CD138-POSITIIVISTEN PLASMASOLUJEN RIKASTUS MYELOOMASOLUJEN FISH-TUTKIMUKSESSA

TEKSTI Mari Vesala, Susanna Vuohelainen ja Leena Tikka

Multippeli myelooma on plasmasolujen verisyöpä. Siinä esiintyviä elinikää ennustavia kromosomipoikkeavuuksia tutkitaan FISHmenetelmällä, jonka herkkyyttä parantaa olennaisesti CD138-positiivisten plasmasolujen rikastus. Rikastus on mahdollistanut kromosomipoikkeavuuksien selvittämisen aikaisessa vaiheessa, kun myeloomasolujen määrä elimistössä on vielä pieni.

Multippeli myelooma

Myelooma on verisyöpä, joka alkaa plasmasoluja tuottavasta kantasolusta. Myeloomasolut tuottavat toiminnaltaan poikkeavaa monoklonaalista vasta-ainetta, eli paraproteiinia, joka ei toimi elimistön puolustuksessa tarkoituksenmukaisesti. (1, 2).

Myelooman oireet vaihtelevat tautisolujen tyypistä ja sairauden vaiheesta riippuen. Taudin edetessä myeloomasolut runsastuvat, ja vievät tilaa terveiltä plasmasoluilta ja muilta verisoluilta luuytimessä. Tämä johtaa toimivien vasta-aineiden puutteeseen ja luuytimen vajaatoimintaan. Immuunipuolustus heikkenee merkittävästi, mikä johtaa infektioihin. Taudin aktiivisessa vaiheessa potilailla esiintyy tyypillisesti ainakin jotain seuraavista CRAB-oireista (3). Myeloomasolut erittävät aineita, jotka vilkastuttavat luukudoksen hajoamista ja vapauttaa vereen kalsiumia (C). Paraproteiinin kertyminen rasittaa munuaisia, ja voi johtaa munuaisvaurioon (R). Punasolujen väheneminen voi aiheuttaa anemiaa (A). Luun hajotessa syntyy paikallisia syöpymäpesäkkeitä (B). (1).

Hoitamattomana aktiivisessa vaiheessa oleva myelooma johtaa nopeasti kuolemaan. Taudin etenemisvauhti ja vasteet hoidoille vaihtelevat paljon potilaiden välillä (4). Vain aktiivista vaihetta hoidetaan. Hoitovaihtoehtoja ovat kantasolusiirto ja lääkitys erilaisina yhdistelminä. (5, 6).

Kromosomitutkimukset myelooman ennusteen arvioinnissa

90 %:lla myeloomapotilaista on osoitettavissa solun kromosomipoikkeavuus (7). Kromosomipoikkeavuuksien osoittamista ja tunnistamista ei käytetä myelooman diagnosoimiseen; muut tutkimukset sopivat siihen paremmin (taulukko 1).

Eri kromosomipoikkeavuudet omaavilla myeloomasoluilla on erilaiset vasteet käytössä oleviin hoitoihin. Tietyt poikkeavuudet on yhdistetty keskimääräistä huonompaan eliniän ennusteeseen (8). Kromosomipoikkeamat ovat osa ennusteen arvioinnissa käytettäviä standardeja. Niiden perusteella potilaat jaotellaan riskiluokkiin, esimerkiksi korkean ja standardiriskin potilaisiin (6, 9). 20 prosentilla potilaista on jokin korkean riskin muutos, esimerkiksi kromosomin 17 p53- geenin deleetio eli häviämä (8) tai jokin kromosomin 14 translokaatio eli siirtymä (4, 5, 6, 10, 11). Heidän keskimääräinen elinikänsä diagnoosista on noin 2 vuotta (4, 5, 9). Standardiriskin potilailla ei ole huonon ennusteen muutoksia, ja heidän keskimääräinen elinikänsä on noin 7 vuotta. (6, 9).

Kromosomipoikkeamat selvitetään rikastetuista CD138-positiivisista plasmasoluista FISH-tutkimuksella

FISH-tutkimus on tarkka ja luotettava menetelmä löytää pieniäkin määriä kromosomipoikkeavuuksia. Plasmasolujen rikastus ennen FISH-tutkimusta parantaa ratkaisevasti tutkimuksen herkkyyttä.

