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Neuza Maria Brunoro Costa Nutricionista. Professora-Associada do Departamento de Nutrição e Saúde (DNS) da Universidade Federal do Espírito Santo (UFES). Pós-Doutorado em Biodisponibilidade de Minerais pela Purdue University, pela Colorado University e pela University of Illinois at Urbana-Champaign, EUA. Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela University of Reading, Inglaterra. Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

A ética na utilização de animais de laboratório como agente biológico.

Maria do Carmo Gouveia Peluzio Nutricionista. Professora-Associada do Departamento de Nutrição e Saúde (DNS) da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutora em Ciências pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), MG. Mestre em Agroquímica pela UFV, MG.

Os animais experimentais na pesquisa em Nutrição – diferentes modelos animais (modificados geneticamente e induzidos por dietas, fármacos e cirurgia) que constituem o “meio biológico” no qual ocorrem as reações fisiológicas e metabólicas. O uso correto de uma alimentação segura que atenda às necessidades nutricionais do animal. A importância do conhecimento do tempo médio da vida homeostática das diferentes substâncias e como elas podem ser rastreadas no organismo, devido à existência de marcadores. Os métodos in vitro e in vivo químicos, enzimáticos e biológicos, baseando-se no ganho de peso e no incremento de nitrogênio, bem como em todos os fatores que contribuem e interferem nessa utilização.

Hércia Stampini Duarte Martino Nutricionista. Professora-Associada do Departamento de Nutrição e Saúde (DNS) da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Pós-Doutorado em Fitoquímica, Bioquímica e Biologia Celular pela Texas A&M University, EUA.

Alimentos Funcionais – Componentes Bioativos e Efeitos Fisiológicos Neuza Maria Brunoro Costa / Carla de Oliveira Barbosa Rosa Biotecnologia em Saúde e Nutrição: Como o DNA Pode Enriquecer os Alimentos, 2a ed. Neuza Maria Brunoro Costa / Aluízio Borém

Nutrição ExperimentaL T e o r i a

e

P r á t i c a

Neuza Maria Brunoro Costa | Maria do Carmo Gouveia Peluzio Hércia Stampini Duarte Martino | Gilberto Simeone Henriques

Áreas de interesse Nutrição Ciências dos Alimentos

Neuza Maria B. Costa | Maria do Carmo G. Peluzio Hércia Stampini D. Martino | Gilberto S. Henriques

Gilberto Simeone Henriques Nutricionista. Professor Adjunto da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Doutor e Mestre em Ciências dos Alimentos pela Universidade de São Paulo (USP).

Te o r i a e P r á t i c a

Nutrição Experimental – Teoria e Prática faz um apanhado de todo o conhecimento importante para quem deseja trabalhar com Nutrição Experimental. Abordam-se, por exemplo:

Nutrição ExperimentaL

Organizadores

Outros títulos de interesse

Instrumentos de Apoio para Implantação das Boas Práticas em Empresas Alimentícias Ana Lúcia de Freitas Saccol / Lize Stangarlin / Luisa Helena Hecktheuer Instrumentos de Apoio para Implantação das Boas Práticas em Serviços de Nutrição e Dietética Hospitalar Lize Stangarlin / Ana Lúcia Serafim / Ana Lúcia de Freitas Saccol / Luisa Helena Hecktheuer Instrumentos para Diagnóstico das Boas Práticas de Manipulação em Serviços de Alimentação Lize Stangarlin / Ana Lúcia Serafim / Laissa Benites Medeiros / Ana Lúcia de Freitas Saccol Manual de BPF, POPs e Registros em Estabelecimentos Alimentícios – Guia Técnico para Elaboração Clever Jucene Manual de Segurança Alimentar – Boas Práticas para os Serviços de Alimentação, 2a ed. Clever Jucene Plano APPCC em Estabelecimentos Alimentícios – Guia Técnico para Elaboração Clever Jucene Prebióticos e Probióticos – Atualização e Prospecção Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira Tabela de Equivalentes, Medidas Caseiras e Composição Química dos Alimentos, 2a ed. Manuela Pacheco Unidades Produtoras de Refeições – Uma Visão Prática Carla de Oliveira Barbosa Rosa / Márcia Regina Pereira Monteiro

Saiba mais sobre estes e outros títulos em nosso site: www.rubio.com.br

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Neuza Maria Brunoro Costa Nutricionista. Professora-Associada do Departamento de Nutrição e Saúde (DNS) da Universidade Federal do Espírito Santo (UFES). Pós-Doutorado em Biodisponibilidade de Minerais pela Purdue University, pela Colorado University e pela University of Illinois at Urbana-Champaign, EUA. Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela University of Reading, Inglaterra. Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Maria do Carmo Gouveia Peluzio Nutricionista. Professora-Associada do Departamento de Nutrição e Saúde (DNS) da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutora em Ciências pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), MG. Mestre em Agroquímica pela UFV, MG.

Hércia Stampini Duarte Martino Nutricionista. Professora-Associada do Departamento de Nutrição e Saúde (DNS) da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Pós-Doutorado em Fitoquímica, Bioquímica e Biologia Celular pela Texas A&M University, EUA.

Gilberto Simeone Henriques Nutricionista. Professor Adjunto da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Doutor e Mestre em Ciências dos Alimentos pela Universidade de São Paulo (USP).

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Organizadores

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Copyright © 2014 Editora Rubio Ltda. ISBN 978-85-64956-88-9 Todos os direitos reservados. É expressamente proibida a reprodução desta obra, no todo ou em parte, sem autorização por escrito da Editora.

Produção Equipe Rubio Capa Bruno Pimentel

Editoração Eletrônica Elza Maria da Silveira Ramos

CIP-BRASIL. CATALOGAÇÃO-NA-FONTE SINDICATO NACIONAL DOS EDITORES DE LIVROS, RJ N97 Nutrição experimental: teoria e prática / organização Neuza Maria Brunoro   Costa [et al.]. – 1. ed. – Rio de Janeiro: Rubio, 2014. 178 p.: il.; 23cm.   Inclui índice   ISBN 978-85-64956-88-9   1. Alimentos – Análise – Laboratórios. 2. Nutrição – Experiências. I. Peluzio, Maria do Carmo Gouveia. II. Martino, Hércia Stampini Duarte. III. Henriques, Gilberto Simeone. IV. Título. 14-13097

Editora Rubio Ltda. Av. Franklin Roosevelt, 194 s/l 204 – Castelo 20021-120 – Rio de Janeiro – RJ Telefax: 55(21) 2262-3779 • 2262-1783 E-mail: rubio@rubio.com.br www.rubio.com.br Impresso no Brasil Printed in Brazil

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CDD: 613.2 CDU: 613.2

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Nutrição Experimental – Teoria e Prática

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Cassiano Oliveira da Silva Doutorando em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela UFV. Damiana Diniz Rosa Doutoranda em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. João Bosco Gonçalves de Barros Doutor em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Medicina Veterinária pela UFV. Professor Substituto Adjunto do Departamento de Nutrição e Saúde da UFV. Manoela Maciel dos Santos Dias Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela UFV. Monise Viana Abranches Doutora em Biologia Celular e Estrutural pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. Sandra Aparecida dos Reis Mestranda em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

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Colaboradores

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Dedicamos esta obra à nossa família, em especial aos nossos filhos. Que o tempo que deixamos de estar ao lado deles, para nos dedicar ao trabalho, não tenha sido em vão.

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Dedicatória

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Nossos agradecimentos a todos que nos incentivaram a redigir esta obra, em especial aos nossos alunos e colegas de profissão, os quais confiaram neste trabalho e nos apoiaram com suas críticas e sugestões.

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Agradecimentos

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A razão é o passo; o aumento da ciência, o caminho; e o benefício da humanidade, o fim (Thomas Hobbes, 1588-1679).

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Epígrafe

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A Nutrição Experimental é um tópico obrigatório nos cursos de Nutrição, mas, sobretudo, um caminho para se avançar no conhecimento sobre a Ciência da Nutrição. Não pretendemos esgotar todas as possíveis formas de investigação científica; entretanto, esta obra visa a suprir uma lacuna na literatura brasileira sobre alguns princípios da Experimentação, conforme o avanço na Ciência da Nutrição. Os estudos in vitro e in vivo com animais experimentais têm sido ferramentas importantes nesse avanço científico e alguns deles estão descritos neste livro. Procuramos enfatizar os conceitos éticos na experimentação animal, as técnicas de preparo de dietas experimentais, os modelos animais possíveis, os métodos de avaliação das propriedades nutricionais dos alimentos (como a qualidade proteica) e a biodisponibilidade de nutrientes e seus efeitos funcionais. Este trabalho é reflexo das nossas experiências acadêmicas teóricas e práticas, e esperamos contribuir para o ensino das disciplinas de graduação e pós-graduação na formação de profissionais de Nutrição e Saúde.

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Apresentação

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A Professora Neuza tem graduação em Nutrição (1983), mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV) (1987), doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos – University of Reading (1992) e pós-doutorado na Purdue University (1998) e na Colorado University (2006). Além disso, é pós-doutoranda na University of Illinois at Urbana-Champaign. É Professora-associada IV, no Departamento de Farmácia e Nutrição da Universidade Federal do Espírito Santo (UFES) em Alegre, ES. Atua como orientadora nos Programas de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos (UFES) e de Ciência da Nutrição (UFV). Tem, ainda, experiência na área de Nutrição, com ênfase em Nutrição Experimental, atuando principalmente nas áreas de Biodisponibilidade de Minerais, Alimentos Funcionais e Valor Nutricional dos Alimentos. Com toda essa bagagem acadêmica, após muitos outros livros, organiza mais esta obra, Nutrição Experimental – Teoria e Prática, em companhia de vários autores, a maioria formada nos cursos de graduação e pós-graduação da UFV – todos com experiência nos temas abordados ao longo do texto. Esses temas têm despertado o interesse dos pesquisadores da área de Ciências Biológicas e Saúde, principalmente os especializados em alimentos e saúde que trabalham com a nutrição humana e animal. Por isso, estamos nessa labuta desde o início dos anos 1980, tentando mostrar a importância do conteúdo para alunos de graduação, pós-graduação e futuros pesquisadores. Talvez em decorrência do trabalho ao longo de todos esses anos é que a Professora Neuza tenha me feito esse convite. Já naquela década tivemos o primeiro contato com o tema, e, de lá para cá, estamos, por incrível que pareça, trabalhando numa mesma linha de trabalho, ainda que em instituições de ensino superior diferentes. Tal linha volta-se para o estudo do alimento como instrumento de melhor qualidade de vida da nossa população.

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Prefácio

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Apesar de atuar na área, este é o primeiro prefácio que escrevo, até porque existem poucos livros dedicados, especificamente, ao assunto. Talvez também seja este o grande motivo de estar falando sobre essa obra, com a qual me identifico muito, pois retrata os meus mais de 30 anos de trabalho. Este livro faz um apanhado nos diferentes capítulos de todo o conhecimento importante para quem deseja trabalhar com Nutrição Experimental. Primeiramente, aborda-se um tema bem atual: a ética na utilização de animais de laboratório como agente biológico. Ainda hoje existe a necessidade desse modelo para decisões acerca da utilização dessa experimentação. Tal assunto é muito bem delineado por João Bosco Gonçalves de Barros, Mestre e Doutor em Medicina Veterinária pela UFV. O capítulo seguinte aborda os animais experimentais na pesquisa em Nutrição. Diferentes modelos animais (modificados geneticamente; induzidos por dietas, fármacos e cirurgia) constituem o “meio biológico” em que ocorrem as reações fisiológicas e metabólicas. Estas, ao final, servirão de parâmetro de aferição do efeito de alguma substância ou alteração da dieta. Por isso, a importância do assunto. Assim, faz-se necessário que os animais reúnam condições ideais e que sejam mantidos em ambiente controlado para que atendam aos padrões de qualidade sanitária e genética, mantendo uniformidade com relação a variáveis ambientais, genéticas e experimentais. Consequentemente, isso diminui a quantidade de animais necessários para o experimento delineado. O capítulo foi escrito pela Professora Doutora Maria do Carmo Gouveia Peluzio, pela Professora Doutora Monise Viana Abranches e pela doutoranda Damiana Diniz Rosa – todas graduadas em Nutrição, também pela UFV, com trabalhos publicados na área de experimentação animal. Já o terceiro capítulo, Necessidades Nutricionais e Dietas Experimentais de Roedores de Laboratório, é escrito pela Professora Doutora Neuza, que aborda o uso correto de uma alimentação segura voltada para atender às necessidades nutricionais do animal como ponto principal para alcançar seu objetivo. Em nossa opinião, o assunto é um dos mais importantes principalmente para os pesquisadores. O leitor terá a oportunidade de praticar seu conhecimento sobre os constituintes de alimentos ou dietas, observando a composição no momento da elaboração e as possíveis interações durante o preparo e a estocagem dos diferentes tipos de dietas oferecidas aos agentes biológicos. No Capítulo 4, Marcadores Bioquímicos e Isotópicos em Pesquisa Nutricional, a Professora Doutora Maria do Carmo Gouveia Peluzio, a Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos Manoela Maciel dos Santos Dias e a Mestranda Sandra Aparecida dos Reis mostram a importância do conhecimento do tempo médio da vida homeostática das diferentes substâncias e como elas podem ser rastreadas no organismo, devido à existência de marcadores. Tais ferramentas importantes podem ser do tipo bioquímico ou isotópico e auxiliam os métodos empregados em estudos de biodisponibilidade, quantificando a porcentagem do nutriente ingeri-

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Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura

Professor-Associado IV da Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro da Universidade Federal Fluminense (UFF), Niterói, RJ.

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do para suprir as demandas fisiológicas do organismo. O objetivo desses métodos abordados é monitorar ou quantificar um determinado nutriente que está sendo estudado em um órgão ou tecido, para assim ser avaliado quanto à sua utilização pelo corpo. Vale a pena conhecer a fundo o uso de marcadores isotópicos, um grande avanço nas pesquisas em Nutrição. Isso porque o marcador é absorvido e utilizado da mesma maneira que o elemento avaliado. Assim, demonstram-se as interações dos nutrientes consumidos na dieta e sua utilização nas vias metabólicas, de armazenamento ou de excreção. No capítulo seguinte, Avaliação da Qualidade Proteica, é dada a devida importância para este nutriente na formação e crescimento dos animais. A Professora Doutora Hércia Stampini Duarte Martino e o Professor Cassiano Oliveira da Silva abordam os métodos in vitro e in vivo químicos, enzimáticos e biológicos, baseando-se no ganho de peso e no incremento de nitrogênio, bem como em todos os fatores que contribuem e interferem nessa utilização. No Capítulo 6, Biodisponibilidade de Minerais, o termo “biodisponibilidade” compreende não somente a absorção ou a captação do nutriente pela mucosa intestinal, mas também seu transporte, sua assimilação celular e sua conversão em sua(s) forma(s) biologicamente ativa(s). Refere-se, portanto, à proporção de nutrientes alimentares ingeridos que é efetivamente absorvida e utilizada. As autoras abordam as interações que podem ocorrer entre esses elementos no organismo, demonstrando os métodos de avaliação da biodisponibilidade de alguns minerais e suas possíveis aplicações para estudos em humanos e animais experimentais. No último capítulo, Desenhos Experimentais para Avaliação dos Efeitos Funcionais dos Alimentos, o Professor Doutor Gilberto Simeone Henriques, parceiro de longa data e pós-graduado na mesma casa que eu, a Universidade de São Paulo, com orientação da Professora Sílvia, faz um apanhado de toda a fundamentação apresentada nesta obra, mostrando a importância dos conteúdos abordados anteriormente. Em resumo, trata-se de uma obra de qualidade destinada aos que se interessam pela experimentação em nutrição. É de valor inestimável pelo seu conteúdo e pela alta contribuição nesta lacuna do conhecimento na formação de futuros pesquisadores. Tenho certeza de que será do agrado dos interessados no assunto. Prefaciar esta brilhante contribuição foi recordar toda a minha vida acadêmica. É um privilégio que me deixou profundamente honrado, agradecido, muito feliz e que me foi dado, creio, pela bondade, pela gentileza e pela amizade da autora.

