RMCP Vol. 13 Núm. 3 (2022): Julio-Septiembre [versión en español]

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Edición Bilingüe Bilingual Edition

Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 13 Núm. 3, pp. 584-845, JULIO-SEPTIEMBRE-2022

ISSN: 2448-6698

Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 13 Núm. 3, pp. 584-845, JULIO-SEPTIEMBRE-2022


REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS PECUARIAS Volumen 13 Numero 3, JulioSeptiembre 2022. Es una publicación trimestral de acceso abierto, revisada por pares y arbitrada, editada por el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Avenida Progreso No. 5, Barrio de Santa Catarina, Delegación Coyoacán, C.P. 04010, Cuidad de México, www.inifap.gob.mx Distribuida por el Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Salud Animal e Inocuidad, Km 15.5 Carretera México-Toluca, Colonia Palo Alto, Cuidad de México, C.P. 05110. Editor responsable: Arturo García Fraustro. Reservas de Derechos al Uso Exclusivo número 04-2022-033116571100-102. ISSN: 2448-6698, otorgados por el Instituto Nacional del Derecho de Autor (INDAUTOR). Responsable de la última actualización de este número: Arturo García Fraustro, Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Salud Animal e Inocuidad, Km. 15.5 Carretera México-Toluca, Colonia Palo Alto, Ciudad de México, C.P. 015110. http://cienciaspecuarias. inifap.gob.mx, la presente publicación tuvo su última actualización en julio de 2022. Corral de engorda intensiva de corderos Dorper x Katahdin destinados a la producción de cortes finos del Instituto de Ciencias Agrícolas de la UABC. Fotografía: Ulises Macías Cruz

DIRECTORIO EDITOR EN JEFE Arturo García Fraustro

FUNDADOR John A. Pino EDITORES ADJUNTOS Oscar L. Rodríguez Rivera Alfonso Arias Medina

EDITORES POR DISCIPLINA Dra. Yolanda Beatriz Moguel Ordóñez, INIFAP, México Dr. Ramón Molina Barrios, Instituto Tecnológico de Sonora, Dr. Alfonso Juventino Chay Canul, Universidad Autónoma de Tabasco, México Dra. Maria Cristina Schneider, Universidad de Georgetown, Estados Unidos Dr. Feliciano Milian Suazo, Universidad Autónoma de Querétaro, México Dr. Javier F. Enríquez Quiroz, INIFAP, México Dra. Martha Hortencia Martín Rivera, Universidad de Sonora URN, México Dr. Fernando Arturo Ibarra Flores, Universidad de Sonora URN, México Dr. James A. Pfister, USDA, Estados Unidos Dr. Eduardo Daniel Bolaños Aguilar, INIFAP, México Dr. Sergio Iván Román-Ponce, INIFAP, México Dr. Jesús Fernández Martín, INIA, España Dr. Maurcio A. Elzo, Universidad de Florida Dr. Sergio D. Rodríguez Camarillo, INIFAP, México Dra. Nydia Edith Reyes Rodríguez, Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, México Dra. Maria Salud Rubio Lozano, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM, México Dra. Elizabeth Loza-Rubio, INIFAP, México Dr. Juan Carlos Saiz Calahorra, Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, España Dr. José Armando Partida de la Peña, INIFAP, México Dr. José Luis Romano Muñoz, INIFAP, México Dr. Jorge Alberto López García, INIFAP, México

Dr. Alejandro Plascencia Jorquera, Universidad Autónoma de Baja California, México Dr. Juan Ku Vera, Universidad Autónoma de Yucatán, México Dr. Ricardo Basurto Gutiérrez, INIFAP, México Dr. Luis Corona Gochi, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM, México Dr. Juan Manuel Pinos Rodríguez, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, México Dr. Carlos López Coello, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM, México Dr. Arturo Francisco Castellanos Ruelas, Facultad de Química. UADY Dra. Guillermina Ávila Ramírez, UNAM, México Dr. Emmanuel Camuus, CIRAD, Francia. Dr. Héctor Jiménez Severiano, INIFAP., México Dr. Juan Hebert Hernández Medrano, UNAM, México Dr. Adrian Guzmán Sánchez, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, México Dr. Eugenio Villagómez Amezcua Manjarrez, INIFAP, CENID Salud Animal e Inocuidad, México Dr. José Juan Hernández Ledezma, Consultor privado Dr. Fernando Cervantes Escoto, Universidad Autónoma Chapingo, México Dr. Adolfo Guadalupe Álvarez Macías, Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco, México Dr. Alfredo Cesín Vargas, UNAM, México Dra. Marisela Leal Hernández, INIFAP, México Dr. Efrén Ramírez Bribiesca, Colegio de Postgraduados, México

TIPOGRAFÍA Y FORMATO: Oscar L. Rodríguez Rivera

Indizada en el “Journal Citation Report” Science Edition del ISI . Inscrita en el Sistema de Clasificación de Revistas Científicas y Tecnológicas de CONACyT; en EBSCO Host y la Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal (RedALyC) (www.redalyc.org); en la Red Iberoamericana de Revistas Científicas de Veterinaria de Libre Acceso (www.veterinaria.org/revistas/ revivec); en los Índices SCOPUS y EMBASE de Elsevier (www.elsevier. com).

I


REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS PECUARIAS La Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias es un órgano de difusión científica y técnica de acceso abierto, revisada por pares y arbitrada. Su objetivo es dar a conocer los resultados de las investigaciones realizadas por cualquier institución científica, relacionadas particularmente con las distintas disciplinas de la Medicina Veterinaria y la Zootecnia. Además de trabajos de las disciplinas indicadas en su Comité Editorial, se aceptan también para su evaluación y posible publicación, trabajos de otras disciplinas, siempre y cuando estén relacionados con la investigación pecuaria. Se publican en la revista tres categorías de trabajos: Artículos Científicos, Notas de Investigación y Revisiones Bibliográficas (consultar las Notas al autor); la responsabilidad de cada trabajo recae exclusivamente en los autores, los cuales, por la naturaleza misma de los experimentos pueden verse obligados a referirse en algunos casos a los nombres comerciales de ciertos productos, ello sin embargo, no implica preferencia por los productos citados o ignorancia respecto a los omitidos, ni tampoco significa en modo alguno respaldo publicitario hacia los productos mencionados. Todas las contribuciones serán cuidadosamente evaluadas por árbitros, considerando su calidad y relevancia académica. Queda entendido que el someter un manuscrito implica que la investigación descrita es única e inédita. La publicación de Rev. Mex. Cienc. Pecu. es trimestral en formato bilingüe Español e Inglés. El costo

total por publicar es de $ 7,280.00 más IVA por manuscrito ya editado. Se publica en formato digital en acceso abierto, por lo que se autoriza la reproducción total o parcial del contenido de los artículos si se cita la fuente. El envío de los trabajos de debe realizar directamente en el sitio oficial de la revista. Correspondencia adicional deberá dirigirse al Editor Adjunto a la siguiente dirección: Calle 36 No. 215 x 67 y 69 Colonia Montes de Amé, C.P. 97115 Mérida, Yucatán, México. Tel/Fax +52 (999) 941-5030. Correo electrónico (C-ele): rodriguez_oscar@prodigy.net.mx. La correspondencia relativa a suscripciones, asuntos de intercambio o distribución de números impresos anteriores, deberá dirigirse al Editor en Jefe de la Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias, CENID Salud Animal e Inocuidad, Km 15.5 Carretera México-Toluca, Col. Palo Alto, D.F. C.P. 05110, México; Tel: +52(55) 3871-8700 ext. 80316; garcia.arturo@inifap.gob.mx o arias.alfonso@inifap.gob.mx. Inscrita en la base de datos de EBSCO Host y la Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal (RedALyC) (www.redalyc.org), en la Red Iberoamericana de Revistas Científicas de Veterinaria de Libre Acceso (www.veterinaria.org/revistas/ revivec), indizada en el “Journal Citation Report” Science Edition del ISI (http://thomsonreuters. com/) y en los Índices SCOPUS y EMBASE de Elsevier (www.elsevier.com)

VISITE NUESTRA PÁGINA EN INTERNET Artículos completos desde 1963 a la fecha y Notas al autor en: http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias is an open access peer-reviewed and refereed scientific and technical journal, which publishes results of research carried out in any scientific or academic institution, especially related to different areas of veterinary medicine and animal production. Papers on disciplines different from those shown in Editorial Committee can be accepted, if related to livestock research. The journal publishes three types of papers: Research Articles, Technical Notes and Review Articles (please consult Instructions for authors). Authors are responsible for the content of each manuscript, which, owing to the nature of the experiments described, may contain references, in some cases, to commercial names of certain products, which however, does not denote preference for those products in particular or of a lack of knowledge of any other which are not mentioned, nor does it signify in any way an advertisement or an endorsement of the referred products. All contributions will be carefully refereed for academic relevance and quality. Submission of an article is understood to imply that the research described is unique and unpublished. Rev. Mex. Cien. Pecu. is published quarterly in original lenguage Spanish or English. Total fee charges are US $ 425.00 per article in both printed languages.

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REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS PECUARIAS

REV. MEX. CIENC. PECU.

VOL. 13 No. 3

JULIO-SEPTIEMBRE-2022

CONTENIDO Contents ARTÍCULOS Articles

Pág.

Isolated Escherichia coli resistance genes in broiler chicken Genes de resistencia a aislados de Escherichia coli en pollos de engorda Diana López-Velandia, Edna Carvajal-Barrera, Egberto Rueda-Garrido, Martín Talavera- Rojas, María Vásquez, María Torres-Caycedo ………………………………………………………………………………….584 Detección del virus de la lengua azul en ovinos por RT- PCR en tiempo real en diferentes sistemas de producción en San Martín, Perú Detection of bluetongue virus in sheep by real-time RT-PCR in different production systems in San Martín, Perú Alicia María López Flores, Roni David Cruz Vasquez, Víctor Humberto Puicón Niño de Guzmán, Alicia Bartra Reátegui, Orlando Ríos Ramírez, Fredy Fabián Domínguez ………………………………….596 Detección del virus de la diarrea viral bovina en artiodáctilos silvestres en cautiverio en México Detection of bovine viral diarrhea virus in captive wild artiodactyls in Mexico Jocelyn Medina-Gudiño, Ninnet Gómez-Romero, José Ramírez-Lezama, Luis Padilla-Noriega, Emilio Venegas-Cureño, Francisco Javier Basurto-Alcántara ………………………………………………………….…612 Evaluación de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real acoplado a separación inmunomagnética (PCRTR-IMS) como método alternativo para la detección rutinaria de Salmonella spp. en carne de res en México Evaluation of real-time polymerase chain reaction coupled to immunomagnetic separation (rtPCRIMS) as an alternative method for the routine detection of Salmonella spp. in beef in Mexico Gloria Marisol Castañeda-Ruelas, José Roberto Guzmán-Uriarte, José Benigno Valdez-Torres, Josefina León-Félix…………………………………………………………………………………………………………..…625 Prevalence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and associated risk factors in dairies under mechanical milking parlor-systems in Antioquia, Colombia Prevalencia de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y factores de riesgo asociados en lecherías bajo sistemas de sala de ordeño mecánico en Antioquia, Colombia Nathalia M. Correa-Valencia, Nicolás F. Ramírez-Vásquez, Jorge A. Fernández-Silva …………………643

III


Effects of nutrition in the final third of gestation of beef cows on progeny development Efecto de la nutrición en el último tercio de la gestación de vacas de carne sobre el desarrollo de la progenie John Lenon Klein, Sander Martinho Adams, Amanda Farias de Moura, Daniele Borchate, Dari Celestino Alves Filho, Dieison Pansiera Antunes, Fabiana Moro Maidana, Gilmar dos Santos Cardoso, Ivan Luiz Brondani, Ricardo Gonçalves Gindri ……………………………………………………………………….658 Establishment of tropical forage grasses in the Cerrado biome Establecimiento de gramíneas forrajeras tropicales en el bioma del Cerrado Antonio Leandro Chaves Gurgel, Gelson dos Santos Difante, Carolina Marques Costa, João Virgínio Emerenciano Neto, Gustavo Henrique Tonhão, Luís Carlos Vinhas Ítavo, Alexandre Menezes Dias, Iuri Mesquita Moraes Vilela, Vivian Garcia de Oliveira, Pâmella Cristina da Silva Lima, Andrey William Alce Miyake ....................................................................………………………………………..674 Efectividad del clorhidrato de zilpaterol en la finalización de corderos: Patente vs. Genérico Effectiveness of zilpaterol hydrochloride in lamb finishing: Patent vs. Generic Arnulfo Vicente Pérez, Leonel Avendaño-Reyes, Juan E. Guerra-Liera, Rubén Barajas Cruz, Ricardo Vicente-Pérez, M. Ángeles López-Baca, Miguel A. Gastelum Delgado, Alfonso J. Chay-Canul, Ulises Macías-Cruz ………………………………………………………………………………………………………………………690 Forage availability in Xaraés grass pastures subjected to nitrogen sources of the slow and fast release Disponibilidad de forraje en praderas de pasto Xaraés en respuesta a fuentes de nitrógeno convencionales y tratadas con N-(n-butil) triamida tiofosfórica (NBPT) Luís Henrique Almeida Matos, Carlindo Santos Rodrigues, Douglas dos Santos Pina, Vagner Maximino Leite, Paula Aguiar Silva, Taiala Cristina de Jesus Pereira, Gleidson Giordano Pinto Carvalho ..................................................................................…………………………………….….706

REVISIONES DE LITERATURA Reviews Diagnóstico, prevención y control de enfermedades causadas por Chlamydia en pequeños rumiantes. Revisión Diagnosis, prevention and control of diseases caused by Chlamydia in small ruminants. Review Fernando De Jesús Aldama, Roberto Montes de Oca Jiménez, Jorge Antonio Varela Guerrero …..725 Comportamiento de ingestión y consumo de forraje por vacas en pastoreo en clima templado. Revisión Ingestion behavior and forage intake by grazing cows in temperate climate. Review Juan Daniel Jiménez Rosales, Ricardo Daniel Améndola Massiotti .........………………………………….743 La citometría de flujo, un universo de posibilidades en el ámbito veterinario. Revisión Flow cytometry, a universe of possibilities in the veterinary field. Review Luvia Enid Sánchez-Torres, Alejandra Espinosa-Bonilla, Fernando Diosdado-Vargas …………………763

IV


Presencia de alcaloides pirrolizidínicos en miel y los efectos de su consumo en humanos y abejas. Revisión Presence of pyrrolizidine alkaloids in honey and the effects of their consumption on humans and honeybees. Review Laura Yavarik Alvarado-Avila, Yolanda Beatriz Moguel-Ordóñez, Claudia García-Figueroa, Francisco Javier Ramírez-Ramírez, Miguel Enrique Arechavaleta-Velasco ……………………787 Efectos de los fitoestrógenos en la fisiología reproductiva de especies productivas. Revisión Effects of phytoestrogens on the reproductive physiology of productive species. Review Miguel Morales Ramírez, Dinorah Vargas Estrada, Iván Juárez Rodríguez, Juan José Pérez-Rivero, Alonso Sierra Reséndiz, Héctor Fabián Flores González, José Luis Cerbón Gutiérrez, Sheila Irais Peña-Corona ………..…………………………………………………………..................................803

NOTAS DE INVESTIGACIÓN Technical notes Estructura genética y aptitud ambiental de poblaciones de pasto banderita [ Bouteloua curtipendula (Michx.) Torr.] en Chihuahua, México Genetic structure and environmental aptitude of sideoats grama [ Bouteloua curtipendula (Michx.) Torr.] populations in Chihuahua, Mexico Alan Álvarez-Holguín, Carlos Raúl Morales-Nieto, Raúl Corrales-Lerma, Jesús Alejandro PrietoAmparán, Ireyli Zuluami Iracheta-Lara, Nathalie Socorro Hernández-Quiroz ………………..............830

V


Actualización: marzo, 2020 NOTAS AL AUTOR La Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias se edita completa en dos idiomas (español e inglés) y publica tres categorías de trabajos: Artículos científicos, Notas de investigación y Revisiones bibliográficas.

6.

Los autores interesados en publicar en esta revista deberán ajustarse a los lineamientos que más adelante se indican, los cuales en términos generales, están de acuerdo con los elaborados por el Comité Internacional de Editores de Revistas Médicas (CIERM) Bol Oficina Sanit Panam 1989;107:422-437. 1.

2.

3.

Página del título Resumen en español Resumen en inglés Texto Agradecimientos y conflicto de interés Literatura citada

Sólo se aceptarán trabajos inéditos. No se admitirán si están basados en pruebas de rutina, ni datos experimentales sin estudio estadístico cuando éste sea indispensable. Tampoco se aceptarán trabajos que previamente hayan sido publicados condensados o in extenso en Memorias o Simposio de Reuniones o Congresos (a excepción de Resúmenes). Todos los trabajos estarán sujetos a revisión de un Comité Científico Editorial, conformado por Pares de la Disciplina en cuestión, quienes desconocerán el nombre e Institución de los autores proponentes. El Editor notificará al autor la fecha de recepción de su trabajo. El manuscrito deberá someterse a través del portal de la Revista en la dirección electrónica: http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx, consultando el “Instructivo para envío de artículos en la página de la Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias”. Para su elaboración se utilizará el procesador de Microsoft Word, con letra Times New Roman a 12 puntos, a doble espacio. Asimismo se deberán llenar los formatos de postulación, carta de originalidad y no duplicidad y disponibles en el propio sitio oficial de la revista.

4.

Por ser una revista con arbitraje, y para facilitar el trabajo de los revisores, todos los renglones de cada página deben estar numerados; asimismo cada página debe estar numerada, inclusive cuadros, ilustraciones y gráficas.

5.

Los artículos tendrán una extensión máxima de 20 cuartillas a doble espacio, sin incluir páginas de Título, y cuadros o figuras (los cuales no deberán exceder de ocho y ser incluidos en el texto). Las Notas de investigación tendrán una extensión máxima de 15 cuartillas y 6 cuadros o figuras. Las Revisiones bibliográficas una extensión máxima de 30 cuartillas y 5 cuadros.

Los manuscritos de las tres categorías de trabajos que se publican en la Rev. Mex. Cienc. Pecu. deberán contener los componentes que a continuación se indican, empezando cada uno de ellos en página aparte.

7.

Página del Título. Solamente debe contener el título del trabajo, que debe ser conciso pero informativo; así como el título traducido al idioma inglés. En el manuscrito no es necesaria información como nombres de autores, departamentos, instituciones, direcciones de correspondencia, etc., ya que estos datos tendrán que ser registrados durante el proceso de captura de la solicitud en la plataforma del OJS (http://ciencias pecuarias.inifap.gob.mx).

8.

Resumen en español. En la segunda página se debe incluir un resumen que no pase de 250 palabras. En él se indicarán los propósitos del estudio o investigación; los procedimientos básicos y la metodología empleada; los resultados más importantes encontrados, y de ser posible, su significación estadística y las conclusiones principales. A continuación del resumen, en punto y aparte, agregue debidamente rotuladas, de 3 a 8 palabras o frases cortas clave que ayuden a los indizadores a clasificar el trabajo, las cuales se publicarán junto con el resumen.

9.

Resumen en inglés. Anotar el título del trabajo en inglés y a continuación redactar el “abstract” con las mismas instrucciones que se señalaron para el resumen en español. Al final en punto y aparte, se deberán escribir las correspondientes palabras clave (“key words”).

10. Texto. Las tres categorías de trabajos que se publican en la Rev. Mex. Cienc. Pecu. consisten en lo siguiente: a) Artículos científicos. Deben ser informes de trabajos originales derivados de resultados parciales o finales de investigaciones. El texto del Artículo científico se divide en secciones que llevan estos encabezamientos:

VI


Introducción Materiales y Métodos Resultados Discusión Conclusiones e implicaciones Literatura citada

referencias, aunque pueden insertarse en el texto (entre paréntesis).

Reglas básicas para la Literatura citada Nombre de los autores, con mayúsculas sólo las iniciales, empezando por el apellido paterno, luego iniciales del materno y nombre(s). En caso de apellidos compuestos se debe poner un guión entre ambos, ejemplo: Elías-Calles E. Entre las iniciales de un autor no se debe poner ningún signo de puntuación, ni separación; después de cada autor sólo se debe poner una coma, incluso después del penúltimo; después del último autor se debe poner un punto.

En los artículos largos puede ser necesario agregar subtítulos dentro de estas divisiones a fin de hacer más claro el contenido, sobre todo en las secciones de Resultados y de Discusión, las cuales también pueden presentarse como una sola sección. b) Notas de investigación. Consisten en modificaciones a técnicas, informes de casos clínicos de interés especial, preliminares de trabajos o investigaciones limitadas, descripción de nuevas variedades de pastos; así como resultados de investigación que a juicio de los editores deban así ser publicados. El texto contendrá la misma información del método experimental señalado en el inciso a), pero su redacción será corrida del principio al final del trabajo; esto no quiere decir que sólo se supriman los subtítulos, sino que se redacte en forma continua y coherente.

El título del trabajo se debe escribir completo (en su idioma original) luego el título abreviado de la revista donde se publicó, sin ningún signo de puntuación; inmediatamente después el año de la publicación, luego el número del volumen, seguido del número (entre paréntesis) de la revista y finalmente el número de páginas (esto en caso de artículo ordinario de revista). Puede incluir en la lista de referencias, los artículos aceptados aunque todavía no se publiquen; indique la revista y agregue “en prensa” (entre corchetes).

c) Revisiones bibliográficas. Consisten en el tratamiento y exposición de un tema o tópico de relevante actualidad e importancia; su finalidad es la de resumir, analizar y discutir, así como poner a disposición del lector información ya publicada sobre un tema específico. El texto se divide en: Introducción, y las secciones que correspondan al desarrollo del tema en cuestión.

En el caso de libros de un solo autor (o más de uno, pero todos responsables del contenido total del libro), después del o los nombres, se debe indicar el título del libro, el número de la edición, el país, la casa editorial y el año. Cuando se trate del capítulo de un libro de varios autores, se debe poner el nombre del autor del capítulo, luego el título del capítulo, después el nombre de los editores y el título del libro, seguido del país, la casa editorial, año y las páginas que abarca el capítulo.

11. Agradecimientos y conflicto de interés. Siempre que corresponda, se deben especificar las colaboraciones que necesitan ser reconocidas, tales como a) la ayuda técnica recibida; b) el agradecimiento por el apoyo financiero y material, especificando la índole del mismo; c) las relaciones financieras que pudieran suscitar un conflicto de intereses. Las personas que colaboraron pueden ser citadas por su nombre, añadiendo su función o tipo de colaboración; por ejemplo: “asesor científico”, “revisión crítica de la propuesta para el estudio”, “recolección de datos”, etc. Siempre que corresponda, los autores deberán mencionar si existe algún conflicto de interés. 12. Literatura citada. Numere las referencias consecutivamente en el orden en que se mencionan por primera vez en el texto. Las referencias en el texto, en los cuadros y en las ilustraciones se deben identificar mediante números arábigos entre paréntesis, sin señalar el año de la referencia. Evite hasta donde sea posible, el tener que mencionar en el texto el nombre de los autores de las referencias. Procure abstenerse de utilizar los resúmenes como referencias; las “observaciones inéditas” y las “comunicaciones personales” no deben usarse como

En el caso de tesis, se debe indicar el nombre del autor, el título del trabajo, luego entre corchetes el grado (licenciatura, maestría, doctorado), luego el nombre de la ciudad, estado y en su caso país, seguidamente el nombre de la Universidad (no el de la escuela), y finalmente el año. Emplee el estilo de los ejemplos que aparecen a continuación, los cuales están parcialmente basados en el formato que la Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos usa en el Index Medicus. Revistas

Artículo ordinario, con volumen y número. (Incluya el nombre de todos los autores cuando sean seis o menos; si son siete o más, anote sólo el nombre de los seis primeros y agregue “et al.”).

VII


I)

Basurto GR, Garza FJD. Efecto de la inclusión de grasa o proteína de escape ruminal en el comportamiento de toretes Brahman en engorda. Téc Pecu Méx 1998;36(1):35-48.

XI)

Sólo número sin indicar volumen. II) Stephano HA, Gay GM, Ramírez TC. Encephalomielitis, reproductive failure and corneal opacity (blue eye) in pigs associated with a paramyxovirus infection. Vet Rec 1988;(122):6-10.

XII) Cunningham EP. Genetic diversity in domestic animals: strategies for conservation and development. In: Miller RH et al. editors. Proc XX Beltsville Symposium: Biotechnology’s role in genetic improvement of farm animals. USDA. 1996:13.

III) Chupin D, Schuh H. Survey of present status ofthe use of artificial insemination in developing countries. World Anim Rev 1993;(74-75):26-35.

Tesis.

No se indica el autor.

XIII) Alvarez MJA. Inmunidad humoral en la anaplasmosis y babesiosis bovinas en becerros mantenidos en una zona endémica [tesis maestría]. México, DF: Universidad Nacional Autónoma de México; 1989.

IV) Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994;84:15.

Suplemento de revista.

XIV) Cairns RB. Infrared spectroscopic studies of solid oxigen [doctoral thesis]. Berkeley, California, USA: University of California; 1965.

V) Hall JB, Staigmiller RB, Short RE, Bellows RA, Bartlett SE. Body composition at puberty in beef heifers as influenced by nutrition and breed [abstract]. J Anim Sci 1998;71(Suppl 1):205.

Organización como autor. XV) NRC. National Research Council. The nutrient requirements of beef cattle. 6th ed. Washington, DC, USA: National Academy Press; 1984.

Organización, como autor. VI) The Cardiac Society of Australia and New Zealand. Clinical exercise stress testing. Safety and performance guidelines. Med J Aust 1996;(164):282-284.

XVI) SAGAR. Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural. Curso de actualización técnica para la aprobación de médicos veterinarios zootecnistas responsables de establecimientos destinados al sacrificio de animales. México. 1996.

En proceso de publicación. VII) Scifres CJ, Kothmann MM. Differential grazing use of herbicide treated area by cattle. J Range Manage [in press] 2000.

XVII) AOAC. Oficial methods of analysis. 15th ed. Arlington, VA, USA: Association of Official Analytical Chemists. 1990.

Libros y otras monografías

XVIII) SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 6.03). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1988.

Autor total. VIII) Steel RGD, Torrie JH. Principles and procedures of statistics: A biometrical approach. 2nd ed. New York, USA: McGraw-Hill Book Co.; 1980.

XIX) SAS. SAS User´s Guide: Statistics (version 5 ed.). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1985.

Publicaciones electrónicas

Autor de capítulo. IX)

XX) Jun Y, Ellis M. Effect of group size and feeder type on growth performance and feeding patterns in growing pigs. J Anim Sci 2001;79:803-813. http://jas.fass.org/cgi/reprint/79/4/803.pdf. Accessed Jul 30, 2003.

Roberts SJ. Equine abortion. In: Faulkner LLC editor. Abortion diseases of cattle. 1rst ed. Springfield, Illinois, USA: Thomas Books; 1968:158-179.

Memorias de reuniones. X)

Olea PR, Cuarón IJA, Ruiz LFJ, Villagómez AE. Concentración de insulina plasmática en cerdas alimentadas con melaza en la dieta durante la inducción de estro lactacional [resumen]. Reunión nacional de investigación pecuaria. Querétaro, Qro. 1998:13.

XXI) Villalobos GC, González VE, Ortega SJA. Técnicas para estimar la degradación de proteína y materia orgánica en el rumen y su importancia en rumiantes en pastoreo. Téc Pecu Méx 2000;38(2): 119-134. http://www.tecnicapecuaria.org/trabajos/20021217 5725.pdf. Consultado 30 Ago, 2003.

Loeza LR, Angeles MAA, Cisneros GF. Alimentación de cerdos. En: Zúñiga GJL, Cruz BJA editores. Tercera reunión anual del centro de investigaciones forestales y agropecuarias del estado de Veracruz. Veracruz. 1990:51-56.

VIII


XXII) Sanh MV, Wiktorsson H, Ly LV. Effect of feeding level on milk production, body weight change, feed conversion and postpartum oestrus of crossbred lactating cows in tropical conditions. Livest Prod Sci 2002;27(2-3):331-338. http://www.sciencedirect. com/science/journal/03016226. Accessed Sep 12, 2003.

ha hectárea (s) h hora (s) i.m. intramuscular (mente) i.v. intravenosa (mente) J joule (s) kg kilogramo (s) km kilómetro (s) L litro (s) log logaritmo decimal Mcal megacaloría (s) MJ megajoule (s) m metro (s) msnm metros sobre el nivel del mar µg microgramo (s) µl microlitro (s) µm micrómetro (s)(micra(s)) mg miligramo (s) ml mililitro (s) mm milímetro (s) min minuto (s) ng nanogramo (s)Pprobabilidad (estadística) p página PC proteína cruda PCR reacción en cadena de la polimerasa pp páginas ppm partes por millón % por ciento (con número) rpm revoluciones por minuto seg segundo (s) t tonelada (s) TND total de nutrientes digestibles UA unidad animal UI unidades internacionales

13. Cuadros, Gráficas e Ilustraciones. Es preferible que sean pocos, concisos, contando con los datos necesarios para que sean autosuficientes, que se entiendan por sí mismos sin necesidad de leer el texto. Para las notas al pie se deberán utilizar los símbolos convencionales. 14 Versión final. Es el documento en el cual los autores ya integraron las correcciones y modificaciones indicadas por el Comité Revisor. Los trabajos deberán ser elaborados con Microsoft Word. Las fotografías e imágenes deberán estar en formato jpg (o compatible) con al menos 300 dpi de resolución. Tanto las fotografías, imágenes, gráficas, cuadros o tablas deberán incluirse en el mismo archivo del texto. Los cuadros no deberán contener ninguna línea vertical, y las horizontales solamente las que delimitan los encabezados de columna, y la línea al final del cuadro. 15. Una vez recibida la versión final, ésta se mandará para su traducción al idioma inglés o español, según corresponda. Si los autores lo consideran conveniente podrán enviar su manuscrito final en ambos idiomas. 16. Tesis. Se publicarán como Artículo o Nota de Investigación, siempre y cuando se ajusten a las normas de esta revista. 17. Los trabajos no aceptados para su publicación se regresarán al autor, con un anexo en el que se explicarán los motivos por los que se rechaza o las modificaciones que deberán hacerse para ser reevaluados.

versus

xg

gravedades

Cualquier otra abreviatura se pondrá entre paréntesis inmediatamente después de la(s) palabra(s) completa(s).

18. Abreviaturas de uso frecuente: cal cm °C DL50 g

vs

caloría (s) centímetro (s) grado centígrado (s) dosis letal 50% gramo (s)

19. Los nombres científicos y otras locuciones latinas se deben escribir en cursivas.

IX


Updated: March, 2020 INSTRUCTIONS FOR AUTHORS Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias is a scientific journal published in a bilingual format (Spanish and English) which carries three types of papers: Research Articles, Technical Notes, and Reviews. Authors interested in publishing in this journal, should follow the belowmentioned directives which are based on those set down by the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) Bol Oficina Sanit Panam 1989;107:422-437. 1.

2.

3.

4.

5.

6.

Title page Abstract Text Acknowledgments and conflict of interest Literature cited

Only original unpublished works will be accepted. Manuscripts based on routine tests, will not be accepted. All experimental data must be subjected to statistical analysis. Papers previously published condensed or in extenso in a Congress or any other type of Meeting will not be accepted (except for Abstracts). All contributions will be peer reviewed by a scientific editorial committee, composed of experts who ignore the name of the authors. The Editor will notify the author the date of manuscript receipt. Papers will be submitted in the Web site http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx, according the “Guide for submit articles in the Web site of the Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias”. Manuscripts should be prepared, typed in a 12 points font at double space (including the abstract and tables), At the time of submission a signed agreement co-author letter should enclosed as complementary file; coauthors at different institutions can mail this form independently. The corresponding author should be indicated together with his address (a post office box will not be accepted), telephone and Email.

7.

Title page. It should only contain the title of the work, which should be concise but informative; as well as the title translated into English language. In the manuscript is not necessary information as names of authors, departments, institutions and correspondence addresses, etc.; as these data will have to be registered during the capture of the application process on the OJS platform (http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx).

8.

Abstract. On the second page a summary of no more than 250 words should be included. This abstract should start with a clear statement of the objectives and must include basic procedures and methodology. The more significant results and their statistical value and the main conclusions should be elaborated briefly. At the end of the abstract, and on a separate line, a list of up to 10 key words or short phrases that best describe the nature of the research should be stated.

9.

Text. The three categories of articles which are published in Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias are the following:

a) Research Articles. They should originate in primary

works and may show partial or final results of research. The text of the article must include the following parts:

To facilitate peer review all pages should be numbered consecutively, including tables, illustrations and graphics, and the lines of each page should be numbered as well.

Introduction Materials and Methods Results Discussion Conclusions and implications Literature cited

Research articles will not exceed 20 double spaced pages, without including Title page and Tables and Figures (8 maximum and be included in the text). Technical notes will have a maximum extension of 15 pages and 6 Tables and Figures. Reviews should not exceed 30 pages and 5 Tables and Figures.

In lengthy articles, it may be necessary to add other sections to make the content clearer. Results and Discussion can be shown as a single section if considered appropriate.

Manuscripts of all three type of articles published in Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias should contain the following sections, and each one should begin on a separate page.

b) Technical Notes. They should be brief and be evidence for technical changes, reports of clinical cases of special interest, complete description of a limited investigation, or research results which

X


should be published as a note in the opinion of the editors. The text will contain the same information presented in the sections of the research article but without section titles.

names(s), the number of the edition, the country, the printing house and the year. e. When a reference is made of a chapter of book written by several authors; the name of the author(s) of the chapter should be quoted, followed by the title of the chapter, the editors and the title of the book, the country, the printing house, the year, and the initial and final pages.

c) Reviews. The purpose of these papers is to

summarize, analyze and discuss an outstanding topic. The text of these articles should include the following sections: Introduction, and as many sections as needed that relate to the description of the topic in question.

f. In the case of a thesis, references should be made of the author’s name, the title of the research, the degree obtained, followed by the name of the City, State, and Country, the University (not the school), and finally the year.

10. Acknowledgements. Whenever appropriate, collaborations that need recognition should be specified: a) Acknowledgement of technical support; b) Financial and material support, specifying its nature; and c) Financial relationships that could be the source of a conflict of interest.

Examples The style of the following examples, which are partly based on the format the National Library of Medicine of the United States employs in its Index Medicus, should be taken as a model.

People which collaborated in the article may be named, adding their function or contribution; for example: “scientific advisor”, “critical review”, “data collection”, etc. 11. Literature cited. All references should be quoted in their original language. They should be numbered consecutively in the order in which they are first mentioned in the text. Text, tables and figure references should be identified by means of Arabic numbers. Avoid, whenever possible, mentioning in the text the name of the authors. Abstain from using abstracts as references. Also, “unpublished observations” and “personal communications” should not be used as references, although they can be inserted in the text (inside brackets).

Key rules for references a. The names of the authors should be quoted beginning with the last name spelt with initial capitals, followed by the initials of the first and middle name(s). In the presence of compound last names, add a dash between both, i.e. Elias-Calles E. Do not use any punctuation sign, nor separation between the initials of an author; separate each author with a comma, even after the last but one. b. The title of the paper should be written in full, followed by the abbreviated title of the journal without any punctuation sign; then the year of the publication, after that the number of the volume, followed by the number (in brackets) of the journal and finally the number of pages (this in the event of ordinary article). c. Accepted articles, even if still not published, can be included in the list of references, as long as the journal is specified and followed by “in press” (in brackets).

Journals

Standard journal article (List the first six authors followed by et al.) I)

Basurto GR, Garza FJD. Efecto de la inclusión de grasa o proteína de escape ruminal en el comportamiento de toretes Brahman en engorda. Téc Pecu Méx 1998;36(1):35-48.

Issue with no volume II) Stephano HA, Gay GM, Ramírez TC. Encephalomielitis, reproductive failure and corneal opacity (blue eye) in pigs associated with a paramyxovirus infection. Vet Rec 1988;(122):6-10. III) Chupin D, Schuh H. Survey of present status of the use of artificial insemination in developing countries. World Anim Rev 1993;(74-75):26-35.

No author given IV) Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994;84:15.

Journal supplement V) Hall JB, Staigmiller RB, Short RE, Bellows RA, Bartlett SE. Body composition at puberty in beef heifers as influenced by nutrition and breed [abstract]. J Anim Sci 1998;71(Suppl 1):205.

d. In the case of a single author’s book (or more than one, but all responsible for the book’s contents), the title of the book should be indicated after the

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Organization, as author VI) The Cardiac Society of Australia and New Zealand. Clinical exercise stress testing. Safety and performance guidelines. Med J Aust 1996;(164):282284.

In press VII) Scifres CJ, Kothmann MM. Differential grazing use of herbicide-treated area by cattle. J Range Manage [in press] 2000. Books and other monographs

Author(s) VIII) Steel RGD, Torrie JH. Principles and procedures of statistics: A biometrical approach. 2nd ed. New York, USA: McGraw-Hill Book Co.; 1980.

Organization as author XV) NRC. National Research Council. The nutrient requirements of beef cattle. 6th ed. Washington, DC, USA: National Academy Press; 1984. XVI) SAGAR. Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural. Curso de actualización técnica para la aprobación de médicos veterinarios zootecnistas responsables de establecimientos destinados al sacrificio de animales. México. 1996. XVII) AOAC. Official methods of analysis. 15th ed. Arlington, VA, USA: Association of Official Analytical Chemists. 1990. XVIII) SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 6.03). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1988. XIX) SAS. SAS User´s Guide: Statistics (version 5 ed.). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1985.

Chapter in a book IX)

Roberts SJ. Equine abortion. In: Faulkner LLC editor. Abortion diseases of cattle. 1rst ed. Springfield, Illinois, USA: Thomas Books; 1968:158-179.

Conference paper X)

Loeza LR, Angeles MAA, Cisneros GF. Alimentación de cerdos. En: Zúñiga GJL, Cruz BJA editores. Tercera reunión anual del centro de investigaciones forestales y agropecuarias del estado de Veracruz. Veracruz. 1990:51-56.

XI)

Olea PR, Cuarón IJA, Ruiz LFJ, Villagómez AE. Concentración de insulina plasmática en cerdas alimentadas con melaza en la dieta durante la inducción de estro lactacional [resumen]. Reunión nacional de investigación pecuaria. Querétaro, Qro. 1998:13.

XII) Cunningham EP. Genetic diversity in domestic animals: strategies for conservation and development. In: Miller RH et al. editors. Proc XX Beltsville Symposium: Biotechnology’s role in genetic improvement of farm animals. USDA. 1996:13.

Thesis XIII) Alvarez MJA. Inmunidad humoral en la anaplasmosis y babesiosis bovinas en becerros mantenidos en una zona endémica [tesis maestría]. México, DF: Universidad Nacional Autónoma de México; 1989.

Electronic publications XX) Jun Y, Ellis M. Effect of group size and feeder type on growth performance and feeding patterns in growing pigs. J Anim Sci 2001;79:803-813. http://jas.fass.org/cgi/reprint/79/4/803.pdf. Accesed Jul 30, 2003. XXI) Villalobos GC, González VE, Ortega SJA. Técnicas para estimar la degradación de proteína y materia orgánica en el rumen y su importancia en rumiantes en pastoreo. Téc Pecu Méx 2000;38(2): 119-134. http://www.tecnicapecuaria.org/trabajos/20021217 5725.pdf. Consultado 30 Jul, 2003. XXII) Sanh MV, Wiktorsson H, Ly LV. Effect of feeding level on milk production, body weight change, feed conversion and postpartum oestrus of crossbred lactating cows in tropical conditions. Livest Prod Sci 2002;27(2-3):331-338. http://www.sciencedirect.com/science/journal/030 16226. Accesed Sep 12, 2003. 12. Tables, Graphics and Illustrations. It is preferable that they should be few, brief and having the necessary data so they could be understood without reading the text. Explanatory material should be placed in footnotes, using conventional symbols.

13. Final version. This is the document in which the authors have already integrated the corrections and modifications indicated by the Review Committee. The works will have to be elaborated with Microsoft Word. Photographs and images must be in jpg (or compatible) format with at least 300 dpi resolution. Photographs, images, graphs, charts or tables must be included in the same text file. The boxes should not contain any vertical lines, and the horizontal ones only those that delimit the column headings, and the line at the end of the box.

XIV) Cairns RB. Infrared spectroscopic studies of solid oxigen [doctoral thesis]. Berkeley, California, USA: University of California; 1965.

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14. Once accepted, the final version will be translated into Spanish or English, although authors should feel free to send the final version in both languages. No charges will be made for style or translation services.

MJ m µl µm mg ml mm min ng

mega joule (s) meter (s) micro liter (s) micro meter (s) milligram (s) milliliter (s) millimeter (s) minute (s) nanogram (s) P probability (statistic) p page CP crude protein PCR polymerase chain reaction pp pages ppm parts per million % percent (with number) rpm revolutions per minute sec second (s) t metric ton (s) TDN total digestible nutrients AU animal unit IU international units

15. Thesis will be published as a Research Article or as a Technical Note, according to these guidelines. 16. Manuscripts not accepted for publication will be returned to the author together with a note explaining the cause for rejection, or suggesting changes which should be made for re-assessment.

17. List of abbreviations: cal cm °C DL50 g ha h i.m. i.v. J kg km L log Mcal

calorie (s) centimeter (s) degree Celsius lethal dose 50% gram (s) hectare (s) hour (s) intramuscular (..ly) intravenous (..ly) joule (s) kilogram (s) kilometer (s) liter (s) decimal logarithm mega calorie (s)

vs

versus

xg

gravidity

The full term for which an abbreviation stands should precede its first use in the text. 18. Scientific names and other Latin terms should be written in italics.

XIII


https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.5627 Artículo

Genes de resistencia a aislados de Escherichia coli en pollos de engorda

Diana López-Velandia a* Edna Carvajal-Barrera b Egberto Rueda-Garrido c Martín Talavera- Rojas d María Vásquez b María Torres-Caycedo a

a

Universidad de Boyacá-Tunja-Colombia.

b

Universidad de Santander, Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud, Grupo de investigación CliniUDES, Bucaramanga, Colombia. c

Universidad de Santander, Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias, Grupo de investigación en Ciencias Agropecuarias GICA, Bucaramanga, Colombia. d

Universidad Autónoma del Estado de México, UAEM, Toluca, Estado de México. México.

*Autor de correspondencia: dplopez@uniboyaca.edu.co

Resumen: Debido a la demanda de los consumidores, la producción avícola se ha incrementado anualmente, lo que conlleva el uso de aditivos tales como los antibióticos para favorecer las condiciones de cría; esto aumenta la deficiencia en la composición de la microbiota intestinal de los animales de producción y puede generar cambios microbiológicos y genéticos. Dicha microbiota puede llegar a los humanos a través de la cadena alimentaria, generando una posible transferencia horizontal de genes que codifican la resistencia a los 584


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antibióticos. El objetivo fue identificar los perfiles de resistencia y los genes que la codifican. A partir de 200 pollos, se aislaron 35 cepas de Escherichia coli con fenotipo de resistencia a betalactamasas de espectro extendido, procedentes de pollos sanos de granjas de producción de Santander (Colombia). Se identificó en un 83 % el gen AmpC, en 86 % el gen blaCTXM, en 54 % el gen blaSHV, y en 57 % el gen blaTEM. En cuanto a los genes que codifican la resistencia a las quinolonas, se identificó el 94 % del gen qnrB, el 9 % del gen qnrC y el 0 % del gen qnrA. La coexistencia de los genes que codifican para la resistencia a los antibióticos es un grave problema que requiere vigilancia; ante esto, se deben generar estrategias de control para evitar la propagación a través de la cadena alimentaria, así como estrategias para el control del uso de antibióticos en la producción. Palabras clave: Aves de corral, Resistencia, Gen, Antibióticos.

Recibido: 28/02/2020 Aceptado: 25/11/2021

Introducción En los países latinoamericanos, el pollo es uno de los alimentos más consumidos por su facilidad para conseguirlo, su bajo precio, su alto contenido en proteínas y su bajo contenido de lípidos: es la segunda carne favorita(1). La producción de aves de corral aumenta cada año; por eso se han empleado aditivos como los antibióticos para favorecer las condiciones de crianza, Estos aditivos aumentan las deficiencias en la composición de la microbiota intestinal. Cuando los pollos nacen, su intestino delgado es inmaduro y requiere de cambios morfológicos, bioquímicos y moleculares que ocurren durante las dos primeras semanas de vida; a medida que el animal crece, se establece una comunidad microbiana que es más compleja a través del tiempo. El consumo de antibióticos hace que los trastornos digestivos sean más frecuentes y produce una baja resistencia natural a la colonización por microorganismos patógenos(2,3). Los residuos de antibióticos pueden llegar al consumidor a través de la cadena alimentaria provocando reacciones alérgicas, resistencia bacteriana y alteración de la microflora. En diversos países existen dificultades para la comercialización debido al incumplimiento de las normas establecidas en relación con las concentraciones de sustancias que se presentan en los alimentos. Asimismo, se han desarrollado varios estudios en los que se refieren patógenos bacterianos, incluyendo aislamientos resistentes que pueden ser transmitidos de los pollos a los seres humanos(4).

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En general, desde hace ya varias décadas no se utilizan ya los antibióticos como promotores del crecimiento en las dietas de los animales en todo el mundo. Su uso ha causado una gran preocupación, ya que la salud humana puede verse afectada al generarse resistencia bacteriana, pues se emplean antibióticos utilizados para tratar infecciones en los humanos. Los antibióticos betalactámicos y las fluoroquinolonas son agentes de amplio espectro comúnmente utilizados para el tratamiento de infecciones; la resistencia a este tipo de antimicrobianos ha surgido fácilmente. Los últimos informes han demostrado que la resistencia a este tipo de antibióticos puede provocar varios impactos, que dependen de las cepas bacterianas(5). Algunos países presentan un uso restringido de antibióticos como promotores del crecimiento, por ejemplo: Suecia, desde 1986; Finlandia, desde 1995(6), y la Unión Europea, desde el primero de enero de 2006(7), entre otros. En Colombia, el uso de antibióticos está regulado por diferentes resoluciones y decretos; sin embargo, no hay restricciones para la comercialización de antibióticos para uso veterinario, por lo que, en algunos casos, el suministro es empírico y sin prescripción especializada(8). Dichos impactos pueden ser causados por mutaciones en los genes cromosómicos y por la presencia de plásmidos conjugativos y no conjugativos en los genes(9). El objetivo de este artículo era establecer los perfiles de resistencia y los genes que la codifican.

Material y métodos Con un hisopo estéril se tomaron muestras de diferentes órganos (tráquea, intestinos, sacos aeroabdominales profundos y superficiales, pericardio, bolsa de Fabricio, intestino, contenido intestinal y páncreas) de 200 pollos de producción; estas muestras se sembraron en caldo BHI y se incubaron a 37 °C durante 24 h; posteriormente fueron sembradas en agar Mac Conkey y luego incubadas a 37 °C durante 24 h. Se aislaron 35 cepas de Escherichia coli con fenotipo de resistencia a betalactamasas de espectro extendido (BLEE) de pollos de engorda sanos provenientes de granjas de Santander (Colombia); se realizó la confirmación microbiológica de género y especie mediante el sistema BBL Crystal®, y se llevaron a cabo las pruebas de sensibilidad mediante el método Kirby Bauer, siguiendo las directrices del CLSI (2017), utilizando la cepa Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 como control positivo y la cepa Escherichia coli ATCC 25922 como testigo negativo. Los discos de susceptibilidad empleados fueron ceftriaxona (CRO 30 µg) (Oxoid®), cefotaxima (CTX 30 µg) (Oxoid®), cefepima (FEP 30 µg) (Oxoid®), ácido nalidíxico (FEP 30 µg) (Oxoid®) ciprofloxacina (CIP 1 µg) (Oxoid®), norfloxacina (NOR 2 µg) (Oxoid®), piperacilina (PRL 30 µg) (Oxoid®), aztreonam (ATM 30 µg) (Oxoid®) y amoxicilina/ácido clavulánico (AMC 30 µg) (Oxoid®). Las cepas se cultivaron en agar Brain Heart Infusion (BHI) a 37 °C toda la noche en agitación para realizar la extracción de ADN según las instrucciones del fabricante (kit de reactivos para extracción de ADN Wizard®), se consideraron cepas ideales en concentración ≥100μg/μL y relación ADN/proteínas A260/280 para determinar la pureza 586


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óptima con un índice de OD entre 1,8 a 2,0 (espectrofotómetro de micro volumen MaestroNano®). Se identificaron por PCR de punto final los genes blaTEM (700 pb), blaSHV (700 pb), blaCTX (500 pb) y Amp-C (550 pb) con el protocolo modificado por López et al(10); y los genes qnrA (580 pb), qnrB (264 pb), qnrC (428 pb) con el protocolo de Aguilar et al.(11) Los productos amplificados se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% con TAE al 1% y Safeview classic como colorante. Los geles se visualizaron utilizando el iluminador Led Ultra Slim.

Resultados Los perfiles de susceptibilidad fueron del 63 % (n= 22/35) para la ceftriaxona (Oxoid®), del 69 % (n= 23/35) para la cefepima (Oxoid®), del 77 % (n= 27/35) para la cefotaxima (Oxoid®), del 86 % (n= 30/35) para la norfloxacina (Oxoid®), del 89 % (n= 31/35) para la ciprofloxacina (Oxoid®), del 91 % (n= 32/35) para la piperacilina (Oxoid®), del 91 % (n =32/35) para el aztrenam (Oxoid®), del 97 % (n= 34/35) para la amoxicilina/ácido clavulánico (Oxoid®) y del 97 % (n= 34/35) para el ácido nalidíxico (Oxoid®). En cuanto a los grupos de antibióticos, se presentó 70 % de resistencia de E. coli a las cefalosporinas, un 90 % de resistencia a las quinolonas y un 93 % de resistencia a las betalactamasas (Figura 1). En cuanto a los genes, se identificaron fragmentos del tamaño esperado para los genes que codifican la resistencia a las betalactamasas, y se identificó el 83 % del gen AmpC, el 86 % del gen blaCTXM, el 54 % del gen blaSHV y el 57 % del gen blaTEM (Figure 2). En cuanto a los genes que codifican la resistencia a las quinolonas, se identificó el 94 % del gen qnrB, el 9 % del gen qnrC y el 0 % del gen qnrA (Figura 2 y Cuadro 1). Figura 1: Grupos de resistencia a los antibióticos

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Figura 2: Gel de electroforesis del gen blaCTMX

C1= 1Kb, C2= Control positivo, C3= Mx1, C4= Mx2, C5=Mx3, C6= Mx4, C7= Mx5, C8=Mx6, C9= Mx7, C10= Mx8, C11= Mx9, C12= Mx10, C13= Mx11, C14= control negativo.

Cuadro 1: Resultados de los genes amplificados Mues tra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Am pc P P P N P P P P P N P P P P P P P P P

blaCT X-M P P P N P P P P P N N P P P P N P P P

blaS HV P N P N P P P N N P N N P N P N N P P

blaT EM P P P N N P N P P N P P N P N P N N N

qnr A N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

qnr B N N P P P P P P P P P P P P P P P P P

qnr S N N P P N N N N N N N N N N N N N N N

588

CR O R I R S R R S R R R I S I R R S S I S

CT X I R R I R I I R R R R S R R R S S R R

FE P I S R S R R S R R R I S R R I S S I R

AM C R R R R R R R R R R R R R R R R R R R

CI P R I R R R I R R R R R I R R R R R R R

NO R S I R R R I R R R R I R R R R R R R R

PR L I R R R R R R R R R R R R R R R I R R

AT M I R R R R R R R R R I R R R R R R R R


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20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

P P P P P P P N P P P N P N P N

P P N P P P P N P P P N P P P N

P P P N P P N N P N P N N P P N

P N N N P P P N P P P N P P P N

N N N N N N N N N N N N N N N N

P P P P P P P P P P P P P P P P

P N N N N N N N N N N N N N N N

R R S R R R R R R R R I S R R R

R R S R R R R R R R R R R R R R

R R S R R R R R R R R R R R R R

R R R R R R R R R R R R R R R R

R R R R R R R R R R R R R R R R

R R R R R R R R R R R R R R R R

R R R R R R R R R R R R R R R R

R R R R R R R R R R R R R R R R

P= positivo; N= negativo; R= resistente; S= sensitivo; I= intermedio. CRO= ceftriaxona; CTX= cefotaxima; FEP= cefepima; AMC= amoxicilina/ ácido clavulánico. CIP= ciprofloxacina; NOR= norfloxacina; PRL= piperacilina; ATM= aztreonam.

Discusión A partir de los perfiles de susceptibilidad, se puede notar que las cepas presentaron multirresistencia, teniendo en cuenta que éstas tuvieron resistencia a más de cuatro antibióticos; el 49 % presentó resistencia a todos los antibióticos; estos resultados generan una gran preocupación. En Corea del Sur, se encontró resistencia incluso a once antibióticos, incluyendo la ciprofloxacina(12). Yurong et al. obtuvieron resultados similares al encontrar resistencia a más de cinco agentes antimicrobianos, entre los que destacan la ciprofloxacina y la levofloxacina(13). En cuanto a los grupos de antibióticos, destaca que el 93 % presentó resistencia a los betalactámicos, seguido de las quinolonas en un 90 % y las cefalosporinas en un 70 % (Figura 3), antimicrobianos que se emplean para el uso diario de infecciones bacterianas en humanos. En Corea se registraron casos similares de resistencia a la ampicilina (75 %), seguida de la tetraciclina (69 %) y la ciprofloxacina (65 %)(14). Mientras que Varga et al(15) identificaron resistencia a los betalactámicos, las sulfonamidas y las tetraciclinas en las aves de corral. En Colombia, se aislaron bacterias resistentes a múltiples fármacos como el ceftiofur, la enrofloxacina, el ácido nalidíxico y la tetraciclina, en la carne de aves de corral de tiendas independientes y de un centro de distribución de la cadena principal, lo que genera una alarma para las entidades sanitarias del país(16).

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Figura 3: Prevalencia de genes

Dentro del ámbito de la resistencia, es necesario confirmar los fenotipos de resistencia mediante PCR identificando los genes que la codifican para las betalactamasas; entre éstos se pueden encontrar los genes blaTEM, blaSHV, blaCTX y Amp-C(17); y para las fluoroquinolonas, los genes son qnrA, qnrB y qnrC(11). Con base en los perfiles analizados arriba, se puede notar la similitud con lo reportado por otros autores. Investigaciones realizadas en Brasil expusieron que los aislamientos que presentan los genes blaCTX-M-2 o blaCMY-2 tienden a acumular resistencia a un mayor rango de antimicrobianos no betalactámicos(4). En China, los genes que predominaron en los aislamientos fueron blaCTXM y blaTEM; asimismo, se encontraron variantes de blaCMY. Por otra parte, no se identificó blaSHV(13), como tampoco en los estudios realizados en Pakistán(18), mientras que en la presente investigación éste se presentó en un 57 %. Alonso et al refieren que la diseminación del blaSHV puede ocurrir por transferencia horizontal, principalmente causada por plásmidos, lo que podría facilitar la diseminación de este gen(19). En cuanto a AmpC, en el Reino Unido, se analizaron pollos importados, encontrando un 23 % de este gen, y también se identificaron mutaciones de éste(20). Sin embargo, en países como Ecuador se obtuvo una alta prevalencia del gen blaCTXM, resultado que difiere del obtenido en el presente estudio(21). El uso de antibióticos como promotores del crecimiento en los animales genera una gran preocupación debido a la propagación de bacterias resistentes, ya que el pollo tiene una fácil comercialización. En el presente estudio se observa que el 26 % de las cepas presentaron los cuatro genes; el 46 % presentaron tres genes; el 14 %, dos genes; el 3 %, un gen, y en el 4 % no se observó ningún gen. Las técnicas de biología molecular tienen una gran relevancia, ya 590


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que a través de ellas se confirman los fenotipos de resistencia por mutaciones puntuales en los genes objetivo en el caso de las bacterias susceptibles(22). Los genes qnr están mediados por plásmidos, transmisibles por conjugación, lo que se relaciona con su potencial de circulación. El cebador se reportó en 1998, y desde entonces se han reportado cinco tipos de genes qnr (qnrA, qnrB, qnrS, qnrC, and qnrD), con más de 30 alelos(23). Los animales pueden actuar como reservorios de una serie de infecciones zoonóticas, que pueden transmitirse al ser humano por contacto directo o a través de la cadena alimentaria(24). Kilani et al identificaron en muestras de animales un 17.6 % de genes de tipo qnr, así como genes de betalactamasas, por lo que son similares a los identificados en el presente estudio(25). Clemente et al(26) detectaron en aislamientos de E. coli el gen gyrA en animales productores de alimentos que en conjunto expresaban el gen blaCMY-2. En la investigación realizada por Montes et al se reportó sólo el 1% del gen gyrB y del gen gyrA 0%(11), mientras que en Quito se observó la presencia del gen qnrB en el 36 % de los aislamientos de pollos de engorda: resultados similares a los reportados en Brasil, en los que se pudieron identificar variantes del gen gyr en aislados de alimentos y humanos, observando una menor susceptibilidad a la ciprofloxacina(27). Según los resultados obtenidos en la presente investigación sobre la presencia de genes que codifican para la resistencia a las quinolinas, ésta es alta en comparación con otras investigaciones realizadas por otros autores; diversos estudios han encontrado que los genes qnr están altamente distribuidos en bacterias E. coli aisladas de humanos sanos y de animales domésticos y de granja(9).

Conclusiones e implicaciones La coexistencia de genes que codifican la resistencia a los antibióticos es un problema grave que requiere vigilancia. Ante esta situación se deben generar estrategias de control para evitar la propagación a través de la cadena alimentaria, ya que el pollo es uno de los alimentos que con mayor frecuencia forma parte de la canasta del mercado. Estos resultados reflejan la resistencia hallada principalmente para los antimicrobianos que actúan inhibiendo la síntesis de la pared y la síntesis de proteínas, como las cefalosporinas y la gentamicina respectivamente. Esto parece demostrar la teoría de la producción de betalactamasas de espectro extendido, mecanismo que puede ser mediado por plásmidos y que representa un problema de resistencia emergente. Las limitaciones de este estudio incluyen un sesgo de muestreo, ya que sólo se trabajó en una granja, además de que no se obtuvieron muestras de heces. Por lo tanto, el estudio podría sobrestimar la frecuencia de la resistencia en las muestras procedentes de aves que pueden haber sido tratadas con antimicrobianos.

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Agradecimientos Los investigadores manifiestan su agradecimiento a la Universidad de Boyacá, a la Universidad de Santander y a todas las personas que contribuyeron de alguna manera a este proyecto. Cumplimiento de las normas éticas Todos los procedimientos se realizaron teniendo en cuenta el comité de investigación institucional y nacional y la declaración de Helsinki de 1964 y sus modificaciones posteriores o normas éticas similares. Este estudio fue aprobado por el comité ético local. Financiamiento Esta investigación fue apoyada por la Universidad de Boyacá, Tunja, Colombia, y por la Universidad de Santander (UDES), Bucaramanga, Colombia. Conflicto de intereses Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses. Literatura citda: 1. Tyson GH, Nyirabahizi E, Crarey E, Kabera C, Lam C, Rice-Trujillo C, et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Enterococci isolated from retail meats in the United States, 2002 to 2014. Appl Environ Microbiol 2018;84(1):1–9. 2. Blajman J, Zbrun M, Astesana D, Berisvil A, Romero A, Fusari M, et al. Probióticos en pollos parrilleros: una estrategia para los modelos productivos intensivos. Rev Argent Microbiol 2015;47(4):360–367. 3. Carvajal EB, Hernández WA, Torres MC, López DV, Rueda EG, Vásquez MR. Antimicrobial resistance of Escherichia coli strains isolated from the bursa of Fabricius in broilers. Rev Inv Vet Perú 2019;30(1):430–437. 4. Botelho LAB, Kraychete GB, Costa e Silva JL, Regis DVV, Picão RC, Moreira BM, et al. Widespread distribution of CTX-M and plasmid-mediated AmpC β-lactamases in Escherichia coli from Brazilian chicken meat. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2015;110(2):249–254.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.5873 Artículo

Detección del virus de la lengua azul en ovinos por RT- PCR en tiempo real en diferentes sistemas de producción en San Martín, Perú

Alicia María López Flores a* Roni David Cruz Vasquez a Víctor Humberto Puicón Niño de Guzmán a Alicia Bartra Reátegui a Orlando Ríos Ramírez a Fredy Fabián Domínguez a

a

Universidad Nacional de San Martin. Laboratorio de Sanidad Animal de la Escuela Profesional de Medicina Veterinaria, San Martin, Perú.

* Autor de correspondencia: alicialopezflores@unsm.edu.pe

Resumen: El presente estudio tuvo como objetivo determinar la prevalencia del Virus de la Lengua Azul (VLA) en ovinos, por la técnica reacción en cadena de la polimerasa con Transcripción Reversa (RT- PCR) en tiempo real. Se evaluaron 366 ovinos procedentes de las diez provincias de la región del Perú. La metodología empleada fue la toma de muestras sanguínea de la vena yugular del ovino, seguidamente se realizó el proceso de extracción y purificación de ARN con el kit QIAmp®, luego la transcripción reversa para obtener el ADNc, y finalmente realizar la RT- PCR en tiempo real, para lo cual se utilizó el kit SuperScript III platinium One- step qRT–PCR, siendo los iniciadores y sondas dirigidos al segmento 10 del gen NS3 del VLA. Los resultados de la prueba de RT-PCR en tiempo real revelaron dos ovinos positivos con valor de ciclo umbral (Ct) de 35.21 y 35.57, siendo la prevalencia de 0.54 % de ovinos positivos a VLA en sistema de crianza extensiva, con las condiciones del ambiente que favorecen el desarrollo del vector Culicoide. Se concluye que mediante la técnica RT-PCR en tiempo real, se confirma la presencia del VLA en esta región del Perú, lo que hace necesario futuros estudios para determinar la detección de otros serotipos potenciales de VLA en la

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Amazonia peruana, con la finalidad de mejorar las estrategias de control de la enfermedad. Palabras clave: ARN, Gen, Diagnóstico molecular, Rumiantes, Amazonia.

