Hanf und seine Cannabinoide

– Bedeutung und Grundlagen der modernen Cannabinoid-Analytik

Die wissenschaftlich begründete Cannabis-Analytik muss neu gedacht werden, wenn moderne Anwendungen Rechtssicherheit bekommen sollen. Cannabis und seine Verbindungen finden heute vor allem in drei Bereichen Anwendung, in der Lebensmittel- und Kosmetikindustrie sowie in der Pharmazie. Im pharmazeutischen Bereich wird die Qualität der Cannabisprodukte sowohl über das Arzneimittelgesetz (AMG) [3,4] als auch die weiteren pharmazeutischen Gesetze und Vorschriften (z. B. DIN 13485) sehr gut überwacht [5,6] . Von Stefan Meyer

Ebenso wie für medizinische Produkte kommen für Kosmetika eine große Vielzahl von Gesetzen, EU-Verordnungen und regulatorische Vorschriften zur Anwendung. Life-Style-Produkte, wie die Nahrungsergänzungsmittel, haben in den letzten Jahrzehnten enorm an Bedeutung gewonnen, wobei die Qualitätssicherung der Nahrungsergänzungsmittel (NEM) dank des Internethandels sicher nicht immer die Umsetzung erfahren hat, die gesetzlich vorgeschrieben ist. Viele der NEM kommen heute aus allen möglichen Ländern der Welt. Da nicht überall die gleichen Gesetze und Normen existieren, ist die Überwachung der Einhaltung dieser Parameter zur Absicherung der Käufer immer wichtiger. Aber auch innerhalb der EU bzw. Deutschlands kommt es zu Problemen mit der Lebensmittelsicherheit. 2013 erschütterte in Deutschland der Fleischskandal die Verbraucher. Billiges und Pferdefleisch wurde in Deutschland und anderen EU-Ländern in Fertiggerichten gefunden. Dabei war nicht nur eine einzelne Handelskette davon betroffen. Die großen Supermarktketten wie Edeka, Aldi Süd, Kaiser‘s Tengelmann, Lidl sowie der Lieferservice Eismann hatten Fertiggerichte verkauft, in denen Pferdefleisch verarbeitet wurde. Weitere bekannte Lebensmittelskandale sind der um Mäusekot und Speisereste in Produkten von Müller-Brot (2012) oder der Dioxinskandal. 2010 wurde mit Dioxin verseuchtes Biofuttermittel eines niederländischen Herstellers in elf Bundesländer geliefert. Also sind auch Bioproduzenten kein Garant für einwandfreie Waren. Deshalb ist die Lebensmittelüberwachung nicht nur wichtig und notwendig, sie schützt neben der Gesundheit der Konsumenten diese auch vor Lebensmittelbetrug bzw. Lebensmittelmanipulationen. Die Aufgaben der Lebensmittelanalytik sind heute sehr vielfältig.

Im Fokus stehen dabei: 1.die Lebensmittel-Informationsverordnung (LMIV) [3, 4] 2.die Überwachung der Lebensmittelsicherheit und [5,6] 3.die Qualitätskontrolle [7,8] Das wichtigste Ziel dabei ist immer das Wissen über Inhaltsstoffe, Zusatzstoffe, Verunreinigungen durch Pestizide, Schimmel oder Schwermetalle, mikrobiologische Schadstoffe oder Herkunfts- bzw. Produktbetrug. Die Analytik der Cannabinoide, welche zwingend notwendig ist für den Verbraucherschutz, ist eine echte Herausforderung. Nicht nur dass es mehr als hundert verschiedene Cannabinoide gibt, wobei nur ca. zehn bis 14 derzeit relevant sind, auch die thermische Umwandlung von Cannabinoiden muss beachtet werden, sodass man die Konzentrationen in der zu untersuchenden Ware kennen muss. Die thermische Umwandlung von der Cannabinoid-Säurestufe (Cannabinoid mit Carboxylgruppe) in ein säurefreies Cannabinoid wird als Decarboxylierung bezeichnet. Zum Beispiel die Umwandlung von CBDA in CBD. Laienhaft wird dieser Prozess auch als Aktivierung bezeichnet. Dieser Prozess benötigt eine Wärmezufuhr. Beim Rauchen, Backen, Dabben oder Dampfen werden die Blüten oder das Extrakt so stark erhitzt, dass die Cannabinoide decarboxylieren [9] . Da nicht alle Cannabinoide psychoaktiv sind, ist es nicht nur juristisch wichtig, die genaue Konzentration der psychoaktiven Bestandteile zu kennen. Wenn der Kunde ein Produkt kauft, z. B. eine Creme mit 0,5 % CBD, muss er auch sicher sein können, dass diese 0,5 % CBD in der Creme enthalten sind. Ähnlich verhält es sich mit allen anderen Hanfprodukten.