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2-AAF AAS AIN AOAC BN BNv CEUA CFMV CG COBEA Cochrane Concea Cu DANT DEN DEXA DMBA DNA DPD EPI EQ FAEO FASEB Fe FNT-alfa FSH GH GnRH HCl HDL

2-acetilaminofluoreno ácido acetilsalicílico American Institute of Nutrition Association of Official Analytical Chemists balanço de nitrogênio balanço de nitrogênio verdadeiro Comissão de Ética no Uso de Animais Conselho Federal de Medicina Veterinária carga glicêmica Colégio Brasileiro de Experimentação Animal The Cochrane Database of Systematic Reviews Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal cobre doenças e agravos não transmissíveis dietilnitrosamina absorciometria de raios X de dupla energia dimetilbenzantraceno ácido desoxirribonucleico deoxipiridinolina equipamentos de proteção individual escore químico fosfatase alcalina específica óssea Federation of the American Societies for Experimental Biology ferro fator de necrose tumoral alfa hormônio folículo estimulante hormônio de crescimento hormônio de liberação das gonadotropinas ácido clorídrico lipoproteínas de alta densidade

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Lista de abreviaturas

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eficiência de regeneração da hemoglobina Inductively Coupled Plasma Mass Spectrophotometry inteferon-gama índice glicêmico fator de crescimento similar à insulina 1 imunoglobulina G interleucina interleucina 6 intramuscular (via) intraperitonial (via) intravenosa (via) hormônio luteinizante Literatura Latino-americana e do Caribe em Ciências da Saúde livre de nitrogênio National Library of Medicine – EUA magnésio dose de retinol modificada glutamato monossódico hormônio estimulante de melanócitos dinucleotídeo de nicotinamida e adenina oxidado amoníaco células exterminadoras naturais (natural killers cell) razão proteica líquida (net protein ratio) utilização proteica líquida (net protein utilization) óxido nítrico Escore Químico Corrigido pela Digestibilidade (Protein Digestibility Corrected Amino Acid Score) razão de eficiência proteica (protein efficiency ratio) hormônio paratireóideo polivinil pirrolidona piridinolina células vermelhas do sangue (red blood cells) biodisponibilidade relativa dose resposta relativa Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório subcutânea (via) Scientific Eletronic Library Online ratos espontaneamente hipertensos (spontaneously hypertensive rats) síndrome metabólica livres de patógenos específicos (specific patogen free) capacidade de ligação do ferro total fosfatase ácida tártaro-resistente livre de uma carga antigênica (vírus antibody free) valor biológico zinco

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HRE ICPMS IFN-gama IG IGF-1 IgG IL IL-6 IM IP IV LH Lilacs LN Medline Mg MRDR MSG MSH NAD+ NH3 NK NPR NPU ON PDCAAS PER PO PTH PVPI PYD RBC RBV RDR SBCAL SC SciELO SHR SM SPF TIBC TRACP VAF VB ZN

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1 Bioterismo e Ética na Pesquisa com Animais............................................. 1 João Bosco Gonçalves de Barros

  2 Animais Experimentais na Pesquisa em Nutrição...................................... 25 Maria do Carmo Gouveia Peluzio | Monise Viana Abranches | Damiana Diniz Rosa

  3 Necessidades Nutricionais e Dietas Experimentais de Roedores de Laboratório............................................................................................. 47 Neuza Maria Brunoro Costa

  4 Marcadores Bioquímicos e Isotópicos em Pesquisa Nutricional................ 65 Maria do Carmo Gouveia Peluzio | Manoela Maciel dos Santos Dias | Sandra Aparecida dos Reis

  5 Avaliação da Qualidade Proteica.............................................................. 89 Hércia Stampini Duarte Martino | Cassiano Oliveira da Silva

  6 Biodisponibilidade de Minerais............................................................... 111 Neuza Maria Brunoro Costa | Hércia Stampini Duarte Martino

  7 Desenhos Experimentais para Avaliação dos Efeitos Funcionais dos Alimentos............................................................................................. 133 Gilberto Simeone Henriques

Anexos................................................................................................. 153 Índice................................................................................................... 171

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Sumário

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CAPÍTULO

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Bioterismo e Ética na Pesquisa com Animais João Bosco Gonçalves de Barros

³³Introdução A experimentação animal data dos antigos gregos e romanos. Todavia, a partir do século XX, intensificou-se o debate em torno das questões sobre a Ética na utilização animal. Apesar de todos os esforços da comunidade científica a fim de reduzir e/ou substituir a sua aplicação, ainda não foi possível abandoná-la. Assim sendo, a preocupação com o bem-estar levou à conscientização acadêmica sobre a necessidade do aperfeiçoamento na manutenção e no manuseio animal e da padronização de alguns parâmetros, ditos básicos, mas extremamente necessários para a realização de um ensaio biológico de qualidade. Animais são utilizados na experimentação científica por constituírem modelos. Os modelos são mapas de territórios não explorados e servem de base para encontrar o caminho de um destino. Na sua falta, chegar ao destino é, portanto, mais difícil. Como exemplo, modelos experimentais desenvolvidos em animais de laboratórios (na sua grande maioria, ratos e camundongos) são utilizados na ciência para o entendimento da origem de doenças (que afligem humanos e não humanos). Dessa compreensão surgem hipóteses sobre os mecanismos de doenças que, uma vez confirmadas, podem ser revertidas em benefício da sociedade na forma de novos medicamentos, tratamentos mais adequados de doenças, aperfeiçoamento de técnicas cirúrgicas ou não, entre outros. Portanto, no universo da ciência experimental, o uso de animais gerando o conhecimento é um dos elos da corrente formadora do saber científico. O uso dos animais na experimentação obedece a critérios éticos, os quais são construídos dentro de uma visão humana de mundo, onde a experimentação deve priorizar o bem-estar animal. O entendimento que se tem é a adoção de métodos

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humanitários, de tal forma que exista responsabilidade no manejo animal em todos os aspectos e do seu bem-estar (alojamento, nutrição, saúde, assistência médica e eutanásia). Ideias e achados a respeito da vida mental e emocional dos animais, de sua capacidade de inteligência e de aprendizagem, da complexidade de sua comunicação, da existência de atos conscientes e até mesmo de uma consciência de si próprio, de sua possibilidade de criar e transmitir cultura, de manifestações de interação empática, tem conduzido os humanos a reconhecer a necessidade de mudar sua percepção e conduta em relação aos animais não-humanos. O conceito de senciência abrange e fortalece essas ideias. A senciência é a capacidade que um ser tem de sentir conscientemente algo, ou seja, de ter percepções (sensações e sentimentos), conscientes sobre o que lhe acontece e o que o rodeia. Reconhecer a senciência nos animais provoca o surgimento de reflexões éticas acerca do uso que damos a eles, dos efeitos que a interferência humana provoca em seu hábitat e do grau de sofrimento que os atinge em virtude da forma como os tratamos. Isso implica que tomemos, desde já, algumas medidas no sentido de melhor conhecer e atender às suas necessidades básicas, assim como protegê-los de abusos e sofrimentos desnecessários. Nessa linha, dois ramos recentes do conhecimento humano – a Bioética e a Ciência do Bem-estar Animal – podem servir aqueles que trabalham e lidam com animais, como ferramentas auxiliares para uma atuação moderna, pautada numa visão multidimensional, que considera tanto a ciência quanto à ética. Este capítulo tem por função condensar informações, com base em literatura consolidada da área, acerca da aplicabilidade prática de algumas ações em biotérios e laboratórios de pesquisa com animais, sobretudo em camundongos e ratos (devido à sua larga escala de utilização) à luz de condutas éticas e diretrizes atuais no tocante ao uso de animais em pesquisas, bem como das respectivas entidades competentes envolvidas nesta questão.

³³Importância do bioterismo e do bem-estar animal A contínua evolução do conhecimento humano repercute no desenvolvimento de ações envolvendo a criação e experimentação animal, desencadeando a constante e necessária atualização de suas técnicas e procedimentos. Por mais de um século, os animais de laboratório vêm sendo utilizados na pesquisa científica, permitindo avanços importantes, contribuindo para o desenvolvimento da ciência e tecnologia. Sua vasta contribuição nos diferentes campos científicos conduziu ao longo do tempo, descobertas imensuráveis de medidas profiláticas e tratamentos de enfermidades que acometem os seres vivos. Animais de laboratório, por definição, são aqueles criados e produzidos sob condições ideais e mantidos em ambiente controlado (sem variações extremas),

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com conhecimento e acompanhamento microbiológico e genético seguros. Os animais de laboratório convencionais podem satisfazer as exigências da experimentação biomédica, ao passo que animais obtidos de formas distintas não as satisfazem, pois não são submetidos a nenhum tipo de controle. A condução de pesquisa em animais de laboratório foi responsável por descobertas que permitiram, por exemplo, o uso terapêutico de antibióticos e o tratamento de diversas doenças, corroborando para se evitar epidemias e epizootias, bem como o desenvolvimento de técnicas cirúrgicas e possibilidade de uso de fármacos anestésicos e antidepressivos, entre inúmeros outros benefícios ao homem. Mesmo com o progresso de métodos alternativos nos últimos anos (como estudos in vitro e cultura de células), os modelos animais ainda apresentam como principal vantagem o fornecimento de informações sobre o organismo como um todo, fato este não alcançado em outros métodos. Pelas razões supracitadas, o bioterismo assume função primordial e de suma importância, que deve ser encarado com total responsabilidade por parte daqueles que desenvolvem tais atividades com animais. Um biotério nada mais é que uma instalação dotada de características próprias, que atende às exigências dos animais onde são criados ou mantidos, proporcionando-lhes bem-estar e saúde para que possam se desenvolver para responder satisfatoriamente aos testes experimentais neles conduzidos. Muitos estudos a respeito dos biotérios vêm sendo desenvolvidos com o intuito de melhorar e tornar mais eficientes a criação e a manutenção desses animais. Todo este conjunto de ideias e conhecimentos constitui a chamada ciência de animais de laboratório. A evolução dessa Ciência e os constantes questionamentos sobre o uso de animais em experimentação científica alteraram as relações entre o ser humano e os animais, transformando o bem-estar animal em uma importante área de estudo. A Ciência de Animais de Laboratório parte do princípio de que o tema principal de um determinado estudo, é o próprio animal que será utilizado na pesquisa e como este deverá ser criado/manipulado. Ou seja, considera o bem-estar dos animais um dos principais fatores que poderão influenciar o resultado de um experimento e valoriza o uso ético destes, retomando o princípio dos “3Rs” proposto por Russel & Burch em 1959 (vide item Ética na pesquisa com animais, deste capítulo). Neste sentido, há ainda uma série de fatores físicos, químicos ou microbiológicos (Figura 1.1) que poderão desencadear um desequilíbrio fisiológico (indesejável para finalidade de pesquisa) nos animais e consequentemente aumentar ou diminuir o bem-estar, principalmente pela situação de confinamento e impossibilidade de resolução de tais situações indesejáveis. Um ambiente adequado para a manutenção de animais de laboratório é necessário, pois essas espécies são sistemas biológicos sensíveis a fatores internos e externos (vide item Ética na pesquisa com animais, deste capítulo). A área destinada ao alojamento é um exemplo, pois deve levar em conta as necessidades básicas do animal. Um dos requisitos prin-

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Figura 1.1 Fatores que podem afetar o bem-estar de animais de laboratório Fonte: adaptada de Hessler & Leary, 2002.

cipais é o espaço suficiente para a realização de movimentos corporais normais (movimentação) e livre acesso à água e alimento. Por exemplo, o estresse gerado por excesso de animais confinados ou mesmo o isolamento, pode causar alterações fisiológicas e comportamentais que, certamente, influenciarão na resposta ao estudo. Ambientes mais estáveis, livres de odores fortes, limpos, com luminosidade e temperatura ideais (controladas) e ainda, isentos de microrganismos patogênicos são cientificamente melhor aceitos e favorecem o bem-estar animal. Qualquer alteração nos procedimentos ou protocolos experimentais para minimizar a dor e o estresse deve ser considerada para aumentar o bem-estar animal. O simples uso de analgésicos (vide item Ética na pesquisa com animais, deste capítulo), por exemplo, deve ser levado em consideração sempre, quando os procedimentos provocarem dor injustificada (não esperada). Outro fato para atenção, é que a utilização de agulhas hipodérmicas de calibre apropriado ao tamanho do animal e a realização de contenção física adequada reduzem, acentuadamente, o desconforto físico causado pelo procedimento. Em suma, basicamente, o aprimoramento das técnicas utilizadas em animais de laboratório reduzirá o estresse associado a elas. Em estudos no qual o animal necessariamente é exposto a algum fator estressante ou doloroso, é muito importante estabelecer o momento de encerrar o experimento e da eutanásia do animal (vide item A prática da eutanásia e a finalização humanitária em animais de laboratório). Somente em situações muito especiais pode-se aguardar o desfalecimento do estado do animal até sua morte. Uma forma de contribuição para aumento do bem-estar é a utilização de enriquecimento ambiental, pois os animais vivem em ambientes nus e monótonos.

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Esse enriquecimento consiste na exposição de animais a ambientes ricos em estimulação sensorial, gerada por objetos inanimados, como rodas de atividades, canos e brinquedos, e/ou caixas com infraestruturas mais complexas, contendo tocas, galerias de túneis e/ou plataformas com diferentes níveis de acesso. O objetivo principal do enriquecimento é dar ao animal em cativeiro condições que estimulem seu comportamento natural. Por exemplo, ratos e camundongos têm hábitos noturnos, porém no laboratório eles passam o dia expostos à luz sem condições de proteger-se. Qualquer modificação que altere de forma benéfica o ambiente ou a rotina do animal pode ser considerada um enriquecimento ambiental. Materiais simples, como canos de PVC, caixas de papelão, fundos de garrafas de plástico, bolas de papel, caixa de ovos, podem e devem ser utilizados como enriquecimento ambiental. Deve-se levar em consideração que o enriquecimento ambiental não pode interferir com o experimento. Alguns podem introduzir patologias indesejáveis ou problemas no manejo. Com relação aos animais de laboratório, uma série de parâmetros podem ser alterados com o enriquecimento ambiental, por exemplo: ■■ Diminuição do nível de excitabilidade dos animais diante dos procedimentos de manipulação no laboratório. ■■ Melhoria nas condições gerais de saúde. ■■ Diminuição dos níveis de agressão intraespecífica. ■■ Diminuição dos níveis circulantes de hormônios suprarrenais associados ao estresse. ■■ Diminuição da frequência de comportamentos estereotipados.

