1.2.
1.3.
1.4.
2.1.
2.2.
2.2.1.
2.4.1.
2.4.4.
2.5.1.
2.5.2.
2.5.5.
2.6. Sposoby prowadzenia procesu chromatograficznego w kolumnowej chromatografii cieczowej ......................................................................
2.6.1. Chromatografia w normalnym i odwróconym układzie faz ......................
2.6.2. Mechanizm retencji w normalnym układzie faz
2.6.3. Mechanizm retencji w odwróconym układzie faz
2.6.4. Elucja izokratyczna i elucja gradientowa ......................................
2.7. Rozdzielczość kolumn chromatograficznych
2.7.1. Parametry wpływające na proces rozdzielania ................................
2.7.2. Pojęcie półki teoretycznej ..................................................
2.7.3. Rozdzielczość kolumny w funkcji parametrów charakteryzujących selektywność i sprawność rozdzielania ...................................................
2.7.4. Wpływ temperatury na rozdzielanie chromatografowanych substancji ............
2.8. Techniki kolumnowej chromatografii cieczowej
2.8.1. Chromatografia jonowa
2.8.2. Chromatografia wykluczania
2.8.3.
2.8.4. Chromatografia micelarna i mikroemulsyjna
2.8.5. Chromatografia
2.8.6.
2.8.8.
2.9.2.
2.9.3. Charakterystyka detektorów używanych w kolumnowej chromatografii cieczowej
2.9.4. Detektor fotometryczny absorpcji w świetle widzialnym i nadfiolecie (UV-VIS)
2.9.6. Detektor refraktometryczny
2.9.7.
2.9.8.
2.9.9.
2.12.
2.11.6.
2.13. Techniki wielowymiarowe w chromatografii cieczowej kolumnowej .....................
2.13.1. Chromatografia dwuwymiarowa ............................................
2.13.2. Tandemowa chromatografia cieczowa kolumnowa ............................
2.14. Chromatografia cieczowa kolumnowa łączona z innymi technikami analitycznymi ........
2.14.1. Połączenie chromatografu cieczowego ze spektrometrią mas wysokiej rozdzielczości ............................................................
2.14.2. Chromatografia cieczowa łączona z magnetycznym rezonansem jądrowym .......
2.15. Szczególne zastosowania kolumnowej chromatografii cieczowej .......................
2.15.1. Biochromatografia ........................................................
2.15.2. Chromatografia związków chiralnych ........................................
2.15.3. Szybka chromatografia preparatywna
3. Chromatografia cienkowarstwowa .................................................
3.1. Wprowadzenie ..................................................................
3.1.1. Historia TLC – ważniejsze etapy rozwoju
3.2. Analiza za pomocą chromatografii planarnej ........................................
3.3. Płytki do chromatografii cienkowarstwowej
3.3.1. Samodzielna preparatyka płytek chromatograficznych
3.4. Fazy stacjonarne
3.5. Eluenty (fazy ruchome)
3.6. Nanoszenie próbek na płytki chromatograficzne
3.7. Sposoby
3.7.2. Rozwijanie odśrodkowe (cyrkularne)
3.7.3. Rozwijanie dośrodkowe (antycyrkulacyjne)
3.7.4. Mechanizm rozwijania chromatogramów
3.7.5. Rozwijanie jednokrotne i wielokrotne
3.8. Komory do chromatografii cienkowarstwowej
3.9. Chromatografia cienkowarstwowa z wymuszonym przepływem
3.9.1. Rotacyjna chromatografia planarna
3.9.2. Ciśnieniowa chromatografia cienkowarstwowa
3.9.3. Elektrochromatografia planarna
3.10. Detekcja i dokumentacja chromatogramów
3.10.1.
3.10.2. Chemiczne metody detekcji
3.10.3. Biologiczne metody detekcji
3.11. Sprzężenie TLC ze spektralnymi metodami detekcji
3.11.1. Sprzężenie TLC z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym i/lub detektorem płomieniowo-fotometrycznym (TLC-FID/TLC-(FID-FPD))
3.11.2. Sprzężenie TLC z MS
3.12. Chromatogramy planarne ........................................................
3.12.1. Analiza jakościowa
3.12.2. Analiza ilościowa
3.13. Normalizacja w TLC
4.
