LASTEN RESPIRATORISTEN VIRUSINFEKTIOIDEN LABORATORIODIAGNOSTIIKKA

TEKSTI Katariina Laihola ja Mika Paldanius

Respiratoristen virusten aiheuttamat hengitystieinfektiot ovat tavallisimpia lasten sairauksia. Hengitystieinfektioita lapsilla aiheuttavat mm. influenssa-, RS-, parainfluenssa-, adeno-, rino- ja ihmisen metapneumovirus. Lasten respiratoristen virusten aiheuttajaa voi harvoin diagnosoida pelkästään kliinisten oireiden perusteella, koska oirekuvat ovat hyvin samankaltaisia eri virusten välillä. Vaikka respiratorisiin viruksiin, influenssaa lukuun ottamatta, ei ole toistaiseksi saatavilla antiviraalista lääkettä, niiden diagnosointi vähentää turhia antibioottikuureja ja auttaa eristystarpeen arvioinnissa epidemia-aikana.

Eristämisen ja nopean laboratoriodiagnostiikan merkitys on tullut tutuksi koko väestölle uuden koronaviruksen seurauksena lastenkin kohdalla. Respiratoristen virusten laboratoriodiagnostiikka on kehittynyt viimeisten vuosikymmenien aikana. Diagnostiikan kulmakiven muodostavista ei-molekylaarisista menetelmistä on kehitytty pitkä matka kohti nykyisiä molekyylimenetelmiä, jotka ovat nopeita, herkkiä ja spesifisiä menetelmiä virusten osoittamiseksi.

Kultaiset standardit virusdiagnostiikassa

Elektronimikroskopia ja virusviljely ovat vanhoja tutkimusmenetelmiä, joita on korvattu viime aikoina uudemmilla molekulaarisilla menetelmillä. Ne ovat olleet aikansa tärkeimpiä diagnostisia menetelmiä luoden tärkeän kulmakiven seuraavien menetelmien kehittämiselle. Elektronimikroskopia mahdollistaa respiratoristen virusten diagnosoinnin silloin, kun muita menetelmiä ei voida käyttää. Elektronimikroskopian avulla voidaan nopeasti tunnistaa virusten morfologia erilaisista näytteistä. Elektronimikroskopia vaatii käyttäjältään huomattavaa teknistä osaamista ja asiantuntijuutta sekä kokemusta. Lisäksi tutkittavan näytteen viruspartikkelipitoisuuden tulee olla korkea ja menetelmä itsessään on suhteellisen epäherkkä. Vaadittavat laitteistot ovat arvokkaita ja vaativat mittavia investointeja.

Virusviljelyä käytetään edelleen mm. adeno-, influenssa-, RS-, rino- ja parainfluenssavirusten eristämisessä ja tunnistamisessa. Esimerkiksi rinovirukselle viljely soveltuu erityisen hyvin, koska sen useiden alatyyppien vuoksi antigeeniosoitus ja serologiset menetelmät ovat osoittautuneet haasteellisiksi laboratoriodiagnostiikan kannalta.

Virusviljelyä hyödynnetään viruspartikkelien lukumäärän kasvatuksessa, koska yksikin infektiokykyinen viruspartikkeli riittää muodostamaan laajan infektion virusviljelmässä. Menetelmänä virusviljely on edullinen tapa kasvattaa useanlaisia viruksia – niin tunnettuja kuin tuntemattomia. Virusviljely vaatii menetelmänä paljon osaamista, se on kontaminaatioherkkä ja tuloksien saamiseen menee kohtuuttoman paljon aikaa.

Ongelma viljelyissä voi olla se, että viljelty virus ei aina ole kyseisen tutkittavan infektion aiheuttaja. Esimerkiksi adenovirus erittyy ulosteeseen pitkään infek

tion jälkeen. Toisaalta viljelyn tuloksena voidaan löytää sellainen infektion aiheuttaja, jota ei alun perin osattu epäillä. Virusviljelymenetelmiä kehitetään jatkuvasti ja esimerkiksi tulosten saamista voidaan nopeuttaa sentrifugoitua putkikasvatusta hyödyntämällä.