³³Controle da qualidade em biotérios e laboratórios de experimentação com animais Fatores como a origem dos animais e meio ambiente em que estão vivendo podem afetar diretamente suas respostas biológicas, fisiológicas e comportamentais. Assim, desde a elaboração e aprovação do projeto inicial, os biotérios e laboratórios experimentais devem atender a recomendações para minimizar os efeitos do meio ambiente nessas variáveis dos animais. Instalações adequadas para os padrões necessários à criação e à manutenção de animais de laboratório devem possuir programas de gerenciamento das condições físicas e ambientais, garantindo cuidados que favoreçam o desenvolvimento e a reprodução (quando for o caso de biotério de criação) dos animais, mantendo a sanidade e o bem-estar, minimizando as variações que podem interferir nos resultados dos ensaios. Um erro comum é a expectativa de que os animais utilizados respondam fisiologicamente da mesma forma aos interferentes externos, independentemente de onde estejam alojados. Neste sentido, entende-se como microambiente o espaço físico mais próximo ao animal, ou seja, a gaiola, com parâmetros próprios para temperatura, umidade

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Nutrição Experimental – Teoria e Prática

Tabela 1.1 Anti-inflamatórios e analgésicos para camundongos Fármaco

Dose e via de administração

Frequência

Acetaminofeno

300mg/kg, VO; 700mg/25g, VO

A cada 4h

Butorfanol

1 a 5mg/kg, SC

A cada 6h

Ácido acetilsalicílico (AAS)

120mg/kg, VO

A cada 4h

Dexametazona

0,06mg/25g SC, IM, IV, IP

Prednisona

0,05 a 0,22mg/25g, SC, IM

Fonte: adaptada de Paiva et al., 2005.

Tabela1.2 Anti-inflamatórios e analgésicos para ratos Fármaco

Dose e via de administração

Frequência

Acetaminofeno

110 a 300mg/kg, VO; 25 a 75mg/250g

A cada 4h

Butorfanol

0,05 a 2mg/kg, SC; 0,012 a 0,5mg/250g

A cada 4h

Ácido acetilsalicílico

100mg/kg, VO; 2,5mg/250g

A cada 4h

Dexametazona

0,5 a 2,0mg/kg, VO, SC

A cada 12h

Prednisona

0,05 a 0,22mg, SC, IM

Fonte: adaptada de Paiva et al., 2005.

como fiscalizar se o que foi descrito no projeto está realmente sendo realizado na prática. Enquanto não tivermos um sistema de fiscalização efetivo, o bem-estar dos animais dependerá unicamente da conduta ética dos pesquisadores envolvidos.

Vias de administração e coletas de fluidos em animais de laboratório A validade de resultados em grande escala dos experimentos com animais de laboratório está baseada na análise de índices obtidos em decorrência da administração de substâncias quaisquer e ainda, coleta adequada de fluidos corpóreos em grande número de estudos in vitro e in vivo. Para essas aplicações existem diversos métodos eficientes.

Vias de administração (pequenos roedores) A escolha da via de administração de drogas, vacinas e anestésicos injetáveis deve ser alicerçada na natureza do agente a ser administrado, na espécie animal-alvo, com propósito de administração e proporção entre volume e sítio de aplicação. Cada técnica tem vantagens e limitações, sendo algumas não indicadas de forma universal. Seguem abaixo, as considerações sobre algumas técnicas: ■■ Administração por gavagem: esta via tem a vantagem de permitir a administração da dosagem exata preestabelecida com intervalos de tempo bem con-

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trolados. Uma cânula de aço com esfera na extremidade é cuidadosamente introduzida na cavidade oral do animal, passando pelo esôfago e chegando até o estômago, onde o material é depositado. ■■ Via subcutânea (SC): esta via de administração é frequentemente utilizada, e o tempo de absorção dependerá da formulação do agente penetrante. A punção deverá observar o sentido do pelo no meio da prega da pele. ■■ Via intraperitonial (IP): é a primeira opção. No entanto, embora injeções nesta via pareçam seguras, há risco de puncionar o trato intestinal por dificuldades de contenção do animal. Não são indicadas para múltiplas aplicações e materiais irritantes podem gerar peritonite. A absorção é variável e pode ocorrer por circulação sistêmica e portal. Inclinar ligeiramente a cabeça do animal para baixo ajuda que os órgãos do abdome se acomodem de modo a deixar um flanco vazio no quadrante inferior esquerdo, permitindo maior facilidade na aplicação. ■■ Via intramuscular (IM): esta via pode ser dolorosa devido às fibras musculares estarem obrigatoriamente sob a tensão do material injetado. O local escolhido deverá ter a menos possibilidade de dano às terminações nervosas. Para estudos com múltiplas doses (repetições), deve-se considerar uma rotação dos sítios puncionados. Quando a velocidade de absorção é importante, é necessária a distinção entre formulações aquosas e oleosas que permaneçam depositadas por mais de 24h. Em estudos com múltiplas doses, deve-se considerar também a ocorrência de inflamação e possíveis sequelas.

Coleta de sangue (pequenos roedores) É de suma importância lembrar que a coleta de sangue, por exemplo, pode causar estresse ao animal, e isso poderá impactar sobre os resultados do estudo na pesquisa. Neste sentido, a Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA – vide item Entidades competentes quanto ao uso de animais de laboratório, a seguir) recomenda, para a autorização do uso de animais em pesquisa, que a coleta seja realizada por pessoa qualificada e com habilidade para desempenhar a técnica descrita no protocolo enviado à Comissão, reduzindo assim o estresse no animal. A literatura apresenta considerações sobre as diferentes técnicas de coleta de sangue e indicações específicas para cada uma delas. Tanto a fonte quanto o método de coleta podem afetar os parâmetros sanguíneos. Aumentos dos níveis de hormônios e glicose no sangue estão diretamente relacionados ao estresse inerente ao método de coleta efetuado. Os animais, sobretudo os roedores, podem se estressar por procedimentos de contenção ou mesmo por sentir ameaça de perigo. Afastá-los para outro lado da sala do laboratório ou cobrir a caixa até o momento da coleta são cuidados que ajudam a minimizar o estresse, aclimatar o animal à estratégia de procedimentos de contenção e

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■■ Apropriado para a idade e o estado de saúde do animal em questão. ■■ Causar um mínimo de sofrimento e estresse. ■■ Simples de administrar (em pequenas doses, se possível). ■■ Seguro para o operador e, tanto quanto possível, esteticamente aceitável para este ■■ Deve ser realizada distante de outros animais. Entre os métodos utilizados para realização da eutanásia, têm-se os métodos físicos e os métodos químicos, utilizando-se tanto gases inalantes como agentes farmacológicos não-inalantes. Os métodos físicos, como deslocamento cervical, traumatismo craniano, decapitação, ou eletrocussão, só devem ser empregados quando outros métodos podem invalidar uma determinada informação ou pesquisa, principalmente aquelas relacionadas com os processos bioquímicos do animal. Os métodos químicos utilizando agentes farmacológicos inalantes, como anestésicos ou gases, ou agentes farmacológicos não inalantes, como pentobarbital sódico ou hidrato de cloral, são os métodos de escolha de melhor resolução e mais estéticos, não causando traumas aparentes ao animal. A Tabela 1.3 apresenta os métodos de eutanásia recomendados e aceitos sob restrição para várias espécies animais, de acordo com a Resolução no 1.000, de 11 de maio de 2012, do Conselho Federal de Medicina Veterinária (CFMV). Entende-se por métodos recomendados aqueles que produzem consistentemente uma morte humanitária, quando usados como métodos únicos de eutanásia. Já os métodos aceitos sob restrição são aqueles que, por sua natureza técnica ou por possuírem um maior potencial de erro por parte do executor ou por apresentarem problemas de segurança, podem não produzir consistentemente uma morte humanitária. Tais métodos devem ser empregados somente diante da total impossibilidade do uso dos métodos recomendados na citada Resolução do CFMV. Uma condição inquestionável para se considerar no método de eutanásia é que a perda da consciência deve ser rápida, irreversível e preceda qualquer experiência emocional ou física desagradável, ou seja, sem dor, estresse, apreensão ou ansiedade. Dessa forma, independentemente do método, a inconsciência deve anteceder a parada cardiorrespiratória, seguida da perda da função cerebral. Assim, a imobilização do animal deve ocorrer com o mínimo de estresse. Para obter esse grau de inconsciência, devem-se utilizar agentes injetáveis ou inalatórios. Por sua vez, a finalização humanitária representa interromper, reduzir ou minimizar a dor ou sofrimento do animal de modo adequado. A decisão de finalização humanitária passa pela abordagem ética, científica, legal e prática. O estabelecimento de normas para decisão de finalizar adequadamente animais submetidos a procedimentos de pesquisa tem como princípio que pesquisadores e técnicos atuem com responsabilidade no momento de minimizar o desconforto durante protocolos experimentais. A decisão exige, como pré-requisito, amplo conhecimento dos indicativos de bem-estar animal.

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Métodos recomendados

Barbitúricos, anestésicos inaláveis (em algumas espécies), dióxido de carbono (CO2), monóxido de carbono (CO), metano sulfonato de tricaína (TMS, MS222), hidrocloreto de benzocaína, dupla secção da medula espinal

Métodos aceitos sob restrição

N2, argônio, deslocamento cervical, decapitação N2, argônio, pistola de ar comprimido, eletrocussão com sedação prévia Hidrato de cloral (IV, após sedação), pistola, eletrocussão com sedação prévia N2, argônio, deslocamento cervical (<1kg), decapitação, pistola de ar comprimido N2, argônio Pistola (cetáceos <4m de comprimento) Decapitação e secção da medula espinal, atordoamento e decapitação ou secção da medula espinal Anestésicos inaláveis, CO2, CO, N2, argônio Pistola de ar comprimido, pistola, decapitação e secção da medula espinal, atordoamento e decapitação

Barbitúricos, anestésicos inaláveis, CO2, CO, pistola

Barbitúricos, anestésicos inaláveis, CO2, CO, cloreto de potássio com anestesia geral prévia

Barbitúricos, cloreto de potássio com anestesia geral prévia, pistola de ar comprimido

Barbitúricos, anestésicos inaláveis, CO2, CO, cloreto de potássio com anestesia geral prévia

Barbitúricos, anestésicos inaláveis, CO2, CO, cloreto de potássio com anestesia geral prévia

Barbitúricos, hidrocloreto de etorfina

Barbitúricos, anestésicos inaláveis, CO2, tricaína metano sulfonato (TMS, MS222), hidrocloreto de benzocaína, 2-fenoxietanol

Barbitúricos

Barbitúricos, anestésicos inaláveis (em algumas espécies), CO2, (em algumas espécies)

Aves

Cães

Cavalos

Coelhos

Gatos

Mamíferos marinhos

Peixes

Primatas não humanos

Répteis

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(continua)

N2, argônio, pistola de ar comprimido, pistola

Barbitúricos, anestésicos inaláveis, CO2, CO, cloreto de potássio com anestesia geral prévia

CO2, CO, nitrogênio (N2), argônio, pistola de ar comprimido, pistola, armadilhas (testadas cientificamente)

Pistola de ar comprimido, pistola, atordoamento e decapitação, decapitação e secção da medula espinal

Animais de zoológicos

Animais selvagens de vida livre Barbitúricos intravenosos (IV) ou intraperitonais (IP), anestésicos inaláveis, cloreto de potássio com anestesia geral prévia

Anfíbios

Espécies animais

Tabela 1.3 Métodos de eutanásia recomendados ou aceitos sob restrição para várias espécies de animais

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CAPÍTULO

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Necessidades Nutricionais e Dietas Experimentais de Roedores de Laboratório Neuza Maria Brunoro Costa

³³Introdução Ao utilizar modelos animais em pesquisa, é fundamental uma alimentação adequada que atenda às necessidades nutricionais dos seres estudados. Isso é necessário para os animais apresentarem suas características de crescimento, desenvolvimento, reprodução e longevidade normais, além de responder da melhor maneira aos estímulos testados. Assim, uma dieta nutricionalmente balanceada é importante para o bem-estar do animal e evita interferências indesejáveis na resposta ao experimento que se deseja realizar. Convém considerar ainda o tipo de dieta, a biodisponibilidade dos nutrientes, a palatabilidade e a aceitação da alimentação pelo animal, a forma de preparação e estocagem da dieta e a concentração química dos contaminantes. A seguir, serão apresentados alguns fatores que podem afetar as necessidades nutricionais dos animais de laboratório.

³³Fatores que afetam as necessidades nutricionais Genética Diferenças genéticas entre espécies, linhagens, gênero e indivíduos podem afetar as necessidades nutricionais. Por exemplo, a falta da L-gulonolactona oxidase, enzima necessária para a síntese de ácido ascórbico, ocorre em algumas espécies, como o porquinho-da-índia. Entretanto, o rato Wistar apresenta essa enzima; assim, sua dieta não requer a inclusão da vitamina C.

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Necessidades Nutricionais e Dietas Experimentais de Roedores de Laboratório

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Nutrição Experimental – Teoria e Prática

Estágio da vida As necessidades nutricionais mudam de acordo com o estágio do ciclo de vida do animal, especialmente durante o crescimento, a gestação e a lactação. Todavia, estudos a esse respeito são escassos. Desse modo, ainda não foram estabelecidas as necessidades para cada momento da vida dos diferentes modelos animais utilizados em laboratório. Reeves et al. (1993)1 estabeleceram recomendações para as diferentes fases da vida de ratos e camundongos, modelos animais comumente usados em estudos nutricionais. Tal dieta será apresentada posteriormente (Tabelas 3.1 a 3.3).

Impactos ambientais A mudança no ambiente do animal pode alterar suas necessidades nutricionais. Como exemplo, podemos citar a redução da temperatura ambiente, a qual causa aumento da demanda energética. Por isso, é importante a manutenção da temperatura controlada na sala de acondicionamento dos animais.

Status microbiológico Os animais de laboratório, assim como os seres humanos, apresentam em seu trato digestivo microrganismos capazes de sintetizar vitaminas e aminoácidos. No entanto, a utilização desses nutrientes pelo animal varia muito. Ratos e camundongos têm maior atividade microbiológica no cólon, e os compostos produzidos não são absorvidos. Todavia, podem ser utilizados se o animal ingerir suas próprias fezes (coprofagia), conduta que deve ser evitada para não interferir nos resultados do experimento. Uma forma de evitar a coprofagia é manter o animal em gaiola com fundo aramado, de modo que as fezes caiam em um compartimento abaixo, fora do alcance do animal, conforme mostrado na Figura 3.1.

Figura 3.1 (A e B) Gaiolas aramadas para animais de laboratório. As fezes são coletadas em papel absorvente (jornal ou similar), em bandejas abaixo das gaiolas, fora do alcance dos animais

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Interações entre nutrientes Ocorrem interações entre os minerais que são absorvidos ou transportados pelas mesmas moléculas. Assim, quando ingredientes não habituais são adicionados à dieta, as interações devem ser consideradas, e as correções, feitas sempre que for apropriado.

