técnica histológica torias (3,4). Para estos y otros solventes deberían ser consultadas las recomendaciones del Material Safety Data Sheet (MSDS) sobre agentes químicos de laboratorio (http://www. proscitech.com/). La Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR/EPA, http://www.atsdr.cdc.gov/cxcx3. html) publicó recientemente una lista de agentes químicos con toxicidad conocida o sospechada. Entre 275 compuestos evaluados en orden de efecto tóxico creciente, el xileno y el cloroformo ocuparon las posiciones 11 y 48, respectivamente, lo cual señala un potencial importante de provocar daños a la salud. En los últimos años, se ha introducido el uso de algunos sustitutos como agentes aclarantes y desparafinantes para el procesado en parafina de los tejidos. Maxwell (5) sugirió primeramente el empleo del tricloroetano como un solvente aclarante y este agente es ahora aplicado de forma creciente (6). Aunque el tricloroetano no es inflamable, su uso requiere una ventilación adecuada (7). Otros sustitutos propuestos para el xileno fueron aceites vegetales (8), butildecanoato (9), isopropanol (10), mezclas de isopropanol-aceite mineral (11) y éster metílico del propilenglicol (12). También se han descrito protocolos desparafinantes utilizando octano (13,14) y mezclas de agua-detergente (15). Aunque sin especificar su estructura química precisa, la isoparafina-H (Panreac, Barcelona) se comercializa ahora como un sustituto del xileno. El n-heptano es un constituyente conocido de la gasolina (un mezcla de hidrocarburos de C4 a C12) y es usado como estándar para la comprobación del autoencendido/octanaje en los motores de combustión interna (16). El n-heptano es un solvente inerte y no fluorescente y, tal como se desprende de este trabajo, puede ser empleado como un sustituto muy adecuado del xileno y de otros solventes usados para la inclusión de tejidos en parafina.
Material y métodos Se fijaron muestras de tejidos de ratas Wistar (glándulas salivales, lengua, esófago, estómago, intestino delgado y grueso, hígado, riñón, pulmón), ya sea por perfusión o por inmersión, con formaldehído 3,7% en solución salina tamponada de fosfato (pH 6,8). Igualmente se utilizaron tejidos fijados en líquido de Bouin a temperatura ambiente. Después de una primera fijación de 30 minutos, las muestras fueron cortadas en pequeñas piezas y dejadas en fijador nuevo durante 24 horas. Las piezas se lavaron 24 horas en agua corriente y se deshidrataron en grados crecientes de etanol (30, 50, 70, 96 y 100%) durante una hora en cada etapa. El aclaramiento se realizó mediante un cambio en n-heptano (Scharlau Chemie, Sentmenat, España, pureza: 99%) de 10
técnicas de LABORATORIO
Figura 1. Fotomicrografías de campo claro de cortes de parafina de riñón de rata. La muestra fue fijada por perfusión, procesada mediante n-heptano y teñida mediante hematoxilina-eosina. A: Región de la médula renal a baja magnificación. B: Detalle de un glomérulo renal.
minutos como máximo, cuidando que las piezas permanecieran siempre en el fondo. El material fue colocado en una mezcla de parafina/n-heptano (1:1, v/v) a 56 °C durante 1 hora, e incluido en parafina a 56 °C durante 24 horas. Con propósitos comparativos, muestras de los mismos tejidos se aclararon en xileno y se incluyeron en parafina como de costumbre. Las secciones fueron obtenidas con un microtomo Microm HM 355 S-2 (Walldorf, Alemania), desparafinadas con n-heptano durante 15 minutos e hidratadas en etanol (100, 96 y 70%, 10 minutos en cada etapa) hasta quedar en agua destilada. La tinción de las secciones se realizó con hematoxilina-eosina o tricrómico de Masson como técnicas de rutina, montándose en DePeX. El examen microscópico se llevó a cabo en un microscopio Olympus BX 61TF (Tokio, Japón) equipado con cámara digital Olympus DP50-CU. Las fotomicrografías fueron procesadas usando el programa Adobe Photoshop 8.0 (Adobe Systems, San Jose, CA).
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Nº 367 DICIEMBRE 2011