Elektronimikroskopiaa ja virusviljelyä käytetään edelleen etenkin tutkimustyössä, mutta myös uusien virusten tunnistamisessa sekä niiden muuntumisen tarkastelussa pohjana tulevien rokotteiden kehittämiselle.

Virusantigeenien osoitus

Virusantigeenien osoittamiseen kehitetyt menetelmät perustuvat viruksen proteiiniantigeenien havaitsemiseen merkittyjen vasta-aineiden avulla. Virusantigeenin osoittamisessa voidaan käyttää useita menetelmiä, joista käytetyimpiä ovat immunofluoresenssitekniikka (FIA) ja entsyymi-immunologiset menetelmät (EIA). Menetelmillä on useita etuja. Ne ovat nopeita, spesifisiä ja herkkiä. Lisäksi ne mahdollistavat usean respiratorisen viruksen samanaikaisen tutkimisen yhdestä potilasnäytteestä, joka parantaa varhaista diagnoosia ja mahdollistaa epidemioiden varhaisen havaitsemisen.

Virusantigeeniosoitukset soveltuvat myöhemmän viruksen reaktivaation toteamiseen, kun vertailussa serologisilla menetelmillä tutkittavaa IgM-luokan vasta-aineiden vastetta ei reaktivaatiossa aina muodostu. Antigeenien havaitsemiseen perustuvat menetelmät mahdollistavat sellaisten virusten osoittamisen, joiden kasvatus soluviljelmissä on joko hidasta tai lähes mahdotonta.

Respiratoristen virusten osoittamiseen tarkoitetut pikatestit (POC) mahdollistavat taudinaiheuttajan osoittamisen jopa alle 30 minuutissa. Esimerkiksi influenssadiagnostiikka sekä RS-viruksen osoitus on mahdollista toteuttaa POC-testinä. POC-testit ovat edullisia ja suhteellisen helppoja toteuttaa, mikä tekee niistä arvokkaita diagnostisia työkaluja muun muassa vastaanotoilla, ensiavussa ja tilanteissa, joissa resurssit ovat rajallisia. POC-testien ansiosta lisäkokeiden ja turhien antibioottikuurien määrä on vähentynyt. Testien herkkyys ja tarkkuus voivat olla heikompia verrattuna laboratoriossa tehtäviin määrityksiin. Kuitenkin lapsilla testit ovat herkempiä ilmeisesti sen vuoksi, että lapsipotilailla viruspartikkelien pitoisuus on korkeampaa ja pidempikestoista kuin aikuisilla.

Immunofluoresenssitekniikassa käytettävä fluoresenssimikroskopia edellyttää käyttäjältään erityisosaamista laitteiston käyttöön ja visualisoidun kuvan tulkintaan. Tulosten luotettavuuteen vaikuttavia tekijöitä voi muodostua näytteenotossa, POC-testin suorittamisessa ja laitteiston laatuseurannassa tai sen puutteessa. Vakioidut preanalyyttiset ja analyyttiset tekijät ovat jalkautuneet osaksi laboratorioiden laatutoimintaa, mutta laboratorioiden ulkopuolella niiden noudattamisessa on vielä haasteita.

Virusnukleiinihappojen osoitus

Virusnukleiinihappojen osoitus geeninmonistustekniikalla (PCR) on parantanut respiratoristen virusten diagnostiikkaa viimeisten vuosikymmenien aikana merkittävästi. Esimerkiksi vaikeasti viljeltävä rinovirus on PCR-tekniikan myötä nykyisin luotettavasti ja nopeasti diagnosoitavissa. Käytännössä kaikki uudet respiratoriset virukset ovat diagnosoitavissa PCR-tekniikan avulla.