³³Tipos de formulação de dietas Existem vários tipos de dietas utilizadas em animais de laboratório. Selecionar qual tipo será utilizado depende do grau de controle na quantidade dos nutrientes desejados, da necessidade de produtos-teste, dos potenciais efeitos dos microrganismos da dieta sobre o animal, da aceitação desta e do custo. Dessa maneira, o tipo de dieta a ser utilizado no estudo também depende muito dos objetivos que se busca alcançar. Entretanto, deve-se sempre estar atento em oferecer uma dieta palatável ao animal, que atenda às suas necessidades nutricionais e seja livre de contaminantes tóxicos ou causadores de alguma enfermidade. As dietas costumam ser classificadas de acordo com o grau de refinamento dos ingredientes. Elas são apresentadas a seguir.

Dieta quimicamente definida A dieta formulada por componentes quimicamente puros, como aminoácidos, triglicerídios, ácidos graxos essenciais, sais inorgânicos e vitaminas, é isenta de contaminantes e de fatores estimuladores de enzimas. É utilizada nos estudos em que o controle da concentração de determinados nutrientes e a adição de constituintes específicos são de extrema relevância. Desse modo, é a que apresenta o maior grau de controle dos seus constituintes. Em estudos que utilizam animais germ-free e com baixa imunidade, convém dar prioridade à dieta quimicamente definida, que deve ser esterilizada antes de oferecida ao animal. Entretanto, esse tipo de dieta apresenta baixa estabilidade à temperatura ambiente, o que pode causar oxidação e interação entre os nutrientes, acarretando alteração da biodisponibilidade de seus componentes. Outro fator limitante é seu elevado custo.

Dieta purificada Na dieta purificada, são utilizados ingredientes extraídos de determinados alimentos, como, por exemplo, a caseína ou a albumina (fontes proteicas); a sacarose e o amido (carboidratos); e o óleo vegetal (lipídio). Pelos tipos de ingredientes utilizados, essa dieta tem sua composição relativamente conhecida. O custo é relativa-

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Necessidades Nutricionais e Dietas Experimentais de Roedores de Laboratório

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³³Recomendação nutricional para roedores de laboratório – AIN-93 Em 1973, o American Institute of Nutrition (AIN) organizou um comitê com o objetivo de identificar uma dieta padrão que fosse adotada em estudos nutricionais com roedores em laboratório. A padronização desses estudos era necessária para reduzir as variações inerentes às dietas utilizadas que se baseavam em cereais e em ingredientes naturais, além de facilitar a interpretação dos resultados entre os diferentes experimentos e laboratórios. Esse comitê resultou na publicação da dieta AIN-76. Entretanto, as diversas críticas à recomendação mostraram a necessidade de revisar o documento. Entre as limitações relatadas, estavam problemas nutricionais e técnicos. Para o estabelecimento dessa nova recomendação, foi organizado em 1989 um workshop durante a reunião da Federation of the American Societies for Experimental Biology (FASEB). A partir desse workshop, foi elaborado um resumo publicado no The Journal of Nutrition. Como resultado do workshop e das sugestões enviadas, novas dietas foram propostas considerando quatro diferentes fases de vida de ratos e camundongos: crescimento, gestação, lactação e manutenção. Para o crescimento, a gestação e a lactação, recomendou-se a dieta AIN-93G e, para a manutenção do animal adulto, a dieta AIN-93M. As Tabelas 3.1, 3.2 e 3.3 apresentam os ingredientes e a composição das misturas de minerais e de vitaminas que devem ser utilizados nas dietas AIN-93G e AIN-93M, respectivamente. Tabela 3.1 Composição da dieta AIN-93 Ingredientes

g/kg de dieta AIN-93G

AIN-93M

Amido de milho

397,486

465,692

Caseína (≥85% de proteína)

200,000

140,000

Amido dextrinizado (90% a 94% tetrassacarídeos)

132,000

155,000

Sacarose

100,000

100,000

Óleo de soja (sem aditivos)

70,000

40,000

Fibra (celulose microfina)

50,000

50,000

Mistura de minerais

35,000

35,000

Mistura de vitaminas

10,000

10,000

L-cistina

3,000

1,800

Bitartarato de colina (4,1% colina)

2,500

2,500

Tetrabutil-hidroquinona

0,014

0,008

Fonte: adaptada de Reeves et al., 1993.

1

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Tabela 3.2 Composição da mistura de minerais g/kg de mistura

Ingredientes

AIN-93G

AIN-93M

Elementos minerais essenciais Carbonato de cálcio anidro (40,04% Ca)

357,00

357,00

Fosfato de potássio monobásico (22,76% P; 28,73% K)

196,00

250,00

Citrato de potássio, tripotássio, monoidratado (36,16% K)

70,78

28,00

Cloreto de sódio (39,34% Na; 60,66% Cl)

74,00

74,00

Sulfato de potássio (44,87% K; 18,39% S)

46,60

46,60

Óxido de magnésio (60,32% Mg)

24,00

24,00

Citrato de ferro (16,5% Fe)

6,06

6,06

Carbonato de zinco (52,14% Zn)

1,65

1,65

Carbonato de manganês (47,79% Mn)

0,63

0,63

Carbonato de cobre (57,47% Cu)

0,30

0,30

Iodato de potássio (59,3% I)

0,01

0,01

Selenato de sódio anidro (41,79% Se)

0,01025

0,01025

Paramolibdato de amônio tetraidratado (54,34% Mo)

0,00795

0,00795

Metassilicato de sódio nonaidratado (9,88% Si)

1,45

1,45

Sulfato de cromo e potássio dodecaidratado (10,42% Cr)

0,275

0,275

Cloreto de lítio (16,38% Li)

0,0174

0,0174

Ácido bórico (17,5% B)

0,0815

0,0815

Fluoreto de sódio (45,24% F)

0,0635

0,0635

Carbonato de níquel (45% Ni)

0,0318

0,0318

Vanadato de amônio (43,55% V)

0,0066

0,0066

Sacarose

221,026

209,806

Elementos minerais potencialmente benéficos

Fonte: adaptada de Reeves et al., 1993.1

Tabela 3.3 Composição da mistura de vitaminas (AIN-93G e AIN-93M) Ingredientes

g/kg de mistura

Ácido nicotínico

3,000

Pantotenato de cálcio

1,600

Piridoxina-HCl

0,700

Tiamina-HCl

0,600

Riboflavina

0,600

Ácido fólico

0,200

D-biotina

0,020 (continua)

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Necessidades Nutricionais e Dietas Experimentais de Roedores de Laboratório

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Nutrição Experimental – Teoria e Prática

Tabela 3.3 Composição da mistura de vitaminas (AIN-93G e AIN-93M) (continuação) Ingredientes

g/kg de mistura

Vitamina B12 (cianocobalamina: 0,1% em manitol)

2,500

Vitamina E (all-rac-a-acetato de tocoferila: 500UI/g)

15,00

Vitamina A (all-transpalmitato de retinil: 500.000UI/g)

0,800

Vitamina D (colecalciferol: 400.000UI/g)

0,250

Vitamina K (filoquinona)

0,075 974,655

Sacarose Fonte: adaptada de Reeves et al., 1993.

1

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Considerações sobre a dieta AIN-93: Lipídios: muitas vezes, busca-se testar diferentes fontes lipídicas, mudando assim esse componente da dieta. Entretanto, as gorduras com elevado teor de ácidos graxos saturados com 16 carbonos ou mais são maldigeridas. Ainda quanto aos lipídios, dietas com elevadas quantidades de ácidos graxos poli-insaturados necessitam de maior quantidade de antioxidantes. Proteína: verifica-se o grau de pureza da caseína utilizando uma que apresente mais de 85% de proteína. Como a caseína é uma fonte proteica pobre em cistina, optou-se por acrescentar esse composto na dieta AIN-93. Quando se quer substituir a fonte proteica, a caseína é uma fonte de fósforo. Se a nova proteína não apresentar esse composto, ele deve ser acrescido de outro modo na mistura de minerais. Fibra: as fontes de fibras de mais baixo custo são menos purificadas e podem conter elevadas concentrações de minerais, como o ferro e o manganês, além de metais pesados e fatores antinutricionais, como fitatos e taninos. Desse modo, se o estudo tem por objetivo avaliar um mineral específico, esse ingrediente da dieta deve ser selecionado com cautela. Minerais e vitaminas: é importante observar que as formas de minerais e vitaminas selecionados para compor as misturas se relacionam com sua biodisponibilidade e sua estabilidade. Assim, a substituição por outra forma deve ser feita considerando esses pontos. O ácido ascórbico (vitamina C) é dispensável na dieta, visto que tais roedores sintetizam a vitamina. Elementos-traço: existem evidências de que esses minerais são necessários ao bom funcionamento do organismo do roedor; entretanto, suas funções bioquímicas ainda não foram bem estabelecidas. Em decorrência dessas incertezas, alguns pesquisadores podem optar por não os acrescentar à dieta. Nesse caso, o elemento deve ser substituído por sacarose, e a dieta receber a denominação de “modificada”.

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³³Dietas modificadas As dietas podem sofrer modificações com o propósito de atender aos objetivos da pesquisa, de modo a fornecer quantidades equitativas de determinado nutriente ou componente, ou para promover alterações metabólicas no animal. Assim, as dietas devem ser isoproteicas e isocalóricas em estudos da avaliação da qualidade proteica e conter o mesmo teor de ferro para testar a biodisponibilidade desse mineral. Além disso, podem receber colesterol, para induzir hipercolesterolemia nos animais, conforme exemplificado a seguir.

Dieta isoproteica e isocalórica Estudos de avaliação da qualidade proteica da dieta requerem doses baixas de proteína (9,5%), de modo a diferenciar as dietas experimentais quanto à promoção do crescimento de animais jovens. Esse tema será abordado mais detalhadamente no Capítulo 5, Avaliação da Qualidade Proteica. As dietas experimentais devem conter a mesma quantidade de proteína e se diferenciar apenas quanto à sua fonte, a fim de se avaliar a qualidade de determinada proteína em promover crescimento (ganho de peso) do animal. A adição de diferentes fontes proteicas requer ajustes dos seus constituintes, de maneira a fornecer os mesmos teores de proteína e de calorias. Assim, convém ajustar todos os ingredientes que interferem no valor calórico das dietas, como proteínas, carboidratos, lipídios e fibras. Embora as fibras não forneçam calorias diretamente, podem alterar a densidade calórica da dieta, visto que um alto teor de fibras reduz a densidade, enquanto baixos teores aumentam a densidade calórica da dieta. No exemplo da Tabela 3.4, apresenta-se a composição das dietas experimentais de um estudo de avaliação da qualidade proteica. Tabela 3.4 Composição das dietas experimentais (g/kg) Ingrediente Caseína Feijão Soja Amido dextrinizado Sacarose Óleo de soja Celulose Mix de minerais Mix de vitaminas L-cistina Bitartarato de colina Tetrabutil-hidroquinona Amido de milho

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Livre de nitrogênio (LN) – – – 132 100 70 50 35 10 3 2,5 0,014 597,486

Dieta Caseína 111,76 – – 132 100 70 50 35 10 3 2,5 0,014 485,726

Feijão – 475 – 132 100 60,5 0 35 10 3 2,5 0,014 181,986

Soja – – 316,67 132 100 0 18,33 35 10 3 2,5 0,014 382,486

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CAPÍTULO

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Biodisponibilidade de Minerais Neuza Maria Brunoro Costa | Hércia Stampini Duarte Martino

³³Introdução O termo biodisponibilidade compreende não somente a absorção ou a captação do nutriente pela mucosa intestinal, mas também seu transporte, sua assimilação celular e sua conversão em sua(s) forma(s) biologicamente ativa(s). Refere-se, portanto, à proporção de nutrientes alimentares ingeridos efetivamente absorvida e utilizada.1 Diversos fatores fisiológicos e/ou alimentares podem afetar a biodisponibilidade dos minerais de modo positivo ou negativo, nas diferentes etapas da sua passagem pelo organismo.2 As interações entre os nutrientes e demais componentes dos alimentos podem ocorrer no lúmen intestinal, na passagem pelos enterócitos, no transporte pela corrente sanguínea, na captação e na utilização pelas células e pelos tecidos, bem como na sua excreção fecal ou urinária. Dessa maneira, para avaliar a biodisponibilidade dos minerais, torna-se imprescindível o conhecimento das possíveis interações entre os componentes dos alimentos e da dieta e do estado fisiológico do indivíduo, assim como das técnicas de avaliação da biodisponibilidade. Neste capítulo, serão abordados os métodos de avaliação da biodisponibilidade de alguns minerais e suas possíveis aplicações para estudos em humanos e animais experimentais.

³³Métodos de determinação da biodisponibilidade de cálcio A falta de sensibilidade de indicadores do estado nutricional de cálcio e a regulação homeostática das concentrações de cálcio nos meios intra- e extracelular

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limitam os métodos de avaliação da biodisponibilidade de cálcio.3 Por exemplo, a mudança na concentração plasmática de cálcio após sua ingestão é um indicador pobre da sua absorção, visto que o mecanismo homeostático mantém os níveis quase constantes, mesmo quando altas doses do mineral são ingeridas.

Métodos de balanço A técnica clássica de balanço de cálcio, com ou sem o uso de traçadores isotópicos, continua sendo a mais usada para estudos de biodisponibilidade de cálcio. Define-se o balanço de cálcio como: Balanço de Ca = Cai – (Caf + Cau + Cad) Cai: Ca ingerido; Caf: Ca fecal; Cau: Ca urinário; Cad: perda pela pele (perspiração e descamação da pele).

Geralmente, as perdas pela pele são ignoradas, pois são bem menores se comparadas com as perdas fecal e urinária, além de serem muito difíceis de medir. A absorção aparente, calculada como a diferença entre o cálcio consumido e o cálcio excretado nas fezes, pode também ser utilizada como indicador da biodisponibilidade. No entanto, subestima a absorção verdadeira de cálcio, visto que o cálcio fecal inclui quantidades substanciais de cálcio endógeno, além do cálcio não absorvido. Na prática, os métodos de balanço são entediantes e demandam muito tempo e gaiolas metabólicas em aço inoxidável para a coleta de urina (Figura 6.1). Além do mais, são sujeitos a grandes erros. Isso porque as medidas precisas de consumo e das perdas são difíceis e o tempo de coleta pode não estar bem estimado. Marcadores, como o azul-brilhante, o polietileno glicol e o cromo, podem ser usados para corrigir a coleta de fezes.

Figura 6.1 Gaiolas metabólicas para coleta de fezes e urina

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Uma modificação do método de balanço consiste na administração de uma solução de lavagem, a fim de limpar todo o trato digestório. Os indivíduos recebem uma refeição e, após 12h, a lavagem é repetida. O procedimento é repetido em outro dia, substituindo-se a refeição por água. O conteúdo total do efluente retal (após a ingestão da refeição ou da água) é coletado e a absorção líquida de cálcio, calculada pela seguinte equação: Absorção líquida de Ca = Ca ingerido – (Efluente Ca após a refeição – Efluente de Ca após a ingestão de água) Essa medida tem a vantagem de ser rápida e, portanto, menos cara do que a técnica tradicional. A absorção, em vez do balanço, é calculada, visto que a determinação acurada da excreção urinária não pode ser feita nesse curto período de tempo. É provável que a absorção no cólon esteja alterada, uma vez que a ação bacteriana estaria praticamente ausente, e o tempo de trânsito intestinal estaria muito mais rápido do que o habitual. Até que ponto isso pode interferir na absorção de cálcio, dependerá do quanto da substância é absorvido no cólon.