Recibido: 19/11/2020 Aceptado: 08/11/2021

Introducción El virus de la lengua azul (VLA), genero Orbivirus(1), sin envoltura, el genoma posee 10 segmentos de doble cadena de ARN, siete proteínas estructurales y cinco no estructurales(2). La VP7 es una proteína de la cápside vírica(3). La VP2 de la superficie del virión(4). Además, los serotipos 9, 13, 18(5) y 27(6), siendo el serotipo 28 en identificarse últimamente(7). La lengua azul es una enfermedad, no contagiosa y transmitido a través de la picadura de insectos Culicoides(8). De los 1,357 especies de Culicoides en el mundo(9), solo unos 30 han sido reportados como vectores(10). Los vectores al alimentarse de un animal con VLA, estarán infectados toda su vida(11), pueden infectar a los animales con variaciones en los signos clínicos(12). En ovinos, se manifiesta descarga nasal seromucosa, edema facial, fiebre trombo hemorrágico, coronitis y ulceración en labios y paladar duro(13); la viremia suele detectarse entre 3 y 5 días después de la infección alcanzando puntos máximos febriles en el día 7(14). Sin embargo, estos signos clínicos (p. ej., fiebre en ovinos y bovinos, salivación en bovinos, edema facial en ovinos) se observaron en rebaños infectados y no infectados, estos signos no son un indicativo de la enfermedad(15). Así mismo, las lesiones macroscópicas son edema pulmonar, consolidación pulmonar cráneo - ventral, lengua tumefacta y cianótica; y en mucosa ruminal lesiones hemorrágicas(16). El bovino, caprino, bubalinos y otros rumiantes silvestres, actúan como reservorios del virus, siendo animales que podrían no manifestar signos clínicos(17,18,19), sin embargo, existen reportes de mortalidad en bovinos con el serotipo 8 del VLA(20); otros signos clínicos como la amaurosis que es la imposibilidad de pararse y la ausencia de reflejo de succión en terneros infectados(21). Por lo tanto, los diferentes serotipos del VLA en rumiantes pequeños y grandes, indica su expansión enzoótica(22). Así mismo, la transmisión del virus, huésped-vector son complejos, con una variedad de impulsores ecológicos(23). La epidemiologia del VLA incluida en la lista del Código Sanitario para los Animales Terrestres de la OIE(24). Ha generado brotes en Israel en el 2006, generando pérdidas de $ 2.5 millones(25), así mismo, un brote en Europa Occidental(26). De este modo, ha

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repercutido en un costo anual de $ 3,000 millones, se convierte en una de las enfermedades de importancia económica(27). En la actualidad, esta enfermedad es a nivel mundial, excepto la Antártida(28). Reportado en Brasil en ovinos(16); en Sudán, en trastornos reproductivos en bovinos(29); en Japón(30) e India, en una transmisión transplacentaria del VLA-1, en la etapa media de gestación en ovinos(31). En Australia, el VLA, se originaron a partir del Sudeste Asiático(32). Mientras en Reino Unido, los animales silvestres en zoológicos son susceptibles a arbovirus, actuando como hospederos nativos de los Culicoides(33). En Perú, el VLA ha sido reportado en ovinos, camélidos y en animales silvestres de áreas tropicales(34,35,36). Los estudios preliminares, se realizaron en 1984 y 1987, encontrándose 88, 41 y 56 % de ovinos seropositivos a VLA provenientes de tres regiones (norte, centro y sur)(37) y 21 % de alpacas seroreactores de la región sur(38). Estudios en Tayassu tajacu en Madre de Dios, se reporta un 7.5 % de muestras con anticuerpos específicos al VLA y el 29.2 % tuvieron anticuerpos al serogrupo VLA(34). Recientemente, Navarro et al(35) confirmaron la presencia del virus en ovinos de crianza extensiva, además identificaron los Culicoides vectores de la enfermedad. No obstante, la región San Martín en su clima tropical, es un ambiente óptimo para el vector y facilita sus vías de infección en hospedadores domésticos y silvestres; mencionado por Felippe-Bauer(39) quienes reportaron especies de Culicoides. En relación al diagnóstico, la prueba de seroneutralización, es específica, pero su desventaja es la baja sensibilidad y costo(40). No obstante, el ELISA competitivo es sugerido en llamas, rumiantes silvestres(41), ovinos y caprinos(42). En la actualidad, las pruebas recomendadas por la OIE para VLA son la RT- PCR, el ensayo de inmunodifusión en gel de agar y el ELISA competitivo(43,44). Siendo la RT- PCR en tiempo real para la detección rápida del VLA dirigido al Seg-1 / VP1(45,46), Seg-2/VP2 y Seg-10/NS3(47), es el método ampliamente utilizado(48), en la detección de todos los serotipos de VLA(49), basada en sonda de fluorescencia TaqMan(50,51,52,53), para detectar VLA en muestras de ovinos infectados(54). Por lo tanto, el objetivo del estudio fue detectar al VLA en ovinos mediante RT- PCR tiempo real, considerándose la influencia de las características ambientales y presencia de la enfermedad.

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Material y métodos Lugar de estudio La investigación se realizó en la región San Martín, Perú. Se recolectaron muestras sanguíneas en ovinos en condición de salud estable, en las 10 provincias de la región San Martín (Cuadro 1), en el periodo de agosto a diciembre de 2018. Cuadro 1: Cantidad de ovinos muestreados por provincia idóneas para el desarrollo del vector N° Muestras 9 11 35 41 74 41 15 24 30 86 366

Provincias Moyobamba Rioja El Dorado Lamas Bellavista Picota Mariscal Cáceres Huallaga Tocache San Martin Total

Recolección de muestra Se recolectaron 366 muestras de sangre de la vena yugular de los ovinos seleccionados al azar, provenientes de 42 granjas. Para la recolección se emplearon agujas y tubos vacutainer al vacío con anticoagulante EDTA. Las muestras se transportaron en un contenedor refrigerado con gel refrigerante para su procesamiento en el laboratorio de Biología y Genética Molecular de la Escuela Profesional de Agronomía - Facultad Ciencias Agrarias, Universidad Nacional San Martin. Según el Censo del 2012(55), la población es de 7,656 ovinos en todo el departamento de San Martin. Basado en esta población se calculó la muestra:

Donde: n es el tamaño de la muestra; Z= es el nivel de confianza 95%= 1.96; p= es la probabilidad de éxito 50%/100= 0.5; q= es la probabilidad de fracaso 50%/100 = 0.5; E= es el nivel de error 5%/100 = 0.05; N= es el tamaño de la población= 7656

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n = (1.96)2 (0.5) (0.5) (7656) (0.05)2(7656-1) + (1.96)2(0.5) (0.5) n=366 Fórmula de la subpoblación muestral.

Nh= subpoblación o grupo; N= población total ; n= muestra total; nh=muestra de los grupos.

Extracción de ARN Para el procesamiento de la muestra sanguínea se llevó a centrifugar a 800 xg durante 10 min, seguidamente se extrajo el plasma y se adicionó PBS estéril, se invirtió el tubo varias veces para mezclar, volver a centrifugar a 800 xg durante 10 min para separar los glóbulos rojos del PBS. Para la extracción de ARN se utilizó el kit QIAmp®, marca Qiagen. El paso de extracción del ARN se realizó según los procedimientos especificados del fabricante. El producto final obtenido es ARN en Buffer, para finalmente seguir con la RT- PCR en tiempo real que tiene por diana el segmento 10 del VLA (Gen NS3).

Transcripción reversa - Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real La RT- PCR en tiempo real es una prueba de elección para el diagnóstico. El método aquí descrito es recomendado por la OIE y Hofmann et al(56), para detectar el segmento 10 del Gen NS3 del VLA. Para la obtención del ADNc mediante transcripción reversa y PCR en tiempo real se utilizó el kit SuperScript III platinium One- step qRT –PCR, marca Invitrogen, siendo las secuencias de los iniciadores para la detección del segmento 10 del gen NS3 del VLA. Las soluciones primarias del iniciador se diluyeron a una concentración de 20 pmol/μl, las secuencias nucleotídicas de los iniciadores: VLA_IVI_F 5’-TGG-AYA-AAG-CRA-TGT-CAA-A-3’, VLA_IVI_R 5’-ACR-TCATCA-CGA-AAC-GCT-TC-3’(57). La solución de la sonda para el gen NS3 del VLA, se diluyó hasta una concentración de 5 pmol/μl, la secuencia de la sonda: VLA_IVI_P 5’FAM-ARG-CTG-CAT-TCG-CAT-CGT-ACG- C-3’ BHQ1. Se adicionaron 0.5 μl de cada iniciador primario a concentración de 20 pmol/μl a cada pocillo, la placa se debe mantener sobre hielo. Seguidamente se adiciona 2 μl de muestras de ARN, tanto de la muestra diana como de los controles positivos y negativos, a los pocillos correspondientes de la placa siguiendo la distribución. La temperatura de desnaturalización fue 95 °C durante 5 min, y se mantuvieron sobre hielo

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otros 3 min. Se preparó un volumen de la mezcla primaria(57) de la RT- PCR, siguiendo las instrucciones del fabricante. La sonda se incluyó en la mezcla primaria para obtener una concentración final de 0.2 pmol/μl por muestra. Se distribuyeron 22 μl de mezcla primaria en cada pocillo de la placa situado en el termociclador de tiempo real programado para una transcripción reversa y amplificación, detección mediante fluorescencia del ADNc.

Condiciones de temperatura La reacción fue llevada en light cycler 480 System Roche Applied Biosystems. Siguiendo el siguiente perfil térmico: Transcripción reversa 48 °C por 30 min, inactivación de la transcriptasa reversa o desnaturalización inicial 95 °C por 2 min, seguido, por 50 ciclos, amplificación 95 °C por 15 seg, 56 °C por 30 seg, 72 °C por 30 seg(57).

Resultados y discusión Análisis RT- PCR en tiempo real Los resultados de RT-PCR en tiempo real indicó que el 0.54 % (2/366) de las muestras fueron positivos al VLA. Para el primer individuo con código (E8), positivo a VLA presentó un valor de ciclo umbral (Ct) de alrededor de 35.21, con un valor de temperatura de disociación™ de 84 °C para VLA. Para la muestra con código (G12) – C+ VLA 1/10, presentó un Ct de 28.22 y 31.63 para la muestra con código (H12) – C+VLA 1/100. No se observó amplificación en el control negativo. Se evidencio la alta carga viral y la amplificación de un producto específico (Figura 1). Figura 1: Resultados de la prueba de RT-PCR en tiempo real para el primer individuo positivo (E8), en la curva de amplificación, se observa con valor de Ct de 35.21. Software Opticon Monitor v.3.0

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Para el segundo individuo (E6), positivo a VLA presentó un valor de Ct de alrededor de 35.57, con un valor de temperatura de disociación™ de 84 °C. Para la muestra (G12)C+VLA 1/10, presentó un Ct de 28.81 y 32.72 para la muestra (H12)- C+VLA 1/100. No se observó amplificación en el control negativo. Se evidenció la alta carga viral y la amplificación de un producto específico (Figura 2). Figura 2. Resultados de la prueba de RT-PCR en tiempo real para el segundo individuo positivo (E6), en la curva de amplificación, se observan un valor Ct de 35.57. Software Opticon Monitor v.3.0.

Una revisión panorámica en América del Sur, mediante estudios serológicos para la detección de anticuerpos efectuados en bovinos, caprinos, ovinos y búfalos indica variadas prevalencias mínimas y máximas en los siguientes países: en Argentina (0– 95 %)(58), Brasil (1.22-89.69 %)(59,60), Chile (0-19.6 %)(61,62), Colombia (51.856 %)(63.64), Ecuador (10 %)(65), Guyana(0-56 %)(66), Suriname (82-91 %)(66) y Venezuela (74.8-94.7 %)(67); en el Perú, los estudios preliminares de 1984 y 1987 reportaron una seroprevalencia de 87.5, 41 y 55.5 % al VLA en ovejas del norte, centro y sur de la sierra del país(37). En la presente investigación, se detectó el genoma viral del VLA, siendo la prevalencia de 0.54 % en sueros de ovinos mediante la RT- PCR en tiempo real, que confirma la presencia epidemiológica de este virus en esta región. Las zonas donde se detectaron los animales positivos se encuentran muy cerca de afluentes de agua como el rio Sisa y la quebrada de Ishangayacu. Siendo las sensibilidades ambientales como componente clave de la capacidad del vector(68). Asimismo, es posible que la infección por el VLA en los ovinos muestreados haya sido subclínica, ya que los animales estuvieron en condiciones normales. Esto se explica según Maclachlan et al(69), porque el desarrollo de los signos clínicos de la enfermedad depende si la infección es endémica o no; como consecuencia, los animales presentan anticuerpos, pero rara vez presentan signos clínicos. Esto es posiblemente porque en el ovino el periodo de viremia raramente persiste por más de 14 días, a diferencia del bovino cuya viremia puede ser de hasta 90 a 120 días.

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Tal como lo menciona Navarro(36), el Perú es uno de los países predisponentes a presentar la enfermedad de VLA, ya que posee diversos ecosistemas propicios para el desarrollo de Culicoides. Se considera necesario la determinación de la seroprevalencia del VLA en zonas ganaderas, identificar los diversos serotipos, levantar un mapa de la ubicación de las diversas especies de Culicoides spp., en las diferentes áreas geográficas y altitudes, y determinar las zonas endémicas.

Entorno de los ovinos positivos a VLA Se realizó una evaluación de los alrededores de las granjas para observar el hábitat del vector Culicoide. Encontrándose que los animales positivos a VLA están cerca de afluentes de agua, lo que contribuye con desarrollo del vector, (Cuadro 2). Por otra parte, los ovinos positivos fueron de la raza Pelibuey, sin embargo, no es determinante la predisposición por la raza. Además, la crianza extensiva de los ovinos permite su crianza junto a los vacunos, gallinas, perros y caballos. En las encuestas realizadas los propietarios de las granjas extensivos, intensivas y semi-intensiva no desparasitan a sus animales, ni fumigan por la presencia de moscas, mosquitos o zancudos. Cuadro 2: Entorno de los ovinos positivos al VLA Provincia Distrito

Bellavista

San Pablo

San Bellavista Pablo

Ubicación de la granja

Sistema de explotación

Sector Angélica

extensivo

Caserío de San extensivo Ignacio

Entorno de la granja

Raza

Margen izquierda del Pelibuey rio Sisa Margen izquierda de Pelibuey la quebrada Ishangayacu

Condición corporal 3

2.5

Estudios epidemiológicos, indican que el VLA existe en una extensa zona en el mundo entre los 40° latitud norte y 35° latitud sur, con ecosistemas tropicales, subtropicales y templados(70), coincidiendo estas características con la región San Martín. Los primeros estudios de la presencia del vector transmisor del VLA en nuestra región se dieron con Felippe-Bauer et al(39), quienes identificaron cinco especies de Culicoides vectores del virus. De igual manera, Navarro et al(35), de los 7,930 mosquitos capturados, el 94.8 % fueron identificados como Culicoides insignis, además se confirma la presencia del VLA en ovinos en la región Pucallpa(36). Por otra parte, el vector Culicoide suele desarrollarse en zonas donde existen ciertos tipos de conductores como el uso de la tierra, el comercio, la crianza de animales y la presencia de animales silvestres como reservorio del VLA; este último se refuerza con

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el trabajo que realizaron Rivera et al(34), quienes encontraron un 7.5 % de huanganas (Tayassu pecari) positivos al VLA en la región Madre de Dios. El presente trabajo de investigación es el primero que se desarrolló en toda la región San Martin, donde los resultados mediante RT- PCR en tiempo real dan la presencia VLA. Felippe-Bauer et al(39) mencionan haber encontrado el vector Culicoide del virus. Por lo tanto, se requiere detectar otros serotipos existentes de VLA en animales domésticos y silvestres de la región que son susceptibles o reservorios de la enfermedad.

Sistemas de explotación En el sistema de explotación los productores optan en su mayoría por un sistema extensivo de crianza de ovinos en la Región San Martin (Cuadro 3). Cuadro 3: Sistemas de producción Sistemas de explotación Provincias Moyobamba Rioja El Dorado Lamas Bellavista Picota Mariscal Cáceres Huallaga Tocache San Martin

Intensivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 33

Extensivo 9 11 35 27 74 29 15 19 20 15 Total

Semi Intensivo 0 0 0 14 0 12 0 5 10 38 366

Conclusiones e implicaciones Se concluye que el VLA tiene una baja prevalencia en ovinos en la Región San Martin del Perú, sin embargo, es necesario estudios futuros para determinar la morbilidad y la detección de otros serotipos potenciales de VLA en el país, para dilucidar mejor el manejo de vectores y las estrategias de control de la enfermedad.

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Agradecimientos El presente trabajo de investigación recibió el apoyo financiero del Instituto de investigación y Desarrollo de la UNSM–T, concurso de proyectos de tesis de pregrado, periodo 2018, con Resolución N° 611 -2018 – UNSM/CU – R/ NLU. Literatura citada: 1.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.6067 Artículo

Detección del virus de la diarrea viral bovina en artiodáctilos silvestres en cautiverio en México

Jocelyn Medina-Gudiño a Ninnet Gómez-Romero a José Ramírez-Lezama b Luis Padilla-Noriega c Emilio Venegas-Cureño d Francisco Javier Basurto-Alcántara a*

a

Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Microbiología e Inmunología. Ciudad de México, México. b

Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Patología, Ciudad de México, México. c

Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Medicina. Departamento de Microbiología y Parasitología. Ciudad de México, México. d

Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. Centro Nacional de Servicios de Diagnóstico en Salud Animal, Departamento de Validación de Técnicas, Estado de México, México.

*Autor de correspondencia: basurto@unam.mx

Resumen: El virus de la diarrea viral bovina pertenece al género Pestivirus de la familia Flaviviridae. Los pestivirus infectan a un extenso rango de artiodáctilos, silvestres y domésticos, en los cuales ocasionan una gran variedad de desórdenes respiratorios, gastrointestinales y

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reproductivos que derivan en pérdidas relevantes para la industria pecuaria. El uso compartido de fuentes de agua y alimento entre los ambientes naturales y pecuarios incrementa el contacto directo e indirecto entre animales domésticos y silvestres, lo que aumenta el riesgo de transmisión interespecie de pestivirus. Por este motivo, la vigilancia de enfermedades causadas por pestivirus debería considerar la prevalencia de estos patógenos en animales silvestres. Actualmente se desconoce la diversidad genética de pestivirus en poblaciones silvestres en México. Este grupo de trabajo recolectó muestras de suero de 371 artiodáctilos silvestres en cautiverio en cuatro regiones de cuatro estados de México que incluyen a Veracruz, Querétaro, el Estado de México y la Ciudad de México. Dos muestras de suero de búfalas de agua y una muestra de suero de una gama fueron positivas al virus de la diarrea viral bovina mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa. El análisis filogenético de las secuencias amplificadas las agrupó dentro del subgenotipo 1b del virus de la diarrea viral bovina. Además, se logró el aislamiento de un virus citopático a partir de la muestra de suero de la gama. Este estudio constituye el primer reporte del virus de la diarrea viral bovina en artiodáctilos silvestres en México. Palabras clave: Pestivirus, VDVB 1b, Genotipificación Aislamiento, Fauna silvestre.

Recibido: 20/09/2021 Aceptado: 21/12/2021

Introducción El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) pertenece al género Pestivirus, ubicado dentro de la familia Flaviviridae. Este género incluye al virus de la diarrea viral bovina 1 (VDVB1) y al virus de la diarrea viral bovina 2 (VDBV2), entre otros virus de importancia veterinaria. De acuerdo con el Comité Internacional de Taxonomía de los Virus (ICTV), el VDB1 y el VDVB2 se encuentran actualmente clasificados en las especies Pestivirus A y Pestivirus B, respectivamente(1). El VDVB1 tiene 21 subgenotipos (1a-1u), mientras que el VDVB2 tiene 4 subgenotipos (2a-2d)(2). Adicionalmente, las cepas del VDVB se clasifican como biotipos citopáticos (CP) o no citopáticos (NCP), dependiendo de su efecto en el cultivo celular(3). Los biotipos CP causan vacuolización y muerte celular, mientras que los biotipos NCP no provocan alteraciones visibles en el cultivo celular(4,5). El VDVB infecta a un amplio rango de animales pertenecientes al orden Artiodactyla. Por varias décadas, el VDVB ha sido principalmente reconocido como un agente patógeno para los bovinos domésticos, en los que puede causar desde infecciones subclínicas hasta infecciones caracterizadas por inapetencia, fiebre transitoria, diarrea, alteraciones

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respiratorias y alteraciones reproductivas como abortos, momificaciones, defectos congénitos, mortinatos o el nacimiento de animales inmunotolerantes persistentemente infectados (PI)(6,7). En la actualidad, al VDBV también se le reconoce como agente causal de alteraciones reproductivas, respiratorias, inmunológicas y neurológicas en artiodáctilos silvestres(8-14). El VDVB puede transmitirse verticalmente por infección transplacentaria, durante la monta o mediante el uso de semen o embriones infectados(15). Mientras que la transmisión horizontal ocurre mediante el contacto directo o indirecto con secreciones orales y nasales de animales infectados(12). Factores como el uso común de suelo y las migraciones animales pueden promover la diseminación de pestivirus entre animales domésticos y silvestres(9), debido a que las fuentes naturales de agua y comida representan puntos comunes de interacción en los que los virus pueden diseminarse hacia una gran variedad de huéspedes(12). Las infecciones por el VDVB generan pérdidas económicas significativas para la industria pecuaria, atribuidas a la pérdida de la producción láctea, disminución en el rendimiento reproductivo, retraso en el crecimiento, defectos congénitos, predisposición a enfermedades concomitantes y aumento en la mortalidad de animales jóvenes(16). En países como Inglaterra y Nueva Zelanda, se estima que las pérdidas ascienden a 46 millones de dólares/año y 44.5 millones de dólares/año, respectivamente(17,18). Mientras que en Dinamarca ocurren pérdidas aproximadas de 20 millones de dólares por cada millón de partos(19). En México, la información de la diversidad genética de los pestivirus circulantes se encuentra limitada a un estudio realizado en ganado bovino, en el cual las variantes genéticas identificadas incluyen a los subgenotipos 1a, 1b, 1c y 2a del VDVB(20). Al considerar el impacto económico que las infecciones por el VDVB puede ocasionar en la industria pecuaria(17-19), que la transmisión del VDVB entre artiodáctilos domésticos y silvestres es posible(9,12,21) y que se ha detectado la presencia de anticuerpos contra el VDVB en venados cola blanca en México, el objetivo de este estudio fue detectar e identificar a los genotipos del VDVB presentes en animales silvestres en México para determinar su potencial prevalencia en las poblaciones evaluadas.

Material y métodos Muestras de suero Se recolectaron 371 muestras de suero de artiodáctilos silvestres en cautiverio con edades de 2 a 3 años. Las especies muestreadas incluyeron búfalos de agua (Bubalus bubalis), venados gamos (Dama dama), venados cola blanca (Odocoileus virginianus), antílopes eland

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(Taurotragus oryx) y jabalíes (Sus scrofa) provenientes de Veracruz, Querétaro, el Estado de México y la Ciudad de México. Se recolectaron entre 3 ml y 6 ml de sangre a partir de la vena yugular en tubos VacutainerTM. Una vez formado el coágulo, las muestras se centrifugaron por 20 min a 2,000 rpm en una centrífuga clínica. El suero se transfirió a tubos de microcentrífuga y se almacenó a -70 °C hasta su uso.

Extracción de ARN El ARN total se extrajo de las muestras de suero con TRIzolTM LS Reagent, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se mezclaron 400 µl de suero con 900 µl de TRIzolTM LS Reagent al invertir seis veces el tubo de microcentrífuga. La mezcla se incubó durante 5 min a 4 °C. Se añadieron 240 µl de cloroformo, se homogeneizó y posteriormente se incubó por 5 minutos a 4 °C. La mezcla se centrifugó por 15 min a 13,000 g y 4 °C. Se transfirieron 200 µl del sobrenadante a un tubo libre de nucleasas, se añadieron 600 µl de isopropanol y se homogeneizaron. La mezcla se incubó a -20 °C por una hora y posteriormente se centrifugó por 15 min a 13,000 xg y 4 °C. Se descartó el sobrenadante, se lavó el botón con 1 ml de etanol al 75% y se centrifugó por 5 min a 13,000 xg y 4 °C. Se descartó el sobrenadante y se secó el botón por 5 min a temperatura ambiente. Los botones se suspendieron en 20 µl de agua libre de nucleasas y se almacenaron hasta su uso a -70 °C. También se extrajo el ARN total de células MDBK libres del VDVB y de la cepa de referencia NADL para incluirlos respectivamente como control negativo y positivo en la RTPCR.

Transcripción reversa (RT) La retrotranscripción se realizó de acuerdo con el protocolo descrito por el fabricante de la M-MLV Reverse Transcriptase (Thermo-Fisher) en un volumen total de 20 µl/reacción. Brevemente, se utilizaron: 500 ng de ARN (1-10 µl), 1 µl de iniciadores aleatorios (Invitrogen) (0.2 µg/µl), 1 µl de dNTP Mix (10 mM c/u) y agua libre de nucleasas (c.b.p. 12 µl). Se homogeneizó mediante pipeteo y se incubó durante 5 min a 65 °C. Posteriormente se añadieron 4 µl de Buffer (5 X), 2 µl de DTT (0.1 M) y 1 µl de ribonuclease inhibitor (40 U/µl). Se homogeneizó mediante pipeteo y se incubó durante 2 min a 37 °C. A continuación, se agregó 1 µl de M-MLV Reverse Transcriptase (200 U/ µl) y se incubó por 50 min a 37 °C para sintetizar el ADN complementario. La reacción se detuvo al calentar la mezcla por 15 min a 70 °C.

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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación Para la PCR de la región 5’ UTR de los pestivirus se utilizaron los iniciadores 5UTRfwd/STAR-Trev, 324/326 y HCV90/HCV368, los cuales amplifican respectivamente a fragmentos de 292 pb, 288 pb y 278 pb(22-24). Cada reacción se preparó en un volumen total de 25 µl con: 2 µl de cDNA, 1 µl de iniciador sentido (10 µM), 1 µl de iniciador antisentido (10 µM), 1 µl de dNTP Mix (10 mM c/u), 0.2 µl de Taq polimersa (5 U/µl), 5 µl de buffer (10 X) y 14.8 µl de agua libre de nucleasas. La PCR se realizó en un termociclador Select Cycler II (Select BioProducts) con los parámetros descritos a continuación. Desnaturalización inicial durante 4 min a 94 °C, 30 ciclos de amplificación con: desnaturalización por 30 seg a 94 °C; alineamiento por 30 seg a 56.2 °C (iniciadores 5UTRfwd/STAR-Trev), 55 °C (iniciadores 324/326) y 50 °C (iniciadores HCV90/HCV368); extensión por 30 seg a 72 °C. Extensión final durante 10 min a 72 °C. Los productos de la RT-PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, de acuerdo con la metodología descrita(15,25). Los geles de agarosa se tiñeron con GelRed® de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los productos de la RT-PCR se visualizaron mediante un transiluminador de luz ultravioleta y se purificaron con el QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los amplicones se secuenciaron por duplicado en ambas direcciones con el BigDyeTM Terminator Sequencing Kit en el ABI PRISM® 3130xl Genetic Analyzer del Instituto de Biotecnología de la UNAM.

Análisis filogenético La reconstrucción filogenética de las secuencias de la región 5’ UTR de los virus detectados se realizó con el programa MEGA 10, mediante el método de máxima verosimilitud y el modelo de sustitución Kimura 2 con 1,000 bootstraps(26-28).

Aislamiento viral El aislamiento viral se realizó mediante el uso de técnicas estándar para cultivo celular(29). Brevemente, se utilizaron cajas para cultivo celular de 25 cm2 con un 70 % de confluencia de células MDBK (libres del VDVB) en MEM suplementado con suero equino al 5%. A partir de las muestras de suero identificadas como positivas mediante RT-PCR, se depositaron 500 μl de suero en las cajas para cultivo celular. La identificación de los cultivos de células MDBK infectados se realizó mediante la observación de los efectos citopáticos (vacuolización y lisis) a las 48 h de incubación, RT-PCR y secuenciación.

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El título del aislamiento se determinó mediante el método de Reed-Muench(30). Brevemente, se realizaron diluciones del virus aislado mediante el uso de microplacas de 96 pozos. Las diluciones logarítmicas decimales se realizaron por triplicado desde 10-1 hasta 10-8. En cada uno de los pozos empleados en la titulación se colocaron 100 μl del sobrenadante del cultivo con el virus aislado y 900 μl de MEM suplementado con suero equino al 5%. Las microplacas se incubaron por 48 h a 37 ºC.

Resultados Se detectó el ARN del VDVB mediante RT-PCR con los iniciadores 324/326 en la muestra de suero de una gama de dos años identificada como 7916 (Ciudad de México). Mientras que los iniciadores 5UTRfwd/STAR-Trev y 324/326 permitieron la detección del ARN del VDVB en las muestras de suero de dos búfalas de agua de seis meses identificadas como BUMA 6 y BUMA 15 (Mil Aguas, Veracruz). Se realizó el análisis filogenético de los amplicones de la región 5’ UTR para determinar las especies y subgenotipos del VDVB detectado en las muestras. Las secuencias de las 3 muestras positivas se agruparon en el subgenotipo 1b del VDVB (Figura 1). Figura 1: Análisis filogenético de pestivirus basado en un fragmento de la región 5´ UTR

La reconstrucción del árbol filogenético enraizado de la región 5´ UTR se elaboró con el método de máxima verosimilitud en Mega 10, con el modelo de sustitución Kimura 2 y 1,000 bootstrap. Las secuencias de virus de referencia se encuentran identificadas por su número de acceso del GenBank, mientras que las secuencias virales obtenidas en este estudio se identifican en negritas y con un asterisco.

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El análisis filogenético de la región 5’ UTR indicó que las secuencias provenientes de las muestras identificadas como BUMA 6 y BUMA 15 (número de acceso GenBank: MN811650 y MN811651) presentan un 99.8 % de identidad con la cepa de referencia NY del VDVB, perteneciente al subgenotipo 1b. Mientras que la secuencia proveniente de la muestra identificada como 7916 (número de acceso GenBank: MN811649) tiene un 99.8 % de identidad con la cepa de referencia Osloss del VDVB, también perteneciente al subgenotipo 1b. Se obtuvo el aislamiento de un virus con biotipo CP a partir de la muestra de suero proveniente de la gama 7916 mediante el uso de células MDBK libres del VDVB. El título del VDVB 1b aislado fue de 106 DICC50/ml. No se logró el aislamiento viral a partir de las muestras de suero provenientes de las búfalas de agua BUMA 6 y BUMA 15.

Discusión El subgenotipo 1b del VDVB se considera el más distribuido a nivel mundial en el ganado bovino, seguido por los subgenotipos 1a y 1c(2). El subgenotipo 1b ha sido detectado en artiodáctilos domésticos en diversos países (incluido México) de cinco continentes(2,20). Mientras que, en animales silvestres, el subgenotipo 1b ha sido detectado en países como Canadá (bisonte)(31), China (yak)(32), Alemania (bongo)(33) y Estados Unidos (alpaca y venado cola blanca)(34-35). La información actualmente disponible sobre la prevalencia de diarrea viral bovina en animales silvestres en México corresponde a un único estudio realizado por Cantu et al. en 2008. Los autores obtuvieron muestras de suero de venados cola blanca procedentes de tres estados del noreste de México (Coahuila, Nuevo León y Tamaulipas) y determinaron una seroprevalencia del 63.5 % en las muestras analizadas(36). Sin embargo, el estudio se limitó a la detección de anticuerpos y no se realizó la identificación directa del VDVB ni su caracterización genética, por lo que el presente estudio representa el primer reporte de aislamiento y detección directa del VDVB en animales silvestres en México, así como el primer reporte de la prevalencia del VDVB en animales silvestres del sureste del país. Aunque los iniciadores utilizados pueden permitir la detección de diversas especies de pestivirus (Pestivirus A-E, G-H)(22-24), en este trabajo solo se detectó el ARN del subgenotipo 1b del VDVB1 (Pestivirus A), el cual se encontró en aproximadamente el 1% de las muestras de artiodáctilos silvestres analizadas. La circulación del subgenotipo 1b del VDVB1 en animales domésticos y silvestres en México, sugiere la posibilidad de diseminación del virus entre ambos tipos de poblaciones animales. Por lo que la información generada en este trabajo podría ser de utilidad en el

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diseño de programas eficaces para el control de la enfermedad que incluyan el monitoreo de artiodáctilos domésticos y silvestres, así como el uso de vacunas que confieran protección específica contra los subgenotipos actualmente circulantes del VDVB en México. Las infecciones con los biotipos CP o NCP del VDVB tienen diferentes implicaciones en la severidad de la enfermedad(37,38). El biotipo NCP es comúnmente detectado en muestras asociadas con alteraciones respiratorias, mientras que el biotipo CP suele detectarse en muestras de animales con alteraciones reproductivas, entéricas o sistémicas(38). Las infecciones con el biotipo CP pueden causar trastornos en el desarrollo embrionario, como momificaciones, hidrocefalia, displasia retinal, artrogrifosis y abortos(39). Por otra parte, las infecciones intrauterinas con el biotipo NCP que ocurren entre los días 42 y 125 de la gestación, pueden ocasionar infecciones persistentes en el feto y por consiguiente, el nacimiento de animales persistentemente infectados que son inmunotolerantes al VDVB, permanecen seronegativos y diseminan al virus a lo largo de toda su vida(6,40). Además, la infección simultánea con biotipos CP y NCP en artiodáctilos PI ocasiona una presentación letal, conocida como enfermedad de las mucosas. Por lo que la presencia de biotipos CP y NCP en una misma explotación o localidad es un evento relevante que debe considerarse porque incrementa la posibilidad de que ocurran coinfecciones con ambos biotipos(41). Los toros PI pueden diseminar entre 104 y 107 DICC50/ml del VDVB en semen a lo largo de su vida(42), título similar al del VDVB aislado en este estudio a partir de una gama clínicamente sana (106 DICC50/ml). Este título sugiere que el animal podría haber cursado con un estado temprano de viremia durante una infección aguda, aunque aún subclínica, lo que permitiría la detección del virus en la muestra de suero. El título es similar a lo indicado en estudios previos, donde se reportan 105.8 DICC50/ml en suero y desde 105.8 DICC50/ml hasta 106.3 DICC50/ml en secreciones nasales de venados cola blanca(12). En contraste con los hallazgos previamente descritos en otros estudios, el aislamiento del VDVB CP aquí detallado se obtuvo de una gama libre de signos clínicos. Se desconoce si el título viral del aislamiento con el biotipo CP y la ausencia de signos clínicos observados en esta gama en particular, podrían estar relacionados con una infección subclínica recurrente. Cabe destacar que el VDVB aislado a partir del suero de la gama fue capaz de replicarse en células de origen bovino (MDBK) in vitro, lo que sugiere que este aislamiento podría ser capaz de infectar a ambas especies, aunque se requiere realizar estudios adicionales para evaluar su capacidad de transmisión y virulencia en ambas especies. En conclusión, este estudio es el primer informe de detección y aislamiento del VDVB (Pestivirus A, subgenotipo 1b, biotipo CP) en búfalos y venados gamo en México. No se detectaron otras especies de pestivirus en el análisis de las muestras. Se requieren más estudios para obtener una mejor caracterización de los pestivirus circulantes en poblaciones de animales silvestres en México porque pueden representan una fuente de infección para las 619


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especies domésticas y viceversa. No obstante, la información generada en este estudio contribuye a un mejor entendimiento de la diversidad genética y epidemiológica de pestivirus en las poblaciones evaluadas. Agradecimientos El financiamiento para este estudio fue proporcionado por el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica IN217919 “Identificación y caracterización genética de las cepas del virus de la diarrea viral bovina circulantes en poblaciones ganaderas de México”. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México (FMVZ-UNAM). Conflicto de intereses Los autores declaran que no existe conflicto de intereses. Aprobación ética La recolección de las muestras fue aprobada por el Comité Interno para el Cuidado y Uso de los Animales. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México (FMVZ-UNAM). Literatura citada: 1.

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[Escriba aquí] https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.5997 Artículo

Evaluación de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real acoplado a separación inmunomagnética (PCRTR-IMS) como método alternativo para la detección rutinaria de Salmonella spp. en carne de res en México

Gloria Marisol Castañeda-Ruelas a José Roberto Guzmán-Uriarte b José Benigno Valdez-Torres b Josefina León-Félix b*

a

Universidad Autónoma de Sinaloa. Facultad de Ciencias Químico-Biológicas. Culiacán, Sinaloa, México. b

Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, AC., Biología Molecular y Genómica Funcional. Carretera a El Dorado Km 5.5, Col. Campo El Diez, 80129, Culiacán, Sinaloa, México.

*Autor de correspondencia: ljosefina@ciad.mx

Resumen: Salmonella es una bacteria patógena considerada una amenaza para la industria alimentaria, siendo relevante su detección oportuna. El objetivo del estudio fue evaluar la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real acoplado a separación inmunomagnética (rtPCR-IMS) como método alternativo a la Norma Oficial Mexicana (NOM-114-SSA1-1994) para la detección de Salmonella en carne de res. Los parámetros evaluados fueron límite de detección, sensibilidad, especificidad, selectividad (inclusión y exclusividad), y grado de concordancia entre ambos métodos para la detección de Salmonella en muestras de carne de res presuntivas y contaminadas artificialmente. La incidencia de Salmonella en las muestras presuntivas de carne (n= 60) osciló de 20.0 a 21.6 % por ambos métodos. En las muestras 625


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inoculadas (n= 60), la tasa de detección de Salmonella por rtPCR-IMS (93.3 %) y NOM114-SSA1-1994 (98.3 %) mostró una coincidencia de 56 ocasiones con una desviación negativa. La comparación de rtPCR-IMS y NOM-114-SSA1-1994 en carne de res reportó una exactitud de 98.3 %, sensibilidad de 98.2 %, especificidad de 100 % y selectividad de 100 %. El límite de detección para ambos métodos fue 1-5 UFC·25 g-1 de carne. El análisis estadístico indica que el rtPCR-IMS es equivalente al método de referencia para la detección de Salmonella en carne de res. Estos resultados advierten la alta incidencia de Salmonella en carne de res y proponen al rtPCR-IMS como un método idóneo y rápido para el control de Salmonella en la industria cárnica. Palabras clave: Carne, Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), Salmonella, Separación Inmunomagnética (IMS).

Recibido: 28/05/2021 Aceptado: 03/02/2022

Introducción Salmonella es un grupo de bacterias Gram negativas que comprende >2,600 serotipos clasificados en dos especies, S. enterica (incluye seis subespecies) y S. bongori. Entre estos, Salmonella enterica subsp. enterica (>1,500 serotipos) es el principal grupo responsable de enfermedades en el hombre denominadas “salmonelosis”(1). Las principales manifestaciones clínicas son fiebre entérica (tifoidea y paratifoidea) y gastroenteritis causadas por los serotipos tifoideos y no tifoideos de Salmonella, respectivamente(2). La estimación global anual de la salmonelosis es de >25 millones de casos de fiebre entérica y 153 millones de casos de gastroenteritis con ~300 mil muertes, las cuales se asocian mayormente al consumo de alimentos contaminados(3). Actualmente, la salmonelosis es una de las cuatro principales enfermedades de transmisión alimentaria (ETA) a nivel mundial(4). Salmonella está ampliamente distribuida en la naturaleza y puede sobrevivir en una gran variedad de alimentos (origen animal y hortalizas), los cuales se han identificado como vehículos de transmisión de la bacteria(2,4,5). La naturaleza zoonótica de los serotipos no tifoideos de Salmonella señala a los animales como el principal factor de riesgo para exponer a la bacteria al medio ambiente y transferir al patógeno a los humanos durante la producción, manipulación o consumo de los alimentos(6). La vigilancia de Salmonella debe basarse en métodos de detección confiables que favorezcan la inocuidad alimentaria(7).

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La detección de Salmonella en los alimentos puede ser compleja, debido a que las bacterias a menudo se encuentran en concentraciones bajas en los alimentos. Otro aspecto que dificulta la detección del microorganismo en un alimento es el proceso de elaboración, los microorganismos de fondo y el tipo de matriz alimentaria(8). Esto puede advertir un riesgo sanitario y justificar la necesidad de métodos oportunos para la detección de patógenos relevantes como es Salmonella(7). El método de cultivo es considerado el estándar de oro para el aislamiento y la detección de microbios patógenos en los alimentos(9). El método de cultivo para la detección de Salmonella implica una etapa de pre-enriquecimiento no selectivo, seguido de enriquecimiento selectivo y sembrado en agares selectivo, y posterior caracterización bioquímica y serológica de colonias presuntivas, permitiendo obtener un resultado negativo o positivo en 4 y 6-7 días, respectivamente(9). El consumo de tiempo, mano de obra y reactivos que involucra este método son un inconveniente para la detección rápida de Salmonella en la industria alimentaria(7). Actualmente se han desarrollado métodos moleculares rápidos como el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y su variante en tiempo real (rtPCR), que permiten la detección de Salmonella en un tiempo corto (24-72 h) en diversos alimentos(10-12). Pruebas inmunológicas, bioquímicas y biosensores también se han propuesto como métodos rápidos(8). Los métodos moleculares son útiles como herramientas de detección reduciendo la mano de obra y el tiempo de respuesta en comparación con los métodos de cultivo(12). Sin embargo, la precisión de los métodos moleculares puede limitarse por la presencia de sustancias inherentes del alimento (sales biliares, bilirrubina, hemoglobina, urea, polisacárido, heces y antígenos y ADN, que pueden interferir con los resultados(13). La separación inmunomagnética (IMS) se ha utilizado para el aislamiento de Salmonella en diferentes matrices alimentarias(8,14-16). Las IMS mejora la sensibilidad y especificidad de detección de Salmonella en los alimentos debido a las perlas de poliestireno anti-Salmonella que capturan a la bacteria, y ésta puede ser identificada por métodos de cultivo, inmunológicos o moleculares(17). Recientemente se han desarrollado métodos que combinan las tecnologías IMS y rtPCR, que prescinden de la extracción de ADN y concentran al microorganismo por IMS después de un enriquecimiento primario de <24 h(10,11,18). En México, Salmonella representa un tema concerniente para la salud pública y la industria alimentaria. La Dirección General de Epidemiología de México reporta anualmente 28,815 casos de fiebres tifoidea y 78,681 casos de otras salmonelosis a nivel nacional(19). Pero, la identificación de estos casos como ETA no está esclarecida. A pesar de que, en México, Salmonella se ha identificado como agente contaminante de carne de pollo(20,21), carne de puerco(21), carne de res(21-23), vegetales(24) y huevo(25). 627


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La detección oportuna de Salmonella en la carne de res es de especial interés dado su elevada frecuencia (28.9 a 32.4 %) en el alimento(21-23) y la relevancia de la producción (1,960 t) y consumo per cápita (14.8 kg) anual de carne en México(26). Además, el ganado y las aves se han identificado como reservorios de Salmonella(27). En México, el método de cultivo es el estándar de oro para la detección de Salmonella en los alimentos, cuyo proceso puede resultar laborioso y requerir mucho tiempo (4 a 7 días) para obtener resultados finales(28). Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue realizar una validación interna del método comercial de rtPCRIMS para la detección de Salmonella en carne de res, y comparar su eficiencia con el método de cultivo de referencia empleado en México.

Material y métodos Descripción del estudio El estudio de validación interna del método de reacción en cadena de polimerasa en tiempo real acoplado a separación inmunomagnética (rtPCR-IMS) para la detección de Salmonella en carne de res se evaluó respecto al método de cultivo de referencia en México “NOM-114SSA1-1994”(28), como se especifica en el manual de validación de métodos microbiológicos alternativos propuesto por la ISO16140:2003(29). La validación del método de rtPCR-IMS se realizó en muestras de carne de res presuntivas y contaminadas artificialmente. Los parámetros evaluados fueron límite de detección, sensibilidad, especificidad, selectividad, y el grado de concordancia entre los métodos.

Cepas bacterianas La cepa de Salmonella ATCC 35664 se utilizó como control de referencia para el ensayo de validación. Una colonia pura se transfirió a 30 ml de caldo de soya tripticaseína (TSB; Becton Dickinson) y se incubó durante 4 h en un baño de agua a 35± 2 °C con agitación constante. Una alícuota del cultivo se utilizó para inocular 50 ml de TSB para obtener una absorbancia (DO) de 0.1 a 600 nm. Este subcultivo se incubó en las mismas condiciones hasta obtener una DO 1.0 (λ= 600 nm). Diluciones seriadas y recuento de placa en agar entérico Hektoen (Becton Dickinson) se realizaron para estandarizar las concentraciones de 1-5, 6-10, 1-15 y 16-30 UFC·100 µl-1. Un listado de 60 cepas clasificadas como Salmonella (n= 30) y no-Salmonella (n= 30) se usaron para el parámetro de selectividad (Cuadro 1). La selección de las cepas no-Salmonella fue con base a las características bioquímicas que comparten con Salmonella o por ser considerados agentes contaminantes de la carne. La mayoría de las cepas no-Salmonella correspondían a cultivos de colección y se obtuvieron comercialmente. Las cepas Salmonella

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se obtuvieron del laboratorio, cuya identificación se realizó previamente con pruebas moleculares. Todas las cepas se cultivaron en TSB a 37 ºC por 24 h. Cuadro 1: Microorganismos utilizados para la prueba de selectividad Prueba de inclusividad Prueba de exclusividad Cepas No Referencia Cepas no No Referencia Salmonella Salmonella S. Agona 1 CIAD A.C Bacillus subtilis 1 Ambiental S. Albany 1 CIAD A.C Candida Albicans 1 ATCC 10231 S. Anatum 1 CIAD A.C Citrobacter freundii 1 LEM 04001 S. B monofásica 1 CIAD A.C Citrobacter freundii 1 LEM-04001 S. C1 monofasica 1 CIAD A.C Enterobacter aerogenes 1 LEM-04003 S. Cayar 1 CIAD A.C Enterobacter aerogenes 1 ATCC 13048 S. Cholerasuis 1 CIAD A.C Enterobacter cloacae 1 LEM-04013 S. Enteritidis 1 CIAD A.C Enterococcus faecalis 1 LIBM-01003 S. F 1 CIAD A.C Escherichia coli 1 LEM-01005 S. Gaminara 1 CIAD A.C Escherichia coli 1 ATCC 25922 S. Give 1 CIAD A.C Eschrichia coli O157:H7 1 CENAPA700728 S. Haviana 1 CIAD A.C Klebsiella pneumoniae 1 ATCC 13883 S. Infantis 1 CIAD A.C Listeria innocua 1 ATCC 33090 S. Luciana 1 CIAD A.C Listeria ivanovvi 1 ATCC 19119 S. Meliagridis 1 CIAD A.C Listeria monocytogenes 1 Ambiental S. Minnesota 1 CIAD A.C Listeria monocytogenes 1 ATCC 7694 S. Montevideo 1 CIAD A.C Listeria monocytogenes 1 ATCC 7644 S. Muenchen 1 CIAD A.C Listeria monocytogenes 1 Ambiental S. Newport 1 CIAD A.C Proteus mirabilis 1 ATCC 12453 S. Oranienburg 2 CIAD A.C Proteus mirabilis 1 LEM-03011 S. Saintpaul 2 CIAD A.C Proteus vulgaris 1 LEM-06070 S. San Diego 1 CIAD A.C Pseudomonas aeroginosa 1 ATCC 27853 S. Senftenberg 1 CIAD A.C Pseudomonas aeruginosa 1 LEM-01002 S. Sohanina 1 CIAD A.C Rhodococcus equi 1 LEM-01019 Salmonella sp 1 CIAD A.C Rhodococcus equi 1 ATCC 6939 S. Typhimurium 1 CIAD A.C Shigella flexneri Gpo. B 1 ATCC 12022 S. Thompson 1 CIAD A.C Shigella flexnieri 1 LEM-04004 S. Weltevreden 1 CIAD A.C Shigella sonnei 1 ATCC 9290 CIAD A.C Staphylococcus aereus 1 ATCC 25923 CIAD A.C Staphylococcus epidermis 1 ATCC 12228 Las siglas representan: CIAD A.C. (Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C.), CENAPA (Centro Nacional de Servicios de Diagnóstico en Salud Animal), ATCC (American Type Culture Collection), LEM (código interno), LIBM (código interno)

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Colección de las muestras de carne de res Para el estudio se recolectaron 60 muestras de carne cruda de res que consistían en carne tipo molida (n= 20), pulpa negra (n= 20) y pulpa redonda (n= 20) procedentes de tres mercados ubicados en la ciudad de Culiacán, Sinaloa, México. El número de muestras de carne se asignó de acuerdo con la recomendación mínima sugerida por la ISO16140:2003(29). Se tomaron muestras de 500 g de carne, las cuales se colocaron en bolsas de plástico estériles y transportadas en refrigeración al laboratorio para su posterior análisis. El estudio contempló realizar el análisis en las muestras presuntivas para simular los efectos reales de contaminación que ocurren en la naturaleza, y en muestras de carne contaminadas artificialmente.

Análisis de las muestras de carne de res presuntivas Se homogenizaron 50 g de carne de res con 50 ml de agua destilada estéril en un triturador a 230 rpm por 2 min. Posteriormente, la muestra se dividió equitativamente en porciones de 25 ml para el método de rtPCR -IMS y NOM-114-SSA1-1994.

Análisis de las muestras de carne de res contaminadas artificialmente Se utilizaron las muestras de carne de res clasificadas como negativas para Salmonella por ambos métodos. Una porción de 100 g de carne de res se homogenizó con 100 ml de agua destilada estéril durante 2 min a 230 rpm, y se separaron equitativamente en dos porciones de 50 ml; una porción se usó como control negativo y la porción restante para la contaminación de la carne con Salmonella. La porción contaminada se homogeneizó durante 2 min a 230 rpm, y subsecuentemente se dividió el homogenizado en dos porciones de 25 ml para su análisis por ambos métodos. Paralelamente, se incluyó un control negativo bajo las mismas condiciones. La selección del inóculo correspondió al límite de detección que permite una recuperación fraccional de la bacteria por alguno de los métodos.

Límite de detección Para establecer el límite de detección relativa, se prepararon cinco niveles de inóculo de Salmonella: 0, 1-5, 6-10, 1-15 y 16-30 UFC·25 ml-1. A partir de las muestras de carne de res clasificadas como negativas para Salmonella, se tomaron 250 g de muestra y se homogeneizaron con 250 ml de agua destilada estéril durante 2 min a 230 rpm en un homogeneizador automático (Stomacher 400 Circulador). El homogenizado se fraccionó en 10 porciones de 25 ml para su inoculación con Salmonella: porción 1-2 (0 UFC·25 ml-1), porción 3-4 (1-5 UFC·25 ml-1), porción 5-6 (6-10 UFC·25 ml-1), porción 7-8 (1-15 UFC·25 ml-1) y porción 9-10 (16-30 UFC·25 ml-1). Los niveles de inóculo añadidos se corroboraron 630


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mediante el método de recuento en placa en agar entérico Hektoen, y los tipos de porciones se repartieron equitativamente para su análisis para ambos métodos. El límite de detección corresponderá a la concentración más pequeña del inóculo que se pueda detectar en la muestra en el 50 % de las ocasiones por los métodos(29).

Prueba de selectividad La prueba de selectividad de los métodos se realizó in vitro sin el uso de muestras de carne de res y la selección del inóculo bacteriano se realizó según las especificaciones de la ISO16140:2003(29). Para cada bacteria (Cuadro 1) se estandarizó un inóculo a una absorbancia de 1.0 (λ= 600 nm) en ambos ensayos. Para el ensayo de exclusividad se ajustó una concentración de 104 UFC·100 µl-1 en 225 ml de agua peptonada. Mientras que, en el ensayo de inlcusividad se ajustó la concentración de 100 UFC·100 µl-1 en 225 ml de los medios de enriquecimiento utilizados por los métodos rtPCR -IMS (agua peptonada) y NOM114- SSA1-1994 (caldo lactosado), y la posterior adición de 100 µl de un pool de las cepas empleadas en la prueba de exclusividad. Todos los cultivos fueron evaluados por los métodos de rtPCR -IMS y NOM-114- SSA1-1994.

Método de cultivo de referencia (NOM-114-SSA1-1994) Muestras de carne (25 ml) se enriquecieron con 225 ml de caldo de lactosa (Becton Dickinson) y se incubó a 35 ± 2 °C durante 24 ± 2 h. Posteriormente, se transfirieron alícuotas de 1 ml del cultivo a 10 ml de caldo Selenito Cistina (Becton Dickinson) y a 10 ml de caldo Rappaport Vassiliadis (Becton Dickinson), para su incubación a 35 ± 2 °C durante 24 h. Una vez completada la incubación, se inocularon alícuotas de 10 µl de los cultivos previos en agar entérico Hektoen (Becton Dickinson), Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (Becton Dickinson) y agar Salmonella-Shigella (Becton Dickinson), y se incubaron a 35 ± 2 °C por 24 h. A partir de los agares, se seleccionaron colonias presuntivas (n= 3) de Salmonella para su identificación mediante pruebas bioquímicas primarias (agar de hierro de azúcar triple, agar de lisina y hierro y caldo de urea), API 20E (Biomeriux NC) y pruebas serológicas basadas en la detección de antígeno O polivalente (InDRE)(28). Paralelamente, se incluyeron un control negativo (medio sin bacteria) y un control positivo (Salmonella ATCC 35664).

Método rtPCR-IMS La detección de Salmonella se realizó de acuerdo con las condiciones del proveedor (www.biocontrolsys.com ). Todos los reactivos necesarios para la preparación de la reacción rtPCR para Salmonella (GDS Salmonella Tq 71008) están disponibles comercialmente por Assurance GDS®, BioControl System Inc. Una porción de 25 ml de muestra se enriqueció con 225 ml de agua de peptona tamponada (Becton Dickinson), y se incubó a 35 ± 2 °C por 631


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24 h. Posteriormente, se transfirió 1 ml del enriquecimiento previo a la placa de concentración que contenía 20 µl de reactivo de concentración (perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-Salmonella), y se mezcló por 10 min en un homogeneizador automático (Vortex Mixed Biocontrol Sistema Bellevue). Las perlas magnéticas se extrajeron con una pipeta magnética (Pick Pen ™ Biocontrol System Bellevue), se lavaron con 1 ml del tampón por 7 seg, y se transfirió a una placa que contenía 35 µl del reactivo de resuspensión. Con una pipeta multicanal, se transfirieron 20 µl del tampón de resuspensión con las perlas inmunomagnéticas, y se depositaron en los tubos de PCR, que previamente contenían la sonda, los oligonucleótidos y la ADN Taq-polimerasa (5- Prime). Finalmente, los tubos se colocaron en la máquina de rtPCR. Paralelamente, se incluyeron un control negativo (medio sin bacteria) y un control positivo (Salmonella ATCC 35664). Todas las muestras analizadas por el ensayo de rtPCR-IMS se evaluaron nuevamente a partir del enriquecimiento original utilizando el método de referencia para verificar la detección de Salmonella.

Análisis estadístico Los parámetros de validación del método rtPCR-IMS se basaron en la comparación de los acuerdos positivos (AP), acuerdos negativos (AN), desviaciones positivas (DP) y desviaciones negativas (DN) de los resultados obtenidos en la detección de Salmonella en las muestras de carne en comparación al método de NOM-114-SSA1-1994. Los parámetros se calcularon con las siguientes fórmulas: Exactitud =

AP+AN AP+AN+DP+DN AN

Especificidad = Sensibilidad =

AN+DP AP AP+DN

x 100%

(1)

x 100%

(2)

x 100%

(3)

Falsos positivos = 100 % − % sensibilidad (4) Falsos negativos = 100 % − % especificidad (5) Valores discordantes (Y) = DP + DN (6) El grado de concordancia entre los métodos (rtPCR-IMS y NOM-114-SSA1-1994) se determinó por el índice kappa y la prueba de McNemar (χ²) con significancia del 5%.

Resultados Límite de detección El Cuadro 2 muestra la capacidad de los métodos de rtPCR-IMS y NOM-114-SSA1-1994 para la detección de los diferentes niveles de contaminación de Salmonella en carne de res. El límite de detección para el método de rtPCR-IMS fue de 1 – 5 UFC·25 g-1. No se obtuvieron productos de PCR de las muestras no inoculadas. 632


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Sensibilidad, especificidad y exactitud El Cuadro 3 resume los acuerdos (AP y AN), las desviaciones (DP y DN) y los parámetros de validación relativa del ensayo de rtPCR-IMS para la detección de Salmonella en las muestras de carne de res. La tasa de detección de Salmonella en las muestras presuntivas (n = 60) mediante el análisis de rtPCR -IMS (21.6%) y NOM-114-SSA1-1994 (20.0 %) no fue suficiente para calcular los parámetros de validación. En las 60 muestras de carne contaminadas artificialmente (1-5 UFC·25 ml-1), los ensayos de rtPCR-IMS y NOM-114-SSA1-1994 detectaron a Salmonella en 56 (93.3 %) y 59 (98.3 %) veces, respectivamente. Los métodos coincidieron en la detección de Salmonella en 59 ocasiones: 56 AP y 3 AN. Solo se obtuvo una DN (detectada por NOM-114 pero no por rtPCR-IMS). La rtPCR-IMS presentó una sensibilidad de 98.2 % (56/57), especificidad de 100 % (3/3) y exactitud de 98.3 % (59/60). Los índices de concordancia (k = 0.85 y χ² = 1.0) y el valor discordante (Y= 1), indicaron que el ensayo de rtPCR-IMS y el método de referencia (NOM-114-SSA1-1994) coinciden en los criterios estadísticos (Cuadro 3). Todas las muestras de carne no inoculadas fueron negativas para Salmonella por ambos métodos.

Selectividad Los métodos de rtPCR-IMS y NOM-114-SSA1-1994 presentaron 100 % de exclusividad y 100 % de inclusividad. Ninguno de los métodos reportó reacciones cruzadas. La Figura 1 muestra las amplificaciones del método de rtPCR-IMS correspondientes a la prueba de inclusividad y exclusividad.

Discusión Salmonella representa una amenaza para la salud pública y la industria alimentaria a nivel mundial(5), y en México no es la excepción(19,20-25). Los resultados de este trabajo exhiben la alta persistencia de Salmonella en las muestras presuntivas de carne de res (20 a 21.6 %), como previamente lo han expuesto algunos estudios en México(21-23). Los métodos microbiológicos convencionales sirven de base para el análisis de rutina en muchos laboratorios de seguridad alimentaria y salud pública debido a la facilidad de uso, la fiabilidad de los resultados, la alta sensibilidad y especificidad(8). No obstante, el tiempo de análisis (5 a 7 días) de los métodos de cultivo se observa como una limitante. La incorporación de los métodos moleculares rápidos para la detección de Salmonella en los alimentos permite una intervención temprana y hace posible la protección preventiva del consumidor(10,11,18). El límite de detección del método de rtPCR-IMS y NOM-114-SSA1-1994 fue de 1 – 5 UFC·25 g-1 en carne de res, que corresponde a la concentración más baja evaluada. Del total 633


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de muestras inoculadas con 1 – 5 UFC·25 g-1, el método alternativo arrojó tres repeticiones negativas, de las cuáles solo dos se confirmaron como verdaderamente negativas por el método de referencia (Cuadro 2). La no detección por el método de rtPCR-IMS se puede explicar por la cantidad pequeña (1 – 5 UFC·25 g-1) de Salmonella en el enriquecimiento no selectivo, las consideraciones probabilísticas de inoculación o el efecto del enriquecimiento(30). Widjojoatmodjo et al(31) destacan la importancia del pre-enriquecimiento previo a la detección por PCR para aumentar su sensibilidad, dado que la mayoría de los métodos de PCR necesitan concentraciones altas de microorganismos para una adecuada detección. Similar a nuestros resultados, Notzon et al(30) y O´Regan et al(32) reportaron un límite de detección del método de rtPCR-IMS en carne de res de 10-100 UFC·25 g-1, y en carne de pollo de 1-10 UFC·25 g-1, respectivamente. Estos métodos emplearon un enriquecimiento de 6 h(30) ó 24 h(32) previo a la detección por PCR. Por otra parte, se menciona(10) que la IMS es una alternativa para evitar el enriquecimiento secundario permitiendo la detección de 1-10 células en un periodo de incubación de 12 – 24 h. El límite de detección observado (1 – 5 UFC·25 g-1) con la rtPCR-IMS permitiría alinearse con los requerimientos normativos nacionales (NOM-213-SSA1-2002) que exigen la cero tolerancia de Salmonella en 25 g de carne cruda de res(33). Los datos obtenidos en las muestras presuntivas no permitieron determinar los parámetros de validación, debido a que los cálculos se realizan sobre una serie de resultados negativos obtenidos por el método de referencia, los cuales no pueden exceder el doble del número de los resultados positivos según lo estipulado en el manual de validación(29). Por lo que este estudio, explica la validación del método de rtPCR-IMS para el análisis de Salmonella basado en muestras de carne de res contaminadas artificialmente. El grado de sensibilidad, especificidad, exactitud, y concordancia del método comercial de rtPCR-IMS con el método de cultivo de referencia valida su uso para el análisis de Salmonella en carne de res generando resultados idóneos en un tiempo de 24 h (Cuadro 2). Además, la tasa de falsos positivos (0 %) y falsos negativos (1.8 %) del método son bajas. Es importante señalar que los métodos moleculares no reemplazan las técnicas de cultivo, dado que los resultados positivos deben confirmarse por el método de referencia(34). Algunos estudios previos han expuesto la concordancia de protocolos de rtPCR-IMS con los métodos de cultivo de referencia para la detección de Salmonella en carne de res(30) y pollo(32,35), resaltando su alto grado de sensibilidad (94 - 100 %), especificidad (80 - 94 %) y exactitud (89 – 100 %). Estas características determinadas en el método comercial de rtPCRIMS (Cuadro 3) pueden atribuirse a que las perlas inmunomagnéticas contienen antígenos que permite concentrar al microbio de interés a partir de enriquecimientos no selectivos disminuyendo el tiempo de análisis(35). Además, los oligonúcleótidos empleados son capaces de detectar diferentes tipos de cepas de Salmonella (Figura 1).

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Figura 1: Amplificaciones del método de rtPCR-IMS para la prueba de inclusividad y exclusividad

La figura a y b muestran la amplificación de las 30 cepas de Salmonella (25 serotipos diferentes) y las 30 cepas de no-Salmonella, respectivamente. La posición de las líneas respecto al umbral indican un resultado positivo (superior) o negativo (inferior). La figura c y d muestran la amplificación de los controles internos de la reacción (ICA) de las cepas incluidas en el ensayo de inclusividad (a) y exclusividad (b). Las de líneas ICA rebasaron el umbral por lo que se considera una reacción válida.

La desviación negativa (DN) observada entre los métodos (Cuadro 2), puede explicarse debido a que el método de cultivo contiene diversas etapas de enriquecimiento que favorecen la recuperación de células dañadas y el crecimiento del microorganismo de interés en comparación a los métodos rápidos(12). También, la presencia de Proteus, E. coli, Klebsiella aerogenes y Enterobacter en estado mucoide en el caldo de enriquecimiento pueden unirse a los anticuerpos de las perlas causando reacciones cruzadas e impidiendo la detección de Salmonella(35). Ampliamente se ha descrito que el tipo de matriz y sus componentes químicos pueden afectar los resultados de los métodos moleculares(12-13). En cuanto a los tres acuerdos negativos entre los métodos, puede atribuirse a la cantidad extremadamente baja del microorganismo después del enriquecimiento o que no existían células en el inóculo inicial. El valor de McNemar (χ² = 1.0, P = 0.317) obtenido en este estudio cumplen con el parámetro de no significancia (χ² < 3.84)(29), y demuestra que no existe diferencia entre los métodos de rtPCR-IMS y el método NOM-114-SSA1-1994 para la detección de Salmonella en carne de res. Además, el índice Kappa revela una alta concordancia (0.85 o 85%) entre los métodos. Notzon et al(30) infirieron la equiparabilidad del método alterno de rtPCR-IMS con una concordancia de 85 % (k = 0.85) y 87 % (k = 0.87) para la detección de Salmonella en carne contaminadas artificial y naturalmente, respectivamente. 635


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Un método selectivo es aquel que permite detectar al analito que se está examinando, y que puede garantizar que la señal detectada solo puede ser un producto de ese analito específico(29). En este sentido el método de rtPCR-IMS fue capaz de discriminar a Salmonella, dado que detectó las 30 cepas de Salmonella correspondiente a 25 diferentes serotipos aún en presencia de otros microorganismos, y no generar interferencia con las cepas diferentes a Salmonella. Mercanoglu & Griffiths(36) han reportado que la combinación de rtPCR y IMS para la detección de Salmonella presentan una selectividad del 100%, atribuyéndose esta propiedad al efecto de las perlas inmunomagnéticas y la selección de los oligonucleótidos empleados.