Yksittäisen viruksen tunnistamisen rinnalle ovat tulleet Multiplex PCR-paneelit, joiden avulla voidaan tutkia eri respiratorisia viruksia yhdestä näytteestä samanaikaisesti. Multiplex PCR-paneelit nopeuttavat oikeaan diagnoosiin pääsemistä merkitsevästi ja lisäksi ne ovat suhteessa yksittäisiä patogeeneja tunnistavia Monoplex-paneeleja edullisempia.

Respiratorisille viruksille on saatavilla erilaisia paneeleja. Paneelien erot pohjautuvat niiden havaitsemien patogeenien monimuotoisuuteen, kykyyn luokitella kyseisiä patogeeneja niiden alatyyppeihin, testin vastausaikaan, helppokäyttöisyyteen ja muun muassa siihen, voidaanko tuloksia havaita yksitellen testin aikana vai vasta lopuksi kaikkien patogeenitestien valmistuttua. Kaupallisia Multiplex-paneeleja on saatavilla tällä hetkellä useille respiratorisille viruksille, kuten muun muassa influenssa A:lle ja B:lle, parainfluenssa 1-3:lle, RS-virukselle, adenovirukselle, ihmisen metapneumovirukselle ja rinovirukselle.

Multiplex-paneeleilla on useita etuja yksittäisten patogeenien PCR-tutkimuksiin verrattuna. Useiden patogeenien tutkiminen samasta näytteestä, samanaikaisesti, vähentää työmäärää sekä kustannuksia ja negatiiviset tulokset saadaan nopeasti noin tunnissa. Suhteellisen nopeasti saadut paneelitulokset vähentävät turhia antibioottikuureja ja hoitokustannuksia sekä nopeuttavat kriittisten tulosten saantia hoitoratkaisujen ja eristämisen arvioinnissa. Näytteiden määrän tarve ja reagenssien kulutus on pienempää yksittäisten patogeenien tutkimiseen verrattuna. Multiplex-menetelmät ovat hyvin herkkiä ja spesifisiä. Herkkyyden kasvaessa väärien positiivisten tulosten määrä lisääntyy, koska hyvin herkkä menetelmä voi ei-toivotusti havaita mahdollisen näytteenottovaiheen kontaminaation tai edellisen näytteen

monistamistuotteiden joutumisen seuraavaan reaktioon. Alukkeiden samankaltaisuus voi aiheuttaa ristireagointia eri virusten välillä johtuen niiden genomirakenteen samankaltaisuudesta. Edellä mainitut tekijät aiheuttavat haasteita tulosten tulkinnassa.

Etenkin pienillä lapsilla sekainfektiot ovat tavallisia. 5-8%:ssa kaikista respiratorisista näytteistä on löytynyt kaksi tai kolme virusta, jotka voivat olla seurausta peräkkäin tai samanaikaisesti sairastetuista infektioista tai oireettomasta tartunnasta (1). Tulosten kliininen merkitys on siten aina punnittava tapauskohtaisesti ja harkittava sopivan ja luotettavan erotusmenetelmän, kuten herkemmän virusspesifisen PCR:n käyttämistä tarvittaessa. Laitteet ja testit ovat arvokkaita. Niiden käyttäminen vaatii osaavaa henkilökuntaa ja hyviksi todettuja työtapoja esimerkiksi kontaminaation estämiseksi biosuojakaapein, aseptisella työskentelyllä ja oikeanlaisilla tilaratkaisuilla. Testejä tulee päivittää aika ajoin virusten muuntumisen seurauksena. Kustannuksiin voidaan vaikuttaa harkitsemalla testien tarpeellisuutta. Esimerkiksi laajan testipaneelin tilaaminen tulee huomattavasti kalliimmaksi kuin yhden, spesifisen testin tekeminen tilanteessa, jossa tiettyä patogeenia osataan epäillä infektion aiheuttajaksi.