Técnicas de traçadores isotópicos Balanço O método de balanço pode ser realizado em conjunto com traçadores isotópicos. Uma dose oral de 47Ca é misturada com a dieta e dada numa única refeição. Após uma ou duas horas, um segundo traçador, por exemplo 45Ca, é dado por via intravenosa (IV). A absorção fracional ou verdadeira pode ser, então, calculada pela relação entre os dois traçadores em amostras de sangue e de urina coletadas algum tempo após a administração dos isótopos:                      Fração do traçador oral Absorção fracional = __________________________                      Fração do traçador IV Essa medida tem a vantagem de estimar a absorção de cálcio numa única amostra de sangue e de urina. A absorção total de cálcio pode, então, ser calculada multiplicando-se a ingestão de cálcio pela absorção fracional. O cálcio fecal de origem endógena é determinado pelo conteúdo fecal do traçador dado por via IV. O balanço de cálcio pode ser calculado pela equação:

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Balanço de Ca = Ca absorvido – (Ca fecal endógeno + Ca urinário) Pode-se também utilizar apenas um traçador radioativo na absorção fracional. Os animais em jejum de 12h são treinados a consumir 3g de dieta-teste dentro de uma hora. Após o treinamento, a dieta-teste é marcada com 45Ca (10µCi de 45Ca), conforme a Figura 6.2A. Para cada grupo-teste, existe um grupo-controle que receberá a mesma dieta-teste, mas sem o marcador radioativo. Uma hora após o grupo-teste receber a dose oral, o grupo-controle toma a dose por via intraperitoneal (IP) de 0,3mL de solução salina 0,9% com 10µCi de 45Ca (Figura 6.2B). Três horas após receber a dosagem IP, todos os animais retornam à dieta AIN-93G. Após 48h, os animais são eutanasiados e o fêmur direito é retirado e dissolvido em 3mL de ácido nítrico concentrado (Figura 6.2C). Alíquotas de 1mL são dissolvidas em 15mL de coquetel de cintilação e analisadas em aparelho cintilador (Figura 6.2D). A absorção fracional de 45Ca nos animais que recebem a dieta-teste é calculada com relação à quantidade de 45Ca no fêmur de cada animal que recebeu IP, alcançando 100% de absorção.

                  (% da dose oral de 45Ca) ÷ fêmur Absorção fracional = _______________________________________________                    (% da dose intraperitoneal de 45Ca) ÷ fêmur

Contagem de corpo inteiro A contagem de corpo inteiro pode ser realizada após a administração oral de 47Ca para estimar a biodisponibilidade de cálcio. A radioatividade no corpo é medida logo depois do oferecimento da dose e, novamente, após sete dias (Figura 6.3). A retenção no sétimo dia é expressa como porcentual da dose inicial. Esse método pode subestimar a absorção verdadeira de cálcio, uma vez que pode haver excreção do traçador absorvido após sete dias. Apesar disso, é um excelente método quando se quer comparar a biodisponibilidade de diferentes dietas. Infelizmente, os contadores de corpo inteiro suficientemente grandes para estudos com humanos estão pouco disponíveis e são muito caros.

Marcação isotópica de alimentos Esse procedimento de traçadores isotópicos para medir a biodisponibilidade de cálcio depende do pressuposto de que o traçador seja absorvido e utilizado da mesma maneira que o cálcio intrínseco do alimento. Os alimentos podem ser marcados intrínseca ou extrinsecamente. A marcação intrínseca consiste na introdução intrave-

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Figura 6.2 (A a D) Marcação extrínseca da dieta com 45Ca (A); administração da dose intraperitoneal de 45Ca (B); digestão ácida dos fêmures dos animais (C); e determinação da radioatividade nos fêmures dos animais (D)

Figura 6.3 (A e B) Contador de corpo inteiro

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nosa do traçador no animal (produtos de origem animal) ou na adição do traçador na solução nutritiva de plantas cultivadas em hidroponia (produtos de origem vegetal). Já a marcação extrínseca consiste na simples mistura de uma solução contendo o traçador com o alimento antes de ser administrado no indivíduo. A marcação extrínseca é mais simples, porém o traçador pode não se equilibrar completamente com o mineral no alimento e, consequentemente, apresentar diferente biodisponibilidade. A marcação intrínseca é mais trabalhosa e cara, porém se presume que o traçador seja quimicamente idêntico ao elemento estável no alimento. Estudos têm mostrado que, para produtos lácteos, a marcação extrínseca é válida, porém, para alimentos de origem vegetal, o resultado é variado. Por exemplo, na couve, os resultados entre marcação intrínseca e extrínseca foram similares. No entanto, no espinafre, que contém mais oxalato, com a marcação extrínseca a absorção de cálcio foi duas vezes maior do que na intrínseca. Uma desvantagem do uso de traçadores isotópicos para estudos com humanos é o risco de radiação ionizante, especialmente quando administrados em crianças, gestantes e nutrizes. Uma alternativa mais segura consiste no emprego de isótopos estáveis, porém seu uso é ainda limitado pelo alto custo e pela necessidade de equipamentos sofisticados, como o espectrômetro de massa, nem sempre disponíveis nos laboratórios. Essas técnicas podem ser perfeitamente utilizadas em estudos com animais, nos quais a radioatividade é medida nos ossos (fêmur ou tíbia) após a administração de uma dose do traçador na dieta. A absorção fracional pode ser medida pela relação do traçador nos ossos dos grupos que o receberam na dieta e o traçador nos ossos dos animais que tomaram uma dose via intraperitoneal.

Avaliação do estado nutricional O esqueleto funciona como uma enorme reserva de cálcio, para manter os níveis no fluido extracelular, fundamental para as funções celulares. Essa reserva é tão grande que a deficiência de cálcio na célula ou no tecido nunca é encontrada, pelo menos por motivos nutricionais. Entretanto, a redução nas reservas de cálcio resulta na diminuição da força óssea.4 O tamanho da reserva pode ser estimado usando a absorciometria de raios X de dupla energia (DEXA). Reservas baixas podem estar baixas devido a outras razões, que não as nutricionais, como, por exemplo, falta de atividade física adequada, perda de peso, deficiência de hormônios gonadais e várias doenças e seus tratamentos. O balanço de cálcio em seres humanos também tem sido usado em pesquisas para determinar as perdas de cálcio em função das quantidades ingeridas. O balanço negativo implica perdas ósseas. Essa técnica não se aplica aos indivíduos de vida livre em níveis habituais de cálcio.

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CAPÍTULO

7

Desenhos Experimentais para Avaliação dos Efeitos Funcionais dos Alimentos Gilberto Simeone Henriques

³³Introdução Certamente, o delineamento experimental é um componente fundamental para o sucesso de qualquer projeto de pesquisa. Se todos os aspectos do desenho experimental não forem completamente abordados, os pesquisadores podem chegar a conclusões inverídicas com base em protocolos de ensaio maldelineados e com indicadores de avaliação sem validação. Como consequência, ocorrerão prejuízos tanto no tempo despendido quanto no volume de recursos gastos, sem um produto de pesquisa confiável que contribua para a evolução dos estudos de Nutrição. Portanto, para planejar cientificamente projetos de impacto, é fundamental seguir as práticas padrão de laboratório durante a execução de experimentos válidos. Isso resulta em dados com significância estatística, passíveis de repetição em várias condições e possíveis de serem comparados a parâmetros diversos de avaliação.1,2 Os dados obtidos por abordagens experimentais ou miméticas devem ser de tal qualidade que possam ser publicados em revistas relevantes. Geralmente, elas são o principal modo de comunicação e arquivamento de dados experimentais em pesquisa.3 Este capítulo apresenta uma visão geral dos passos envolvidos na concepção das experiências em animais para a avaliação de compostos bioativos. Além disso, fornece algumas informações práticas que também devem ser consideradas durante o processo. Projetos envolvendo animais devem ser concebidos e realizados somente após considerar seu valor para a saúde humana ou animal, além dos avanços de conhecimento sobre os seres humanos ou animais versus os potenciais efeitos sobre o bem-estar dos animais. Para a avaliação da funcionalidade de nutrientes ou subs-

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tâncias bioativas, pode-se, de acordo com os recursos disponíveis, optar basicamente por duas grandes estratégias: ■■ Adoção de um modelo animal com características genéticas, ou induzidas experimentalmente, que simulem situações metabólicas e/ou doenças de interesse para a investigação na espécie humana. ■■ Modificação da dieta a ser ingerida pelos animais de experimentação, das mais diversas ordens e formas de composição – tanto no conteúdo de macronutrientes quanto no de micronutrientes. A escolha de uma dessas estratégias será determinante para a formulação do desenho experimental que, em última análise, deverá cotejar as variáveis de estudo, cujos vieses deverão ser controlados para que o nutriente ou a substância bioativa a ser testada possa ser avaliada quanto ao seu efeito fisiológico ou metabólico.4 No caso da primeira estratégia, os animais constituem o “meio biológico” no qual ocorrem as reações fisiológicas e metabólicas que ao final servirão de parâmetros para aferição do efeito de alguma substância ou modificação da dieta. Assim, conforme destacado no Capítulo 2, Animais Experimentais na Pesquisa em Nutrição, faz-se necessário que os animais reúnam condições ideais e sejam mantidos em ambiente controlado, a fim de atender aos padrões de qualidade sanitária e genética, mantendo a uniformidade dos parâmetros ambientais, genéticos e experimentais. Consequentemente, isso diminui a quantidade amostral de animais necessários para o experimento delineado.5 Quanto à segunda estratégia – modificar a dieta –, inúmeras possibilidades de variação se apresentam. No entanto, há que se atentar para a padronização da base da dieta e do equilíbrio da composição de nutrientes para que a dieta constitua-se um veículo, e não um interferente, sobre o componente que se deseja avaliar. Muitos experimentos demandam a utilização de rações semipurificadas, com a composição altamente definida, passível de validação bromatológica, que atendam a todas as necessidades nutricionais dos animais de experimentação. Esse procedimento, apesar de elevar o custo experimental, diminui significativamente erros e possibilidades de interferência de variáveis ambientais, geralmente chamados de ruídos (bias), os quais podem invalidar dados coletados após sua administração. Mais considerações sobre os detalhes de formulação, composição e análise de dietas para animais experimentais podem ser consultadas no Capítulo 2, Animais Experimentais na Pesquisa em Nutrição, e no Capítulo 3, Necessidades Nutricionais e Dietas Experimentais de Roedores de Laboratório. Em diversos protocolos, nos quais a dieta não seja um fator maior de impacto, admite-se o uso de dietas comerciais, desde que se mantenha o controle de qualidade sobre sua composição. No entanto, é imprescindível o controle na manipulação de dietas para avaliação da funcionalidade de compostos bioativos, como as vitaminas A, E e D, os ácidos graxos (p. ex., poli-insaturados), as frações flavonoi-

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des, os carotenoides, os taninos e diversos outros associados a funções protetoras das células, antioxidantes, cicatrizantes, substitutos de metabólitos intermediários, análogos hormonais e moduladores da absorção ou de combustíveis (p. ex., glicose).6 Em nossa abordagem, nosso foco principal será direcionado aos estudos que utilizam modelos experimentais de ratos e camundongos e levantam aspectos de grande interesse para a saúde humana, como a avaliação funcional de gorduras, do metabolismo da glicose e de nutrientes envolvidos com a osteoporose, o funcionamento do sistema imunológico e a proteção contra o câncer.

³³Avaliação funcional de lipídios – modelos de dislipidemia/ hipercolesterolemia Modelo de indução de hipercolesterolemia com colesterol purificado adicionado à dieta Um dos desenhos clássicos de indução de hipercolesterolemia é a administração direta de colesterol na forma purificada pela dieta. Em geral, a adição de 1% de colesterol purificado a uma base de dieta semipurificada do tipo AIN-93 já é suficiente, dentro de um período de duas semanas, para aumentar significativamente os níveis de colesterol de ratos (p. ex., Wistar ou Sprague Dawley) ou coelhos. As dietas são preparadas de modo a manter as características isoproteicas e isocalóricas e os animais devem ser submetidos a um período de adaptação de 3 dias consumindo dieta basal antes do início do experimento.7 Convém que o controle da lipemia seja feito pela dosagem do perfil plasmático de lipídios, coletando-se amostras de sangue, normamente da veia caudal (no caso de ratos) e da veia auricular (no caso de coelhos), na primeira e na segunda semanas. O plasma deve ser separado por centrifugação a 3.000rpm por 15min, em centrífuga comum, e testado com kits comerciais e leitura em espectrofotômetros UV/VIS. Os valores de colesterol total e triglicerídeos devem ser determinados por métodos enzimáticos.8 Em alguns estudos de balanço, pode-se também utilizar a dosagem de colesterol ou de outras frações lipídicas contidas nas fezes. Para tanto, elas deverão ser coletadas ao longo do experimento e levadas à secagem em estufa a 60°C durante 2 dias, trituradas e, então, submetidas à extração de lipídios. Outra maneira bastante eficiente de induzir a hiperlipidemia é a administração, por via intraperitoneal (IP), de Triton WR-1339®, também conhecido como tyloxapol, na dose de 300mg/kg de peso corporal, dissolvido em NaCl a 0,9%, e seguindo o modelo experimental desenvolvido por Mathur et al. (1964).9 Trata-se de um detergente não aniônico de estrutura polimérica, que dissolve os grânulos de gordura e facilita sua absorção, aumentando a superfície de contato com a bicamada lipídica da membrana da borda em escova e facilitando a absorção de

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ácidos graxos. Consequentemente, isso aumenta a probabilidade de saturação das lipoproteínas plasmáticas.10 Para a confirmação dos perfis hipercolesterolinêmicos, deve-se proceder ao monitoramento de marcadores dos lipídios séricos, coletando-se amostras de sangue dos animais após 5 dias de iniciado o protocolo experimental. Geralmente, coletam-se alíquotas de sangue pela veia caudal (no caso dos coelhos, uma via de escolha muito comum é a veia auricular), separando-se o plasma por centrifugação a 3.000rpm por 15min e testando-o com kits comerciais e leitura em espectrofotômetro UV-VIS. A seguir, os valores de colesterol total e triglicerídeos são determinados por métodos enzimáticos.8 O colesterol-HDL também pode ser determinado com o uso de kits comerciais, disponíveis com facilidade no mercado de produtos de análises clínicas. Os modelos experimentais de hipercolesterolemia pressupõem ainda análises post mortem, as quais podem gerar dados bastante significativos, sobretudo a análise histológica do tecido hepático. Sabidamente, alterações nos perfis plasmáticos de lipídios podem ocasionar impactos mais profundos no nível tecidual. O fígado, grande centralizador metabólico de macromoléculas, como proteínas e lipídios, é um órgão de grande plasticidade, capaz de sintetizar, alterar a composição e exportar lipoproteínas. Assim é, portanto, detentor de enzimas-chave para o colesterol. Nos protocolos experimentais mais comuns, os fígados são retirados após eutanásia, armazenados em frascos de formalina a 10% e encaminhados para a preparação histológica de lâminas. Após a preparação desses artefatos, a leitura pode ser feita de diversas maneiras, conforme o equipamento disponível ao pesquisador, sendo o mais popular o de microscopia óptica computadorizada, acoplado a um software de imagem capaz de fazer a captura e o tratamento das imagens obtidas. São possíveis diversas análises do tecido, como contagem de gotículas de gordura (esteatose hepática) e infiltração de células inflamatórias, além de identificação de substâncias oxidativas.