Conclusiones e implicaciones Los resultados proponen a la rtPCR-IMS como un método eficiente para la detección rápida de Salmonella spp. en carne de res dado que no presentó diferencias con el método de referencia (NOM-114-SSA1-1994), aportando la ventaja de detectar al microorganismo en un tiempo corto (24 h) y en una concentración mínima (1 UFC·25 g-1) y sin causar reacciones cruzadas con otros microorganismos que se encuentran como microbiota natural en la carne de res. La incorporación de este tipo de métodos a la industria alimentaria y laboratorios microbiológicos permitirán una respuesta rápida para asegurar la inocuidad de los alimentos y prevenir el riesgo de enfermedades. Adicionalmente, se alerta a las autoridades sanitarias sobre la alta incidencia de Salmonella en la carne cruda a fin de incluir controles a lo largo de la cadena alimentaria. Agradecimientos Se agradece el apoyo técnico del QFB. Jesús Héctor Carrillo Yáñez, responsable del Laboratorio de Biología Molecular y Genómica Funcional y al Fondo S0007-2006-1. SAGARPA-CONACYT. Proyecto No. 48134 por el financiamiento para el desarrollo de la investigación. Conflicto de intereses Los autores declaran no tener conflictos de intereses, financieros o de otra índole. Literatura citada: 1. Ryan MP, O’Dwyer J, Adley CC. Evaluation of the complex nomenclature of the clinically and veterinary significant pathogen Salmonella. BioMed Res Int 2017;1-6.

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Cuadro 2: Límite de detección de Salmonella en las muestras de carne mediante los métodos de rtPCR-IMS y NOM-114-SSA11994 rtPCR-IMS NOM-114-SSA1-1994 No. de 6-10 11-15 16-30 6-10 11-15 16-30 réplica 1-5 UFC 0 UFC 1-5 UFC 0 UFC UFC UFC UFC UFC UFC UFC 1 +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ -/-/+/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ -/-/2

+/+/+

+/+/+

+/+/+

+/+/+

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3

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4

+/+/-*

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+/+/+

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5

+/+/+

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6

+/ -/ -

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+/+/+

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+/+/+

-/-/-

+ = Salmonella sp. fue detectada en la muestra; – = Salmonella sp. no fue detectada en la muestra. El ensayo fue negativo, pero la confirmación por el método de referencia fue positiva a partir del enriquecimiento original.

*

641


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Cuadro 3: Comparación de los métodos de rtPCR-IMS y NOM-114-SSA1-1994 para la detección de Salmonella en carne de res Muestra Presuntivas

Resultados*

Y

Sensibilidad

AP DP AN DN No (%) 5 7 41 7 14 ND

Contaminadas** 56

0

3

1

1

*

98.2

Falso Falso Especificidad Exactitud negativo positivo (%) (%) (%) (%) ND ND ND ND 1.8

100

0

98.3

χ²

Kappa

ND ND 1.0 0.85 (P=0.317)

AP (acuerdo positivo): Detección del patógeno por ambos métodos. AN (acuerdo negativo): No detección del patógeno por ambos métodos. DP (desviación positiva): Detección del patógeno por el método alterno, pero no por el método de referencia. DN (desviación negativa): Detección del patógeno por el método de referencia, pero no por el método alterno. ND (no determinado). ** Los resultados corresponden a muestras de carnes inoculadas con una concentración de 1-5 UFC·25 ml-1 de Salmonella ATCC 35664.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.5776 Artículo

Prevalencia de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y factores de riesgo asociados en lecherías bajo sistemas de sala de ordeño mecánico en Antioquia, Colombia

Nathalia M. Correa-Valencia a Nicolás F. Ramírez-Vásquez a Jorge A. Fernández-Silva a*

a

Universidad de Antioquia. Facultad de Ciencias Agrarias. Centauro, Escuela de Medicina Veterinaria, Carrera 75 # 65 - 87, Ciudadela Robledo, Medellín, Colombia.

*Autor de correspondencia: jorge.fernandez@udea.edu.co

Resumen: El presente estudio tuvo como objetivo determinar la prevalencia de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) según muestras ambientales y explorar los factores de riesgo a nivel de hato asociados a la infección por MAP en hatos lecheros bajo sistemas de sala de ordeño mecánico y basados en pastoreo de prados. Los hatos de estudio (n= 94) se ubicaron en 60 distritos de cinco municipios de la región Norte de la Provincia de Antioquia, Colombia. Los hatos fueron visitados una vez en 2016 para recolectar dos muestras ambientales compuestas y completar un cuestionario de evaluación de riesgos. La identificación de MAP se llevó a cabo utilizando un método de PCR cuantitativo en tiempo real basado en la secuencia IS900. Un hato se consideró como MAP-positivo si una o ambas muestras ambientales resultaron positivas mediante la técnica molecular. La información sobre los factores de riesgo se analizó utilizando un modelo de regresión logística multivariable. La prevalencia aparente a nivel de hato encontrada fue de 14.9 % (14/94; IC 95 %: 7.7-22.1), oscilando entre 0 y 33.3 % a nivel municipal. Los hatos en los que predominaban razas distintas a la Holstein pura (estas son, Jersey, cruzas de Jersey) tenían más probabilidades de estar positivamente infectados con MAP-qPCR que aquellos en los que predominaba el ganado Holstein puro (OR= 3.7; IC 95 %: 1.1-15.2). El presente estudio reporta la prevalencia de MAP en hatos lecheros de la Provincia de Antioquia (Colombia), y la asociación entre la positividad ambiental de MAP con la raza predominante en el hato.

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Palabras clave: Muestreo ambiental, Holstein, Jersey, enfermedad de Johne.

Recibido: 19/08/2020 Aceptado: 20/04/2021

Introducción Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) es el agente causal de la enfermedad de Johne (EJ)(1), una enterocolitis granulomatosa crónica de desarrollo lento(2). El MAP es resistente a los cambios ambientales y químicos y puede sobrevivir en el medio ambiente hasta por un año(3,4). La enfermedad tiene una distribución mundial y también se describen pérdidas de producción relacionadas(5,6). Cada una de las pruebas diagnósticas de MAP actualmente disponibles presenta ventajas y desventajas, dependiendo de la matriz y de las diferentes etapas de la infección y enfermedad posterior(7,8). La detección molecular de MAP utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) en muestras ambientales ha sido propuesta para la examinación de hatos(8,9), con resultados equivalentes a los obtenidos mediante cultivo(10). La sensibilidad (Se) de la PCR (en todos los formatos) puede variar debido a la excreción fecal irregular de los organismos, mientras que su especificidad (Es) es cercana al 100 % en todas las etapas de la enfermedad(11,12). Se ha encontrado que el método de PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR, por sus siglas en inglés) es sensible (≈60 %) y específico (≈97 %)(13,14), lo que también permite la detección y cuantificación de MAP en matrices complejas (por ejemplo, leche, muestras fecales)(15-17). El análisis de muestras ambientales utilizando qPCR es considerado hoy en día como un enfoque ahorrador y fácil de usar para diagnosticar la EJ a nivel de hato y clasificar el hato como infectado o no, ya que no requiere la recolección de muestras de animales individuales, reduciendo el estrés inherente del proceso de muestreo(16,18). La prevalencia de EJ a nivel de hato en todo el mundo parece ser de >18 %, con reportes >50 %(19-21). En Colombia, una seroprevalencia aparente a nivel de hato pareció ser >50 %, según estudios basados en ELISA(22,23). Sin embargo, otros estudios han reportado prevalencias más bajas, como 3.6(24) y 4.1 %(25). Parece que el rango de resultados posibles sobre la estimación de la prevalencia en el país es amplio, y depende en gran medida de la prueba diagnóstica utilizada y de la población de estudio. En Colombia, los datos sobre los factores de riesgo de EJ a nivel animal o de hato en los hatos lecheros aún son limitados y los sistemas de producción lechera son diversos. Por lo tanto, las prácticas de manejo y los factores de riesgo a nivel de hato, que difieren entre los hatos y los sistemas de producción lechera(26,27), exigen la definición local de los factores de riesgo para la enfermedad considerando la diversidad local de los sistemas de producción lechera. Esta diversidad a menudo se supervisa y los informes sobre la prevalencia y los factores de riesgo comúnmente ignoran este hecho, produciendo datos que no se pueden 644


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comparar con otros estudios y resultados, incluso en la misma región o país. En un estudio transversal anterior reciente, se muestrearon 292 hatos lecheros con instalaciones de ordeño en potrero, unidades móviles, ubicadas en 61 distritos diferentes de seis municipios del norte de Antioquia (Colombia) con una muestra ambiental compuesta que contenía material de al menos seis sitios diferentes (submuestras) de la concentración de ganado adulto o áreas de alto tráfico en potreros de pastoreo. En este estudio, los hatos con antecedentes de ganadería mixta con otros rumiantes tuvieron mayores probabilidades de estar infectados con MAP que los hatos sin esta característica(25). Otro sistema de producción lechera muy común en el Norte de Antioquia y en toda Colombia, basaba su producción de leche en sistemas de sala de ordeño mecánico y pastoreo de prados. Se plantea la hipótesis de que este sistema tiene diferentes niveles de prevalencia, así como diferentes factores de riesgo a nivel de hato en comparación con los hatos lecheros con instalaciones de unidades móviles de ordeño en potrero, unidades móviles, que fueron previamente estudiados(25). Por lo tanto, este estudio transversal tuvo como objetivo determinar la prevalencia de MAP a nivel de hato de acuerdo con los resultados de IS900-qPCR en muestras ambientales, y explorar los factores de riesgo a nivel de hato asociados a la infección por MAP en hatos lecheros bajo sistemas de sala de ordeño mecánico de la región Norte de la Provincia de Antioquia (Colombia).

Material y métodos Diseño del estudio y selección del hato En 2016 se realizó un estudio transversal probabilístico en la región lechera Norte de la Provincia de Antioquia (Colombia). Los hatos seleccionados estuvieron distribuidos en cinco municipios (San Pedro de los Milagros, Entrerríos, Santa Rosa de Osos, Donmatías y Belmira), conocidos por sus considerables volúmenes de producción lechera. El área de estudio se encuentra entre 1,090 y 2,979 msnm, y la temperatura ambiental oscila entre 12 y 16 °C. Según la clasificación climática de Caldas-Lang, los municipios de Santa Rosa de Osos, San Pedro de los Milagros, Entrerríos y Donmatías están clasificados como frío-húmedos, y el municipio de Belmira como frío-muy húmedo(26). El hato fue considerado como la unidad de análisis. El estudio se realizó bajo un diseño de muestreo aleatorio estratificado, con restitución y sin reemplazo. En el diseño del estudio se consideró una distribución proporcional a nivel de municipio y distrito, de acuerdo con la población bovina adulta en cada nivel (vacas y toros >2 años de edad)(27). La selección de los distritos a muestrear en cada uno de los cinco municipios se definió de acuerdo con su peso específico en el municipio correspondiente, considerando los primeros distritos con mayor población bovina adulta, hasta que la cantidad de su censo alcanzó el 70 % de la población en cada municipio.

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El tamaño de la muestra se definió de acuerdo con una fórmula para la estimación de la prevalencia a partir de una población finita(28), incluyendo una estimación a priori de la proporción de prevalencia de EJ de 0.118 (11.8 %) de un informe previo en la región de estudio(25), obtenida en condiciones metodológicas y poblacionales similares, un nivel de confianza del 95 % y una tasa de error máxima aceptable del 7 %. Se consideró el límite superior de dicho informe. El marco muestral se refirió a 7,794 hatos enlistados en los registros de vacunación contra la fiebre aftosa de los cinco municipios de estudio(27). De los hatos enlistados, se designaron al azar 94 hatos en 60 distritos, de acuerdo con la estrategia de muestreo y los criterios de inclusión (estos son, tener ganado adulto, instalaciones de ordeño mecánico en sala y sistemas basados en pastoreo de prados, accesibilidad geográfica, sin antecedentes o reporte previo de detección de EJ o MAP por ningún método y disposición del propietario a participar).

Recolección de la muestra y cuestionario El muestreo ambiental se realizó según lo reportado previamente por la literatura(18,29), con algunas modificaciones debido a las particularidades en los sistemas de producción e instalaciones de la región de estudio (por ejemplo, maternidad, cuarentena y/o área de lactancia no siempre definidas) y a restricciones presupuestarias. Cada hato de estudio fue visitado una vez para recolectar dos muestras ambientales compuestas y completar un cuestionario. La primera muestra compuesta contenía submuestras de al menos seis puntos diferentes de concentración de ganado adulto/áreas de alto tráfico (por ejemplo, potrero, áreas cercanas a bebederos y comederos, pasillos, canaletas, áreas de espera de la sala de ordeño). Cada submuestra se recogió teniendo en cuenta aquellos que no estaban previamente expuestos a la luz solar directa. La segunda muestra compuesta contenía estiércol de la sala de ordeño recolectado de la laguna de almacenamiento de estiércol, después de mezclar su contenido durante al menos 5 min antes del muestreo. Las submuestras de la laguna se obtuvieron de seis lugares diferentes del perímetro sumergiendo el recipiente de muestreo hasta 10 cm debajo de la superficie. Cada muestra ambiental se recolectó utilizando un guante de plástico desechable limpio. Las submuestras de cada uno de los dos lugares de recolección se juntaron y mezclaron a mano en la granja. Luego, se colocaron aproximadamente 20 g de cada una de las dos muestras conjuntas (por separado) en un recipiente. Las muestras definitivas se conservaron en refrigeración a 4 °C durante el transporte al laboratorio de investigación, donde se homogeneizaron a mano durante 5 min y luego se almacenaron a -20 °C hasta la extracción de ADN. El mismo cuestionario de una página utilizado y reportado anteriormente(25) se aplicó aquí (disponible previa solicitud).

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Análisis de laboratorio El análisis de laboratorio se realizó como se describió anteriormente(25). Brevemente, se utilizó un kit comercial de preparación de ADN (ZR Fecal DNA Kit™, Zymo Research, CA, EE. UU.) para el aislamiento de ADN, y el protocolo incluyó un paso previo de batido de perlas (Disruptor Genie® 120V, Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, EE. UU.). Se utilizó un espectrofotómetro NanoDrop 2000® (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EE. UU.) para medir la pureza y el rendimiento de los ácidos nucleicos en dos longitudes de onda (A260 y A280 nm). La integridad del ADN se confirmó utilizando un gel de solo agarosa en una submuestra representativa de cada lote de extracción (10 %). La eficiencia de extracción de ADN se confirmó mediante PCR utilizando genes constitutivos bacterianos a las mismas submuestras mencionadas anteriormente. El ADN extraído se conservó a -20 °C hasta el análisis de IS900-qPCR (Bactotype MAP PCR Kit®, Qiagen, Leipzig, Alemania). La muestra analizada se consideró como positiva cuando se produjo una señal de canales FAM/MAX o fuertemente positiva si se emitió una señal solo de FAM, con un Ct≤40 y una curva de patrón sigmoide, según las directrices de MIQE(30).

Análisis estadístico El análisis estadístico se realizó como se describió anteriormente(25). La variable independiente fue el estado de infección por MAP del hato por IS900-qPCR (positivo/negativo). Toda la información se analizó utilizando Stata 15.0 (StataCorp, 2017, College Station, Texas, EE. UU.) para el modelado descriptivo y de regresión. Se calcularon los estadísticos descriptivos para todas las variables de interés. Se consideró un análisis de encuesta compleja, de acuerdo con un efecto de conglomerado a nivel de distrito y con el diseño estratificado del estudio. Se realizó un análisis univariable para evaluar las asociaciones incondicionales entre el resultado (estado MAP del hato) y cada predictor independiente utilizando regresión logística simple. Las asociaciones con un P≤0.20 se consideraron para su inclusión en el modelo de regresión logística multivariable. Después, se realizó la evaluación de los posibles factores de confusión mediante la evaluación del cambio en el coeficiente β de las variables del modelo ajustado en comparación con el modelo no ajustado. Las variables a explorar como factores de confusión (estas son, tamaño del hato, raza predominante) se consideraron de acuerdo con la literatura. Se estudiaron las interacciones biológicamente plausibles entre las variables significativas de los modelos multivariables, así como las interacciones bidireccionales entre los predictores significativos con una asociación incondicional significativa con la variable dependiente. Los factores de confusión solo se mantuvieron si se observaba un cambio superior al 15 %, independientemente de la significancia del coeficiente de la variable de confusión en el modelo. Las variables independientes incluidas en el modelo final se seleccionaron de acuerdo con un procedimiento escalonado hacia atrás (entrada P= 0.20; eliminación P= 0.25). El modelo final se presenta considerando las razones de probabilidad (RP) con IC de 95 %. El ajuste del modelo fue evaluado usando la prueba de bondad de ajuste de Hosmer-Lemeshow(28).

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Resultados Se recolectaron dos muestras ambientales de cada uno de los 94 hatos lecheros bajo sistemas de sala de ordeño mecánico y basados en pastoreo de prados, ubicados en 60 distritos diferentes en cinco municipios de la Provincia de Antioquia (Colombia). Ninguno de los hatos estaba estabulado o semiestabulado. El 2.1 % (2/94) de los hatos principalmente elegibles no autorizaron ser visitados cuando fueron contactados por teléfono por primera vez y, un 6 % de los números de teléfono estaban fuera de servicio/no registrados. Los hatos no participantes se consideraron como hatos lecheros grandes (>30 vacas en ordeño) para el contexto colombiano, y se ubicaron principalmente en los municipios de Donmatías y Entrerríos, según los registros censales de la Provincia. La prevalencia aparente a nivel de hato encontrada fue de 14.9 % (14/94; IC 95 %: 7.7-22.1), oscilando entre 0 y 33.3 % a nivel de municipio (Cuadro 1). Los Cuadros 2 y 3 muestran las características y las prácticas de manejo a nivel hato consideradas como predictores para el enfoque de factores de riesgo de MAP. Cuadro 1: Prevalencia de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis a nivel de municipio en la Provincia de Antioquia, Colombia (2016) Municipio Belmira Santa Rosa de Osos Entrerríos San Pedro de los Milagros Donmatías Total

Peso de la muestra (%) 3.2 16.0 26.6 41.5 12.7 100

Hatos de estudio 3 15 25 39 12 94

No. de hatos positivos (%) 0 (-) 0 (-) 6 (24.0) 4 (10.3) 4 (33.3) 14 (14.9)

Cuadro 2: Características a nivel de hato en lecherías de la región norte de la Provincia de Antioquia, Colombia (2016)

17 77

DIS (%) 18.1 81.9

OR (IC 95%) 1.4 (0.3-6.9)

71 9

81 13

86.2 13.8

3.2 (0.8-12.2)

0.096*

73 7

85 9

90.4 9.6

0.6 (0.1-3.1)

0.871

Predictor

CAT

OR (n)

RN (n)

N

Tamaño del hato

≤ 30 >30

2 12

15 65

Raza predominante

Holstein puro Otroa Sí No

10 4 12 2

Disponibilidad de asistencia veterinaria

648

Valor P 0.514


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Prácticas de compra de ganado (uso de crías/novillas de reemplazo en los últimos 10 años) Animales externos pastando en prados propios Animales propios pastando en pastos no propios Combinación del ganado con otros rumiantes susceptibles a MAP (por ejemplo, caprinos, ovinos, búfalos) en los últimos 2 años Combinación de especies de rumiantes con el ganado en los últimos 2 años

Sí No

4 10

37 43

41 53

43.6 56.4

0.5 (0.1-1.6)

0.226

Sí No

1 13

1 79

2 92

2.1 97.9

6.1 (0.4-103.3)

0.262

Sí No

0 14

4 76

4 90

4.3 95.7

0

NE

Sí No

3 11

17 63

20 74

21.3 87.7

1.0 (0.3-4.0)

0.938

Caprinos, 2 Ovinos 0 Ovinos y 1 caprinos 11 No aplica

8 8 1 63

10 8 2 74

10.6 8.5 2.2 78.7

5.7 (1.5-20.9) 0 1.4 (0.2-11.6)

0.099

Estatus de buenas prácticas ganaderas (BPG; según el ICA) Estatus de tuberculosis bovina (libre de tuberculosis según el ICA) Conocimiento del productor sobre la enfermedad

Sí No

9 5

33 47

42 52

44.7 55.3

2.6 (0.8-8.4)

0.111*

Sí No

11 3

57 23

68 26

72.3 27.7

1.5 (0.4-5.8)

0.572

4 10

0 70

14 80

14.9 85.1

0.4 (0.1-1.4)

NE

3 11

17 63

20 74

21.3 87.7

1.0 (0.3-4.0)

0.938

Algob Nunca antes había oído hablar de ella Antecedentes de Síc síntomas Nunca compatibles con EJ

NE 0.773

CAT= categorías; RP= hatos positivos; RN= hatos negativos; DIS= distribución; NE= no estimable. ICA= Instituto Colombiano Agropecuario. OR= razón de probabilidades. IC= intervalo de confianza. a Incluye: Jersey puro y cruzas de Jersey. b Incluye: Reconoce solo el nombre, algunos conceptos básicos y bastante informado. c Incluye: En la actualidad y/o en los últimos 2 años. * Variables utilizadas para el análisis multivariable (P≤0.20).

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Cuadro 3: Prácticas de manejo a nivel de hato en lecherías de la región Norte de la Provincia de Antioquia, Colombia (2016)

Sí No

RP (n) 14 0

RN (n) 77 3

≤1 ≥2

4 10

Sí No

De múltiples vacas De su propia madre Leche no vendible Otras fuentesa

Predictor

CAT

Esparcimiento de estiércol como fertilizante en los prados Tiempo típico de separación de la cría recién nacida de su madre después del nacimiento (en días) Crías ≤ 6 meses de edad en contacto directo con ganado adulto Fuente de calostro proporcionado a las crías Fuente de leche proporcionada a las crías no destetadas

OR (IC 95%) 0

Valor P NE

22.3 77.4

0.68 (0.2-2.4)

0.544

12 82

12.8 87.2

1.2 (0.2-6.0)

0.854

0 80

0 94

100.0

0

NE

30 50

35 59

37.2 67.8

1.08 (0.3-3.5)

0.899

N

DIS (%)

91 3

96.8 3.2

17 63

21 73

2 12

10 70

0 14

5 9

CAT= categorías; RP= hatos positivos; RN= hatos negativos; OR= razón de probabilidades. IC= intervalo de confianza; NE= no estimable. a Incluye: Leche sin antibiótico (leche vendible) y sustituto de la leche. * Variables utilizadas para el análisis multivariable (P≤0.20).

Las variables con un promedio de “0” entre hatos con estado MAP positivo/negativo se excluyeron de las regresiones logísticas (estas son, animales propios pastando en pastos no propios, conocimiento del productor sobre la enfermedad, esparcimiento del estiércol como fertilizante en los prados, fuente de calostro proporcionado a las crías). Las variables tamaño del hato y prácticas de compra de ganado se incluyeron en el análisis como posibles factores de confusión, pero el cambio relativo en los coeficientes fue <15 %, por lo que no se exploraron más a fondo.

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El modelo final de regresión logística multivariable para el estado MAP-positivo en las lecherías de estudio mostró que los hatos en los que predominaban razas distintas de la Holstein pura (estas son, Jersey, cruzas de Jersey) tenían más probabilidades de estar positivamente infectados con MAP-qPCR utilizando muestreo ambiental que aquellos en los que predominaba el ganado Holstein puro (RP= 3.7; IC 95 %: 1.1-15.2).

Discusión El presente estudio se llevó a cabo para determinar la prevalencia de MAP a nivel de hato de acuerdo con muestras ambientales en 94 hatos en cinco municipios diferentes. Además, el estudio tuvo como objetivo explorar los factores de riesgo a nivel de hato asociados con la infección por MAP en lecherías bajo sistemas de sala de ordeño mecánico y basados en pastoreo de prados en el Norte de Antioquia, Colombia. Todos los hatos encontrados positivos a MAP-qPCR se consideraron como infectados, con base en el hecho de que una fuente de eliminación de MAP conduce a la contaminación fecal ambiental y, por lo tanto, al riesgo de ingestión por parte del ganado sensible(31). La prevalencia de MAP aparente a nivel de hato de 14.9 % estimada del presente estudio (0-33.3 % a nivel de municipio) parece ser menor que las reportadas para el ganado de Norteamérica, Europa y América Latina y el Caribe, independientemente del sistema de producción lechera o de carne(19-21). A escala nacional, los resultados de un estudio reciente realizado en la misma región en hatos lecheros con instalaciones de ordeño en potrero encontraron una prevalencia aparente de 4.1 %(25), basada en la detección molecular de MAP en muestras ambientales utilizando un método de PCR cuantitativo en tiempo real basado en la secuencia de MAP IS900. Las diferencias en las estimaciones de prevalencia de estos dos sistemas de producción lechera (incluso estando ambos bajo sistemas de pastoreo rotacional en la mayoría de los casos) y procedimientos de ordeño diferentes podrían deberse, hipotéticamente, a una mayor carga metabólica y al consiguiente estrés para los individuos, que deben caminar al menos dos veces al día hacia y desde la sala de ordeño en comparación con las vacas en hatos lecheros con instalaciones de ordeño en el potrero, en el que las vacas permanecen en los prados pastando la mayor parte del día y es el ordeñador quien se acerca a ellas para el ordeño. Las vacas que tienen que caminar varias veces al día podrían tener una inmunidad comprometida que podría favorecer el éxito de la colonización intestinal por MAP, la formación de lesiones granulomatosas, y la consiguiente eliminación del agente al medio ambiente(2,32), así como la infección por otros patógenos. Además, la mayor prevalencia aparente podría deberse a una mayor probabilidad de detección de hatos positivos en el ambiente cuando se recolectan dos muestras de cada uno, como se siguió en este caso(16,33). Estos argumentos propuestos necesitan más enfoques de investigación.

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Un lugar preciso conocido como apropiado para definir un hallazgo MAP positivo a nivel de hato es la laguna de almacenamiento de estiércol(34,35). Sus consideraciones en la región de estudio no parecen ser una característica representativa de los sistemas lácteos locales/regionales en Colombia, teniendo en cuenta que sólo 1 de cada 4 lecherías de la Provincia cuenta con esta instalación(27). Sin embargo, dichas lecherías fueron una fuente representativa de los hallazgos positivos, ya que 8 de los 14 hatos encontrados como MAP-qPCR positivos se detectaron utilizando las muestras de las lagunas, mientras que cinco de los positivos fueron de la concentración de ganado adulto y/o área de alto tráfico, y uno de ambos lugares de muestreo. Esta puede ser una explicación adicional al comparar el resultado aquí obtenido de prevalencia con el reportado previamente(25), como se mencionó. Se encontró que los hatos donde predominaban razas distintas a la Holstein pura (a saber, Jersey y cruzas de Jersey) tenían más probabilidades de estar positivamente infectados con MAP-qPCR en comparación con aquellos en los que la Holstein pura era la raza predominante. En estudios previos(36-38) se ha reportado una mayor susceptibilidad aparente a la EJ para vacas de razas distintas a la Holstein pura. Se ha sugerido que las razas Channel Island (estas son, Jersey, Guernsey) son más susceptibles a la EJ, con base en evidencia de que la enfermedad clínica ha sido reportada con mayor frecuencia en estas razas que en cualquier otra raza(37). No obstante, la razón de esto sigue siendo desconocida. Se ha planteado la hipótesis de que esta susceptibilidad puede estar relacionada con una mayor exposición en lugar de una mayor susceptibilidad o puede estar confundida por algunos factores que juegan un papel importante en el desarrollo de la enfermedad clínica, como una menor tasa de sacrificio en las razas Channel Island, solo por dar un ejemplo, pero esa información no está disponible a partir del presente estudio. Se sospecha entonces que la susceptibilidad a la infección tiene un componente genético, y se han reportado valores moderados de heredabilidad de la infección y susceptibilidad y hasta ahora se han hecho algunas aproximaciones sobre el tema. En este sentido, el uso de la selección genética como herramienta de control de la EJ es un enfoque relativamente nuevo. El fenotipo (estado de infección) mostrado por algunos animales es una combinación de factores genéticamente determinados (genes de susceptibilidad/resistencia/tolerancia) y factores ambientales (exposición a MAP)(12). La susceptibilidad se evidencia por la infección y progresión a la etapa clínica; la resistencia se caracteriza por la ausencia de infección o por combatir exitosamente una infección y eliminar el patógeno del cuerpo; y la tolerancia se caracteriza por la infección y un estado subclínico. Se espera que las variaciones genéticas del hospedero contribuyan a modificar la respuesta del animal a la exposición al agente y alcanzar uno de los tres escenarios de desafío desencadenantes(39). En el caso de la EJ, los objetivos de investigación hasta el momento se han centrado principalmente en la evaluación de la susceptibilidad. Esto se da principalmente por razones de practicidad, ya que la resistencia o tolerancia a la infección debe evaluarse a través de estudios de desafío, en los que los animales son expuestos a dosis iguales del patógeno y posteriormente se evaluaría su 652


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respuesta durante un largo período de tiempo, siendo un abordaje costoso (debido al tipo de especie), a largo plazo (debido a la patogénesis de la enfermedad), y para llegar a conclusiones aceptables, el grupo de animales debe ser grande(40). Sin embargo, el establecimiento de una población más resistente a MAP a través de programas de mejoramiento no debe considerarse una solución completa para controlar la enfermedad, sino más bien como una herramienta para prevenir o reducir la incidencia de la infección(41). La leche y el calostro pueden portar MAP, debido a la contaminación fecal de los pezones o al ser excretados de la ubre(7). Desde un punto de vista local, otros autores han reportado que las probabilidades de ser un hato seropositivo fueron menores en aquellos que alimentaban a las crías con calostro combinado de varias vacas en comparación con los hatos que alimentaban a las crías con calostro de sus propias madres(42). Este estudio previo se realizó en 14 lecherías, ubicadas en los municipios de Belmira y San Pedro de los Milagros (Provincia de Antioquia), dos de los cinco municipios incluidos en este estudio. Sus resultados contrastan con el conocimiento previo del riesgo de ser seropositivo representado por el uso de calostro de múltiples vacas vs de la propia madre(7). Los resultados de este trabajo reportaron que todo el calostro dado a las crías es de sus propias madres (100 % de los hatos). Otros estudios han relacionado la alimentación de animales jóvenes con leche contaminada con antibióticos u otra leche de descarte como un factor de riesgo significativo para la propagación de MAP(43). Los resultados indicaron que los sustitutos de leche y la leche vendible (sin antibióticos) fueron las principales fuentes utilizadas para alimentar a las crías no destetadas. No obstante, según la experiencia, utilizar leche desechada para alimentar a las crías sigue siendo una práctica común en los sistemas de estudio en Colombia, lo que aumenta las probabilidades de transmisión dentro del hato, no solo de MAP, sino de otros agentes infecciosos.

Conclusiones e implicaciones La prevalencia aparente encontrada en los hatos con instalaciones de ordeño en potrero del presente estudio fue de 14.9 %, variando de 0 a 33.3 % entre los municipios de estudio. Además, se encontró que las lecherías, donde predominaban razas distintas a la Holstein pura, tenían más probabilidades de estar positivamente infectadas con MAP-qPCR mediante muestreo ambiental que aquellas en las que la Holstein pura era la raza predominante (OR =3.7; IC 95 %: 1.1-15.2), lo cual no significa que el ganado Holstein sea resistente a la infección por MAP. Sin embargo, esta característica debe ser tomada en cuenta para el control de la EJ, particularmente en las lecherías de Colombia bajo el mismo sistema de producción lechera que los considerados aquí.

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Agradecimientos Los autores agradecen a la Convocatoria Programática 2014-2015: Área de Ciencias de la Salud, Universidad de Antioquia (beca #8714-2015-2042), Medellín (Colombia). A la Dra. Christine Gaunitz (Qiagen, Leipzig, Alemania) por su acompañamiento en la interpretación de los resultados de la PCR. A Gentech Biosciences (Colombia) por todo el apoyo técnico y de laboratorio. Conflicto de intereses Los autores afirman que no tienen conflictos de intereses que declarar. Literatura citada: 1.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.6015 Artículo

Efecto de la nutrición en el último tercio de la gestación de vacas de carne sobre el desarrollo de la progenie

John Lenon Klein a* Sander Martinho Adams a Amanda Farias de Moura b Daniele Borchate a Dari Celestino Alves Filho a Dieison Pansiera Antunes a Fabiana Moro Maidana c Gilmar dos Santos Cardoso a Ivan Luiz Brondani a Ricardo Gonçalves Gindri a

a

Federal University of Santa Maria (UFSM). Department of Animal Science, Santa Maria, RS, Brazil. b

State Technical School of Professional and Technological Education of Diamantino, MT, Brazil. c

Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS). Department of Animal Science, Porto Alegre, RS, Brazil.

*

Autor de correspondencia: johnlenonklein@yahoo.com.br

Resumen: La restricción de la ingesta de nutrientes por parte de las vacas de carne durante la gestación puede influir en el potencial de crecimiento posparto de la progenie, por lo que el objetivo del presente estudio fue evaluar los efectos de la restricción nutricional y de la nutrición adecuada o la sobrealimentación durante el último tercio de la gestación de 658


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las vacas cruzadas (Charolais x Nellore) criadas en el bioma pampeano, sobre el rendimiento productivo de la progenie hasta los 15 meses de edad. Ochenta y tres (83) vacas se dividieron en tres tipos de tratamiento: vacas de control en pastos naturales bajo restricción nutricional (RES); suplementación para satisfacer el 100 % de las necesidades (REQ); suplementación por encima de las necesidades (ALTO). Los terneros nacidos de vacas con tratamiento REQ y ALTO tuvieron un mayor peso corporal al nacimiento que los terneros de las vacas con tratamiento RES (39.28, 39.13 vs 34.58 kg), sin que esto haya influido en el rendimiento postnatal. Las hembras de las vacas con tratamiento REQ y ALTO presentaron un mejor rendimiento postnatal y, en consecuencia, un mayor peso a los 12 meses de edad en comparación con las crías de las vacas con tratamiento RES (300.71 y 311.79 frente a 259.47 kg). Estos terneros alcanzaron el 60 % del peso adulto temprano (358 y 345 vs 405 d) y tuvieron un mayor porcentaje de reproducción a los doce meses de edad (73.98 y 84.08 vs 34.08 %) que las hembras nacidas de las vacas con tratamiento RES. La suplementación de las vacas para satisfacer el 100 % de las necesidades, así como la sobrealimentación durante el último tercio de la gestación, mejora el rendimiento de las crías a los doce meses de edad, y los machos y las hembras responden de forma diferente a los insultos nutricionales de la madre durante este periodo. Palabras clave: Terneros, Crecimiento fetal, Restricción nutricional, Miogénesis.

Recibido: 08/07/2021 Aceptado: 18/01/2022

Introducción En el sistema de producción de terneros, las vacas de carne se mantienen en sistemas de forraje de menor calidad y pasan por períodos de menor suministro de nutrientes durante la preñez. La escasez de alimentos es habitual en muchas regiones del mundo, lo que hace que las vacas estén sometidas a restricciones alimentarias durante la gestación(1). Esta baja ingesta de nutrientes se asocia con el futuro desarrollo de la progenie(2). En estas situaciones de bajo suministro de nutrientes, la suplementación durante la gestación es una alternativa para evitar los efectos negativos de la deficiencia nutricional durante el período fetal en la productividad de la progenie(3). De acuerdo con Wilson et al(4), el consumo de nutrientes afecta el desarrollo fetal, así como el desarrollo furuturo de la progenie. Al trabajar con vacas cruzadas (Angus x Hereford), Bohnert et al(5) obtuvieron terneros machos más pesados al nacimiento (40.8 vs 39.3 kg) y al destete (191 vs 183 kg), cuando eran nacidos de vacas suplementadas con granos de destilería durante la gestación final. Wilson et al(4) también observaron que al proporcionar dos niveles de nutrientes digeribles totales en el último tercio de la gestación (100 y 12 % de las necesidades) a vacas de raza Angus x Simmental se registraba un

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aumento del peso de los terneros machos al nacer (41.0 frente a 44.0 kg) cuando la ingesta de energía de la vaca aumentaba. Una mejor formación del músculo esquelético durante la gestación permite un mejor desarrollo de la progenie, ya que la nutrición de la hembra durante este periodo incrementa la síntesis y el crecimiento de las fibras musculares, así la formación de adipocitos intramusculares, favoreciendo la producción de carne de calidad en la progenie(2). Ciertos investigadores(3) añadieron que cuando el número de fibras musculares formadas durante el embarazo debido a la programación fetal es menor, también disminuye la masa muscular y el rendimiento de los animales se ve influido negativamente. Además de mejorar la producción de carne de las crías, la nutrición de las vacas durante la gestación también afecta al potencial productivo de las hembras. Funston et al(6) observaron un mayor peso al destete (232 frente a 225 kg) y una menor edad de pubertad (352 frente a 366 días) en las novillas de vacas cruzadas Red Angus x Simmental suplementadas con pastos nativos de invierno y/o residuos de cultivos de maíz durante el final de la gestación. Al estudiar los efectos de la nutrición materna en el segundo y tercer trimestre de la gestación, se demostró(7) que las hembras de vacas cruzadas (¼ Angus, ¼ Hereford, ¼ Pinzgauer y ¼ RedPoll) sometidas al 125 % de las necesidades nutricionales en el último trimestre de la gestación tenían una mayor tasa de partos y durante la temporada de cría concebían antes que los terneros de vacas que recibían el 100 y el 75 % de las necesidades. Partiendo de la hipótesis de que la mayor ingesta de nutrientes por parte de la vaca gestante mejora la productividad de la progenie después del parto, el objetivo del presente estudio fue evaluar los efectos de la restricción nutricional y de la nutrición adecuada o sobrealimentación durante el último tercio de la gestación de las vacas cruzadas (Charolais x Nellore) criadas en el bioma pampeano, sobre el rendimiento productivo de la progenie hasta los doce meses de edad.

Material y métodos Los protocolos utilizados en el experimento fueron aprobados por el Comité de Ética para el Uso de Animales (CEUA) de la Universidad Federal de Santa María, bajo el protocolo nº 7920140617 aprobado el 12/07/2017.

Animales y factores de estudio El estudio se realizó en el Departamento de Ciencia Animal de la Universidad Federal de Santa María, Santa María - RS, Brasil. La zona experimental está situada a una altitud media de 95 m, a 29° 43' S y 53° 42' O. El clima de la región es "Cfa" (subtropical húmedo), según la clasificación de Köppen, con una pluviometría media anual entre 1,600 y 1,900 mm, y una temperatura de 18.8 °C, con una media mínima de 9.3 °C y una máxima media de 24.7 ºC(8).

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Se utilizó un total de 83 vacas de carne, junto con su progenie, procedente del cruce rotativo entre Charolais (CH) y Nelore (NE), previamente distribuidos por edades (4 a 12 años) y por porcentaje de sangre Nelore. Tras el diagnóstico de gestación para determinar el momento de la misma, se dividieron en tres tratamientos según el nivel nutricional en el último tercio de la gestación: 28 vacas de control en pastos naturales bajo restricción nutricional (RES); 28 vacas en pastos naturales suplementados para cubrir el 100 % de las necesidades energéticas y proteicas (REQ), y 27 vacas en pastos naturales con suplementación por encima de las necesidades energéticas y proteicas (ALTO). Las dietas fueron calculadas por los requerimientos nutricionales en el último tercio de la gestación de vacas de 475 kg de peso corporal, que consumían el 2.1 % del peso vivo de la materia seca forrajera, según las recomendaciones del Consejo Nacional de Investigación de Estados Unidos (NRC por sus siglas en inglés)(9). El suplemento concentrado (Cuadro 1) se consideró como un aditivo a la ingesta de forraje que aportó el 0.28 y el 0.98 % del peso corporal de la suplementación para los tratamientos REQ y ALTO, respectivamente. Este plan nutricional permitió ganancias de peso diarias de 0.103, 0.025 y 0.207 kg día-1 durante el último tercio de la gestación para los tratamientos RES, REQ y ALTO, respectivamente, lo que se tradujo en una mejor condición corporal de estas vacas al nacimiento (2.81, 2.92 y 2.99 puntos, en el mismo orden), siguiendo la escala de 1 a 5 puntos, donde 1 se clasifica como muy delgada y 5 como muy gorda. Las vacas que parieron machos tuvieron un menor aumento de peso diario durante el último tercio de la gestación (-0.02 vs 0.11 kg día-1) y una menor condición corporal que las que parieron hembras (2.89 vs 2.93 puntos). Los animales se mantuvieron en cuatro potreros de pastos naturales, con superficies de 20, 21, 41 y 47 ha, y se les administró un suplemento de sales minerales (ProduBeef 60P® - con valores mínimos de 170, 60 y 130 g kg-1 de calcio, fósforo y sodio, respectivamente) en cada potrero, con libre acceso. El pasto nativo estaba compuesto principalmente por la especie de verano, de origen africano, llamada capim-annoni (Eragrostis plana Ness), y por otras especies de pasto de estación cálida, Paspalum notatum, Axonupus affinis y Desmodium incanum. Las vacas de cada tratamiento se manejaron en grupos. Los potreros se rotaron entre los tratamientos cada 28 días para reducir el error experimental. La masa y el suministro de forraje en los potreros fueron de 4144.72 kg de materia seca ha-1 y 11.22 kg de materia seca por cada 100 kg de peso vivo de los animales. La carga animal media fue equivalente a 275.21 kg ha-1 de peso corporal. La suplementación se suministró diariamente a las 1100 h, comenzando el 15 de agosto de 2017, y duró hasta la fecha del parto de las vacas. El periodo de suplementación fue de 95 y 92 días para las vacas REQ y HIGH, respectivamente.

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Cuadro 1: Composición de la fracción concentrada y consumo de nutrientes de las vacas en el último tercio de la gestación Tratamientos1 Fracción de la dieta RES REQ ALTO Ingredientes de la fracción concentrada (% de materia seca) Maíz molido 81.78 Harina de soya 17.22 Urea 1.00 Composición bromatológica de la fracción concentrada (% de materia seca) Proteína cruda 18.00 Nutrientes digeribles totales 85.00 Ingesta de materia seca y nutrientes en vacas preñadas que pesan 475 kg Forraje nativo, kg día-1 9.98 9.98 Suplemento concentrado, kg día-1 1.32 -1 Nutrientes digeribles totales, kg día 4.69 5.81 -1 Proteína cruda, kg día 0.45 0.70 Nutrientes digeribles totales3 , % de materia seca 88.50 109.60 3 Proteína cruda , % de materia seca 60.00 93.40 1

91.74 7.26 1.00 15.00 85.00 9.98 4.69 8.60 1.15 162.30 153.30

Composición del forraje autóctono: proteína cruda 4.5%; nutrientes digeribles totales 47.0%. RES= vacas en pastos naturales bajo restricción nutricional; REQ= vacas suplementadas para satisfacer el 100% de las necesidades; ALTO= vacas suplementadas por arriba de los requerimientos. 2 Consumo de forraje estimado en un 2,1% del peso corporal(9). 3 Consumo en relación con las necesidades diarias de nutrientes digeribles totales (5.30 kg) y proteína cruda (0.75 kg) descrito en NRC(9).

Tras el parto, se mantuvieron las mismas condiciones de manejo para todos los tratamientos. El parto tuvo lugar entre el 25 de octubre y el 15 de diciembre de 2017. El día del parto, el conjunto de madres y crías fue llevado al centro de manejo para el pesaje y cuidado de las crías, y luego se mantuvieron en pastos de Tifton-85 (especies del género Cynodon) durante tres semanas. Tras este periodo, los animales se reubicaron en pastos nativos hasta el momento del destete de las crías convencionales, donde se presentaron a una edad promedio de 165 ± 17 días.

Crecimiento de los terneros

Tras el destete, la progenie permaneció durante 30 días en pastos tifton-85 recibiendo un 1 % de peso vivo de suplemento concentrado. El suplemento para terneros estaba compuesto por 57.2 % de maíz molido, 38.14 % de harina de soja y 4.66 % de sal mineral (ProduBeef 60P®). La combinación de estos ingredientes contenía un 22.20 % de proteína bruta y un 83.54 % de nutrientes digeribles totales. Posteriormente, se criaron a base de pastos intercalados de Avena negra y Raigrás (Avena strigosa + Lolium multiflorum), hasta los 12 meses de edad. Las muestras de los pastos, obtenidas cortando el follaje, mostraron un contenido de 17.84, 59.97 y 57.36 % de proteína bruta, nutrientes digeribles totales y fibra

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detergente neutra, respectivamente. Todos los análisis químicos del concentrado y del forraje fueron realizados en el Laboratorio de Análisis Bromatológicos de la Universidad Federal de Santa María. Las crías permanecieron en los pastos entre el 5 de junio de 2018 y el 6 de noviembre de 2018, con un total de 155 días. La masa y el suministro de forraje en el período fueron de 1087.56 kg ha-1 de materia seca y 7.61 kg de materia seca por 100 kg de peso vivo de los animales. La carga ganadera media en este periodo fue de 894.83 kg ha-1 de peso corporal. Debido a que los terneros se mantuvieron en un solo grupo, no fue posible cuantificar la ingesta de forraje de los animales; sin embargo, la estimación de la ingesta de materia seca para esta categoría de crecimiento es cercana al 2.40 % del peso corporal(9).

Medidas de rendimiento de la progenie El rendimiento de los machos y de las hembras se evaluó por separado mediante el pesaje al nacimiento, al destete y a los 265 y 335 días de edad (± 17 días). La ganancia media diaria de los animales se calculó dividiendo la ganancia de peso total entre el número de días transcurridos entre los pesajes, y los pesos de las crías se ajustaron posteriormente a 205, 270 y 365 días de edad, según las siguientes ecuaciones: PAJUST205 = (GMD Nacimiento al destete) x 205 + Peso al nacer; PAJUST270 = (GMD Destete a los 270 d) x 65 + PAJUST205; PAJUST365 = (GMD Destete a los 365 d) x 160 + PAJUST205, donde GMD = ganancia media diaria. Para complementar las evaluaciones de rendimiento, se tomaron las medidas corporales de los machos, junto con las ponderaciones. La condición corporal de los terneros se calculó siguiendo la metodología descrita por Cattelam et al(10), a través del cociente del peso por la longitud corporal, siendo posteriormente ajustado por los 205 y 365 días. La aptitud reproductiva de las hembras se evaluó basándose en el peso reproductivo objetivo de 285 kg, que representa aproximadamente el 60 % del peso adulto (AW), tal y como recomienda el NRC(9).

Diseño experimental y análisis estadístico El diseño experimental utilizado tanto para los machos (n= 42) como para las hembras (n= 41) fue completamente aleatorio, con tres tratamientos y un número variado de repeticiones. La normalidad de los residuos se analizó mediante la prueba de ShapiroWilk. Se eliminaron las transformaciones y los valores atípicos cuando fue necesario. Posteriormente, los datos se sometieron a un análisis de la varianza mediante la prueba F a través del procedimiento (PROC) GLM, y cuando hubo significancia, las medias se compararon mediante la prueba de Tukey a un nivel de significancia del 5% (P<0.05). Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SAS® Studio University Edition(11), utilizando el siguiente modelo matemático: Yijk = µ + Ni + Ij+ Zk+εijk Donde, γijk: variables dependientes;

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μ: media de todas las observaciones; Ni: efecto del i-ésimo nivel nutricional prenatal; Ij: efecto de la covariable edad de la vaca; Zk: efecto de la covariable porcentaje de la raza Nellore en las vacas; εijk: efecto del error aleatorio residual (error b).

Resultados Rendimiento de los machos El rendimiento de las crías de las vacas sometidas a diferentes niveles nutricionales en el último tercio de la gestación se muestra en el Cuadro 2. Las vacas con tratamiento REQ y ALTO produjeron terneros machos más pesados al nacimiento en relación con las vacas con tratamiento RES (39.28 y 39.13 vs 34.58 kg, respectivamente). El rendimiento de los terneros machos durante la fase de lactancia no se vio influido por el nivel nutricional de la vaca en el último tercio de la gestación (P= 0,1375), con un peso ajustado a los 205 días de edad de 199.75, 220.76 y 215.93 kg de peso corporal, respectivamente, para los tratamientos RES, REQ y ALTO. El peso a los 205 días de edad es el resultado de la similitud (P=0.2471) del aumento de peso diario de los machos durante la lactancia, con un valor medio de 0.85 kg día-1. Un comportamiento similar se observó para el rendimiento post-destete de los machos, que no se vio influido por la nutrición materna durante el último trimestre de la gestación (Cuadro 2). Los machos tenían un peso medio de 229.18 y 302.12 kg de peso corporal, respectivamente, a los 270 días (P = 0.1305) y a los 365 d de edad (P= 0.3603). El peso corporal de los machos a los 365 días de edad es el resultado de la similitud en el rendimiento de estos animales durante el período posterior al destete (P=0.8582). La ganancia media diaria de peso de los machos en este periodo fue equivalente a 0.56 kg día-1 de peso corporal, rendimiento que puede considerarse inferior al esperado para animales en fase inicial de crecimiento con pastos cultivados. El rendimiento durante el periodo postnatal hasta los doce meses de edad no se vio influido por el nivel nutricional de la vaca en el último tercio de la gestación (P=0.5829), en el cual los terneros machos tuvieron una ganancia diaria equivalente a 0.70 kg día-1 de peso corporal desde el nacimiento hasta los doce meses de edad. Asimismo, no hubo ningún efecto del nivel nutricional de la vaca durante la gestación (P>0.05) en la longitud corporal de los terneros. Sin embargo, la compacidad corporal al nacimiento fue mayor en los terneros nacidos de vacas con tratamiento REQ y ALTO en comparación con los nacidos de vacas con tratamiento RES (0.59 y 0.59 frente a 0.54 kg cm-1, respectivamente), mostrando un mayor potencial de producción muscular por centímetro de canal.

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Cuadro 2: Efectos del nivel nutricional de las vacas de carne durante el último tercio de la gestación sobre el rendimiento posparto de los terneros machos Tratamiento1 (n) Valor Rendimiento RES (14) REQ (16) ALTO (12) de P Rendimiento antes del destete a los siete meses de edad Peso al nacer, kg 34.58b ± 1.32 39.28a ± 1.24 2 PAJUST205 kg 199.75 ± 7.71 220.76 ± 7.25 -1 Nacimiento-destete, kg d 0.80 ± 0.03 0.88 ± 0.03 Longitud del cuerpo, cm 63.58 ± 1.19 64.56 ± 1.15 Compacidad del cuerpo, kg cm-1 0.54b ± 0.13 0.59a ± 0.13 Rendimiento post-destete a los nueve meses de edad PAJUST2702 , kg 215.97 ± 8.28 238.67 ± 7.50 Destete-265 d, kg día-1 0.28 ± 0.04 0.28 ± 0.03 Longitud del cuerpo, cm 108.18 ± 1.69 111.50 ± 1.62 Compacidad del cuerpo, kg cm-1 1.77 ± 0.05 1.93 ± 0.05 Rendimiento post-destete a los doce meses de edad PAJUST3652 , kg 289.15 ± 10.96 308.52 ± 10.30 Destete-335 d, kg día-1 0.56 ± 0.03 0.56 ± 0.03 -1 Nacimiento-335 d kg día 0.68 ± 0.02 0.71 ± 0.02 Longitud del cuerpo, cm 125.78 ± 1.97 128.12 ± 1.89 Compacidad del cuerpo, kg cm-1 2.25 ± 0.08 2.38 ± 0.07

39.13a ± 1.43 215.93 ± 8.35 0.86 ± 0.03 64.51 ± 1.37 0.59a ± 0.15

0.0248 0.1375 0.2471 0.8130 0.0212

232.91 ± 8.66 0.26 ± 0.04 110.94 ± 1.87 1.94 ± 0.05

0.1305 0.9498 0.3447 0.0813

308.72 ± 11.87 0.58 ± 0.04 0.72 ± 0.03 125.12 ± 2.18 2.45 ± 0.08

0.3603 0.8582 0.5829 0.5388 0.2438

Los valores son las medias previstas ± errores estándar media (SEM). Letras distintas en la misma línea difieren según la prueba de Tukey (P<0.05). 1 RES = vacas en pastos naturales bajo restricción nutricional; REQ = vacas suplementadas para satisfacer el 100% de las necesidades; ALTO = vacas suplementadas por encima de los requerimientos. 2 Peso de los terneros ajustado a la edad. abc

Rendimiento de las hembras A diferencia del rendimiento de los machos, el peso al nacer de las hembras no se vio influido (P= 0.3730) por el nivel nutricional de las vacas en el último tercio de la gestación (Cuadro 3), con un valor medio equivalente a 34.08 kg de peso corporal. Sin embargo, el desarrollo inicial de las terneras durante la fase de lactancia dio lugar a un mayor peso corporal ajustado a los 205 días de edad para la progenie de las vacas con tratamiento REQ y ALTO en comparación con las nacidas de vacas con tratamiento RES (211.58 y 210.95 frente a 187.76 kg, respectivamente). Este resultado está relacionado con la mayor ganancia media diaria de estas hembras durante la lactancia (P=0,0336) en relación con las terneras de las vacas con tratamiento RES (0.86 y 0.86 vs 0.75 kg día-1, respectivamente). Además de un mejor rendimiento durante la fase de lactancia, las terneras de las vacas con tratamiento REQ y ALTO presentaron un mayor rendimiento tras el destete que las nacidas de vacas con tratamiento RES, lo que se tradujo en un mayor peso corporal tanto a los 270 (P=0.0105) como a los 365 d de edad (P=0.0021). Las terneras presentaron pesos corporales de 200.93, 224.89 y 233.15 kg a los 9 meses y de 259.47, 300.71 y

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311.79 kg a los 12 meses de edad, respectivamente, para los tratamientos RES, REQ y ALTO. La superioridad en el peso corporal de las hembras puede explicarse por las ganancias diarias de peso corporal de las crías en el periodo posterior al destete (Cuadro 3). En este periodo, las crías de las vacas con tratamiento ALTO mostraron mayores ganancias que las nacidas de las vacas con tratamiento RES tanto en 265 (0.34 vs 0.17 kg día-1) y 335 días de edad (0.45 vs 0.63 kg día-1). Las terneras de las vacas con tratamiento REQ mostraron un rendimiento similar al de los otros grupos estudiados durante la fase de crecimiento, con ganancias diarias de 0.21 y 0.55 kg de peso corporal a los 270 y 365 días de edad, respectivamente. El rendimiento desde el nacimiento hasta los 12 meses de las hembras fue mayor en las terneras de vacas con tratamiento REQ y ALTO (P=0,0019) en relación con las nacidas de vacas con tratamiento RES (0.70 y 0.74 vs 0.60 kg día-1, respectivamente). La nutrición de las vacas durante el último tercio de la gestación mejoró la aptitud reproductiva de las terneras a los doce meses de edad (Cuadro 3) Las terneras procedentes de vacas con tratamiento REQ y ALTO presentaron un mayor porcentaje de peso adulto a los doce meses de edad (P=0.0021) en comparación con las nacidas de vacas con tratamiento RES (63.19 y 65.64 vs 54.65 %, respectivamente), resultado que está relacionado con el mayor rendimiento postnatal de estas hembras y, en consecuencia, con un mayor peso corporal a esa edad. Cuadro 3: Efectos del nivel nutricional de las vacas de carne durante el último tercio de la gestación sobre el rendimiento posparto de las terneras Tratamiento1 (n) Valor Rendimiento RES (14) REQ (12) ALTO (15) de P Rendimiento después del destete Peso al nacer, kg 32.79 ± 1.25 2 PAJUST205 , kg 187.76b ± 6.46 -1 Nacimiento-destete, kg d 0.75b ± 0.02 Rendimiento después del destete PAJUST2702 , kg 200.93b ± 7.08 Destete-265d, kg día-1 0.17b ± 0.03 PAJUST3652, kg 259.47b ± 9.60 -1 Destete-335d, kg día 0.45b ± 0.03 Nacimiento-335d, kg día-1 0.60b ± 0.02 Peso adulto -335 d, %3 54.65b ± 2.02 1

35.45 ± 1.38 211.58a ± 7.28 0.86a ± 0.03

34.01 ± 1.24 210.95a ± 7.08 0.86a ± 0.03

0.3730 0.0266 0.0336

224.89a ± 7.71 0.21ab ± 0.03 300.71a ± 10.83 0.55ab ± 0.03 0.70a ± 0.02 63.19a ± 2.28

233.15a ± 7.48 0.34a ± 0.03 311.79a ± 10.51 0.63a ± 0.03 0.74a ± 0.02 65.64a ± 2.21

0.0105 0.0103 0.0021 0.0043 0.0019 0.0021

Los valores son las medias previstas ± errores estándar medios (EEM). RES = vacas en pastos naturales bajo restricción nutricional; REQ = vacas suplementadas para satisfacer el 100% de las necesidades; ALTO = vacas complementadas por encima de los requerimientos. 2 Peso de los terneros ajustado a la edad. 3 Las hembras deben alcanzar el 60% del peso adulto (285 kg de peso corporal). abc Valores con letras distintas en la misma línea difieren según la prueba de Tukey (P<0.05).

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Discusión Entre los factores que pueden alterar el ambiente uterino durante la gestación, destacan los efectos de la nutrición materna, donde tanto la desnutrición como la sobrealimentación pueden modificar el metabolismo y la fisiología del ternero tras el nacimiento(12), con reflexiones sobre el potencial de producción de la progenie. En este estudio, los efectos de los distintos niveles nutricionales de las vacas de carne durante el último tercio de la gestación fueron diferentes entre la progenie de los machos y de las hembras, lo que dio lugar a una discusión de las categorías por separado.

Rendimiento de los machos La satisfacción de los requerimientos o la suplementación de las vacas por encima de las necesidades de mantenimiento de proteínas y energía en el último tercio de la gestación proporcionó una mayor ingesta de nutrientes por parte de las vacas preñadas, aspecto que puede haber mejorado el suministro nutricional para el feto, con la consiguiente formación de tejido muscular. La mejora de la nutrición materna dio lugar a un mayor peso al nacer de los machos provenientes de vacas con tratamiento REQ y ALTO. Du et al.(13) afirman que en esta etapa de la gestación se producen la finalización de la hiperplasia muscular y la hipertrofia de las fibras preformadas, así como el inicio de la formación de adipocitos en el músculo esquelético fetal. Según Funston et al(6), el desarrollo del músculo esquelético fetal tiene una baja prioridad nutricional durante el embarazo, factor que perjudica la formación del tejido muscular en situaciones de baja ingesta de nutrientes. Diversos autores que han estudiado los efectos de la nutrición materna sobre el rendimiento de la progenie masculina(5,14,15) corroboran este estudio al reportar la mejora en el peso corporal al nacimiento de los terneros machos nacidos de vacas con mayor estado nutricional en la gestación, justificando la atribución de este resultado a los efectos la programación fetal. La mayor compacidad corporal de los terneros de vacas con tratamiento REQ y ALTO en comparación con los de vacas con tratamiento RES (Cuadro 3) puede estar relacionada con los cambios en la hiperplasia y/o hipertrofia de las fibras musculares que se produjeron en el último tercio de la gestación y que se vieron favorecidos por una mejor nutrición de la vaca gestante, como se explicó anteriormente(12). Maresca et al(16) calcularon el índice de masa corporal dividiendo el peso del ternero al nacer entre la raíz cuadrada de la longitud del cuerpo, y obtuvieron un mayor índice muscular en los terneros nacidos de vacas Aberdeen Angus alimentadas con un mayor nivel de proteínas en la dieta durante el final de la gestación. La compacidad corporal representa una mayor deposición de músculo por unidad de medida corporal, aspecto que puede aumentar la parte comestible de la canal. Los efectos de la nutrición materna durante la gestación no se evidenciaron después del nacimiento de los terneros machos, los cuales mostraron una similitud (P>0,05) en los

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pesos ajustados a los 205, 270 y 365 días, resultado que se relaciona con el aumento de peso diario de los terneros machos después del parto. Sin embargo, a la edad de 105 días los terneros nacidos de vacas con tratamiento REQ y ALTO eran, respectivamente, un 10.51 y un 8.10 % más altos que los machos nacidos de vacas con tratamiento RES. Larson et al(17) y Bohnert et al(5), quienes trabajaron con vacas Red Angus x Simmental y Angus x Hereford, respectivamente, obtuvieron mayores pesos al destete de los terneros nacidos de vacas suplementadas con granos de destilería en el último tercio de la gestación. Marques et al(18) observaron un mayor peso al destete en los terneros machos nacidos de vacas Angus x Hereford que ganaron puntajes de condición corporal en el segundo o tercer trimestre de gestación, en comparación con las que fueron alimentadas para ganar condición corporal al principio de la gestación o que recibieron suplementos para mantener un puntaje de condición corporal adecuada e inadecuada durante toda la gestación, lo que demuestra que la estimulación nutricional durante las etapas de miogénesis y adipogénesis da lugar a una progenie masculina con mayor potencial productivo. El rendimiento post-destete de los machos fue similar en los diversos niveles nutricionales de las vacas durante el último tercio de la gestación (Cuadro 2). Un estudio metaanalítico(19) demostró que el aumento de peso de las vacas durante la gestación mejora el rendimiento de la progenie, y agrega que los efectos de una mejor nutrición materna en la gestación son más evidentes durante los dos primeros meses de vida de los terneros. En general, la literatura ha demostrado que los resultados de la programación fetal se expresan más claramente en los primeros meses de vida de la progenie, especialmente en lo relativo al rendimiento masculino(5,14,17). Estos autores no encontraron diferencias de peso tras el destete; sin embargo, comentan que el peso corporal superior observado en las crías de vacas con un mayor nivel nutricional durante la gestación persiste o incluso aumenta durante las fases de su crecimiento. Incluso sin obtener la ingesta de forraje de los terneros, el estrés causado por el destete y la posterior adaptación al pasto de Avena Negra + Raigrás puede haber limitado el potencial productivo de la progenie de vacas con tratamiento REQ y ALTO durante el periodo de crecimiento inicial hasta los 270 días de edad, que es el momento de este periodo cuando los terneros de las vacas con tratamiento RES vieron su rendimiento favorecido (Cuadro 2). Webb et al(20) afirman que la restricción nutricional durante la gestación acaba produciendo un fenotipo "económico", que según Greenwood et al(21), tiene una mayor capacidad de adaptación metabólica a ambientes menos favorables durante la vida postnatal, pudiendo mostrar ganancias compensatorias en ambientes desafiantes después del nacimiento(22). Estos cambios estructurales y funcionales en los órganos permiten una rápida adaptación del feto en desarrollo a la presión de la selección ambiental uterina(23) y preparan al organismo para sobrevivir en entornos similares en su vida adulta.