Plasmasolujen rikastuksessa käytetään vain niiden ilmentämää CD138-pinta-antigeeniä. Rikastuksessa erotellaan CD138-positiiviset plasmasolut muista verisoluista. Näytteeseen lisätään magneettileimattua CD138-vasta-ainetta. Vasta-aineessa oleva magneettiosa pitää CD138-positiiviset solut kiinni erottelupylväässä, kun muut solut pestään pois. Magneetin irrottamisen jälkeen CD138-positiiviset solut eluoidaan omaan putkeen. (12). Rikastukseen voidaan käyttää kaupallisia menetelmiä.

FISH-tutkimuksessa visualisoidaan fluoresenssileimatulla koettimella tietty DNA-sekvenssi, mikäli se on läsnä tutkittavassa näytteessä. Rikastetut solut kerätään kolkisiini-, hypotonia- ja fiksauskäsittelyllä ja tiputetaan objektilasille, johon lisätään haluttu koetin. Koetin hybridisoituu eli sitoutuu sitä vastaavaan DNA-sek-

Näyte

Veri ja/tai virtsa

Menetelmä/tutkimus

Elektroforeesi

Veri Immunofiksaatio, elektroforeesi

Luuydin Sivelyvalmiste

Luuydin Virtaussytometria/immunohistokemia

CRAB-oireiden osoittaminen

Veri

Veri P-Ca/S-Ca

P-Krea tai eGFR

Veri B-PVK, B-Hb

Luusto Röntgen, TT tai MRI

Eliniän riskiluokituksessa käytettäviä ennustetekijöitä

Veri

Veri

Luuydin Seerumin beeta-2-mikroglobuliini

Laktaattidehydrogenaasi

FISH-tutkimus

Indikaatio

Proteiinien fraktiointi, paraproteiinin (M-komponentti) osoittaminen M-komponentin vasta-ainetyyppien (IgG, IgA, IgM) ja vapaiden kevytketjujen (kappa, lambda) määritys Plasmasolujen määrä ja morfologia Myeloomasolujen klonaalisuus ja immunofenotyypitys

Hyperkalsemia

Munuaisten vajaatoiminta

Anemia

Yksi tai useampi syöpäpesäke luissa

Kromosomimuutokset

venssiin näytteessä. Sitoutumaton koetin pestään pois ja tumat taustavärjätään. Fluoresenssimikroskoopilla nähdään koettimien signaalit. Normaalissa solussa on esimerkiksi neljä signaalia: kaksi punaista ja kaksi vihreää, eli yksi punainen ja vihreä kutakin kromatidia kohti. Translokaatiot havaitaan punaisen ja vihreän signaalin keltaisena fuusiona (7).

Rikastuksen FISH-tutkimuksen herkkyyttä parantava vaikutus on todettu useissa tutkimuksissa (13, 14, 15, 16, 17, 18). Esimerkiksi Lu ym. 2013 vertailivat rikastamisen vaikutusta plasmasolujen määrään ja FISH-tutkimukseen. Plasmasolujen määrä rikastetuissa näytteissä oli 3,4-74-kertainen rikastamattomiin verrattuna. Rikastetuista näytteistä löydettiin huomattavasti enemmän (50 %) kromosomipoikkeavuuksia kaikilla käytetyillä koettimilla rikastamattomaan näytteeseen verrattuna (17,9 %). (13).

Ennen plasmasolujen rikastusta myelooman kromosomipoikkeavuuksien löytämisessä oli haasteita (15, 17). Sama muutos on löydyttävä riittävän monesta solusta, jotta tulosta voidaan pitää luotettavana. Myeloomasolujen määrä veren laimentamassa luuydinnäytteessä on yleensä pieni (14, 17). Hybridisaatioon päätyi todennäköisimmin terveitä soluja, ja myeloomasolujen määrä näytteessä jäi niin pieneksi, ettei luotettavaa tulkintaa saatu tehtyä. Myelooman FISH-tutkimuksen tulos oli usein siis virheellisesti normaali (14, 17). Luotettava tulos saatiin vain tapauksissa, joissa myeloomasoluja oli ehtinyt kertyä paljon. FISH-tuloksen saaminen diagnoosivaiheessa on tärkeää, koska kromosomimuutosten selvittämisellä on eniten kliinistä merkitystä potilaan eliniän ennusteen arvioinnissa (19).

