Microbiota Gastrintestinal – Evidências da sua Influência na Saúde e na Doença – Alessandra Machado

Alessandra Barbosa Ferreira Machado Professora Convidada do Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG. Pós-Doutorado em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Ana Paula Boroni Moreira Professora-Assistente da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG. Doutorado em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Damiana Diniz Rosa Pós-Doutorado em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Pós-Doutorado em andamento em Agricultural and Biological Engineering pela University of Illinois, UrbanaChampaign.

Maria do Carmo Gouveia Peluzio

Doutorado em Bioquímica e Imunologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

O livro trata desde as bases microbiológicas necessárias à compreensão das associações biológicas até o uso de probióticos na correção de anomalias oriundas de deficiências nutricionais e doenças ou na prevenção de ambas. Discorre, ainda, sobre as técnicas e os métodos de estudos de microbiomas e pela compilação cuidadosa de dados coletados como evidências científicas desse tema tão instigante. O respaldo dado por trabalhos de notáveis cientistas, publicados nos mais respeitados periódicos científicos, possibilita que tal área, com relevância questionada até poucas décadas atrás, seja hoje fundamentada por ciência profunda e amplamente acreditada. O impacto desses conhecimentos permeia áreas como a Biologia, a Nutrição, a Bioquímica e a Medicina.

Tatiana Fiche Salles Teixeira Doutorado em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestrado em Ciência da Nutrição pela UFV.

Organizadoras

Rodrigo Siqueira-Batista / Andréia Patrícia Gomes / José Galvão-Alves / Alessandro Lisboa da Silva

Angelo P. Ferrari Jr.

Atlas Endoscópico de Doenças Inflamatórias Intestinais Marcelo Cury / Alan Colm Moss

BIZU Comentado – Perguntas e Respostas Comentadas de Endoscopia Digestiva Angelo P. Ferrari Jr. / Erika Pereira de Macedo / Fernanda Prata Martins / Gustavo Andrade de Paulo

BIZU Comentado – Perguntas e Respostas Comentadas de Gastrenterologia e Hepatologia Gerson Domingues / Carlos Terra

Cirurgia do Aparelho Digestório Cirilo P. M. Muraro

Doenças Inflamatórias Intestinais – Retocolite Ulcerativa e Doença de Crohn, 2a Ed. Dídia Bismara Cury / Alan Colm Moss

José Galvão-Alves

Microbiota

Gastrintestinal

Fisiologia Anorretal Lucia Camara Castro Oliveira

Intestino Saudável – Orientações e Receitas Lucia Camara Castro Oliveira / Flávia de Alvarenga Netto

Manometria Esofágica, pHmetria Esofágica e Manometria Anorretal – Como Fazer e Interpretar Ricardo Guilherme Viebig

Técnicas em Endoscopia Digestiva Angelo P. Ferrari Jr.

Saiba mais sobre estes e outros títulos em nosso site: www.rubio.com.br

Machado | Moreira Rosa | Peluzio | Teixeira

Gastrenterologia Microbiologia Nutrição

Antimicrobianos em Gastrenterologia – Guia Prático 2012/2013

Atlas de Endoscopia Digestiva, 2a Ed.

Evidê n c ias de Sua I n f l u ên ci a n a S a ú d e e n a D oen ça

Áreas de interesse

OUTROS TÍTULOS DE INTERESSE

Emergências em Gastrenterologia, 2a Ed.

Evidências de Sua Inf luênc i a na Saúde e na D oença

Professora-Associada da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Microbiota Gastrintestinal – Evidências de Sua Influência na Saúde e na Doença aborda de maneira abrangente, cuidadosa e detalhada um dos temas mais atuais e palpitantes da Biologia. A visão do organismo animal isoladamente não é mais aceitável diante das evidências científicas da interdependência dos macro- e microrganismos. Todo o conhecimento acumulado de Ecologia tem sido revisto para acomodar a noção de que organismos ditos superiores são, na realidade, sistemas intrincadamente dependentes de microrganismos que com eles coevoluíram no curso de milhões de anos.

Microbiota Gastrintestinal

SOBRE AS ORGANIZADORAS

Alessandra Barbosa Ferreira Machado | Ana Paula Boroni Moreira Damiana Diniz Rosa | Maria do Carmo Gouveia Peluzio | Tatiana Fiche Salles Teixeira

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Copyright © 2015 Editora Rubio Ltda.

ISBN 978-85-6495691-9 Todos os direitos reservados. É expressamente proibida a reprodução desta obra, no todo ou em parte, sem autorização por escrito da Editora.

Produção e Capa Equipe Rubio Imagens de Capa iStock.com/©luismmolina/©Eraxion Editoração Eletrônica Edel

CIP-BRASIL. CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO SINDICATO NACIONAL DOS EDITORES DE LIVROS, RJ M572 Microbiota gastrintestinal: evidências da sua influência na saúde e na doença / Alessandra Barbosa Ferreira Machado/ Damiana Diniz Rosa/ Maria do Carmo Gouveia Peluzio/ Tatiana Fiche Salles Teixeira.

- 1. ed. - Rio de Janeiro: Rubio, 2015.

288 p.: il.; 25 cm.

Inclui bibliografia e índice ISBN 978-85-64956-91-9 1. Gastrenterologia. 2. Fígado - Doenças 3. Aparelho digestório - Doenças. I. Machado, Alessandra Barbosa Ferreira.

14-15941

Editora Rubio Ltda.

Av. Franklin Roosevelt, 194 s/l. 204 – Castelo 20021-120 – Rio de Janeiro – RJ Telefax: 55(21) 2262-3779 • 2262-1783 E-mail: rubio@rubio.com.br www.rubio.com.br Impresso no Brasil Printed in Brazil

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CDD: 618.9233 CDU: 616.33/.34-053.2

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Microbiota Gastrintestinal – Evidências da Sua Influência na Saúde e na Doença

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Alessandra Barbosa Ferreira Machado Professora Convidada do Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG. Pós-Doutorado em andamento em Microbiologia pela UFJF, MG. Pós-Doutorado em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutorado em Microbiologia Agrícola pela UFV. Mestrado em Microbiologia Agrícola pela UFV. Graduação em Nutrição pela UFV.

Ana Paula Boroni Moreira Professora-Assistente da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG. Doutorado em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestrado em Ciência da Nutrição pela UFV. Especialização em Nutrição Clínica pelo Ganep – Nutrição Humana, SP. Graduação em Nutrição pela UFV.

Damiana Diniz Rosa Pós-Doutorado em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Pós-Doutorado em andamento em Agricultural and Biological Engineering pela University of Illinois, Urbana-Champaign.

Doutorado em Ciência da Nutrição pela UFV. Mestrado em Ciência da Nutrição pela UFV. Graduação em Nutrição pela UFV.

Maria do Carmo Gouveia Peluzio Professora-Associada da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutorado em Bioquímica e Imunologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

Mestrado em Agroquímica pela UFV. Graduação em Nutrição pela UFV.

Tatiana Fiche Salles Teixeira Doutorado em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestrado em Ciência da Nutrição pela UFV. Especialização em Nutrição Clínica Funcional pela Universidade Cruzeiro do Sul (Unicsul) – Valéria Paschoal (VP), RJ. Graduação em Nutrição pela UFV.

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Aline Dias Paiva Professora Adjunta do Departamento de Parasitologia, Microbiologia e Imunologia da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG. Pós-Doutorado em Microbiologia pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutorado em Microbiologia Agrícola pela UFV/Utrech University (Países Baixos).

Mestrado em Microbiologia Agrícola pela UFV. Graduação em Nutrição pela UFV.

Ana Paula do Carmo Professora Adjunta no Instituto Federal do Espírito Santo (IFES), campus Vila Velha, ES. Pós-Doutorado em Virologia Básica e Aplicada pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), MG. Pós-Doutorado em Biotecnologia de Leveduras pela Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), MG. Doutorado em Microbiologia Agrícola pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestrado em Microbiologia Agrícola pela UFV. Graduação em Ciência e Tecnologia de Laticínios pela UFV.

Ângela Aparecida Barra

Institute pela Universidade de Wisconsin-Madison, Madison.

Pós-Doutorado em Avaliações Clínicas na área de probióticos/Functional Foods Forum, pela Universidade de Turku, Finlândia.

Especialista consultora na formação de base para terminologia em alimentos funcionais, pre­bióticos, probióticos, simbióticos e alegações de saúde.