Die Probenahme als Fehlerquelle

Die Bedeutung der Probenahme vom Feld

Im Allgemeinen wird die Probenahme von Außenstehenden leicht belächelt, nach dem Motto “was soll das Ganze, rein mit dem Löffel in den Topf und die Probe ist gezogen“. Dieses Herangehen klingt plausibel. Jedoch lauern in der Probenahme die meisten Fehlerquellen, die im Anschluss zu großen Diskussionen und Missstimmungen führen.

Ein erstes einfaches Beispiel. Ein Bauer will Hanf ernten. Er geht zu seinem Feld und schneidet Hanfblüten von den Randpflanzen des Feldes ab. Er will ja keine Pflanzen vor der Ernte beschädigen. Diese trocknet er vorsichtig und gibt sie zur Analyse. Der Analytiker untersucht diese Probe und teilt dem Bauern mit, seine Pflanzen haben einen Gehalt von 4,5 % CBD. Dieser freut sich und beginnt die Ernte. Selbst wenn alles bestens läuft, wird die gesamte Biomasse mit hoher Wahrscheinlichkeit eine geringere CBD-Konzentration aufweisen. Spätestens dann wird der Bauer unzufrieden sein, weil er mit ganz anderen Werten für einen Verkauf gerechnet hatte.

Warum wird die Konzentration von der ersten Analyse abweichen? 1.Diese Probe ist nicht repräsentativ. Die Probe wurde nur vom Rand genommen. 2.Die Probe wurde sehr vorsichtig getrocknet. Beim Trocknen der Ernte geht der Trocknungsprozess gröber vor sich. Denn neben der Temperatur zur Trocknung, spielt der Luftzug eine große Rolle. Ist dieser zu stark, brechen die Trichome der Hanfblüte ab und gehen meistens verloren. Unglücklicherweise sind Trichome (kleine Härchen) die eigentliche Quelle des Hanfharzes, in dem die Cannabinoide angereichert sind.

An den Trichomen sieht man, wenn man genau hinsieht, kleine Kugeln, die der Blüte ein Aussehen verleihen als sei diese überzuckert bzw. verschneit. Die Trichome sind wie eine kleine Fabrik, in der die Cannabinoide und Terpene hergestellt werden. 3.Die Versorgung der Pflanzen mit Wasser, Nährstoffen und Wärme ist auf einem Feld sehr inhomogen. Man kann dies sehr schön anhand der Pflanzengröße sehen. Daher können die Cannabinoidgehalte der Pflanzen vom Rand von denen aus der Mitte schon mal 30 % bis maximal 50 % abweichen.

Das heißt also, man kann nur dann eine repräsentative Probe eines Feldes erhalten, wenn man aus jedem seiner Abschnitte, entsprechend des Flächenbeitrages am gesamten Feld, Probematerial entnimmt, dieses produktionsnah trocknet und im Anschluss gut vermischt bzw. homogenisiert. Eine Analyse dieser Probe sollte dann nach bestem Wissen und Gewissen homogen sein.