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Rendimiento de las hembras Sin embargo, los efectos de la programación fetal también se observaron en las terneras hembras, con efectos distintos a los observados en los machos. A diferencia de lo observado en la progenie de los machos, el peso al nacer de las hembras fue similar entre los distintos niveles nutricionales de las vacas en el último tercio de la gestación (Cuadro 3). Funston et al(6) y Larson et al(17), quienes estudiaron los efectos de la programación fetal en el rendimiento de machos y hembras contemporáneos Red Angus x Simmental, observaron resultados similares. Estos autores informaron de comportamientos diferentes para el desarrollo de los machos y de las hembras, en los que los machos mostraron diferencias en el peso al nacer, pero tuvieron rendimientos similares en las etapas posteriores del crecimiento. Al evaluar a las hembras, Funston et al(6) observaron pesos similares al momento del nacimiento; sin embargo, en el desempeño postnatal, las terneras nacidas de las vacas que recibieron suplementación proteica durante la gestación tardía presentaron mayor peso al destete, y esta diferencia de peso se mantuvo hasta el inicio de su etapa reproductiva. En general, las hembras tienen un menor peso al nacer en comparación con los machos, lo que puede representar una menor demanda nutricional para la vaca durante la gestación y, en consecuencia, menores efectos de la programación fetal en el peso al nacer de las terneras hembras, como se observó en el presente estudio, en el que las crías de las vacas con tratamiento REQ y ALTO al nacer sólo pesaron un 5.91 % más que las vacas con tratamiento RES. Las hembras tuvieron en promedio 10.5 % menos de peso al nacer que los machos, lo que puede justificar la hipótesis de que las hembras tienen menores necesidades nutricionales durante el periodo fetal. Esta teoría es aún más evidente cuando se observa que las vacas que parieron hembras tuvieron una mayor ganancia media diaria durante el periodo de suplementación (0.11 vs -0.02 kg día-1) y parieron con una mejor puntuación de condición corporal (2.93 vs 2.89 puntos) en comparación con las vacas que parieron machos, es decir: el exceso de nutrientes se almacenó como reservas corporales debido a las menores demandas nutricionales para el feto. Los efectos de la programación fetal se expresaron más claramente en el rendimiento postnatal de las hembras (Cuadro 3), siendo las terneras de vacas con tratamiento REQ y ALTO en promedio 23.50 kg más pesadas a los 7 meses de edad en comparación con las crías de vacas con tratamiento RES. También se observó un mayor peso al destete de las hembras nacidas de vacas suplementadas en el último trimestre de gestación(24) en vacas Red Angus cruzadas, y lo mismo reportaron Funston et al(6), habiendo sido este grupo de hembras respectivamente 7.5 y 8.0 kg más pesadas que las terneras de vacas con menor nivel nutricional en el mismo periodo. Cushman et al(7) y Shoup et al(25), al estudiar vacas cruzadas (¼ Angus, ¼ Hereford, ¼ Pinzgauer y ¼ RedPoll) y Angus x Simmental, respectivamente, no observaron diferencias en el rendimiento, durante la lactancia hasta el destete, entre las terneras de vacas que recibieron suplementación durante la gestación y las de aquellas que no, y justificaron este resultado por la similitud en las ganancias de peso en la fase de lactancia. 669


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El crecimiento superior de las hembras de las vacas con tratamiento REQ y ALTO persistió y aumentó después del periodo de lactancia, y a los doce meses de edad, estas hembras tenían respectivamente un 15.89 y un 20.16 % más de peso corporal en comparación con las nacidas de vacas con tratamiento RES. Según Greenwood et al(21), la restricción de la alimentación durante el desarrollo fetal puede limitar la capacidad de crecimiento de la progenie durante el periodo postnatal, con un crecimiento más lento de las crías hasta los 30 meses de edad. El retraso en el desarrollo de las hembras durante la edad adulta puede provocar pérdidas, así como una disminución de su potencial productivo. Como consecuencia de su mayor desarrollo corporal durante el crecimiento, las hembras de vacas con tratamiento REQ y ALTO tuvieron un mayor porcentaje de peso adulto a los doce meses de edad (Cuadro 3). Shoup et al(25) no observaron diferencias en el porcentaje de peso adulto —que en promedio ascendió al 51%— entre las crías de vacas no suplementadas o que recibieron cantidades bajas de concentrado durante la gestación y las que recibieron cantidades altas del mismo. Un mayor porcentaje de peso adulto al momento del apareamiento puede reflejar mejores tasas de reproducción, ya que la hembra necesita ganar menos peso durante la gestación hasta el primer parto. Algunos autores(7,24) observaron en las hembras nacidas de vacas con una mayor ingesta de nutrientes en el último trimestre de la gestación no sólo una mejora en la estructura corporal sino también una mayor tasa de partos en los primeros 21 días de la temporada de nacimientos; esto indica que estas hembras conciben al inicio de su etapa reproductiva, lo que puede dar como resultado una mayor longevidad productiva de las hembras nacidas de vacas que recibieron una nutrición de más alto nivel durante la gestación(6). En este sentido, es evidente la influencia que ejerce la mejor nutrición materna durante la gestación sobre el potencial productivo de la progenie. Sin embargo, la satisfacción de los requerimientos nutricionales o la sobrealimentación de las vacas en el último tercio de la gestación no modificó el rendimiento de las crías evaluadas hasta la edad de doce meses. También cabe destacar que durante las fases de crecimiento los efectos de la programación fetal en el rendimiento postnatal pueden ser diferentes en los machos que en las hembras.

Conclusiones e implicaciones En resumen, los resultados de este estudio demuestran que tanto la suplementación por arriba de las necesidades nutricionales como la satisfacción del 100 % de las necesidades de las vacas de carne durante el último tercio de la gestación mejora el peso al nacer de los machos, pero, sobre todo, el rendimiento postnatal de las hembras hasta los 12 meses de edad, lo que se traduce en un mayor peso adulto a los 365 días de edad de estas novillas. Por lo tanto, la progenie masculina y femenina responden de manera diferente a los cambios intrauterinos causados por la nutrición materna durante el último tercio de la gestación, tema que es necesario seguir investigando. Por otra parte, con respecto a los parámetros evaluados, la sobrealimentación de las vacas en el último tercio de la gestación no mejora el rendimiento de las crías hasta los 12 meses de edad.

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Agradecimientos Los autores manifiestan su gratitud al equipo de apoyo de profesores y estudiantes de grado y postgrado de las carreras de Agronomía, Medicina Veterinaria y Zootecnia por su asistencia en las actividades operativas que permitieron la ejecución de este trabajo. Declaración de conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses Literatura citada: 1. Gutiérrez V, Espasandín AC, Machado P, Bielli A, Genovese P, Carriquiry M. Effects of calf early nutrition on muscle fiber characteristics and gene expression. Livest Sci 2014;(167):4018-416. 2. Du M, Huang Y, Das AK, Duarte MS, Dodson MV, Zhu MJ. Manipulating mesenchymal progenitor cell differentiation to optimize performance and carcass value of beef cattle. J Anim Sci 2013;(91):1419-1427. 3. Du M, Wang B, Fu X, Yang Q, Zhu MJ. Fetal programming in meat production. Meat Sci 2015;(109):40-47. 4. Wilson TB, Faulkner DB, Shike DW. Influence of prepartum dietary on beef cow performance and calf growth and carcass characteristics. Livest Sci 2016;(184):2127. 5. Bohnert DW, Stalker LA, Nyman A, Falck SJ, Cooke RF. Late gestation suplementation of beff cows differing in body condition score: Effects on cow and calf performance. J Anim Sci 2013;(91):5485-5491. 6. Funston RN, Martin JL, Adams DC, Larson DM. Winter grazing system and supplementation of beef cows during late gestation influence heifer progeny. J Anim Sci 2010;(88):4094-4101. 7. Cushman RA, McNeel AK, Freetly HC. The impact of cow nutrient status during the second and third trimesters on age at puberty, antral follicle count, and fertility of daughters. Livest Sci 2014;(162):252-258. 8. Alvares, CA, Stape, JL, Sentelhas, PC, Gonçalves, JLM, Sparovek, G. KÖPPEN’S climate classification map for Brazil. Meteorologi Schezeit Schrift 2014;(22):211728. 9. NRC. National Research Council. Nutrient requirements of beef cattle. Oklahoma State University: Division of Agricultural Sciences and Natural Resources, Oklahoma, USA: National Academy Press; 1998.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.6039 Artículo

Establecimiento de gramíneas forrajeras tropicales en el bioma del Cerrado

Antonio Leandro Chaves Gurgel a* Gelson dos Santos Difante a Carolina Marques Costa a João Virgínio Emerenciano Neto b Gustavo Henrique Tonhão a Luís Carlos Vinhas Ítavo a Alexandre Menezes Dias a Iuri Mesquita Moraes Vilela a Vivian Garcia de Oliveira a Pâmella Cristina da Silva Lima a Andrey William Alce Miyake a

a

Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Avenida Senador Filinto Müler, 2443 - Pioneiros, 79074-460, Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil. b

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias. Macaíba, Rio Grande do Norte, Brasil.

* Autor de correspondencia: antonioleandro09@gmail.com

Resumen: Este estudio se llevó a cabo para evaluar el tiempo para el establecimiento de gramíneas forrajeras tropicales en el bioma del “Cerrado”, con base en rasgos morfogenéticos y estructurales. Se distribuyeron tres cultivares (Paiaguás, Ipyporã y Marandu) de Brachiaria brizantha (Sin. Urochloa brizantha) y dos cultivares (Quênia y Tamani) de 674


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Panicum maximum (Sin. Megathyrsus maximus) en un diseño de bloques al azar con cuatro repeticiones. Los rasgos morfogenéticos y estructurales del pasto se evaluaron desde el día 35 hasta el día 65 después de la siembra, a intervalos de siete días. La altura del dosel aumentó linealmente con el período de establecimiento, en todos los cultivares. En los cultivares de Megathyrsus, la densidad de macollos disminuyó a medida que avanzaba el período experimental, mientras que el número de macollos en los cultivares de Urochloa aumentó. Los cultivares Ipyporã y Marandu tuvieron las tasas más altas de aparición foliar. Las tasas de elongación foliar más bajas se presentaron en los cultivares Paiaguás, Ipyporã y Tamani, y las tasas de elongación más altas en el cv. Quênia. Como resultado, el cv. Quênia mostró los valores más altos de longitud foliar final (64.9 cm) y masa de lámina foliar (3,352.9 kg MS ha-1). La mayor tasa de senescencia del cv. Tamani (2.1 cm macollo-1 d-1) dio como resultado que el mayor porcentaje de material muerto (1,815.5 kg ha-1) se encontrara en la masa de forraje de este cultivar. Los cultivares Paiaguás, Marandu y Tamani se establecieron a los 44 d, mientras que los cv. Quênia e Ipyporã se establecieron a los 51 y 58 días después de la siembra, respectivamente, en el Cerrado brasileño. Palabras clave: Morfogénesis, Megathyrsus maximus, Pasto, Urochloa brizantha.

Recibido: 10/08/2021 Aceptado: 23/02/2022

Introducción Las plantas forrajeras son la principal fuente de alimento para los rumiantes en Brasil y contribuyen significativamente a la producción de alimentos. En el Bioma del Cerrado, región relevante para la ganadería brasileña, los géneros Urochloa brizantha y Megathyrsus maximus son los más utilizados debido a su alto potencial de rendimiento y adaptabilidad al clima tropical(1,2). Sin embargo, la mayoría de las áreas cultivadas están degradadas o en proceso de degradación, lo que ha constituido un obstáculo importante para la expansión e intensificación de la producción animal en los sistemas de pastoreo(3). El establecimiento adecuado de las especies forrajeras es fundamental para la perennidad y productividad de un pasto(4). La fase de establecimiento es un momento crítico en la formación de los pastos. A menudo, representa el comienzo del proceso de degradación o la implementación de un pasto perenne y productivo, dependiendo de la interacción entre el suelo, la planta y el clima. Prácticas eficientes de corrección y fertilización del suelo; la elección del período apropiado para la siembra del pasto; y el momento adecuado para el primer pastoreo son esenciales para asegurar la germinación y el crecimiento de la planta(5).

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Comprender la evolución de la estructura del pasto a lo largo del período de establecimiento permite mayor asertividad sobre el momento de realizar el primer pastoreo. Además, la comprensión de los cambios morfológicos y estructurales de los cultivares forrajeros cuando se someten a diferentes condiciones edafoclimáticas permite identificar sus mecanismos de adaptación al medio ambiente y ayuda a elegir aquellos cultivares con un establecimiento más vigoroso(6). En vista del escenario descrito anteriormente, este estudio se llevó a cabo para evaluar el tiempo para el establecimiento de gramíneas forrajeras tropicales en el Bioma del Cerrado con base en rasgos morfogenéticos y estructurales.

Material y métodos El experimento se realizó del 15 de diciembre de 2020 al 19 de febrero de 2021, en la granja Fazenda Escola, de la Universidad Federal de Mato Grosso do Sul, ubicada en el municipio de Terenos - MS, Brasil (20°26’31” S, 54°51’36” O, 437 msnm). El clima de la región se clasifica como sabana tropical lluviosa (subtipo Aw), caracterizado por la distribución estacional de las precipitaciones (Köppen). Los datos de temperatura se obtuvieron de la base de datos del INMET y los datos de precipitación (Figura 1) se registraron a partir de un pluviómetro instalado en el sitio del experimento. La precipitación acumulada durante el período experimental fue de 453 mm. Figura 1: Precipitación y temperaturas mínimas (Tmin) y máximas (Tmax) durante el período experimental

El suelo en el área experimental está clasificado como un oxisol rojo con una textura muy arcillosa(7). Antes de la siembra, se tomó una muestra de suelo de la capa de 0-20 cm para su análisis químico (Cuadro 1). Con base en estos resultados, la fertilización se realizó en la siembra con 70.0 kg ha-1 de P2O5 y 35 kg ha-1 de K2O.

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Cuadro 1: Características químicas del suelo en el área experimental, en la capa de 020 cm de profundidad 2+ 2+ + pH* Ca Mg K Al3+ H+Al SB CIC SAB MO P mg -3 5.9 -------------------------------cmolc dm ------------------------------- -----%----- dm-3 5.9 4.0 0.11 5.7 10.0 15.7 63.7 3.4 8.3 *pH en agua 1:2.5; SB: suma de bases (Ca + Mg + K); CIC= capacidad de intercambio catiónico a pH 7.0 [SB+(H+Al)]; SAB= saturación de bases [(SB/CIC) * 100]; MO= materia orgánica.

El diseño experimental fue uno de bloques al azar con cinco tratamientos y cuatro repeticiones. Los tratamientos consistieron en tres cultivares de Urochloa brizantha (Paiaguás, Ipyporã y Marandu) y dos cultivares de Megathyrsus maximus (Quênia y Tamani). El área experimental (3.14 ha) se dividió en cuatro bloques de 7,850 m2. Cada bloque estuvo compuesto por cinco parcelas de 1,570 m². El suelo se preparó mecánicamente con arado profundo y rastra niveladora de discos. La siembra se realizó al voleo el 15 de diciembre de 2020. La tasa de siembra se calculó según lo descrito por Dias-Filho(4), considerando un valor de semilla para el cultivo del 60 % para los cultivares de Urochloa brizantha y del 40 % para los cultivares de Megathyrsus maximus. Se utilizó una aplanadora para aumentar el contacto suelo-semilla. La evaluación abarcó cinco semanas, desde el día 30 hasta el día 65 después de la siembra. Los rasgos morfogenéticos y estructurales de los pastos se evaluaron a intervalos de siete días. La altura del dosel (cm) se midió en 15 puntos representativos por parcela experimental, utilizando una regla milimétrica. La altura del dosel en cada punto correspondió a la altura promedio de la curvatura de las hojas alrededor de la regla. La densidad de macollos (DM, macollos m-2) se evaluó en tres puntos por parcela experimental, contando todos los macollos dentro de un marco cuadrado de 0.50 × 0.50 m (0.25 m2). Los puntos de muestreo fueron fijos a lo largo del período experimental, marcados con estacas de madera. Los rasgos morfogenéticos y estructurales del dosel forrajero se evaluaron utilizando la técnica de marcaje de macollos. Se marcaron tres macollos por parcela experimental utilizando hilos de colores y se midieron semanalmente con una regla graduada en centímetros. Las alturas del pseudotallo y del macollo extendido y la longitud de cada hoja se midieron cada siete días para estimar las siguientes variables: tasa de aparición foliar (TAF, hojas macollo-1 día-1); filocrono (días hoja-1 macollo-1); tasa de elongación foliar (TEF, cm macollo-1 día-1); tasa de elongación del tallo (TET, cm macollo-1 día-1); longitud foliar final (LFF, cm macollo-1); tasa de senescencia foliar (TSF, cm macollo-1 día-1); número de hojas vivas (NHV, hojas macollo-1); y vida útil de la hoja (VUH, d), según lo propuesto por Lemaire y Chapman(8). El corte para determinar la masa de forraje y los componentes morfológicos ocurrió cuando el dosel interceptó el 95.0 ± 3.5 % de la luz incidente, 65 días después de la

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siembra. La luz interceptada por el dosel se estimó utilizando un analizador de dosel (PAR Ceptometer - 80 AccuPAR Linear PAR / LAI; DECAGON Devices), en 15 puntos al azar por unidad experimental. En cada punto se tomó una lectura en la parte superior del dosel forrajero y otra a 10 cm del suelo. Así, a los 65 d después de la siembra, la masa seca de forraje (MF, kg MS ha-1) cortando el forraje contenido dentro de tres cuadrados de 1 m² por parcela experimental. Las muestras se pesaron y se secaron en un horno de aire forzado a 55 °C hasta un peso constante y luego se pesaron nuevamente para determinar la masa seca de forraje. Para evaluar los componentes morfológicos del forraje, se extrajeron tres submuestras de las muestras recolectadas para determinar la MF. Estos se separaron en hoja (lámina de la hoja), tallo (tallo + vaina), material muerto y plantas indeseables. La relación hoja:tallo se calculó como la relación entre la masa seca de la lámina foliar (MLF, kg ha-1) y la masa del tallo (MT, kg ha-1). Los datos de altura del dosel, DM y NHV se sometieron a un análisis de varianza, considerando un diseño de bloques al azar con medidas repetidas en el tiempo. El efecto de los cultivares se asignó a la parcela, y los días después de la siembra (30, 37, 44, 51, 58 y 65 días) a la subparcela (mediciones repetidas en el tiempo). Se utilizó el siguiente modelo: Yijk= μ + Ci + Bj + αij + Dk + CDik + βijk, Donde: Yijk= valor observado en el cultivar i, bloque j y día k; μ= efecto de la media general; Ci= efecto del cultivar i; Bj= efecto del bloque j; αij: efecto del error aleatorio atribuido a la parcela; Dk= efecto del día k después de la siembra; CDik= efecto de la interacción entre cultivar y día; βijk= error aleatorio atribuido a la subparcela. Cuando fueron significativos según la prueba F, los cultivares se compararon mediante la prueba de Tukey a un nivel de significancia del 5 %, mientras que el efecto de los días después de la siembra se analizó utilizando ecuaciones de regresión. Las variables restantes fueron sometidas a análisis de varianza de acuerdo con el siguiente modelo: Yij= μ + Ci + Bj + αij, Donde: Yij= valor observado en el cultivar i y el bloque j; μ= efecto de la media general; Ci= efecto del cultivar i; Bj= efecto del bloque j; y αij= efecto del error aleatorio.

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Cuando fueron significativos según la prueba F, los efectos de los cultivares se analizaron mediante la prueba de Tukey con una significancia del 5 %. Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante el procedimiento MIXED, en SAS ver. 9.1.

Resultados La interacción cultivar por día después de la siembra fue significativa (P<0.05) para la altura del dosel, DM y NHV. La altura del dosel aumentó linealmente para todos los cultivares, con incrementos diarios estimados de 1.52, 0.95, 1.21, 2.53 y 1.01 cm para Paiaguás, Ipyporã, Marandu, Quênia y Tamani, respectivamente (Cuadro 2). El día 30 después de la siembra, el cultivar Quênia tuvo una altura mayor que el cultivar Ipyporã, pero no hubo diferencia entre los otros cultivares. El día 37, el cultivar Quênia presentó un dosel más alto que los cultivares Ipyporã y Paiaguás. En los otros períodos, el cultivar Quênia tuvo el dosel más grande, seguido de los cultivares Marandu, Paiaguás y Tamani. La densidad de macollos aumentó linealmente para los cultivares de Urochloa brizantha y disminuyó linealmente para los cultivares de Megathyrsus maximus durante el período de establecimiento. El aumento estimado en el número de macollos en Paiaguás, Ipyporã y Marandu fue de 10.2, 10.8 y 6.6 macollos m-2 día-1, respectivamente. En Quênia y Tamani, la población de macollos disminuyó en 5.09 y 29.67 macollos m-2 día-1, respectivamente. La DM a los 30, 37, 44 y 51 días después de la siembra fue mayor en el cultivar Tamani. Por otro lado, el día 58 después de la siembra, Tamani presentó una mayor DM que Ipyporã, Marandu y Quênia, sin diferencias entre los dos últimos y Paiaguás. Finalmente, el día 65, la DM de Tamani superior a la observada en Marandu y Quênia (Cuadro 3). Quênia mantuvo un NHV constante desde el comienzo del período de evaluación. En Marandu, hubo un incremento diario estimado de 0.05 hojas macollo-1. En los otros cultivares, el NHV ajustó una regresión lineal de segundo grado. Paiaguás e Ipyporã alcanzaron el máximo de NHV a los 42.5 y 47.0 d después de la siembra, respectivamente. Tamani alcanzó un NHV mínimo estimado a los 58.3 d. A los 30 días después de la siembra, no se observaron diferencias en el NHV entre cultivares. A los 37 días, se encontró una diferencia entre Paiaguás y Tamani. En los otros períodos (30, 44, 51, 58 y 65), los cultivares de Urochloa brizantha presentaron un mayor NHV (Cuadro 4). La vida útil de las hojas no difirió entre los cultivares (Cuadro 5). Ipyporã y Marandu mostraron mayor TAF que Tamani, mientras que Paiaguás y Quênia mostraron valores intermedios. El filocrono difirió entre Tamani e Ipyporã, que presentaron los valores más altos y más bajos, respectivamente, mientras que los cultivares Paiaguás, Marandu y Quênia presentaron valores intermedios. Las TEF más bajas se observaron en Paiaguás, Ipyporã y Tamani, y las más altas en Quênia, que a su vez estuvo por encima de Marandu. Como resultado, Quênia mostró la LFF más alta. Paiaguás y Quênia tuvieron la TET más

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alta. Por último, la TSF fue más alta en Quênia y más baja en Marandu, mientras que Paiaguás, Ipyporã y Tamani mostraron valores intermedios (Cuadro 5). La masa de forraje no difirió entre cultivares (Cuadro 6). Quênia produjo la mayor MLF, mientras que Paiaguás e Ipyporã mostraron la más baja, los otros mostraron valores intermedios. La masa del tallo fue mayor en Marandu y Quênia que en Ipyporã y Tamani. La MT de Paiaguás fue similar a los demás. El cultivar Tamani mostró la mayor masa de material muerto (MMM). La única diferencia para la masa de plantas indeseables (MPI) se encontró entre Paiaguás y Tamani, mientras que los pastos de Tamani no tuvieron MPI. La relación hoja/tallo más alta se presentó en Tamani, Ipyporã y Quênia.

Discusión El aumento lineal de la altura del dosel es consistente con el período de establecimiento (Cuadro 2), ya que cuando el forraje se encuentra en la fase inicial de crecimiento vegetativo, se observa un aumento en la altura promedio del césped a lo largo de los días, independientemente del cultivar(5,6). La altura recomendada para interrumpir el crecimiento es de alrededor de 30 cm para los cultivares de Brachiaria(9,10,11), 70 cm para Quênia(12) y 35 cm para Tamani(13). Paiaguás, Marandu y Tamani alcanzaron la altura recomendada para la interrupción del crecimiento el día 44 después de la siembra, mientras que Quênia e Ipyporã alcanzaron este valor a los 51 y 58 días, respectivamente. La alta población de macollos observada en todos los períodos de evaluación en Quênia y Tamani puede explicar en parte la reducción de la DM (Cuadro 3). Mayores poblaciones de macollos durante el crecimiento vegetativo de los pastos promueven una mayor competencia intraespecífica por la luz, reduciendo la cantidad y calidad de la luz que llega a la base del dosel(14), lo que resulta en la mortalidad de los macollos(15). Por lo tanto, el momento en que los cultivares alcanzaron la altura recomendada para detener su crecimiento sería el adecuado para realizar el primer pastoreo. El número de hojas vivas difirió entre los cultivares (Cuadro 4). En Paiaguás e Ipyporã, hubo un aumento en el NHV hasta que alcanzó su valor máximo, a los 42.5 y 47.0 días después de la siembra, respectivamente. A partir de ese momento, por cada nueva hoja que aparecía, otra comenzaba a morir. Sin embargo, el aumento lineal del NHV en el cv. Marandu indica que este cultivar no alcanzó el valor máximo durante su establecimiento. El NHV siempre más alto en los cultivares de Urochloa brizantha en comparación con los cultivares de Megathyrsus maximus se puede atribuir a su genética, ya que el número de hojas formadas en los cultivares de Urochloa brizantha es mayor que en las plantas de Megathyrsus maximus(5,6,16). Entre los cultivares de Megathyrsus maximus, Quênia mantuvo un NHV constante desde el comienzo del período de evaluación (30 días después de la siembra). Por otro lado, en el cv. Tamani, el NHV disminuyó hasta un valor mínimo que se presentó el día 58 después

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de la siembra. Posteriormente, hubo un aumento en el número de hojas por macollo. Este comportamiento se debió a la alta DM del cv. Tamani, que promovió un efecto compensatorio, ya que, los doseles con una DM alta tienen macollos más cortos, pero estos tienen tasas de crecimiento bajas y viceversa(17,18). Este mecanismo compensatorio se evidencia por las variables morfogenéticas evaluadas durante el período de establecimiento, ya que Tamani fue el que tuvo menos hojas, lo que a su vez aumentó el filocrono (Cuadro 3). Para los pastos tropicales en etapa vegetativa, la morfogénesis puede ser descrita por TAF, TEF, VUH(18) y TET(19). Estos rasgos están determinados genéticamente y, como tales, varían según el genotipo evaluado. Además, las variaciones en la morfogénesis determinan los rasgos estructurales del pasto(15,19). Por lo tanto, para una interpretación consistente de estas variables, se deben tener en cuenta las interacciones entre ellas. Las variaciones en la TEF reflejaron las diferencias morfológicas entre los cultivares, especialmente en la LFF, un rasgo estructural del dosel forrajero determinado genéticamente(18). Como lo describen Lemaire y Chapman(8), la TEF tiende a seguir el comportamiento de la LFF. Esta asociación se pudo observar en el cv. Quênia, que mostró los valores más altos tanto para la TEF como para la LFF (Cuadro 5). Marandu, Paiaguás y Quênia mostraron mayor elongación del tallo de todos porque estos cultivares son más altos (Cuadro 2), lo que evidencia la asociación entre la TET y la altura de cada cultivar(20). La mayor TSF observada en el cv. Quênia se puede atribuir a sus mayores tasas de aparición y elongación foliar. Con el crecimiento de nuevos tejidos, se espera un aumento de la tasa de senescencia de los tejidos más viejos, debido al proceso de renovación de la planta(18). El cultivar Marandu tuvo la TSF más baja, lo que se puede explicar porque este cultivar no alcanzó el máximo NHV (Cuadro 4), y la senescencia en las plantas forrajeras aumenta después de que ha surgido el máximo NHV(19). La MF similar entre los cultivares puede reflejar la correlación negativa entre la altura y la DM(21), lo que induce una compensación en la MF. El cultivar Quênia tuvo los valores más altos de tasa de aparición foliar, elongación foliar y LFF. Esta combinación de factores fue responsable de la MLF más alta que se presentó en este cultivar. La masa del tallo siguió la tendencia observada para la TET. Luna et al(16) reportaron un resultado similar, en el que la tasa de acumulación de tallos se comportó de manera similar a la TET, independientemente de la especie evaluada. La mayor contribución de MMM a la MF en el cv. Tamani fue el resultado de la alta TSF y mortalidad de macollos encontradas en este cultivar (Cuadros 3 y 4). Debido a su alta DM, es posible que Tamani hubiera alcanzado rápidamente el índice de área foliar crítico(22). Los aumentos posteriores en el índice de área foliar conducen a una reducción de la acumulación de hojas y al aumento de la mortalidad de hojas y macollos(23). Por otro

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lado, esta mayor competencia por la luz disminuyó el número de plantas indeseables en los pastos de Tamani. Estos hallazgos sugieren que todos los cultivares exhibieron un establecimiento vigoroso, dadas sus altas tasas de renovación de tejidos, lo que promovió cambios en los rasgos estructurales del pasto(24). Como consecuencia, se modificó la masa de forraje, la composición morfológica y la población de macollos.

Conclusiones e implicaciones Se encontró que, dependiendo de las características morfogenéticas y estructurales, el tiempo de establecimiento en el Bioma del Cerrado es de 44 días después de la siembra para los cultivares Paiaguás, Marandu y Tamani; y de 51 y 58 días después de la siembra para los cultivares Quênia e Ipyporã, respectivamente. Los rasgos morfogénicos están determinados genéticamente y, como tales, varían entre genotipos; además, las variaciones en la morfogénesis determinan las características estructurales del pasto. Evaluar de forma simultánea las variables morfogenéticas y estructurales permite observar la dinámica de emergencia y muerte de los tejidos tanto dentro de un macollo como para toda la población de macollos. Permitiendo así una mayor precisión en el momento ideal para detener el crecimiento de los pastos. Agradecimientos A la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) Código financiero 001. Gracias también al Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), a la Fundação de Apoio ao Desenvolvimento da Educação, Ciência e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul (FUNDECT) y a la Universidade Federal de Mato Grosso do Sul por su apoyo. Literatura citada: 1.

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Cuadro 2: Altura del dosel (cm) de gramíneas forrajeras tropicales en diferentes períodos de evaluación durante el establecimiento en el bioma brasileño del Cerrado Días después de la siembra Valor P Cultivar Ecuación de regresión R2 (%) 30 37 44 51 58 65 L C Paiaguás 12.1ab 16.0b 27.9b 40.1cb 47.2cb 60.3b 0.001 0.522 Y = -33.30 + 1.42x 98.5 b b b c c c Ipyporã 8.5 12.8 20.5 26.8 30.6 43.0 0.001 0.554 Y = -21.23 + 0.95x 97.6 ab ab b b b cb Marandu 17.6 24.8 33.4 44.2 51.5 58.6 0.001 0.896 Y = -19.09 + 1.21x 99.6 a a a Quênia 28.5 37.0 57.3ª 69.5ª 87.1ª 119.7 0.001 0.101 Y = -53.45 + 2.53x 96.5 ab ab b cb cb cb Tamani 19.5 24.1 35.8 40.1 42.5 57.1 0.001 0.765 Y = -11.56 + 1.01x 95.5 abc

L= lineal; C= cuadrático. Y es la variable dependiente y X es la variable independiente (días después de la siembra). Las letras minúsculas en la misma columna difieren entre sí según la prueba de Tukey (P<0.05); Error estándar de la media= 4.38.

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Cuadro 3: Densidad de macollos (macollos m-2) de gramíneas forrajeras tropicales en diferentes períodos de evaluación durante el establecimiento en el bioma brasileño del Cerrado Días después de la siembra Valor P Cultivar Ecuación de regresión R2 (%) 30 37 44 51 58 65 L C Paiaguás 210.0c 245.7c 318.0b 412.3b 487.0ab 546.0ab 0.001 0.821 Y = -114.50 + 10.20x 98.8 Ipyporã

166.0c

229.0c

314.0b

396.7b

445.7b

546.7ab

0.001

0.934

Y = -161.46 + 10.76x

99.5

Marandu

221.0c

257.7c

354.3b

422.7b

445.7b

417.7b

0.002

0.270

Y = 39.93 + 6.59x

84.5

Quênia

602.0b

583.6b

531.7b

435.0b

456.5b

448.2b

0.016

0.538

Y = 751.27 - 5.09x

83.3

Tamani

1534.4a

1605.0a

1617.3a

864.4a

737.2a

742.0a

0.001

0.136

Y = 2594.20 - 29.67x

77.3

abc

L= lineal; C= cuadrático. Y es la variable dependiente y X es la variable independiente (días después de la siembra). Las letras minúsculas en la misma columna difieren entre sí según la prueba de Tukey (P<0.05); Error estándar de la media= 63.92.

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Cuadro 4: Número de hojas vivas por macollo en gramíneas forrajeras tropicales en diferentes períodos de evaluación durante el establecimiento en el bioma brasileño del Cerrado Días después de la siembra Valor P Cultivar Ecuación de regresión R2 (%) 30 37 44 51 58 65 L C Paiaguás 5.3a 6.3a 7.5a 6.0a 5.1ab 5.7ab 0.227 0.002 Y= -1.26 + 0.34x - 0.004x2 39.0 Ipyporã

4.0a

5.6ab

6.6ab

6.1a

5.4ab

5.9ab

0.105

0.001

Y= -5.61 + 0.47x - 0.005x2

71.8

Marandu

4.9a

5.2ab

6.0ab

6.4a

6.6a

6.3a

0.001

0.117

Y= 3.61 + 0.05x

81.7

Quênia

4.5a

5.2ab

5.2b

4.3b

4.5b

4.5b

0.367

0.326

Y= 4.7

4.5a

Tamani

4.9a

4.5b

3.8c

2.8b

2.8c

3.5c

0.081

0.008

Y= 12.87 - 0.35x + 0.003x2

86.5

ab

L= lineal; C= cuadrático. Y es la variable dependiente y X es la variable independiente (días después de la siembra) Las letras minúsculas en la misma columna difieren entre sí según la prueba de Tukey (P<0.05), Error estándar de la media= 0.40.

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Cuadro 5: Rasgos estructurales y morfogenéticos de gramíneas forrajeras tropicales durante el período de establecimiento en el bioma brasileño del Cerrado Cultivar Variable EEM Valor P Paiaguás Ipyporã Marandu Quênia Tamani TAF, hojas macollo-1 día-1 0.16ab 0.18a 0.17a 0.15ab 0.13b 0.01 0.0181 Filocrono, días hoja-1 macollo-1

6.4ab

5.7b

5.8ab

6.9ab

8.1a

0.50

0.0355

TEF, cm macollo-1 día-1

5.4c

5.3c

7.8b

10.8a

5.4c

0.48

0.0001

TET, cm macollo-1 día-1

1.25a

0.52b

1.1a

1.0a

0.19b

0.08

0.0001

TSF, cm macollo-1 día-1

1.7ab

1.5ab

1.2b

2.5a

2.1ab

0.26

0.0312

LFF, cm

30.2b

29.1b

43.1b

64.9a

36.0b

3.50

0.0001

VUH, días

37.9

32.0

34.4

32.7

28.2

2.40

0.2026

TAF= tasa de aparición foliar; TEF= tasa de elongación foliar; TET= tasa de elongación del tallo; TSF= tasa de senescencia foliar; LFF= longitud foliar final; VUH= vida útil de la hoja; EEM= error estándar de la media. abc Las letras minúsculas en la misma fila difieren entre sí según la prueba de Tukey (P<0.05).

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Cuadro 6: Rasgos estructurales de gramíneas forrajeras tropicales durante el período de establecimiento en el bioma brasileño del Cerrado Cultivar Variable EEM Valor P Paiaguás Ipyporã Marandu Quênia Tamani MF, kg MS ha-1 5405.0 4736.5 5766.5 6884.8 6007.5 529.5 0.1554 MLF, kg MS ha-1

1654.6b

1962.7b

2533.1ab

3352.8a

2571.7ab

258.1

0.0131

MT, kg MS ha-1

1879.9ab

1427.1b

2345.7a

2429.6a

1619.3b

209.2

0.0353

MMM, kg MS ha-1

546.7b

449.2b

484.3b

839.4b

1816.5a

96.1

0.0001

MPI, kg MS ha-1

1444.9a

937.8ab

403.4ab

263.0ab

0.0b

279

0.0378

Relación hoja:tallo

0.9b

1.5a

1.1b

1.4a

1.59a

0.1

0.0436

MF= masa de forraje; MLF= masa de la lámina foliar; MT= masa del tallo; MMM= masa del material muerto; MPI= masa de plantas indeseables; EEM= error estándar de la media. ab Las letras minúsculas en la misma fila difieren entre sí según la prueba de Tukey (P<0.05).

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.5786 Artículo

Efectividad del clorhidrato de zilpaterol en la finalización de corderos: Patente vs. Genérico

Arnulfo Vicente Pérez a,b Leonel Avendaño-Reyes a Juan E. Guerra-Liera b Rubén Barajas Cruz b Ricardo Vicente-Pérez c M. Ángeles López-Baca a Miguel A. Gastelum Delgado b Alfonso J. Chay-Canul d Ulises Macías-Cruz a*

a

Universidad Autónoma de Baja California. Instituto de Ciencias Agrícolas, 21705, Valle de Mexicali, BC., México. b

Universidad Autónoma de Sinaloa. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Culiacán, Sinaloa, México. c

Universidad de Guadalajara. CUCSUR-Departamento de Producción Agrícola, Autlán de Navarro, Jalisco, México. d

Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. División Académica de Ciencias Agropecuarias, Villahermosa, Tabasco, México.

*Autor de correspondencia: ulisesmacias1988@hotmail.com, umacias@uabc.edu.mx

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Resumen: El objetivo del estudio fue comparar el efecto de la fuente del clorhidrato de zilpaterol (CZ; patente vs genérico) sobre el comportamiento productivo, características de la canal, rendimientos de cortes primarios y calidad de la carne de corderos finalizados en corral. Se distribuyeron 30 corderos Dorper ×Pelibuey en 10 bloques donde cada bloque tenía tres corderos de similar peso vivo inicial, los cuales se asignaron aleatoriamente a los siguientes tratamientos: 1) sin CZ (testigo), 2) con CZ de patente (CZP), y 3) con CZ genérico (CZG). Las medias de tratamientos se compararon a través de dos contrastes ortogonales: testigo vs. CZ (CZP+CZG) y CZP vs. CZG. El CZ no afectó (P≥0.15) el comportamiento productivo, peso de la canal, espesor de grasa dorsal, ni los porcentajes de grasa (riñón-corazón-pelvis, mesentérica u omental), pero aumentó (P≤0.05) el área del músculo Longissimus dorsi y los rendimientos de canal, paleta, pierna y lomo plano. En calidad de la carne, el CZ no afectó (P≥0.24) el pH y esfuerzo al corte, pero redujo (P<0.05) los valores de color rojizo, amarillento y chroma a las 24 h post mortem, y también los valores de rojizo (P<0.01) a los 14 días de maduración. Con excepción del rendimiento en canal que tendió (P=0.07) a ser mayor con CZP, todas las variables medidas fueron similares (P0.14) entre CZP y CZG. Se concluye que ambos tipos de CZ a una dosis de 0.10 mg/kg de peso vivo promueven hipertrofia muscular en corderos de finalización, pero no es suficiente para reflejarse en mejor comportamiento productivo y peso de la canal. Palabras clave: Agonistas adrenérgicos, Calidad de carne, Características de canal, Ovinos de pelo.

Recibido: 29/08/2020 Aceptado: 13/07/2021

Introducción La oferta de carne ovina en México es inferior a su demanda (~30 %) y, en consecuencia, la industria cárnica ovina está en la búsqueda constante de estrategias de bajo costo que ayuden a incrementar la eficiencia alimenticia y la ganancia de peso(1). En las últimas dos décadas, diversos estudios han mostrado que el clorhidrato de zilpaterol (CZ) es un promotor de crecimiento efectivo en la finalización de corderos en corral, ya que mejora la eficiencia alimenticia, la tasa de crecimiento, el peso y el rendimiento de la canal, así como el área del músculo Longissimus dorsi; también reduce la deposición de grasa interna y externa en el cuerpo(2–5). Sin embargo, la adición dietaria de CZ promueve algunos efectos detrimentales

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en la calidad de la carne ovina, específicamente mantiene el pH final alto causando una decoloración y un aumento en su dureza(6,7). A pesar de que la mayoría de los resultados han sido positivos con el uso de CZ en la engorda intensiva de corderos, este producto tiene un costo elevado y los productores han mostrado cierta resistencia en adoptar el uso de CZ en dietas para borregos. Una vez que caducó la patente de CZ, diferentes empresas farmacéuticas comenzaron a producir CZ genérico y actualmente lo comercializan a un precio que es hasta 23 % más bajo comparado con el CZ de patente. Recientemente, en estudios conducidos en corderos(8) y toros(9), se comprobó que el CZ de patente y el CZ genérico Grofactor® tienen una efectividad similar como promotores de crecimiento usando la dosis recomendada de la etiqueta (0.15 mg/kg de peso vivo [PV]). Por su parte, Avendaño-Reyes et al(10) demostraron que la dosis óptima de este CZ genérico para corderos de pelo finalizados en corral es inferior (0.10 mg/kg de PV) a la recomendada en la etiqueta de todas las marcas de CZ (0.15 mg/kg de PV). Basado en lo anterior, el CZ genérico Grofactor® podría ser usado para reducir los costos por el uso de esta tecnología, ya que tiene menor precio en el mercado y se requiere menos dosis (33.3 %) que la señalada para CZ de patente(11). A pesar de los antecedentes que ya se tienen con relación en la efectividad del CZ genérico en la finalización de corderos, se requiere comprobar si dicha efectividad del CZ genérico es comparable a la del CZ patentado a una dosis de 0.10 mg/kg de PV. Cabe mencionar que la molécula de CZ en este genérico es bioequivalente a la molécula de CZ de patente, pero difiere en la forma como está fijada en el vehículo, lo cual podría reducir su biodisponibilidad y modo de acción(10). Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue comparar el efecto de la fuente del CZ (patente vs genérico) a una dosis diaria de 0.10 mg/kg de PV sobre el comportamiento productivo, características de la canal, rendimiento de cortes primarios y calidad de la carne en corderos de pelo finalizados en corral.

Material y métodos Localización del experimento Todos los procedimientos de manejo y cuidado de los animales fueron realizados conforme a las Normas Oficiales Mexicanas NOM-051-ZOO-1995 (Cuidado humanitario de los animales durante su movilización) y NOM-033-ZOO-1995 (Sacrificio de animales domésticos y salvajes). El estudio se realizó durante la época de primavera en la unidad experimental ovina del Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma de Baja California, localizada en el Valle de Mexicali, Baja California, México (32.8o N, 114.6o O).

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Animales y manejo experimental Se utilizaron 30 corderos enteros de la cruza F1 Dorper × Pelibuey (PV inicial= 36.9 ± 6.9 kg y edad= 5 meses), los cuales se adaptaron a corraletas individuales y a una dieta basal (Cuadro 1) durante los 20 días previos al inicio del experimento. Los animales recibieron dos inyecciones al inicio del periodo de adaptación, una intramuscular para administrar 1.0 ml de vitaminas (Vigantol ADE Fuerte; Bayer, Ciudad de México, México) y la otra subcutánea para aplicar 0.5 ml de ivermectina (Laboratorio Sanfer, Ciudad de México, México). Las corraletas estaban provistas de comedero, bebedero y sombra. La dieta basal se formuló para una ganancia diaria de peso de 300 g en corderos de engorda en etapa de finalización (2.8 Mcal de energía metabolizable/kg de materia seca [MS] y 16 % de proteína cruda)(12). Se tomaron muestras de alimento semanalmente y al final del periodo experimental se juntaron para obtener dos submuestras, las cuales se analizaron para la determinación de su composición química(13,14,15). En general, tanto en el periodo de adaptación como en el experimental, la dieta se ofreció dos veces por día (0700 y 1800 h) garantizando un rechazo diario de al menos del 10 %, mientras que la disponibilidad del agua fue ad libitum. Cuadro 1: Ingredientes y composición química de la dieta experimental Ingredientes (%)* Composición química (% de MS) Heno de alfalfa 17.5 Materia seca Paja de trigo 11.0 Materia orgánica Grano de trigo molido 60.0 Proteína cruda Harina de soya 7.0 Extracto etéreo Aceite de soya 2.0 Fibra detergente neutro Piedra caliza 1.0 Fibra detergente acido Fosfato dicálcico 1.0 Cenizas Sal común 0.5 Calcio Fósforo Energía metabolizable, Mcal/kg

94.2 92.9 15.1 4.2 17.9 10.1 7.1 0.87 0.54 2.9

* La cantidad de cada ingrediente es en base húmeda. MS= materia seca.

Diseño experimental Se realizó una prueba de comportamiento productivo que duró 32 días después de finalizado el periodo de adaptación. El primer día de la prueba se pesaron individualmente todos los corderos en ayunas (12 h sin alimento y agua) para agruparlos en 10 bloques donde cada bloque tenía tres corderos con PV iniciales similares (factor de bloqueo). Los corderos de cada bloque se asignaron aleatoriamente a los tratamientos, los cuales consistieron en ofrecer una dieta base adicionada con: 1) 0 mg de CZ /kg de PV (testigo), 2) 0.10 mg de CZ patentado/kg de PV del producto Zilmax® (Intervet, Ciudad de México, México; CZP), y 3)

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0.10 mg de CZ genérico/kg de PV del producto Grofactor® (Virbac México, Guadalajara, México; CZG). Todos los corderos se pesaron individualmente cada 10 días para ajustar la cantidad de CZ en los tratamientos CZP y CZG. La dosis diaria del producto se mezcló en 30 g de grano de trigo molido y se ofreció por la mañana antes de servir la dieta basal. Al grupo testigo se le ofreció 30 g de trigo molido al mismo tiempo que se hizo en los grupos de CZP y CZG. Durante la prueba de comportamiento, los tratamientos se ofrecieron durante los primeros 30 días y los dos días finales se usaron como periodo retiro. Posteriormente, los corderos en ayunas se trasladaron al taller de carnes (ubicado a 200 m de los corrales), donde se sacrificaron por el método de degüelle.

Comportamiento productivo Las variables evaluadas para comportamiento productivo fueron el PV inicial y final (kg), ganancia diaria promedio (GDP= GPT/32; kg/día/animal), ganancia de peso total (GPT= PV final – PV inicial; kg/periodo), consumo diario de materia seca (CMS= kilogramos de alimento consumido en fresco × [% MS/100], kg/animal) y eficiencia alimenticia (GDP/CMS). En ayunas, se registró el PV individual al día 1 (inicial) y 33 (final) de la prueba en corral, y con estos datos se calculó la GDP y GPT.

Despojos del cuerpo y características de la canal La evaluación de los despojos y las características de la canal se realizó como lo describe Avendaño-Reyes et al(10). Después del sacrificio, los cuerpos fueron eviscerados y se registró el peso de cada órgano, vísceras y desechos de la canal (piel, cabeza, patas, testículos, sangre, corazón, hígado, riñón, pulmón, bazo, tracto gastrointestinal lleno y vacío, rumen, intestinos, y las grasas omental, mesentérica, así como la que rodea a los riñones, cavidad pélvica y corazón [KPH]). El contenido del tracto gastrointestinal se calculó por diferencia entre el peso del tracto gastrointestinal lleno y vacío, mientras que el PV vacío se calculó restándole el peso del contenido del tracto gastrointestinal al PV final. Así, todos los pesos de órganos, vísceras y desechos del cuerpo se expresaron como un porcentaje del PV vacío. También se pesó la canal caliente (PCC) y luego se enfrió a 4 ºC por 24 h para registrar el peso de la canal fría (PCF), así como la conformación, largo de canal, profundidad del tórax, largo y circunferencia de pierna, área del músculo Longissimus dorsi (MLD) y espesor de grasa dorsal. La conformación se determinó en una escala de 8 puntos considerando 1 como mala y 8 como excelente(16). Las medidas morfométricas de la canal se hicieron con una cinta flexible(17). El área del MLD y el espesor de la grasa dorsal se midieron entre la 12.a y 13.a costilla por lo que se realizó un corte perpendicular sobre el lomo a esta altura. El área del MLD se midió con una plantilla de puntos cuadriculada (64 mm2), mientras que el espesor

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de grasa dorsal con un vernier. Finalmente, se calculó el rendimiento en canal expresando el PCC como un porcentaje del PV vacío.

Rendimiento de cortes primarios Las canales se cortaron a lo largo de la línea media, posteriormente las medias canales derechas se seccionaron en los siguientes cortes primarios(18): tren posterior, tren inferior, cuello, paleta, costillas, lomo, lomo plano, pierna y faldilla. La media canal derecha se pesó, así como cada uno de los cortes y posteriormente se calculó el rendimiento de cada corte expresando su peso como un porcentaje del peso de la media canal.

Calidad de la carne La calidad de la carne se evaluó en el MLD. Un electrodo de penetración conectado (modelo PHW57-SS, HACH, Colorado, USA) a un medidor de pH (modelo H160G, HACH, Colorado, USA) se introdujo en el lomo de la canal, entre la 12.a y 13.a costilla, para registrar el pH a los 45 min y 24 h post mortem. Posteriormente, el MLD se diseccionó a partir del corte primario lomo y se midieron los parámetros de color (a* [rojizo], b* [amarillento], L* [luminosidad], C* [índice de saturación de color] y h* [ángulo de matiz]) a las 24 h post mortem, usando un colorímetro portátil (modelo SP60, X-rite, Michigan, USA). Finalmente, el MLD se empaquetó al vacío y se mantuvo en un refrigerador a 4 ºC durante 14 días para posteriormente medir el pH y los parámetros de color nuevamente, así como el esfuerzo al corte en carne madurada. Pasado el tiempo de maduración, el MLD se desempaquetó y se oxigenó durante 30 min antes de hacer las mediciones. El pH se midió en una mezcla homogeneizada de 5 g de carne y 25 ml de agua destilada usando un potenciómetro para líquidos (modelo HI-2210, Hanna Instruments Digital, Woonsocker, Rhode Island). Los parámetros de color se midieron siguiendo la misma metodología descrita previamente en la evaluación a las 24 h post mortem. Las mediciones de color se realizaron por triplicado y al final se calculó y registró el promedio para cada parámetro. Para el esfuerzo al corte, dos bistecs del MLD (2.5 cm de grosor) se cocieron en una parrilla eléctrica hasta que alcanzaron una temperatura interna de 71 °C. Posteriormente, los bistecs se dejaron enfriar a temperatura ambiente (~25 ºC) y se obtuvieron cinco prismas de 1.27 cm de diámetro, en los cuales se midió el esfuerzo al corte con un equipo de Warner-Bratzler (Salter 235, Manhattan, KS, USA). El esfuerzo al corte por muestra se registró promediando los tres valores más homogéneos (< 5 % de coeficiente de variación).

Análisis estadístico Todos los datos se analizaron con el procedimiento ANOVA del paquete estadístico SAS(19), usando un modelo estadístico de un diseño experimental en bloque completo aleatorizado.

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El modelo incluyó al PV inicial como el factor de bloqueo y el tipo de CZ como tratamiento. Las medias se compararon a través de dos contrastes ortogonales, declarando diferencias a P≤0.05 y tendencias a 0.05>P≤1.0. El primer contraste comparó al grupo testigo con la aplicación de cualquier fuente de CZ (C1: testigo vs CZP+CZG) y el segundo contraste comparó la fuente del CZ (C2: CZP vs ZG).

Resultados Testigo versus clorhidrato de zilpaterol Independientemente de la fuente de CZ, la adición de este agonista adrenérgico β2 (AA-β2) en la dieta no afectó (P≥0.15) el comportamiento productivo de los animales (Cuadro 2). En la canal, el CZ aumentó su rendimiento (P≤0.01) y el área del MLD (P≤0.05), asimismo tendió (P=0.09) a mejorar la conformación de la canal, pero no afectó (P≥0.28) el PCC, PCF, medidas morfométricas de la canal o cualquier variable asociada con la deposición de grasa interna y externa (Cuadro 3). En el rendimiento de los cortes primarios, el CZ aumentó (P≤0.03) el rendimiento del tren posterior, pierna y lomo plano, pero redujo (P≤0.01) el rendimiento del tren anterior y de la paleta, sin afectar (P≥0.27) ninguno de los otros cortes primarios (Cuadro 4). Cuadro 2: Comportamiento productivo de corderos alimentados con clorhidrato de zilpaterol de patente (CZP) o genérico (CZG) Tratamientos Contrastes* Variables (kg) Testigo CZG CZP EE C1 C2 Peso inicial 36.9 36.8 36.9 2.19 0.98 0.96 Peso final 46.1 46.6 46.8 2.58 0.85 0.96 Ganancia de peso total 9.18 9.80 9.85 0.69 0.45 0.96 Ganancia diaria de peso 0.30 0.31 0.31 0.02 0.32 0.96 Consumo diario de MS 1.59 1.51 1.56 0.06 0.26 0.62 Eficiencia alimenticia 0.18 0.20 0.20 0.01 0.15 0.28 * C1: testigo vs. CZP+CZG; C2= CZP vs. CZG. EE= error estándar; MS= materia seca.

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Cuadro 3: Características de la canal en corderos alimentados con clorhidrato de zilpaterol de patente (CZP) o genérico (CZG) Tratamiento Contrastes* Variables Testigo CZG CZP EE C1 C2 Peso de canal caliente, kg 22.00 22.59 23.52 1.32 0.51 0.62 Peso de canal fría, kg 21.82 22.42 23.36 1.31 0.51 0.61 Rendimiento en canal, % 53.67 54.63 55.87 0.46 0.01 0.07 2 Área del MLD, cm 13.42 15.69 16.88 1.19 0.05 0.48 Conformación 6.17 6.40 6.80 0.20 0.09 0.17 Largo canal, cm 55.15 54.82 54.58 0.92 0.69 0.85 Largo pierna, cm 36.20 34.90 36.15 0.58 0.35 0.14 Perímetro pierna, cm 47.23 49.91 47.97 2.04 0.50 0.50 Profundidad del tórax, cm 15.85 15.38 15.48 0.33 0.30 0.83 Espesor de grasa dorsal, mm 1.15 1.15 1.10 0.16 0.90 0.83 Grasa omental, % 2.08 2.32 2.27 0.23 0.46 0.90 Grasa mesentérica, % 1.87 1.85 1.66 0.16 0.36 0.21 Grasa KPH, % 1.49 1.74 1.62 0.14 0.28 0.55 * C1= testigo vs. CZP+CZG; C2= CZP vs. CZG. EE= error estándar; MLD= músculo Longissimus dorsi; Grasa KPH= La suma de grasas localizadas alrededor del riñón, corazón y cavidad pélvica.

Cuadro 4: Rendimiento de cortes primarios en corderos alimentados con clorhidrato de zilpaterol de patente (CZP) o genérico (CZG) Tratamiento Contrastes** Variables*, % Testigo CZG CZP EE C1 C2 Tren anterior 54.59 53.04 52.50 0.39 <0.01 0.34 Cuello 4.06 4.07 3.93 0.25 0.83 0.68 Costilla 9.72 9.83 9.71 0.27 0.88 0.73 Lomo 9.70 10.2 9.95 0.25 0.27 0.54 Paleta 31.0 28.9 29.9 0.67 0.01 0.96 Tren posterior 45.4 47.0 47.4 0.39 <0.01 0.34 Pierna 31.3 32.5 32.6 0.47 0.03 0.90 Lomo plano 8.80 9.35 9.47 0.22 0.03 0.70 Faldilla 5.25 5.00 5.34 0.38 0.85 0.54 * Los rendimientos se calcularon expresando el peso de cada corte como porcentaje del peso de la media canal. ** C1= testigo vs. CZP+CZG; C2= CZP vs. CZG. EE= error estándar.

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En los despojos del cuerpo (pesos expresados como porcentaje del PV vacío), la adición dietaria de CZ disminuyó (P≤0.05) los pesos de piel, hígado, riñón, bazo y rumen, y también tendió (P=0.06) a disminuir el peso de las patas (Cuadro 5). El peso de los otros despojos no varió (P≥0.12) con la inclusión de CZ. En el caso de calidad de la carne, el CZ no afectó (P≥0.23) el pH post mortem en ninguno de los tiempos (45 min, 24 h y 14 d), pero redujo (P≤0.01) los valores de a* y C*, y tendió (P=0.07) a disminuir los valores de b* a las 24 h (Cuadro 6). A los 14 días de maduración post mortem, la inclusión dietaria de CZ redujo (P<0.01) los valores de a* y aumentó (P=0.05) los valores h*, sin encontrarse efectos (P=0.95) sobre el esfuerzo al corte. Los valores de L* no fueron afectado (P≥0.65) por CZ en ninguno de los tiempos evaluados. Cuadro 5: Porcentaje de los despojos en corderos alimentados con clorhidrato de zilpaterol de patente (CZP) o genérico (CZG) Tratamiento Contrastes** Variables*, % Testigo CZG CZP EE C1 C2 Sangre 4.55 4.38 4.29 0.13 0.18 0.61 Patas 2.44 2.25 2.33 0.06 0.06 0.35 Cabeza 5.61 5.68 5.71 0.16 0.69 0.88 Piel 9.69 8.99 8.68 0.24 <0.01 0.37 Corazón 0.48 0.45 0.45 0.01 0.19 0.79 Hígado 2.33 2.17 2.06 0.06 0.01 0.24 Riñón 0.30 0.27 0.28 0.01 0.03 0.64 Pulmón 1.81 1.95 1.85 0.10 0.52 0.51 Bazo 0.22 0.17 0.18 0.01 0.01 0.66 Rumen 3.41 3.22 3.13 0.09 0.05 0.52 Intestino 3.22 2.84 2.90 0.17 0.12 0.81 Testículos 1.53 1.51 1.57 0.07 0.93 0.54 * Los pesos de cada órgano o víscera se expresaron como porcentaje del peso vivo vacío. ** C1= testigo vs. CZP+CZG; C2= CZP vs. CZG. EE= error estándar.

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Cuadro 6: Calidad de la carne en corderos alimentados con clorhidrato de zilpaterol de patente (CZP) o genérico (CZG) Tratamiento Contrastes** Variables Testigo CZG CZP EE C1 C2 pH45 min 6.54 6.59 6.57 0.05 0.60 0.82 Evaluación a 24 h post mortem pH 5.83 5.93 5.92 0.06 0.24 0.88 L* 39.1 37.7 38.9 1.30 0.65 0.51 a* 10.3 8.17 9.01 0.44 <0.01 0.19 b* 9.51 8.46 8.82 0.38 0.07 0.51 C* 13.7 12.0 12.6 0.43 0.01 0.34 h* 43.8 44.3 44.4 1.33 0.76 0.92 Evaluación a 14 días post mortem pH 5.83 5.95 5.98 0.08 0.23 0.81 2 Esfuerzo al corte, kg/cm 2.04 1.87 2.25 0.24 0.95 0.28 L* 41.2 42.5 41.1 1.20 0.70 0.39 a* 9.15 7.76 7.98 0.36 <0.01 0.66 b* 10.26 9.74 9.19 0.50 0.21 0.45 C* 13.8 12.5 13.2 0.56 0.18 0.39 h* 45.9 51.3 49.5 1.66 0.05 0.45 ** C1= testigo vs CZP+CZG; C2= CZP vs CZG. EE= error estándar; L*= Luminosidad, a*= rojizo, b*= amarillento, C*= chroma y h*= ángulo hue.

Clorhidrato de zilpaterol de patente versus genérico El comportamiento productivo (Cuadro 2), las características de la canal (excepto rendimiento en canal; Cuadro 3), el rendimiento de cortes primarios (Cuadro 4), el peso de los despojos expresado como porcentaje del PV vacío (Cuadro 5) y la calidad de la carne (Cuadro 6), no variaron (P≥0.23) entre CZP and CZG. La adición de CZP en la dieta tendió a incrementar (P = 0.07) el rendimiento en canal con respecto al CZG.

Discusión Testigo versus clorhidrato de zilpaterol La adición de CZ en la dieta de finalización no mejoró el comportamiento productivo y el peso de la canal en los corderos de pelo. Estos resultados no se esperaban, ya que la mayoría de estudios en los que han incluido este AA-β2 reportan mayor GDP, eficiencia alimenticia, PCC y PCF con efectos poco consistentes en el CMS(4,5,8,18,20-22). Podría pensarse que haber administrado una dosis por debajo (0.10 vs 0.15 mg/kg de PV) de lo recomendado por la

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empresa es la causa de dicha falta de efectos, ya que la mayoría de esos estudios donde reportan mejoras adicionaron el producto de acuerdo con las indicaciones de la etiqueta. Sin embargo, en un estudio previo se demostró que 0.10 mg de CZ/kg de PV es una dosis óptima para corderos finalizados en corral usando este tipo de CZ genérico(10). Cabe mencionar que los trabajos en los que el CZ mejoró el comportamiento productivo y el peso de la canal, el grupo testigo mostró una GDP inferior (168-280 g/día) a la encontrada en el presente estudio (300 g). Por lo tanto, los resultados de comportamiento productivo y peso de la canal podrían deberse a que los corderos expresaron su máximo potencial genético para crecimiento sin necesidad del promotor, y entonces, el CZ tuvo un margen limitado para ejercer sus efectos positivos en la ganancia de PV y sobre la canal. La literatura señala que los corderos de pelo tienen una GDP de alrededor de 250 g/día(23), es decir, 50 g menos que la observada en los corderos testigo de este estudio que también son ovinos de pelo. Acorde a este hallazgo, Mersmann(24) menciona que la efectividad de los AA-β2 para mejorar la ganancia de masa corporal puede limitarse por el potencial genético del animal. Si bien el CZ no afectó la ganancia de PV y el peso de la canal de los corderos, sí mostró mejorar el rendimiento en canal, área del MLD y rendimiento de algunos cortes primarios (i.e., pierna y lomo plano). Esto sugiere que el AA-β2 promovió hipertrofia muscular y, consecuentemente, un incremento en la deposición de masa muscular, pero en forma limitada. El aumento en el rendimiento en canal podría ser el reflejo de la mayor deposición de masa muscular en regiones corporales como el lomo plano y las piernas. Estos hallazgos coinciden con los resultados de otros estudios(5,10), aunque en esos trabajos el efecto fue más marcado. Esto apoya más la idea de que factores externos fueron más importantes que el mismo CZ para que los corderos expresaran su máximo potencial genético de crecimiento, limitando el mecanismo de acción del AA-β2(24). La inclusión de CZ también mostró no afectar la deposición de grasa interna y externa del cuerpo, pero redujo el peso de varios despojos de la canal (piel, hígado, riñón, bazo, rumen y patas). Así que la hipertrofia muscular observada en el lomo y las piernas de los corderos se debió a que el AA-β2 promovió una redistribución de nutrientes a partir de los tejidos de despojo hacia la formación de músculo esquelético, tal como previamente había sido reportado con la adición de CZ genérico(8,10,22). Por otra parte, la alimentación de corderos con CZ se ha asociado principalmente con un aumento en el pH de la carne, lo cual causa una disminución en los valores de color y un aumento en la dureza de la carne(6,7,22). No obstante, también hay evidencia de que CZ disminuye los valores de color aun con pH normal(25). En el presente estudio, el CZ no afectó los pH post mortem (45 min, 24 h y 14 días) y esto podría explicar parcialmente porque la fuerza al corte y la luminosidad de la carne no cambiaron con la inclusión dietaria de este AA-β2. Dado los resultados de pH, inesperadamente la carne del tratamiento CZ se decoloró sin perder luminosidad a las 24 h post mortem y este efecto persistió en menor grado después 700


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de madurar la carne 14 días. Si bien, el pH a 24 h y 14 d post mortem no cambió estadísticamente, los valores de pH en la carne de CZ (>5.9) se mantuvieron por arriba del rango normal (≤5.8)(26). Esto pudo causar un aumento en la respiración mitocondrial de las fibras oxidativas y una mayor competencia por el oxígeno con la oximioglobina, lo cual provocó un aumento en las concentraciones de desoximioglobina y metamioglobina, pigmentos que favorecen la decoloración de la carne(27).