Doutorado em Food Science pela Oklahoma State University, Estados Unidos.

Mestrado em Food Science pela University of Wisconsin-Madison, Estados Unidos.

Claudia de Mello Ribeiro Doutorado em Medicina Veterinária na área de Saúde Animal, Saúde Pública Veterinária e Segurança Alimentar pela Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (Unesp).

Mestrado em Ciências Biológicas pela Universidade do Vale do Paraíba (Univap), SP. Especialização em Biologia Molecular pela Universidade de Taubaté (Unitau), SP. Graduação em Medicina Veterinária pela Unesp.

David Henrique Rodrigues

Mestrado em Cirurgia pela UFMG.

Professor Adjunto da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG. Pós-Doutorado em andamento em Neurociências pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

Doutorado em Biologia Celular pela UFMG. Mestrado em Biologia Celular pela UFMG. Graduação em Bioquímica pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Graduação em Medicina pela Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG.

Éder Galinari Ferreira

Membro do corpo clínico da Santa Casa de Misericórdia de Juiz de Fora, MG. Professora Adjunta da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutorado em Cirurgia pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira Professora Titular da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Pós-Doutorado em Microbiologia de Anaeróbios, com ênfase em Clostridium difficile, no Food Research

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Doutorando em Microbiologia Agrícola pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela UFV. Graduação em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário do Leste de Minas Gerais (Unileste).

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Colaboradores

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Luís Fernando de Sousa Moraes

Mestranda pelo programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Graduação em Bioquímica pela UFV.

Doutorando em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestrado em Ciência da Nutrição pela UFV. Graduação em Nutrição pela UFV.

Flávia Xavier Valente

Łukasz Marcin Grzes’kowiak

Doutoranda em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Professor Visitante (apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Capes) no Departamento de Nutrição e Saúde da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Pesquisador vinculado ao Functional Foods Forum, Departamento de Bioquímica e Química de Alimentos pela Universidade de Turku, Finlândia.

Doutorado em Ciências Naturais pela Universidade de Turku, Finlândia.

Mestrado em Biologia pela University of Sciences, Poz­ nan’, Polônia.

Mestrado em Ciência da Nutrição pela UFV. Especialização em Nutrição Clínica pelo Ganep – Nutrição Humana, SP. Graduação em Nutrição pela UFV.

Hilário Cuquetto Mantovani Professor-Associado do Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Pós-Doutorado pela University of Wisconsin-Madison, Estados Unidos.

Doutorado em Microbiologia pela Cornell University, Estados Unidos.

Mestrado em Microbiologia Agrícola pela UFV. Graduação em Engenharia Agronômica pela UFV.

Hudsara Aparecida de Almeida Paula Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestrado em Ciência da Nutrição pela UFV. Graduação em Nutrição pela UFV.

Joice de Fátima Laureano Martins Doutoranda em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela UFV. Graduação em Nutrição pela UFV.

Marcelo Nagem Valério de Oliveira Professor Auxiliar da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG. Doutorado em Microbiologia Agrícola pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestrado em Microbiologia Agrícola pela UFV. Graduação em Biologia pela UFV.

Márcia de Carvalho Vilela Professora Adjunta do Departamento de Biologia Animal pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutorado em Infectologia e Medicina Tropical pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

Mestrado em Patologia pela UFMG. Graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), MG.

Marcos Rodrigo de Oliveira

Luciana Rodrigues da Cunha

Professor da Pós-Graduação em Farmacologia Aplicada e Análises Clínicas na Universidade José do Rosário Vellano (Unifenas), MG. Farmacêutico-Bioquímico da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Ex-Coordenador do curso de Farmácia da Univiçosa.

Mestrado em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), MG. Especialização em Citologia Clínica pela UFOP. Graduação em Farmácia pela UFOP.

Professora Adjunta I da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), MG.

Monise Viana Abranches

Leandro Licursi de Oliveira Professor Adjunto no Departamento de Biologia Geral da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Doutorado em Imunologia Básica e Aplicada pela Universidade de São Paulo (USP).

Mestrado em Imunologia Básica e Aplicada pela USP. Graduação em Farmácia e Bioquímica pela USP.

Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG e na North Carolina State University, Estados Unidos.

Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela UFV. Graduação em Engenharia de Alimentos pela UFV.

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Professora no Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de Viçosa (UFV), campus Rio Parnaíba, MG. Doutorado em Biologia Celular e Estrutural pela UFV. Mestrado em Ciência da Nutrição pela UFV. Graduação em Nutrição pela UFV.

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Fernanda de Souza Freitas

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Professora do Centro Universitário de Patos de Minas (Unipam), MG. Mestrado em Bioquímica Agrícola pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Doutorado em Imunologia Básica e Aplicada – Bioagentes Patogênicos pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/ USP).

Graduação em Farmácia pela Unipam, MG.

Mestrado em Imunologia Básica e Aplicada – Bioagentes patogênicos pela FMRP/USP.

Rita de Cássia Gonçalves Alfenas

Graduação em Medicina Veterinária pela UFV.

Professora-Associada da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Tatiana do Nascimento Campos

Doutorado em Nutrição pela Purdue University, Estados Unidos.

Nutricionista do Departamento de Nutrição e Saúde da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Mestrado em Microbiologia Agrícola pela UFV.

Mestrado em Ciência da Nutrição pela UFV.

Graduação em Nutrição pela UFV.

Sérgio Oliveira de Paula

Especialização em Nutrição Clínica pela Universidade Gama Filho (UGF), RJ.

Professor Adjunto no Departamento de Biologia Geral da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Graduação em Nutrição pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).

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Natalia Filardi Tafuri

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Dedicamos este livro a todos os estudantes e profissionais das áreas da saúde e afins que desejam ter um ponto de partida, seja em pesquisas científicas ou na prática clínica. Ainda estamos enxergando apenas a ponta do iceberg.

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Agradecemos ao Programa de Pós-Graduação em Ciência da Nutrição da Universidade Federal de Viçosa por direta ou indiretamente permitir e incentivar a dedicação de parte de nosso tempo a esta obra.

Aos órgãos de fomento Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (Fapemig), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), por financiarem projetos e proverem bolsas de estudo para a formação de recursos humanos nessa área do conhecimento.

Aos colaboradores, pela dedicação e por apostarem na nossa proposta.

Aos nossos familiares, pelo apoio incondicional.

Ao trabalho em equipe, que é uma maneira maravilhosa de apresentar um conteúdo de modo democrático.

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O médico pediatra Theodore Escherich (18571911) foi um dos pioneiros a introduzir o conceito de que os microrganismos intestinais interagem uns com os outros e podem interferir nas propriedades do hospedeiro e até causarlhe doenças. Tal visão perdura até os tempos atuais, e a evolução das técnicas moleculares tem inspirado diversos grupos de pesquisadores a investigar e caracterizar a microbiota gastrintestinal.

A conclusão do sequenciamento do genoma humano foi um marco para a era “ômica” nas diversas áreas relacionadas com a saúde. Em 2001, David Relman & Stanley Falkow* alertaram para a necessidade de se desenvolver um segundo projeto genoma humano: O corpo humano é hospedeiro para uma diversidade de microrganismos. Ainda somos, de certa forma, ignorantes quanto à composição e variabilidade da microbiota endógena. Muitos destes microrganismos dependem dos seres humanos para sua sobrevivência, e ainda desconhecemos qual a dependência da vida humana em relação à microbiota. No espírito do recente projeto “Genoma Humano” e com a esperança de capturar a imaginação da comunidade científica, é tempo de embarcarmos na compreensão do amplo inventário genômico representado por grande proporção de vida celular do corpo humano – a microbiota endógena – a qual tem sido ignorada até então.

Um grande estudo de sequenciamento genômico dos quatro principais nichos microbianos do corpo humano – a boca, o trato intestinal, a vagina e a pele – ajudaria a preencher as lacunas importantes na compreensão da evolução humana, desenvolvi*Relman DA, Stanley F. The meaning and impact of the human genome sequence for microbiology. Trends in Microbiology. 2001; 9(5):206-8.

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mento, função imune e doenças. Não é necessário nenhum salto de fé para reconhecer que esse inventário também contribui substancialmente para o âmbito da conhecida diversidade funcional da biosfera. O bioma humano é tanto uma fronteira inexplorada quanto uma coleção de vidas, encontradas também em fontes hidrotermais no fundo do mar, se não mais.