³³Modelos que abordam condições ligadas ao desenvolvimento de doenças e agravos não transmissíveis – DANT (resistência À insulina/hiperglicemia/diabetes melito/obesidade) Há diferentes tipos de modelos experimentais que se prestam à investigação dos efeitos metabólicos do diabetes melito e da obesidade. Entre eles, muitos estudos utilizam os ratos Wistar ou camundongos que se tornam diabéticos após injeção de fármacos como aloxana ou estreptozotocina por via IP. Ambas as substâncias têm alto nível de toxicidade para as células beta das ilhotas de Langerhans. A aloxana proporciona discreta redução glicêmica cerca de 30min após sua aplicação, como resultado de estimulação da secreção de insulina. Contudo, após 60min da injeção, ocorre hiperglicemia por decréscimo da insulinemia. Ela persis-

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I

Presidência da República Casa Civil Subchefia para Assuntos Jurídicos

DECRETO No 6.899, DE 15 DE JULHO DE 2009. Dispõe sobre a composição do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA, estabelece as normas para o seu funcionamento e de sua Secretaria-Executiva, cria o Cadastro das Instituições de Uso Científico de Animais – CIUCA, mediante a regulamentação da Lei no 11.794, de 8 de outubro de 2008, que dispõe sobre procedimentos para o uso científico de animais, e dá outras providências. O PRESIDENTE DA REPÚBLICA, no uso das atribuições que lhe confere o art. 84, incisos IV e VI, alínea “a”, da Constituição, e tendo em vista o disposto no art. 25 da Lei no 11.794, de 8 de outubro de 2008,  DECRETA: CAPITULO I DAS DISPOSIÇÕES PRELIMINARES E GERAIS  Art. 1o As atividades e projetos que envolvam a criação e utilização de animais de laboratório pertencentes ao filo Chordata, subfilo Vertebrata, exceto o homem, destinados ao ensino e à pesquisa científica ficam restritas ao âmbito de entidades de direito público ou privado, que serão responsáveis pela obediência aos preceitos da Lei no 11.794, de 8 de outubro de 2008, deste Decreto e de normas complementares, bem como pelas eventuais consequências ou efeitos advindos de seu descumprimento. § 1o As atividades e projetos de que trata este artigo são vedados a pessoas físicas em atuação autônoma e independente, ainda que mantenham vínculo empregatício ou qualquer outro com pessoas jurídicas. § 2o As instituições interessadas em realizar atividade prevista neste Decreto deverão requerer seu credenciamento junto ao Conselho Nacional de Controle e Experimentação Animal – CONCEA. 

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ANEXO

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Art. 2o Além das definições previstas na Lei no 11.794, de 2008, considera-se, para os efeitos deste Decreto: I – subfilo Vertebrata: animais cordados que têm, como características exclusivas, um encéfalo grande encerrado numa caixa craniana e uma coluna vertebral, excluindo os primatas humanos; II – métodos alternativos: procedimentos validados e internacionalmente aceitos que garantam resultados semelhantes e com reprodutibilidade para atingir, sempre que possível, a mesma meta dos procedimentos substituídos por metodologias que: a) não utilizem animais; b) usem espécies de ordens inferiores; c) empreguem menor número de animais; d) utilizem sistemas orgânicos ex vivos; ou e) diminuam ou eliminem o desconforto; III – atividades de pesquisa científica – todas aquelas relacionadas com ciência básica, ciência aplicada, desenvolvimento tecnológico, produção e controle de qualidade de drogas, medicamentos, alimentos, imunobiológicos, instrumentos, ou quaisquer outros testados em animais, conforme definido em regulamento próprio. Parágrafo único. O termo pesquisa científica adotado neste Decreto inclui as atividades de desenvolvimento tecnológico, de acordo com a definição constante do § 2o do art. 1o da Lei no 11.794, de 2008, e a do inciso III deste artigo.  CAPÍTULO II DO CONSELHO NACIONAL DE CONTROLE DE EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL – CONCEA  Seção I Da Natureza e Finalidade  Art. 3o O CONCEA, órgão integrante da estrutura do Ministério da Ciência e Tecnologia, é instância colegiada multidisciplinar de caráter normativo, consultivo, deliberativo e recursal, para coordenar os procedimentos de uso científico de animais.   Seção II Das Atribuições Art. 4o Compete ao CONCEA: I – formular e zelar pelo cumprimento das normas relativas à utilização humanitária e ética de animais com finalidade de ensino e pesquisa científica; II – credenciar instituições para criação ou utilização de animais com finalidade de ensino ou pesquisa científica; III – monitorar e avaliar a introdução de técnicas alternativas que substituam a utilização de animais em ensino ou pesquisa científica; IV – estabelecer e rever, periodicamente, as normas para uso e cuidados com animais para ensino e pesquisa científica, em consonância com as convenções internacionais das quais o Brasil seja signatário; V – estabelecer e rever, periodicamente, normas técnicas para instalação e funcionamento de centros de criação, de biotérios e de laboratórios de experimentação animal, bem como sobre as condições de trabalho em tais instalações;

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II

Presidência da República Casa Civil Subchefia para Assuntos Jurídicos LEI No 11.794, DE 8 DE OUTUBRO DE 2008. Mensagem de veto Regulamenta o inciso VII do § 1o do art. 225 da Constituição Federal, estabelecendo procedimentos para o uso científico de animais; revoga a Lei no 6.638, de 8 de maio de 1979; e dá outras providências O PRESIDENTE DA REPÚBLICA Faço saber que o Congresso Nacional decreta e eu sanciono a seguinte Lei: CAPÍTULO I DAS DISPOSIÇÕES PRELIMINARES Art. 1o A criação e a utilização de animais em atividades de ensino e pesquisa científica, em todo o território nacional, obedece aos critérios estabelecidos nesta Lei. § 1o A utilização de animais em atividades educacionais fica restrita a: I – estabelecimentos de ensino superior; II – estabelecimentos de educação profissional técnica de nível médio da área biomédica. § 2o São consideradas como atividades de pesquisa científica todas aquelas relacionadas com ciência básica, ciência aplicada, desenvolvimento tecnológico, produção e controle da qualidade de drogas, medicamentos, alimentos, imunobiológicos, instrumentos, ou quaisquer outros testados em animais, conforme definido em regulamento próprio. § 3o Não são consideradas como atividades de pesquisa as práticas zootécnicas relacionadas à agropecuária.

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ANEXO

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Art. 2o O disposto nesta Lei aplica-se aos animais das espécies classificadas como filo Chordata, subfilo Vertebrata, observada a legislação ambiental. Art. 3o Para as finalidades desta Lei entende-se por: I – filo Chordata: animais que possuem, como características exclusivas, ao menos na fase embrionária, a presença de notocorda, fendas branquiais na faringe e tubo nervoso dorsal único; II – subfilo Vertebrata: animais cordados que têm, como características exclusivas, um encéfalo grande encerrado numa caixa craniana e uma coluna vertebral; III – experimentos: procedimentos efetuados em animais vivos, visando à elucidação de fenônemos fisiológicos ou patológicos, mediante técnicas específicas e preestabelecidas; IV – morte por meios humanitários: a morte de um animal em condições que envolvam, segundo as espécies, um mínimo de sofrimento físico ou mental. Parágrafo único. Não se considera experimento: I – a profilaxia e o tratamento veterinário do animal que deles necessite; II – o anilhamento, a tatuagem, a marcação ou a aplicação de outro método com finalidade de identificação do animal, desde que cause apenas dor ou aflição momentânea ou dano passageiro; III – as intervenções não-experimentais relacionadas às práticas agropecuárias. CAPÍTULO II DO CONSELHO NACIONAL DE CONTROLE DE EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL – CONCEA Art. 4o Fica criado o Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA. Art. 5o Compete ao CONCEA: I – formular e zelar pelo cumprimento das normas relativas à utilização humanitária de animais com finalidade de ensino e pesquisa científica; II – credenciar instituições para criação ou utilização de animais em ensino e pesquisa científica; III – monitorar e avaliar a introdução de técnicas alternativas que substituam a utilização de animais em ensino e pesquisa; IV – estabelecer e rever, periodicamente, as normas para uso e cuidados com animais para ensino e pesquisa, em consonância com as convenções internacionais das quais o Brasil seja signatário; V – estabelecer e rever, periodicamente, normas técnicas para instalação e funcionamento de centros de criação, de biotérios e de laboratórios de experimentação animal, bem como sobre as condições de trabalho em tais instalações; VI – estabelecer e rever, periodicamente, normas para credenciamento de instituições que criem ou utilizem animais para ensino e pesquisa; VII – manter cadastro atualizado dos procedimentos de ensino e pesquisa realizados ou em andamento no País, assim como dos pesquisadores, a partir de informações remetidas pelas Comissões de Ética no Uso de Animais – CEUAs, de que trata o art. 8o desta Lei; VIII – apreciar e decidir recursos interpostos contra decisões das CEUAs; IX – elaborar e submeter ao Ministro de Estado da Ciência e Tecnologia, para aprovação, o seu regimento interno; X – assessorar o Poder Executivo a respeito das atividades de ensino e pesquisa tratadas nesta Lei. Art. 6o O CONCEA é constituído por:

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A Acetaminofeno, 12 Ácido, 12

- desenhos experimentais para avaliação dos efeitos funcionais dos, 133-152 - - de câncer, 140

- fólico, 83

- - de interações entre nutrientes, sistema imunológico e mecanismos inflamatórios, 147

- - marcadores, 83

- - de lipídios, 135

- acetilsalicílico (AAS), 12

- - - bioquímicos, 83 - - - isotópicos, 83 Administração, vias de (ver Vias de administração) Agentes patogênicos específicos, animais isentos de, 8 Água, 53 - vias de administração da dieta e da, 51 - - alimentação ad libitum versus ingestão controlada, 51 - - gavagem, 52AIN-93G, dieta, modificada, para ensaio biológico de qualidade proteica, 95 Akeson & Stachman, método de, 93 Alimentação ad libitum versus ingestão controlada, 51 Alimentos, 133

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- - de osteoporose e atrofia musculoesquelética, 142 - - que abordam condições ligadas ao desenvolvimento de doenças e agravos não transmissíveis, 136 - marcação isotópica de, 114 American Institute of Nutrition (AIN), 54 Aminoácidos, 100 - digestibilidade de, 100 - essenciais, teor de alguns, do arroz e do feijão, 106 - padrões de, 92 Analgésicos, anti-inflamatórios e, para camundongos, 12 Anfíbios, 19 Animal(is), 1

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Índice

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- bioterismo e pesquisa com, 1-24

- silvestres, 28

- - a prática da eutanásia e a finalização humanitária, 17

Animais experimentais, 25-46

- - biossegurança em biotérios e laboratórios de experimentação, 7

- - modelos induzidos por cirurgia, 40

- - controle da qualidade em biotérios e laboratórios de experimentação, 5

- - - de cafeteria, 37

- - ética na pesquisa, 10 - - - coleta de sangue (pequenos roedores), 13

- na pesquisa em nutrição, 25 - - modelos induzidos por dietas, 37 - - - de depleção e repleção, 38 - - - hiperlipídica ou hiperglicídica, 38 - - modelos induzidos por fármacos, 39

- - - entidades competentes quanto ao uso de animais de laboratório, 15

- - - diabetes melito, 39

- - - vias de administração e coletas de fluidos, 12

- - - síndrome metabólica, 40

- - - vias de administração, pequenos roedores, 12

- - modificados geneticamente, 33

- - importância do, e do bem-estar animal, 2

- - conceitos e definições, 26

- convencionais, 8 - crescimento dos, com base no, 101 - - PER, 101 - - NPR, 103 - de laboratório, 15, 17, 29 - - a prática da eutanásia e a finalização humanitária em, 17 - - entidades competentes quanto ao uso de, 15 - - fatores que podem afetar o bem-estar de, 4

- - - resistência à insulina, 39 - - modelos negativos, 41 - utilização de modelos animais, 25 - - - e suas características, 27 - - - tipos de populações de animais e uso na experimentação, 28 - - critérios para escolha, 32 - - de laboratório convencionais, 29 - - origem das espécies mais utilizadas, 30 - - quando usar um modelo animal, 31 - - requisitos para um modelo animal, 31 Anti-inflamatórios e analgésicos, 12 - para camundongos, 12

- - gaiolas aramadas para, 48

- para ratos, 12

- - padrão sanitário dos, 41

AOAC, método, 121

- - status sanitário dos, 43

Atrofia musculoesquelética, modelos de avaliação experimental de osteoporose e, 142

- de zoológicos, 19 - digestão ácida dos fêmures dos, 115 - domésticos, 29 - excitabilidade dos, 5 - fêmures dos, determinação da radioatividade nos, 115 - selvagens de vida livre, 19

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Aves, 19

B Balanço, 96 - de nitrogênio, 71

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- - métodos com base no, 96

- ética na pesquisa, 10

- - - digestibilidade aparente e verdadeira, 98

- - coleta de sangue (pequenos roedores), 13

- - - digestibilidade de aminoácidos, 100 - - - valor biológico, 97

- - entidades competentes quanto ao uso de animais de laboratório, 15

- de cálcio, técnica de, 112

- - vias de administração, 12

- metabólico, zinco, 125

- - - e coletas de fluidos, 12

- químico, 67

- - - pequenos roedores, 12

Bem-estar animal, 2

- importância e o bem-estar animal, 2

- fatores que podem afetar o, 4

Butorfanol, 12

- importância do bioterismo e do, 2 Biodisponibilidade de minerais, 111-131 - métodos de determinação da, 118 - - de cálcio, 111 - - de cobre, 128 - - - avaliação do estado nutricional, 129 - - - técnicas isotópicas, 128 - - de ferro, 120 - - - avaliação do estado nutricional, 124 - - - depleção e repleção, 121 - - - in vitro, 122 - - - técnicas radioisotópicas, 120 - - de magnésio, 118 - - de zinco, 124 - - - balanço metabólico, 125 - - flúor, 129 - - iodo, 129 - - selênio, 129 Biossegurança em biotérios e laboratórios de experimentação com animais, 7 Bioterismo e pesquisa com animais, 1-24 - a prática da eutanásia e a finalização humanitária, 17 - biossegurança em biotérios e laboratórios de experimentação, 7 - controle da qualidade em biotérios e laboratórios de experimentação, 5

Nutricao Experimental - cap-09 - Indice.indd 173

C Cães, 19 Cafeteria, 37 - dieta de, 60 - - modelos animais induzidos por, 37 Cálcio, 74 - absorção líquida de, 113 - administração da dose intraperitoneal de, 115 - balanço de, 112 - dieta com, marcação extrínseca da, 115 - ionizado, 117 - marcadores, 75 - - bioquímicos, 74 - - isotópicos, 75 - métodos de determinação da biodisponibilidade de, 111 - - avaliação do estado nutricional, 116 - - marcação isotópica de alimentos, 114 - - técnicas, 113 - - - de balanço, 112 - - - de traçadores isotópicos, 113 Camundongo(s), 29 - anti-inflamatórios e analgésicos para, 12 - Apo E, 35

C o p y r i g h t ©2 0 1 4E d i t o r aR u b i oL t d a . C o s t ae t a l . Nu t r i ç ã oE x p e r i me n t a l –T e o r i aeP r á t i c a . Al g u ma sp á g i n a s , n ã os e q u e n c i a i s , ee mb a i x ar e s o l u ç ã o .