Clorhidrato de zilpaterol de patente versus genérico Los corderos tratados con CZP y CZG no mostraron diferencias en su comportamiento productivo, características de la canal, rendimiento de cortes primarios y calidad de la carne, sugiriendo similar efectividad de ambas moléculas como promotor de crecimiento a una dosis diaria de 0.10 mg/kg de PV en este tipo de animales. Aunque este hallazgo debe tomarse con precaución, ya que previamente se indicó que la adición de CZ de patente y genérico en la dieta de los corderos promovió hipertrofia muscular, pero no a un nivel suficiente para reflejarse en mayor GDP, eficiencia alimenticia y peso de la canal. No obstante, se rescata el hecho que el CZ genérico a la dosis usada promueve hipertrofia muscular equiparable a la observada con CZ de patente en corderos de engorda en etapa de finalización. Esto podría deberse a que ambos productos tienen similar bioequivalencia, quilaridad y determinación isomerica(9). Aunque, ellos difieren en la forma como están fijados al vehículo (olote molido), ya que la molécula de CZ de patente está adherida alrededor de los gránulos del vehículo y la molécula de CZ genérico no se encuentra adherida al vehículo(10). Esto último podría reducir la biodisponibilidad y, en consecuencia, la efectividad del producto. Los resultados del este estudio sugieren que la forma como está fijada la molécula en cada producto, no es un factor que disminuya o potencialice el funcionamiento del CZ en el crecimiento en los corderos de pelo finalizados en corral. Al igual que en este estudio, otros autores(8) no encontraron diferencias en el comportamiento productivo, las características de la canal, el rendimiento de cortes de venta ni el peso de órganos entre corderos alimentados con CZ de patente y genéricos. Por otro lado, la fuente del CZ tampoco afectó el crecimiento, las características de la canal y la calidad de la carne en toros(9). Un punto a destacar es el hecho de que ninguna fuente de CZ promovió lipolisis para ejercer los efectos hipertróficos del músculo esquelético(25). Esto ya se había documentado con el uso del CZ genérico(8,10,22); sin embargo, el uso del CZ de patente regularmente había causado un efecto lipolítico en ovinos de engorda(4,20,28). Por lo tanto, esto sugiere que el mecanismo de acción lipolítico asociado al CZ de patente es dependiente de la dosis, ya que en los estudios previos usaron dosis de 0.15 mg/kg de PV y en este estudio se usó 33.3 % menos

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dosis. No obstante, se requieren hacer más investigación al respecto para confirmar este hallazgo.

Conclusiones e implicaciones Se concluye que la adición diaria de 0.10 mg/kg de PV de CZ de patente o genérico en la dieta de finalización de corderos de pelo promueve sustancialmente hipertrofia muscular en el lomo y las piernas, lo cual se refleja en mayor rendimiento en canal, pero no en mejor crecimiento, eficiencia alimenticia, peso de la canal y color de la carne. Finalmente, se recomienda continuar haciendo más estudios usando otras dosis del AA-β2 y genotipos de corderos para definir si el CZ genérico tiene la misma efectividad del CZ de patente para funcionar como promotor de crecimiento. Agradecimientos Los autores agradecen al Cuerpo Académico de Fisiología y Genética Animal del Instituto de Ciencias Agrícolas por apoyar en la realización de esta investigación, ya que financiaron y condujeron todo el estudio en sus instalaciones. Se agradece a los alumnos del posgrado (Erick Gómez Aranda, Ricardo Vicente Pérez, Yolanda Osorio Marín y Arnulfo Vicente Pérez) y técnicos del laboratorio que ayudaron a realizar toda la fase de campo. El primer autor también agradece al Conacyt por la beca otorgada para realizar sus estudios de doctorado. Literatura citada: 1. Hernández-Marín JA, Valencia-Posadas M, Ruíz-Nieto JE, Mireles-Arriaga AI, CortezRomero C, Gallegos-Sánchez J. Contribución de la ovinocultura al sector pecuario en México. Agroproductividad 2017;10(3):87-93. 2. Macías-Cruz U, Álvarez-Valenzuela FD, Torrentera-Olivera NG, Velázquez-Morales JV, Correa-Calderón A, Robinson PH, et al. Effect of zilpaterol hydrochloride on feedlot performance and carcass characteristics of ewe lambs during heat-stress conditions. Anim Prod Sci 2010;50(10):983. 3. Ríos Rincón FG, Barreras-Serrano A, Estrada-Angulo A, Obregón JF, Plascencia-Jorquera A, Portillo-Loera JJ, et al. Effect of level of dietary zilpaterol hydrochloride (β 2agonist) on performance, carcass characteristics and visceral organ mass in hairy lambs fed all-concentrate diets. J Appl Anim Res 2010;38(1):33-38.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.6022 Artículo

Disponibilidad de forraje en praderas de pasto Xaraés en respuesta a fuentes de nitrógeno convencionales y tratadas con N-(n-butil) triamida tiofosfórica (NBPT)

Luís Henrique Almeida Matos a Carlindo Santos Rodrigues a,b* Douglas dos Santos Pina a Vagner Maximino Leite a Paula Aguiar Silva a Taiala Cristina de Jesus Pereira a Gleidson Giordano Pinto Carvalho a

a

School of Veterinary Medicine and Animal Science, Federal University of Bahia, Adhemar de Barros Avenue, 500, Ondina, Zipcode 40170-110, Salvador, Bahia, Brazil. b

Federal Institute of Education, Sciences and Technology Baiano, Bahia, Brazil.

*

Autor de correspondencia: carlindo.rodrigues@ifbaiano.edu.br

Resumen: La N-(n-butil) triamida tiofosfórica (NBPT) es un inhibidor de la ureasa usado en los sistemas agrícolas para reducir las pérdidas por volatilización de NH3 y maximizar el uso del nitrógeno ureico (N). Se realizó un estudio de campo para evaluar el efecto de la urea tratada con NBPT sobre la densidad volumétrica y la masa de forraje en el pasto Brachiaria brizantha cv. Xaraés. El periodo experimental fue de un año (septiembre 2017 a septiembre 2018). El diseño experimental fue de bloques completamente aleatorios con un arreglo factorial de 3×2×4: tres estaciones del año (lluvia, sequía y transición), dos fuentes de urea (convencional y tratada con NBPT), y cuatro tasas de N (0, 80, 160 y 240 kg N ha-1 año-1). Se hicieron tres 706


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réplicas. Ambas fuentes de nitrógeno tuvieron un efecto positivo (P<0.0001) sobre la densidad aparente, la masa de forraje y el estrato de pastoreo durante la estación de lluvia y la de transición. También produjeron aumentos de N en los pastos. La relación hoja:tallo disminuyó linealmente (P<0.0045) a medida que aumentaron las tasas de N; la relación mayor fue durante la estación de lluvia y la menor en la estación de sequía. A la tasa de 80 kg N ha-1 año-1, hubo una diferencia (P=0.0042) entre las fuentes de N. A esta tasa la urea convencional produjo una mayor (P=0.0006) masa de forraje total, masa de forraje pospastoreo (P= 0.0042) y densidad volumétrica del forraje (P=0.0006). En las estaciones de lluvia y de transición, la aplicación de N, cual sea la fuente, resultó en un aumento en la masa y la densidad volumétrica del forraje en praderas de pasto Xaraés hasta la tasa de 240 kg N ha-1 año-1. Palabras clave: Brachiaria brizantha, Eficiencia de uso de nutrientes, Praderas, Volatilización de amonio.

Recibido: 14/07/2021 Aceptado: 31/01/2022

Introducción La fertilización nitrogenada aumenta la cantidad y la calidad de forraje. El nitrógeno (N) es un componente importante de las proteínas y el principal nutriente necesario para mantener la productividad en forrajes. Cuando se aplica, es asimilado por las plantas lo cual promueve un aumento en los constituyentes celulares(1). Como consecuencia, se incrementa tanto el vigor de rebrote como la producción total de materia seca verde de la planta en condiciones climáticas favorables. Como fertilizante, la urea [CO(NH2)2] presenta problemas en el recebado del suelo ya que se pierde N por la volatilización del NH3(2,3). Los cambios en la cantidad de N disponible en el sistema y en la relación nitrato:amonio en la solución del suelo afectan la eficiencia de recuperación y uso de N, el rendimiento de materia seca y la composición química de los pastos(4). A pesar de esto, la urea se considera entre las más importantes fuentes de N porque tiene una alta concentración de este elemento (46%) y sus costos de producción son menores que otras fuentes(5-9). Muchas investigaciones se han enfocado en mitigar las pérdidas de NH3 de la urea por medio de un tratamiento con un inhibidor de la ureasa; la N-(n-butil) triamida tiofosfórica (NBPT por sus siglas en inglés) es el compuesto más estudiado y utilizado(10-17). La mayoría de los estudios han demostrado el potencial de la urea tratada con productos a base de NBPT para 707


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reducir las pérdidas de NH3(18-21). Sin embargo, en comparación con la urea no tratada el desempeño de la urea tratada con NBPT no aumenta la producción de forraje de una manera consistente; de hecho, bajo algunas condiciones no hay diferencias en el rendimiento(23,24,25). Inconsistencias de este tipo probablemente estén asociadas con el clima y las condiciones del suelo al momento de la aplicación del fertilizante. Condiciones como tasas altas en la cantidad de N aplicado(26,27), y la aplicación de urea en suelos con alta humedad y en altas temperaturas provocan una mayor pérdida de NH3(20,26). Esto hace más atractivo el uso de inhibidores de la ureasa como una herramienta para incrementar la eficiencia del uso del N. Por el contrario, las bajas temperaturas y/o las condiciones secas pueden limitar la hidrólisis de la urea y, por lo tanto, las pérdidas de NH3(20,28). Siempre existen incertidumbres sobre las ventajas de usar urea tratada con NBPT en tales condiciones para aumentar el rendimiento del pasto. Este estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto de los inhibidores de la ureasa en la densidad volumétrica del forraje y en la masa de forraje de una gramínea (Brachiaria brizantha cv. Xaraés) fertilizada con N.

Material y métodos Ubicación del experimento y condiciones climáticas Se llevó a cabo el experimento durante un periodo de un año, desde el septiembre 2017 hasta el septiembre 2018, en la granja de Talitha, en el distrito de Monte Gordo, en la cuidad de Camaçari, en el estado de Bahia, Brasil (12°41’51” S, 38°19’27” O; 36 msnm). La temperatura promedio anual en la región es de 23.3°C y la precipitación promedio anual es de 1,466.5 mm. Los suelos en el área de estudio son arenosos y friables con las siguientes características fisicoquímicos: materia orgánica (MO) = 21.0 g dm-3; pH (H2O) = 5.3; P = 4.0 mg dm-3; K = 0.2 mmolc dm-3; Ca = 13.0 mmolc dm-3; Mg = 7.0 mmolc dm-3; Na = 0.0 mmolc dm-3; Al = 0.0 mmolc dm-3; H + Al = 18.0 mmolc dm-3; SB = 20.0 mmolc dm-3; CTC = 38.0 mmolc dm-3; V = 53%; arena = 894 g dm-3; cieno = 18 g dm-3; y arcilla = 88 g dm-3.

Diseño experimental y tratamientos Se usó un diseño experimental de bloques completamente aleatorio con un arreglo factorial de 3×2×4: tres estaciones climáticas (lluvia, sequía y transición), dos fuentes de urea (convencional y tratada con NBPT), y cuatro tazas de fertilización con N (0, 80, 160 y 240 kg N ha-1 año-1). Se llevaron a cabo tres réplicas. El periodo experimental fue de 380 d, durante el cual se midieron la temperatura, el índice de la precipitación (Figura 1), y el balance hídrico (Figura 2) utilizando un almacén de agua de 50 mm de capacidad(29).

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40 35 30 25 20 15 10 5 0

350 300 250 200 150 100 50 0

Precipitación (mm)

Temperatura co

Figura 1: El índice de la precipitación y la temperatura mensual promedia (2017 a 2018) en el área de estudio

Precipitación Max Min

Promedio

La fertilización y la siembra se hicieron el 26 de junio de 2016. Para la siembra se utilizaron 15 kg de semillas ha-1 de Brachiaria brizantha cv. Xaraés. La fertilización se hizo utilizando 70 kg P2O5 ha-1 (pentóxido de fósforo), 60 kg KCL ha-1 (cloruro de potasio), y 50 kg de N ha-1 sobre toda el área experimental. El área experimental total fue de 0.66 ha, lo cual incluyó los corredores, el área de manejo y el espacio entre las parcelas. Cada parcela media 10 m × 10 m (100 m2). Se dividieron las parcelas en tres bloques. Todas las parcelas recibieron una aplicación de 30 kg P2O5 ha-1 y 200 kg KCL ha-1. La aplicación de N se hizo en cobertura, con la excepción de la tasa de 0 N. El P2O5 se aplicó en dosis única en el primer ciclo, mientras el KCL y el N se dividieron en cuatro aplicaciones de igual cantidad (inicio y final de la estación de lluvia). Figura 2: Balance hídrico promedio durante el periodo experimental (2017 a 2018) en al área de estudio 300

Balance hidríco Déficit

200 100

mm

0 -100 -200

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Superávit


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El monitoreo de la altura del dosel del pasto se inició después del pastoreo, midiendo las plantas tres veces por semana hasta que las plantas alcanzaron la altura de prepastoreo (30 cm). Se tomaron doce lecturas para cada unidad experimental utilizando una varilla graduada y una hoja de película radiográfica, según Pequeno(30). La defoliación de las praderas se llevó a cabo de una manera que simulaba un escenario de pastoreo rotacional, agregando o eliminando animales reguladores(31).

Variables medidas La etapa de pre-pastoreo, los cortes de forraje se realizaron a dos alturas: >15 cm, lo cual corresponde a la masa de forraje, y de 0-15 cm, lo cual corresponde al nivel del suelo hasta el corte de masa de forraje. La suma de estos dos cortes corresponde a la masa de forraje total, es decir, de 0–30 cm de altura. En el muestreo de masa de forraje pos-pastoreo los cortes se realizaron al ras del suelo. Las muestras de forraje correspondientes a cada uno de los estratos del dosel se pesaron y luego se colocaron en una estufa de circulación forzada de aire a 65 °C hasta alcanzar peso constante. Con ellas se llevó a cabo un análisis del contenido de materia seca (MS) utilizando la espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS por sus siglas en inglés), según los procedimientos de Marten et al(32). Se hicieron las lecturas en un rango de longitud de onda de 700 a 2,500 nm con un espectrómetro (2500 XL, Unity Scientific SpectraStar™). Utilizando los resultados del rendimiento de materia seca (RMS), se calculó la densidad volumétrica del forraje por medio de la división de la masa de forraje en el pre- y pospastoreo por la altura del pasto correspondiente; se expresaron en términos de kg ha-1 cm-1 de MS, según la metodología de Stobbs(33). El resultado fue la densidad volumétrica del forraje (kg MS ha-1 cm-1) correspondiente al estrato de 0 a 30 cm de altura, y la densidad volumétrica del estrato en pastoreo (kg MS ha-1 cm-1) de 15 a 30 cm de altura. Una vez retirado los animales, se identificaron al azar dos grupos de diez brotes en diferentes áreas de la unidad experimental (pradera)(34). Al final del ciclo de pastoreo, se cortaron los brotes cerca de la superficie del suelo. Se realizó una separación morfológica de las fracciones de hoja, tallo y material muerto, se pesó cada fracción y se secaron a 65 °C por 72 h. Basado en los pesos, se calculó la relación hoja:tallo.

Análisis estadístico Se analizaron los resultados con un análisis de varianza por medio del procedimiento PROC MIXED del programa SAS ver. 9.2, usando el siguiente formula: Yijkl=µ + Bi +Sj + Dk+ (SxD)jk + eijk +Pl + (SxP)jl + (DxP) kl + (SxDxP)jkl + Ɛijkl

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Donde: Yijkl = valor observado; μ= media global; Bi= efecto aleatorio de los bloques; Sj = efecto fijo de la fuente de N; Dk= efecto fijo de la tasa de N; (SxD)jk= efecto de la interacción fuente x tasa; eijk = error aleatorio asociado con la fuente y la tasa de N; Pl = efecto fijo de la estación del año; (SxP)jl = efecto de la interacción de fuente x tasa; (DxP) jL= efecto de la interacción de tasa x estación; (SxDxPx) jkl = efecto de la interacción de fuente x tasa x estación; Ɛijkl = error aleatorio asociado con el efecto de la estación. Por el factor cuantitativo (tasa), se evaluaron los resultados por medio de un análisis de regresión, mientras a los factores cualitativos (fuente y estación) se evaluaron con una prueba de Tukey. Para ambas evaluaciones se usó una probabilidad de 5% para un error tipo I.

Resultados La masa de forraje total (0-30 cm) varió en respuesta a las fuentes de urea (P=0.0145), la estación (P=0.0230), la tasa de N (P<0.0001) y las interacciones (P=0.0020). Para la masa de forraje total, hubo un efecto lineal positivo (P≤0.05) en la interacción para la urea convencional y la urea tratada con NBPT ya que hubo un aumento de las tasas en las praderas; sin embargo, los valores de masa eran similares entre las dos fuentes. A la tasa de 80 kg de N ha-1 año-1, la masa de forraje (promedio) fue más alta (P=0.0006) con la urea tradicional (4,093.28 kg MS ha-1) que con la tratada con NBPT (3,450.44 kg MS ha-1)(Cuadro 1). También se observó un efecto lineal positivo en la masa de forraje durante la estación de lluvia y la de transición, lo cual produjo un mayor crecimiento del pasto tratado con N a medida que aumentaba la tasa de N. En la estación de sequía la dosis de N no tuvo efecto sobre el crecimiento del pasto (Cuadro 1). En los tratamientos de 0 y 80 kg de N ha-1 año-1, la masa de forraje (0-30 cm) no presentó diferencias significativas (P>0.05) entre estaciones. En los tratamientos de 160 (P=0.0372) y de 240 kg de N ha-1 año-1, la masa de forraje fue mayor (P≤0.05) durante la estación de lluvia y la de transición comparado con la de la estación de sequía. En la masa de forraje en el estrato de pastoreo (15–30 cm) se observaron efectos significativos (P≤0.05) para las estaciones, la tasa de N y su interacción. En la interacción hubo un efecto lineal positivo durante la estación de lluvia (P<0.0001) y la de transición

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(P<0.0001); aparentemente las plantas que recibieron más agua pudieron aprovechar mejor el N agregado. Durante la estación de sequía las diferentes tasas no tuvieron efecto (P>0.05) cuando se ajustaron los resultados a las funciones lineal y cuadrática (Cuadro 1). En la comparación entre las estaciones y la tasa de fertilización nitrogenada, la masa de forraje en el estrato en pastoreo no difirió (P>0.05) entre la tasa cero y la de 160 kg de N ha-1 año-1. Para las tazas de 80 y 240 kg de N ha-1 año-1, durante la estación de lluvia y la de transición, sí hubo una producción más alta de masa en el estrato de pastoreo (Cuadro 1).

Cuadro 1: Forraje disponible promedio por estrato en pasto Xaraés (B. brizantha) en respuesta a cuatro tasas de fertilización con N durante tres estaciones Tasas (kg N ha-1 año-1) Efecto Estaciones 0 80 160 240 L C -1 Masa de forraje total (0-30 cm) (kg MS ha ) Lluvia 3136.2a 3765.5a 3876.1a 4023.9a <0.00011 0.2534 Sequía 3477.9a 3730.9a 3339.2b 3350.3b 0.2393 0.4207 a a b a 2 Transición 3360.9 3819.2 3527.9 4330.5 <0.0001 0.1022 Valor de P 0.2456 0.9174 0.0372 <0.0001 Masa de forraje, estrato de pastoreo (15-30 cm) (kg MS ha-1) Lluvia 1005.8 a 1152.6 a 1164.1 a 1259.3 a <0.00013 0.4761 Sequía 1021.0a 904.5 b 1048.2 a 990.9 b 0.8301 0.5496 a a a a 4 Transición 947.1 1121.9 1105.7 1338.1 <0.0001 0.5228 Valor de P 0.4946 0.0001 0.1355 <0.0001 Masa de forraje pos-pastoreo (kg MS ha-1) Lluvia 1879.0b 2346.5a 2250.5a 2481.8a 0.00045 0.4476 a a a ab Sequía 2394.6 2226.7 2344.4 2245.1 0.4604 0.7318 b a a b Transición 2045.3 2083.1 2164.8 2050.4 0.8395 0.2411 Valor de P 0.0022 0.1836 0.4484 0.0136 L= lineal; C= cuadrática; N= nitrógeno; MS= materia seca. Los valores en la misma columna con diferentes letras superíndices son diferentes estadísticamente (P<0.05, prueba Tukey). 1 Fórmulas de regresión: Ŷ = 3.4671x + 3284.4 R² = 0.84; 2Ŷ = 3.2719x + 3367 R² = 0.63; 3Ŷ = 0.9649x + 1029.7 R² = 0.91;4Ŷ = 1.4463x + 954.66 R² = 0.87; 5Ŷ = 2.1404x + 1982.6 R² = 0.73 ab

En la etapa pos-pastoreo, hubo un efecto (P≤0.05) en la producción de masa de forraje en respuesta a la estación, la interacción de estación × tasa y la interacción de fuente × tasa. En la interacción, se observó un efecto lineal positivo durante la estación de lluvia a medida que aumentaban las tasas de N (Cuadro 1). En el tratamiento de tasa cero, la masa de forraje fue mayor (P=0.0022) durante la estación de lluvia. La estación no tuvo efecto (P>0.05) en las

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tasas de 80 y 160 kg de N ha-1 año-1. El tratamiento de 240 kg de N ha-1 año-1 produjo una mayor masa de forraje durante la estación de lluvia, pero la producción no difirió (P>0.05) entre las estaciones de sequía y de transición a esta tasa. En la interacción para la masa de forraje pospastoreo, la tasa no tuvo influencia (P>0.05) sobre la fuente de urea convencional cuando se ajustó a las funciones lineal y cuadrática. Sin embargo, con la urea tratada con NBPT la interacción mostró un efecto lineal positivo (P= 0.0358) a medida que aumentaba la tasa de fertilización. En particular a la tasa de 80 kg N ha-1 año-1, hubo una diferencia (P=0.0042) entre las fuentes, con una mayor masa de forraje pospastoreo con el uso de la urea convencional (2,391.94 kg de MS ha-1) y una menor con la urea tratada con NBPT (2,045.60 kg de MS ha-1) (Cuadro 2). Cuadro 2: La masa de forraje y la densidad volumétrica en pasto Xaraés (B. brizantha) en respuesta a diferentes tasas de fertilización con N en condiciones de pre- y pos-pastoreo Tasas (kg N ha-1 año-1) Efecto Fuente 0 80 160 240 L C -1 Masa de forraje total (0-30 cm) pre-pastoreo (kg MS ha ) Urea 3325.0 4093.3 3702.4 3891.6 0.00171 0.1816 2 NBPT 3325.0 3450.4 3459.7 3911.6 0.0172 0.3521 Valor de P 1.0000 0.0006 0.1690 0.9052 -1 Masa de forraje pos-pastoreo (kg MS ha ) Urea 2106.3 2391.9 2321.0 2188.8 0.7046 0.2139 NBPT 2106.3 2045.6 2185.5 2329.4 0.03583 0.0534 Valor de P 1.0000 0.0042 0.2439 0.2268 Densidad volumétrica de forraje (kg MS ha-1 cm-1) Urea NBPT Valor de P

110.8 110.8 1.0000

136.4 115.0 0.0006

123.4 115.3 0.1689

129.7 130.4 0.9049

0.00174 0.01735

0.1816 0.3520

L= lineal; C= cuadrática; N= nitrógeno; MS= materia seca, NBPT= N-(n-butyl) thiophosphoric triamide. Fórmulas de regresión: 1Ŷ = 1.6363x + 3556.7 R² = 0.27; 2Ŷ = 2.2112x + 3271.3 R² = 0.79; 3Ŷ = 1.0115x + 2045.3 R² = 0.73; 4Ŷ = 0.0546x + 118.55 R² = 0.27; 5Ŷ = 0.0737x + 109.04 R² = 0.79

En las condiciones de pre-pastoreo, hubo diferencias significativas (P≤0.05) en la densidad volumétrica (0–30 cm) por fuente, estación (P=0.0231), tasa (P<0.0001), la interacción fuente × tasa (P=0.0305), y la interacción estación × tasa (P<0.0020). En la interacción se observó un efecto lineal positivo (P≤0.05) durante la estación de lluvia y la de transición; aparentemente, las plantas que tenían más agua pudieron responder al N agregado. Durante la estación de sequía, no hubo influencia (P>0.05) por las tasas de N cuando se ajustaron a las fórmulas lineal y cuadrático (Cuadro 3).

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Cuadro 3: La densidad volumétrica de forraje en el pasto Xaraés (B. brizantha) en respuesta a cuatro tasas de N durante tres estaciones (lluvia, sequía y transición) Tasas (kg N ha-1 año-1) Efecto Estación 0 80 160 240 L C -1 -1 Densidad volumétrica de forraje (kg MS ha cm ) Lluvia 104.5 a 125.5 a 129.2 a 134.1 a <0.00012 0.2535 a a b b Sequía 115.9 124.4 111.3 111.7 0.2392 0.4206 a a ab a 1 Transición 112.0 127.3 117.6 144.4 <0.0001 0.1022 Valor de P 0.2456 0.9174 0.0372 <0.0001 Densidad volumétrica, estrato de pastoreo (kg MS ha-1 cm-1) Lluvia 67.1 a 76.8 a 77.6 a 84.0 a <0.00014 0.4760 a b a b Sequía 68.1 60.3 69.9 66.1 0.8304 0.5493 a a a a 3 Transición 63.1 74.8 73.7 89.2 <0.0001 0.5231 Valor de P 0.4946 0.0001 0.1357 <0.0001 L= lineal; C= cuadrática; N= nitrógeno; MS= materia seca. Los valores en la misma columna con diferentes letras superíndices son diferentes estadísticamente (P<0.05, prueba Tukey). 1 Fórmulas de regresión: Ŷ= 0.1156x + 109.48 R² = 0.84; 2Ŷ= 0.1091x + 112.24 R² = 0,63; 3Ŷ= 0.0643x + 68.649 R² = 0.91 4Ŷ= 0.0964x + 63.648 R² = 0.87. ab

La interacción estación × tasa de N tuvo un efecto significativo (P<0.0025) en la densidad volumétrica en el estrato de pastoreo. Mostró un efecto lineal positivo en la estación de lluvia y la de transición en respuesta a los aumentos en las tasas de N en las praderas. Sin embargo, durante la estación de sequía, las tasas de N no tuvieron un efecto (P>0.05) ni con la función ajustada lineal ni cuadrática (Cuadro 1). Tanto la estación como la tasa de N tuvieron efecto (P≤0.05) sobre la relación hoja:tallo. La relación fue más alta durante la estación de lluvia y más baja en la de sequía (Figura 3a). Las fuentes de N no influyeron en la relación hoja:tallo (P>0.05), pero el incremento en las tasas de N en las praderas se reflejó en una reducción lineal (P≤0.05) en tal relación (Figura 3b).

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Figura 3: La relación hoja:tallo en el pasto Xaraés (B. brizantha) en respuesta a cuatro tasas de N y tres estaciones [lluvia (W), sequía (D), y transición (T)] 2.25 (a)

2

Hoja:Tallo

Hoja:Tallo

2.5

1.56 (b) 1.27 (c)

1.5 1 0.5

Ŷ = -0.0012x + 1.8334 R² = 0.92

1.90 1.85 1.80 1.75 1.70 1.65 1.60 1.55 1.50 0

0 W

D

T

80

160

240

Tasas de N ( Kg N Ha-1 Year-1)

Período del año

a abc

b

Letras minúsculas diferentes después del promedio sobre las columnas indican diferencias significativas (prueba de Tukey, 5% de probabilidad).

Discusión El nitrógeno es un componente vital en las proteínas y es el principal nutriente necesario para mantener la productividad en pastos(35). Cuando se asimila por las plantas promueve un aumento en los constituyentes celulares(1), e influye de manera sustancial sobre la producción y elongación de las hojas(36,37). Desde luego, la fertilización nitrogenada actúa directamente sobre la tasa de crecimiento en pastos, que a su vez afecta el aumento en y la disponibilidad de masa de forraje en una pradera. En pastos de pastoreo, la masa de forraje se caracteriza por la altura del dosel en la etapa del prepastoreo. En el presente estudio la tasa de N causó un efecto lineal positivo en la masa de forraje durante la estación de lluvia y la de transición (Cuadro 1). Sin embargo, esto ocurrió en diferentes magnitudes según el coeficiente del pendiente de la recta. Según los resultados, se puede esperar un aumento en la masa de forraje disponible, por cada kilogramo de N, de 3.2719 kg MS ha-1 en la estación de transición y de 3.4671 kg MS ha-1 en la estación de lluvia. Estas variaciones en la magnitud de las respuestas a la fertilización nitrogenada también pueden estar relacionadas con las condiciones climáticas a lo largo del año (Figura 1), y con que la temperatura y la humedad estén dentro de los rangos favorables para el desarrollo del pasto Xaraés. La disponibilidad de masa de forraje debe ser mayor a 2,000 kg de MS ha-1(38), ya que valores menores que este promueven un mayor tiempo de pastoreo y un menor consumo de pasto por parte de los animales. En el presente estudio, hasta los pastos en la tasa cero de N exhibieron valores superiores a este mínimo, con promedios de 3,360.9 kg MS ha-1 en la estación de

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transición; 3,477.9 kg MS ha-1 en la estación de sequía y 3,136.2 kg MS ha-1 en la estación de lluvia (Cuadro 1). Este resultado se puede atribuir al manejo de la defoliación, lo cual incluyó una meta de altura establecida que respetó los límites ecofisiológicos del pasto Xaraés. La estrategia de pastoreo utilizado en el presente estudio se definió de acuerdo con los lineamientos establecidos para el pasto Xaraés bajo carga intermitente, con una altura previa al pastoreo de 30 cm, una interceptación de luz (IL) correspondiente al 95 %, y la salida de los animales cuando la altura del pasto se baja a los 15 cm(39,40). De esta manera, se consideró el rango de 15 a 30 cm de altura para calcular la masa de forraje disponible en el estrato de pastoreo (Cuadro 1); esta variable respondió a las tasas de N con un patrón similar a la masa de forraje de 0 a 30 cm. En teoría, la masa de forraje en el estrato de pastoreo es la que será consumida por el animal durante el tiempo de ocupación de la pradera. Consecuentemente, este estrato influye de manera directa en la respuesta animal ya que, en la práctica, la disponibilidad de masa de forraje está asociada al consumo individual de los animales y, desde luego, al rendimiento(41). Las respuestas de las plantas y los animales durante el pastoreo están condicionadas por la estructura del dosel del forraje(42), el cual se ha caracterizado por variables como la intercepción de la luz, la altura de la pradera, la masa de forraje y la densidad volumétrica. La altura de las praderas prepastoreo en el presente estudio fue de 30 cm en todos los tratamientos. Como resultado, las variaciones observadas en la estructura de las praderas a lo largo del período experimental fueron resultados aislados y/o de la interacción de las fuentes de variación, de las estaciones (lluvia, sequía y transición), de las tasas de N (0, 80, 160 y 240 kg de N ha-1 año-1) y las fuentes de N (urea convencional y tratada con NBPT). Los datos de la densidad volumétrica del forraje (Cuadros 2 y 3) y la relación hoja:tallo (Figura 3) en este estudio apoyan a los resultados obtenidos para la masa de forraje. Esto es de esperar ya que son los componentes relevantes en la estructura del pasto e influyen en el comportamiento de ingesta en los animales de pastoreo(43). Se observó un efecto lineal creciente en la densidad volumétrica del forraje y la densidad volumétrica del estrato de pastoreo durante la estación de transición y la de lluvia (Cuadro 3). La densidad volumétrica promedio del forraje, por cada kilogramo de N aplicado, fue de 0.1091 kg MS ha-1cm-1 durante la de lluvia y de 0.1156 kg MS ha-1cm-1 en la de transición. Para el estrato en pastoreo, los incrementos fueron de 0.0964 kg MS ha-1cm-1 durante la de lluvia y 0.0643 kg MS ha-1cm-1 en la de transición. Incrementos en la densidad volumétrica del forraje favorecen la aprehensión por parte de los animales durante el pastoreo(44). De preferencia, la mayor proporción del volumen de forraje aprehendido es de hojas. Las principales estructuras vegetales que componen la densidad volumétrica del forraje en la pradera son la lámina foliar y el tallo. Las proporciones de estos elementos son importantes para el manejo de las plantas forrajeras y se califica por medio de la relación hoja/tallo. 716


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Cuando un forraje está en la condición de límite crítica, es decir una relación hoja/tallo menor a 1, la biomasa relativa de los tallos aumenta, lo que implica una reducción en la calidad del forraje producido(45). La relación hoja:tallo experimentó un efecto lineal negativo, con reducciones de 0.0012 puntos por cada kg de N aplicado a las praderas (Figura 3b). Aunque el coeficiente del pendiente fue decreciente, el valor más bajo de esta relación estuvo por encima del límite recomendado, con una relación de 1.55 puntos para la tasa de 240 kg de N ha-1 año-1 (Figura 3b). Se puede explicar esta disminución por un mayor crecimiento de las plantas, particularmente por el mayor crecimiento de los tallos; estas tasas más altas de crecimiento están asociadas con las condiciones de temperatura y lluvia durante la estación de lluvia y la de transición. Aumentos en los niveles de N disponibles para la planta resultan en un aumento en la densidad de brotes(46), seguido por un aumento en la tasa de crecimiento de la planta. Este puede desencadenar una competencia temprana por la luz en el dosel, favoreciendo la elongación del pseudotallo(47-50), y así produciendo una reducción en la relación hoja:tallo. La estrategia de manejo de la pradera implementado en el presente estudio evitó la acumulación excesiva de culmos. Aunque si habían culmos presentes, eran más jóvenes y desde luego más fáciles de aprehender por el animal; o sea, eran básicamente un pseudotallo(39), formado por invaginaciones de las vainas de las hojas. La relación hoja:tallo respondió a las condiciones en las estaciones (Figura 3a); era más alta en la estación de lluvia (2.25) y más baja en la estación de sequía (1.27). Sin importar la estación, las relaciones hoja:tallo observadas en este estudio estaban por encima del límite crítico preestablecido. La menor proporción de tallo producido demuestra que la estrategia de pastoreo implementada fue eficiente en el control de la elongación del tallo, produciendo una mejor calidad de forraje disponible. Es importante señalar que en las tasas de N de 0 y 80 kg de N ha-1 año-1 la masa de forraje de 0-30 cm no difirió entre la estación de lluvia y la de transición (Cuadro 1). Lo mismo se observó para la masa de forraje en el estrato en pastoreo en las tasas de 80 y 160 kg de N ha-1 año-1. Cuando se considera los datos de la relación hoja:tallo en las estaciones (Figura 3b), se puede observar que la proporción de tallo predomina, lo que puede bajar la calidad del forraje, y como consecuencia el consumo de forraje y el desempeño del animal. La masa de forraje disponible es el resultado de la acumulación de forraje durante el período de rebrote, que a su vez se vea afectado por la masa de forraje pospastoreo. En la estación de lluvia, hubo un efecto lineal positivo (P<0.0004) sobre la masa de forraje pospastoreo por cada kilogramo de N aplicado, produciendo aproximadamente 21,404 kg MS ha-1 (Cuadro 1). La presencia de más masa de forraje pospastoreo puede proporcionar un rebrote vigoroso ya que un mayor remanente de hojas verdes provee un mayor aparato fotosintético para que la planta inicie este rebrote.

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Se esperaba que la urea tratada con NBPT, de liberación prolongada, promovería una mayor producción de masa de forraje en todos los tratamientos. La liberación lenta del N llevaría a menores pérdidas de NH3 por la volatilización y desde luego un mayor uso de N por parte de la planta. Sin embargo, las únicas diferencias observadas entre los dos tipos de urea en términos de masa de forraje pre- y pos-pastoreo (y por consecuencia la densidad volumétrica) fueron valores mayores con la urea convencional en la tasa de 80 kg de N ha-1 año-1(Cuadro 2). Se puede atribuir estos resultados al efecto sinérgico de algunos factores como los residuos de pos-pastoreo(51,52), la concentración de urea tratada con NBPT(6), y las condiciones climáticas (altas temperaturas y suelos húmedos) durante el período de aplicación del fertilizante(51,52,53). En el presente estudio, el manejo eficiente del pastoreo resultó en un adecuado residuo de pos-pastoreo (Cuadro 1), lo cual aumentó la cobertura vegetal del suelo. Esto podría haber aminorado la eficiencia de la urea tratada con NBPT debido a la alta actividad de ureasa(51). La urea tratada con NBPT utilizado en el presente estudio es un producto comercial que se comercializa en Brasil con una concentración de 530 mg kg-1(52). En un estudio previo, se usó la urea tratada con NBPT en cultivos de caña de azúcar con cobertura de paja verde. La cantidad de paja en el suelo bajó la eficiencia de la urea, y la recomendación fue duplicar la concentración comercial de NBPT en la urea como una forma de aumentar su eficiencia (52). Esto sugiere que la presencia del residuo pos-pastoreo al momento de la fertilización, en conjunto con la concentración de urea tratada con NBPT, contribuyeron a los resultados encontrados en este trabajo. Además, es importante considerar que, tanto en la estación de lluvia como en la de transición, el nivel de precipitación y las temperaturas registradas antes de las aplicaciones de los fertilizantes fueron muy favorables (Figuras 1 y 2). Esto puede acelerar la degradación del NBPT y aumentar la volatilización del NH3(54,55). El correcto manejo del pastoreo en el presente estudio aseguró un adecuado nivel de residuo pos-pastoreo. Esto permitió que los aumentos en las tasas de N se reflejaban en una mayor producción de forraje, y una relación hoja-tallo más favorable. Por lo tanto, se puede inferir de manera indirecta que tanto la calidad del forraje como la eficiencia en el aprovechamiento del forraje producido fueron buenos. A la vez, este mismo nivel de residuos pudo haber comprometido la eficiencia de la urea de liberación lenta (NBPT) en promocionar un aumento en la productividad de la masa de forraje.

Conclusiones e implicaciones La aplicación de urea tratado con NBPT sobre el pasto Xaráes manejado con alturas de 30 cm pre-pastoreo y 15 cm pos-pastoreo no tuvo efecto sobre la disponibilidad de forraje. En

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la estación de lluvia y la de transición, tanto la urea tradicional como la tratada con NBPT produjeron un aumento en la masa de forraje y la densidad volumétrica hasta en un 240 kg N ha-1 año-1. En el futuro, las investigaciones deben de enfocarse en evaluar la respuesta de praderas de pastos tropicales en diferentes alturas pos-pastoreo a concentraciones más altas de urea tratado con NBPT. Agradecimientos Los autores recibieron becas del CNPq and CAPES. Literatura citda: 1.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.5564 Revisión bibliográfica

Diagnóstico, prevención y control de enfermedades causadas por Chlamydia en pequeños rumiantes. Revisión

Fernando de Jesús Aldama a Roberto Montes de Oca Jiménez a* Jorge Antonio Varela Guerrero a

a

Universidad Autónoma del Estado de México. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Toluca, Estado de México, México.

* Autor de correspondencia: romojimenez@yahoo.com

Resumen: Las especies que conforman el género Chlamydia afectan una amplia gama de hospederos animales, causando diversas patologías. Chlamydia abortus (C. abortus), Chlamydia psittaci (C. psittaci) y Chlamydia pecorum (C. pecorum) son las de mayor relevancia clínica en pequeños rumiantes a nivel mundial, ya que han sido relacionadas con problemas reproductivos, oculares y del tracto digestivo respectivamente; dos de estas (C. abortus y C. psittaci), representan un riesgo potencial zoonótico al ser humano. El diagnóstico de infecciones por organismos de este género resulta complicado; ya que, en la mayoría de los casos no hay signología clínica que indique la presencia del agente en animales afectados. Actualmente en países europeos la prevención y control principalmente de C. abortus se realiza mediante la administración de inmunógenos atenuados comerciales; sin embargo, su uso no ha mostrado resultados satisfactorios en la protección de animales susceptibles. Por lo tanto, la implementación de nuevas opciones de inmunización basadas en la utilización de proteínas recombinantes es la línea de investigación que más realce está tomando actualmente. Adicionalmente, el uso de proteínas con potencial inmunogénico podrían ser herramientas importantes para el diagnóstico, prevención y control de estos patógenos. Debido a esto, la presente revisión se centró en recapitular los estudios más actuales enfocados al uso experimental de diferentes proteínas inmunogénicas de Chlamydia spp.

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Rev Mex Cienc Pecu 2022;13(3):725-742

empleadas a nivel mundial, destacando su innovación y resultados obtenidos en los modelos experimentales. Palabras clave: Chlamydia, Diagnóstico, PCR, Proteínas recombinantes, Vacunas.

Recibido: 28/11/2019 Aceptado: 02/12/2020

Introducción Las bacterias del género Chlamydia son organismos Gram negativos, intracelulares obligados que se caracterizan por compartir un ciclo de desarrollo bifásico único, cuentan con dos estructuras morfológicas denominadas: cuerpo elemental (CE); la cual, es la forma infectiva y el cuerpo reticular (CR), forma de la bacteria metabólicamente activa(1). Estas bacterias causan una amplia gama de enfermedades en diferentes hospederos animales y el hombre(1,2). Dentro del género, se han reportado un total de doce especies(3): C. trachomatis, C. muridarum, C. suis, C. psittaci, C. abortus, C. caviae, C. felis, C. pneumoniae, C. pecorum, C. avium, C. gallinacea, C. poikilothermis y cuatro candidatos a especie: C. ibidis, C. serpentis, C. corallus y C. sanzinia(4–6). Algunas de estas especies tienden a afectar animales de producción; además, representan un riesgo potencial zoonótico al ser humano(7). Las principales especies del género identificadas en estas especies animales son: C. abortus, C. psittaci y C. pecorum; además, de que las patologías asociadas con éstas han sido ampliamente documentadas(1,2,8). Las patologías relacionadas con estos organismos son diversas, entre las que destacan: abortos, queratoconjuntivitis y problemas en el tracto digestivo(2,9); sin embargo, C. abortus es la de mayor importancia en la producción pecuaria generando mayores pérdidas en los rebaños que por la presencia de C. psittaci y C. pecorum(1,2). Debido a la importancia para la salud pública y animal que representan estos organismos, la presente revisión se enfocó en realizar una recopilación de los estudios más recientes acerca del desarrollo de pruebas de diagnóstico, tratamiento y control de infecciones causadas por estas especies bacterianas, donde se resaltan los estudios enfocados a la producción de proteínas recombinantes; los cuales, han sido objeto de estudio en los últimos años.

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Especies del género Chlamydia que afectan a pequeños rumiantes Chlamydia abortus Agente causal del Aborto Enzoótico Ovino (AEO), enfermedad que está ampliamente distribuida a nivel mundial; la cual, causa pérdidas económicas en países que se dedican a la actividad pecuaria. La enfermedad provoca aborto en ovejas gestantes en el último tercio de la gestación o en algunos casos el nacimiento de corderos débiles que no superan las 48 h de vida(1, 2). Actualmente es considerada la patología de origen clamidial de mayor importancia; ya que, representa un riesgo potencial zoonótico ocupacional y para mujeres embarazadas que están en contacto con animales infectados(2). En este orden, se han realizado diferentes reportes en los que además de causar abortos, provoca otras afecciones, tales como: enfermedad febril, desarrollo de coagulación intravascular diseminada, insuficiencia renal aguda y edema pulmonar(10), septicemia y lesiones importantes en hígado, riñón y corazón; cabe mencionar que estas patologías se presentaron posterior al aborto(11). Se describe también como agente causal de enfermedad pélvica inflamatoria(12). En México la prevalencia de anticuerpos contra C. abortus se reportó en grupos de riesgo expuestos (trabajadores y médicos veterinarios) que estaban en contacto con rebaños con antecedentes de aborto(13). Finalmente, también ha sido reportada como agente causal de problemas de neumonía(14), demostrado de este modo el potencial zoonótico de esta especie bacteriana.

Chlamydia psittaci Bacteria de origen aviar que provoca psitacosis en aves y con riesgo potencial zoonótico comprobado. En los últimos cinco años se han realizado distintos estudios evidenciando el riesgo que representa esta especie bacteriana para el humano, principalmente por contacto con aves infectadas(2). En primera instancia causando psitacosis, ornitosis(2) o neumonía atípica(15). Asimismo, se ha reportado como agente causal de infecciones genitales en mujeres(16). Se ha identificado en pacientes con enfermedades respiratorias; por ejemplo, neumonía en granjeros que trabajaban con animales infectados(17). De igual forma, se ha relacionado con neumonía, tosferina y conjuntivitis(18). No menos importante, asociando los posibles factores de riesgo involucrados en el contagio de la psitacosis en personas que manipulan aves(19,20). Recientemente, se reportó como agente causal en un brote relacionado con enfermedad respiratoria grave entre trabajadores de plantas de sacrificio de aves de corral en USA(21). Actualmente no existen reportes de contagio de C. psittaci de mamíferos al hombre.

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Chlamydia pecorum Esta bacteria se aloja de forma natural en el tracto digestivo y ocasiona enteritis; en la mayoría de los casos ésta se presenta de manera subclínica, evitando así la detección oportuna de la enfermedad(22). C. pecorum también, ha sido asociada con otras enfermedades, entre ellas: artritis, queratoconjuntivitis, encefalomielitis, infertilidad, neumonía y mastitis, y ocasionando pérdidas económicas en las unidades de producción(22). A pesar de la gran variedad de patologías con las que ha sido relacionado este agente bacteriano, el potencial zoonótico de esta especie de Chlamydia es aún desconocido(23).

Transmisión Se ha documentado ampliamente que la forma en la que se trasmiten mayormente estos organismos es mediante la vía oronasal(1). C. abortus es excretado por las ovejas infectadas mediante fluidos vaginales o restos placentarios, los cuales, contaminan el agua o alimentos, el ingreso a animales suceptibles es mediante la ingesta de estos(2). C. psittaci habitualmente esta contenido en las heces fecales de aves y pequeños rumiantes, por lo cual, la principal ruta de transmisión de este patógeno es mediante la inhalación de aerosoles contaminados por las heces, en los comederos o zonas al aire libre(7). Se cree que la transmisión de C. pecorum se lleva a cabo mediante la vía oral-fecal o por ingestión o inhalación de bacterias contenidas en secreciones de animales infectados. Algunos estudios han sugerido una transmisión como resultado de factores como aseo mutuo, inhalación y hacinamiento(22).

Diagnóstico Debido a la variedad de cuadros clínicos, hospederos animales y dado que estos agentes a menudo se diagnostican en combinación con otros agentes infecciosos, un diagnóstico definitivo generalmente requiere pruebas de laboratorio en la mayoría de los casos(24). El diagnóstico de enfermedades de origen clamidial es complicado y requiere de metodologías complejas que necesitan de personal altamente capacitado para poder llevar a cabo un diagnóstico ideal(24). Para realizar el diagnóstico de especies de Chlamydia, las muestras por elección son hisopados (vaginales, conjuntivales y/o rectales) conservados en medio de transporte especial para Chlamydia spp., sacarosa-fosfato-glutamato (SPG)(24,25); por otra parte, el diagnóstico puede realizarse por métodos indirectos (ELISA) o directos (cultivo celular y PCR)(24).

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Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) El ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas o ELISA (del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), es una prueba de diagnóstico indirecta que detecta anticuerpos en suero de individuos afectados contra anticuerpos específicos de las bacterias de este género (2,24) , actualmente existen pruebas de ELISA disponibles comercialmente, entre las desventajas que tienen este tipo de pruebas son las reacciones cruzadas entre especies (C. abortus y C. pecorum); lo cual, dificulta el diagnóstico específico(2). Los ensayos que evalúan diferentes antígenos para la detección de especies de Chlamydia spp. han sido diversos. Primeramente evaluando fragmentos de la MOMP a través de una prueba de ELISA indirecta (rOMP91B iELISA), la cual, mostró una sensibilidad y especificidad del 84.2 y 98.5 % respectivamente; el estudio demostró que la prueba de ELISA indirecta fue mejor en la diferenciación de animales infectados con C. abortus y C. pecorum(26). Posteriormente, otro estudio evalúo diferentes antígenos recombinantes, todos estos fueron identificados a partir de la Proteína Polimórfica de la Membrana Externa o POMP90 (del inglés, Polymorphic Outer Membrane Protein). De las 11 fracciones identificadas, OMP90-3 y OMP90-4 fueron las más efectivas mostrando una sensibilidad del 95.7 y 94.3 % respectivamente y una especificidad del 100 % para ambas. Los hallazgos del estudio revelaron que la prueba de ELISA con el fragmento rOMP90-4 fue más sensible que la de rOMP90-3, ya que identificaba más muestras positivas para OEA y además, ambas fueron superiores a la prueba de fijación del complemento o CFT (del inglés complement fixation test)(27). Adicionalmente y de manera complementaria a estos estudios, se realizó un estudio en el cual, se evaluaron cuatro pruebas de ELISA experimentales basadas en CE completos de C. abortus (CE), una preparación a partir de la membrana externa de bacteria completa (SolPr) y dos fragmentos recombinantes de POMP90 (rOMP90-3 y rOMP90-4), contra tres pruebas comerciales, la prueba CHEKIT1 Chlamydophila abortus, Pourquier1 ELISA Chlamydophila abortus y ImmunoComb Ovine Chlamydophila Antibody, Los resultados durante la prueba mostraron que la prueba de ELISA comercial InmunoComb obtuvo la mayor sensibilidad (98.4 %) en comparación con las demás; sin embargo, la especificidad determinada (65.4 %) fue menor que todas las pruebas evaluadas. Los resultados al finalizar el estudio determinaron que, de las ocho pruebas de ELISA evaluadas, la prueba que ofrece mejores resultados en cuanto a sensibilidad y especificidad, fue la prueba de ELISA basada en el fragmento recombinante rOMP90-3 con valores de 96.8 % y 100 % respectivamente, este estudio demostró que esta prueba de ELISA experimental puede ser una alternativa adecuada para el diagnóstico serológico de AEO(28). A estos resultados, se suma un estudio realizado en 2018; el cual, comparó tres pruebas comerciales (IDvet, MVD-Enfer y LSI) para la detección de anticuerpos contra C. abortus en ovejas, se evaluaron animales vacunados durante diferentes periodos de tiempo para medir la producción de anticuerpos entre animales que abortaban y animales que llegaban a término, los resultados revelaron que la prueba más

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sensible fue la LSI (94.74 %) seguida por MVD-Enfer (78.95 %) y por último IDvet (73.68 %), los tres kit detectaron niveles altos de anticuerpos en las ovejas que abortaban en comparación con las que tenían corderos sin complicaciones. La prueba más sensible en este estudio se basa en la identificación del lipopolisacarido (LPS) clamidial; el cual, muestra reacción cruzada con todas las especies del género Chlamydia, se determina adecuado para identificar ovejas infectadas con cualquier especie de Chlamydia, pero no se considera específico para C. abortus(29). Finalmente, un estudio reveló las desventajas que tienen este tipo de pruebas comerciales en cuanto a reacciones cruzadas entre C. abortus y C. pecorum, realizando la evaluación en diferentes rebaños, las pruebas serológicas revelaron una baja seropositividad de C. abortus empleando una prueba de ELISA basada en péptidos (1.2 %) en ovejas australianas y una seropositividad moderada en un rebaño de suiza con antecedentes clínicos de aborto asociados a C. abortus (26.9 %). Utilizando pruebas de CFT y ELISA, la seropositividad fue significativamente mayor, lo que sugiere reactividad cruzada entre estas dos especies. Adicionalmente, empleando una prueba de PCR tiempo real para detectar ADN de C. pecorum en animales australianos seropositivos a Chlamydia spp., se concluyó que la seropositividad de Chlamydia puede estar relacionado a la reactividad cruzada con infecciones endémicas de C. pecorum(30). Debido a las desventajas que demuestran este tipo de pruebas es recomendable complementarlas con alguna otra más específica como las pruebas de PCR(24).

Cultivo celular Por su naturaleza intracelular obligada, estas bacterias requieren de medios vivos para su aislamiento; debido a esto, actualmente se emplea el cultivo celular (células McCoy por elección) para dicho fin(24), hasta hace algunos años esta técnica era considerada el estándar de oro para el diagnóstico de Chlamydia spp.(1); sin embargo, el desarrollo de nuevas metodologías como la amplificación de ácido nucleico (PCR y secuenciación) empleadas para mejorar el diagnóstico, se consideran actualmente el estándar de oro para diagnosticar infecciones por Chlamydia spp.(8). Otras pruebas como la reacción en cadena de la polimerasa; la cual, es una técnica mucho más específica para la detección y tipificación de especies de Chlamydia spp. se emplean con mucha más frecuencia debido a que cuenta con una mayor sensibilidad y especificidad en comparación con el cultivo celular(2).

Prueba de reacción en cadena de la polimerasa Esta prueba detecta ADN específico de cualquier organismo; por lo cual, es una prueba mucho más sensible y específica que el cultivo celular al momento de identificar el género y especie implicada en los individuos afectados(24). En los últimos 15 años el uso de esta técnica ha tomado mucha relevancia y sus diferentes variantes revelan mejores resultados en comparación con las mencionadas anteriormente tales como: i) procesar un mayor número

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de muestras, ii) menor tiempo para la obtención de resultados, iii) el uso de diferentes tipos de muestras para el diagnóstico, iv) los organismos no tienen que estar cien por ciento viables y v) mayor sensibilidad y especificidad. Desde que se implementó su uso en laboratorios de diagnóstico veterinario, los genes empleados para la identificación de estos agentes bacterianos han sido diferentes: proteína principal de la membrana externa o MOMP (del inglés, Major Outer Membrane Protein), proteínas de la membrana polimórfica o Pmp’s (del inglés, Polymorphic membrane protein), 16S y 23S(24). Las metodologías de PCR para la detección específica de especies de Chlamydia son variadas, por mencionar algunas: La prueba de PCR “Touchdown enzyme time release” para amplificar diferentes secuencias de ADN en las regiones variables de los genes de ARNr espaciador 16S y 16S-23S específicos para la identificación de especies de este género bacteriano; por ejemplo, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae y Chlamydia psittaci(31). Otra variante de esta prueba, la PCR-RFLP prueba que identifica en primera instancia la presencia del gen omp2 específico de la familia Chlamydiaceae y posteriormente mediante una digestión con la enzima de restricción AluI, tiene la capacidad de identificar un total de nueve especies del género Chlamydia entre estas, C. abortus, C. pecorum(32) y C. psittaci(33). Adicionalmente, una variante enfocada al gen 16S específico de la familia Chlamydiaceae pero empleando una prueba de PCR en tiempo real demostró alta especificidad al evaluar muestras de diferentes especies de Chlamydia contra otros géneros bacterianos(34); adicionalmente, esta variante también puede ser empleada para la identificación específica de especies de Chlamydia empleando iniciadores específicos para cada una(35). Posteriormente, se desarrolló una prueba de PCR multiplex para la identificación de C. abortus, C. pecorum y Coxiella burnetii, implicadas como agentes causales de aborto, esta prueba a diferencia de las antes mencionadas, ayuda a identificar de manera simultánea a las tres especies, dicha prueba demostró ser altamente específica y rápida para la detección de estos agentes bacterianos(36).

Tratamiento Antibióticos Para el tratamiento de patologías de origen clamidial, los antibióticos son los fármacos de elección, ya que las bacterinas en el caso del AEO solo están disponibles en algunos países de Europa y los costos que requieren para su implementación son muy elevados(2,7). La administración de tetraciclina, penicilina y el cloranfenicol para el tratamiento de infecciones causadas por estos agentes bacterianos ha demostrado inhibir el crecimiento de estos organismos(24), es importante recalcar, que el uso de los antibióticos debe ser de manera controlada para minimizar el desarrollo de resistencia por parte del patógeno. Aunque los antibióticos sirven para disminuir las pérdidas a causa de estos patógenos, este tipo de tratamientos no eliminan a las bacterias; ya que, los animales afectados siguen eliminando a los organismos; por lo cual, su uso profiláctico no es recomendado(37). En países europeos,

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además del uso de antibióticos también se implementa para el caso del AEO la administración de bacterinas para prevenir y controlar la enfermedad en rebaños con animales susceptibles, esto debido, a que es la única enfermedad de origen clamidial para la que existen bacterinas disponibles comercialmente(2).

Inmunógenos En el siglo pasado, los inmunógenos destinados al tratamiento y prevención de enfermedades a nivel mundial han sido uno de los mayores logros de la salud pública; en este rubro, entre 2 a 3 millones de vidas son salvadas por la implementación de estas medidas de salud(38). En el ámbito veterinario, los avances tecnológicos en el desarrollo de inmunógenos para el control de enfermedades han tenido un realce importante en los últimos 25 años, desde el empleo de bacterias completas ya sean vivas o muertas hasta el uso de inmunógenos de ADN; los cuales, ofrecen medidas más seguras tanto para el animal como para el médico veterinario que las administra(39). En los últimos 70 años, los estudios para el desarrollo de inmunógenos para combatir enfermedades de origen clamidial en especies animales principalmente ganado (ovinos, caprinos, bovinos y porcinos) se enfocan en prevenir pérdidas económicas en las unidades de producción; sin embargo, el objetivo principal es preservar la salud humana por la zoonosis que algunas de éstas representan. En los últimos 10 años los ensayos vacunales contra Chlamydia spp. se han incrementado, en estos estudios la proteína más empleada en los desafíos contra Chlamydia spp. ha sido la MOMP(40). Adicionalmente, se han realizado estudios enfocados en la búsqueda de antígenos específicos de esta proteína de superficie para una diferenciación entre especies(41). Posteriormente, se han empleado diferentes tipos de antígenos en el desarrollo de inmunógenos contra agentes clamidiales, las primeras pruebas empleaban tradicionalmente los CE, los cuales, eran inactivados mediante tratamientos con luz ultravioleta o vivos (atenuados) fijados con formalina. Posteriormente, a mediados de la década de los 90’s los enfoques en el uso de otros antígenos para el desarrollo de vacunas de subunidades como: proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, vectores de expresión y ADN comenzaron a emplearse para el desafío en modelos murinos principalmente(40). En el caso de C. pecorum solo existen dos ensayos de vacunas contra este agente; los cuales, han sido desafiados en modelos murino, aunque los resultados revelaron respuesta inmune en los animales, estos deben tratarse con cautela debido a que pocas veces los casos clínicos de abortos son relacionados con C. pecorum(42). Por último, aunque existen vacunas disponibles comercialmente para el control y prevención de C. abortus, está bien documentado que en el caso de la vacuna viva atenuada 1B C.

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abortus, tiene el potencial de reactivación y causar la enfermedad en animales inmunizados(43-45). Del total de los desafíos vacunales contra Chlamydia spp. solo el 5 % han sido enfocadas a C. abortus, evaluados en ratones, vacas, ovejas y cerdos de Guinea(40), los estudios evalúan algunas proteínas principalmente las Pmp´s buscando diferentes variaciones o mutaciones que puedan servir como puntos clave para la prevención del AEO(46).