Desse modo, surgiu o projeto “Microbioma Humano”, por iniciativa do National Institute of Health (NIH), nos Estados Unidos, como uma extensão do projeto “Genoma Humano”.

Iniciado em 2007, tem como um dos objetivos aprofundar a caracterização da microbiota ou do microbioma, com vistas a construir conhecimentos para melhorar a saúde humana a partir do monitoramento ou da manipulação do microbioma humano.

O ser humano nesse contexto passa a ser visto como um superorganismo, ou seja, um conjunto de células microbianas e humanas, no qual o arcabouço genético deste agrega os genes do genoma microbiano. Essa interação reflete-se nos aspectos metabólicos humanos, como resultado da interação da expressão gênica do genoma humano e do microbioma.

O trato gastrintestinal apresenta-se como o laboratório natural para estudo da microevolução em humanos, em razão da disponibilidade de ferramentas experimentais e computacionais que possibilitam o conhecimento da diversidade da microbiota intestinal. Uma importante visão advinda da revolução da ecologia molecular foi que a composição da microbiota é específica de cada indivíduo e dominada por filotipos ainda não totalmente caracterizados. As análises metagenômicas revelaram que a diversidade da

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Apresentação

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O Capítulo 6 trata do papel da microbiota intestinal na fisiologia do hospedeiro e discute brevemente a disbiose intestinal.

O Capítulo 7 aborda como a microbiota intestinal pode influenciar o desenvolvimento do sistema imunológico e como este, por sua vez, regula a colonização de microrganismos intestinais.

O Capítulo 8 apresenta a estrutura química do lipopolissacarídeo e descreve seus efeitos biológicos e os métodos de detecção do composto.

O Capítulo 9 discute a relação entre a microbiota e a biotransformação de fármacos e compostos bioativos O Capítulo 10 aborda a influência da microbiota nas doenças intestinais.

O Capítulo 11 apresenta as evidências da participação de microrganismos provenientes da microbiota oral ou intestinal no aumento do risco cardiovascular.

O Capítulo 12 discute os principais destaques apontados pela comunidade científica em relação à participação da microbiota intestinal na obesidade e no diabetes melito tipo 2.

O Capítulo 13 descreve alguns mecanismos que têm sido propostos para explicar a influên­ cia indireta ou mesmo direta da microbiota intestinal sobre o sistema nervoso central e o comportamento.

O Capítulo 14 aborda o uso dos probióticos como adjuvante para os indivíduos imunodeprimidos.

O Capítulo 15 aborda o potencial de uso de probióticos no tratamento e/ou na prevenção das doenças crônicas.

Por fim, o Capítulo 16 trata dos aspectos gerais das principais etapas do processo produtivo de probióticos e as alegações de propriedade fun­cional.

Esperamos que o leitor amplie sua visão a respeito dos microrganismos, especialmente no que se refere às complexas relações entre os microrganismos e o hospedeiro. Uma excelente leitura!

As Organizadoras

C o p y r i g h t ©2 0 1 5E d i t o r aR u b i oL t d a .

Ma c h a d oe t . a l .

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microbiota gastrintestinal foi subestimada pelos estudos que utilizaram técnicas dependentes de cultivo. O metagenoma intestinal humano criou um catálogo que contém virtualmente milhares de genes microbianos prevalecentes e ofereceu uma ampla visão de funções importantes para a vida bacteriana no intestino. Além disso, mostrou a complementaridade entre o metagenoma intestinal e o genoma humano e indicou que muitas espécies bacterianas são, de fato, compartilhadas por diferentes indivíduos.

As relações entre a microbiota intestinal e o hospedeiro são diversas e complexas e a elucidação de como a interação das diferentes espécies contribui para a saúde humana continua um desafio para a ciência. A principal dificuldade é a de correlacionar o status de saúde do hospedeiro com a presença ou a ausência de certas espécies bacterianas. A análise metagenômica de comunidades complexas oferece uma oportunidade para examinar como ecossistemas respondem a perturbações ambientais e, no caso dos humanos, como o ecossistema microbiano contribui para a saúde e a doença.

A obra está organizada em 16 capítulos. O Capítulo 1 aborda a origem da vida, a árvore evolutiva desta, o conceito de espécie microbiana, as diversas interações dos microrganismos no trato gastrintestinal e o conceito de biologia de sistemas.

O Capítulo 2 trata do projeto Microbioma Humano, a importância da amostragem e a evolução das técnicas utilizadas no estudo da microbiota gastrintestinal humana.

O Capítulo 3 discorre sobre os principais modelos in vivo e in vitro desenvolvidos para o estudo da microbiota, os quais podem ser empregados por aqueles que planejam avançar nesse campo da pesquisa.

O Capítulo 4 descreve os principais substratos da dieta humana que podem ser utilizados pelas bactérias intestinais e como os produtos da atividade metabólica da microbiota intestinal podem influenciar o metabolismo do hospe­ deiro.

O Capítulo 5 discute o conceito de redundância funcional e aborda a composição de microrganismos ao longo do trato gastrintestinal e os fatores que influenciam essa composição ao longo da vida.

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Microbiota Gastrintestinal – Evidências de Sua Influência na Saúde e na Doença aborda de maneira abrangente, cuidadosa e detalhada um dos temas mais atuais e palpitantes da Biologia. A visão do organismo animal isolado não é mais aceitável diante das evidências científicas da interdependência dos macro- e microrganismos. Todo o conhecimento acumulado de Ecologia tem sido revisto para acomodar a noção de que organismos ditos superiores são, na realidade, sistemas intrincadamente dependentes dos microrganismos que com eles coevoluíram no curso de milhões de anos. Assim, a obra aqui apresentada é única no seu aspecto interdisciplinar e holístico.

Os capítulos sucedem-se harmonicamente, desde as bases microbiológicas necessárias à compreensão das associações biológicas até o uso de probióticos na correção de anomalias oriundas de deficiências nutricionais e doenças ou na prevenção de ambas. Passam, ainda, os capítulos, por técnicas e métodos de estudos de microbiomas e pela compilação cuidadosa de dados coletados como evidências científicas desse tema tão instigante. O respaldo dado por trabalhos de notáveis cientistas, publicados nos mais respeitados periódicos científicos, não permite negar que tal área que teve sua relevância questionada até poucas décadas atrás seja hoje fundamentada por ciência profunda e amplamente acreditada.

O impacto desses conhecimentos permeia áreas como a Biologia, a Nutrição, a Bioquímica e a Medicina.

Esta obra é recomendada a todos que se interessem pela saúde humana e preenche uma lacuna na literatura brasileira nessa área. A competência e a interdisciplinaridade na formação da equipe responsável pelo livro autorizam e chancelam sua publicação e seu uso como material essencial de consulta e referência.

Profa Célia Alencar de Moraes Professora Adjunta da Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Ph.D. em Ciência de Alimentos pela Cornell University, Ithaca, Estados Unidos.

Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela UFV.

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Prefácio

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2-AG

2-araquidonoil glicerol

CEI

células epiteliais intestinais

5-ASA

ácido 5-aminossalicílico

CF

citometria de fluxo

Aa

aminoácidos

CHO

carboidratos

Acc-1

acetil-CoA carboxilase

ChREBP

acetil-CoA

acetilcoenzima A

ACSC

anticorpos contra Saccharomyces cerevisiae

Act

acetato

proteína de ligação do elemento de resposta sensível a carboidratos (carbohydrate response element-binding protein CLR C-type lectin)

AGCC

ácidos graxos de cadeia curta

CMV

citomegalovírus

AIDS

síndrome da imunodeficiência adquirida

AME

aleitamento materno exclusivo

AMP

monofosfato de adenosina

AMPK

proteína cinase ativada por monofosfato de adenosina (adenosine monophosphate activated protein kinase)

Ang4

angiogenina 4

ANGPTL4

angiopoietina-like 4 (angiopoietin-like 4)

DCT

dieta-controle

anti-LDLox

anticorpos anti-LDL oxidada

DCT + Ant

dieta-controle + antibiótico

AO

ácidos orgânicos

DCV

doenças cardiovasculares

AOAH

enzima lipolítica acil oxiacil hidrolase

DGGE

AP-1

proteína ativadora 1

APC

células apresentadoras de antígenos

Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (denaturing gradient gel electrophoresis)

apoA-I

apoproteína A-I

DII

doença inflamatória intestinal

ASF

flora Schaedler alterada (altered Schaedler flora)