4.1. Znaczenie i zasady przygotowania próbek do analizy
4.2. Przygotowanie próbek ciekłych ....................................................
4.2.1. Ekstrakcja ciecz–ciecz .....................................................
4.2.2. Ekstrakcja do ciała stałego
4.2.3. Mikroekstrakcja do fazy upakowanej
4.2.4. Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej ........................................
4.2.5. Mikroekstracja do kropli rozpuszczalnika
4.2.6. Ekstrakcja ruchomym elementem sorpcyjnym
4.2.7. Destylacja
4.3. Przygotowanie próbek stałych
4.3.1. Ekstrakcja rozpuszczalnikami
4.3.2. Ekstrakcja rozpuszczalnikami pod zwiększonym ciśnieniem
4.3.3. Ekstrakcja nadkrytyczna
4.3.4. QuEChERS
4.4. Derywatyzacja
4.5. Przygotowanie próbek biologicznych do analizy
4.5.1. Przygotowanie próbek do analizy kwasów nukleinowych w genomice
4.5.2. Przygotowanie próbek do analizy białek w proteomice
4.5.3. Przygotowanie próbek do analizy leków i ich metabolitów oraz biomarkerów w organizmach żywych ....................................................
Waalsa. W tym przypadku siła elucji wzrasta ze wzrostem rozmiarów niepolarnych fragmentów cząsteczek rozpuszczalników. Miarą mocy elucyjnej rozpuszczalników, czyli ich zdolności wymywania substancji chromatografowanych z kolumny chromatograficznej, są indeksy polarności rozpuszczalników.
Aby ułatwić wybór właściwego rozpuszczalnika jako eluentu chromatograficznego, w tabeli 2.1 rozpuszczalniki umieszczono w kolejności ich zmieniających się właściwości wpływających na siłę elucji, tworząc szereg eluotropowy. W przypadku polarnych faz stacjonarnych rozpuszczalniki w szeregu eluotropowym ułożono według rosnącej siły eluowania.
TABELA 2.1. Szereg eluotropowy rozpuszczalników, z wartościami ich siły elucji (E0), gdy fazą stacjonarną jest żel krzemionkowy
Rozpuszczalnik
E0
Miesza się z wodąPolarność
izooktan0,01nie tetrachlorek węgla0,11nie
chloroform0,26nie
chlorek metylu0,32nie
tetrahydrofuran0,35tak
eter etylowy0,38nie
octan etylu0,38słabo
aceton0,47tak
dioksan-1,40,49tak
acetonitryl0,50tak
izopropanol0,63tak
metanol0,73tak
woda> 0,73tak
kwas octowy> 0,73tak
n-heksan0,00nie niepolarny polarny
Na niepolarnej fazie stacjonarnej (np. związanej oktadecylowej) siła elucji przy chromatografowaniu rośnie w kierunku odwrotnym – jej wzrost można zaobserwować w szeregu: woda, metanol, etanol, aceton, propanol, eter dietylowy, butanol, octan etylu, n-heksan i benzen. W tabeli 2.1 przedstawiono przykład szeregu eluotropowego, w którym dla polarnej fazy stacjonarnej siła elucji wzrasta ze wzrostem polarności rozpuszczalnika.
Oprócz polarności ważną cechą rozpuszczalników (eluentów) jest ich lepkość. Ma ona wpływ na wysokość ciśnienia wymaganego do wywołania potrzebnego przepływu fazy ruchomej przez kolumnę. Ciśnienie to jest liniową funkcją lepkości,
CHROMATOGRAFIA
a więc należy, jeżeli to możliwe, przy podobnej polarności stosować eluenty mało lepkie. Sprzyja to otrzymywaniu rozdzielonych składników mieszaniny w krótkim czasie, przy niskich ciśnieniach fazy ruchomej w kolumnie.
Wybierając rozpuszczalnik, który ma być fazą ruchomą, należy uwzględnić rodzaj detektora, w który został wyposażony chromatograf, ponieważ pewne właściwości fizykochemiczne rozpuszczalnika mogą wpływać na jego działanie. W przypadku detektora refraktometrycznego jest to współczynnik załamania światła, a w przypadku detektora absorpcji światła nadfioletowego granica, przy której rozpuszczalnik staje się „nieprzezroczysty” dla nadfioletu i zaczyna absorbować światło o określonej długości fali.