Vacunas de subunidades, nuevas tecnologías para el desarrollo de pruebas de serodiagnóstico y prototipos vacunales A la fecha se han desarrollado diferentes estudios que han identificado a estos posibles candidatos, tanto para el diagnóstico como para el desarrollo de vacunas(2). Las proteínas inmunorreactivas, expresadas en animales infectados, se han propuesto como nuevos candidatos como antígenos marcadores para el diagnóstico y el uso de diferentes genes de virulencia que pueden ser empleados para el desarrollo de prototipos de vacunas de subunidades para la prevención y control de enfermedades causadas por especies de Chlamydia spp(47). En el caso de C. abortus, se han realizado diversos estudios, evaluando diferentes proteínas. Un estudio evaluó la respuesta inmune humoral provocada por algunas proteínas de superficie (MOMP, MIP, Pmp13G) y asociadas con la virulencia (CPAF, TARP, SINC), dicho estudio demostró que las ovejas que abortaron mostraron una fuerte respuesta de anticuerpos a los antígenos de superficie. Adicionalmente, identificaron que el antígeno más específico para el serodiagnóstico de las infecciones humanas por C. abortus fue la Pmp13G; esta proteína no mostró reactividad cruzada con otras especies de Chlamydia spp. que afectan a humanos(47). En cuanto a las proteínas empleadas actualmente para el desarrollo de prototipos vacunales, los estudios se han enfocado a tres proteínas que juegan un rol principal en el ciclo de desarrollo de la bacteria(40). Otras proteínas de este género bacteriano utilizadas como antígenos en ensayos vacúnales son las proteínas de la superficie membranal de Chlamydia spp. las cuales, han mostrado que tienen regiones altamente conservadas(48). Las proteínas de choque térmico (HSP) y las proteínas del factor de actividad similar a la proteasa de clamidia (CPAF) también, se han considerado como candidatos adecuados para el desarrollo de inmunógenos para el control y prevención de enfermedades de origen clamidial, estas han demostrado provocar una fuerte respuesta inflamatoria en el hospedero(49). Otro estudio evalúa tres diferentes tipos de vacunas: vacuna de ADN, vacuna de fagos (OmpA) y una vacuna comercial viva atenuada, liofilizada basada en la cepa 1B de Chlamydia abortus. Aunque la vacuna de fagos ofrece buenos resultados, no supera la ofrecida por la vacuna comercial; sin embargo, el estudio concluye que este novedoso sistema de administración de vacunas ofrece ventajas que superan por mucho a las vacunas comerciales, tales como:

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manejo, seguridad más eficiente y producción relativamente más económica(50). Otras pruebas evaluaron una combinación con el polisacárido de Lycium barbarum (LBP3a), los resultados demostraron una buena protección en ratones desafiados con C. abortus empleando un polisacárido LBP3a combinado con una vacuna de ADN que codifica la MOMP de C.abortus(51). Posteriormente, se han propuesto otras proteínas, tales como las pertenecientes a la familia de las Pmp’s, éstas han demostrado tener el potencial inmunogénico para el desarrollo de inmunógenos contra C. abortus(2). Un estudio evaluó la Pmp18D en dos diferentes formulaciones, FL (ligando de tirosina quinasa 3 tipo Fms; Flt3L) y fantasmas de Vibrio cholerae (VCG) para inducir inmunidad innata y de protección cruzada contra la infección genital por C. abortus. La evaluación se realizó con la regulación de la expresión de la proteína, por la activación y diferenciación de diferentes tipos celulares. Los resultados demostraron que la formulación que ofrece mejores resultados es la Pmp18D+VCG(52), así como otra variante, empleando un fragmento N-terminal de esta proteína, denomina Pmp18D.1, el estudio evaluó su capacidad para inducir una respuesta inmunes innata en células dendríticas y activar las vías de señalización involucradas en la secreción de IL-1β(53). Otras proteínas empleadas como antígenos combinados (MIP y CPAF) demostraron una eficacia del 50% contra una vacuna viva atenuada comercial; adicionalmente, aunque existe liberación del patógeno por parte de los animales inmunizados, estos se liberan en menor cantidad en comparación con el control negativo. No obstante, se pudo observar en dicho estudio que cuando estas dos proteínas son administradas de manera individual no tiene efecto alguno contra la infección experimental(54). Contra C. psittaci se han realizado diversos estudios empleando diferentes tipos de proteínas. Inicialmente enfocada en la evaluación de la persistencia de una vacuna de ADN (pcDNA1MOMP) y la expresión de la proteína recombinante (rMOMP) a partir de la MOMP de una cepa aviar de C. psittaci; la cual, ocasiona problemas respiratorios en pavos, los resultados demostraron que la persistencia de la vacuna fue de 10 semanas y la expresión de la proteína fue proporcional al tiempo de persistencia(55). Posteriormente, empleando una vacuna de adenovirus recombinante empleando la misma proteína, se evaluó en aves contra la clamidiosis aviar, los resultados de este estudio demostraron que esta vacuna era segura y que la tasa de protección alcanzó hasta un 90 % en los animales desafiados. Aunque el período de protección de la vacuna fue de seis meses se enfatiza que los períodos de crecimiento de las aves utilizadas en carne son aproximadamente similares. Sin embargo, las aves destinadas a postura deben vacunarse dos veces, debido a que estas tienen periodos de vida más amplios(56). Por otra parte, también se han empleado las Pmp’s como candidatos para el desarrollo de vacunas contra C. psittaci; en este sentido, un estudio desarrolló y examinó una vacuna recombinante administrada por el herpesvirus de los pavos, empleando el extremo 5 'del gen 734


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PmpD el cual codifica la fracción N-terminal de este (pmpD-N). La evaluación del virus recombinante (rHVT-pmpD-N) en las aves desafiadas reveló niveles aumentados de anticuerpos específicos contra PmpD y una proliferación de linfocitos específicos contra este. Después del desafío con la cepa C. psittaci CB7, se encontró una disminución significativa en la dificultad respiratoria, las lesiones y la carga bacteriana en el grupo desafiado(57). Un estudio evaluó la eficacia de la vacunación con proteínas plasmídicas para prevenir la infección pulmonar por C. psittaci en ratones, en el cual, se emplea una proteína recombinante de CPSIT_p8; la cual, pertenece a un importante factor de virulencia en forma de un plásmido "críptico" de 7,5 kb altamente conservado. Se produjo una recombinante de esta proteína y se desafió en modelo murino. Los resultados en este estudio demostraron que la inmunización disminuyó significativamente la carga bacteriana en los pulmones de los ratones desafiados, también se observó un nivel más bajo de IFN-γ. Sus resultados concluyen que la proteína recombinante evaluada en dicho estudio induce una inmunidad protectora significativa contra C. psittaci y que ésta podría ser considerada como candidato para el desarrollo de una nueva vacuna para la prevención de infecciones causadas por esta bacteria(58). No obstante, otras proteínas implicadas en la virulencia de esta bacteria tales como, las proteínas de membrana de inclusión clamidial (Inc’s) también ha sido empleadas como candidatos en el desarrollo de prototipos vacunales. Un estudio empleó una recombinante de la proteína de cabeza transmembrana CPSIT_0846 y desafió ratones con infección en las vías respiratorias causada por C. psittaci, el estudio reveló un fuerte perfil de citocinas con altos niveles de IFN-γ; de igual forma, se detectó una fuerte respuesta inmune humoral en los ratones desafiados contando con altos títulos de anticuerpos IgG específicos. La fuerte respuesta inmune se correlacionó con una concentración bacteriana significativamente reducida y una disminución en la patología inflamatoria en los pulmones de los ratones después del desafío. Los resultados de este estudio sugieren que la proteína CPSIT_0846 puede ser un posible antígeno candidato para el desarrollo de una vacuna para inducir protección contra este tipo de infecciones(59). Para la detección de anticuerpos contra C. psittaci, se desarrolló una prueba de ELISA basada en el fragmento N-terminal de la PmpD (PmpD-N), las pruebas se realizaron para determinar su sensibilidad y especificidad en aves infectadas experimentalmente y no infectadas. Los resultados de dicho estudio revelaron que la ELISA-PmpD-N tuvo una sensibilidad y especificidad del 97.9 %, 100 % respectivamente; además, no hubo reacción cruzada con sueros positivos para otros patógenos aviares. Los resultados concluyeron que esta fracción proteínica (PmpD-N) puede ser empleada como antígeno para el diagnóstico de infecciones por C. psittaci en aves(60). Cabe destacar que todos los estudios se han realizado en C. psittaci de origen aviar; sin embargo, dado que C. psittaci está genéticamente relacionada con C. abortus(61), con estas evidencias se puede contemplar la idea de enfocar los estudios en la variante que afecta a los pequeños rumiantes. 735


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En C. pecorum el estudio más reciente enfocado al desarrollo de prototipos vacunales empleando proteínas de superficie se han realizado en ovejas infectadas experimentalmente y evaluando dos proteínas recombinantes: rMOMP y rPmpG, dicho estudio identificó epítopos de células B en animales asintomáticos, con artritis relacionada con este agente y animales inmunizados con una vacuna recombinante de estas proteínas. Los resultados de este estudio concluyen que estas pruebas pueden ayudar en mejorar las pruebas de diagnóstico de este agente en rebaños ovinos(62). Posteriormente, un estudio evalúa una prueba de ELISA directa utilizando dos antígenos de proteínas recombinantes de esta especie bacteriana (rPmpG y rMOMP-G) y mediante el método de Pepscan, se realizó un mapeo y caracterización de epítopes de células B en estas proteínas en corderos con infecciones por C. pecorum asintomáticas, con poliartritis asociada a C. pecorum y vacunados con las proteínas recombinante. Los resultados revelaron que existe una respuesta inmune de anticuerpos contra PmpG en la infección natural. Los anticuerpos contra MOMP-G se elevaron en animales con poliartritis. Finalmente, se identificó una respuesta de epítopos en corderos inmunizados y en corderos infectados naturalmente(63).

Conclusiones Los estudios enfocados a la identificación de proteínas inmunorreactivas para el desarrollo de pruebas de ELISA y prototipos vacunales contra enfermedades causadas por especies del género Chlamydia que afectan a pequeños rumiantes han tomado mucha relevancia en los últimos años, debido a la importancia en salud pública, bienestar animal y económica que estas representan. Los inmunoensayos con proteínas específicas de cada especie como las Pmp’s, pueden ser un punto clave para evitar reacciones cruzadas entre especies; lo cual, disminuiría resultados erróneos en los laboratorios de diagnóstico veterinario. C. abortus es la especie del género que más importancia ha tenido en la última década; ya que, las vacunas comerciales disponibles no han dado resultados satisfactorios para la prevención y control del AEO; además, del riesgo biológico que esta representa. El uso de vacunas de subunidades como opción para el desarrollo de prototipos tiene buenos niveles de seguridad en comparación con las vacunas comerciales; ya que, no representan un riesgo para el personal que las maneja y ofrecen resultados iguales o superiores a los ofrecidos por éstas.

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Conflictos de interés Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses. Literatura citada: 1. Longbottom D, Coulter LJ. Animal chlamydioses and zoonotic implications. J Comp Pathol 2003;128:217–244. 2. Rodolakis A, Laroucau K. Chlamydiaceae and chlamydial infections in sheep or goats. Vet Microbiol 2015;181:107-118. 3. Sachse K, Bavoil PM, Kaltenboeck B, Stephens R, Kuo CC, Rosselló-Móra R. et al. Emendation of the family Chlamydiaceae: Proposal of a single genus, Chlamydia, to include all currently recognized species. Syst Appl Microbiol 2015;38:99–103. 4. Vorimore F, Hsia R-ching, Huot-Creasy H, Bastian S, Deruyter L, Passet A. et al. Isolation of a new Chlamydia species from the Feral Sacred Ibis (Threskiornis aethiopicus): Chlamydia ibidis. PLoS One 2013;8(9):e74823. 5. Taylor-Brown A, Bachmann NL, Borel N, Polkinghorne A. Culture-independent genomic characterisation of Candidatus Chlamydia sanzinia, a novel uncultivated bacterium infecting snakes. BMC Genomics 2016;17(1):710. 6. Staub E, Marti H, Biondi R, Levi A, Donati M, Leonard CA, et al. Novel Chlamydia species isolated from snakes are temperature-sensitive and exhibit decreased susceptibility to azithromycin. Sci Rep 2018;(1):5660 7. Bommana S, Polkinghorne A. Mini review: Antimicrobial control of chlamydial infections in animals: Current practices and issues. Front Microbiol 2019;10:1-9. 8. Borel N, Polkinghorne A, Pospischil A. A review on chlamydial diseases in animals: still a challenge for pathologists? Vet Pathol 2018;55:374-390. 9. Jelocnik M, Laurence M, Murdoch FR, Polkinghorne A. Detection of Chlamydiaceae in ocular swabs from Australian pre-export feedlot sheep. Aust Vet J 2019;97(10):401403. 10. Johnson F, Matheson BA, Williams H, Laing AG, Jandial V, Davidson-Lamb R, et al. Abortion due to infection with Chlamydia psittaci in a sheep farmer’s wife. Br Med J 1985;290:592-594. 11. Pospischil A, Thoma R, Hilbe M, Grest P, Gebbers FO. Abortion in woman caused by caprine Chlamydophila abortus (Chlamydia psittaci serovar 1). Swiss Med Wkly 2002;132:64-66.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.6103 Revisión bibliográfica

Comportamiento de ingestión y consumo de forraje por vacas en pastoreo en clima templado. Revisión

Juan Daniel Jiménez Rosales a Ricardo Daniel Améndola Massiotti a*

a

Universidad Autónoma Chapingo. Departamento de Zootecnia, Posgrado en Producción Animal. km. 38.5 Carretera México-Texcoco, 56230, Chapingo, Estado de México. México.

*

Autor de correspondencia: r_amendola@yahoo.com

Resumen: El objetivo fue revisar, con base en publicaciones predominantemente recientes, el conocimiento sobre los componentes del comportamiento de ingestión (CI) de vacas que pastorean en clima templado, y su relación con las características de las praderas que regulan el consumo diario de forraje (CF). Los componentes del CI que median el CF son masa de bocado (MB, g MS bocado-1), tasa de bocados (TB, bocados min-1), tasa de consumo (TC, g MS min-1) y tiempo de pastoreo (TP, min día-1). La masa, altura y densidad del forraje de las praderas afectan la MB y consecuentemente, el CF. La altura de la pradera se relaciona con los componentes del CI y es útil para evaluar el CF. Con base en estudios en praderas templadas en estado vegetativo, se destaca que el CF de vacas aumenta con incrementos en altura de la pradera, porque cosechan bocados de mayor MB, lo que les permite obtener altas TC. Pero, hay evidencia de que la TC puede disminuir en praderas demasiado altas; para procesar bocados más grandes, las vacas reducen su TB y ejecutan mayor cantidad de movimientos mandibulares compuestos y de masticación. Por el contrario, en praderas cortas las vacas aumentan su TB y TP, para remediar la reducción en la TC debida a la cosecha de bocados de menor peso, aunque esto no compensa completamente la disminución de TC. Por lo anterior, para mantener altas TC las vacas no deben ser forzadas a consumir forraje a altas intensidades de pastoreo.

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Palabras clave: Tasa de consumo, Tiempo de pastoreo, Tasa de bocados, Masa de bocado, Altura de pradera.

Recibido: 28/11/2021 Aceptado: 22/02/2022

Introducción El consumo de materia seca (MS) y la digestibilidad de la dieta determinan el suministro de nutrientes a vacas estabuladas o en pastoreo, y en consecuencia afectan su producción. Por ello, la comprensión de los factores que afectan el consumo en el corto plazo de forraje por vacas en pastoreo es importante para la gestión del pastoreo, más aún cuando el consumo y, por ende, la producción de vacas en pastoreo es menor que en vacas estabuladas. La ingesta de forraje por bovinos en pastoreo se puede evaluar a partir del comportamiento de ingestión que exhiben durante el forrajeo, ya que adaptan ese comportamiento en función de características de la pradera(1) y diversos factores como la composición química del forraje (fibra por detergente neutro, carbohidratos solubles y proteína cruda), los estímulos de los productos de la fermentación ruminal (N-NH3 y ácidos grasos volátiles), las hormonas del hambre (grelina), la saciedad (leptina y melatonina), el llenado del rumen(2), las consecuencias post-ingestivas ocasionadas por el contenido de metabolitos secundarios en las plantas(3), la suplementación y el estado fisiológico y nutricional(4). Sin embargo, en pastoreo la masa de bocado junto con características de la pradera como; masa, altura y desaparición del forraje son factores que median el consumo y en un estudio explicaron 78 % de las variaciones en la ganancia de peso de bovinos(5). Corroborando este resultado, en un metaanálisis de publicación reciente(6), que involucró 103 publicaciones con 278 experimentos, se confirmó que la masa de bocado (MB) es un componente fundamental del comportamiento de ingestión (CI) en pastoreo; ya que es sensible a las principales características del dosel de la pradera y es factor determinante para la tasa de consumo (TC) y el consumo de forraje (CF). Por la importancia que tiene el consumo de forraje en la producción animal en pastoreo y debido a los efectos de las características del pastizal inducido (pradera) en el comportamiento de ingestión, el propósito de esta revisión es caracterizar los componentes del comportamiento de ingestión de vacas en pastoreo en clima templado, con base en resultados de investigaciones principalmente recientes, realizadas en su mayoría en praderas de clima templado homogéneas (monofitas, con escasa variación espacial en los ejes vertical y horizontal). Estos estudios, han permitido avanzar en la comprensión de las relaciones 744


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funcionales entre características de las praderas con las dimensiones del bocado y la TC(7). La predominancia del estudio del comportamiento ingestivo de bovinos en praderas homogéneas se debe a la mayor dificultad en la metodología para evaluar dicho comportamiento en vegetaciones más heterogéneas, con plantas que difieren en su morfología y estructura(8). Al inicio de este documento se definen y describen los componentes del comportamiento de ingestión y las escalas espacio temporales del ambiente de pastoreo; luego, se presentan conceptos sobre las dimensiones del bocado, para analizar su relación con la densidad del forraje e impacto en la ingesta de forraje. Más adelante, se aborda la importancia de la altura de la pradera y su reducción, como medidas de abundancia de forraje, sobre el comportamiento de ingestión y el consumo. Al final, se describen el patrón de actividad de pastoreo de vacas y resultados de comportamiento de ingestión y consumo.

Comportamiento de ingestión y escalas de pastoreo El conocimiento del CI de las vacas es imprescindible para comprender y gestionar su CF. En el análisis del CI de las vacas para evaluar el CF (g MS d-1), se integran componentes de la conducta de los animales y atributos de la pradera (Figura 1). Los componentes son MB (g MS bocado-1), tasa de bocados (TB, bocados min-1), TC (g MS min-1) y tiempo de pastoreo (TP, min d-1). Las vacas colectan el forraje en diferentes escalas jerárquicas de espacio y tiempo del ambiente de pastoreo, tomando decisiones, que en su conjunto se conocen como comportamiento de ingestión, equivalente a la dinámica de forrajeo (Figura 2)(9). Figura 1: Componentes del comportamiento de ingestión de vacas en pastoreo(1,10,11).

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La escala más pequeña de la dinámica de forrajeo es el bocado y su obtención se define como la colocación de forraje en la boca y su desprendimiento del resto de la planta por movimientos de la boca y de la cabeza(8,12). Con movimientos de los labios, lengua y mandíbulas ocurre la aprehensión y acomodo del bocado dentro de la boca y con movimientos de la cabeza se obtiene la tensión para lograr la ruptura del forraje. Durante esta operación, los bovinos utilizan la lengua para introducir el forraje en su boca y para ampliar el área de bocado(13). Figura 2: Escalas espaciales y temporales del comportamiento de pastoreo de herbívoros grandes(9,11,12)

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La escala espacial siguiente es la estación de alimentación, área en la que el animal selecciona y toma bocados con movimientos del cuello sin mover sus patas delanteras(14). El nivel inmediatamente superior es el parche, que consiste en un conjunto de estaciones de alimentación(13). El forrajeo en estas escalas puede durar desde 1 seg hasta 30 min, en superficies que van desde pocos cm² hasta 1 ha(9). La escala siguiente es el sitio de pastoreo, que está integrado por distintos parches donde la vaca consume forraje durante una sesión de pastoreo(13). El tiempo de permanencia en esta escala varía entre 1 y 4 h, en superficies que van desde 1 a 4 ha(9). Por último, la escala superior del comportamiento de pastoreo es el campo de pastoreo, que implica mayor tiempo (semanas) y espacio (km²). Dicha escala puede ser alcanzada por hatos de ganado que, durante el pastoreo, se mueven dentro de grandes pastizales(15). El tiempo de permanencia de los grandes herbívoros (incluidos los bovinos) en las diferentes escalas, en general es función de la cantidad y calidad del forraje que allí se encuentra(9); además de otros factores que incluyen la topografía del área(16), la ubicación del agua(17), la estación del año(18), así como componentes del comportamiento social del ganado(19). El genotipo del animal es un factor en el que se han encontrado resultados contradictorios, en una investigación se comparó el pastoreo de vacas Beefmaster × Simford con el de vacas Baladi de menor tamaño, las vacas Baladí presentaron mayor tiempo de pastoreo y distancia recorrida(18). En otro estudio, compararon toretes de maduración temprana (Angus y Hereford) y maduración tardía (Limousin, Charolais) y no encontraron diferencias en comportamiento ingestivo y consumo entre genotipos(20). Sin embargo, el consumo de forraje en vacas F1 Hereford × Angus durante la gestación fue menor que en vacas Hereford y Angus(21). En la investigación sobre el CF por vacas lecheras en praderas, han predominado los estudios de corto plazo, en las escalas de bocado(22,23), estación de alimentación(24,25), parche(26,27) y sitio de pastoreo(16). Una causa de que la investigación se haya focalizado más en el corto plazo es porque pocos investigadores cuentan con acceso a la grabación automática del CI y personal capacitado para hacer observaciones a largo plazo(7). Sin embargo, la ganadería de precisión, que abarca el uso de herramientas tecnológicas para evaluar el comportamiento del ganado(28), puede contribuir a tomar decisiones sobre la gestión en tiempo real y comprender mejor la relación planta-animal en los sistemas de pastoreo. Al respecto, existen diversos sensores y dispositivos que se han utilizado para el monitoreo de movimientos mandibulares y el comportamiento de ingestión de bovinos en pastoreo(12). El CF de los animales en pastoreo se puede describir aritméticamente como el producto de dos componentes, TC y TP(1) y, a su vez la TC como el producto de TB y MB(29). Por su parte, la TB está determinada por los movimientos mandibulares (Figura 1) que pueden ser diferenciados con equipos que registran ya sea señales mecánicas(30) o acústicas(31). Los movimientos mandibulares son de masticación, bocado y compuestos (masticación747


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bocado)(23), estos últimos han sido identificados exclusivamente con el análisis acústico(32). Un metaanálisis de publicación reciente(6) que involucró 103 publicaciones con 278 experimentos, confirmó que la MB es un componente fundamental del CI en pastoreo, ya que es sensible a las principales características del dosel de la pradera y es factor determinante para la TC y el CF. Para comprender la estrategia de forrajeo de los animales en pastoreo y poder optimizar el CF entre las escalas, hace más de dos décadas se postuló en un modelo que el desplazamiento entre las escalas más pequeñas está gobernado por la TC de las escalas jerárquicas inmediatamente inferiores (Figura 2)(33). Por ejemplo, cuando una vaca cosecha bocados dentro de una estación de alimentación, el pastoreo puede continuar hasta que la TC de los últimos bocados cae por debajo de un umbral. Si esa situación se presenta, la vaca se desplazará hacia la próxima escala jerárquica superior, en la que se realizará la cosecha de bocados a nivel de parche, y ahí a su vez permanecerá hasta que la TC llegue al umbral inferior. Al respecto, se ha destacado que el tiempo de permanencia de animales cosechando bocados en cada estación de alimentación refleja la condición del dosel forrajero; cuando la calidad estructural del forraje es mejor en relación hoja/tallo, masa, altura y densidad de forraje mayor será el tiempo de permanencia(13). En un estudio se documentó que bovinos y ovinos permanecieron menos entre estaciones de alimentación y se desplazaron más rápidamente entre ellas en praderas nativas del sur de Brasil de baja altura (4 y 8 cm), que de mayor altura (12 y 16 cm)(14). Asimismo, en otro estudio se obtuvo que el tiempo de permanencia de novillos en la estación de alimentación de ballico anual (Lolium multiflorum Lam.) con avena negra (Avena strigosa Schreb) aumentó con incrementos en la altura de la pradera (10, 20, 30 y 40 cm)(34). En relación con el CF a nivel de estación de alimentación, en una investigación se obtuvo que novillos pastoreando trigo (Triticum aestivum L.) de mayor altura (23.6 cm) tuvieron 1.9 veces mayor TC de forraje y cosecharon más bocados en el área pastoreada por estación de alimentación, que en praderas de menor altura (20.4 y 19.5 cm)(35). Esto es evidencia de que la estrategia de forrajeo que emplean los bovinos para lograr una alta ingesta de forraje durante el pastoreo, es aumentar su TC en parches con alta cantidad de forraje (mayor altura) y desplazarse más rápidamente entre estaciones de alimentación cuando se encuentran con parches de menor oferta de forraje (menor altura). La distancia entre los parches potenciales para la ingesta de forraje también es importante en los componentes de la TC. Al respecto, se obtuvo que el número de bocados, los tiempos de permanencia, la velocidad de desplazamiento y la proporción de forraje total consumido por vacas en parches de alfalfa (Medicago sativa L.) y festuca (Festuca arundinacea L.) se incrementaron y la TC se redujo con el aumento en la distancia entre parches (1, 4 y 8 m)(27); 748


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las vacas realizaron un uso más uniforme de las especies a medida que la distancia entre parches fue mayor.

Dimensiones del bocado El CF de un animal en pastoreo está relacionado con la capacidad que tiene su aparato recolector(11) y con la dinámica de la respuesta funcional, que es la relación que hay entre la TC y algunas variables que describen la abundancia de forraje en el área de pastoreo, por ejemplo, biomasa, altura y densidad del forraje(36). Por ello, el CF por bocado se puede evaluar por las dimensiones del bocado y la densidad aparente del forraje (DAF). La MB se puede cuantificar con el uso de aritmética, como el producto del volumen del bocado (VB) y la DAF(1). El VB no es el volumen de la cavidad bucal, sino el que ocupaba el forraje en la pradera que es cosechado con el bocado, el cual se ha considerado un cilindro de profundidad y área determinadas (Figura 1). Como resultado de un metaanálisis, se publicó que hay una relación curvilínea entre el VB (y) y la altura de la pradera (x), y=9.63*(1-exp (0.00125x)), n=90, RMSE=0.30, debida a las respuestas que hay entre la profundidad y el área del bocado por efecto del aumento de la altura de la pradera(10). La profundidad del bocado se puede definir como la diferencia entre la altura media inicial de los hijatos y la altura media de los hijatos medida después del pastoreo(8) y en praderas de gramíneas puede conocerse a partir de la medición del largo de los hijatos extendidos antes y después del pastoreo(14). Además, resultados obtenidos en diferentes especies de forrajes y rumiantes ponen de manifiesto que hay una relación lineal entre la profundidad del bocado (y) y el largo de los hijatos extendidos (x), y=1.1+0.52x, R2=0.84, n=203, lo que destaca que la profundidad de bocado corresponde al 52 % del largo de los hijatos(1). El valor de la pendiente del modelo anterior se aproxima a la pendiente obtenida con otro modelo basado en datos de experimentos realizados con bovinos, que indicaron que la profundidad del bocado (y) se incrementa de manera lineal con la altura de la pradera (x), y=1.41+0.44x, RMSE=1.4, n=149(10). Con base en lo anterior, hay evidencia(1,10) para sustentar que la profundidad del bocado en bovinos se aproxima a 50 % de altura de la pradera. No obstante, en un experimento previo sobre profundidad de bocado(26), se concluyó que hay que tener precaución con este concepto de proporcionalidad, a pesar de que en el mismo experimento se documentaron valores de profundidad de bocado en vacas de 40 a 55 % de altura de una pradera de ballico inglés (Lolium perenne L.). También, se reportó que la profundidad del bocado aumentó de manera progresiva durante los primeros 10 a 20 bocados, lo que indica que el ganado puede ser cauteloso al evaluar los parches durante el pastoreo(26).

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El área del bocado en estudios con parcelas construidas manualmente se calcula como el cociente del área total pastoreada entre el número de bocados realizados(37). El área del bocado en bovinos aumenta con la altura de la pradera, con una relación curvilínea y un máximo teórico de 153.6 cm2(10). La DAF se refiere a la relación entre la masa del forraje y el volumen que ocupaba dicha masa en la pradera. En estudios sobre dimensiones del bocado la DAF se estima por el cociente de la masa de forraje y el volumen del estrato del dosel(38). La disminución de la DAF tiene un efecto positivo en el área de bocado de bovinos; en valores más bajos DAF el área de bocado fue cercana a 130 cm², mientras que para los valores altos de DAF el área de bocado presentó un valor mínimo de 33 cm²(10). La altura y densidad de las praderas templadas no varían de manera independiente, sino que por lo regular están inversamente relacionadas. En praderas muy cortas (en general más densas) no son posibles mayores áreas de bocado, ya que los componentes cortos (esencialmente hojas) que se ubican en los bordes del área del bocado que el animal intenta tomar, escapan a la captura por la lengua y la prensión por medio de los dientes y el rodete dental(12). Por el contrario, en las praderas de clima templado de mayor altura en estado vegetativo la profundidad del bocado y el área de bocado son mayores debido a que se facilita la aprehensión de los componentes del dosel(13). En estos casos los bovinos ejecutan movimientos mandibulares compuestos; el animal toma un nuevo bocado cuando aún se encuentra masticando el bocado que tomó previamente(23).

La altura de la pradera en el consumo Hasta ahora se han destacado los efectos de la altura de la pradera y la DAF en las dimensiones del bocado. Pero es importante discutir el impacto que tiene la altura de la pradera sobre el CF en pastoreo y, explicar cómo este último está mediado por los componentes del CI y por la MB(6,10). Sin embargo, en praderas templadas y tropicales, en estado vegetativo, el CF será afectado de manera positiva por la altura de la pradera, siempre y cuando se mantengan doseles con alta densidad de hojas verdes(29,39,40). El aumento del CF por vacas lecheras en pastoreo es una respuesta clásica al incremento en la altura de pradera, la que se explica por los cambios que ocurren en los componentes del CI durante el pastoreo, también por efecto de cambios en la altura de pradera (Figura 3). Esto se evidenció desde un trabajo clásico realizado con borregas en praderas templadas(40) y en los últimos años, resultados obtenidos con bovinos de carne en praderas tropicales(29) confirmaron lo mismo. La respuesta clásica de la TC y la MB por efecto de la altura de pradera es que dichas variables se incrementan con el aumento de la altura(29,40,41,42). No obstante, estudios recientes en los que se evaluaron diferentes alturas de pradera en Cynodon sp. (10, 15, 20, 25, 30 y 35 cm) y Avena strigosa Schreb (15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 y 50 cm), destacaron que si bien se encontró el mismo patrón, la TC y la MB disminuyeron en las

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praderas más altas que se evaluaron(24); los resultados evidenciaron una respuesta funcional en forma de cúpula, donde la TC de forraje fue mayor en alturas de pradera intermedias en ambas especies (39.2 g MS min-1 con 19 cm en Cynodon y 54 g MS min-1 con 29.3 cm en avena)(43). Los autores del trabajo resaltaron que dicha respuesta fue el resultado de cambios en la MB en las praderas altas (30 y 35 cm en Cynodon, 45 y 50 cm en avena) y atribuyeron la disminución de la MB a una reducción en su volumen, debida a menor área de bocado impulsada por el comportamiento selectivo de los animales, ya que no se relacionó con restricciones de la pradera que limitaran la formación del bocado(43). Con el aumento de la altura de pradera, los bovinos también incrementan el total de movimientos mandibulares por gramo de MS consumida(38), porque los animales tienen que ejecutar mayor número de movimientos mandibulares por cada bocado debido a que estos son de mayor masa y, por ello, requieren mayor número de masticaciones para que se pueda tragar el forraje(6,41). En resumen, la MB y el CF en praderas templadas, en estado vegetativo, pueden resultar mayores en praderas con alturas intermedias(43) y altas(29), y para procesar bocados de mayor tamaño, los bovinos incrementan el número de movimientos mandibulares compuestos(23). Otro cambio importante en el CI de las vacas en pastoreo en respuesta al incremento en altura de pradera es la reducción en la TB y TP (Figura 3); la primera es consecuencia de la mayor cantidad de forraje aprehendido por bocado, que implica un aumento en el tiempo por bocado(24) por el incremento del número de movimientos mandibulares de masticación(34). En otras palabras, a medida que los bovinos aprehenden más forraje por bocado emplean más tiempo para masticar, lo que aplaza la toma del siguiente bocado(6,34).

La reducción de la altura de la pradera en el consumo Hasta ahora se ha referido cómo el CF se explica por el CI de los animales y por características estructurales del dosel de la pradera (cantidad de forraje, DAF y altura de pradera) que regulan la MB, con base en estudios donde se evaluaron dichas variables en plantas en estado vegetativo de diferentes alturas. Sin embargo, es importante discutir el efecto que, sobre el CF tiene la reducción de altura de la pradera que se presenta con el agotamiento rápido del recurso forrajero que ocurre durante el pastoreo a través del día. La cosecha de bocados durante el pastoreo se realiza a través de horizontes del dosel forrajero, a una profundidad más o menos constante de 50 % de altura de la pradera(11). Los bovinos inician el pastoreo en el horizonte 1 (H1), consumen 50 % de la altura del forraje y después continúan al horizonte 2 (H2), en el que cosecharán de manera aproximada la misma proporción de altura correspondiente al horizonte, hasta llegar al horizonte 3 (H3) y finalizar a una altura límite de pastoreo (Figura 1). En una investigación realizada con

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bovinos se obtuvo que la profundidad, el área y la MB en trigo, sorgo (Sorghum sacharatum L.) y alfalfa (Medicago sativa L.) variaron a través de los horizontes de pastoreo(22). Desde el H1 hasta el H3, las profundidades de bocado disminuyeron en 76, 78 y 70 %, las áreas de bocados se redujeron en 44, 56 y 56 % y en consecuencia las MB fueron menores en 61, 71 y 87 %, respectivamente para trigo, sorgo y alfalfa. En la estructura vertical de la pradera se encuentra parte de la causa de la variación en las dimensiones del bocado, porque el aumento del seudotallo, tallo y material muerto desde la superficie de la pradera hasta su base, se vuelven barreras para la formación del bocado(11,38), y en consecuencia modifican la MB y a su vez el CF. También, se ha documentado que el seudotallo y las alturas de rebrote y material muerto dentro del dosel forrajero, son reguladores parciales de la profundidad de bocado(26). Por lo anterior, la disminución del área de bocado desde H1 a H3 se debe a la disminución de hojas en la base del dosel forrajero y a la dificultad de aprehensión del forraje que escapa al barrido de la lengua(22). Además, el aumento de la DAF en los estratos más bajos de las praderas(38,39), afecta de manera negativa el área de bocado(10). Con base en lo anterior, hay evidencia para destacar que la disminución del CF que se presenta con la reducción de la altura de la pradera, cuando los animales son forzados a cosechar hasta el horizonte más bajo de la pradera, se debe a la cosecha de bocados pequeños. El pastoreo en franjas se asocia con situaciones de rápido agotamiento del recurso forrajero y cuando los niveles de reducción de altura de pradera en dicha situación no se controlan, el CF puede ser afectado de manera negativa(44). Sin embargo, en situaciones de gestión diferente, en las que las praderas no presentan cambios en su condición durante el día, la TC es constante y el comportamiento del consumo es similar a través del día(29). El pastoreo rotatinuo (baja intensidad y altas frecuencias de pastoreo) es una estrategia de gestión para mantener altas TC de forraje, ya que los animales cosechan la mayoría de los bocados en el H1(1,45). Por tanto, es importante resaltar que el control de la intensidad del pastoreo durante la gestión de la pradera es una medida de manejo útil para tener una idea del nivel de CF. Por ejemplo, para maximizar el CF en vacas lecheras en pastoreo de Lolium arundinaceum, se ha destacado que la gestión del pastoreo debe realizarse a bajas intensidades de pastoreo; alturas de forraje residual de 12 y 15 cm en otoño-invierno y primavera, respectivamente(25). Mientras que, en bovinos bajo pastoreo de avena negra cv. Iapar 61, Cynodon sp. cv. Tifton 85(24) y sorgo (Sorghum bicolor L.)(46) se encontró que altas TC se mantenían hasta un nivel de reducción de 40 % de altura de la pradera. El forraje residual más corto, no solamente se traduce en menor consumo, sino que también en menor selectividad lo que contribuye a menor ingesta de materia orgánica digestible, y por tanto menor producción de leche(25). Los bovinos y ovinos en pastoreo son capaces de aumentar su TB y TP ante situaciones de baja MB (Figura 3) como estrategia conductual para compensar de manera parcial la 752


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reducción en la TC(6,7). No obstante, no se compensa de manera completa la disminución de la cantidad de forraje ingerido por bocado y como resultado el CF es menor(7). Por diferencias en conducta animal, la respuesta se presenta en pastoreo continuo y rotacional pero no así en pastoreo en franjas; en estos casos, la altura se torna en factor muy limitante, ocasionando que los animales opten por no pastorear durante más tiempo por la baja retribución asociada a masas de bocados muy pequeñas(20,47).

El tiempo de pastoreo y el consumo de forraje Durante el día las vacas realizan actividades de pastoreo, rumia y otras acciones. Algunos resultados del tiempo que dedican las vacas a cada actividad en clima templado en pastoreo de ballico inglés se presentan en el Cuadro 1. Las vacas en praderas templadas exhiben diferentes sesiones de pastoreo durante el día, entre tres y cuatro sesiones, dos de mayor intensidad; al medio día y antes del anochecer(2). En un estudio en pastoreo de ballico inglés con asignación de forraje por la mañana, vacas invirtieron entre 70 y 80 % de su tiempo en pastoreo después de las ordeñas matutina y vespertina(48). Al respecto, en otra investigación(49) se encontró que conforme transcurrieron las primeras 4 h después de las ordeñas matutina (después de las 0800 h) y vespertina (después de las 1500 h) el porcentaje de vacas en pastoreo declinó de 94 a 35 % (ordeña matutina) y 87 a 9 % (ordeña vespertina). En relación con los tiempos de rumia e inactividad por vacas lecheras, éstas dedican más del 70 % de su tiempo a dichas actividades por la noche(48,49). A pesar de que el mayor tiempo de rumia se presenta durante la noche, también hay periodos de rumia en el día. La rumia durante la noche se asocia con la conducta natural que exhiben los rumiantes; al atardecer consumen forraje lo más rápido posible y reservan la rumia para la noche, cuando se ocultan con relativa seguridad y disminuyen los riesgos de ser depredados(2). Debido a que el tiempo total de pastoreo diario es el resultado acumulado de todos las sesiones o eventos de pastoreo, con fines de estimación de CF el TP debe ser de pastoreo activo, el cual está determinado por el número y la duración de las sesiones de pastoreo (SP) durante el día(13). La SP por definición se refiere a una secuencia larga de pastoreo, la cual se caracteriza por un mínimo de 20 min de pastoreo activo, cuya interrupción ocurre por la realización de cualquier otra actividad, también por un periodo mínimo de 20 min(50). A partir de investigaciones realizadas en pastoreo rotacional de praderas dominadas por ballico inglés, se ha encontrado que vacas lecheras pueden efectuar alrededor de 5.6 a 10.0 SP a través del día (Cuadro 1) y la duración de la SP es de aproximadamente 90 min. El número de SP y su duración se han asociado con la calidad y cantidad de forraje; si la masa de forraje disponible es elevada, el número de SP es mayor y su duración es menor(25). En esas situaciones los bovinos se vuelven más selectivos y por ende pueden cosechar forraje de mayor calidad en menor tiempo(50).

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El CF en vacas lecheras bajo pastoreo de praderas dominadas por ballico inglés es de aproximadamente 3 % de su peso vivo (PV), a partir de la integración de resultados sobre componentes de CI reportados(48,51) (Cuadro 1). No obstante, la variación alrededor de esa media puede ser elevada, debido a factores de la pradera, de gestión del pastoreo y del animal. En una revisión sobre pastoreo de praderas templadas, se reportaron valores de CF en vacas lecheras de 1.6 a 3 % del PV.

Tasa de consumo de diferentes categorías Con base en los resultados del Cuadro 1, la TB es similar entre vaquillas y vacas adultas (en promedio 59 bocados min-1), en cambio, la MB promedio es mayor en animales adultos (0.41 g) que en jóvenes (0.22 g). Lo anterior se debe a la mayor longitud en la arcada de los incisivos de las vacas, porque determina el área y el volumen de bocado y en consecuencia la MB(10). Por lo anterior, la TC promedio reportada en las vaquillas es menor (12.8 g MS min-1) que en las vacas (24 g MS min-1).

Conclusiones Aunque las vacas en praderas de baja altura (cortas) tienen la capacidad de aumentar la TB y el TP, como estrategia conductual para remediar la reducción en la TC debida a la cosecha de bocados de menor peso, los animales no compensan la disminución de la cantidad de forraje ingerido por bocado y como resultado el CF puede ser bajo. Por tanto, cuando las vacas se mantienen en praderas muy cortas o en situaciones de sobrepastoreo es seguro que las TC serán bajas y en consecuencia el consumo diario de forraje será menor. Debido a la relación que tiene la altura de la pradera con los componentes del CI y el CF, en la práctica el monitoreo de la altura de la pradera puede ser una herramienta útil para evaluar el CF y mantener altas TC en los bovinos. No obstante, en México hace falta desarrollar investigaciones enfocadas a evaluar la TC de bovinos en pastoreo a diferentes alturas de pradera, que permitan generar implicaciones prácticas para la gestión del pastoreo. Agradecimientos y conflicto de interés Los autores agradecen el apoyo del CONACYT para los estudios de doctorado del primer autor y declaran que no tienen ningún conflicto de interés. Literatura citada: 1. Carvalho PCF. Harry Stobbs Memorial Lecture: Can grazing behavior support innovations in grassland management? Trop Grassl 2013;1(2):137-155. https://doi.org/10.17138/tgft(1)137-155.

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Figura 3: Consumo de forraje y componentes del comportamiento de ingestión en respuesta a la altura de pradera(29,40)

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Cuadro 1: Componentes de la conducta de ingestión, tiempos de pastoreo, rumia e inactividad en vacas lecheras bajo pastoreo en praderas de clima templado Vacas lecheras Vaquillas (52) Ballico inglés Ballico Ballico Trifolium (53) (51) inglés inglés repens(51) Consumo de forraje, kg MS 100 kg PV-1 3.3 3.0 3.0 2.4 -1 Consumo de forraje, kg MS día 15.2 15.5 6.9 5.5 -1 Tiempo de pastoreo, min día 629 646 536 436 -1 Tasa de consumo, g MS min 24.2 23.9 12.8 12.7 -1 Tasa de bocados, bocados min 62 57 61 55 Masa de bocado, g 0.39 0.42 0.21 0.23 Tiempos de pastoreo, rumia y otras actividades en vacas lecheras Ballico inglés(48) Ballico (80 %) Ballico Ballico (80 %) y (48) (53) y Trébol inglés Trébol(54) Tiempo de pastoreo, min día-1 622 591 646 549 -1 Pastoreo, sesiones día 6.5 5.6 10.0 9.6 -1 Duración de sesión, min período 99 120 79.5 63 -1 Rumia, min día 431 402 426 401 -1 Otras actividades, min día 388 447 368 490

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.5985 Revisión bibliográfica

La citometría de flujo, un universo de posibilidades en el ámbito veterinario. Revisión

Luvia Enid Sánchez-Torres a* Alejandra Espinosa-Bonilla b Fernando Diosdado-Vargas c

a

Instituto Politécnico Nacional. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Departamento de Inmunología. Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n, Colonia Santo Tomás, Alcaldía Miguel Hidalgo, 11340, Ciudad de México, México. b

Instituto Politécnico Nacional. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Central de Instrumentación. México. c

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Ciudad de México, México.

* Autor de correspondencia: luviasanchez@hotmail.com

Resumen: La citometría de flujo es una tecnología que ha favorecido el rápido avance de muchas y muy diversas áreas de la ciencia, ya que permite la medición simultánea de múltiples características de cada una de las partículas o células individuales que se encuentran en una muestra mientras pasan a gran velocidad a través de una zona iluminada por uno o varios láseres. La información obtenida incluye datos sobre el tamaño y la complejidad interna, así como otros parámetros inherentes a cada una de las partículas presentes en la muestra, los cuales son captados por el equipo como señales luminosas. Las partículas más comúnmente analizadas en los citómetros de flujo son células, así que puede analizarse la expresión de moléculas tanto en su superficie como en su interior, la viabilidad, la funcionalidad, la proliferación celular, el contenido de ADN y la producción de citocinas entre muchas otras. Estas determinaciones pueden realizarse gracias a la utilización de anticuerpos acoplados a 763


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fluorocromos o bien, al uso de moléculas cuya fluorescencia depende de la característica que se quiera evaluar. Algunos citómetros de flujo son además clasificadores (“sorters”), lo que implica que el equipo puede separar físicamente las células que presentan las características de interés y además, es factible que una vez que han sido purificadas, éstas puedan emplearse en posteriores experimentos. En esta revisión se concentran los fundamentos de la citometría de flujo y sus principales aplicaciones, las cuales ofrecen una gran ventana de oportunidad en el ámbito veterinario, tanto en investigación como en la clínica. Palabras clave: Citometría de flujo, Inmunofenotipo, Viabilidad, Muerte celular, Análisis de DNA, Citocinas.

Recibido: 28/04/2021 Aceptado: 17/11/2021

Generalidades de la citometría de flujo La citometría de flujo (CF) permite analizar simultáneamente varias características individuales de células o partículas en suspensión a medida que pasan por uno o varios haces de luz láser. Los citómetros de flujo pueden leer miles de células por segundo con la posibilidad de regular la velocidad de análisis, de tal manera que el análisis multiparamétrico y la velocidad a la que se realiza, constituyen dos de sus principales y más poderosas ventajas. El tipo de muestra que puede utilizarse es muy diverso e incluye sangre, poblaciones celulares purificadas, líneas celulares, suspensiones celulares de órganos sólidos, núcleos extraídos de bloques de parafina, organelos celulares, liposomas, vesículas extracelulares y líquidos corporales, entre otros. Las células que pueden estudiarse en un citómetro de flujo pueden provenir de diferentes especies animales, vegetales e incluso, es posible hacer estudios directamente en microorganismos(1-5). Debido a la posibilidad de estudiar también partículas inertes, es factible analizar y cuantificar moléculas en solución, las cuales pueden estar en muestras de suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, calostro, semen, sobrenadantes de cultivos, etc.(6,7). Dada su gran versatilidad, la CF es actualmente una de las técnicas más utilizadas en diversas áreas. La relevancia de sus aportaciones y la transcendencia de los resultados obtenidos ha llevado a integrar asociaciones nacionales e internacionales que han permitido compartir información y establecer protocolos unificados (Páneles de inmunofluorescencia multicolor optimizados, “OMIP” por sus siglas en inglés) para diversas aplicaciones, principalmente aquellas relacionadas con la caracterización de poblaciones celulares y con el diagnóstico clínico, algunas de las cuales están enfocadas al campo veterinario(8-11), así como revistas

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especializadas en el tema como “Cytometry”(12). El uso de esta tecnología en el ámbito veterinario se ha ido incrementado de manera lenta y gradual; se tienen reportadas múltiples aplicaciones no solo en investigación sino en la clínica, tanto para animales de compañía como para animales de vida salvaje. Los aspectos de la medicina veterinaria que más se han beneficiado de la CF son el diagnóstico, el pronóstico y la inseminación artificial(13-19); desafortunadamente en México, su uso en la clínica veterinaria es escaso ya que no hay laboratorios que cuenten con alguno de estos equipos. En el área de investigación veterinaria, diversas instituciones educativas cuentan con equipos en los cuales se pueden realizar ese tipo de análisis, siendo aún poco el uso que se hace de esta tecnología. Es por lo anterior que, en este documento se pretende recalcar su versatilidad y dar a conocer las múltiples áreas de oportunidad que existen en el ámbito veterinario para aprovechar todas las aplicaciones de la citometría de flujo, sobre todo en la clínica.

Fundamentos de la citometría de flujo Las propiedades que pueden ser medidas por un citómetro de flujo incluyen el tamaño, la complejidad interna y la intensidad de fluorescencia de las células analizadas. Todos estos parámetros son determinados de manera relativa y no se generan valores absolutos, a menos que se utilicen estándares y controles de referencia(20,21). Las partículas o células que van a ser analizadas deben estar en suspensión, de tal manera que son tomadas por el equipo y son dirigidas a un espacio físico llamado por algunos autores como “punto de interrogación”, que es el sitio en el cual, el láser o láseres del equipo inciden sobre las células (Figura 1A). Cuando el láser incide en cada una de las células de la muestra, provoca la dispersión de la luz en varias direcciones, lo cual da información sobre su tamaño y complejidad relativas (Figura 1B); si además hay moléculas fluorescentes presentes en la célula, el equipo capta la fluorescencia emitida por estas, pudiendo dar información sobre la expresión de moléculas y algunas funciones celulares, entre otras características como se detalla más adelante (Figura 1C). La magnitud de cada una de las señales para tamaño, complejidad y fluorescencia es registrada para todas y cada una de las células de la muestra que pasan a través del láser, por lo que es una tecnología que hace un análisis individual, célula por célula. Finalmente, las señales emitidas son recolectadas y transformadas en valores que pueden ser analizados por una computadora e interpretadas por los usuarios de manera sencilla (Figura 1C)(22).

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Figura 1: Funcionamiento general de un citómetro de flujo

La muestra es llevada al sitio físico en el cual el láser incide sobre cada una de las células llamado punto de interrogación. El alineamiento de las células se logra gracias a la diferencia de presión a la cual circula la solución que va por fuera de la muestra (líquido envolvente), generando el enfoque hidrodinámico de las células (A). Cuando el láser incide sobre cada célula es desviado con base en el tamaño y la complejidad interna de cada una de ellas; dichas señales son detectadas en el detector frontal (FSC) y el detector lateral (SSC) respectivamente (B). Los detectores de tamaño, complejidad y los que captan las señales fluorescentes, llevan la información a una computadora para que ésta la muestre en gráficos sencillos de interpretar (C). Imagen creada parcialmente con BioRender.

Componentes de un citómetro de flujo Los citómetros de flujo están compuestos de tres sistemas principales: sistema de fluidos, sistema óptico y sistema electrónico(2,23). El sistema de fluidos toma la muestra y dirige a las células al punto de interrogación. Para que las partículas sean iluminadas de la mejor manera, éstas deben pasar una por una por el centro del haz del rayo láser. Lo anterior se logra gracias al enfoque hidrodinámico, que favorece el alineamiento de las células en el flujo gracias a la diferencia de presión que hay entre la suspensión celular y el líquido que va por la parte externa, llamado líquido envolvente, como se muestra en la figura 1A(24,25). El sistema óptico está compuesto por dos sistemas, el de excitación (láseres) y el colector de señales(26). Cuando el láser se encuentra con una célula, éste se dispersa dependiendo de las propiedades físicas de la célula, en particular de su tamaño y su complejidad interna. La luz dispersada es captada por un detector frontal (forward scatter = FSC) y el valor reportado es

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proporcional a la superficie celular o tamaño de la partícula iluminada. Por otro lado, la luz que se dispersa lateralmente es captada por otro detector ubicado a 90° del láser (side scatter = SSC), en este caso, el valor generado es proporcional a la complejidad interna de la célula o de la partícula(22-23). En la figura 1B, se muestra un esquema representativo. Con base en los valores de FSC y el SSC de cada célula en la muestra, el sistema electrónico de los citómetros construye gráficos que permiten ubicar en posiciones diferentes, a aquellas células de la muestra que tengan diferencias suficientes entre ellas en cuanto a su tamaño o complejidad. Es decir, se toma una muestra de sangre periférica, se lisan sus eritrocitos y se pasan por un citómetro, los linfocitos aparecerán en el gráfico en una posición diferente a la de los neutrófilos, ya que los primeros son pequeños y su complejidad interna es baja, mientras que los neutrófilos son más grandes y son más complejos en su interior dado que su núcleo es multilobulado y tiene gran cantidad de gránulos (Figura 1C)(1-2). Cabe mencionar que la ubicación en el gráfico de FSC y SSC no da la identificación de las poblaciones celulares; como se verá más adelante, se requiere del uso de anticuerpos para definir sin lugar a duda, la identidad de las células presentes y la proporción en la que se encuentra cada una en la muestra que se analiza. El sistema electrónico se encarga de hacer la conversión de las señales ópticas en señales electrónicas proporcionales o pulsos de voltaje. Las señales de luz son generadas conforme cada una de las células pasa por el haz del láser. Estas señales de luz son transformadas en señales electrónicas mediante fotodetectores y con base en su intensidad, se les asigna un valor relativo en una escala. Las señales con idénticas intensidades se acumulan en el mismo valor de la escala, lo que incrementa la altura del pico y las señales de mayor intensidad se representan en los valores más altos de la escala del gráfico. Finalmente, todos estos valores se presentan de manera en que los usuarios pueden interpretar los resultados obtenidos por el equipo, como se ejemplifica más adelante(22,25,27). Aunado a la información que se puede tener de las células o partículas con respecto a su tamaño y complejidad interna, se puede obtener información sobre otras características basada en señales fluorescentes(28). Un compuesto fluorescente o fluorocromo es capaz de absorber la luz dentro de un rango determinado de longitudes de onda y en consecuencia de emitir a una longitud de onda mayor a la de absorción. El rango de longitudes de onda en las cuales un compuesto fluorescente puede excitarse es llamado espectro de absorción, y el rango de longitudes de onda de los fotones emitidos es denominado espectro de emisión(25). La fluorescencia que puede ser detectada en un citómetro puede ser intrínseca o extrínseca, es decir, puede provenir de moléculas que forman parte de la célula (riboflavinas, NADPH, triptófano, tirosina, etc.) y por ello suelen denominarse como autofluorescencia, o bien provenir de algún reactivo fluorescente que se añadió a la muestra(1). Los reactivos más utilizados en CF son los anticuerpos, los cuales se unen a la molécula contra la cual fueron fabricados y que se quiere detectar. Estos anticuerpos, llamados anticuerpos primarios, pueden estar marcados con algún fluorocromo (Figura 2A) o bien, requerir de un segundo 767


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anticuerpo o anticuerpo secundario que reconozca al anticuerpo primario y que sea el secundario el que esté conjugado al fluorocromo (Figura 2B)(23). En algunas de las aplicaciones de la citometría no se utilizan anticuerpos como herramientas sino moléculas cuya longitud de onda de emisión o bien la intensidad de fluorescencia, depende de la característica celular que se quiere evaluar (Figura 2C). Figura 2: Tinción para citometría de flujo con anticuerpos y moléculas fluorescentes

Para analizar la expresión de moléculas en las células se pueden utilizar anticuerpos específicos para ellas, los cuales pueden ir unidos a un fluorocromo (estrella verde) (A) o necesitar un segundo anticuerpo acoplado a un fluorocromo que reconoce al anticuerpo primario (B). Para algunas aplicaciones se utilizan moléculas cuya fluorescencia indica alguna característica o función de la célula. En (C) se ejemplifica el uso de ioduro de propidio (PI), molécula fluorescente que se añade a la muestra; las células vivas no dejan pasar el fluorocromo a su interior por lo que no fluorescen, mientras que las muertas sí, ya que tienen su membrana dañada, dejando pasar el PI y tiñendo los ácidos nucleicos de la célula.

La CF actual se considera multiparamétrica ya que es posible evaluar además de tamaño y complejidad, varias características fenotípicas y funcionales en una misma célula de manera simultánea(22,29). El número de fluorocromos y, en consecuencia, el número de características que se pueden analizar en una misma muestra, depende del modelo y la configuración del citómetro en el que se trabaje, así como de las características propias de cada fluorocromo que se quiera utilizar. El láser más comúnmente usado en CF es el de argón, el cual tiene una longitud de onda de 488 nm (azul). La mayoría de los citómetros de flujo actuales tienen más de un láser, lo que incrementa su potencial de análisis y su versatilidad(26). Los fluorocromos que pueden utilizarse en un citómetro son aquellos que pueden ser excitados por alguno de los láseres del equipo y que pueden ser captados por los detectores de fluorescencia que tiene. Las longitudes de onda que capta cada detector de fluorescencia están definidas por los filtros que tenga el equipo. Algunas aplicaciones que facilitan la selección de fluorocromos con base en la configuración del equipo disponible son BD Bioscience Spectrum Viewer, Biolegend Spectra Analyzer, FluoroFinder y ThermoFisher Fluorescence Spectra Viewer. 768


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Tipos de gráficos y su interpretación Los datos que proporcionan los citómetros de flujo de todas y cada una de las células de una muestra, deben presentarse de manera que su interpretación sea fácil, rápida e integrativa. Los histogramas se emplean para analizar uno solo de los parámetros captados por el equipo, el cual se visualiza en el eje “x”, mientras que en el “y” se representa el número de eventos, ya sean células o partículas que cumplen con esa característica; los histogramas son en realidad gráficos de frecuencias (Figura 3). Con este tipo de gráfico se puede distinguir entre eventos que presentan o no la característica evaluada en el eje “x”. La interpretación más sencilla de este tipo de gráficos es de todo o nada, es decir, o tiene o no tiene la molécula que se quiere identificar, pero la utilidad de este tipo de gráfico va más allá, ya que permite saber qué tanto la expresa y poder comparar niveles de expresión de una molécula entre las células de una misma muestra o entre muestras que se encuentren en condiciones diferentes. Para poder establecer el porcentaje de células positivas para la marca, debe darse al citómetro una muestra a la que no se agregó la marca fluorescente para que sirva de punto de referencia entre lo negativo y lo positivo. En la figura 3 se muestra un ejemplo en el que se evalúa la expresión de la molécula CD3 en las células de una muestra. En la figura 3A, se muestra el histograma de una muestra no teñida, lo que implica que, cuando se lea una muestra teñida, todas las células que aparezcan a la derecha (en los valores de la escala que comprende M1, figuras 3B y3C) serán positivas para la marca que se esté determinando, siendo posible obtener el porcentaje de éstas(1,23,30). Figura 3: Análisis unidimensional

En los histogramas se visualiza una sola característica a la vez. Para saber si las células expresan la molécula de interés (CD3), primero se introduce una muestra que no haya sido teñida (A) y con ella se establece a partir de qué valor en la escala se considerará que las células son positivas (M1). En (B) y (C) se muestran histogramas de dos muestras diferentes teñidas en las que hay 25 % y 70 % de células que expresan la molécula CD3 respectivamente.

Los diagramas de puntos, de densidad o de contornos son ejemplos de gráficos que permiten correlacionar dos parámetros al mismo tiempo, uno de ellos graficado en el eje “x” y el otro en el eje “y”. La diferencia entre estos gráficos es la manera en que presenta dicha interacción. La ubicación de cada célula en el gráfico es similar a lo que ocurre con coordenadas en un

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plano cartesiano, en el que la posición de cada célula dependerá de sus valores individuales para la característica graficada en x y para la graficada en y (Figura 4A). Con este tipo de representación, se pueden distinguir al menos cuatro posibilidades: las células que no presentan ninguna de las dos características que se evalúan y que se ubican en el cuadrante inferior izquierdo, las que solo presentan una u otra y por ello se visualizarán en los cuadrantes superior izquierdo o inferior derecho, y aquellas que presentan ambas y por lo tanto se ubican en el cuadrante superior derecho (Figura 4B). Cuando se realiza el análisis de los resultados, el citómetro de flujo reportará el porcentaje de células que tienen la o las características de mayor interés(23,30). En las figuras 4C-E se muestra el análisis biparamétrico de una suspensión de timo teñido con un anticuerpo anti-CD4-FITC (característica 1) y un anticuerpo anti-CD8-PE (característica 2). Se observa que en la muestra existe un 4 % de células que no expresan la molécula CD4, ni la molécula CD8, un 17 % que solo expresan CD4, un 6 % que solo expresan CD8 y un 73 % de células que expresan tanto la molécula CD4 como la CD8. La visualización de la expresión y coexpresión de ambas moléculas puede hacerse en un diagrama de puntos (dot plots, figura 4C), un diagrama de densidad (density plots, figura 4D) o en un diagrama de contornos (contour plots, figura 4E). Figura 4: Análisis bidimensional

Se visualizan dos características de manera simultánea y se pueden establecer correlaciones entre ellas. Cada célula (punto) tiene un valor en el eje x y otro en y, similar a un plano cartesiano (A); Interpretación general para diagramas bidimensionales (B); Ejemplos de gráficos bidimensionales: Diagrama de puntos (C), diagrama de densidades (D) y diagrama de contornos (E) de la misma muestra.

Sin duda, una de las áreas de mayor avance en los últimos años dentro de la CF tiene que ver con el desarrollo de softwares cada vez más robustos, los cuales hacen uso de la minería de datos y el machine learning que permiten hacer análisis multivariados complejos. Lo anterior ha permitido que ahora sea muy frecuente encontrar los resultados de CF organizados en

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mapas de calor o en análisis de componentes principales entre otras muchas estrategias, las cuales permiten analizar muchos parámetros integrados en un solo gráfico y comparar los resultados entre individuos o condiciones. Los archivos que se generan en los citómetros de flujo utilizan el formato de archivo cuya extensión es “.fcs” (flow cytometry standard), lo cual facilita el análisis de los archivos generados en diferentes plataformas, independientemente del citómetro de flujo en el que hayan sido adquiridas las muestras(22,31,32).

Separación celular (“cell sorting”) Algunos citómetros de flujo tienen la capacidad de hacer “sorting”, es decir, de enriquecer una población particular, la cual es separada físicamente del resto de las células de la muestra; al final, se obtiene la o las poblaciones de interés purificadas o enriquecidas de manera aséptica en tubos individuales o en pozos de placas de cultivos, con la opción de realizar estudios posteriores con las células así obtenidas, como análisis por microscopia, cultivo celular y biología molecular entre otros(33,34).

Aplicaciones clásicas de la citometría de flujo Como ya se ha mencionado, la CF es una tecnología extremadamente versátil que evalúa varios parámetros de manera simultánea en cada célula, lo que permite establecer correlaciones entre ellos. Con la CF no solo se pueden analizar la presencia de moléculas en la superficie o en el interior de las células, sino también cuantificarlas. Es posible hacer pruebas funcionales, evaluaciones biológicas de compuestos tanto en células eucariotas como procariotas, purificar poblaciones celulares aun cuando se encuentren en baja proporción en la muestra, cuantificar moléculas solubles y evaluar la proliferación celular, la viabilidad y el tipo de muerte celular que presenta una célula, la actividad metabólica y la señalización intracelular solo por mencionar algunas; otro aspecto muy importante es que al poderse evaluar de manera simultánea muchas de estas características, se reduce el volumen de muestra necesario(35,36). Las técnicas que se describen a continuación tienen aplicación tanto en humanos como en el ámbito veterinario, y dentro de éste, tanto en animales domésticos como en fauna silvestre. Cabe mencionar que, en algunas ocasiones, la limitante es la disposición en el mercado de los anticuerpos que reconocen moléculas específicas de las diferentes especies animales, pero dada la importancia de los resultados que pueden obtenerse por CF, la disponibilidad de anticuerpos con diferentes especificidades ha crecido en los últimos años, facilitando el trabajo en el área pecuaria tanto en investigación como en la clínica, sobre todo para diagnóstico. Aunado a lo anterior, se ha reportado reactividad interespecies de diferentes anticuerpos, lo que permite su uso aún en aquella para la cual no fueron producidos originalmente(37).

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Inmunofenotipo El inmunofenotipificación hace referencia a la caracterización de las poblaciones celulares con base en las moléculas que expresa una célula, permitiendo así su identificación gracias al uso de anticuerpos(28). Para realizar un estudio de inmunofenotipificación se utilizan anticuerpos que reconocen moléculas particulares en las células y con base en su presencia o ausencia, o a su nivel de expresión, es que se realiza dicha identificación o caracterización. Hay que recordar que existen moléculas que se expresan en varias estirpes celulares, mientras que la expresión de otras es exclusiva de ciertas poblaciones o subpoblaciones celulares, lo que implica que debe hacerse una correcta selección de anticuerpos. Debe tenerse en cuenta que las moléculas que identifican a cada población celular pueden depender de la especie animal con la que se esté trabajando(38-42). La detección de las diferentes moléculas de interés se realiza utilizando anticuerpos marcados con fluorocromos, por lo que si se hace incidir un haz de luz que excite a ese fluorocromo, éste emitirá fluorescencia a cierta longitud de onda que será captada por un detector que identificará al fluororomo y en consecuencia a la molécula a la que se unió el anticuerpo. La identificación o caracterización de las poblaciones celulares puede ser tan detallada como se necesite. Algunos citómetros como se mencionó previamente, sólo permiten evaluar de manera simultánea 1-4 parámetros basados en fluorescencia, es decir solo se pueden emplear un máximo de cuatro anticuerpos que reconocen moléculas diferentes, mientras que en otros equipos, se puede estudiar la expresión de más de 20 moléculas en un mismo tubo, lo cual amplía las posibilidades y el detalle de la caracterización y cuantificación de las poblaciones celulares(28). Las figuras 4C-E son ejemplos de inmunofenotipificación de diferentes muestras utilizando dos anticuerpos, un anti-CD4 y un anti-CD8. La inmunofenotipificación ha resultado de vital importancia en el diagnóstico y pronóstico de diversas enfermedades veterinarias y un complemento muy adecuado al estudio morfológico convencional, dado que es factible detectar modificaciones en las proporciones de las diferentes poblaciones celulares, así como caracterizar células neoplásicas con base en sus marcadores fenotípicos(43), lo cual permite hacer un diagnóstico certero. Actualmente, uno de los principales usos de la inmunofenotipificación ha sido en la detección y caracterización de procesos hemato-oncológicos, tanto linfo como mieloproliferativos en pequeñas especies(13,14,16,44). A manera de ejemplo, se puede mencionar el caso de los linfomas caninos, los cuales son el tipo de tumor hematológico más frecuente; del 30 al 40 % son linfomas de células T y el resto son de células B, los cuales pueden diferenciarse con base en los marcadores fenotípicos que presentan. Los paneles de anticuerpos utilizados pueden llevar a una caracterización más fina que permite, de ser necesario, identificar incluso diferentes subtipos. La información sobre los anticuerpos, los marcadores fenotípicos de cada población y subpoblación celular, así como la estrategia de análisis pueden ser consultados

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en diferentes trabajos publicados recientemente(45), en los cuales se menciona que la FC puede utilizarse además, para dar seguimiento al tratamiento y detectar enfermedad mínima residual en estos animales, lo que puede ser indicio de una recaída. Gracias a la CF se han identificado ciertos fenotipos con un peor pronóstico(45). Es interesante ver que algunos anticuerpos obtenidos para humanos muestran reactividad cruzada con antígenos caninos, lo que permite su utilización. La rapidez con la que se pueden obtener el diagnóstico es una ventaja adicional. Por otro lado, en los hatos lecheros, la cuantificación de células somáticas en la leche es una estrategia común que permite detectar la presencia de infecciones clínicas y subclínicas en las vacas. La CF permite hacer una cuenta diferencial de poblaciones y subpoblaciones celulares presentes en la leche, lo que ha sido sugerido como una excelente alternativa para identificar procesos inflamatorios en las ubres, aun cuando las cuentas de células somáticas son bajas. La detección temprana de procesos infecciosos, evita su progresión y con ello, cambios en la cantidad y calidad de la leche, reduciendo las posibles pérdidas económicas(40,46).