Probenahme aus einem Big-Pack

Die Probenahme aus einem Big-Pack stellt sich ebenso als Herausforderung dar. Wenn das Produkt getrocknet wurde und im Anschluss daran verpackt wird, erfolgt eine mechanische Wirkung auf den Hanf. Dies führt u. a. dazu, dass die Trichome abbrechen können und wenn das Big-Pack noch auf holprigen Wegen mit dem LKW von A nach B gefahren wird, finden sich die meisten Trichome (Cannabinoide & Terpene) in dem unteren Bereich der Verpackung. Auch hier hilft nur eine Probenahme nach dem Mischprinzip aus allen Schichten. Als sinnvoll hat sich der Ansatz erwiesen, ein oder mehrere BigPacks für eine Versuchsextraktion zu verwenden, wobei drei bis fünf Big-Packs reichen sollten. Insgesamt ist die Verwendung einer Versuchsextraktionsmasse von 500 bis 2.500 Kilo als repräsentativ anzusehen. Aus dem gewonnen Extrakt an Cannabinoiden kann man ihre Ausgangskonzentration im Nachgang abschätzen. Voraussetzung ist natürlich, man kennt die Effektivität des Extraktionsverfahrens.

Probenahme bei Lebensmitteln

Für die Probenahme bei Lebensmitteln gibt es eine Vielzahl von Literaturquellen im Internet. Auch das Deutsche Institut für Normung beschreibt diesen Sachverhalt in der DIN EN ISO 18593/ 15216 sehr detailliert. Deshalb möchte ich hier nur ein Beispiel aus der Praxis beschreiben. Es geht um die Probenahme von Hanfblüten in Backware. In diesem fiktiven Fall wurden die Hanfblüten aus den Backwaren mit Pinzette und Skalpell fein rausgearbeitet und dann im Nachgang analysiert. Die so gewonnenen Werte sind aber in keinem Fall aussagefähig über den Gesamtgehalt der Cannabinoide in Nahrungsmitteln. Richtiger wäre gewesen, die Probe zu homogenisieren und erst dann diese repräsentative Probe zu untersuchen. Ähnlich verhält es sich bei einer Untersuchung von Teemischungen. Die Rosinenpickerei in einem Tee führt auch zu keiner repräsentativen Probe. Man müsste für eine korrekte Inhaltsbestimmung eine repräsentative Menge der Teemischung homogenisieren, zum Beispiel 250 oder 500 Gramm. Aus dieser könnte man dann eine Probe für die eigentliche Untersuchung entnehmen.

Dokumentation der Probenahme

Da die Probenahme einen wichtigen Teil der Gehaltsbestimmungen darstellt, sollte diese protokolliert werden. Am besten protokolliert man die Probenahme, Probenaufarbeitung und Entnahme der repräsentativen Probe für die Untersuchung. Dies hilft dabei, spätere Diskussionen zum Ergebnis der Analyse sachdienlich zu führen.

Analytische Methoden der Cannabinoid-Analytik

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie – das HPCL-Verfahren

Die Methode der Wahl zur Cannabinoid-Analytik ist die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie, abgekürzt als HPLC von der englischen Bezeichnung high performance oder high pressure liquid chromatography [10,11] . Die Bezeichnung Chromatographie ist von den griechischen Worten χρώμα chroma „Farbe“ und γράφειν graphein „schreiben“ abgeleitet. Es kann also auch als Farbenschreiben interpretiert werden. Das kommt daher, dass der Entdecker der chromatographischen Analyse, Michail Semjonowitsch Zwet [12], bei botanischen Untersuchungen von Chlorophyll dieses in zwei Farbfraktionen aufgeteilt hat. Mit Hilfe eines mit Inulin gefüllten Glasrohres und einem organischen Lösungsmittel trennte er ein Chlorophyll-Extrakt in seine zwei Hauptbestandteile, in das blaugrüne und in das gelbgrüne Chlorophyll.

Ausrüstung für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, HPLC, in einem Labor.