Yhteenveto

Nyt on mahdollista käyttää menetelmää kromosomipoikkeavuuksien määritykseen entistä aikaisemmassa taudin vaiheessa tai kun potilas on jo saanut hoitoa, jolloin myeloomasolujen määrä on pieni (17). Rikastus on mahdollistanut FISH-tutkimuksen hyödyntämisen kromosomipoikkeavuuksien kliiniseen määrittämiseen muiden syöpien tapaan myös myeloomassa. Se kuuluu virallisiin suosituksiin osana myelooman FISH-tutkimusta (3, 6, 20). FISH-tutkimusta pidetään yhtenä hyvänä työkaluna, joka yhdessä muiden menetelmien kanssa muodostaa tehokkaan kokonaisuuden myelooman diagnostiikassa (17, 19).

Mari Vesala, bioanalyytikko-opiskelija, Savonia-amk Susanna Vuohelainen, päätoiminen tuntiopettaja, Savonia-amk Leena Tikka, yliopettaja, Savonia-amk

LÄHTEET

1. Porkka K, Lassila R, Remes K ja Savolainen E-R. (Toim.) Veritaudit. Helsinki: Kustannus Oy Duodecim, 403-426. 2015. 2. Röllig C, Knop S Ja Bornhäuser M. Multiple

Myeloma. The Lancet; 385 (9983): 2197-2208. 2015. <https://Reader.Elsevier.Com/Reader/Sd/Pii/ S0140673614604931?Token=8fbb1327ea7de20499420d8a50dd7386455f7c19c2ca116886e19f8194d72cf9ff4c0a14012fc033f8b85758c6b65aab>. [Haettu 2019-11-8]. 3. Caers J, Garderet L, Kortüm M, O’dwyer ME,

Van De Donk NWCJ, Binder M, Dold SM, Gay F, Corre J, Beguin Y, Ludwig H, Larocca A, Driessen C, Dimopoulos MA, Boccadoro M, Gramatzki M, Zweegman S, Einsele H, Cavo M, Goldschmidt H, Sonneveld P, Delforge M, Auner HW, Terpos E. ja Engelhardt M. European Myeloma Network Recommendations On Tools For The Diagnosis And Monitoring Of Multiple Myeloma: What To Use And When. Haematologica 103(11):1772-1784. 2018. 4. Avet-Loiseau H. Ultra High-Risk Myeloma. Hematology 1: 489-493. 2010. 5. Lonial S, Boise LH ja Kaufman J. How I Treat

High-Risk Myeloma. Blood 126 (13):1536-1543. 2015. 6. Myelooman Hoito-Ohje. Suomen Myeloomaryhmän (FMG) Hoitosuositus 2019. <https://Www. Hematology.Fi/Fi/Hoito-Ohjeet/Veritaudit/Plasmasolutaudit/Myelooma/Hoito/Kansalliset-Hoitosuositukset-Fmg>. [Haettu 2019-11-24]. 7. Kishimoto RK, Vaughan Vulcani De Freitas SL,

Alonso Ratis C, Borri D, Sitnik R ja Rodrigues Pereira Velloso ED. Validation Of Interphase Fluorescence In Situ Hybridisation (iFISH) For Multiple Myeloma Using CD138 Positive Cells. Rev Bras Hematol Hemoter 38(2):113–120. 2016.

8. Barwick BG, Neri P, Bahlis NJ, Nooka AK, Dhodapkar MY, Jaye Dl, Hofmeister CC, Kaufman, JL, Gupta VA, Auclair D, Keats JJ, Lonial S, Vertino PM ja Boise LH. Multiple Myeloma Immunoglobulin Lambda Translocations Portend Poor Prognosis. Nature Communications; 10 (1911). 2019. <https:// Www.Nature.Com/Articles/S41467-019-09555-6>. [Haettu 2019-11-8]. 9. Palumbo A, Avet-Loiseau H, Oliva S, Lokhorst

HM, Goldschmidt H, Rosinol L, Richardson P, Caltagirone S, Lahuerta JJ, Facon T, Bringhen S, Gay F, Attal M, Passera R, Spencer A, Offidani M, Kumar S, Musto P, Lonial S, Petrucci MT, Orlowski RZ, Zamagni E, Morgan G, Dimopoulos MA, Durie BGM, Anderson KC, Sonneveld P, San Miguel J, Cavo M, Rajkumar V ja Moreau P. Revised International Staging System For Multiple Myeloma: A Report From International Myeloma Working

Group. J. Clin. Oncol. 33:2863–2869. 2015. 10. Bergsagel L, Chesi M, Nardini E, Brents LA, Kirby

SL ja Kuehl WM. Promiscuous Translocations Into Immunoglobulin Heavy Chain Switch Regions In Multiple Myeloma. Proc.Natl Acad. Sci. USA 93 (24):13931-13936. 1996. 11. Sawyer JR, Waldron JA, Jagannath S ja Barlogie B.