Índice 173

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- gigante, 35

Comportamentos estereotipados, 5

- NOD17, 35

Compostos bioativos, 123

- nude, 35

CONCEA, 15

- Oncomice, 35

Conselho Federal de Medicina Veterinária (ver CFMV)

Câncer, modelos de avaliação experimental de, 140

Contador de corpo inteiro, 115, 120

Carboidratos, 71

Contaminantes em potencial, 53

- marcadores, 72

- biológicos, 53

- - bioquímicos, 71

- químicos, 53

- - isotópicos, 72

Corpo inteiro, 115

Carbono, 69

- contador de, 115, 120

Cavalos, 19

Crescimento dos animais, 101

Células, 74

- marcadores, 70

- Caco-2, modelo de cultura de, 123

- métodos com base no, 101

- vermelhas, 74

- - NPR, 103

- - incorporação, retenção do isótopo nas, 74, 120

- - PER, 101

CFMV, 18

Cultura de células Caco-2, modelo de, 123

Criação, biotérios de (ver Bioterismo)

Ciência, representantes da, 16 Cirurgia, modelos induzidos por, 40 Cobaia, 29 COBEA (ver Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório) Cobre, métodos de determinação da biodisponibilidade de, 128 - avaliação do estado nutricional, 129 - técnicas isotópicas, 128 Coelho(s), 19, 29 Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (ver COBEA) Colesterol, modelo de indução de hipercolesterolemia com, purificado adicionado à dieta, 135 Coleta(s), 12 - de fezes e urina, gaiolas metabólicas para, 112 - de fluidos, vias de administração e, 12 - de sangue (pequenos roedores), 13

Nutricao Experimental - cap-09 - Indice.indd 174

D Depleção, repleção e, 60 - de ferro, 121 - dietas de, 60 - métodos de, 67 Desenhos experimentais para avaliação dos efeitos funcionais dos alimentos, 133-152 - avaliação funcional de lipídios, 135 - modelos de avaliação experimental de câncer, 140 - modelos de interações entre nutrientes, sistema imunológico e mecanismos inflamatórios, 147 - modelos de avaliação experimental de osteoporose e atrofia musculoesquelética, 142 - modelos que abordam condições ligadas ao desenvolvimento

C o p y r i g h t ©2 0 1 4E d i t o r aR u b i oL t d a . C o s t ae t a l . Nu t r i ç ã oE x p e r i me n t a l –T e o r i aeP r á t i c a . Al g u ma sp á g i n a s , n ã os e q u e n c i a i s , ee mb a i x ar e s o l u ç ã o .

174 Nutrição Experimental – Teoria e Prática

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de doenças e agravos não transmissíveis, 136 Desenvolvimento de doenças, modelos experimentais que abordam condições ligadas ao, 136 Dexametazona, 12 Diabetes melito, 39, 136 Dieta(s), 114 - AIN-93G modificada, para ensaio biológico de qualidade proteica, 95 - com cálcio, 115 - experimentais, necessidades nutricionais e, de roedores de laboratório, 47-64 - - água, 53 - - composição das dietas, 61 - - - centesimal, 61 - - - modificadas da AIN-93G, 59, 95 - - - padrão e uma dieta hiperlipídica, 62 - - contaminantes em potencial, 53

- - - isoproteica e isocalórica, 57 - - preparação e estocagem de dietas, 50 - - recomendação nutricional, 54 - - tipos de formulação de dietas, 49 - - - comercial, 50 - - - purificada, 49 - - - quimicamente definida, 49 - - vias de administração da dieta e da água, 51 - - - alimentação ad libitum versus ingestão controlada, 51 - - - gavagem, 52 - modelo de indução de hipercolesterolemia com colesterol purificado adicionado à, 135 - modelos animais induzidos por, 37 - - de cafeteria, 37 - - de depleção e repleção, 38 - - hiperlipídica ou hiperglicídica, 38

- - - biológicos, 53

Digestão ácida dos fêmures dos animais, 115

- - - químicos, 53

Digestibilidade, 100

- - de depleção, 60

- aparente e verdadeira, 98

- - de linhaça, 60

- de aminoácidos, 100

- - dieta-controle, 60

- in vitro, 93

- - fatores que afetam as necessidades nutricionais, 47

- verdadeira, ensaio biológico para determinar a, 99

- - - estágio da vida, 48

Dislipidemia, 135

- - - genética, 47

Doenças, desenvolvimento de, modelos que abordam condições ligadas ao, 136

- - - impactos ambientais, 48 - - - interações entre nutrientes, 49 - - - status microbiológico, 48 - - forma física da dieta, 53

E

- - modificadas, 57, 59, 95

Elementos-traço, 56

- - - de cafeteria, 60

Enriquecimento ambiental, 5

- - - hipercolesterolemiante, 60

Ensaio biológico, 102

- - - hiperlipídica, 62

- de qualidade proteica, dieta AIN-93G modificada para, 95

- - - isenta de ferro, 59

Nutricao Experimental - cap-09 - Indice.indd 175

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Índice 175

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- para determinar a digestibilidade verdadeira, 99

- resistência à insulina, 39

- para determinar o NPR, 103

Fêmures dos animais, 115

- para determinar o PER, 102

- determinação da radioatividade nos, 115

Entidades competentes quanto ao uso de animais de laboratório, 15 Enxofre, 69 Escore químico ou cômputo químico, 91 Estado nutricional, 129

- síndrome metabólica, 40

- digestão ácida dos, 115 Ferritina, 124 Ferro, 73

- - do cálcio, 116

- avaliação do estado nutricional de, conforme as reservas corporais, 125

- - do cobre, 129

- dialisável, fluxograma de, 122

- - do ferro, 124

- dieta isenta de, 59

- - - conforme as reservas corporais, 125

- marcadores, 74

- - do magnésio, 119

- - bioquímicos, 73

- - do zinco, 127

- - isotópicos, 74

- proteico, 70

- métodos de determinação da biodisponibilidade de, 120

- avaliação do, 125

Ética na pesquisa com animais, 10 - coleta de sangue (pequenos roedores), 13

- - avaliação do estado nutricional, 124

- entidades competentes quanto ao uso de animais de laboratório, 15

- - in vitro, 122

- vias de administração, 12 - - e coletas de fluidos, 12

- - - modelo de cultura de células Caco-2, 123

- - pequenos roedores, 12

- - - solubilidade em HCl diluído, 122

Eutanásia, 19

- - técnicas radioisotópicas, 120

- a prática da, e a finalização humanitária, 17

Fezes, 48

- métodos de, recomendados ou aceitos sob restrição para várias espécies de animais, 19 Excitabilidade dos animais, 5 Experimentação com animais (ver Animais experimentais)

F

- - depleção e repleção, 121 - - - ferro dialisável, 122

- coleta de, e urina, gaiolas metabólicas para, 112 Fibra, 56 Fluidos, coleta de, vias de administração e, 12 Flúor, métodos de determinação da biodisponibilidade do, 129 Formulação de dietas, tipos de, 49 - comercial, 50

Fármacos, modelos induzidos por, 39

- purificada, 49

- diabetes melito, 39

- quimicamente definida, 49

Nutricao Experimental - cap-09 - Indice.indd 176

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176 Nutrição Experimental – Teoria e Prática

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Frasco coletor de urina, gaiola metabólica com, 97

G Gaiola(s), 48 - aramadas para animais de laboratório, 48

- estáveis, 69, 74, 126 - - abundância natural de, 69 - incorporação do, nas células vermelhas, 74, 120

L Laboratório, animais de, 29

- metabólica(s), 112

- biotérios, 5

- - com frasco coletor de urina, 97

- - biossegurança em, 7

- - para coleta de fezes e urina, 112

- - controle da qualidade em, 5

Gatos, 19

- convencionais, 29

Gavagem, administração por, 12, 52

- entidades competentes quanto ao uso de, 15

Germ-free, 8 Gnotobióticos, 8, 42 Grupo-teste, 102

H

- fatores que podem afetar o bem-estar de, 4 - gaiolas aramadas para, 48 - padrão sanitário dos, 41

Hamster, 29

- roedores, necessidades nutricionais e dietas experimentais de, 47-64

Hemoglobina, 121

- - água, 53

Hidrogênio, 69

- - composição das dietas, 61

Hipercolesterolemia, 135

- - - centesimal, 61

- modelo de indução de, com colesterol purificado adicionado à dieta, 135

- - - modificadas da AIN-93G, 59

Hiperglicemia, 136

- - contaminantes em potencial, 53

Hormônios suprarrenais, 5 Hsu, método de, et al., 94 Huruya, método de, et al., 94

I

- - - padrão e uma dieta hiperlipídica, 62 - - - biológicos, 53 - - - químicos, 53 - - de depleção, 60 - - de linhaça, 60 - - dieta-controle, 60

Índice glicêmico, 72

- - fatores que afetam as, 47

Ingestão controlada, alimentação ad libitum versus, 51

- - - estágio da vida, 48

Insulina, resistência à, 39, 136

- - - impactos ambientais, 48

Iodo, biodisponibilidade do, 129

- - - interações entre nutrientes, 49

Isolador standard safety, 42

- - - status microbiológico, 48

Isótopo(s), 69

- - forma física da dieta, 53

Nutricao Experimental - cap-09 - Indice.indd 177

- - - genética, 47

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Índice 177

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- - - de cafeteria, 60

- métodos de determinação da biodisponibilidade de, 118

- - - hipercolesterolemiante, 60

- - do estado nutricional, 119

- - - hiperlipídica, 62

- - técnicas de traçadores isotópicos, 118

- - - isenta de ferro, 59

Mamíferos, 19

- - - isoproteica e isocalórica, 57

- criados para extração de pelos, 20

- - preparação e estocagem de dietas, 50

- marinhos, 19

- - recomendação nutricional, 54 - - tipos de formulação de dietas, 49

Marcadores bioquímicos e isotópicos em pesquisa nutricional, 65-88

- - - comercial, 50

- dos macronutrientes, 70

- - - purificada, 49

- - carboidratos, 71

- - - quimicamente definida, 49

- - lipídios, 73

- - vias de administração da dieta e da água, 51

- - proteínas, 70

- - - alimentação ad libitum versus ingestão controlada, 51

- - minerais, 73

- - - gavagem, 52

- - - ferro, 73

- status sanitário dos, 43

- - - magnésio, 76

Lei Arouca, 15

- - - selênio, 77

Linhaça, dieta de, 60

- - - zinco, 75

Lipídios, 56, 73

- - vitaminas, 77

- avaliação funcional de, 135

- - - A, 77

- marcadores, 73

- - - ácido fólico, 83

- - bioquímicos, 73

- - - B12, 84

- - modificadas, 57

- - isotópicos, 73

Marcação isotópica de alimentos, 114

- dos micronutrientes, 73 - - - cálcio, 74

- - - C, 81 - - - D, 79

M

- - - E, 79

Macronutrientes, marcadores bioquímicos e isotópicos dos, 70

- - - K, 80

- carboidratos, 71

- - - piridoxina, 82

- lipídios, 73

- - - tiamina (vitamina B1), 81

- proteínas, 70

- métodos de avaliação, 67

Magnésio, 76

- - balanço químico, 67

- marcadores, 76

- - de depleção e repleção, 67

- - bioquímicos, 76

- - in vitro, 67

- - isotópicos, 76

- - isótopos estáveis, 69

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- - - niacina, 82

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178 Nutrição Experimental – Teoria e Prática

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- - relação dose-efeito, 68

- - escore químico ou cômputo químico, 91

Médico-veterinário, 16

- - monoenzimático, 93

Membrana, 123

- - multienzimáticos, 93

- apical, 123

- in vivo, 94

- basolateral, 123

- - com base na retenção de nitrogênio, 105

- - radioisótopos, 69

Método(s), 101 (ver também Técnica) - AOAC, 121 - de Akeson & Stachman, 93 - de depleção e repleção, 67 - de determinação da biodisponibilidade de minerais, 111 - - de cálcio, 111 - - de cobre, 128 - - de ferro, 120 - - de magnésio, 118 - - de zinco, 124 - - flúor, 129 - - iodo, 129 - - selênio, 129 - de eutanásia recomendados ou aceitos sob restrição para várias espécies de animais, 19 - de Furuya et al., 94 - de Hsu et al., 94 - fecal, 101 - ileal, 101 - in vitro, 67 - NPR, 95 - PER, 101 Métodos de avaliação da qualidade proteica, 91 - associação entre método in vivo e in vitro, 106

- - - utilização proteica líquida, 105 - - com base no balanço de nitrogênio, 96 - - - balanço de nitrogênio, 96 - - - digestibilidade aparente e verdadeira, 98 - - - digestibilidade de aminoácidos, 100 - - - valor biológico, 97 - - com base no crescimento dos animais, 101 - - - NPR, 103 - - - PER, 101 Microbiota, 8 - animais que possuem, indefinida, 8 Micronutrientes, marcadores bioquímicos e isotópicos dos, 73 - minerais, 73 - - cálcio, 74 - - ferro, 73 - - magnésio, 76 - - selênio, 77 - - zinco, 75 - vitaminas, 77 - - A, 77 - - ácido fólico, 83 - - B12, 84 - - C, 81

- in vitro, 91

- - D, 79

- - com base na simulação de sistemas digestivos, 94

- - E, 79

- - digestibilidade in vitro, 93

- - niacina, 82

Nutricao Experimental - cap-09 - Indice.indd 179

- - K, 80

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Índice 179

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- - piridoxina, 82

- composição da mistura de, 55

- - tiamina (vitamina B1), 81 Minerais, 56

Mistura arroz, cálculo do escore químico da, e feijão, 107

- biodisponibilidade de, 111-131

Modelo(s) animal(is), 39

- - de cálcio, 111

- a utilização de, 25

- - - avaliação do estado nutricional, 116

- conceitos e definições, 26

- - - marcação isotópica de alimentos, 114

- - e suas características, 27

- - - métodos de balanço, 112

- - tipos de populações de animais e uso na experimentação, 28

- - - técnicas de traçadores isotópicos, 113

- critérios para escolha, 32

- - de cobre, 128

- e biodisponibilidade de zinco, 127

- - - avaliação do estado nutricional, 129

- e sua aplicabilidade em estudos experimentais, 27

- - - técnicas isotópicas, 128 - - de ferro, 120 - - - avaliação do estado nutricional, 124 - - - depleção e repleção de ferro, 121 - - - dialisável, 122

- de laboratório convencionais, 29

- induzidos, 37 - - por cirurgia, 40 - - por dietas, 37 - - - de cafeteria, 37

- - - métodos in vitro, 122

- - - de depleção e repleção, 38

- - - modelo de cultura de células Caco-2, 123

- - - hiperlipídica ou hiperglicídica, 38 - - por fármacos, 39

- - - solubilidade em HCl diluído, 122

- - - diabetes melito, 39

- - - técnicas radioisotópicas, 120

- - - resistência à insulina, 39

- - de magnésio, 118

- - - síndrome metabólica, 40

- - - do estado nutricional, 119

- negativos, 41

- - - técnicas de traçadores isotópicos, 118

- origem das espécies mais utilizadas, 30

- - de zinco, 124

- requisitos para um, 31

- quando usar um, 31

- - - aparência no plasma, 126 - - - avaliação do estado nutricional, 127 - - - balanço metabólico, 125