Damals wie heute nutzt man zur Auftrennung von Stoffgemischen deren unterschiedliche Verteilung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase. Folgende Parameter beeinflussen eine solche Trennung: 1.die Art und Struktur der einzelnen Stoffbestandteile (Probe), 2.das Lösungsmittel und deren Zusammensetzung (mobile Phase), 3.das Säuleninnenmaterial (stationäre Phase), Länge und Querschnitt, 4.die Temperatur, 5.der pH-Wert und 6.die Durchflussgeschwindigkeit des Lösungsmittels.

Sowohl die unterschiedliche Löslichkeit im Lösungsmittel als auch die spezifische Wechselwirkung mit dem Säulenfüllstoff führt zu einer Auftrennung des Stoffgemisches, wenn die Säule nur lang genug ist und die Durchflussgeschwindigkeit, der pHWert und die Temperatur optimiert wurden. Nach heutigem Stand der Technik benutzt man zumeist die HPLC zur Analytik von Stoffgemischen, da diese eine wesentlich bessere und reproduzierbare Trennung der Einzelsubstanzen erlaubt [13] . Ein modernes HPLC-System ist eine druckoptimierte Säulenchromatographie, bei der zur besseren und schnelleren Trennung der Einzelsubstanzen die mobile Phase mit einem erhöhten Druck auf die Trennsäule gegeben wird. Dieser Druck kann zwischen 50 bis 400 bar betragen. Wichtig ist, dass dieser Druck absolut stabil ist während der gesamten Messung. Ganz moderne HPLC-Anlagen nutzen Säulen mit einem Säulenpackmaterial kleiner 2 µm Korngröße, was einen wesentlich höheren Druck der mobilen Phase benötigt. Dieser Druck kann bis zu 1.000 bar betragen. In diesem Fall spricht man dann von einer UHPLC-Methode (UHPLC = Ultra-High-Performance-LC) [14] . Herkömmliche HPLC-Säulen sind zwischen 15 bis 300 mm lang und haben zumeist einen Innendurchmesser zwischen 2 bis 5 mm. Am Ende einer solchen Trennsäule wird eine Registriereinheit (Detektor) installiert. Heute gibt es eine Vielzahl von Detektoren, welche die eine oder andere physikalische Eigenschaft zur Registrierung verwenden.

Die wichtigsten Typen sind: 1.der UV/VIS-Detektor, 2.der Lichtstreudetektor, 3.der Brechungsindexdetektor, 4.das Massenspektrometer, 5.der Leitfähigkeitsdetektor und 6.der elektrochemische Detektor.

Für eine Stoffgemischanalyse wird eine kleine Probenmenge auf die Säule gegeben. Nun wird die mobile Phase auf die Säule gegeben. Wechselwirkt ein Bestandteil des Stoffgemisches (Probe) stark mit der stationären Phase, so verbleibt er relativ lange in der Säule. Wechselwirkt dieser jedoch nur schwach mit der stationären Phase, verlässt er die Säule früher und wird durch den Detektor erfasst. Je nach Stärke dieser Wechselwirkungen erscheinen die Bestandteile der Probe zu verschiedenen Zeiten, den sogenannten Retentionszeiten, am Detektor, wo sie dann nachgewiesen werden können [13]. Die Retentionszeit ist verbindungsspezifisch und die Stoffmenge, welche durch den Detektor geht, ist für die Größe des Signals verantwortlich. Je mehr von einer Verbindung in der mobilen Phase enthalten ist, desto größer das Signal. Mit diesen beiden Parametern, Retentionszeit und Signalhöhe, lassen sich durch vorherige Analysenläufe mit definierten Standards, die Verbindung und die Stoffmenge in der Probe genau berechnen. Die Bestimmungsgrenzen der jeweiligen Verbindungen sind stark abhängig vom Gerät selbst, dem Lösungsmittel, der Säule, Säulenlänge und dem Säulenmaterial. Schlussendlich ist auch der Detektor selbst ein limitierender Faktor. Auf dem Markt gibt es eine Vielzahl von Anbietern eines kompletten HPLC-Systems zur Cannabinoid-Analytik. Neben dem Gerät an sich können die Messmethoden und dazugehöriges Personaltraining käuflich erworben werden.