ATP

trifosfato de adenosina

AZT

zidovudina

BAL

bactérias produtoras de ácido lático

BDNF BRAVE

COX-2

ciclo-oxigenase 2

CPT1

carnitina palmitoil transferase 1

Cy3

cianina 3

Cy5

cianina 5

DAC

doença arterial coronariana

DAG lipase

sn-1-diacilglicerol lipase seletiva

DC

doença celíaca

DLG

dieta livre de glúten

DM2

diabetes melito tipo 2

D-MALT

tecido linfoide difuso associado a mucosa (diffuse mucosa-associated-lymphoid tissue)

DNA

ácido desoxirribonucleico

fator neurotrófico derivado do cérebro (brain-derived neutrophic factor)

DNAr

DNA ribossômico ou ribossomal

dNTP

desoxirribonucleotídeo sulfatado

alteração do fluxo biliar, redução do tamanho estomacal, rearranjo anatômico intestinal e alteração do fluxo de nutrientes, manipulação vagal e modulação de hormônios enterais (bile flow alteration, reduction of gastric size, anatomical gut rearrangement and altered flow of nutrients, vagal manipulation and enteric gut hormone modulation)

dsRNA

RNA de fita dupla

ECAI

Escherichia coli aderente e invasiva

eCB

sistema endocanabinoide

emPCR

reação em cadeia da polimerase em emulsão

EPEC

Escherichia coli enteropatogênica

ERK

cinase regulada por sinal extracelular

ERO

espécies reativas de oxigênio

Bu

butirato

EU

unidade de endotoxinas

CA3

cornu Ammonis 3

EUT

controles (eutróficos)

CD

células dendríticas

FAAH

fatty acid amide hydrolase

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Lista de Abreviaturas

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ácido graxo sintase

IRF5

fator 5 regulador de interferon

FcRn

receptor Fc neonatal

ISR

substrato do receptor de insulina

FDA

Food and Drug Administration

JNK

proteína cinase C-Jun N-terminal

FeS

pirita

KC

quimiocina quimiotática para neutrófilo

FIAF

fator adiposo induzido pelo jejum (fastinginduced adipose factor)

KDO

ácido 2-ceto-3-deoxioctanoico

La

lactato

FISH

hibridização fluorescente in situ (fluorescence in situ hybridization)

LACA

último ancestral comum das archaea (last archaeal common ancestral)

FMO3

flavin monooxygenase

LAL

FOS

fruto-oligossacarídeos

Lisado de Amebócitos do Limulus (Limulus Amebocyte Lysate)

GABA

ácido gama-aminobutírico

LBP

GalNAc

N-acetilgalactosamina

proteína de ligação de lipopolissacarídeos (lipopolysaccharide binding protein)

GALT

tecido linfoide associado ao intestino (gutassociated lymphoid tissue)

LDL

lipoproteína de baixa densidade

L-dopa

levodopa

GlcNAc

N-acetilglicosamina

Le

antígeno Lewis

GLP-1

peptídio 1 semelhante ao glucagon (glucagon-like peptide-1)

LF

leite fermentado

LGG

Lactobacillus rhamnosus Gorbach e Goldin

GPCR

receptores acoplados à proteína G

GPI

glicosil fosfatidilinositol

LM

leite materno

GRAS

Geralmente reconhecido como seguro (generally recognized as safe)

H2S

sulfeto de hidrogênio

HBL

hemolysin binding lytic (ou simplesmente hemolisina BL)

HDAC

desacetilase de histonas

HDL

lipoproteína de alta densidade

HF

dieta hiperlipídica

HF + Ant

dieta hiperlipídica + antibiótico

HFA

associada à flora humana (human flora-associated)

HIV

vírus da imunodeficiência humana

HLA

antígenos leucocitários humanos

HMO

oligossacarídeos do leite humano

HSP

heat shock protein (proteína de choque térmico)

ICAM-1

molécula de adesão intercelular 1

LNM

linfonodos mesentéricos

LP

lâmina própria

LPL

lipase lipoproteica

LPS

lipopolissacarídeo

LTB4

leucotrieno B4

LUCA

último ancestral comum universal (last universal common ancestral)

MAG

monoacilglicerol lipase

MAMP

padrão molecular associado a micróbios (microbe-associated molecular pattern)

MAP

Mycobacterium avium paratuberculosis

MAPK

proteína-cinase ativada por mitógeno (mitogen-activated protein kinases)

MCP-1

proteína quimiotática de monócito 1 (monocyte chemotactic protein-1)

MD-2

proteína mieloide diferenciadora 2

MHC

complexo de histocompatibilidade

m-HPAA

ácido m-hidroxi-fenilacético

MIP-2

proteína inflamatória de macrófagos-2 (macrophage inflammatory protein-2)

MYD88

proteína de resposta à diferenciação mieloide 88

ICC

insuficiência cardíaca crônica

IFN

interferon

IFN-gama

interferon-gama

IgA

imunoglobulina A

IgAS

imunoglobulina A secretória

NAG

N-acetilglicosamina

IHMC

Consórcio Internacional do Microbioma Humano (International Human Microbiome Consortium)

NAP1

proteína 1 de conjunção a nucleossomo

NAPE-PLD

N-acil fosfatidiletanolamida-fosfolipase D seletiva

IL

interleucina

NF-κB

fator nuclear kappa B

IMC

índice de massa corporal

NGF

fator de crescimento de nervos

iNOS

óxido nítrico sintetase induzível

INVEST

Estudo Epidemiológico das Infecções Orais e Doenças Vasculares (The Oral Infections and Vascular Disease Epidemiology Study)

NIK

cinase indutora do fator nuclear kappa B

NK

células exterminadoras naturais

NOD

receptores de domínio de oligomerização de ligação de nucleotídeos (nucleotidebinding oligomerization domain)

O-MALT

tecido linfoide associado à mucosa organizado (organized mucosa-associated lymphoid tissue)

IRAK

cinase do receptor de interleucina

IRAK-1

receptor de interleucina-1 associado à cinase

IRF3

fator 3 regulador de interferon

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Fas

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fator ativador de plaquetas

SHIP

PAMP

padrões moleculares associados a patógenos (pathogen-associated molecular pattern)

inositol 5-fosfatase contendo SH2 (SH2containing inositol phosphatase)

SIBO

supercrescimento bacteriano (small intestine bacterial overgrowth)

PBMC

células mononucleares do sangue periférico

PCR

reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction)

PC-R

proteína C reativa

PGC

Coativador-1 alfa do receptor ativado por proliferador do peroxissoma (peroxisomal proliferator-activated receptor coactivator)

PGE2

prostaglandina E2

PGF

proteína G fluorescente

PGRP

proteínas de reconhecimento de peptidioglicanos

Pi

pirofosfato

SII

síndrome do intestino irritável

SINTBAD

proteína 1 de ligação à cinase de ligação a TANK

SOCS-1 e SOCS-3

proteínas supressoras da sinalização de citocinas 1 e 3

SP

sobrepeso

sprr2a

proteínas pequenas ricas em prolina 2a (small proline-rich protein 2a)

SREBP-1

proteína de ligação a elemento regulador do esterol 1 (sterol regulatory elementbinding protein 1)

STAT

transdutores de sinal e ativadores de transcrição (signal transducer and activator of transcription)

PI3K

fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-cinase

pIgR

receptor polimérico de imunoglobulina

Su

succinato

PP

placas de Peyer

TAK1

PPAR-gama

receptor ativador por proliferadores de peroxissomos gama

cinase 1 ativada do fator transformador do crescimento beta

TGF-beta

Pr

propionato

fator transformador do crescimento beta

PRR

receptores de reconhecimento de padrão (pattern recognition receptors)

TGGE

PYY

polipeptídio Y

eletroforese em gel com gradiente de temperatura (temperature gradient gel electrophoresis)

RAPD

DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (random amplified polymorphic DNA)

TGI

trato gastrintestinal

TGY

extrato de levedura glicose triptona (prereduced tryptone glucose yeast extract)

RCU

retocolite ulcerativa

TLR

receptores tipo Toll (Toll-like receptors)

RDP

Projeto do Banco de Dados Ribossomal (Ribosomal Database Project)