N

- - - relação molar fitato, 128

Necessidades nutricionais e dietas experimentais de roedores de laboratório, 47-64

- - - técnicas isotópicas, 125

- água, 53

- - flúor, 129

- composição das dietas, 61

- - iodo, 129

- - centesimal, 61

- - selênio, 129

- - modificadas da AIN-93G, 59, 95

- - - modelos animais, 127

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180 Nutrição Experimental – Teoria e Prática

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- - padrão e uma dieta hiperlipídica, 62

- - métodos com base no, 96

- contaminantes em potencial, 53

- - - digestibilidade aparente e verdadeira, 98

- - biológicos, 53 - - químicos, 53 - de depleção, 60 - de linhaça, 60 - dieta-controle, 60 - fatores que afetam as necessidades nutricionais, 47 - - estágio da vida, 48 - - genética, 47 - - impactos ambientais, 48 - - interações entre nutrientes, 49 - - status microbiológico, 48

- - - digestibilidade de aminoácidos, 100 - - - valor biológico, 97 - fecal, 100 - métodos com base na retenção de, 105 NPR, 103 - ensaio biológico para determinar o, 103 - método, 103 - valores de PER e, de diversas fontes proteicas, 105

- modificadas, 57, 59, 95

Nutrição, animais experimentais na pesquisa em, modelos induzidos por dietas, 37

- - de cafeteria, 60

- modelos induzidos, 37

- - hipercolesterolemiante, 60

- - por cirurgia, 40

- - hiperlipídica, 62

- - por dietas, 37

- - isenta de ferro, 59

- - - de cafeteria, 37

- - isoproteica e isocalórica, 57

- - - de depleção e repleção, 38

- preparação e estocagem de dietas, 50

- - - hiperlipídica ou hiperglicídica, 38

- recomendação nutricional, 54

- - por fármacos, 39

- tipos de formulação de dieta, 49

- - - diabetes melito, 39

- - comercial, 50

- - - resistência à insulina, 39

- forma física da dieta, 53

- - purificada, 49

- - - síndrome metabólica, 40

- - quimicamente definida, 49

- modelos negativos, 41

- vias de administração da dieta e da água, 51

- modificados geneticamente, 33 Nutrientes, 147

- - alimentação ad libitum versus ingestão controlada, 51

- interações entre, 49

- - gavagem, 52 Net protein ratio (ver NPR) Niacina, 82

- modelos experimentais de interações entre, sistema imunológico e mecanismos inflamatórios, 147

- marcadores bioquímicos, 82

O

Nitrogênio, 69

Obesidade, 136

- balanço de, 71

Osteocalcina, 117

Nutricao Experimental - cap-09 - Indice.indd 181

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Índice 181

09-07-2014 17:11:50


Osteoporose, modelos de avaliação experimental de, e atrofia musculoesquelética, 142 Oxigênio, 69

P

- - por dietas, 37 - - - de cafeteria, 37 - - - de depleção e repleção, 38 - - - hiperlipídica ou hiperglicídica, 38 - - por fármacos, 39 - - - diabetes melito, 39

Padrão sanitário dos animais de laboratório, 41

- - - resistência à insulina, 39

Peixes, 19

- modelos negativos, 41

Pelos, mamíferos criados para extração de, 20

- modificados geneticamente, 33

PER, 101

- - - síndrome metabólica, 40

Pesquisa nutricional, marcadores bioquímicos e isotópicos em, 65-88

- ensaio biológico para determinação do, 102

- dos macronutrientes, 70

- método, 101

- - lipídios, 73

- valores de, e NPR de diversas fontes proteicas, 105

- - proteínas, 70

Peso corporal, 122

- - minerais, 73

Pesquisa, bioterismo e, com animais, 1-24 - a prática da eutanásia e a finalização humanitária, 17 - biossegurança em biotérios e laboratórios de experimentação, 7 - controle da qualidade em biotérios e laboratórios de experimentação, 5

- - carboidratos, 71

- dos micronutrientes, 73 - - - cálcio, 74 - - - ferro, 73 - - - magnésio, 76 - - - selênio, 77 - - - zinco, 75 - - vitaminas, 77 - - - A, 77

- ética na pesquisa, 10

- - - ácido fólico, 83

- - coleta de sangue (pequenos roedores), 13

- - - B12, 84

- - entidades competentes, 15

- - - D, 79

- - vias de administração, 12

- - - E, 79

- - - e coletas de fluidos, 12

- - - K, 80

- - - pequenos roedores, 12

- - - niacina, 82

- importância e o bem-estar animal, 2

- - - piridoxina, 82

Pesquisa em Nutrição, animais experimentais na, 37

- - - tiamina (vitamina B1), 79

- modelos induzidos, 39

- - balanço químico, 67

- - por cirurgia, 40

- - de depleção e repleção, 67

Nutricao Experimental - cap-09 - Indice.indd 182

- - - C, 81

- métodos de avaliação, 67

C o p y r i g h t ©2 0 1 4E d i t o r aR u b i oL t d a . C o s t ae t a l . Nu t r i ç ã oE x p e r i me n t a l –T e o r i aeP r á t i c a . Al g u ma sp á g i n a s , n ã os e q u e n c i a i s , ee mb a i x ar e s o l u ç ã o .

182 Nutrição Experimental – Teoria e Prática

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- - in vitro, 67

- - métodos in vivo, 94

- - isótopos estáveis, 69

- - - com base na retenção de nitrogênio, 105

- - radioisótopos, 69 - - relação dose-efeito, 68 Piridoxina, 82 - marcadores bioquímicos, 82 - marcadores isotópicos, 82 Plasma, 126 Populações de animais e uso na experimentação, 28

- - - com base no balanço de nitrogênio, 96 - - - com base no crescimento dos animais, 101

R

Prednisona, 12

Radioatividade, determinação da, nos fêmures dos animais, 115

Primatas não humanos, 19

Radioisótopo(s), 69, 75

Protein efficiency ratio (ver NPR)

- técnica de, 125

Proteína(s), 56, 70

Raposas, 20

- avaliação da qualidade das (ver Qualidade proteica, avaliação da)

Rato(s), 29

- marcadores, 71 - - bioquímicos, 70

- anti-inflamatórios e analgésicos para, 12

- - isotópicos, 71

- diabéticos, 36

- somática, 70

- gordos, 36

- visceral, 70

- ob/ob, 35

- amarelos, 36

- obesos, 36

Q Qualidade, 5 - controle de, em biotérios e laboratórios de experimentação com animais, 5 - proteica, avaliação da, 89-110 - - associação entre método in vivo e in vitro, 106

- SHR, 35 - Tubby, 36 - Zucker, 35 Razão da eficiência proteica (ver PER) Razão proteica líquida (ver NPR) Reabsorção óssea, 75 Relação, 128

- - método in vitro, 91

- dose-efeito, 68

- - - com base na simulação de sistemas digestivos, 94

- molar fitato, 128

- - - digestibilidade in vitro, 93

- de ferro, 121

- - - escore químico ou cômputo químico, 91

- métodos de, 67

Repleção, depleção e, 67

- - - monoenzimático, 93

- modelos animais induzidos por dietas de, 37

- - - multienzimáticos, 93

Representantes, 16

Nutricao Experimental - cap-09 - Indice.indd 183

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Índice 183

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- da Ciência, 16

- - comercial, 50

- da sociedade civil organizada, 16

- - purificada, 49

Répteis, 19

- - quimicamente definida, 49

Reservas corporais, avaliação do estado nutricional de ferro conforme as, 125

- vias de administração da dieta e da água, 51

Resistência à insulina, 39, 136

- - alimentação ad libitum versus ingestão controlada, 51

Roedores de laboratório, necessidades nutricionais e dietas experimentais de, 47-64

- - gavagem, 52 Ruminantes, 20

- água, 53 - composição das dietas, 61 - - centesimal, 61 - - modificadas da AIN-93G, 59, 95 - - padrão e uma dieta hiperlipídica, 62 - contaminantes em potencial, 53 - - biológicos, 53 - - químicos, 53 - de depleção, 60 - de linhaça, 60 - dieta-controle, 60

S Sangue, coleta de (pequenos roedores), 13 SBCAL (v. Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório) Selênio, 77 - marcadores, 77 - - bioquímicos, 77 - - isotópicos, 77 - métodos de determinação da biodisponibilidade do, 129

- fatores que afetam as necessidades nutricionais, 47

Síndrome metabólica, 40

- - estágio da vida, 48

- digestivos, 94

- - genética, 47 - - impactos ambientais, 48 - - interações entre nutrientes, 49 - - status microbiológico, 48

Sistema(s), 147 - imunológico, 147 Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório, 15

- forma física da dieta, 53

Sociedade civil organizada, representantes da, 16

- modificadas, 57, 59, 95

Solubilidade em HCl diluído, 122

- - de cafeteria, 60

Specific patogen free, 8

- - hipercolesterolemiante, 60

Status sanitário dos animais de laboratório, 43

- - hiperlipídica, 62 - - isenta de ferro, 59 - - isoproteica e isocalórica, 57

Suínos, 20

- preparação e estocagem de dietas, 50

T

- recomendação nutricional, 54

Técnica(s), 113 (ver também Métodos)

- tipos de formulação de dieta, 49

- de balanço de cálcio, 112

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184 Nutrição Experimental – Teoria e Prática

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- de traçadores isotópicos, 118

Visões, 20

- - cálcio, 113

Vitamina(s), 56, 77

- - magnésio, 118

- A, 77

- isotópicas, 125

- - marcadores, 78

- - cobre, 128

- B1, tiamina, 81

- - de radioisótopo, 125

- B3, niacina, 82

- - isótopos estáveis, 126

- B6, piridoxina, 82

- - zinco, 125

- B9, ácido fólico, 83

- radioisotópicas, 120

- B12, 84

Tiamina, 81

- C, 81

- marcadores bioquímicos, 81

- - marcadores, 81

Traçadores isotópicos, técnicas de, 118

- composição da mistura de, 55

- cálcio, 113

- D, 79

- magnésio, 118

- E, 79 - - marcadores, 80

U Urina, 97 - coleta de fezes e, gaiolas metabólicas para, 112 - frasco coletor de, gaiola metabólica com, 97

V

- - - bioquímicos, 79 - - - isotópicos, 80 - K, 80

Z Zinco, 75 - marcadores, 76 - - bioquímicos, 75

Veterinário, 16

- - isotópicos, 76

Vias de administração, 12

- métodos de determinação da biodisponibilidade do, 124

- da dieta e da água, 51 - - alimentação ad libitum versus ingestão controlada, 51

- - aparência no plasma, 126

- - gavagem, 52

- - balanço metabólico, 125

- e coletas de fluidos, 12

- - modelos animais, 127

- intramuscular, 13

- - relação molar fitato, 128

- intraperitonial, 13

- - técnicas isotópicas, 125

- pequenos roedores, 12

- - - de radioisótopo, 125

- por gavagem, 12

- - - isótopos estáveis, 126

- subcutânea, 13

Zoológicos, animais de, 19

Nutricao Experimental - cap-09 - Indice.indd 185

- - avaliação do estado nutricional, 127

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Índice 185

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Neuza Maria Brunoro Costa Nutricionista. Professora-Associada do Departamento de Nutrição e Saúde (DNS) da Universidade Federal do Espírito Santo (UFES). Pós-Doutorado em Biodisponibilidade de Minerais pela Purdue University, pela Colorado University e pela University of Illinois at Urbana-Champaign, EUA. Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela University of Reading, Inglaterra. Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

A ética na utilização de animais de laboratório como agente biológico.

Maria do Carmo Gouveia Peluzio Nutricionista. Professora-Associada do Departamento de Nutrição e Saúde (DNS) da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutora em Ciências pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), MG. Mestre em Agroquímica pela UFV, MG.

Os animais experimentais na pesquisa em Nutrição – diferentes modelos animais (modificados geneticamente e induzidos por dietas, fármacos e cirurgia) que constituem o “meio biológico” no qual ocorrem as reações fisiológicas e metabólicas. O uso correto de uma alimentação segura que atenda às necessidades nutricionais do animal. A importância do conhecimento do tempo médio da vida homeostática das diferentes substâncias e como elas podem ser rastreadas no organismo, devido à existência de marcadores. Os métodos in vitro e in vivo químicos, enzimáticos e biológicos, baseando-se no ganho de peso e no incremento de nitrogênio, bem como em todos os fatores que contribuem e interferem nessa utilização.

Hércia Stampini Duarte Martino Nutricionista. Professora-Associada do Departamento de Nutrição e Saúde (DNS) da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Pós-Doutorado em Fitoquímica, Bioquímica e Biologia Celular pela Texas A&M University, EUA.

Alimentos Funcionais – Componentes Bioativos e Efeitos Fisiológicos Neuza Maria Brunoro Costa / Carla de Oliveira Barbosa Rosa Biotecnologia em Saúde e Nutrição: Como o DNA Pode Enriquecer os Alimentos, 2a ed. Neuza Maria Brunoro Costa / Aluízio Borém

Nutrição ExperimentaL T e o r i a

e

P r á t i c a

Neuza Maria Brunoro Costa | Maria do Carmo Gouveia Peluzio Hércia Stampini Duarte Martino | Gilberto Simeone Henriques

Áreas de interesse Nutrição Ciências dos Alimentos

Neuza Maria B. Costa | Maria do Carmo G. Peluzio Hércia Stampini D. Martino | Gilberto S. Henriques

Gilberto Simeone Henriques Nutricionista. Professor Adjunto da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Doutor e Mestre em Ciências dos Alimentos pela Universidade de São Paulo (USP).

Te o r i a e P r á t i c a

Nutrição Experimental – Teoria e Prática faz um apanhado de todo o conhecimento importante para quem deseja trabalhar com Nutrição Experimental. Abordam-se, por exemplo:

Nutrição ExperimentaL

Organizadores

Outros títulos de interesse

Instrumentos de Apoio para Implantação das Boas Práticas em Empresas Alimentícias Ana Lúcia de Freitas Saccol / Lize Stangarlin / Luisa Helena Hecktheuer Instrumentos de Apoio para Implantação das Boas Práticas em Serviços de Nutrição e Dietética Hospitalar Lize Stangarlin / Ana Lúcia Serafim / Ana Lúcia de Freitas Saccol / Luisa Helena Hecktheuer Instrumentos para Diagnóstico das Boas Práticas de Manipulação em Serviços de Alimentação Lize Stangarlin / Ana Lúcia Serafim / Laissa Benites Medeiros / Ana Lúcia de Freitas Saccol Manual de BPF, POPs e Registros em Estabelecimentos Alimentícios – Guia Técnico para Elaboração Clever Jucene Manual de Segurança Alimentar – Boas Práticas para os Serviços de Alimentação, 2a ed. Clever Jucene Plano APPCC em Estabelecimentos Alimentícios – Guia Técnico para Elaboração Clever Jucene Prebióticos e Probióticos – Atualização e Prospecção Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira Tabela de Equivalentes, Medidas Caseiras e Composição Química dos Alimentos, 2a ed. Manuela Pacheco Unidades Produtoras de Refeições – Uma Visão Prática Carla de Oliveira Barbosa Rosa / Márcia Regina Pereira Monteiro

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Nutrição Experimental – Teoria e Prática – Neuza Brunoro et al.  

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