Die Gaschromatographischen Methoden[9-11] Während man bei der HPLC-Methode als mobile Phase (Lösungsmittel oder Eluent) eine Flüssigkeit nutzt, wird die Auftrennung bei der Gaschromatographie (GC) mit Hilfe eines Gases erreicht. Neben der Besonderheit, dass ein Gas als mobile Phase genutzt wird, sind die Trennsäulen wesentlich länger und etwas größer im Durchmesser. Moderne GC-Anlagen haben Säulen mit mehr als 100 Meter Länge mit einem Durchmesser zwischen 3 bis 6 mm. Diese können aus Edelstahl oder Glas sein. Edelstahlsäulen wurden in der Vergangenheit auch als gepackte Trennsäulen verwendet. Moderner sind hingegen die Kapillar-Trennsäulen aus Glas, die zur analytischen Untersuchung von hochkomplexen Substanzmischungen eingesetzt werden können. Diese Kapillar-Trennsäulen werden in einem temperierbaren Raum installiert, dem sogenannten Ofenraum. Als mobile Phase werden inerte Trägergase verwendet, wie das inerte Stickstoff oder Helium. In dieser Ofenkammer wird über einen beheizbaren Injektor (oder Einspritzventil) das verdampfbare Stoffgemisch injiziert. Jede Verbindung des Stoffgemisches hat durch ihre spezifische physikalisch-chemische Eigenschaft eine individuelle Mobilität in der Trennsäule. Dadurch ergibt sich ein Verteilungskoeffizient zwischen der stationären und mobilen Phase, der wiederum verbindungsspezifisch ist. Auf diese Art werden die komplexen Cannabinoidgemische in ihre einzelnen Cannabinoide aufgetrennt. Die Gaschromatographie unterliegt einer wesentlichen Beschränkung. Durch die physikalisch-chemischen Besonderheiten der genutzten Säulen können in der Gaschromatographie nur Substanzen untersucht werden, die (i) verdampfen und (ii) eine Molekülmasse nicht über 1.000 u haben. Das trifft für alle Cannabinoide und Terpene zu, mit Ausnahme einiger Poly-Terpene, welche aber bedeutungslos in der Cannabischemie sind.

Die Funktionsweise der Detektoren, wie MS-Detektor bzw. EC-Detektor

Der MS-Detektor: Die Massenspektrometrie basiert auf einem Verfahren zum Messen der Masse von Molekülen. Die zu analysierenden Cannabinoide werden in der HPLC bzw. GC nach dem Passieren der Trennsäule in eine Gasphase überführt und ionisiert. Die dabei entstandenen Ionen werden anschließend durch ein elektrisches Feld beschleunigt und dem Analysator zugeführt. Durch das Verhältnis von Masse zur Ladung werden diese durch eine Beschleunigung in Teilstrahlen aufgetrennt. Je schwerer ein Ion ist, desto schwerer ist seine Beschleunigung, wodurch es zu einer Fragmentierung der Probe kommt [15, 16] . Wer sich für die Details der Massenspektroskopie interessiert, dem kann als Einführung dazu das Manuskript der Universität Heidelberg empfohlen werden [17] . Der EC-Detektor:Dieser Detektor nutzt die elektrische Leitfähigkeit in flüssigen Medien zur Detektion. Damit ist dieser Detektor ideal für die Flüssigkeitschromatographie. Die elektrolytische Leitfähigkeit ist dabei ein Summenparameter, bestehend aus der Leitfähigkeit der gelösten und dissoziierten Stoffe. Die mobile Phase liefert ohne eine zu analysierende Substanz die Grundleitfähigkeit, den Grundstrom. Dieser ändert sich mit der Konzentration einer Substanz in der mobilen Phase. Diese Veränderung wird detektiert und ausgewertet. Die Abweichung der Leitfähigkeit bezüglich Zeit und der Änderung der Leitfähigkeit an sich ist für jedes Cannabinoid an einem Gerät spezifisch [18-21] .