Im większa różnica między współczynnikami załamania światła rozpuszczalnika i substancji chromatografowanej, tym lepsza wykrywalność detektora refraktometrycznego. W przypadku detektora absorpcji nadfioletu bardziej przydatne są rozpuszczalniki z małą wartością granicy nieprzezroczystości, ponieważ można ich używać jako eluentów w szerszym zakresie nadfioletu, dzięki czemu wzrasta szansa na wykrycie większej liczby chromatografowanych substancji.
W tabeli 2.2 zebrano podstawowe właściwości niektórych rozpuszczalników stosowanych jako fazy ruchome w chromatografii cieczowej. Gdy fazą ruchomą ma być mieszanina rozpuszczalników, należy wybierać takie, które mieszają się ze sobą w sposób nieograniczony. Ich wybór ułatwia diagram mieszalności przedstawiony na rycinie 2.7.
TABELA 2.2. Właściwości niektórych rozpuszczalników stosowanych jako fazy ruchome w chromatografii cieczowej
Rozpuszczalnik
Gęstość [g/cm 3 ] Lepkość w temperaturze 20°C [cP]
Siła elucji Współczynnik załamania światła Graniczna długość pochłanianej fali UV [nm] n-pentan0,6290,230,001,358205 n-heksan0,6590,330,011,375195 cykloheksan0,7791,000,041,427205 cyklopentan0,7400,470,051,406210 1-penten0,6400,240,081,371215 dwusiarczek węgla1,2600,370,151,626380 tetrachlorek węgla1,5900,970,181,466265 m-ksylen0,8640,620,261,500290 eter n-dipropylowy0,7470,370,281,368220 2-chloropropan0,8620,330,291,378225 toluen0,8670,590,291,496285
Fazy ruchome
Podczas sporządzania wykresu kalibracyjngo należy przestrzegać następujących zasad: – wykres kalibracyjny powinien obejmować zakres stężeń analitów w próbkach rzeczywistych, – roztwory kalibracyjne należy dozować do kolumny przynajmniej dwukrotnie, – punkty do sporządzenia wykresu kalibracyjnego powinny być rozmieszczone równomiernie w badanym zakresie stężeń.
Wykres kalibracyjny można przedstawić w postaci równania prostej. Charakteryzując go, należy podać wartości: zakresu liniowości, współczynnika korelacji liniowej, współczynnika liniowości lub wariancji R2. W idealnym przypadku wykres wzorcowy powinien przebiegać przez początek układu współrzędnych.
2.11.6.
Proteomika ilościowa
Postęp instrumentalny w zakresie wysokosprawnej chromatografii cieczowej oraz spektrometrii mas umożliwił przeprowadzenie jednoczesnej identyfikacji białek obecnych w komórkach organizmów żywych i ich oznaczenie ilościowe. Badania takie są przedmiotem ważnej i szybko rozwijającej się dziedziny nauki, jaką jest proteomika. Ilościowe analizy proteomiczne umożliwiają monitorowanie zmian zawartości poszczególnych białek w wyniku różnych stanów chorobowych i/lub w odpowiedzi na stosowanie leków farmakologicznych. Pozwala to lepiej zrozumieć rolę białek w funkcjonowaniu organizmu i odkrywaniu białkowych markerów chorób.
W proteomice porównawczej, mającej na celu określenie wyłącznie zmian zawartości poszczególnych białek w próbce badanej względem kontrolnej, na przykład w organizmie zdrowym i chorym, nie ma potrzeby określania ich stężenia. W przypadku wyizolowania białek, których zawartość w próbce badanej w znaczący sposób maleje lub wzrasta w stosunku do próbki kontrolnej, konieczne są badania umożliwiające wyznaczenie stężenia konkretnego białka.
Ilościowe oznaczenia proteomiczne z wykorzystaniem układu LC-MS przeprowadza się w dwojaki sposób: – modyfikuje się białka znacznikami zawierającymi atomy stabilnych ciężkich izotopów, – wprowadza się do próbki wzorcowej wzorzec wewnętrzny oznaczanego białka, o znanym stężeniu i zawierający w swojej strukturze najcięższy izotop danego pierwiastka (jest to istota metody rozcieńczenia izotopowego).