TLR4

receptores tipo Toll (Toll-like receptor 4)

TMA

trimetil amina

RFLP

polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (restriction fragment length polymorphism)

TNF-alfa

fator de necrose tumoral alfa

TollIP

proteína de interação Toll

RIP1

proteína 1 de interação com o receptor

TRAF6

RLR

receptores semelhantes ao gene I induzível por ácido retinoico (retinoic acid-inducible gene I-like receptors)

fator 6 associado ao receptor do fator de necrose tumoral

Treg

células T regulatórias

T-RFLP

polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminal (terminal-restriction fragment length polymorphism)

TRIF

adaptador do domínio Toll/interleucina-1 (TIR) indutor de interferon-beta (IFN-beta)

TWAR

Chlamydia pneumoniae

UFC

unidade formadora de colônias

RNA

ácido ribonucleico

RNAm

RNA mensageiro

RNAr

RNA ribossômico ou ribossomal

RNAt

RNA transportador

RYGB

cirurgia de bypass gástrico em Y de Roux

SCI

síndrome do cólon irritável

Se

fenótipo secretor

SHIME

simulador do ecossistema microbiano intestinal humano (simulator of the human intestinal microbial ecosystem)

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VLDL

lipoproteína de muito baixa densidade

ZO

zônula de oclusão

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PAF

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Capítulo 1 O Mundo Microbiano: Evolução e Diversidade, 1

Capítulo 2 Como Estudar a Microbiota Gastrintestinal Humana, 15

Capítulo 3 Modelos Animais e Sistemas in vitro para Estudo da Microbiota Intestinal, 33

Capítulo 4 Produtos da Atividade Metabólica da Microbiota Intestinal e suas Implicações no Metabolismo Humano, 49

Capítulo 5 Microbiota do Trato Gastrintestinal Humano: Composição e Fatores Determinantes, 63

Capítulo 6 Papel da Microbiota na Fisiologia do Hospedeiro, 85

Capítulo 7 Microbiota Intestinal e Sistema Imunológico: Uma Via de Mão Dupla, 95

Capítulo 8 Lipopolissacarídeos: Estrutura e Influência sobre o Hospedeiro, 111

Capítulo 9 Microbiota e Biotransformação de Fármacos e Compostos Bioativos, 123

Capítulo 10 Microbiota e Doenças Intestinais, 131

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Sumário

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Microbiota do Trato Gastrintestinal e Doença Cardiovascular, 147

Capítulo 12 Microbiota Intestinal, Obesidade e Diabetes Melito Tipo 2, 165

Capítulo 13 Interações entre a Microbiota Intestinal e o Sistema Nervoso, 183

Capítulo 14 Probióticos como Adjuvantes Dietéticos na Saúde de Indivíduos Imunodeprimidos, 191

Capítulo 15 Potencial de Efeitos Benéficos do uso de Probióticos nas Doenças Crônicas, 205

Capítulo 16 Probióticos e Simbióticos: Aspectos Tecnológicos e Alegações de Propriedades Funcionais, 229 Índice, 251

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Capítulo 11

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Alessandra Barbosa Ferreira Machado Marcelo Nagem Valério de Oliveira Fernanda de Souza Freitas

TEMAS ABORDADOS NESTE CAPÍTULO Desde sua origem, há 4,6 bilhões de anos, a Terra vem sofrendo um processo contínuo de alterações físicas e geológicas que criaram condições que levaram à origem da vida há cerca de 3,9 bilhões de anos. Com a evolução dos métodos moleculares, foi proposta a divisão dos organismos vivos em três domínios: Archaea, Bacteria e Eukarya, a partir da análise comparativa de sequências de RNA ribossômico (RNAr), possibilitando a reconstrução da árvore filogenética da vida. Nesse sentido, este capítulo aborda a origem da vida, a árvore evolutiva da vida, o conceito de espécie microbiana, as diversas interações dos microrganismos no trato gastrintestinal (TGI) e o conceito de biologia de sistemas.

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O Mundo Microbiano: Evolução e Diversidade

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Microbiota Gastrintestinal | Evidências da Sua Influência na Saúde e na Doença

Introdução Desde sua origem, a Terra tem passado por di­ versas alterações físicas e geológicas que cria­ ram condições que levaram à origem da vida.

Para entendermos a evolução e a diversidade do mundo microbiano, é importante relembrar o contexto terrestre em que esses seres surgiram.

A origem da vida A idade da Terra é de 4,6 bilhões de anos. Os cientistas dispõem de evidências de que as cé­ lulas surgiram na Terra há 3,8 a 3,9 bilhões de anos. Esses organismos eram exclusivamente microbianos e, por muito tempo, foram a única forma de vida na Terra.1 Há evidências de que a atmosfera original da Terra primitiva era composta principalmente por água (H2O), dióxido de carbono (CO2), nitrogê­ nio (N2), monóxido de carbono (CO), hidrogênio (H2), metano (CH4), amônia (NH3), sulfeto de hi­ drogênio (H2S) e sulfeto de ferro (FeS), proporcio­ nando um ambiente bastante redutor.2 Além dis­ so, devido à forte incidência de raios ultravioleta (UV) e descargas elétricas, as altas temperaturas encontradas nessa atmosfera permitiam a exis­ tência de água somente na forma gasosa. Com a origem e a evolução de formas de vida, alguns desses componentes químicos foram explorados para dirigir uma forma primitiva de metabolismo oxidativo de obtenção de energia.3 O conceito de que a vida tenha surgido a partir da conversão, catalisada pela radiação UV, de metano, água e amônia, em compostos orgânicos é atribuído a Oparin & Haldane.4 De­ vido à ausência de vida capaz de consumir essas moléculas, houve o acúmulo de “caldo primor­ dial”, em que ocorreram as reações que deram origem às primeiras macromoléculas.4 Tempos depois, essa teoria foi experimentalmente con­ firmada por Miller.5 Outra hipótese, a da origem da subsuper­ fície, indica que a vida tenha se originado em fontes hidrotermais no leito oceânico, cujas condições seriam mais estáveis do que na su­ perfície, e compostos reduzidos como H2S e H2 poderiam ser utilizados como fonte de energia.

O fluxo da água hidrotermal quente e alcalina para as águas oceânicas mais frias e levemente ácidas levou à formação de precipitados de piri­ ta (FeS2), silicatos, carbonatos e argilas montmo­

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rilonita contendo magnésio; os argilominerais formaram, por sua vez, estruturas de superfícies adsorventes contendo áreas porosas e semiper­ meáveis. As superfícies e os poros seriam ricos em minerais, os quais teriam catalisado a forma­ ção de aminoácidos, peptídios simples, açúcares e bases nitrogenadas, capturando e concentran­ do esses compostos. O fosfato presente na água do mar foi precursor para a formação de nucleo­ tídeos catalisada por argila montmorilonita. O fluxo de compostos orgânicos reduzidos a par­ tir da crosta promoveu o suprimento de fontes constantes de elétrons para a química pré-bió­ tica. Os gradientes redox e de pH desenvolvidos pelas superfícies semipermeáveis de FeS consti­ tuíam uma força próton-motiva pré-biótica.1 A concentração de compostos orgânicos criou os primeiros sistemas autorreplicantes precursores da vida. Devido às propriedades da molécula de RNA, acredita-se que estas tenham originado os primeiros sistemas autorreplicantes.

O RNA pode ligar-se a moléculas como nucleotí­ deos e apresentar atividade catalítica, podendo ter catalisado sua própria síntese a partir de açú­ cares, bases e fosfato disponíveis.1 Novas varia­ ções das moléculas de RNA autorreplicantes se desenvolveram com a capacidade adicional de catalisar a condensação de peptídios. À medida que diferentes proteínas emergiram, elas assu­ miram o papel catalítico dos RNA. Eventualmen­ te, moléculas de DNA mais estáveis que as de RNA substituíram sua função codificadora.6

Evidências de vida microbiana na Terra remota Restos fossilizados de células e o isótopo “leve” de carbono, abundante em rochas sedimenta­ res, forneceram evidências de vida microbiana na Terra remota.1 Foi documentada a presença de formações microbianas denominadas estro­ matólitos (massas microbianas fossilizadas) em rochas de 3,5 bilhões de anos.7 A comparação de estromatólitos antigos com estromatólitos modernos, desenvolvendo-se em bacias mari­ nhas rasas, ou em fontes quentes, demonstrou que os estromatólitos primitivos foram forma­ dos por bactérias fototróficas anoxigênicas fi­ lamentosas. Ainda que a natureza microbiana desses fósseis seja discutível, eles fornecem a estimativa de que a vida microbiana era abun­ dante há cerca de 3,5 bilhões de anos.1

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Metabolismo primitivo Por um longo período, o oxigênio mo­lecular não esteve presente na atmosfera em concen­ trações significativas, e o metabolismo primiti­ vo para geração de energia seria anaeróbio e autotrófico, uma vez que as fontes de carbono formadas abioticamente eram limitadas. Outra evidência é a descoberta de bactérias autotró­ ficas como Aquifex, uma bactéria de genoma pequeno e que se ramifica próximo à raiz da ár­ vore evolutiva da vida, propriedades que pode­ riam ser associadas a um organismo primitivo.