Qualitätssicherung & Prozessbeschreibungen

Minimalansprüche an die Analytik

Der Begriff der Qualitätssicherung ist ein Überbegriff für alle Prozesse rund um das Produkt und die eigentliche Analyse, welche Einfluss auf die Qualität der Untersuchungsbefunde haben. Deshalb sollten solche Begrifflichkeiten in jedem Qualitätsmanagementhandbuch für Firmen und Institutionen definiert sein.

Alle nachfolgenden Schritte entsprechen einem Minimalanspruch an eine reproduzierbare und repräsentative Analytik:

1.Planung

2.Probenahme & Probendokumentation

3.Probenkonservierung & Probenverpackung

4.Probentransport & Probenlagerung

5.Probenvorbereitung & Probenaufbereitung

6.Probenanalyse

7. Auswertung, Beschreibung der Analysenmethoden

8.Ergebnisbewertung und -diskussion

Das QM-Buch als Qualitätsbasis

Jede Firma sollte ihre Prozesse, Vorgänge und betriebseigenen Normen und Regelungen in einem Qualitätshandbuch (QM-Buch) festschreiben. Der Umfang und der Grad der Detaillierung sind den betrieblichen Vorgängen anzupassen. Dieses QM-Buch hat dabei drei wesentliche Aspekte zu erfüllen: 1. Das QM-Buch legt schriftlich den Geschäftszweck, die Ziele, die Prozesse, Geschäftsabläufe und Vorgaben der Geschäftsführung fest. 2.Im QM-Buch werden die Qualitätsansprüche, Qualitätssicherungsmaßnahmen und die Verbesserungsbemühungen definiert. 3.Die zu beachtenden Gesetze, gesetzlichen Reglungen, Ansprüche sowie die betriebseigenen Verfahrensanweisungen und deren Dokumentation werden schriftlich festgehalten.

Sicherheit durch Auditierung

Als Kunde eines Analysenlabors sollte man sich seinen Geschäftspartner unbedingt genauer ansehen. Man nennt diesen Prozess auch Auditierung. Sie sollten dabei immer ihre Ansprüche an denen ihres Geschäftspartners messen. Lassen Sie sich das QM-Buch schicken. In diesem sollten keine Geheimnisse enthalten sein. Diese sind in den Prozessbeschreibungen und Arbeitsanweisungen niedergelegt. Schauen Sie auf Prozesse, welche sich als Kernprozesse Ihrer in Anspruch genommenen Leistung erweisen. Hinterfragen Sie kritische Punkte und protokollieren Sie die Antworten. Nicht immer muss dabei der Gesprächspartner sofort eine Antwort parat haben. Integrieren Sie die Ergebnisse des Audits in Ihre Abläufe. So lässt sich eine Zusammenarbeit optimieren. Oft hat es sich bewährt, die Zusammenarbeit in einem eigenen Qualitätsprozess nieder zu schreiben. Da beide Partner involviert waren, sind diese Abläufe meist problemärmer. Mitarbeiter lassen sich durch einen Verbesserungswettbewerb motivieren, da diese so einen direkten Einfluss auf Prozesse und Abläufe in der Firma nehmen können. Das sichert Qualität und Kundenzufriedenheit. Wie man sieht, ist die Cannabis-Analytik ein anspruchsvoller Prozess. Eine korrekte Durchführung der Probenentnahme, die Auswahl der passenden analytischen Methoden und eine lückenlose Qualitätssicherung sind die Grundbausteine. Ihre sorgfältige Durchführung trägt erheblich zur Rechtssicherheit für Unternehmen sowie zur Vertrauensbildung und Zufriedenheit bei den Verbrauchern bei. ↙

Das Literaturverzeichnis ist auf Nachfrage in der Redaktion erhältlich.

Dr. Stefan Meyer

ist Präsident des Branchenverbandes Cannabiswirtschaft e.V. und Geschäftsführer der Neo-Livia GmbH. Im BvCW bearbeitet er federführend den Bereich Qualitätssiegel und Analysetechnik.

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