Viabilidad celular El determinar la viabilidad de las células de una muestra permite valorar el estado en el que se encuentran, factor que puede constituir un control de calidad interno dentro del laboratorio(47,48). La viabilidad de las células de una muestra depende de muchos factores, entre ellos se pueden citar el procedimiento de obtención, el transporte (si éste es necesario), el procesamiento de la muestra durante la tinción, el almacenamiento, etc., de tal manera que, si la muestra presenta una viabilidad baja, habrá que determinar cuál o cuáles factores están afectando este parámetro biológico. Es importante mencionar que la presencia de células muertas en una muestra, favorece la unión de los anticuerpos de manera independiente a la especificidad de estos, por lo que, si no se eliminan las células muertas del análisis, éstas pueden llevar a resultados y conclusiones erróneas debido a la presencia de eventos falsos positivos(48,49). Por otro lado, es posible que haya una disminución de la viabilidad (y por ende, un incremento de la muerte celular) como consecuencia de una infección, de un tratamiento con quimioterapéuticos, de una estimulación celular in vitro, etc., evento que debe llamar la atención y requerir un estudio detallado de las causas e implicaciones. En el caso particular de los quimioterapéuticos, el incremento en el porcentaje de células muertas puede indicar una buena respuesta al tratamiento. Los reactivos para cuantificar el porcentaje de viabilidad (o de muerte celular) o para excluir a las células muertas de un análisis de CF se dividen en dos grandes grupos. En el primer caso, el fundamento implica que dada que las células muertas tienen dañada la membrana celular, el fluorocromo entra y tiñe la célula muerta, mientras que las células vivas no captan

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el fluorocromo porque su membrana está íntegra, pudiendo distinguirlas como teñidas y no teñidas respectivamente (Figura 2C). Ejemplos de este tipo de moléculas son el ioduro de propidio (PI) y el 7-amino, actinomicina D (7-AAD); las células una vez teñidas no se pueden fijar. En el segundo caso, una vez agregado el reactivo, éste se lava y las células se fijan, lo que permite que la lectura en el citómetro no tenga que realizarse inmediatamente y las muestras puedan almacenarse. En este caso, las moléculas fluorescentes que se utilizan se unen covalentemente a las proteínas de las células. En las células vivas, al tener la membrana intacta, las únicas proteínas que reaccionarán con el reactivo serán las de la superficie. En el caso de las células muertas, el reactivo además reaccionará con las proteínas del interior de la célula quedando más intensamente teñidas que las células vivas, haciendo posible su distinción(47,50). Los gráficos que se obtienen en ambos casos y su interpretación son similares independientemente del tipo de reactivo que se haya utilizado. La determinación de la viabilidad de los espermatozoides antes y después del proceso de criopreservación es un ejemplo del uso rutinario de esta aplicación de la CF y constituye una evaluación indispensable en inseminación artificial en diferentes especies animales(51,52).

Muerte celular El estudio de la muerte celular y de los posibles mecanismos que la pueden inducir ha sido un tema de gran interés. Desde la descripción de la apoptosis y posteriormente de todos los demás mecanismos descritos a la fecha, las técnicas para evidenciarla, cuantificarla y caracterizarla se han incrementado año con año, dado el mayor conocimiento sobre las vías de señalización que se activan y que llevan a la muerte de las células(49,53,54). La muerte celular puede estudiarse de manera general desde dos perspectivas. La primera implica el establecer el porcentaje de células muertas en una suspensión celular, así como para establecer el efecto de diferentes estímulos sin que interese el mecanismo de muerte. Este tipo de determinaciones son muy comunes cuando se hacen estudios de actividad biológica de nuevas moléculas con posible actividad antibiótica o antineoplásica. Para lo anterior, se realizan tinciones similares a las descritas para viabilidad, pero lo que se reporta es el porcentaje de células muertas en la muestra analizada y como ya se mencionó, los estudios pueden hacerse no solo en células eucariotas infectadas, sino en microorganismos directamente, lo que resulta muy útil para los estudios de resistencia a antibióticos y la evaluación de nuevas moléculas antimicrobianas(55,56). Cuando se requiere identificar el mecanismo de muerte celular es importante establecer una estrategia que permita separar los posibles eventos biológicos implicados en la muerte de las células, como la expresión de moléculas específicas de cada mecanismo de muerte, la activación de enzimas, la alteración de funciones celulares como el potencial de membrana mitocondrial y la producción de especies reactivas de oxígeno, el reacomodo de fosfolípidos

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en la membrana, la fragmentación del ADN, etc., Estos eventos guardan relación con los diferentes tipos de muerte celular hasta ahora descritos y con las vías se señalización que se activan en cada uno(53,57). A la fecha se conocen más de diez mecanismos diferentes de muerte celular, algunos de ellos están interconectados. Uno de los usos más frecuentes del análisis de muerte celular en al ámbito veterinario es completar el estudio de la calidad de semen en diferentes especies animales(52).

Pruebas funcionales La CF permite también evaluar la capacidad funcional de las células; la detección de alteraciones en las capacidades normales de las células puede ser indicio de patologías y su identificación puede ayudar al diagnóstico. A continuación, se mencionan algunas de las técnicas más utilizadas y reportadas en la literatura. Fagocitosis. La fagocitosis forma parte de los mecanismos de respuesta inmune innata que permiten la contención de infecciones por lo que alteraciones en alguno de los pasos de este proceso repercute en la salud de los animales. Los neutrófilos son las células fagocíticas más abundantes en la circulación de muchos mamíferos, aunque su proporción puede variar; en la mayoría de los carnívoros y en los caballos representan más del 50 % de las células en sangre, en los cerdos están en un 50 %, mientras que en los roedores y los rumiantes, están en un 25 % en promedio; En reptiles, aves, conejos y peces, las células fagocíticas se denominan heterófilos y su porcentaje es variable entre ellos(58). La CF permite el estudio de la fagocitosis desde varios puntos de vista; el más común es midiendo la capacidad de fagocitar partículas o bien, evidenciando los cambios bioquímicos intracelulares que se presentas en las células después de fagocitar y que llevan a la destrucción intracelular de los microorganismos. En el primer caso, se pueden utilizar bioindicadores como bacterias o levaduras, o bien partículas inertes acopladas a un fluorocromo, por lo que se puede determinar el porcentaje de células que fagocitan y el nivel de fagocitosis(59). Además, es factible monitorear el cambio de pH una vez que han fagocitado los bioindicadores o las partículas inertes. Para esto se usan sondas fluorescentes sensibles a los cambios de pH, lo que permite monitorear cada etapa del proceso de fagocitosis, desde la formación del fagosomas hasta la fusión de estos con los lisosomas (fagolisosomas), dadas las diferencias en el pH de ambos compartimentos (pH 6.7 y 4.7 respectivamente)(60,61). Este tipo de análisis permite detectar alteraciones en la fagocitosis, las cuales se han reportado en enfermedades veterinarias como la anaplasmosis, clamydiosis, parvovirus canino, la deficiencia de adhesión leucocitaria y enfermedad granulomatosa crónica entre otras(58,62).

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Activación celular. La activación de las células es el resultado de su interacción con agentes extraños o con mitógenos y puede darse in vivo o in vitro; en algunos casos la activación se manifiesta con la expresión de novo o el incremento de la expresión basal de moléculas características y puede ir o no, acompañada de proliferación celular y de síntesis de moléculas solubles como citocinas y quimiocinas que se liberan al microambiente, entre otros eventos. El detectar células activadas en un organismo implica que se está montando una respuesta inmunológica ya sea contra un microorganismo o contra un agente vacunal y junto con la inmunofenotipificación, puede dar información importante en casos de enfermedades infecciosas. Proliferación. La proliferación celular puede evaluarse in vitro e in vivo, agregando análogos de nucléotidos como la bromodesoxiuridina (BrdU) para que, si hay proliferación y por lo tanto síntesis de ADN, esta molécula se incorpore en las nuevas cadenas de ácidos nucleicos. Para determinar si se incorporó, se utilizan anticuerpos dirigidos contra la BrdU marcados con fluorocromos, de tal manera que si las células proliferaron, estas darán señal fluorescente y se podrá cuantificar el porcentaje de células que se dividieron(63). Cabe mencionar que la BrdU tiene otros usos como evidenciar la fragmentación del ADN, por lo que no debe confundirse los fundamentos de su uso en cada caso y la interpretación de los resultados. Otra técnica empleada es el análisis de ADN. En este caso se utilizan moléculas que se unen al ADN de manera estequiométrica y que por lo tanto fluorescen con una intensidad que es proporcional al contenido de ácidos nucleicos(64), de tal manera que las células que están en fase G0 o G1 del ciclo celular se ubicarán en un valor en la escala, el cual será la mitad del valor en el cual se ubiquen las células en fase G2 o mitosis (M) temprana, previo a la citocinesis. Las células que están en las diferentes etapas de la fase S, es decir, desde que inicia la duplicación del material genético hasta que termina, se ubicarán entre la posición de las células en G0/G1 y las G2/M (Figura 5A). Cuando una población celular está proliferando, como ocurre en cáncer, se incrementará el porcentaje de células en fase S y en G2/M con respecto a la muestra testigo en la cual no hay proliferación. En este caso, también es necesaria la permeabilización de las células para que el fluorocromo pueda entrar al núcleo y unirse al ADN. Entre las moléculas más utilizadas están el PI, el 7-amino-actinomicina D (7-AAD) y el Hoechst 33342. El estudio del ciclo celular puede extenderse y completarse con el análisis de moléculas involucradas en cada una de las fases del ciclo haciendo uso del potencial multiparamétrico de la CF. Cabe mencionar que con este tipo de análisis también puede identificarse la presencia de células que tienen el ADN fragmentado, las cuales aparecen en lo que se conoce como “pico Sub-G0” (Figura 5B), y que correlaciona con algunos tipos de muerte celular. Con esta técnica también es posible evaluar la estabilidad del genoma si se compara la ploidía del pico G0/G1 entre células tumorales y células sanas(64,65). Aunado a lo anterior y como se mencionará más adelante, esta técnica permite distinguir con base en su contenido de ADN espermatozoides X de espermatozoides Y.

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Quizá la técnica más utilizada para evaluar proliferación es la dilución de la carboxifluoresceína (CFSE, carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester). Para esta, se utiliza el compuesto CFDA, el cual no es fluorescente, es lipofílico y puede penetrar la membrana de las células; una vez en el interior, la acción de las esterasas de las células vivas lo convierten en CFSE que es fluorescente, esta molécula se une a las proteínas celulares, dejando marcadas a todas las células de la muestra; si las células proliferan, cada una de las células hijas tendrá la mitad del fluorocromo que tenía la célula de la cual proviene, de tal manera que es factible establecer el porcentaje de células que proliferaron y los ciclos de proliferación con base en la dilución o disminución progresiva de la marca con cada división celular(66). Figura 5: Análisis del contenido de ADN

Las células se fijan y se tiñen con Ioduro de propidio. El análisis de ADN permite cuantificar el porcentaje de células en las diferentes fases de ciclo celular: G0/G1, S y G2/M con base en el contenido relativo de ADN. La intensidad de la tinción es directamente proporcional a la cantidad de ADN que tienen las células en cada fase (A). Este tipo de análisis permite cuantificar, además, el porcentaje de células que tienen ADN fragmentado, pico identificado como Sub-G0 (B).

Adicional a lo anterior, se puede detectar la expresión de Ki67, una molécula que se ubica en el núcleo y que está asociada a la proliferación celular utilizando un anticuerpo dirigido contra ella como ha sido propuesto en el OMIP-065(14), que es el primer panel de tinción para CF optimizado específico para perros. La detección de Ki67 se ha asociado a los cánceres caninos más agresivos, por lo que puede tomarse como un biomarcador pronóstico(67). Producción de citocinas. Las citocinas son moléculas solubles que se sintetizan en respuesta a un estímulo y tienen como función principal la comunicación entre las células. Existen dos estrategias generales para detectar la producción de citocinas, una las detecta intracelularmente, lo que permite hacer de manera simultánea la identificación de las células productoras(68) y otra, en la que se pueden cuantificarlas en solución una vez que han sido

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liberadas en el microambiente en el que se encuentren (plasma, suero u otro líquido corporal, o bien en el medio de cultivo si se trata de un sistema in vitro). En esta última estrategia, no se puede saber qué célula las produjo, a menos que las células hayan sido previamente purificadas. Para el primer caso, a las células debe agregarse un reactivo que impide la secreción de las citocinas como la brefeldina o monensina, posteriormente se permeabilizan y se agregan anticuerpos marcados con fluorocromos dirigidos contra las citocinas que se quieren determinar(69). En el segundo caso, la detección se hace en solución, ya sea en algún líquido corporal o en el medio de cultivo. Para esto, se utilizan partículas que tienen dos características, emiten fluorescencia y tienen anticuerpos dirigidos contra la citocina o molécula de interés pegados en su superficie, los cuales actuarán como anticuerpos de captura (Figura 6A). Las partículas, o perlas como también se les conoce, tienen una intensidad de fluorescencia particular dependiendo de la molécula que reconozcan los anticuerpos sobre su superficie, de tal manera que se pueden detectar varias moléculas solubles en la misma muestra(7). La cuantificación de las moléculas solubles se realiza con base en la intensidad de fluorescencia emitida por un anticuerpo reportero que se agrega al final y que está acoplado a un fluorocromo diferente al de la perla; en consecuencia, la intensidad de fluorescencia del anticuerpo reportero es directamente proporcional a la concentración de la molécula en estudio (Figura 6B-D). Gracias a la utilización de estándares de concentración conocida de cada molécula que se quiere cuantificar, se puede obtener la concentración presente en la muestra. Con base en lo anterior, el análisis de los resultados es biparamétrico: la intensidad de la perla identifica la molécula que se quiere cuantificar y la intensidad de fluorescencia del anticuerpo reportero, la concentración de esta en la muestra. Existen en el mercado paquetes comerciales conocidos como “arreglos de perlas” (bead arrays) o “ensayos múltiples basados en perlas” (bead-based multiplex assays) para cuantificar moléculas en solución. A diferencia de los ensayos de ELISA en los que para cuantificar cada molécula se utiliza un volumen dado de muestra, aquí, con el mismo volumen se pueden analizar múltiples moléculas de manera simultánea(6,70). Actualmente y dada su gran versatilidad y potencial en diversas áreas, se han desarrollado equipos destinados únicamente para la lectura de este tipo de ensayos que pueden detectar incluso hasta 500 moléculas solubles con un volumen máximo de 50 l de muestra, las cuales pueden ser elegidas y solicitadas al fabricante, con base en la necesidad particular del comprador. Si bien la oferta comercial aún es limitada en el ámbito veterinario, Christopher-Hennings et al., la han propuesto como una excelente alternativa para la cuantificación de citocinas, quimiocinas, hormonas, patógenos y anticuerpos en el ámbito veterinario(71). Como ejemplo de ello, se puede mencionar el diagnóstico serológico de Leishmaniasis en perros, en el que las perlas en lugar de anticuerpos de captura, tienen pegados antígenos recombinantes del parásito y lo que se detecta en la muestra son anticuerpos por lo que los anticuerpos reporteros reconocen los anticuerpo de caninos presentes en la muestra(72). 778


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Figura 6: Arreglos de perlas

Los más comunes emplean partículas inertes fluorescentes (círculo rojo) que tienen pegados anticuerpos de captura para la molécula que se desea cuantificar (A). Si la molécula soluble que se quiere cuantificar (círculo verde) está presente en la muestra, se unirá a los anticuerpos. En el último paso, se adiciona un anticuerpo “reportero” que está unido a un fluorocromo (estrella naranja) diferente al de la perla y por lo tanto la intensidad de fluorescencia de este, será proporcional a la cantidad de molécula a cuantificar. En esta aplicación se cuenta con estándares de concentración conocida por lo cual es una técnica cuantitativa. En B, C y D se esquematizan tres posibles resultados de un arreglo de perlas. Muestra que no tiene la molécula a cuantificar (A), muestra que tiene la molécula, pero en poca cantidad (C) y muestra que tiene una alta concentración de la molécula (D). La concentración es directamente proporcional a la intensidad de fluorescencia emitida por el anticuerpo reportero. En un mismo ensayo se utilizan perlas que tienen anticuerpos de captura para diferentes moléculas. Imagen creada con BioRender.

Sexado de espermatozoides. Con base en un análisis de ADN es factible diferenciar en una muestra de esperma de cualquier especie animal, cromosomas X de cromosomas Y, ya que los primeros tienen mayor contenido de material genético. Se estima que, en términos generales, esta diferencia es de 3 a 4 % aproximadamente, y dada la alta sensibilidad que tienen los citómetros de flujo, es factible diferenciarlos e incluso separarlos físicamente en diferentes tubos gracias a la función de “sorter” que tienen algunos equipos y que alcanza hasta más de 90 % de pureza. Los espermatozoides separados, se ha utilizado en inseminación artificial con resultados variados dependiendo de la especie animal(73,74). No hay que olvidar que a los espermatozoides pueden evaluárseles varios de los parámetros antes mencionados como la expresión de moléculas en su superficie o intracelularmente, la integridad de su membrana, la presencia de moléculas involucradas con alguno de los tipos

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de muerte celular, etc., por lo que los estudios que pueden hacerse a los espermatozoides van más allá que el análisis de ADN, permitiendo hacer estudios sobre la calidad y función de estos(19).

Comentarios finales El principal uso de la CF en el ámbito veterinario actualmente es en investigación; las aportaciones que se han hecho mediante la utilización de esta tecnología han tenido un gran impacto en el conocimiento de las células, órganos y sistemas en condiciones fisiológicas y patológicas en diferentes especies. El empleo de citómetros de flujo en el área clínica tiene muchas ventajas dada su gran sensibilidad, especificidad y versatilidad en cuanto a pruebas que pueden realizarse; el costo de los equipos y de los reactivos, además de la falta de disponibilidad de muchos de ellos, ha llegado a ser un obstáculo para su implementación en México en medicina veterinaria. Afortunadamente ambas situaciones se han ido superando gracias a la gran demanda que tienen estos equipos en diferentes ámbitos, lo que ha disminuido su precio y se ha ampliado la disponibilidad de reactivos, haciendo poco a poco más accesible su empleo y abriendo la posibilidad de su introducción en los laboratorios clínicos veterinarios de nuestro país. En México, existen diversas alternativas de capacitación en CF tanto teórica como práctica, los cuales son impartidos en algunas universidades del país, así como en el Laboratorio Nacional de Citometría de Flujo (LabNalCit) y en el Capítulo de Citometría de la Sociedad Mexicana de Inmunología, este último pionero en la enseñanza y difusión del uso de los citómetros de flujo y de la correcta interpretación de los resultados obtenidos con esta tecnología. Conflicto de intereses Los autores declaran que no existe conflicto de intereses. Literatura citada: 1. Shapiro HM. Practical flow cytometry. 4th ed. New Jersey, USA: Wiley; 2003. 2. Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, Acs A, Adam D, Adam-Klages S, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (Second ed). Eur J Immunol 2019;49(10):1457-973. 3. D’Hondt L, Höfte M, Van Bockstaele E, Leus L. Applications of flow cytometry in plant pathology for genome size determination, detection and physiological status. Mol Plant Pathol 2011;12(8):815-28. 4. Zamora JLR, Aguilar HC. Flow virometry as a tool to study viruses. Methods 2018;134– 135:87-97.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.6004 Revisión bibliográfica

Presencia de alcaloides pirrolizidínicos en miel y los efectos de su consumo en humanos y abejas. Revisión

Laura Yavarik Alvarado-Avila a Yolanda Beatriz Moguel-Ordóñez b Claudia García-Figueroa a Francisco Javier Ramírez-Ramírez a Miguel Enrique Arechavaleta-Velasco a*

a

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología y Mejoramiento Animal. Km. 1, Carretera a Colón, 76280, Colón, Querétaro. México. b

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Centro de Investigación Regional Sureste. Campo Experimental Mocochá. México.

*Autor de correspondencia: arechavaleta.miguel@inifap.gob.mx

Resumen: La miel que producen las abejas melíferas (Apis mellifera L.) es un alimento natural cuya composición depende del origen floral, la región geográfica y el clima en donde se produce. Las abejas producen miel a partir del néctar de las flores, por lo que la miel puede poseer metabolitos secundarios como los alcaloides pirrolizidínicos, que algunas plantas producen como mecanismos de defensa en contra de insectos y animales herbívoros. Los alcaloides pirrolizidínicos son tóxicos para el ser humano y para las abejas, ya que son mutagénicos, carcinogénicos y hepatotóxicos para el ser humano, y en las abejas producen efectos disuasivos en la alimentación, reducen la trofolaxia entre las obreras y pueden llegar a ocasionar la muerte de las abejas de una colonia. El objetivo de este trabajo fue hacer una revisión sobre el origen y las características químicas de los alcaloides pirrolizidínicos, sobre

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la presencia de estos compuestos en la miel, sobre su toxicidad tanto para el ser humano como para las abejas, y sobre la regulación alimentaria que establece los límites de consumo diario de alcaloides pirrolizidínicos. Palabras clave: Miel, Alcaloides pirrolizidínicos, Consumo, Abejas melíferas, Humanos.

Recibido: 10/06/2021 Aceptado: 03/02/2022

Introducción La miel que producen las abejas melíferas (Apis mellifera L.) es un alimento natural compuesto principalmente por carbohidratos, agua, aminoácidos, ácidos orgánicos, vitaminas y minerales(1). La composición, color, aroma y sabor de la miel dependen principalmente de su origen floral, así como de la región geográfica y el clima donde se produce(2,3). Las abejas producen miel a partir del néctar de las flores, por lo que en algunas ocasiones la miel contiene compuestos que las plantas generan como mecanismos de defensa en respuesta a factores de estrés bióticos y abióticos. Unos de estos compuestos son los alcaloides pirrolizidínicos, los cuales son metabolitos secundarios que las plantas utilizan para protegerse de animales herbívoros, insectos y algunos microorganismos(4,5). Los alcaloides pirrolizidínicos pueden estar presentes en el néctar de las flores. Cuando las abejas pecorean néctar que contiene estos alcaloides, producen miel con estos compuestos y es entonces cuando la miel se convierte en una fuente de alcaloides pirrolizidínicos tanto para las abejas como para los humanos que la consumen(6,7,8,9). La miel es un producto de importancia comercial en México, en el 2019 el valor de la producción fue de aproximadamente 2,489 millones de pesos, en ese año se produjeron 61,986 toneladas y se exportaron aproximadamente 42,150 toneladas. Estos volúmenes de producción y exportación ubican a México en el décimo lugar como productor y en el cuarto lugar como exportador de miel en el mundo(10,11). El objetivo de este trabajo es hacer una revisión sobre la presencia de alcaloides pirrolizidínicos en la miel, sobre el origen y características de estos compuestos, sobre los efectos que tiene el consumir este tipo de alcaloides tanto para el ser humano como para las

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abejas y sobre la regulación alimentaria que establece los límites de consumo diario de alcaloides pirrolizidínicos para el ser humano.

Origen de los alcaloides pirrolizidínicos Las plantas enfrentan factores de estrés bióticos y abióticos que afectan su desarrollo, como lo es el daño causado por animales herbívoros, insectos y microorganismos(4,5). En respuesta a estos factores de estrés, las plantas producen metabolitos secundarios como los alcaloides, que tienen un efecto disuasivo y tóxico ya que no son palatables y algunos afectan el sistema nervioso central. La producción de metabolitos secundarios es uno de los sistemas de defensa más utilizados por las plantas en contra de los animales herbívoros y de los insectos(12). Actualmente se conocen cerca de 20,000 metabolitos secundarios que se dividen en dos grupos: nitrogenados y no nitrogenados. Los alcaloides pertenecen al grupo de los metabolitos nitrogenados y son compuestos heterocíclicos sintetizados a través de aminoácidos como la tirosina y la arginina. Los alcaloides se dividen en cinco grupos: alcaloides pirrolizidínicos, alcaloides isoquinoléicos, alcaloides quinolizidínicos, alcaloides tropánicos y alcaloides indólicos(5,13). Los alcaloides pirrolizidínicos los producen más de 560 especies de plantas, distribuidas principalmente en las familias: Asteraceae, Boraginaceae, Apocynaceae y en el género Crotalaria de la familia Fabaceae, aunque también existen algunas plantas de las familias Celastraceae, Convolvulaceae y Ranunculaceae y de los géneros Liparis, Malaxis y Cysis de la familia Orchidaceae que también producen alcaloides pirrolizidínicos(14,15).

Estructura química de los alcaloides pirrolizidínicos La estructura química de los alcaloides pirrolizidínicos consiste en un fragmento ácido denominado ácido nécico (Figura 1a) y una base de necina bicíclica (Figura 1b) con un sustituyente de hidroximetil en la posición 1 y un grupo hidroxilo en posición 7. Esta base de necina puede tener una saturación (Figura 2a) o una insaturación (Figura 2b) entre las posiciones 1 y 2(16,17).

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Figura 1: Estructura básica de los alcaloides pirrolizidínicos: a) ácido nécico; b) necina bicíclica(17)

Los alcaloides pirrolizidínicos se pueden encontrar en dos formas, una es en forma de base libre o alcaloide terciario (Figura 2a y 2b) y la otra es en forma de N-óxidos (Figura 2c). La base libre o alcaloide terciario es la forma conjugada de una amina, que en el caso de los alcaloides se trata de una amina terciaria, lo que les da la propiedad de ser alcaloides terciarios, cuando esta base libre posee una insaturación entre las posiciones 1 y 2 se presenta la versión tóxica del alcaloide, la presencia de esta insaturación es una característica fundamental para su toxicidad(17,18). Figura 2: Diferentes formas de presentación de los alcaloides pirrolizidínicos: a) necina bicíclica con una saturación entre las posiciones 1 ,2; b) necina bicíclica con una insaturación entre las posiciones 1 ,2; c) estructura básica de los alcaloides pirrolizidínicos en su forma de N-óxido(17)

La forma de N–óxido es producto de la oxidación de los pirroles, y en esta forma los alcaloides pirrolizidínicos no son tóxicos, pero estos pueden ser reducidos y transformados en alcaloides terciarios, de la misma manera, los alcaloides terciarios pueden ser oxidados a su correspondiente N-óxido; por lo que los alcaloides pirrolizidínicos tienen la capacidad de cambiar de una forma a otra(19,20).

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Clasificación de los alcaloides pirrolizidínicos Existen dos sistemas principales para clasificar a los alcaloides pirrolizidínicos, uno se basa en la combinación de la base de necina con el ácido nécico y sus patrones de enlace, mientras que el otro se basa en la estructura química de la base de necina(14,21). En el primer sistema de clasificación, existen cinco tipos de alcaloides pirrolizidínicos. Los del tipo senecionina, que los sintetizan las plantas del género Senecio y Eupatorium de la familia Asteraceae. Los de tipo licopsamina, que los sintetizan principalmente plantas de las familias Boraginaceae y Apocynaceae. Los alcaloides tipo triangularina que los producen varias especies de los géneros Senecio y Boraginaceae. Los de tipo monocrotalina, que los producen principalmente especies de plantas del género Crotalaria y algunas especies de la familia Boraginaceae. Los alcaloides tipo falaenopsina que se encuentran en plantas de la familia Orchidaceae. Los de tipo lolina que los producen la planta Lolium cuneatum y plantas del género Adenocarpus de la familia Fabaceae. Los alcaloides del tipo misceláneo que se encuentran principalmente en el género Crotalaria de la familia Fabaceae. La mayoría de los alcaloides pirrolizidínicos que se conocen son de los tipos senecionina y licopsamina(14). En el segundo sistema de clasificación, que se deriva de las diferentes bases de necina, existen cuatro tipos de alcaloides pirrolizidínicos: los del tipo retronecina, los del tipo heliotridina, los del tipo otonecina y los del tipo platinecina. La base de los alcaloides de los tipos retronecina, heliotridina y otonecina tiene una insaturación entre las posiciones 1 y 2, por lo que se consideran de mayor toxicidad que los del tipo platinecina(15,21).

Toxicidad de los alcaloides pirrolizidínicos El nivel de toxicidad de los alcaloides pirrolizidínicos depende principalmente de su estructura química, las rutas involucradas en el metabolismo de los alcaloides, la tasa de desintoxicación y las variaciones de cada individuo(22). Para que los alcaloides pirrolizidínicos sean tóxicos es necesario que presenten un doble enlace entre las posiciones 1 y 2 y un grupo éster en la posición C-7, en la posición C-9 o en ambas posiciones de la base de necina(23). Los alcaloides pirrolizidínicos se consideran pretoxinas, para que causen daño es necesario que se activen vía el metabolismo hepático, a través de los mecanismos normales de detoxificación oxidativa. De esta manera, los alcaloides que se consumen en su forma terciaria se transforman en metabolitos pirrólicos con la participación de la enzima citocromo P-450 monooxigenasa(20,24,25). Por otro lado, cuando se consume la forma no tóxica de los alcaloides pirrolizidínicos pueden reducirse a su correspondiente alcaloide terciario (forma tóxica), absorberse y activarse vía hepática(22,26,27).

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El efecto tóxico de los alcaloides se debe a que interrumpen la transmisión de la señal neuronal al afectar a los receptores neuronales, a los canales iónicos y a las enzimas encargadas de la degradación de neurotransmisores y mensajeros secundarios. Además, tienen la capacidad para intercalarse en el ADN, así como de detener la síntesis de proteínas, inducir la apoptosis e inhibir la actividad de las enzimas involucradas en el metabolismo de los carbohidratos(28). Estudios que se realizaron en Drosophila melanogaster indican que los alcaloides pirrolizidínicos son mutagénicos y genotóxicos (Cuadro 1)(29,30,31). De igual manera, un estudio desarrollado con ratas y ratones que se alimentaron con el alcaloide ridelina mostró un incremento significativo en la presencia de diferentes tipos de cáncer como hemangiosarcoma, y tumores como adenoma hepatocelular, adenoma alveolar y adenoma bronquiolar(32). Cuadro 1: Concentraciones de alcaloides pirrolizidínicos en las que se presentan efectos mutagénicos o genotóxicos en Drosophila melanogaster(29,30,31) Tipo

Senecionina

Licopsamina

Monocrotalina Retronecina Heliotrina

Alcaloide pirrolizidínico Jacolina Platifilina Retrorsina Senecifilina Senecifilina Senecifilina Senecifilina Senecionina Senecionina Senkirkina Senkirkina 7 – acetil intermidina 7 – acetil licopsamina Equimidina Equinatina Indicina Intermedina Licopsamina N – óxido indicina Monocrotalina Monocrotalina Simlandina Heliotrina Heliotrina Lasiocarpina

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Concentración en moles 25x10-6-5x10-4 2x10-2 25x10-6-5x10-4 5x10-6 - 5x10-5 1x10-5 1x10-4 1x10-3 5x10-6 - 1x10-4 2x10-2 5x10-3 a 5x10-2 1x10-5 1x10-5 - 1x10-4 1x10-5 - 1x10-4 2x10-2 2x10-2 1x10-3 - 1x10-2 5x10-4-1x10-3 1x10-3 25x10-4-25x10-3 25x10-4-0.10 2x10-2 1x10-4 25x10-6-5x10-4 2x10-2 2x10-2

Efecto Genotóxico Mutagénico Genotóxico Genotóxico Mutagénico Mutagénico Mutagénico Genotóxico Mutagénico Genotóxico Mutagénico Genotóxico Genotóxico Mutagénico Mutagénico Genotóxico Genotóxico Genotóxico Genotóxico Genotóxico Mutagénico Genotóxico Genotóxico Mutagénico Mutagénico


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Efectos de la ingesta de alcaloides pirrolizidínicos en la salud del ser humano La presencia de estos alcaloides en los alimentos es un peligro para la salud humana, los casos de exposición a los alcaloides pirrolizidínicos en humanos ocurren por el consumo de alimentos que contienen estos alcaloides, o por el consumo de medicinas y complementos alimenticios elaborados a partir de plantas medicinales. Existen dos tipos de intoxicaciones por la ingesta de alcaloides pirrolizidínicos. La intoxicación crónica es la más frecuente(33) y ocasiona principalmente daño hepático retardado y progresivo, oclusiones venosas tanto hepáticas como pulmonares y daño en vasos sanguíneos. Además, puede provocar en menor medida daño en riñón, en el tracto gastrointestinal, en la médula ósea, en el páncreas, megalocitosis e inhibición de la mitosis(24,34,35,36). La intoxicación aguda ocurre con menor frecuencia y ésta provoca efectos como hepatomegalia y ascitis(36); se estima que causa mortalidad en el 20 % de las personas que sufren una intoxicación aguda, mientras que el 50 % se recupera y el restante 30 % puede desarrollar enfermedad veno-oclusiva hepática crónica años después de la intoxicación(37). Además, se sabe que los agentes alquilantes que se forman por la biotransformación de los alcaloides pirrolizidínicos en el organismo tienen un efecto sinérgico con aflatoxinas y con el virus que ocasiona la hepatitis, lo que causa diferentes tipos de cáncer de hígado(36,38).

Efectos de la ingesta de alcaloides pirrolizidínicos en las abejas Existen algunos insectos que poseen mecanismos para evitar los efectos adversos de consumir alcaloides pirrolizidínicos; sin embargo, las abejas no cuentan con estos mecanismos, ya que no son capaces de realizar la conversión metabólica de la forma tóxica del alcaloide a la forma no tóxica y tampoco cuentan con un sistema específico para mantener a los alcaloides en su forma no tóxica, por lo que transforman hasta un 69 % de los alcaloides pirrolizidínicos que ingieren en forma no tóxica a su forma tóxica en el intestino debido a una reducción del N – óxido, y los absorben de forma pasiva hacia la hemolinfa ya que éstos son liposolubles(18,39). Una vez que los alcaloides se encuentran en la hemolinfa, la base libre funciona como sustrato para la enzima citocromo P450 oxidasa, que forma parte del metabolismo xenobiótico y esta base libre se transforma en pirroles. Los productos que resultan de esta bioactivación son agentes alquilantes altamente reactivos y mutagénicos(24,39). Un estudio que se realizó en Alemania indica que concentraciones de 2 % de alcaloides pirrolizidínicos insaturados en una solución de sacarosa producen efectos dañinos para las

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abejas y pueden ocasionar la muerte de hasta el 70 % de las abejas en un periodo de 48 h bajo condiciones de laboratorio. Este mismo estudio mostró que la presencia de alcaloides pirrolizidínicos en el néctar afecta la trofolaxia, ya que abejas que recolectaron jarabe de azúcar con una concentración de 2 % de alcaloides pirrolizidínicos, sólo pudieron transferir el 4 % del volumen del jarabe que almacenaron en el buche de miel a otras abejas, mientras que abejas que se alimentaron con jarabe de azúcar con concentraciones de alcaloides pirrolizidínicos del 0.2 %, fueron capaces de transferir más del 15 % del volumen del jarabe almacenado en el buche a otras abejas(18).

Regulación y límites de consumo de alcaloides pirrolizidínicos La Organización Mundial de la Salud recomienda reducir la contaminación de alimentos por alcaloides pirrolizidínicos al menor nivel posible, así como monitorear mieles que se producen en regiones donde se conoce que existe el riesgo de contaminación con alcaloides pirrolizidínicos(36). Sin embargo, a la fecha no existe una regulación para la presencia de estos alcaloides en la miel, ya que no se han determinado los límites para establecer los criterios de aceptación o rechazo en la comercialización de este alimento. Algunos países han establecido límites en el consumo de alcaloides pirrolizidínicos basados principalmente en el uso de medicinas y complementos alimenticios elaborados a partir de plantas medicinales. Alemania estableció que los productos que contengan alcaloides pirrolizidínicos y que se ingieren vía oral deben contar con la leyenda “no se use durante el embarazo y lactancia” y a través del Instituto Federal de Evaluación de Riegos (BfR, por sus siglas en alemán), recomienda un límite de ingesta de alcaloides pirrolizidínicos de 0.007µg/kg de peso corporal/día, ya que es poco probable que esta dosis provoque efectos dañinos como cáncer. Además, para tratamientos que utilizan medicamentos elaborados a partir de plantas medicinales cuya duración sea menor a seis semanas el límite de ingesta diaria de alcaloides pirrolizidínicos es de 1µg/día; si el tratamiento debe seguirse por más de seis semanas, el límite de ingesta diaria de estos se reduce a 0.1µg(40,41). El Comité de Toxicidad del Reino Unido recomienda un límite de ingesta de alcaloides pirrolizidínicos de 0.007µg /kg de peso corporal/día(42). En los Países Bajos, el Instituto Nacional para la Salud Pública y el Medio Ambiente (RIVM, por sus siglas en holandés) estableció un límite de consumo máximo de alcaloides pírrolizidínicos de 0.1µg /kg de peso corporal al día con el propósito de disminuir el riesgo de cáncer por la ingesta de concentraciones elevadas de estos alcaloides(43,44).

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La Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) retiró del mercado productos comestibles que contenían alcaloides pirrolizidínicos o que provenían de la planta consuelda (Symphytum spp), ya que se consideró que provocan daños severos a la salud. Sin embargo, no se ha establecido un límite de ingesta específico debido a falta de información(45). En Japón, el Ministerio de Sanidad, Trabajo y Bienestar prohibió la comercialización de consuelda (Symphytum spp.) y todos los alimentos que la contengan(46). En Australia y Nueva Zelanda sólo la intoxicación crónica por alcaloides pirrolizidínicos es considerada un riesgo para la salud humana, por lo que se estableció una ingesta diaria tolerable de alcaloides pirrolizidínicos de 1µg/kg de peso corporal(47). El Código Conjunto sobre Normas Alimentarias en Australia y Nueva Zelanda prohíbe la adición intencional de algunas plantas productoras de alcaloides pirrolizidínicos a los alimentos, como Crotolaria spp, Echium plantagineum, Echium vulgare y Heliotropium spp, entre otras(48). Asimismo, en Australia y Nueva Zelanda existen medidas específicas para disminuir la concentración de alcaloides pirrolizidínicos en miel, que consiste en mezclar mieles que se sabe que provienen de plantas productoras de estos alcaloides con mieles que provienen de plantas que no los producen(49).

Alcaloides pirrolizidínicos en miel La presencia de alcaloides pirrolizidínicos en miel ha sido documentada en estudios que se han desarrollado en varios países y reportan diferentes niveles de concentración y orígenes vegetales de los alcaloides. En un estudio que se hizo en Estados Unidos se encontró que miel que se obtuvo de la planta Senecio jacobea en el estado de Oregón presentó una concentración de hasta 3.9µg/g de este tipo de alcaloides(7). En Nueva Zelanda se encontraron mieles con concentraciones de alcaloides pirrolizidínicos que van de 0.017 a 2.85µg/g de la forma terciaria y N-óxidos de equivulgarina, vulgarina, uplandicina, equiuplatina, 3’–O–acetilequimidina y leptantina, los cuales son característicos de la planta Echium vulgare (viborera)(50). En Australia se desarrolló un estudio en el que se analizaron mieles que provenían de plantas productoras de alcaloides pirrolizidínicos (n= 29) y mieles que provenían de plantas que no producen alcaloides pirrolizidínicos o bien cuyo origen floral no fue asociado a una fuente específica (n= 35). En las 29 mieles que provenían de plantas productoras de alcaloides se

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encontraron concentraciones de alcaloides pirrolizidínicos en un rango de 0.033 a 2.27µg/g, mientras que 19 de las 35 mieles sin fuente floral específica o no productora de alcaloides pirrolizidínicos resultaron positivas y presentaron concentraciones entre 0.003 y 0.8µg/g, debido a mezcla de mieles de diferentes orígenes florales(51). La mezcla y homogenización de mieles que provienen de diferentes apiarios, que realizan algunos productores y comercializadores, ocasiona que los alcaloides pirrolizidínicos se encuentren con frecuencia en mieles comerciales, aunque no todas las mieles que se utilicen en el proceso provengan de néctar de plantas que producen estos alcaloides. En un estudio que se realizó en Irlanda, se encontró que en 50 muestras de mieles que se comercializaron al menudeo en Irlanda, el 16 % fueron positivas a alcaloides pirrolizidínicos y tuvieron una concentración promedio de 1.26µg/g de miel, cantidades capaces de ocasionar intoxicaciones crónicas en humanos(9). En Suiza se realizó un estudio en donde se analizaron 18 muestras de miel y 36 muestras de néctar provenientes de lugares en donde abunda la planta productora de alcaloides Echium vulgare, se encontraron concentraciones de hasta 0.153µg/g de alcaloides pirrolizidínicos en miel y un rango de 0.3 - 95.1µg/g en néctar, asimismo se encontró que el alcaloide más frecuente en las muestras tanto de miel como de néctar fue la equimidina(6). En Alemania se realizó un estudio en el que se incluyeron 216 muestras de mieles que se obtuvieron de supermercados europeos, así como de distribuidores de miel por internet, y se encontró que 19 muestras contenían alcaloides pirrolizidínicos en concentraciones de 0.02 a 0.12µg/g, el método empleado en este estudio sólo detecta los alcaloides pirrolizidínicos de los tipos retronecina y heliotridina de una muestra, pero no detecta otro tipo de alcaloides, por lo que es probable que la cantidad de alcaloides pirrolizidínicos por muestra fuera más alta que la que mostraron los resultados(52). En otro estudio que se desarrolló en ese país, en el que se analizaron 8,000 muestras de miel importada, se encontraron muestras positivas a la presencia de alcaloides pirrolizidínicos con una concentración promedio de 0.036µg/g, siendo la equimidina, licopsamina y el N–óxido de licopsamina los alcaloides pirrolizidínicos que se encontraron con mayor frecuencia(53). Asimismo, en Alemania, en el 2016, se detectó que miel importada de México estaba contaminada con estos alcaloides con concentraciones de 0.46µg/g, lo que hizo que se clasificara como un riesgo serio por las autoridades sanitarias y ocasionó que se retirara del mercado(54), mientras que en el 2019 se detectó polen importado de España que contenía alcaloides pirrolizidínicos en una concentración de 0.786µg/g, lo cual implicó que también se clasificara como un riesgo serio y se retirara del mercado(54).

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Conclusiones En algunos países existen regulaciones que determinan la concentración límite de alcaloides pirrolizidínicos que pueden estar presentes en ciertos alimentos, y en algunos de estos países también se han establecido límites en el consumo diario de estos alcaloides para el ser humano. A pesar de la evidencia científica que indica que la miel puede ser una fuente de alcaloides pirrolizidínicos para las personas, y que la intoxicación crónica es la de mayor preocupación por el consumo de miel, a la fecha no existen reportes de intoxicación por alcaloides pirrolizidínicos a través del consumo de miel en seres humanos. Es posible que esto se deba a que los alcaloides pirrolizidínicos también son tóxicos para las abejas, por lo que no pueden consumir miel con concentraciones altas de estos compuestos. Es importante considerar que las colonias de abejas producen miel para consumirla y por esto las abejas evitan recolectar néctar con altos niveles de alcaloides pirrolizidínicos para protegerse de sus efectos tóxicos. Sin embargo, es importante contar con regulaciones específicas, en donde se establezcan los límites máximos permitidos de estos compuestos en la miel, así como criterios específicos de aceptación o rechazo en cuanto a alcaloides pirrolizidínicos se refiere para la comercialización nacional e internacional de la miel. En este sentido es muy importante establecer los límites máximos tolerables de alcaloides pirrolizidínicos en miel, ya que es un alimento natural que se consume tal como se obtiene de la colmena y la presencia de este tipo de compuestos es una causa de pérdida de inocuidad y calidad en la miel. La producción de miel es una actividad importante en México, en la que la exportación de este producto tiene un papel muy importante desde el punto de vista económico, por lo que debe tomarse en cuenta seriamente cualquier impedimento para su comercialización internacional. Existen casos recientes en el que se retiraron mieles mexicanas del mercado alemán, debido a que la concentración de alcaloides pirrolizidínicos fue clasificada como un riesgo severo para la salud de los consumidores. La información sobre la presencia de alcaloides pirrolizidínicos en mieles mexicanas es muy limitada, por lo que se requiere de estudios para definir los tipos y concentraciones de alcaloides pirrolizidínicos que se pueden encontrar en las mieles mexicanas de acuerdo a su origen floral o región en donde se producen, con el fin de evitar o disminuir sus efectos en la salud de los humanos y su posible impacto en la exportación de este producto. Literatura citada: 1. Alqarni AS, Owayss AA, Mahmoud AA, Hannan M. Mineral content and physical properties of local and imported honeys in Saudi Arabia. J Saudi Chem Soc 2012;5:618–625.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.5878 Revisión bibliográfica

Efectos de los fitoestrógenos en la fisiología reproductiva de especies productivas. Revisión

Miguel Morales Ramírez a Dinorah Vargas Estradab Iván Juárez Rodríguez c Juan José Pérez-Rivero d Alonso Sierra Reséndiz b Héctor Fabián Flores González e José Luis Cerbón Gutiérrez f Sheila Irais Peña-Corona*g

a

Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad Iztapalapa, Departamento de Biología de la Reproducción, Ciudad de México, México. b

Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Fisiología y Farmacología, Ciudad de México, México. c

UNAM. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Ciudad de México, México. d

Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad Xochimilco, Departamento de Producción Agrícola y Animal, Ciudad de México, México. e

UNAM. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Genética y Bioestadística, Ciudad de México, México. f

UNAM. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Reproducción, Ciudad de México, México. g

UNAM. Facultad de Química, Departamento de Biología, Ciudad de México, México.

*Autor de correspondencia: sheila.ipc@live.com

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Resumen: Los fitoestrógenos (FEs) son compuestos químicos provenientes del metabolismo secundario de algunos vegetales, tienen un efecto potencial sobre los parámetros reproductivos de los animales domésticos, al actuar como agonistas o antagonistas de los receptores estrogénicos. El objetivo de esta revisión es conocer los efectos que produce una dieta rica en FEs en la fisiología reproductiva de los animales de abasto. Se realizó una revisión sistemática en dos bases de datos mediante el uso de palabras clave relacionadas con los efectos que produce la ingestión de FEs en la dieta, sobre la reproducción de animales de abasto, únicamente se consideraron los estudios controlados desarrollados in vivo. Se encontraron resultados contradictorios, por un lado, la ingesta de un alto contenido de los compuestos polifenólicos, provenientes de distintos forrajes en la hembra bovina, estuvo relacionado con la disminución de la fertilidad, presencia de abortos y de quistes ováricos; por otro lado, la ingesta de alto contenido de FEs indujo un aumento en la calidad seminal de los machos de las especies: bovinos, ovinos y lepóridos; por lo que, dichos efectos se pueden atribuir a la concentración, al tipo de FEs, sexo, especie e incluso a la raza del animal. Palabras clave: Fitoestrógenos, Animales de abasto, Efectos reproductivos, Coumestanos, Isoflavonas, Lignanos.

Recibido: 25/11/2020 Aceptado: 04/08/2021

Introducción En las actividades pecuarias, la elección de la alimentación representa uno de los principales costos de producción y es uno de los aspectos técnicamente más complejos para la búsqueda de la satisfacción nutricional en las diferentes etapas de producción animal (cría, recría, gestación, lactancia, destete, crecimiento y engorda), considerando su estado fisiológico, edad y raza(1-4). Generalmente, la alimentación de los animales de abasto (AA) está basada en granos de sorgo y maíz, ya que, proporcionan una fuente rica en energía, además de otros alimentos que aportan proteína, como la soya, la canola, alfalfa y trébol(2-4). Es de importancia resaltar que se ha sugerido que se realicen cambios en la fuente de alimento o forraje en el caso de que se presenten alteraciones en la reproducción de los AA(4).

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Los alimentos de origen vegetal, se consideran una fuente rica en fitoestrógenos (FEs), compuestos polifenólicos no esteroides derivados del metabolismo de las plantas con estructura conformacional parecida al 17-β estradiol (E2)(3,5). Cuando son ingeridos por los animales, los FEs pueden actuar como moduladores selectivos de los receptores estrogénicos (REs) y ejercer como disruptores endocrinos de manera agonista o antagonista, dependiendo de la dosis ingerida(5,6), interfiriendo así en la síntesis, secreción, transporte y metabolismo de las hormonas reproductivas, durante el desarrollo embrionario y en la vida adulta(6-11). Se han reconocido cerca de 100 FEs; estos son categorizados de acuerdo a su estructura química, en cuatro clases: isoflavonoides (genisteína, daidzeína, formononetina); flavonoides (naringenina, kaemferol); coumestanos (coumestrol “COU”, sativol, diacetato de COU, 4metoxicoumestrol), y lignanos (enterolactona y enterodiol)(12,13). La soya, es la fuente más abundante de isoflavonas, pues es uno de los alimentos con mayor contenido de genisteína y daidzeína, mientras que la alfalfa y el trébol contienen alta cantidad de coumarinas. Cabe mencionar que los FEs se encuentran presentes de manera natural en las plantas, como glucósidos, los cuales se hidrolizan a aglicona (forma activa) catalizada por enzimas presentes en el sistema digestivo(14,15). A través de varios estudios, se ha demostrado que la ingestión de FEs provoca alteraciones reproductivas en los animales de ambos sexos, así como síndromes temporales de infertilidad(16,17). Sin embargo, también hay evidencia que los FEs favorecen la reproducción por incrementar la concentración, motilidad y volumen espermático necesarias para la fertilización(18-20). Debido a la importancia económica y productiva que representan las alteraciones reproductivas en el contexto de la producción animal, el objetivo de este trabajo es conocer el efecto potencial que tienen los alimentos ricos en FEs sobre la reproducción de los AA.

Método El presente documento se desarrolló de acuerdo con la declaración PRISMA (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses)(21).

Búsqueda de la literatura Se realizó una revisión sistemática en la Web (Figura 1); se utilizaron como buscadores de información especializada, los recursos Google Scholar y PubMed con el objetivo de identificar los estudios que exploraran los efectos de los FEs presentes en la dieta sobre la fisiología reproductiva de los AA, que se hayan publicado en revistas con arbitraje ciego por pares, resúmenes en extenso en congresos de especialidad, y en tesis de grado entre 1996 y

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2019. Las palabras clave, se establecieron de acuerdo al principio PICO (Participantes, Intervenciones, Comparaciones y Resultados [Outcomes]): P como animales de abasto (bovinos, ovinos, caprinos, equinos, porcinos, lepóridos y aves); I como alimentación con dieta rica en FEs; C como grupos control, o grupos de animales con alimentación baja en fitoestrógenos, o variables reproductivas del mismo grupo experimental reportado antes o después de la exposición a la dieta alta en fitoestrógenos; y R como variables reproductivas en machos y en hembras. La declaración del tema de la pregunta de la revisión se desarrolló como: ¿Los fitoestrógenos presentes en la dieta producen efectos adversos en variables reproductivas de los AA? De acuerdo con las palabras clave, se buscó primero en el recurso Google Scholar y, posteriormente, en PubMed, con fecha hasta junio del 2020. Generalmente, se utilizaron las siguientes palabras y buscadores boleanos, a fin de identificar los estudios disponibles en la red: {‘Reproduction’ AND ‘Animals’ AND ‘Phytoestrogens’ AND/OR ‘Fertility’ AND/OR ‘Feed’ AND/OR ‘Isoflavones’ AND/OR ‘Coumestans’, AND/OR ‘Lignans’ AND ‘Cows’ OR ‘Heifers’ OR ‘Bulls’ OR ‘Ewes’ OR ‘Small Rumninant’ OR ‘Sheep’ OR ‘Ovine’ OR ‘Goat’ OR ‘Nanny-goat’ OR ‘Equine’ OR ‘Mare’ OR ‘Horses’ OR ‘Porcine’ OR ‘Sows’ OR ‘Pigs’ OR ‘Leporids’ OR ‘Rabbits’ OR ‘Hens’ OR ‘Rooster’ OR ‘Chickens’} {‘Reproducción’ AND ‘Animales’ AND ‘Fitoestrógenos’ AND/OR ‘Fertilidad’ AND/OR ‘Alimentación’ AND/OR ‘Isoflavonas’ AND/OR ‘Coumestanos’ AND/OR ‘Lignanos’ AND ‘Vacas’ OR ‘Vaquillas’ OR ‘Toros’ OR ‘Pequeños rumiantes’ OR ‘Ovejas’ OR ‘Ovinos’ OR ‘Cabras’ OR ‘Equinos’ OR ‘Yeguas’ OR ‘Caballos’ OR ‘Porcinos’ OR ‘Cerdas’ OR ‘Lepóridos’ OR ‘Conejos’ OR ‘Aves’ OR ‘Gallinas’ OR ‘Gallos’ OR ‘Pollos’}. Todos los artículos se buscaron en inglés y en español, se examinaron inicialmente mediante la lectura de sus resúmenes. Los textos completos de los documentos incluidos de forma preliminar se volvieron a revisar para seleccionar el material a utilizar. En la figura 1 se muestra un diagrama de flujo que detalla la selección de estudios.

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Figura 1: Diagrama de flujo del progreso de la búsqueda del estudio

Criterios de inclusión y exclusión Se consideraron trabajos sobre experimentos controlados in vivo, en AA alimentados con una dieta rica o suplementada con FEs (soya, trébol, alfalfa) por más de siete días, y que incluyeran la determinación de la cantidad de FEs ingeridos o información suficiente para calcularla, en ese caso, la cantidad de FEs en la dieta (mg/kg de MS [materia seca]) se obtuvo de la base de datos del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos [United States Department of Agriculture; USDA(22,23)], asimismo para obtener la cantidad de alimentación diaria se obtuvo la relación del peso del animal y la cantidad de alimento consumido que contenía los FEs (reportado en el artículo). Se excluyeron aquellos estudios en los que la administración del FE no se relacionó con la alimentación, o se administraba vía oral a través de un excipiente, o cuando no se evaluaron parámetros reproductivos. Los datos extraídos de los estudios elegidos se registraron como sigue: especie, raza, alimentación diaria, efectos principales en variables reproductivas, tiempo de exposición en días, FEs presente en la alimentación y cantidad de FEs (mg/kg de MS).

Análisis de riesgo de sesgo Los artículos incluidos se evaluaron por dos examinadores, a fin de esclarecer dudas emergentes, un tercero fue consultado para identificar la presencia de sesgo de aleatorización, de cegamiento, de reporte de resultados y otros (Cuadro 1). Para representar el análisis de sesgo, se propuso una escala de colores: si el estudio cumplía con el criterio descrito, se utilizó el color verde; si el estudio era poco claro o no se contaba con la suficiente información para la evaluación del sesgo, se utilizó el color amarillo.

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Cuadro 1: Resumen de análisis de sesgo de cada estudio incluido

Referencia

Se describe de manera clara la selección aleatoria de la muestra de animales

Los investigadores que seleccionaron la muestra NO conocían a que tratamiento se asignaría ésta

Se aseguró cegamiento de evaluadores al tratamiento asignado

El Los estudio resultados está libre están de otras completos fuentes de sesgo

García et al., 2018(24) Woclawek-Potocka et al., 2005(25) Hashem et al., 2016(26) Rodríguez et al., 2013(27) Piotrowska et al., 2006(28) Yurrita et al., 2017(29) Cantero et al., 1996(30) Pace et al., 2006(31) Hashem et al., 2018(32) Pace et al., 2011(33) Aragadvay-Yungán et al., 2018(2) Sierra et al., 2015(34) Domínguez et al., 2014(19) Ferreira-Dias et al., 2013(35) Gentao et al., 1999(36) Yuan et al., 2012(37) Cardoso et al., 2007(38) Cardoso et al., 2009(39) Yousef et al., 2004(18) Hashem et al., 2008(40) Saleh et al., 2019(41) Ni et al., 2007(42) Lu et al., 2017(43) Wistedt et al., 2012(44) Arija et al., 2006(45) Heng et al., 2017(46) El color verde indica bajo riesgo de sesgo, el color amarillo indica que no es claro o no hay suficiente información para la evaluación del criterio, según el juicio de los autores.

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Resultados En la búsqueda sistemática, se recopilaron finalmente 26 documentos especializados: seis de bovinos (un artículo en español y tres en inglés, una tesis de maestría en español y una tesis de doctorado en inglés); siete de ovinos (uno en español y cuatro en inglés, una tesis de maestría en español, un resumen de congreso en español); uno de equinos en inglés; dos de porcinos en inglés; cuatro de lepóridos en inglés y seis de aves en inglés (Cuadro 2). Todos los artículos fueron publicados entre 1996 y 2019.

Bovinos En un estudio realizado con vaquillas Bradford (n=15 por grupo) de 11 meses de edad alimentadas, seis meses antes de su primer servicio, con 0.8 % de soya, calculado con base en el peso vivo (PV), (alimento que se consideró por los autores como con alto contenido de FEs, al compararlo con la alimentación habitual de 0.3 % PV), se observó un porcentaje de gestación (%G) de 93 % y un aborto, en comparación con el grupo testigo en donde se reportó un 100 % de éxito en la preñez y ningún caso de aborto; los autores aluden que no es posible afirmar que la alimentación con 0.8 % PV haya sido la causa del aborto, y que, dicha alimentación no afectó los parámetros reproductivos(24). En otro estudio, se evaluó el %G en vaquillas Holstein/Polish (75 y 25 %) que fueron alimentadas constantemente con 2.5 kg de soya, se observó que la tasa de la preñez, no fue significativamente diferente comparado con el grupo testigo, aunque se detectó equol y p-etil-fenol (compuestos derivados del metabolismo de los FEs) en el suero de las vaquillas(25). Por otro lado, se ha reportado que en vaquillas Holstein, alimentadas por cinco meses con trébol, el %G disminuyó (61.5 %), comparado con vaquillas alimentadas con ensilado de maíz (92.3 %); el porcentaje de vaquillas que no quedaron gestantes después de varias inseminaciones fue mayor (38.46 %) en el grupo de vacas alimentadas con trébol comparado con su testigo (7.7 % )(26) (Cuadro 2). En vacas adultas Holstein/Polish (75 y 25 %) que fueron alimentadas desde un período de lactancia anterior al empadre, con 2.5 kg de soya, presentaron un %G de 60 % en comparación con el grupo control que mostró un 100 % de gestación(25). En vacas Holstein en etapa de lactancia alimentadas por 60 días con harina de alfalfa o trébol rojo, se reportaron alteraciones en las concentraciones de E2, progesterona (P4) y en la hormona luteinizante (LH). Se documentó disminución significativa de E2 en los grupos de vacas alimentadas con alfalfa (2.32 ± 0.12 pg/mL) o trébol rojo (2.25 ± 0.67 pg/mL) en comparación con las vacas testigo (4.24 ± 0.31 pg/mL); la concentración de P4 disminuyó al finalizar el período de suplementación en las vacas alimentadas con alfalfa (1.586 ± 0.27 ng/ml) o trébol rojo (0.988 ± 0.3 ng/ml) en comparación con los animales control (2.82 ± 0.34 ng/ml); la LH también disminuyó en las vacas de los grupos alimentados con alfalfa (3.82 ± 0.22 UI/ml) o trébol

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rojo (3.7 ± 0.26 UI/ml) comparada con las vacas control (6.66 ± 0.39 UI/ml)(27). En otro estudio se observó que las concentraciones de P4 disminuyeron a lo largo del ciclo estral en vacas Holstein/Polish black cuando se alimentaron con 2.5 kg de soya por 21 días, comparado con el grupo control, lo anterior sugiere que los FEs contenidos en la soya pueden alterar la función del cuerpo lúteo (CL), cabe mencionar que los efectos se comenzaron a observar entre el día 15 y 18 después de su ingesta(28) (Cuadro 2). En el único estudio disponible realizado en toros Angus, con una dieta con 10 % de soya desde el destete y hasta la prepubertad se observó una mejora en el crecimiento escrotal y la calidad del semen en la adultez(29). Las diferencias entre sexos documentadas derivadas de los efectos producidos por FEs son biológicamente plausibles, dado que los FEs son xenoestrógenos conocidos que alteran el sistema endocrino dependiendo de la disponibilidad de REs y órganos blanco de ambos sexos. En los estudios revisados, la edad de exposición de FEs, y el tipo de FEs determinan el efecto biológico de los mismos, observando un efecto nocivo mayor en vacas adultas mantenidas con alimento rico en FEs que en las vaquillas.

Pequeños rumiantes En ovejas Manchegas que consumieron alfalfa de forma ad libitum, durante 10 meses y que contenía COU a razón de 25 ppm en otoño, 30 ppm en invierno y 17 ppm en primavera, se encontró que el 43 % de éstas, presentaron alteraciones en el tracto genital: quistes o microquistes en el endometrio acompañadas de petequias y equimosis en la mucosa uterina, mayor actividad glandular y quistes paraováricos(30). Hay trabajos en los que no se documentan efectos nocivos sobre los parámetros reproductivos de ovejas y machos de la raza Comisana, incluso se ha sugerido que la administración prolongada de trébol subterráneo, con bajo contenido de formononetina (menor que 10 % del total de isoflavonas en base seca), induce una mejora significativa en la ganancia de peso de los animales y, en los machos, buenas características de la canal y la carne(31). En otro estudio llevado a cabo en ovejas gestantes de raza Rahmani, que fueron alimentadas durante dos meses previos al parto y hasta la inducción del siguiente celo (3.5 meses posparto) con 849.4 g/kg de MS de Trifolium alexandrinum, no se documentaron diferencias significativas entre grupos en la actividad ovárica y ovulación en el celo inducido, pero las hembras alimentadas con Trifolium alexandrinum mostraron menor duración de estro (20 h) en comparación con las ovejas alimentadas con maíz (34 h), en las cuales, las concentraciones de P4 en la fase lútea del estro inducido fueron significativamente mayores, en comparación con las ovejas tratadas(32). En otro trabajo realizado en corderas de las razas Sarda y Comisana, se evaluaron los efectos de la alimentación ad libitum con alfalfa o trébol subterráneo, en estos animales, no se

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observaron alteraciones en el desarrollo del sistema reproductivo, fertilidad, fecundidad, rendimiento reproductivo, e intervalo entre partos, aunque los animales alimentados con trébol presentaron un mayor peso en la pubertad, los autores sugieren que algunas variedades de trébol no afectan negativamente la reproducción de las ovejas y parecen mejorar la tasa de crecimiento de los animales(33). En carneros criollos alimentados con 1.1 kg/día de alfalfa contaminada con Pseudopeziza medicaginis en un 10, 40 y 70 % por 45 días, se documentó una disminución significativa de la concentración espermática en carneros alimentados con alfalfa contaminada con el hongo al 40 y 70 %, comparados con el grupo 10 %(2). Es preciso mencionar que las infestaciones fúngicas causadas por Pseudopeziza medicaginis incrementan las síntesis de sustancias fitoestrogénicas como coumarinas e isoflavonas(2). En otros estudios no se reportan diferencias entre características espermáticas, por ejemplo, en un estudio con ovinos híbridos Hampshire/Suffolk, que fueron alimentados con alrededor de 1 kg de alfalfa (2.5-6.5 mg de COU/100g de alfalfa(22,23)) o con 200 g soya extruida (57 mg de genisteína/100 g de soya extruída; 31 mg de daidzeína/100 g de soya extruida (22,23), diarios por 90 días, no se reportaron alteraciones en el volumen, color, motilidad, y concentración espermática evaluado en semen fresco o criopreservado(34). Asimismo, en corderos híbridos de tres meses Katahdin/Pelibuey alimentados por 90 días con 23 % de alfalfa, no se observaron diferencias en el volumen, ni en la integridad de la membrana espermática, la motilidad total, ni progresiva y en el estado del acrosoma(19) (Cuadro 2). En los ovinos, se encontraron contradicciones en cuanto a los efectos deletéreos o benéficos atribuidos a la ingestión de FEs sobre las variables reproductivas.