Sposób pierwszy wykorzystywany jest w proteomice porównawczej. Do jednej próbki, na przykład porównawczej, na etapie wzrostu komórek (in vivo) lub po wyizolowaniu białek z materiału biologicznego (in vitro), wprowadza się atomy cięższego izotopu, a do drugiej atomy lżejszego izotopu tego samego pierwiastka. W wyniku analizy MS obu próbek otrzy muje się widma mas, które różnią się
wartością m/z, odpowiadającą różnicy mas cząsteczkowych znaczników izotopowych. Porównanie intensywności obu widm umożliwia ustalenie względnej zawartości poszczególnych białek w obu próbkach. W handlu dostępnych jest kilka odczynników do znakowania izotopowego, a samo oznaczenie jest względnie proste.
Drugi sposób, czyli metoda rozcieńczenia izotopowego, polega na dodaniu do próbki zawierającej oznaczane białko tego samego białka o znanym stężeniu, ale zawierającego w swojej strukturze izotop (np. 15N). Pozwala to obliczyć stężenie białka w próbce na podstawie wcześniej sporządzonego wykresu kalibracyjnego. Metodę rozcieńczenia izotopowego stosuje się do oznaczenia zarówno białek natywnych (o konformacji, w jakiej występują i funkcjonują w organizmie), jak i peptydów powstałych w wyniku trawienia enzymatycznego danego białka.
2.12.
Szybka chromatografia cieczowa kolumnowa
O szybkości procesu chromatografowania decydują w kolumnowej chromatografii cieczowej długość i średnica kolumny, rodzaj fazy stacjonarnej i fazy ruchomej, natężenie przepływu strumienia fazy ruchomej i jej temperatura. W szybkiej chromatografii ważne są także parametry techniczne chromatografu i dozownika oraz systemu zbierania danych. Czynniki te powinny być tak dobrane, aby przy możliwie jak najkrótszym czasie rozdzielania składników mieszaniny ich rozdzielenie było jak najlepsze. Jakość rozdzielenia składników mieszaniny zależy od selektywności kolumny, której miarą jest współczynnik retencji lub współczynnik rozdzielenia i sprawności kolumny, wyrażanej liczbą półek teoretycznych. Sprawność kolumny zależy od wielkości cząstek jej wypełnienia i ich jednorodności, wielkości powierzchni właściwej, rozmiaru porów, lepkości i szybkości przepływu fazy ruchomej oraz od temperatury.
Na sprawność kolumny chromatograficznej w dużym stopniu wpływa wielkość cząstek fazy stacjonarnej. Im są one mniejsze, tym większa sprawność. Z klasycznego wykresu równania van Deemtera wynika, że kolumna może osiągnąć wysoką sprawność przy optymalnej, względnie małej liniowej prędkości przepływu fazy ruchomej. Owszem, było to słuszne, gdy w HPLC stosowano wypełnienia o średnicach cząstek powyżej 3 μm. Jednak zastosowanie wypełnień kolumnowych, których cząstki o średnicy 1,7 μm i mniejszych są bardzo jednorodne, sprawiło, że przebieg wykresu van Deemtera znacznie różni się od jego przebiegu dla cząstek większych (ryc. 2.62). Zastosowanie cząstek o średnicy 1,7 μm pozwala uzyskiwać około trzykrotnie większą sprawność kolumny niż zastosowanie cząstek o średnicy 5 μm i dwukrotnie większą niż w przypadku cząstek o średnicy 3,5 μm. Daje to wyższą rozdzielczość pików składników rozdzielanych mieszanin odpowiednio o 70 i o 40%. Obecnie dostępne są fazy stacjonarne, których cząstki mają jeszcze mniejsze średnice, na przykład 1,5 μm.
2.12. Szybka chromatografia cieczowa kolumnowa
one szybko przechodzić przez detektor, aby nie powodować poszerzania się pików).
W związku z tym detektory w HPLC powinny mieć stałą czasową mniejszą niż 0,3 s. Parametr ten jest szczególnie istotny w ultraszybkiej wysokosprawnej chromatografii cieczowej, w której istnieje możliwość rozdzielania mieszanin zawierających kilkadziesiąt związków w czasie krótszym od 1 minuty.
