↑ 600gb por corrida • 13 dias

• Custo de sequencia – genoma humano: • ~ U$ 6.000

• MiSeq • Pequena capacidade

• Metagenoma

Illumina Solexa • Fase sólida de vidro • PCR fase sólida • Extremidade 5’ fixa • Extremidade 3’ livre

• 1º ciclo de amplificação • Nucleotídeos não marcados • Síntese da segunda fita do fragmento • Imobilizado no suporte

Illumina Solexa • Anelamento • Estrutura em “ponte”

• Extensão • Fita complementar em “ponte”

• Desnaturação • Fitas são separadas e linearizadas

Illumina Solexa • 35 x – 1000 cópias geradas • cada fragmento

• Fitas próximas • Cluster de sequenciamento • Alta densidade – sinal de fluorescência • Intensidade – detecção exata

Illumina Solexa • Nucleotídeos terminadores marcados • Após add nucleotídeo • Leitura do sinal de fluorescência é realizada

• Lavagem • Sequenciamento prossegue

• Leitura – análise sequencial das imagens • Cada ciclo de sequenciamento

SOLID • Sequenciamento catalisado – DNA ligase • Diferente dos demais – Polimerase.

• DNA alvo – mecanicamente fragmentado • Sonicador • Fragmentos: 60- 90pb

• Ligados – adaptadores universais • P1 e P2 • Ambas as extremidades

SOLID • Visualização – gel • Seleção – tamanho de interesse

• Fragmentos ligados – adaptadores P1 e P2 • Circularizados • Clivados – Enzima de restrição • Reconhece o sítio – adaptador

SOLID • Analisador SOLiD • Moldes ligados a esferas • Combinados aos primers universais • Enzimas ligase Sondas (1024 sondas)

• Sequenciamento dividido em etapas • Uso do primer universal • n bases na primeira etapa • n-1 bases na segunda etapa... n-4 bases

• Sondas marcadas fluoróforos • 4 possíveis • dinucleotídeo – extremidade 3’

• Sonda

• Bases seletivas – a primeira e a segunda • 3ª, 4ª, e 5ª – a degeneradas • 6ª , 7ª e 8ª – inosinas

• Carregam o fluoróforo marcador

• 1 add primer universal completo – anela a P1 • Sonda complementar se hibridizará • Ligase – Ligará ao primer universal • Fluorescência detectada

• Fluoróforo é clivado • Deixa grupo 5’ fosfato disponível para reações adicionais

• Ciclos repetem – sequência coberta

• 5 etapas de sequenciamento

• Necessárias – conhecimento em cada ciclo • Dinucleotídeos marcadores

• Restante da sequência alvo

• Outras quatro etapas de sequenciamento

• Primer universal com uma base a menos – 5’ • Cada etapa (n-1, n-2, n-3 e n-4)

• Primer n-1

• Última base da sequência do adaptador • Primeira base da amostra e assim por diante

• Dupla leitura

• Redução de erros de sequenciamento

• Sistema de leitura • Eficiente – detecção de polimorfismos (SNPs) • Confundidos com erros de sequenciamento

• Leituras – acurácia muito superior

Next Gen X Sanger

RNA-seq • Recente

• Analisa o perfil de transcriptoma • Conjunto completo de transcritos (RNAs) – célula • Quantidade • Estágio de desenvolvimento específico • Condição fisiológica.

Obrigado!

Professor: Felipe Vieira de Souza Felipe.souza@unifacs.br