Assim, considerando esse conjunto de fatores associados à abundância de H2 e CO2 na Terra remota, acredita-se que as primeiras células te­ nham sido autotróficas e anaeróbias.1 Após o desenvolvimento das formas iniciais de metabolismo energético e de carbono, a vi­ da microbiana sofreu diversificação metabólica mediante as fontes de energia abundantes dis­ poníveis na Terra. A atividade metabólica dos microrganismos no ambiente químico da Terra cria novos desafios à sobrevivência assim como oportunidades de utilização dos recursos. O surgimento de microrganismos fotoautotróficos data de cerca de 3,2 bilhões de anos. A capa­ cidade de utilizar radiação solar como fonte de energia possibilitou a extensa diversificação dos fototróficos e o desenvolvimento de linhagens de cianobactérias com um fotossistema capaz de utilizar H2O na redução fotossintética de CO2 liberando O2. À medida que o O2 acumulavase, a atmosfera modificava-se gradativamente de anóxica para óxica, criando uma vantagem energética para microrganismos capazes de utilizar oxigênio como aceptor final de elétrons durante a respiração. Além disso, o acúmulo do oxigênio acarretou também a formação de uma camada de ozônio que protegia o DNA contra os danos decorrentes da intensa radiação UV, o que possibilitou, assim, a colonização de am­ bientes terrestres antes expostos às altas doses de radiação.1

A árvore evolutiva da vida Evolução A evolução é o processo de modificação de uma linha de descendência ao longo do tempo que resulta no surgimento de novas variedades

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e espécies de organismos. A evolução ocorre em qualquer sistema autorreplicante, no qual a variação se dá como resultado de mutação do material genético, seguida de seleção natural.

Assim, todos os organismos são relacionados pela descendência, a partir de um ancestral que viveu no passado.1,8 A evolução das células é uma mistura entre as variações derivadas verti­ calmente e adquiridas horizontalmente,9 sendo responsável tanto pela vasta diversidade que observamos atualmente como pelo alto grau de complexidade dos organismos.

Filogenia A história evolutiva de um grupo de organismo é denominada filogenia. As relações filogenéti­ cas entre as células podem ser deduzidas com­ parando-se a informação genética (sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos) presente em seus ácidos nucleicos ou proteínas.1 Diversos genes são utilizados nos estudos de filogenia molecular dos microrganismos. As se­ quências de genes mais utilizadas e úteis são as que codificam o RNA ribossômico (RNAr) 16S e seu equivalente eucariótico, RNAr 18S (região DNAr). Esses genes são amplamente utilizados para a análise evolutiva com base em sequên­ cias porque são distribuídos universalmente, fun­cionalmente constantes, suficientemente con­ servados, ou seja, modificam-se lentamente e apresentam tamanho adequado (aproximada­ mente 1.500 pares de bases [pb]), fornecendo uma visão da evolução englobando todos os se­ res vivos. Carl Woese, um microbiologista ame­ ricano, foi pioneiro no uso de DNAr como um barômetro da filogenia microbiana e, ao fazê-lo, revolucionou nosso entendimento a respeito da evolução celular.1 Assim, existem vários bancos de dados que armazenam sequências de genes de DNAr, como o Ribosomal Database Project (RDP), que atualmente possui uma coleção de 2.110.258 de sequências de DNAr 16S. A Figura 1.1 mostra de forma esquemática as etapas de reconstrução de uma árvore filo­ genética baseada no RNA. Inicialmente, é feita a extração do DNA das células bacterianas, se­ guida da amplificação do gene que codifica o DNAr 16S pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). Os genes são sequenciados e as sequências obtidas são alinhadas e com­ paradas com outras sequências de DNAr, por

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O Mundo Microbiano: Evolução e Diversidade

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Microbiota Gastrintestinal | Evidências da Sua Influência na Saúde e na Doença

Os três domínios da vida A partir da análise comparativa de sequências de DNAr, foi reconstruída a árvore filogenética da vida, na qual todos organismos vivos são di­ vididos em três domínios: Archaea, Bacteria e Eukarya (Figura 1.2),10 sendo domínio o táxon biológico mais elevado. A árvore filogenética universal corresponde à genealogia de toda a vida na Terra e retrata a história evolutiva das células de todos os organismos, revelando cla­ ramente os três domínios. Dois desses domí­ nios, Bacteria e Archaea, são exclusivamente microbianos e constituídos somente por células desprovidas de um núcleo envolto por membra­ na, ou seja, células procarióticas.1,10 O conceito de três domínios é também sus­ tentado pela análise de genes específicos com­ partilhados por todos os organismos. A análise de mais de 30 genes presentes em mais de 190 espécies de Bacteria, Archaea e Eukarya, cujos genomas foram totalmente sequenciados, con­ firma a separação distinta e inequívoca dessas três linhas de descendência.1 A divisão das formas de vida em três domí­ nios é hoje aceita, mas a posição do domínio Archaea na árvore universal da vida ainda é discutida, existindo três hipóteses principais. A

Extração de DNA PCR Amplificação da sequência de DNA que codifica RNAr (DNAr) Sequenciamento de DNA Alinhamento das sequências Reconstrução da árvore filogenética

Figura 1.1 Etapas de reconstrução de uma árvore filogenética baseada no DNAr PCR: reação em cadeia da polimerase.

Fonte: adaptada de Madigan et al., 2010.1

meio de um algoritmo computacional. Por fim, é realizada a reconstrução da história evolutiva desses organismos. Quanto maior a variação da sequência do gene DNAr entre os organismos, maior sua divergência evolutiva.

Bacteria

Espiroquetas Proteobactérias

Archaea

Eukarya

Bactérias verdes filamentosas Grampositivas

Cianobactérias Planctommyces Bacteroides Cytophaga

Entamoeba Methanosarcina

Methanobacterium Methanococcus Thermococcus celer Thermoproteus Pyrodicticum

Halofílicos

Animais Fungos Plantas Ciliados Flagelados

Microsporídios

Thermotoga Aquifex

Ancestral comum

Figura 1.2 Árvore filogenética da vida. Essa árvore, construída por Sarl Woese, ilustra o relacionamento evolutivo de organismos dos três domínios da vida. Foi construída a partir da comparação das sequências do gene da RNA ribossômico (RNAr), o qual será presente em todos os seres vivos Fonte: adaptada de Woese et al., 1990.10

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os componentes e as interações ali presentes, em uma abordagem que pode ser considerada biologia de ecossistemas.40 O desenvolvimento de novas metodologias para estudos em ecologia microbiana resultou em rápida expansão do conhecimento da diver­ sidade gênica e microbiana, mas não resulta na elucidação completa dos processos nos quais os microrganismos estão envolvidos. O conheci­ mento da estrutura da comunidade microbiana e de como esta se mantém é importante pa­ ra futuras aplicações da medicina baseadas no controle da microbiota, o que também depen­ derá de informações sobre a influência de carac­ terísticas ambientais e genéticas do hospedeiro na modulação da microbiota. Estudos visando à identificação de genes envolvidos em doenças humanas têm, simultaneamente, investigado o efeito da presença ou da ausência dos genes na microbiota, sendo a maioria dos genes relacio­ nados com o sistema imunológico.41,42 A diversidade da microbiota e a ampla faixa de interações existentes no intestino humano são obstáculos a serem superados para o com­ pleto entendimento desse ecossistema. Somen­ te a identificação dos microrganismos presentes em um ecossistema não é suficiente para conso­ lidar os estudos de microbiomas e transformálos em aplicações, especialmente para a saúde humana. O sucesso dos estudos de biologia de

ecossistemas depende da geração de dados em quatro importantes aspectos do sistema: lista das partes; conectividade entre as partes e ade­ quação da conectividade no contexto de tempo e de espaço (Figura 1.3).43 A geração de dados por tecnologias metaô­ micas de high-throughput, como metagenô­ mica, metatranscriptômica, metaproteômica e metabolômica, está produzindo quantidades enormes de dados, contribuindo com informa­ ções sobre as partes. A reconstrução de vias me­ tabólicas em escala genômica é feita pela reu­ nião de todas as informações armazenadas em bancos de dados como KEGG, Brenda, BioCYC e Transporte DB e posterior combinação dos da­ dos com modelos matemáticos, com o objetivo de elucidar processos em sistemas complexos.