W przypadku pracy z detektorami selektywnymi i specyficznymi uwzględnia się ich selektywność. Współczynnik selektywności wyraża się stosunkiem sygnału pochodzącego od heteroatomu do sygnału pochodzącego od węgla.
W trakcie analizy detektor musi mieć określoną stałą temperaturę, zatem należy go termostatować. Zmiany temperatury mogą prowadzić do dryftu linii zerowej. Do znacznych jej fluktuacji mogą przyczyniać się również zmiany składu fazy ruchomej (co stanowi duży problem w przypadku elucji gradientowej). Przy zmianach ciśnienia i prędkości przepływu fazy ruchomej mogą pojawiać się szumy linii zerowej.
Rolę detektora chromatograficznego może pełnić także urządzenie, które samo w sobie jest przyrządem analitycznym (np. spektrometr). Detektory w postaci spektrometrów, ze względu na specyfikę ich połączeń z chromatografami, opisano oddzielnie (rozdz. 2.14).
2.9.3.
Charakterystyka detektorów używanych w kolumnowej chromatografii cieczowej
Jak dotychczas chromatografia cieczowa nie doczekała się detektora tak uniwersalnego i wygodnego w użyciu, jak cieplno-przewodnościowy czy płomieniowo-jonizacyjny w chromatografii gazowejRodzaj eluentu ma w wielu przypadkach decydujące znaczenie w procesie detekcji, warunkuje bowiem możliwość wykrywania analitów oraz wartość wykrywalności. Użytkując na przykład detektor absorpcji nadfioletu, należy zwracać uwagę na graniczną długość fali UV pochłanianej przez rozpuszczalnik stosowany jako eluent (tab. 2.2).
Najczęściej wykorzystywanymi w kolumnowej chromatografii cieczowej detektorami są: spektrofotometryczny UV-VIS, fluorescencyjny, spektrometr mas, rzadziej elektrochemiczny i światła rozproszonego. Niezależnie od rodzaju detektora i właściwości wykrywanej przez niego substancji opuszczającej kolumnę po rozdzieleniu mieszaniny, w której skład wchodziła, substancja ta, rozpuszczona w fazie ruchomej, przepływa przez komórkę pomiarową. Pojemność takiej komórki jest bardzo mała, aby uniknąć niepożądanego rozmycia (poszerzenia) pasma chromatograficznego (a w konsekwencji także piku), i wynosi , μl, odpowiednio do warunków współpracy z różnymi rodzajami kolumn chromatograficznych. Do wykrywania bardzo małych ilości analitów stosuje się mikrodetektory (np. spektrometry optyczne), w których komórki przepływowe są pustą częścią kolumny
kapilarnej (ryc. 2.52). W mikrochromatografii cieczowej przydatne są detektory elektrochemiczne. Są one selektywne, działają dobrze w postaci zminiaturyzowanej i pozwalają uzyskiwać dobrą (nawet na poziomie femtomoli) wykrywalność niektórych związków chemicznych.
RYC. 2.52. Bezpośrednia detekcja w kwarcowej kolumnie kapilarnej
Ze względu na to, że niektóre związki chemiczne mogą pozostać niewykrywane przez ogólnie dostępne detektory, przeprowadza się je w możliwe do wykrycia pochodne, zwykle w reaktorze umieszczonym między kolumną a detektorem. Do reaktora, za pomocą pompy, podaje się odczynnik, który reagując z chromatografowaną substancją, tworzy jej pochodną mającą zdolność, na przykład, fluorescencji lub sorbowania światła nadfioletowego.
Otrzymywanie pochodnych przed wprowadzeniem chromatografowanych substancji do kolumny ma niewielkie znaczenie praktyczne. Należy bowiem uwzględnić, że niektóre składniki mieszaniny mogą nie tworzyć pochodnych, a chromatografowaniu będzie podlegać próbka różniąca się od pierwotnej.
Nie wszystkie z opisanych tutaj detektorów wchodzą w skład standardowego wyposażenia powszechnie dostępnych w handlu chromatografów cieczowych. Niektóre z nich są dostarczane na zamówienie lub montowane w przyrządach przeznaczonych do specjalnych celów.
Nazwy detektorów są często oznaczane, również w języku polskim, akronimami ich pełnych nazw angielskich.
Detektory