Virusnukleiinihappojen osoittamisen kehitystyö on kiivasta POC-testien parissa. Niiden herkkyys ei kuitenkaan yllä laboratoriossa suoritettavien PCR-testien tasolle, kun niiden herkkyys jää lapsilla noin 80%:n ja aikuisilla 30%:n tasolle (2). Lapsilla ne ovat kuitenkin käyttökelpoinen diagnostinen apu ensiavussa epidemioiden yhteydessä. POC-testit ovat verraten nopeita, kun tulos saadaan jo alle puolessa tunnissa. Ne ovat kohtuullisen helppokäyttöisiä ja sopivat siten muun hoitohenkilökunnan suoritettaviksi.

Serologia

Serologiassa infektioiden diagnosointi perustuu seerumin vasta-aineiden tutkimiseen ja patogeenien tyypittämiseen vasta-aineiden avulla. Valtaosa spesifisistä respiratoristen virusten diagnooseista perustuu vasta-aineiden mittaamiseen, koska ne ovat potilasta ajatellen helppoja testejä ja menetelmien herkkyys on hyvällä tasolla. Menetelmiä on useita ja ne valitaan sen mukaan, halutaanko selvittää potilaan immuniteetti tai tartuntahistoria tiettyä taudinaiheuttajaa vastaan. Primaari-infektion ajankohta tai viruksen reaktivaatio voidaan selvittää serologisilla tutkimuksilla.

Serologiset menetelmät soveltuvat erityisesti adeno-, influenssa-, parainfluenssa- ja RS-virusten diagnostiikkaan. IgG-vasta-aineen pariseerumeiden tutkiminen on suositeltavin menetelmä näiden virusten diagnostiikassa, koska IgM-vasta-aineiden vastetta ei välttämättä tule uusintainfektioissa.

Käytetyimpiä serologisia menetelmiä ovat EIA- ja komplementin sitoutumistesti (CF), joista respiratoristen virusten akuuttien infektioiden toteamiseen suositellaan käytettäväksi CF-testiä. CF-testillä voidaan osoittaa spesifinen vasta-aine yhdestä seeruminäytteestä. Pariseeruminäytteitä tutkimalla voidaan kuitenkin osoittaa mahdollinen akuutin respiratorisen infektion aiheuttaja.

Serologinen diagnostiikka on hidasta, koska respiratoristen virusten kohdalla vaaditaan pariseeruminäytteiden käyttämistä. Herkkyydeltään serologiset tutkimukset ovat verrattavissa antigeeniosoitustesteihin. EIA-menetelmillä saavutetaan parempi herkkyys kuin komplementinsitoutumistestillä. Vaikkakin serologinen tutkimus on pariseerumien käytön vuoksi hidasta, ne soveltuvat hyvin lapsille. Niiden avulla voidaan havaita yksittäisten taudinaiheuttajavirusten lisäksi myös usean eri viruksen aiheuttamat sekainfektiot pienillä lapsilla vastasyntyneet pois lukien, koska heidän vasta-ainevasteensa on vielä yleensä heikko. Nykyään respiratoristen virusten laboratoriodiagnostiikassa yhdistetään serologisia tutkimuksia ja nukleiinihappo-osoitustestejä keskenään diagnostisen tarkkuuden ja herkkyyden parantamiseksi.

Katariina Laihola, bioanalyytikko-opiskelija, Oamk Mika Paldanius, dosentti, koulutuspäällikkö, Oamk

LÄHTEET

1. Jacobs, S., Lamson, D., George, K. & Walsh, T. 2013. Human rhinoviruses. Clin Microbiol Rev. 26 (1), 135–162 2. Chartrand, C., Tremblay, N., Renaud, C. & Papenburg, J. 2015. Diagnostics accuracy of rapid antigen detection tests for respiratory syncytial virus infection: systematic review and metaanalysis. J Clin Microbiol. 53 (12), 3738–3749