Por fim, a determinação da variação do modelo, ou dos modelos construídos, em escala espacial e temporal, possibilita prever o comportamento do sistema em diferentes condições, por meio de um modelo de estudo em quatro dimensões (Figura 1.3).42

Considerações finais Este capítulo teve como objetivo fazer uma breve introdução à microbiologia, consideran­ do a diversidade microbiana presente nos três domínios da vida, Archaea, Bacteria e Eukarya,

Aplicação

Microbioma

Escala temporal

Tecnologias metaômicas

Reconstrução de vias metabólicas

Elaboração de modelos matemáticos

Escala espacial

Avaliação do modelo

Modelo de estudo em 4D Lista das partes

Conectividade entre as partes

Conectividade no tempo

Conectividade no espaço

Figura 1.3 Estudo de biologia de ecossistemas em 4D. O trajeto entre os estudos de microbiomas e suas futuras aplicações não consiste em uma relação direta e simples, mas sim em elaborados estudos que envolvem a geração de dados em quatro importantes aspectos do sistema: lista das partes, conectividade entre as partes, conectividade no tempo e conectividade no espaço

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O Mundo Microbiano: Evolução e Diversidade

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Tatiana Fiche Salles Teixeira Monise Viana Abranches

TEMAS ABORDADOS NESTE CAPÍTULO É crescente o interesse em estudar a microbiota intestinal humana e a forma como a sua atividade metabólica pode influenciar a saúde e o bem-estar do hospedeiro. Todavia, para fins de transposição para o estudo da presença desses organismos no intestino e sua relação com a morfologia e fisiologia, diversos modelos animais, sistemas in vitro e cultura de células têm sido desenvolvidos para esse fim. Neste capítulo, serão abordados os principais modelos in vivo e in vitro desenvolvidos para o estudo da microbiota, os quais podem ser empregados por aqueles que planejam avançar nesse campo da pesquisa.

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Modelos Animais e Sistemas in vitro para Estudo da Microbiota Intestinal

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Microbiota Gastrintestinal | Evidências da Sua Influência na Saúde e na Doença

Introdução A microbiota intestinal pode ser estudada in vivo a partir de voluntários humanos sadios, enfermos, pacientes hospitalizados ileostomizados, vítimas de morte súbita, modelos animais e sistemas in vitro. Os estudos com humanos apresentam algumas limitações éticas e práticas, o que pode tornar a investigação pouco confiável ou limitada na amplitude das análises que podem ser realizadas, além das altas taxas de desistência do estudo pelos participantes.1 A disponibilidade de modelos animais para investigar os processos metabólicos mediados por microrganismos intestinais é de grande valor, uma vez que há possibilidade do controle desses pelas dietas e os pesquisadores têm acesso direto ao conteúdo intestinal, assim como aos tecidos e órgãos. Porém, o uso de modelos animais apresenta limitações:1 1. Em geral, são onerosos quando comparados aos modelos in vitro.

2. Em muitas circunstâncias, há necessidade de manejo e de instalações especiais.

3. A fisiologia digestiva dos modelos animais difere da fisiologia de humanos (p. ex., roedores são coprófagos, suínos têm trato digestório superior com maior número de microrganismos e trato digestório inferior maior).

A dificuldade de acesso ao trato digestório de humanos e as limitações do uso de modelos animais muitas vezes justificam a realização de estudos da microbiota in vitro, os quais possibilitam simular processos de fermentação que ocorrem ao longo do intestino grosso.1 Sistemas desenvolvidos recentemente tornam possível investigar a influência da colonização bacteriana intestinal sobre a fisiologia do hospedeiro e a ocorrência de doenças. Desse modo, o objetivo deste capítulo será discutir o uso de modelos animais e sistemas in vitro no estudo da microbiota intestinal.

Utilização de modelos animais no estudo da microbiota intestinal O estudo em modelos animais permite obter informações necessárias para o avanço no campo biomédico por possibilitar a observação

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de fenômenos biológicos, a investigação dos mecanismos envolvidos e o controle das condições externas.2 Os experimentos em animais têm sido adotados já há algum tempo e ainda é crescente o seu uso,3 mas vale ressaltar que em todas as etapas do desenvolvimento da pesquisa com animais é necessário ter postura ética.2

Histórico Os trabalhos de numerosos cientistas, especialmente microbiologistas, desenvolvidos desde o século 19, resultaram em importantes avanços do conhecimento no que se refere à microbiologia intestinal (Figura 3.1).4 Verificou-se já naquela época a importância dos probióticos na alimentação e sua relação com a saúde humana.

As técnicas de pesquisa avançaram muito e atualmente possibilitam avaliar em nível molecular (expressão gênica) a influência dietética sobre a composição microbiana e os papéis que metabólitos da microbiota intestinal exercem sobre o sistema imunológico do hospedeiro.5 As metodologias empregadas têm possibilitado inferir sobre a relação entre a microbiota intestinal e as características genéticas do hospedeiro, além de determinar a fisiologia de microrganismos.

Modelos animais são usados virtualmente em todos os campos da pesquisa biológica, inclusive para o estudo da interação microbiotahospedeiro. Já em 1865, Claude Bernard lançou os princípios do uso de animais como modelo de estudo e sua transposição para a fisiologia humana.6 Atualmente, a microbiota intestinal tem sido estudada em ratos, camundongos gnotobióticos e germ-free, porcos e peixe-zebra. Esses modelos possibilitam compreender como a colonização do hospedeiro afeta processos vitais do mesmo (crescimento normal, estabelecimento e manutenção do sistema imunológico associado à mucosa e funções das células epiteliais). Além disso, favorece o entendimento dos papéis desempenhados por grupos de microrganismos que podem ser analisados na perspectiva da saúde e da doença.7

Conceitos e definições Os animais utilizados em pesquisas devem atender parâmetros de qualidade genética e sanitária. Uma estratégia experimental que foi

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Menor sensibilidade à dor inflamatória

Aumento do ceco

Reduzido número de linfócitos organizados e difusos no tecido linfoide associado ao intestino

Prejuízo do desenvolvimento de tolerância oral

Reduzida formação de centros germinativos nas placas de Peyer

Metabolismo de colesterol e ácidos biliares prejudicado Animal germ-free Reduzida superfície intestinal, dada a redução das vilosidades

Reduzida peristalse

Baixa diversidade e menor secreção de imunoglobulinas

Prolongamento do ciclo celular das células intestinais

Acúmulo de muco com retenção de água, pela ausência de bactérias mucolíticas

Exagerada resposta ao estresse por meio do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal

Figura 3.2 Diagrama das alterações morfológicas e fisiológicas dos animais germ-free Fonte: adaptada de Sekirov et al., 2010;7 Falk et al., 1998;8 Tlaskalová-Hogenová et al., 2004.10

Tabela 3.1 Tipos de associações entre microrganismos e hospedeiro Monoassociado

Há inoculação de um único microrganismo. Fornece informações sobre o microrganismo, em especial como o hospedeiro responde ao estímulo na ausência de competição por outros microrganismos

Biassociados

São inoculadas duas cepas de microrganismos. Revela como ocorre a interação dos dois agentes entre si e com o hospedeiro, como a colonização conjunta altera as demandas metabólicas e o papel funcional estabelecido no ecossistema intestinal em função da competição por espaço e nutrientes7

Poliassociados

Há inoculação de mais de duas cepas de microrganismos. Um coquetel de bactérias conhecido como flora Schaedler alterada (altered Schaedler flora ou ASF) é usado em laboratórios, por refletir o ecossistema intestinal de um animal convencional (metade das espécies representa bactérias sensíveis ao oxigênio e do filo Firmicutes; há ainda representantes dos Bacteroidetes e dos Flexistipes). A vantagem dos animais ASF é que estes não precisam ser mantidos em condições germ-free porque a prole pode herdar a ASF da mãe colonizada7

importante considerar que a ação de determi­ nadas espécies de microrganismos isolados ou de metabólitos secretados pelos mesmos não reflete necessariamente o papel primário dessas espécies ou moléculas em um hospedeiro, uma vez que é complexa a interação microrganismo versus hospedeiro. No entanto, a comparação de animais germ-free com determinada doen­ ça, com o seu respectivo animal convencional (ou seja, com doença e microbiota) ou gnotoxê­

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nico com a doença tem sido útil para indicar o papel dos microrganismos na patofisiologia da enfermidade estudada.7 Em geral, os microrganismos inoculados em ratos e camundongos germ-free pertencem a espécies representativas dos filos dominantes.

