8 tecnologia genética pcr e suas aplicações

Tecnologia Genética: PCR e suas aplicações Professor: Felipe Vieira de Souza

PCR • Polymerase Chain Reaction • Reação em Cadeia da Polimerase

• Por que Polimerase?

• Apenas esta enzima é utilizada no processo

PCR • Síntese exponencial • DNA Alvo • In vitro

• 1987 – Kary Mullis • 1989 – Patente • Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation

• Extração do DNA • Amostra

• DNA-polimerase • Taq-polimerase • Thermus aquaticus • Fonte termal – Yellow Stone

• Solução tampão • Íons • Otimização da reação

• Taq Polimerase • Meia vida – 95°C • ~30 minutos • 30 ciclos

• Tempo: denaturação da Taq. • Em geral: 94oC – 1min.

• ↓ o tempo – ↑ número de ciclos • Se aumentar a temperatura, ↓ tempo.

• MgCl2 • Doador de Mg2+ • Cofator

• dNTPs • Em equilíbrio

• Primer

Primer • Iniciador • Síntese • Desenho • Fontes literárias

• 15 a 25 bases • Grande – especificidade adequada • Curto – primers liguem-se facilmente ao template

Primer • Temperatura de Melting • 50% da dupla fita do DNA(DNA duplex) dissocia • Torna fita simples • Indica a estabilidade da dupla fita.

Tm = 4(G + C) + 2(A + T)oC

Primer • Temperatura de Anelamento • Temperaturas ↑ • Hibridação do template com o primer insuficiente

• ↓ quantidade do produto alvo.

• Temperaturas ↓ • Amplificação de produtos não específicos • ↑ número de pareamentos inespecífico .

Ta = [4(G + C) + 2(A + T)]-5°C

Primer • Conteúdo de GC • 40-60%.

• G ou C – últimas bases – 3´ do primer (GC clamp) • Ligação específica – terminação 3´ • Forte ligação: bases G e C.

• ↑ 3 Gs ou Cs – evitados ultimas 5 bases • Termição 3´do primer.

Exemplo do que não fazer: • 5´ ATACACGTGATGCGTTAAGGGGC 3´

Primer • Grampo • Interações intramoleculares dentro do primer

Primers • Repetições:

• Dinucleotideo – muitas vezes

• Consecutivamente • Evitado – levar a erros • Número máximo de di-nucleotideos repetidos • 4 di-nucleotideos.

ATATATAT.

• Runs:

• Longos runs – única base

• Levar a erros.

• O número máximo aceitável de runs é de 4.

AGCGGGGGATGGGG

Primers • Evitar Homologia Cruzada: • Melhorar especificidade: primers • Evitar regiões de homologia.

• Desenhados – uma sequencia • Não devem amplificar outros genes.

• São desenhados e BLASTed • Testar a sua especificidade • BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

Primers • Temperatura do Par de primers: • Par de primers – Tm próximas • Maximizar a amplificação.

• Diferenças: 5 oC ou mais • Podem levar a NÃO amplificação do produto.

• Cross Dimer (Dímero de primers antisenso): • Interações intermoleculares • Primer senso e antisenso • Apresentam homologia.

• Tamanho do produto: • PCR quantitativo (real time PCR) • Produto alvo ~100pb

• PCR semi-quantitativo • ~500pb.

• Identificação: regiões conservadas • Alinhamento múltiplo – sequências de proteínas • Desenho de oligonucleotídeos

• Conversão da sequência: aa → nucleotídeos, • Nucleotídeos degenerados

• AA codificam mais que um códon • Iniciadores r – todos possíveis códons para cada aa

• Grande degeneração – anelar em outros genes

• Termociclador • Oscilação de temperaturas • Preestabelecidas

• Tempos programados • Ciclos

• Desnaturação • Quebra das pontes de Hidrogênio • Separação das fitas • 92°C a 96°C

• Anelamento • Ligação do primer • 54°C • Início para polimerase • Importante etapa

• Extensão • 72°C • Ideal para polimerase

• Duplicação da fita

• Visualização • Eletroforese

Aplicações • Screening • Mutações

• Classificação de organismos • Genotipagem • Epidemiologia molecular

• Diagnóstico • Pré-natal

• Doenças hereditárias • Doenças infecciosas

• DNA fingerprinting • Terapia gênica

• Estudos – expressão gênica • Detecção de patógenos

• Teste de paternidade • etc

• RAPD • Random Amplified Polymorphism DNA • Espécies não contempladas • Único primer • Sequência arbitrária • Alvo deconhecido • Síntese – vários pontos • Distribuídos ao acaso

• RFLP • Polimorfismo comprimento de fragmentos de restrição

• Fragmentação do DNA • Enzimas de restrição

• Indivíduos distintos • Tamanhos diferentes – polimorfismo

• Nested PCR • Aumenta especificidade • Amplificação

• Reduz o ruído • DNA não específico

• 2 pares de primers

• Nested PCR • 1º PCR • 1 produto • Diluído • Usado no 2º PCR

• 2º PCR • Primers “internos” • Específicos

• 2 Produto • Mais curto

• Inverse PCR • Digestões e ligações • Enzimas – endonucleases de restrição • Liga extremidades • Forma de círculo

• Primers na posição central

• Endonucleases • Conhecidas • Primers

• Invertido PCR

• qPCR • Quantitative PCR (Real Time) • Medir – quantidade • Produtos de PCR

• RNA, DNA e cDNA

• Muito preciso

• qPCR

• Curva de dissociação – Melting • Primers • Iniciar – 70ºC – até 95ºC

• Após amplificação da qPCR

• Determina temperatura – dissociação dos primers • Sequências-alvo

• Verificar – formação único produto • Produtos inespecíficos

• Único pico – único produto

• Vários picos – produtos inespecíficos ou dímeros

• Eletroforese

• Confirmação – produtos indesejáveis

• Sybr green

• Taqman • sondas

• RT-PCR • Reverse Transcriptase • Amplificar DNA • Molde – RNA • cDNA

• Expressão • Mapear éxons

• In situ PCR • PCR – célula • Lâmina • Visualizado

• DNA ou RNA • PCR/RT-PCR e Histologia

• PCR – síntese e amplificação • Sondas marcadas

• In situ PCR • Embriogenese • Organogenese • Doenças infecciosas • Patologia

• Neoplasia • Etc

• Multiplex PCR • Múltiplos alvos • Múltiplos primers • Temperatura otimizada • Amplicons • Tamanhos distintos

• Única “corrida”

• Multiplex PCR • Cuidados • Desenho dos primers • tamanho • Temperatura de anelamento • Especificidade • Evitar dímeros • Hairpin • grampo

• http://www.hhmi.org/biointeractive/bacterialidentification-virtual-lab

Obrigado!

Professor: Felipe Vieira de Souza Felipe.souza@unifacs.br