Equinos Los efectos de FEs en los equinos provenientes de la alimentación están poco descritos. Se han identificado formas conjugadas y libres (activas) de COU y sus metabolitos en el plasma de yeguas alimentadas por 14 días con pellets de alfalfa en concentraciones crecientes hasta 1 kg/día, durante el tiempo del experimento, todas las yeguas ciclaron, en el día cero la mitad de las yeguas estaban en la fase folicular, y la otra mitad en la fase lútea, en los días 13 y 14 del experimento, todas las yeguas presentaron la fase lútea(35) (Cuadro 2). Los resultados sugieren que los FEs afectan la duración del ciclo estral y pueden prolongar la función lútea en la yegua, debido a la inducción de la persistencia de CL(35).

Porcinos En cerdas gestantes alimentadas con una dieta regular suplementada con 0.005 mg de daidzeína/kg de PV, en el período de periparto (desde 30 días preparto al día 7 posparto), mostraron un incremento en el peso de la camada en comparación con el grupo control, que

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no consumió daidzeína; además, la producción de leche, proteínas del calostro y la hormona del crecimiento se incrementaron alrededor de un 12 % en aquellas cerdas alimentadas con dicha isoflavona(36). En minipigs alimentados con baja concentración de isoflavonas (250 ppm) no se observaron efectos negativos en la reproducción; en cambio, cuando aumentó la concentración (500 ppm) disminuyó el índice testicular ((peso testicular bilateral/total del peso corporal) x 100%), LH y testosterona (T4); además, hubo aumento de células germinales apoptóticas indicando peroxidación testicular(37) (Cuadro 2). En cerdas, la alimentación suplementada con daidzeína favorece el peso de las crías al parto y la producción de leche, en el caso de los machos, el efecto de los FEs en la dieta depende de la cantidad administrada, cantidades bajas de FEs favorecen la función testicular.

Lepóridos En un estudio realizado en conejas gestantes alimentadas con una dieta con 18 % de harina de soya (13 mg/kg de isoflavonas/de peso corporal) durante las etapas de gestación, lactancia y hasta la edad de 33 semanas de las crías, se observó que los machos fueron más precoces en el tiempo de inicio de la pubertad en comparación con el grupo testigo, no se reportaron diferencias significativas en la morfología de los órganos reproductivos, la calidad del semen y el comportamiento sexual(38). En otro estudio, se evaluó el efecto de la exposición a una dieta comercial para conejos con 18 % de harina de soya durante el período perinatal (intrauterino y lactancia) sobre la morfología de los órganos reproductivos de los machos, a las 26 semanas de edad. No se observaron alteraciones en el tracto reproductivo de la progenie masculina(39). En conejos machos Nueva Zelanda, adultos de 7 meses, alimentados con 30 % de heno de Berseem (Trifolium alexandrinum) y suplementados con 2.5-5 mg de isoflavonas/kg de peso corporal cada tercer día durante 13 semanas, se documentaron mejoras en las características del semen y libido, ya que hubo un aumento en el volumen, concentración y el porcentaje de movilidad espermática(18). Cuando se evalúo el efecto de una dieta rica en soya (80 g de soya/kg de alimento) y en linaza (100 g de linaza/kg de alimento) en conejos adultos, se apreciaron incrementos en la ocurrencia de anormalidades en los espermatozoides, disminución en libido y en el proceso de la esteroidogénesis, sin embargo, cuando estos se cruzaron con hembras no tratadas, no se afectó la tasa de preñez, el tamaño de la camada y la fertilidad(40) (Cuadro 2). Los resultados de los estudios anteriores sugieren que la administración del alimento comercial, con una concentración de hasta 18 % de soya, a conejas gestantes, no produce en las crías alteraciones en la morfología de los órganos reproductivos en los machos F1. Tampoco las dietas con porcentajes menores a 80 g de harina de soya o 100 g de linaza/kg

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de alimento, provocan efectos sobre los órganos reproductores de machos, el volumen del eyaculado ni la fertilidad. No se encontraron estudios en los que se evaluaran los efectos de los FEs directamente sobre la fisiología reproductiva de las hembras (Cuadro 2).

Aves En un estudio realizado en gallinas ponedoras Bovans Brown(41) de 65 semanas de edad alimentadas por seis semanas con dietas suplementadas con 1 g de semillas de lino, o de fenogreco/kg de alimento (ricas en FEs, 0.20 mg de isoflavonas/kg de MS), se observó un aumento en la concentración de E2 y LH, peso y mejora del grosor del cascarón al final del ciclo de puesta de huevos, tanto con la suplementación de las semillas por separado, así como con su combinación (lino y fenogreco)(41). El aumento en el grosor del cascarón del huevo documentado en el estudio anterior, también se hizo presente en otro, en el que se alimentó a gallinas ponedoras ISA de 445 días de edad, con una dieta suplementada con 10 mg de daidzeína/kg de alimento(42). Además, en este último estudio se reportó un aumento significativo en la proporción del peso del oviducto con respecto al peso corporal(42). No se presentaron alteraciones en el ancho y largo del huevo, ni en las concentraciones séricas de E2(42). Por otro lado, se ha observado que en gallinas ponedoras Rugao de 44 semanas de edad alimentadas con dietas suplementadas desde 60 hasta 248 mg de daidzeína/kg de alimento durante 12 semanas, no generó diferencias significativas en la calidad del huevo ni en la fertilidad, aunque se observó incremento en la incubabilidad de la puesta de huevos(43). También, Wistedt et al(44) reportaron la ausencia de efectos en las variables reproductivas en gallinas ponedoras Lohmann Selected Leghorn (LSL) y Lohmann Brown (LB), de 15 semanas de edad sobre la morfología y tamaño de ovarios y oviductos después de haber sido suplementadas con 50 mg de daidzeína/kg de alimento. Se observó diferencia en la sensibilidad de las razas a la daidzeína, pues los cascarones de huevo fueron más gruesos en las LB que en las LSL(44). En pollos de engorda Cobb de 1 día de edad, alimentados durante 21 días con 100, 200 o 300 mg de frijol extruido o crudo/kg de alimento, se observó disminución en las concentraciones T4 y androstenediona con la alimentación de frijol crudo, en cambio, la administración de frijol extruido aumentó las mismas variables(45). Finalmente, en gallos reproductores jóvenes de 70 días, alimentados con producto comercial adicionado con isoflavonas, se observó que con 5 mg/kg se incrementó el peso del testículo, la concentración de hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH), y la expresión del ARNm de la enzima StAR(46) (Cuadro 2). Los resultados de los estudios sugieren que los FEs provocan efectos favorables en variables reproductivas de aves macho y hembras.

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Sesgo En ninguno de los estudios incluidos en la presente revisión, se realizó cegamiento de los evaluadores al tratamiento asignado, ni tampoco, en la selección de la muestra. En cambio, en todos los artículos se identificaron los resultados completos, y fueron libres de otras fuentes de sesgo. Más de la mitad de los estudios incluidos utilizaron alguna técnica de aleatorización para sus unidades experimentales(18,27,30,31,36,37,38,39,40,41,42,43,45,46).

Discusión En rumiantes, las isoflavonas son metabolizadas en el rumen, lo que genera compuestos estrogénicos o no estrogénicos. El secoisolariciresinol y metairesinol son los precursores de COU, enterodiol y enterolactona; la biochanina A y la genisteína se pueden descomponer en p-etil-fenol (no estrogénico); la formononetina se metaboliza a daidzeína y finalmente a equol, un compuesto más estrogénico que se absorbe a través de la pared ruminal(47,48). Los principales efectos producidos por los FEs en el ganado bovino incluyen: alteraciones hormonales, disminución de %G y aumento de abortos, esto depende de la etapa reproductiva, del tiempo de consumo y del tipo de FEs involucrado. La mortalidad embrionaria temprana y el incremento de la tasa de abortos puede ser explicada por la capacidad que poseen los FEs de inhibir la secreción de P4 estimulada por LH(49,50). En las vacas, la liberación de prostaglandinas (PG) con acción luteolítica, está regulada por E2 y P4(51). Los FEs y sus metabolitos activos alteran la relación PGE2-F2α lo que conduce a la producción no fisiológica de agentes luteolíticos durante la gestación y el ciclo estral(25). En la gestación, el equilibrio entre PGE2-F2α es crucial para el mantenimiento y función de CL, el reconocimiento de la preñez, la implantación embrionaria y el desarrollo, entonces, la estimulación de la producción de PGF2α puede llevar a interferir en dicho balance y el desarrollo embrionario(52). Los FEs como agonistas, en animales no preñados reducen la duración del ciclo estral, pues durante la luteolisis y la ovulación, la estimulación de la secreción de PGF2α puede acelerar la retroalimentación positiva entre PGF2α y oxitocina(51,52). Por otra parte, los FEs como antagonistas, inducen alteraciones en el desarrollo folicular y por lo tanto, la ausencia de estro(53,54). Además, se ha reportado una posible relación positiva entre la concentración de isoflavonas en el plasma sanguíneo y la incidencia de celo silencioso en el ganado lechero alimentado con soya(55). Los FEs al ser parecidos estructuralmente al E2, actúan como agonistas o antagonistas de los REs(7,56). Los efectos biológicos atribuidos a los FEs se presentan con concentraciones de alrededor de 1,000 veces más altas que las concentraciones de E2 endógeno (1-10 nM). Lo anterior se basa en que Woclawek-Potocka et al reportaron 1.6 ± 0.3 μM de p-etil fenol y 1.2 ± 0.28 μM de equol(25); Piotrowska et al reportaron 1.28 ± 0.10 μM de equol y 6.24 ± 0.30

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μM de p-etil fenol(28); Zdunczyk et al reportaron daidzeína, genisteína, equol y p-etil-fenol en un rango de 0.1 a 3.6 μmol/L en vacas que presentaron alteraciones reproductivas(55). En otro estudio, se calculó que la ingesta de 66.8 mg/kg de COU (presente en la alfalfa), produjo concentraciones plasmáticas de 13 ng/ml de este compuesto, que resulta ser también 1,000 veces mayor a la concentración de E2 durante el estro(25). Aún teniendo en cuenta que la actividad biológica del COU es 160 veces menor en comparación con la del E2, la cantidad equivaldría a seis veces la concentración efectiva de E2 en el estro, y por lo tanto, suficiente para inducir cambios estrogénicos semejantes a los encontrados en la vaca durante dicha fase del ciclo estral(57). Los datos anteriores sugieren que las vacas que están continuamente expuestas a una dieta que incluye FEs pueden mostrar alteraciones reproductivas, contrario a lo reportado en machos, en los cuales la alimentación con un 10 % de soya como fuente de proteína, mejora la formación y la concentración espermática(29). En ovinos los efectos de los FEs sobre variables reproductivas son contradictorias. En algunos estudios se ha sugerido que, estos compuestos no provocan alteraciones como en otras especies(19,20); en otros, es evidente su efecto deletéreo, incluso se ha descrito el “Síndrome del Trébol” el cual consiste en infertilidad, prolapso de útero y distocia(58,59). Los principales efectos reportados en hembras son alteraciones morfológicas en órganos reproductivos y mayor actividad de las glándulas endometriales, lo que conduce a cambios cuantitativos y cualitativos del moco cervical, lo que puede dificultar la fertilización(30,60). Está reportado que los FEs sensibilizan al cuello uterino a la acción estrogénica, además de ocupar los REs en cérvix, también estimulan la aparición de nuevos sitios de unión(61). Además, los FEs alteran la secreción de la hormona folículo estimulante (FSH)(62). En ovejas, el número de folículos reclutables depende de las concentraciones de FSH(63), por lo tanto, es probable que los FE interfieran en el reclutamiento folicular. Se ha reportado que los factores relacionados con la ausencia de efectos provocados por los FEs en algunos estudios son la estacionalidad, la dosis de FE ingerida y la especie y condiciones del vegetal utilizado, ya que se ha documentado que en una sola especie vegetal se puede encontrar más de un tipo de FEs en distintas concentraciones; por ejemplo; en condiciones normales, las concentraciones de COU en la alfalfa, son de 1 a 2 mg/kg y en circunstancias de defensa de la planta, la concentración de dicho FE, puede aumentar hasta 100 mg/kg(64). La concentración de FEs también depende de la presentación y órgano del vegetal, por ejemplo: el contenido de isoflavonas en los granos verdes crudos de soya, es de 48.9 mg/100 g de MS; el de la soya extruida es de 91 mg de/100 g de MS y la soya texturizada contiene 172.6 mg/100 g de MS(22,23). Con respecto a los flavonoides, las semillas maduras de soya contienen 37.41 mg/100 g de MS y las semillas verdes de soya contienen 1.23 mg/100 g de MS(22,23). La transición de fotoperiodos contribuye a la regulación del comportamiento estral, la ovulación, disponibilidad de REs y concentración de esteroides endógenos(32). En ovinos, se 815


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ha sugerido, que una ingestión prolongada de trébol subterráneo con niveles de FEs inferiores al 0.3 % o ~10 mg/g MS de alfalfa no produce infertilidad ni trastornos reproductivos, incluso aumenta significativamente el crecimiento corporal(33), probablemente debido a que los FEs también estimulan la hormona de crecimiento(42,65). Se ha sugerido que las diferencias en los efectos deletéreos en la reproducción, se pueden deber al tipo de isoflavonas administradas, a la diferencia en el número de REs y el tipo de metabolismo entre las diferentes especies(66). En ovinos machos también se encontraron resultados contradictorios, Aragadvay et al(2) describen alteraciones reproductivas con la alimentación de alfalfa contaminada con Pseudopeziza medicaginis al 40 y 70 %; otros estudios no reportan efectos nocivos(19,34). La razón por la cual existe esta diferencia en los resultados, aún no está descrita, probablemente se deba a la diferencia en la sensibilidad de los compuestos esteroidogénicos entre las razas de la misma especie, así como está reportado en otros modelos animales(67) incluso, es probable que los ovinos machos sean menos susceptibles al efecto de los fitoestrógenos(20) o que algunas variedades de vegetales no afectan negativamente la reproducción de las ovejas(20,33). De acuerdo con los criterios establecidos en la presente revisión, no se encontraron estudios publicados relacionados con cabras. Sin embargo se ha reportado que cabras alimentadas constantemente con 30% de alfalfa deshidratada presentaron una incidencia del 20 % de prolapsos rectales o vaginales en el último mes de gestación(68). En un reporte de caso de yeguas alimentadas con 5-8 kg/día de mezcla heno de alfalfa y trébol por al menos cinco meses, se observó edema uterino, ausencia de ovulación, y acumulación de fluido uterino, retorno a la ciclicidad ovárica normal dentro de las 2 a 3 semanas posteriores al retiro del alimento rico en FEs(35). El mecanismo de la absorción de FEs no está totalmente descrito; en esta especie, la digestión es muy rápida y el alimento puede pasar a través del estómago y el intestino delgado, dentro de las primeras 5 h(69). Lo anterior fue comprobado en un estudio en el que las formas activas de COU alcanzaron su nivel más alto entre 1 y 3.5 horas después de su ingestión(35). La cantidad de FEs en la pastura depende de la temporada del año, ya que se encontró una disminución de COU y sus metabolitos cuando se evaluó de noviembre a marzo y se sabe que su síntesis se incrementa bajo condiciones adversas para las plantas(35). Cabe mencionar que la deshidratación de la alfalfa para producir pellets podría reducir la actividad estrogénica(70). Por lo anterior, el tiempo de exposición, la presentación de FEs y la temporada del año, es fundamental para la producción de los efectos. Los efectos de los FEs, presentes en la dieta de porcinos sobre variables reproductivas es escaso, en contraste con la cantidad de datos de efectos estrogénicos de alimento contaminado con micotoxinas, o trabajos en los que se estudia el efecto de isoflavonas en la calidad de la carne y el crecimiento(71-73). La daidzeína y la genisteína, son las principales isoflavonas contenidas en la harina de soya, que es el ingrediente proteico básico en la dieta 816


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de los porcinos y se conoce que ambas representan el 88 % de las isoflavonas circulantes en sangre(73). Uno de los efectos de la alimentación de cerdas con dietas que contienen FEs en el último tercio de gestación, es un incremento en el peso de los animales, esto se puede deber al efecto positivo que producen los FEs sobre las concentraciones de hormona del crecimiento(74). En machos, el efecto es mucho más evidente, pues en la etapa fetal las concentraciones de estrógenos circulantes son bajas, y la presencia de FEs estimularía el crecimiento debido a un cambio en el metabolismo, proliferación y diferenciación del músculo esquelético(75). El aumento en la producción y la mejor calidad de la leche en cerdas alimentadas con isoflavonas, se podría deber al efecto agonista de las mismas sobre el factor de crecimiento insulínico-1 (IGF-1) y la prolactina reportado en cerdas periparturientas(76) o a un mejor balance de antioxidantes(77). En los machos, se ha identificado un efecto positivo en la reproducción cuando se administran bajas concentraciones de FEs(37). Lo anterior, se ha atribuido a la unión de las isoflavonas a los REs en el hipotálamo, hipófisis y testículos, estimulando la espermatogénesis, maduración espermática y el crecimiento gonadal(6). En cuanto a los lepóridos, está reportado que las hembras son más sensibles al efecto de los estrógenos ambientales(38). En conejos machos la administración intrauterina y lactacional de los FEs no inducen efectos deletéreos en la producción de semen o el comportamiento sexual, incluso se ha sugerido que la harina de soya se puede utilizar como parte de la dieta normal en hembras preñadas sin daño reproductivo a la progenie(38,39). La influencia benéfica de las isoflavonas en los parámetros seminales se han atribuido a su efecto antioxidante, debido a que reducen la producción del peróxido de hidrógeno y protegen a los espermatozoides contra el daño oxidativo(18). Además, en machos adultos, el estrógeno juega un papel principal en la prevención de la apoptosis en células germinales a través de sus acciones parácrinas o autócrinas en los testículos(32). El tipo de FEs que consumen los conejos también influye en el efecto final, por ejemplo, los lignanos suprimen con mayor fuerza la síntesis de T4 durante la espermatogénesis y la líbido, en comparación con las isoflavonas(32). En aves, al igual que en los otros animales domésticos, los FEs pueden actuar como agonistas/antagonistas, dependiendo de la dosis, tipo de tejido, el subtipo de RE, y presencia de hormonas endógenas, por lo tanto son considerados moduladores selectivos de REs(78). En aves, los efectos producidos por el consumo de FEs están relacionados con el componente genético, pues líneas de gallinas LB y LSL mostraron sensibilidad distinta a dichos compuestos(44); esto, podría deberse a que hay diferencia en la localización y en la expresión de los REs ß en los capilares uterinos entre líneas genéticas, lo que podría influenciar en la obtención de mayor peso del oviducto(44). En aves machos, se observó que una dieta rica en FEs promueve el crecimiento testicular por el incremento de la secreción hormonal, probablemente debido a la participación regulatoria de las isoflavonas en el mecanismo de retroalimentación del eje hipotálamo-hipófisisgónada(79), lo que a su vez regula la secreción de FSH, LH y T4 que promueve el crecimiento 817


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y la maduración de las células de Sertoli y Leydig. La dosis administrada también tiene un papel importante, está documentado que la genisteína tiene efectos agonistas parciales en gallos a dosis de 50-200 mmol/kg, y a dosis de 400-500 mol/kg actúa como antagonista(78); además, los FEs tienen la capacidad de inhibir la actividad de enzimas esteroidogénicas, e influyen en la viabilidad de las hormonas sexuales a través de la regulación de sus proteínas de unión; alteran centros cerebrales relacionados con el comportamiento sexual ya que atraviesan la barrera hemato-encefálica y se unen al RE α y ß(80). Finalmente, el metabolismo de FEs dietarios es predominantemente determinado por el metabolismo bacteriano gastrointestinal y depende de la etapa reproductiva, por ejemplo durante la gestación, la genisteína tiene el potencial de influir en el metabolismo y el crecimiento fetal; en el colon, la genisteína se puede metabolizar a dihidrogenisteína o 6'hidroxi-O-desmetilangolensina, mientras que la daidzeína se puede reducir a dihidrodaidzeína y convertirse en O-desmetilangolensina o equol, dichos metabolitos, pueden absorberse o metabolizarse en fenoles en la luz del colon(81). Luego del consumo de los FEs, estos son des-conjugados por la flora bacteriana intestinal, reabsorbidos, reconjugados en el hígado y excretados en la orina(25,61). La desmetilación de estos compuestos ocurre en el intestino por bacterias acetogénicas y en el hígado(81). Por lo tanto, el microbioma intestinal presente en cada especie influirá en el efecto final de los FEs sobre las variables productivas y reproductivas.

Conclusiones Con base en los artículos revisados y discutidos, se concluye que, los fitoestrógenos provocan alteraciones en la fisiología reproductiva de los animales de abasto considerando cuatro factores: 1) la especie vegetal consumida; 2) la temporada del año en que se consume la especie vegetal; 3) las particularidades de los animales (metabolismo, edad, raza, especie y sexo) y 4) las condiciones de procesamiento de la planta. Futuros estudios deben ser llevados a cabo para dilucidar los mecanismos endocrinos de las acciones de FEs en la reproducción de animales. Es necesario reevaluar los ingredientes que componen los alimentos de los distintos animales productivos. Literatura citada: 1. Meléndez P, Bartolomé J. Advances on nutrition and fertility in dairy cattle: Review. Rev Mex Cienc Pecu 2017;8(4):407-417.

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Cuadro 2: Resumen de los principales efectos de los fitoestrógenos (FEs) en especies productivas Especie

Condición y raza

Ingesta diaria

Efectos principales

Exposición (días)

Adultas Holstein/Polish

2.5 kg de soya

Disminución de %G

300

Cantidad de FEs de acuerdo con la especie y presentación del vegetal (mg/kg de MS) 1900 de GEN y DAI

Adultas Holstein

~5 kg de alfalfa ~5 kg de trébol rojo 2.5 kg de soya

Aumento de E2, disminución de P4 y LH Aumento de E2, disminución de P4 Y LH Disminución de P4

60

~25-65 de COU

60

~100 de GEN y 110 de DAI 1900 de GEN y DAI

2.22 kg de soya

Disminución de %G, aumento de abortos, no significativo Sin diferencia en %G

300

~570 de GEN y 310 de DAI

21

1900 de GEN y DAI

6.60 de GEN, 8.05 de DAI, 2.85 de FOR y 282.5 de BI ~135 de GEN y 6.32 de DAI 17-30 de COU

Adultas Holstein

Bovinos

Ovinos

Adultas Holstein/Polish Vaquillas Bradford

21

Vaquillas Holstein/Polish

2.5 kg de soya

Vaquillas Holstein

~7 kg de trébol

Disminución de %G y P4 Aumento de E2

150

Becerros Angus

~800 g de harina de soya Ad libitum pastura de alfalfa

Aumento en concentración espermática Quistes endometriales y paraováricos

360

Adultas Manchegas

826

300

Autores y año WoclawekPotocka et al., 2005(25) Rodríguez et al., 2013(27) Rodríguez et al., 2013(27) Piotrowska et al., 2006(28) García et al., 2018(24) WoclawekPotocka et al., 2005(25) Hashem et al., 2016(26) Yurrita et al., 2017(29) Cantero et al., 1996(30)


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Adultas Rahmani

800 g de trébol subterráneo

Menor duración del estro

180

Corderas Comisana

Ad libitum pastura trébol subterráneo Ad libitum pastura de alfalfa Ad libitum pastura de trébol subterráneo Ad libitum pastura trébol subterráneo ~1 kg de alfalfa

Sin efectos en reproducción

60

Sin alteraciones en sistema reproductivo, fertilidad, y fecundidad Sin alteraciones en sistema reproductivo, fertilidad, y fecundidad

Corderas Sarda

Corderas Sarda

Corderas Comisana Adultos Criollos

Adultos Hampshire/Suffol k Adultos Hampshire/Suffol k Corderos Katahdin/Pelibue y

6.60 de GEN, 8.05 de DAI, 2.85 de FOR y 265 de BI 797 de GEN, DAI, FOR y BI

Hashem et al., 2018(32)

60

900–10210 de GEN, BI y FOR

Pace et al., 2011(33)

60

900–10210 de GEN, BI y FOR

Pace et al., 2011(33)

Sin alteraciones en parámetros reproductivos

600

810-880 de GEN, BI y FOR

Pace et al., 2011(33)

Concentración espermática inverso a dosis

45

~25-65 de COU

1 kg de harina de alfalfa

Sin alteraciones en parámetros espermáticos

90

~25-65 de COU

AragadvayYungán et al., 2018(2) Sierra et al., 2015(34)

200 g de soya extruida

Sin alteraciones en parámetros espermáticos

90

~570 de GEN y 310 de DAI

Sierra et al., 2015(34)

~230 g de alfalfa

Sin alteraciones en parámetros ni morfología espermática

90

~25-65 de COU

Domínguez et al., 2014(19)

827

Pace et al., 2006(31)


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Corderos Comisana Equinos

Porcinos

Lepóridos

Adultas Lusitanas Gestantes Large White/Erhualian Adultos Minipig

Gestantes Nueva Zelanda

~20 g de harina de soya

Adultos Nueva Zelanda Adultos Nueva Zelanda Adultos Línea V

~32 g de harina de soya 7.13–14.25 mg de ISO* ~15.44 g de soya ~19.3 g de linaza ~120 mg de lino ~131 mg de fenogreco ~128 mg de lino y 128 mg de fenogreco

Adultos Línea V

Aves

Ad libitum pastura trébol subterráneo 1 kg de pellets de alfalfa ~1.5 mg de DAI ~6.75–27 mg de isoflavonas de soya

Adultas Bovans Brown Adultas Bovans Brown Adultas Bovans Brown

Sin efectos en reproducción

60

797 de GEN, DAI, FOR y BI

Pace et al., 2006(31)

Altas concentraciones de COU en suero Incremento en producción de leche En dosis bajas aumento de índice testicular, en dosis altas disminución del índice testicular, LH y T4 Sin efecto en órganos reproductivos, calidad seminal y comportamiento sexual de F1 Sin alteraciones en órganos reproductivos Mejora en características del semen y libido No afecta fertilidad de semen, disminución de T4 No afecta fertilidad de semen, disminución de T4 Aumento de LH, FSH, E2

14

~25-65 de COU

37

-

60

125-500 de ISO

Ferreira-Dias et al., 2013(35) Gentao et al., 1999(36) Yuan et al., 2012(37)

~256

~135 de GEN y 632 de DAI

Cardoso et al., 2007(38)

60

~135 de GEN y 632 de DAI -

Cardoso et al., 2009(39) Yousef et al., 2004(18) Hashem et al., 2018(40) Hashem et al., 2018(40) Saleh et al., 2019(41) Saleh et al., 2019(41) Saleh et al., 2019(41)

91

42

240.4 de DAI y 131 de GEN 368 de SECOI y 52.8 de DAI -

Aumento de LH, E2

42

~0.1 de DAI y 0.1 GEN

Aumento de LH, FSH, E2

42

~0.1 de DAI y 0.1 GEN

828

84 84


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Adultas ISA Adultas Rugao Adultas Lohmann Brown

~1.2 mg de DAI ~5.4–22.57 mg de DAI ~5 mg de DAI

Adultas Selected Leghorn

~5 mg de DAI

Jóvenes Reproductores

~0.75 mg de ISO ~2.38-7.14 mg de frijol extruido ~2.38-7.14 mg de frijol crudo

Pollos Cobb

Aumento en peso del oviducto Sin efecto en fertilidad

63

-

Ni et al., 2007(42)

84

-

Lu et al., 2017(43)

Sin cambios en morfología tamaño de ovarios y oviductos alta sensibilidad a DAI Sin cambios en morfología y tamaño de ovarios y oviductos Incremento en peso del testículo, GnRH Aumento de T4 y androstenediona

84

-

Wistedt et al., 2012(44)

84

-

Wistedt et al., 2012(44)

63

-

21

-

Heng et al., 2017(46) Arija et al., 2006(45)

Disminución de T4 y androstenediona

21

-

Arija et al., 2006(45)

BI= Biochanina A; COU= Coumestrol; DAI= Daidzeína; E2= 17-ß estradiol; FOR= Formonoteina; F1= Generación filial 1; GEN= Genisteína; GLY= Gliciteína; GnRH= Hormona liberadora de gonadotropinas; ISO= Isoflavonas; LH= Hormona luteinizante; MCOU= Metoxicoumestrol; PEP= Para-etil-fenol; P4= Progesterona; SECOI= Secoisolariciresinol; T4= Testosterona; %G= Porcentaje de gestación; -= No aplica; *= Cada tres días; ~= cálculo aproximado.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v13i3.5730 Nota de investigación

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Alan Álvarez-Holguína Carlos Raúl Morales-Nieto b* Raúl Corrales-Lerma a Jesús Alejandro Prieto-Amparán a Ireyli Zuluami Iracheta-Lara a Nathalie Socorro Hernández-Quiroz a

a

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Campo Experimental La Campana. Carretera Chihuahua-Ojinaga km. 33.3, 32190. Aldama, Chihuahua, México. b

Universidad Autónoma de Chihuahua, Facultad de Zootecnia y Ecología. Chihuahua, México.

* Autor de correspondencia: cnieto@uach.mx

Resumen: En los últimos años se han realizado diversos trabajos para seleccionar genotipos sobresalientes de pastos para restauración de pastizales. Estos trabajos se han enfocado principalmente en características agronómicas y poca importancia se ha dado a la estructura genética y adaptación ambiental de los genotipos. El objetivo fue evaluar la estructura genética y aptitud ambiental de poblaciones de pasto banderita en Chihuahua, México. Se evaluaron 51 poblaciones de pasto banderita (Bouteloua curtipendula) a través de marcadores AFLP y análisis de su estructura genética. La aptitud ambiental de los grupos genéticos que se conformaron se determinó mediante el diseño de modelos que utilizan el algoritmo de MaxEnt. Lo anterior, representa una manera novedosa de usar el algoritmo, ya 830


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que comúnmente solo se utilizada a nivel especie. El análisis STRUCTURE dividió las poblaciones de pasto banderita en dos grupos genéticos diferentes (AMOVA; P<0.0001). El 89 % de las poblaciones integradas al Grupo 1 habitan en la región semiárida y 90 % de las poblaciones del Grupo 2 se encuentran en la región árida. Los resultados del análisis de MaxEnt revelaron que los grupos genéticos tienen aptitud ambiental diferente. El nicho climático del Grupo 1 se encuentra en el centro y sur del estado, mientras que el del Grupo 2 se localiza en el centro, oeste y noreste. Por lo anterior, se concluye que los programas de restauración con pasto banderita deben realizarse con genotipos locales de cada ecorregión del Estado y en áreas con mayor aptitud ambiental. Palabras clave: AFLP; Nicho climático; MaxEnt; STRUCTURE.

Recibido: 13/07/2020 Aceptado: 10/01/2022

La degradación de los pastizales ocasiona una pérdida importante de productos y servicios que brindan estos ecosistemas al ser humano, como son el forraje para el ganado, captación de agua, retención de suelo y captura de carbono(1). La fragmentación, expansión de especies invasoras, conversión de pastizales en áreas de agricultura, el crecimiento poblacional, entre otros, son algunas de los principales problemas que continúan afectando a los pastizales(2). Para atender estos problemas en los últimos años se han realizado trabajos con la finalidad de seleccionar genotipos de diferentes especies de pastos para utilizarlos en la rehabilitación de pastizales(3,4,5). Sin embargo, la selección de materiales se ha enfocado principalmente en características agronómicas y se le ha dado poca importancia a la estructura genética y al potencial de adaptación a condiciones climáticas. La estructura genética de una especie la determina principalmente la adaptación a las condiciones ambientales de los sitios donde se distribuye. Por esta razón, conocer la estructura genética de las poblaciones puede ayudar a delimitar la distribución de los tipos genéticos y su uso potencial en programas de restauración ecológica(6,7). Una de las especies más utilizadas en restauración de pastizales en el norte de México es el pasto banderita [Bouteloua curtipendula (Michx.) Torr.], debido a que se adapta a una amplia gama de climas y tiene un excelente valor forrajero. Debido a esto, en los últimos años se han realizado diversos trabajos para seleccionar genotipos sobresalientes de pasto banderita, que puedan ser utilizados para restaurar los pastizales del estado de Chihuahua(8,9,10). Sin embargo, es necesario que se analice la estructura genética de las poblaciones de esta especie en el Estado y la aptitud ambiental que poseen.

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Una manera de estimar áreas con aptitud ambiental potencial para distribución de una especie, es mediante el uso de modelos matemáticos, tales como el método de máxima entropía que aplica el software (MaxEnt)(11). El uso de este tipo de métodos mediante la implementación de MaxEnt tiene una serie de ventajas entre las cuales destacan las siguientes: solo se requiere datos de presencia para su uso, muestra resultados confiables con un número limitados de datos, se emplean datos ambientales de tipo continuo y/o categórico, los resultados se muestran en formato de grafico (mapa) lo cual facilita su interpretación. Así mismo, dentro de las virtudes que posee el software es que permite apreciar la relevancia que tiene cada variable ambiental en la distribución de la especie mediante la prueba de Jacknife que genera(11,12). Por lo antes descrito, los modelos generados a partir de la implementación de MaxEnt han sido ampliamente utilizado para estimar el nicho climático de especies de flora y fauna(13,14). Así, este modelo se ha utilizado para identificar áreas con aptitud ambiental con potencial para la distribución del pasto banderita en México y Estados Unidos(15,16), lo cual se considera un requisito si se desea rehabilitar un ecosistema(17). No obstante, esta herramienta solo se ha utilizado a nivel especie y no para estimar áreas con aptitud ambiental de tipos genéticos que existen dentro de las especies, lo cual podría ayudar para hacer más eficientes los programas de restauración de ecosistemas. Por lo anterior, el objetivo fue evaluar la estructura genética del pasto banderita en el estado de Chihuahua, México, aplicando los modelos de MaxEnt a nivel de grupo genético e identificando las áreas con aptitud ambiental para los grupos genéticos resultantes para la especie. La toma de muestras se realizó en 51 poblaciones, distribuidas en 29 municipios del estado de Chihuahua, situado en el norte de México. Se encuentra dentro de las coordenadas geográficas de 32 y 25 latitud norte y -103 y -109 longitud oeste. Los sitios de muestreo se ubicaron en las eco-regiones árida y semiárida del Estado, con el objetivo de captar una mayor diversidad genética posible (Figura 1).

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Figura 1: Localización geográfica del material genético colectado, correspondiente a 51 poblaciones de pasto banderita (Bouteloua curtipendula), distribuidas en el estado de Chihuahua, México

La estructura genética del pasto banderita fue analizada mediante marcadores moleculares AFLP (Polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados). En cada sitio se colectaron hojas de plantas, las cuales fueron utilizadas para la extracción de ADN, proceso realizado con base en el método propuesto por Doyle & Doyle(18). El análisis AFLP se llevó a cabo mediante el método propuesto por Vos et al(19). El análisis AFLP comenzó con la digestión de 2 µl de ADN diluido por medio de las enzimas de restricción EcoRI y MseI. Posteriormente, los fragmentos de ADN digeridos fueron ligados con adaptadores para EcoRI y MseI. Después, se adhirió un nucleótido extra a los primers (EcoRI + A y MseI + A) para realizar la pre-amplificación. La amplificación selectiva se realizó mediante cuatro combinaciones de primers marcados con fluorescencia: MseI + CTG - EcoRI + AAG, MseI + CTG - EcoRI + ACT, MseI + CAG - EcoRI + AGG, MseI + CAG - EcoRI + AAC. La reacción en cadena de la polimerasa se realizó en un termo ciclador cycler (Verity Applied Biosystems 2720), con el siguiente programa: un ciclo de 94 °C por 30 s, 65 °C por 30 s, 72 °C por 1 min; 12 ciclos de 94 °C por 30 s, 65 °C por 30 s, 72 °C por 1 min; 23 ciclos de 94 °C por 30 s, 56 °C por 30 s, 72 °C por 1 min. Los productos de la amplificación selectiva (2 µl) se mezclaron con 8 µl de formamida y 1 µl de marcado Eco 700 GeneScan (Applied Biosystems). Finalmente, la separación de los fragmentos amplificados se hizo en el analizador de DNA LI-COR, cargando 0.8 µl de muestra por pozo. Se utilizaron oligos o primers, marcados con fluorescencia, a diferentes longitudes de onda (700 nm y 800 nm). Con el patrón de bandas obtenido del análisis AFLP, se formó una matriz binaria de presencia (1) o ausencia (0) de bandas.

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Para el análisis de la información, los datos binarios fueron sometidos a un análisis de estructura genética, con base en el algoritmo de agrupamiento Bayesiano, mediante el software STRUCTURE versión 2.3.4(20,21). El programa STRUCTURE se corrió 30 veces para cada K número de conglomerados genéticos y se analizó desde K=1 hasta K=10. En cada corrida se efectuaron 10,000 repeticiones de cadena de Markov-Monte Carlo (CMMC) y 100,000 periodos de rodaje (burn-in periods). Este análisis se realizó por medio de un modelo de mezcla y frecuencia de alelos correlacionados. Se consideró como número óptimo de K grupos al que obtuvo el valor mayor de la probabilidad posterior promedio (LK) y de ΔK, de acuerdo con los criterios propuestos por Evanno et al(22). Los valores de la probabilidad posterior promedio y ΔK se obtuvieron a través del sitio web Structure Harvester(23). La asociación entre las zonas climáticas del Estado y la distribución de las poblaciones integradas en los grupos genéticos se analizó mediante una prueba de independencia Ji-cuadrada (α=0.05). Los grupos conformados en el análisis de estructura genética fueron comparados mediante un análisis de varianza molecular (AMOVA)(24). Este análisis se llevó a cabo empleando el software GenAIEx versión 6(25). Con los estadísticos F (ΦST) obtenidos del AMOVA, se calculó el índice de flujo genético entre grupos, con la fórmula Nm= [0.25 (1- ΦST)/(ΦST)](26). Adicionalmente, los datos genéticos fueron analizados mediante el algoritmo de Monmonier, para detectar posibles barreras eco-geográficas que afecten el flujo genético entre poblaciones. Este análisis se realizó con ayuda del software Barrier versión 2.2(27), donde los valores de Bootstrap de cada barrera fueron calculados con 100 matrices de distancias del coeficiente Dice. El sofware GenAIEx versión 6(25) fue utilizado para obtener los estadísticos de diversidad, porcentaje de loci polimórficos, promedio de alelos por locus, número de alelos efectivos, índice de información de Shannon (I) y diversidad de Nei (He), para los grupos genéticos formados por el análisis STRUCTURE. Estos índices fueron estimados con base en el supuesto de que cada locus representa un par de alelos, cuando en una banda se encuentra presencia o ausencia de fragmento AFLP. Los estadísticos de diversidad para cada población se compararon mediante la prueba Wilcoxon con corrección Bonferroni (α=0.05). La aptitud ambiental de los grupos genéticos formados por el análisis STRUCTURE, fue determinada mediante el algoritmo de MaxEnt del software de MaxEnt 3.3.3(11). El modelo se corrió con las coordenadas de las poblaciones analizadas genéticamente, para cada grupo genético por separado. Del conjunto de datos, el 75 % se utilizó para probar los modelos, mientras que el 25 % de los datos restantes fueron utilizados para validar los modelos, utilizando la prueba de bootstrap, con 50 réplicas. Los modelos de aptitud ambiental generados fueron evaluados utilizando el análisis de la curva característica de operación del receptor (ROC, por sus siglas en inglés) y el área bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés). La puntuación del AUC es de utilidad para medir el rendimiento del modelo. Cuanto 834


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más alto sea el valor de AUC (más cerca de 1), mejor será el modelo para estimar probabilidad de presencia de la especie. Un total de 22 variables climáticas fueron utilizadas como predictoras para modelar la distribución potencial del pasto banderita. Se emplearon 19 variables bioclimáticas: temperatura promedio anual (Bio1), rango de temperatura promedio diurna (Bio2), oscilación térmica anual (Bio3), estacionalidad de la temperatura (Bio4), temperatura máxima del mes más caliente (Bio5), temperatura mínima del mes más frío (Bio6), rango de temperatura anual (Bio7), temperatura promedio del trimestre más húmedo (Bio8), temperatura promedio del trimestre más frío (Bio9), temperatura promedio del trimestre más caliente (Bio10), temperatura promedio del trimestre más frío (Bio11), precipitación anual (Bio12), precipitación del mes más húmedo (Bio13), precipitación del mes más seco (Bio14), estacionalidad de la precipitación (Bio15), precipitación del trimestre más húmedo (Bio16), precipitación del trimestre más seco (Bio17), precipitación del trimestre más caliente (Bio18) y precipitación del trimestre más frío (Bio19)(28). Adicionalmente se incluyó la radiación solar promedio anual (Rad), evapotranspiración promedio anual (Vapr) velocidad del viento promedio anual (Wind). Las variables que se utilizaron se obtuvieron de la base de datos WorldClim (https://www.worldclim.org) y se delimitaron al espacio geográfico del estado de Chihuahua con el software ArcMap 10.3. Los datos climáticos son estimaciones de interpolación del periodo 1950-2000, con una resolución espacial de 30 arco-segundos. El resultado de la aplicación de MaxEnt es un mapa logístico, que muestra la distribución potencial del pasto banderita con valores que van de 0 (inadecuado) a 1 (óptimo). El análisis de estructura genética (STRUCTURE) dividió a las poblaciones de pasto banderita en dos grupos genéticos, ya que K=2 obtuvo los valores más altos de ΔK y LK (Figura 2).

400 350 300 250 200 150 100 50 0

-5000 -4000

LK

ΔK

Figura 2: Valores de delta K (ΔK) y probabilidad posterior promedio (LK) para la estructura genética de 53 poblaciones de pasto banderita (Bouteloua curtipendula) de Chihuahua, México

-3000 -2000 -1000

0 0

2

4

6

8

10

0

K grupos

2

4

6

8

K grupos

Valores desde K=1 hasta K=10, donde se muestra a K=2 como número óptimo de grupos.

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10


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La divergencia genética de estos grupos parece haber sido generada por una adaptación a las condiciones climáticas del Estado, debido a que se encontró una alta asociación entre las ecoregiones del Estado y la formación de los grupos (Ji cuadrada= 32.9; P<0.0001). El 89 % de las poblaciones integradas al Grupo 1 se ubican en la región semiárida y el 11 % en la región árida. En contraste, el 90 % de las poblaciones del Grupo 2 se encuentran en la región árida y el 10 % en la región semiárida (Figura 3B). Estos resultados concuerdan con los obtenidos en el análisis BARRIER, el cual identificó barreras genéticas que coinciden con la frontera entre las regiones árida y semiárida (Figura 3C). Figura 3: Estructura genética de 53 poblaciones de pasto banderita (Bouteloua curtipendula), en el estado de Chihuahua, México

A) Análisis STRUCTURE con K= 2 realizado con base en 186 fragmentos AFLP, el color representa la proporción de la probabilidad de pertenecer a cada grupo genético. B) Estructura en contexto geográfico de cada zona climática del Estado. C) Barreras genéticas identificadas mediante análisis BARRIER, líneas amarillas representan las barreras y los números el valor de Bootstrap (1000 remuestreos). Gráficas circulares representa el porcentaje de poblaciones dentro de cada grupo, dentro de cada región.

Los grupos conformados por el análisis STRUTURE fueron significativamente (P<0.0001) diferentes, de acuerdo con el AMOVA. No obstante, las diferencias entre grupos solo explicaron el 7 % de la variación global, lo que indica que existe amplia variabilidad genética dentro de grupos. En pastos, es común que las diferencias entre grupos expliquen solamente una pequeña proporción de la variación total, ya que generalmente existe un alto flujo genético entre sus poblaciones(29,30). Por otra parte, la baja diferenciación genética entre poblaciones (7 %), revelada por AMOVA, parece contrastar con la marcada asociación entre las zonas climáticas del Estado y la formación de los grupos. No obstante, esto puede deberse a que un solo locus puede estar altamente relacionado con la adaptación a condiciones climáticas. Tso y Allan(7) encontraron una alta relación entre la frecuencia de un solo locus con la precipitación del trimestre más seco del año (R2=0.84) y con la estacionalidad de la precipitación (R2= 0.77), al estudiar poblaciones de Bouteloua gracilis.

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El intercambio genético encontrado entre grupos genéticos (Fst= 3.41) puede considerarse alto, en comparación con los resultados obtenidos en otras investigaciones. Durka et al(31), encontraron un flujo genético de 0.76 entre 30 poblaciones del pasto Stipa pulcherrima, distribuidas por diferentes países de Europa y Asia. Así mismo, Mitchell et al(29) encontraron un Fst de 0.02 entre 85 poblaciones australianas de Microlaena stipoides. Ambos estudios fueron realizados mediante marcadores AFLP. Los grupos formados por el análisis STRUCTURE mostraron diferencias significativas (P<0.05) en los parámetros de diversidad evaluados. El Grupo 2, que se distribuye principalmente en la región árida, obtuvo los valores más altos (P<0.05) en todos los parámetros de diversidad (Cuadro 1). Este resultado es consistente con Zhang et al(32), quienes encontraron que los niveles de diversidad genética de Festuca ovina son mayores en zonas áridas. Estos investigadores obtuvieron una correlación positiva entre el índice de diversidad genética de Nei y la temperatura media anual (r= 0.56) y una correlación negativa (r= -0.60) con la precipitación media anual. Resultados similares fueron también encontrados en Dactylis glomerata(33). Diversos estudios señalan que las poblaciones de plantas tienden a poseer mayor diversidad en ambientes adversos(34,35). Las poblaciones que se desarrollan en ambientes altamente áridos tienden a poseer mayor diversidad genética como mecanismo de adaptación a la sequía(36). Por otra parte, ambos grupos presentaron alto nivel de diversidad genética dentro de ellos, de acuerdo con el índice de información de Shannon (Grupo 1 = 0.302 y Grupo 2= 0.427). En comparación, Todd et al(37) evaluaron 56 accesiones de Panicum virgatum y obtuvieron un valor de I de 0.317. Así mismo, en 281 cultivares de Pennisetum purpureum encontraron valores de I de entre 0.12 y 0.34(38). Dado el amplio número de genotipos analizados en las investigaciones antes mencionadas, se puede considerar que la diversidad genética encontrada en este estudio fue alta para ambos grupos. Cuadro 1: Parámetros de diversidad de dos grupos genéticos de pasto banderita (Bouteloua curtipendula) del estado de Chihuahua, México Porcentaje de loci Promedio de alelos Número de alelos Grupo I He polimórficos por locus efectivos Grupo 1

59.1

1.56b

1.34b

0.302b 0.211b

Grupo 2

90.4

1.90a

1.43a

0.427a 0.280a

ab

Valores en una columna con la misma letra no son estadísticamente diferentes (P<0.05; Wilcoxon con corrección Bonferroni). I= índice de información de Shannon; He= diversidad genética de Nei.

El modelo de MaxEnt se alimentó con las coordenadas de 20 poblaciones para el Grupo 1 y 32 para el Grupo 2 de acuerdo a la división resultante del análisis STRUCTURE. Este modelo

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mostró que el nicho climático del Grupo 1 obtuvo un valor promedio de AUC de 0.91, con una desviación estándar de 0.031. El valor promedio de AUC del nicho climático del Grupo 2 fue de 0.93, con una desviación estándar de 0.015. Por esta razón, se puede considerar que la estimación de la aptitud ambiental de ambos grupos genéticos tiene un alto grado de confiabilidad(11,39). La Figura 4 muestra la aptitud ambiental de ambos grupos genéticos, donde se observa que el nicho climático de ambos grupos se diferencia claramente. El nicho climático del Grupo 1 se distribuye principalmente en el centro y sur del estado de Chihuahua (Figura 4A), mientras que el del Grupo 2 se localiza en el centro, oeste y noreste del Estado (Figura 4B). Estos resultados sugieren que los grupos genéticos divergieron por una adaptación evolutiva y que cada genotipo está adaptado a las condiciones climáticas de la región. En este sentido, los programas de restauración con pasto banderita deberían ser realizados con materiales locales de cada eco-región del estado de Chihuahua. Sin embargo, los programas de restauración de pastizales en México se han realizado con materiales extranjeros, debido principalmente a la baja disponibilidad de semilla. En el caso del pasto banderita, se han utilizado variedades provenientes de Estados Unidos. Por ejemplo, se ha utilizado la variedad “El Reno” del pasto banderita con resultados desfavorables debido a su baja adaptabilidad al clima de México. Respecto a esto, Morales et al(40) analizaron 277 genotipos de pasto banderita, colectados en diferentes estados de México, y encontraron que más de la mitad de ellos presentaron mejor potencial productivo que la variedad El Reno. Otros investigadores(4) encontraron que la variedad El Reno presenta baja capacidad de establecimiento y producción de forraje, en comparación con materiales nativos. Diversas investigaciones señalan que los programas de restauración se deben realizar con materiales locales, lo que garantiza una mayor probabilidad de éxito y además se preserva la estructura genética local(41,42). Esto concuerda con los resultados del presente estudio, los cuales proponen que los programas de revegetación con pasto banderita deben ser realizados con materiales de cada eco-región del estado de Chihuahua. La alta diversidad encontrada dentro de cada grupo genético sugiere la posibilidad de seleccionar genotipos sobresalientes para cada eco-región. En los últimos años se ha realizado un importante número de trabajos para seleccionar genotipos sobresalientes de pasto banderita(9,43). No obstante, estas investigaciones han dado poca importancia a las condiciones ambientales a las que están adaptados los diferentes genotipos y se han enfocado principalmente en características productivas. Por el contrario, los resultados de la presente investigación proveen información básica sobre la aptitud ambiental potencial de las poblaciones de pasto banderita en el estado de Chihuahua, la cual podría apoyar a los programas de selección de genotipos productivos.

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Figura 4: Mapas del modelo MaxEnt para dos grupos genéticos de pastos banderita (Bouteloua curtipendula) identificados mediante marcadores AFLP y análisis STRUCTURE

Grupo 1 (A) y Grupo 2 (B), donde el color rojo representa las área con mayor aptitud ambiental y el color azul menor aptitud.

Las variables de mayor contribución sobre el modelo de aptitud ambiental del Grupo 1 fueron estacionalidad de la precipitación (79.5 %) y precipitación del trimestre más frío (7.4 %). Por otra parte, el modelo de aptitud ambiental del Grupo 2 estuvo influenciado principalmente por la precipitación del trimestre más frío (36.2 %), oscilación térmica anual (13.2 %), radiación solar promedio anual (8.1 %) y temperatura media del trimestre más seco (7.4 %; Cuadro 2). Estos resultados concuerdan con investigaciones previas, realizadas para modelar el nicho climático del pasto banderita en México y Estados Unidos. Respecto a esto, Martínez et al(16) encontraron que la oscilación térmica y la precipitación fueron los descriptores ecológicos que más contribuyeron en la distribución potencial del pasto banderita en México. Así mismo, Martinson et al.(15) concluyeron que la temperatura media anual fue el factor más importante en la distribución potencial de este pasto en Estados Unidos. Para un analisis más detallado, las curvas de respuestas de las variables de mayor contribución se ilustran en la Figura 5. Acorde a estas curvas, el Grupo 1 presenta mayor probabilidad de desarrollarse en áreas con más de 120 del coeficiente de la estacionalidad de la precipitación y se desarolla mejor en zonas de entre 0 y 20 mm de precipitación en el trimestre más frío (diciembre, enero y febrero). Por otra parte, el Grupo 2 también se desarolla mejor en zonas con entre 0 y 20 mm de precipitación de trimestre más frío. Además, prefiere áreas con oscilación térmica anual de entre 49 y 53, radiación solar promedio anual de entre 18,500 y 19,000 w m-2 y temperatura media del trimestre más seco de 6 a 10 °C. Los 839


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resultados de las curvas de respuesta de los grupos genéticos sugieren que el Grupo 1 no resiste periodos amplios de sequía y necesita una precipitación dispersa durante los meses cálidos del año (junio-octubre). Por otra parte, el Grupo 2 puede resistir menor oscilación térmica, mayor temperatura y mayor radiación solar, pero necesita que la precipitación se concentre en los meses más cálidos. Lo anterior resalta las diferencias evolutivas de cada grupo genético y la importancia de utilizarlos en la eco-región de donde son originarios. Cuadro 2: Contribución relativa (%) de variables ambientales sobre el modelo de aptitud ambiental (MaxEnt) de dos grupos genéticos de pasto banderitia (Bouteloua curtipendula) Contribución Contribución ID Variable (%) para el (%) para el Grupo 1 Grupo 2 Wind

Velocidad del viento promedio anual

0.6

6.7

Rad

Radiación solar promedio anual

2.7

8.1

2.2

2

1.1

13.2

bio-2

bio-3

Rango de temperatura promedio diurna [media mensual (temperatura máxima – temperatura mínima)] Oscilación térmica anual (Rango de temperatura promedio diurna / Rango de temperatura anual) x (100)

bio-9

Temperatura media del trimestre más seco

1.8

7.4

bio-13

Precipitación en el mes más húmedo

0.1

4.3

bio-14

Precipitación en el mes más seco

0.3

4.3

bio-15

Estacionalidad de la precipitación (coeficiente de variación)

79.5

1.4

bio-17

Precipitación del trimestre más seco

0.2

5.3

bio-18

Precipitación del trimestre más caliente

0.8

3.4

bio-19

Precipitación del trimestre más frío

7.4

36.2

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Figura 5: Curva de respuesta de dos grupos genéticos de pasto banderita (Bouteloua curtipendula) de acuerdo a las variables de mayor influyencia sobre su aptitud ambietal

En conclusión, las poblaciones de pasto banderita del estado de Chihuahua están divididas en dos grupos genéticos. La distribución de estos grupos está altamente influenciada por las condiciones climáticas de las eco-regiones del Estado y cada grupo genético posee un nicho climático diferente. Se recomienda que los programas de restauración con pasto banderita se realicen con genotipos locales de cada eco-región del estado de Chihuahua y en áreas con aptitud ambiental. Así mismo, podrían utilizarse en áreas con condiciones edafoclimáticas similares a las de Chihuahua. La diversidad genética encontrada dentro de cada grupo genético representa una oportunidad para genotipos sobresalientes, los cuales puedan ser utilizados en programas de restauración de pastizales para cada eco-región. No obstante, es necesario realizar estudios que consideren proyecciones climatológicas, ya que se desconoce 841


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cómo puede afectar el cambio climático a los tipos genéticos de pasto banderita y sus repercusiones en futuros trabajos de restauración. Literatura citada: 1.

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Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias

Edición Bilingüe Bilingual Edition

Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 13 Núm. 3, pp. 584-845, JULIO-SEPTIEMBRE-2022

ISSN: 2448-6698

ARTÍCULOS

Pags.

Isolated Escherichia coli resistance genes in broiler chicken

Genes de resistencia a aislados de Escherichia coli en pollos de engorda Diana López-Velandia, Edna Carvajal-Barrera, Egberto Rueda-Garrido, Mar�n Talavera- Rojas, María Vásquez, María Torres-Caycedo ……………………………………………………………………........……………….....……584

Detección del virus de la lengua azul en ovinos por RT- PCR en tiempo real en diferentes sistemas de producción en San Martín, Perú

Detection of bluetongue virus in sheep by real-time RT-PCR in different production systems in SanMartín, Perú Alicia María López Flores, Roni David Cruz Vasquez, Víctor Humberto Puicón Niño de Guzmán, Alicia Bartra Reátegui, Orlando Ríos Ramírez, Fredy Fabián Domínguez…………………………….....……..............596

Detección del virus de la diarrea viral bovina en artiodáctilos silvestres en cautiverio en México

Detection of bovine viral diarrhea virus in captive wild artiodactyls in Mexico Jocelyn Medina-Gudiño, Ninnet Gómez-Romero, José Ramírez-Lezama, Luis Padilla-Noriega, Emilio Venegas-Cureño, Francisco Javier Basurto-Alcántara......……..…….....…….....……................……..…....…….612

Evaluación de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real acoplado a separación inmunomagnética (PCR TR -IMS) como método alternativo para la detección rutinaria de Salmonella spp. en carne de res en México

Evaluation of real-time polymerase chain reaction coupled to immunomagnetic separation (rtPCR-IMS) as an alternative method for the routine detection of Salmonella spp. in beef in Mexico Gloria Marisol Castañeda-Ruelas, José Roberto Guzmán-Uriarte, José Benigno Valdez-Torres, Josefina León-Félix……………………………………………….......……...................…….....…….....…….....…….....……...........625

Prevalence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and associated risk factors in dairies under mechanical milking parlor-systems in Antioquia, Colombia

Prevalencia de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y factores de riesgo asociados en Lecherías bajo sistemas de sala de ordeño mecánico en Antioquia, Colombia Nathalia M. Correa-Valencia, Nicolás F. Ramírez-Vásquez, Jorge A. Fernández-Silva…….................…...…............….…............….…............….…............….…............….…............….…............…..........……….……..….. 643

Effects of nutrition in the final third of gestation of beef cows on progeny development

Efecto de la nutrición en el último tercio de la gestación de vacas de carne sobre el desarrollo de la progenie John Lenon Klein, Sander Mar�nho Adams, Amanda Farias de Moura, Daniele Borchate, Dari Celes�no Alves Filho, Dieison Pansiera Antunes, Fabiana Moro Maidana, Gilmar dos Santos Cardoso, Ivan Luiz Brondani, Ricardo Gonçalves Gindri………………...........……..............…….....…….....…….....…….....…….....……..........…..658

Establishment of tropical forage grasses in the Cerrado biome

Establecimiento de gramíneas forrajeras tropicales en el bioma del Cerrado Antonio Leandro Chaves Gurgel, Gelson dos Santos Difante, Carolina Marques Costa, João VirgínioEmerenciano Neto, Gustavo Henrique Tonhão, Luís Carlos Vinhas Ítavo, Alexandre Menezes Dias,Iuri Mesquita Moraes Vilela, Vivian Garcia de Oliveira, Pâmella Cris�na da Silva Lima, Andrey William Alce Miyake……………...................................…......674

Efectividad del clorhidrato de zilpaterol en la finalización de corderos: Patente vs. Genérico

Effectiveness of zilpaterol hydrochloride in lamb finishing: Patent vs. Generic Arnulfo Vicente Pérez, Leonel Avendaño-Reyes, Juan E. Guerra-Liera, Rubén Barajas Cruz, Ricardo Vicente-Pérez, M. Ángeles López-Baca, Miguel A. Gastelum Delgado, Alfonso J. Chay-Canul, Ulises Macías-Cruz..…….....…….....…….....…….....…….....…….....…….....…….....…….....…….....…....….....……...……..…..690

Forage availability in Xaraés grass pastures subjected to nitrogen sources of the slow and fast release

Disponibilidad de forraje en praderas de pasto Xaraés en respuesta a fuentes de nitrógeno convencionales y tratadas con N-(n-butil) triamida tiofosfórica (NBPT) Luís Henrique Almeida Matos, Carlindo Santos Rodrigues, Douglas dos Santos Pina, Vagner Maximino Leite, Paula Aguiar Silva, Taiala Cris�na de Jesus Pereira, Gleidson Giordano Pinto Carvalho………………………………………..…….....…….....…….....……....…….....…….....…….....…….......….…………..............................……….706

REVISIONES DE LITERATURA Diagnóstico, prevención y control de enfermedades causadas por Chlamydia en pequeños rumiantes. Revisión

Diagnosis, prevention and control of diseases caused by Chlamydia in small ruminants. Review Fernando De Jesús Aldama, Roberto Montes de Oca Jiménez, Jorge Antonio Varela Guerrero……………….…………………………………………………………………………………………….....……..........…….....……...........…......725

Comportamiento de ingestión y consumo de forraje por vacas en pastoreo en clima templado. Revisión

Ingestion behavior and forage intake by grazing cows in temperate climate. Review Juan Daniel Jiménez Rosales, Ricardo Daniel Améndola Massio� ……………………………………...………….....…….....…….....…….......….....…….......….....…….......….....…….......….....…….......….....….....….....…….....……...743

La citometría de flujo, un universo de posibilidades en el ámbito veterinario. Revisión

Flow cytometry, a universe of possibilities in the veterinary field. Review Luvia Enid Sánchez-Torres, Alejandra Espinosa-Bonilla, Fernando Diosdado-Vargas…….. ……..………..……….....…….....…….....…….....…................….....…….....…….....…….....…….....…….....…….....…….....…….........…763

Presencia de alcaloides pirrolizidínicos en miel y los efectos de su consumo en humanos y abejas. Revisión

Presence of pyrrolizidine alkaloids in honey and the effects of their consumption on humans and honeybees. Review Laura Yavarik Alvarado-Avila, Yolanda Beatriz Moguel-Ordóñez, Claudia García-Figueroa, Francisco Javier Ramírez-Ramírez, Miguel Enrique Arechavaleta-Velasco…………………………………….........………......787

Efectos de los fitoestrógenos en la fisiología reproductiva de especies productivas. Revisión

Effects of phytoestrogens on the reproductive physiology of productive species. Review Miguel Morales Ramírez, Dinorah Vargas Estrada, Iván Juárez Rodríguez, Juan José Pérez-Rivero, Alonso Sierra Reséndiz, Héctor Fabián Flores González, José Luis Cerbón Gu�érrez, Sheila Irais Peña-Corona………………………………………………………..………………..………………..………………..………………..………………..………...……....…..……803

NOTAS DE INVESTIGACIÓN Estructura genética y aptitud ambiental de poblaciones de pasto banderita [Bouteloua curtipendula (Michx.) Torr.] en Chihuahua, México

Genetic structure and environmental aptitude of sideoats grama [Bouteloua curtipendula (Michx.) Torr.] populations in Chihuahua, Mexico Alan Álvarez-Holguín, Carlos Raúl Morales-Nieto, Raúl Corrales-Lerma, Jesús Alejandro Prieto- Amparán, Ireyli Zuluami Iracheta-Lara, Nathalie Socorro Hernández-Quiroz…….........................…………..…..830

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