Cytogenetic Findings In 200 Patients With Multiple

Myeloma. Cancer Genet 82:41-49. 1995. 12. MACSPrep Multiple Myeloma CD138 Microbeads

Direct Plasma Cell Isolation From Bone Marrow. <https://Www.Miltenyibiotec.Com/Upload/Assets/

Im0022565.Pdf >. [Haettu 2019-11-30]. 13. Lu G, Muddasani R, Orlowski RZ, Abruzzo LV,

Qazilbash MH, You MJ, Wang Y, Zhao M, Chen S, Glitza IC ja Medeiros LJ. Plasma Cell Enrichment Enhanced Detection Of High-Risk Cytogenomic Abnormalities By Fluorescence In Situ Hybridization And Improves Risk Stratification Of Patients With Plasma Cell Neoplasms. Arch Pathol Lab

Med 137(5): 625–631. 2013. 14. Shi Y, Solomides C, Gong G, Wang Z-X, Uppal

G, LY V, Peiper SC, Herbut PA ja Bajaj R. 2015. Fluorescence In Situ Hybridization On Enriched CD138-Positive Cells In Plasma Cell Myeloma. Acta Medica International 2 (21). 2015. 15. Pozdnyakova O, Crowley-Larsen P, Zota V, Wang

SA ja Miron PM. Interphase Fish In Plasma Cell Dyscrasia: Increase In Abnormality Detection With Plasma Cell Enrichment. Cancer Genet Cytogenet. 189(2):112-117. 2009. 16. Stevens-Kroef M, Weghuis DO, Croockewit S,

Derksen L, Hooijer J, Elldrissi-Zaynoun N, Siepman A, Simons A ja Geurts Van Kessel AD. High Detection Rate Of Clinically Relevant Genomic Abnormalities In Plasma Cells Enriched From Patients With Multiple Myeloma. Genes Chromosomes Cancer. 51(11):997-1006. 2012. 17. Zehentner BK, Hartmann L, Johnson KR, Stephenson CF, Chapman DB, De Baca ME, Wells DA, Loken MR, Tirtorahardjo B, Gunn SR ja Lim L. Array-Based Karyotyping In Plasma Cell Neoplasia After Plasma Cell Enrichment Increases Detection Of Genomic Aberrations. Am J Clin Pathol. 138(4):579-589. 2012. 18. Hartmann L, Biggerstaff JS, Chapman DB, Scott

JM, Johnson KR, Ghirardelli KM, Fritscle WK, Martinez DL, Bennigton RK, De Baca ME, Wells DA, Loken MR ja Zehentner BK. Detection Of Genomic Abnormalities In Multiple Myeloma The Application Of Fish Analysis In Combination With Various Plasma Cell Enrichment Techniques. Am J

Clin Pathol 136:712-720. 2011. 19. Ajise OE, Roshal M, Wang L, Sukhram GN, Smith

KM, Maslak P ja Dogan A. Clinical Utility Of Morphology, Immunohistochemistry, Flow Cytometry And Fish Analysis In Monitoring Of Plasma Cell Neoplasms In The Bone Marrow. J Hematopathol 9:9–18. 2016. 20. Fonsecaj R, Bergsagel PL, Drach J, Shaughnessy J,

Gutierrez N, Stewart AK, Morgan G, Van Ness B, Chesi M, Minvielle S, Neri A, Barlogie B, Kuehl WM, Liebisch P, Davies F, Chen-Kiang S, Durie BGM, Carrasco R, Sezer O, Reiman T, Pilarski L ja Avet-Loiseau H. International Myeloma Working Group Molecular Classification Of Multiple Myeloma: Spotlight Review. Leukemia. 23(12):2210-2221. 2009.