Entretanto, suspensões fecais de doadores hu­ manos podem ser transferidas para animais germe-free, os quais são chamados animais asso­ ciados à microbiota humana ou animais HFA (do

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Modelos Animais e Sistemas in vitro para Estudo da Microbiota Intestinal

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Microbiota Gastrintestinal | Evidências da Sua Influência na Saúde e na Doença

inglês human flora-associated). Alguns exemplos de estudos recentes da microbiota utilizando ratos e camundongos são apresentados na Tabela 3.2.

O modelo gnotobiótico HFA é especificamente interessante para pesquisas com aplicações clínicas. Nesse modelo, é possível investigar como a microbiota humana interage com o hospedeiro receptor, e como intervenções dietéticas ou terapêuticas (probióticos, prebióticos, antibióticos) influenciam a morfologia,11 a ecologia intestinal e o metabolismo do hospedeiro.7 Para o desenvolvimento de animais HFA, as fezes de doadores humanos são diluídas 10 a 100 vezes em meios específicos como extrato de levedura glicose triptona (TGY) ou soluçõestampão. A suspensão é administrada por gavagem (1mL a 3mL/camundongo, diariamente durante a primeira semana de vida ou em dose única) e os animais são mantidos em isoladores.

A estrutura da gaiola deve preferencialmente evitar a coprofagia.11-13 O trabalho de Gérard et al. (2004)14 cita obtenção, manipulação e diluição da amostra fecal humana em caixas

anaeróbicas, um cuidado que pode ser tomado sempre que houver infraestrutura disponível.

A importância dos modelos HFA é justificada pela diferença encontrada entre o papel exercido pela microbiota intestinal em modelos HFA e em animais convencionais. O controle das condições experimentais – geralmente difícil de ser realizado em estudos com humanos – como condições genéticas, ambientais e dietéticas7,26 e a possibilidade de repetição do experimento nas mesmas condições são vantagens desse modelo. Além disso, os animais HFA podem ser testados com patógenos ou substâncias que não seriam permitidos em humanos e, ainda, podem ter o trato gastrintestinal (TGI) explorado minuciosamente, o que, em seres humanos, exigiria a aplicação de técnicas invasivas, dificultando tanto a participação de voluntários quanto a aprovação por comitês éticos para pesquisa em humanos.26 As limitações dos modelos HFA se relacionam com o fato de que o metabolismo intestinal do animal pode não refletir o de humanos em relação a algumas atividades metabólicas específicas, como diferenças nas concentra-

Tabela 3.2 Estudos da microbiota com ratos e camundongos Modelos para estudo da influência da microbiota sobre o sistema imunológico Animal

Característica

Aplicação

Referência

Estudo de alergia alimentar. A falta ou a sinalização prejudicada via TLR4 favorece a resposta anafilática antígeno-específica

Bashir et al. (2004)15

Camundongo C3H/HeJ

Expressa receptores tipo Toll 4 (TLR4) defeituoso

Camundongo C57BL/10ScNHsd

Deficiente em TLR4

Camundongo MYD88

Deficiente em MYD88, proteína adaptadora de TLR responsável pela ativação do fator NF-κB e consequente expressão de citocinas pró-inflamatórias (p. ex., fator de necrose tumoral)

Estudo do papel da microbiota intestinal em fisiologia do epitélio e inflamação intestinal16

Rakoff-Nahoum et al.

(2004)16

Camundongo IL-13−/−

Deficiente em IL-13

Papel da microbiota no desenvolvimento de resposta alérgica pulmonar

Noverr et al. (2005)17

Camundongo IL-1rn−/−

Deficiente no antagonista de IL-1. Desenvolvimento de artrite autoimune espontaneamente.

Associado a TLR2−/− e TLR4−/−

Estudo do desencadeamento da artrite espontânea dependente da ativação de TLR pela microbiota

Abdollahi-Roodsaz et al. (2008)18

Camundongo HLA-DQ8 sensível a gliadina

Desenvolve danos nas vilosidades intestinais quando estimulado com gliadina

Papel do probiótico L. casei na recuperação da arquitetura da mucosa e especialmente da homeostase do tecido linfoide associado ao intestino

D’Arienzo et al.

(2011)19

(continua)

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Tabela 3.5 Estudos da microbiota intestinal realizados em peixe-zebra Animal

Característica

Peixe-zebra selvagem

Modelo convencional

Peixe-zebra transgênico para o gene da mieloperoxidase

Expressa mieloperoxidase

Peixe-zebra germ-free

Sem microbiota

Peixe-zebra gnotobiótico mono e poliassociado

Associado a uma ou a várias espécies bacterianas

Peixe-zebra selvagem

Modelo convencional

Peixe-zebra (FAI-deficiente)

Deficiente em fosfatase alcalina intestinal

Peixe-zebra gnotobiótico monoassociado

Associado a espécies de Aeromonas ou Pseudomonas

Peixe-zebra selvagem (Ab/Tu)

Modelo convencional

Peixe-zebra

axin1tm213

Mutante para axina 1. A axina 1 reduz a expressão de betacatenina e, consequentemente, inibe a sinalização via Wnt

Peixe-zebra tcf4exl

Mutante para tcf4. Esse modelo animal perde os compartimentos proliferativos dentro do epitélio intestinal

Peixe-zebra germ-free

Sem microbiota (foram monoassociados)

Peixe-zebra transgênico para proteína G fluorescente (PGF)

Expressa PGF sobre controle transcricional do gene NF-κB

Peixe-zebra selvagem

Modelo convencional

Peixe-zebra ΔfliC

Deficiente em flagelina

Peixe-zebra ΔmotABCD

Deficiente em estatores flagelares

Aplicação

Referência

Verificar se componentes da microbiota intestinal afetam a composição do infiltrado de células imunes intestinais e a gravidade da inflamação

Brugman et al.

(2009)42

Descrever o estabelecimento da microbiota intestinal e seu papel na diferenciação do trato digestório

Bates et al.

(2006)43

Avaliar se a expressão de fosfatase alcalina intestinal é induzida durante o estabelecimento da microbiota e se o mecanismo envolvido na ação dessa fosfatase é dependente de MYD88 e fator de necrose tumoral

Bates et al.

(2006)43

Avaliar se a proliferação intestinal é estimulada pela presença da microbiota residente, sinalização via receptor MYD88 e consequente ativação de Wnt

Cheesman et al.

(2011)44

Analisar a ativação do fator transcricional NF-κB em resposta a fatores da microbiota comensal

Kanther et al.

(2011)45

∆: o símbolo utilizado significa deleção – no primeiro caso foi feita deleção de genes que codificam flagelina (por isso o animal é deficiente em flagelina); no segundo caso foi feita deleção de genes relacionados aos estatores flagelares.

FAI: fosfatase alcalina intestinal; MYD88: proteína de resposta à diferenciação mieloide 88; NF-kB: fator nuclear kappa B.

A dificuldade de avaliar as interações de pro­ dutos da fermentação e microambiente intestinal pode ser contornada pelo estudo da influência dessas substâncias sobre culturas celulares.

São apresentados a seguir os principais sistemas in vitro utilizados para o estudo da microbiota.

Quimiostato Pelo domínio da proporção e da composição dos nutrientes administrados, esse modelo possibilita controlar o metabolismo bacteriano e as condições ambientais. São os aparatos mais simples para o cultivo de microrganismos (Figura 3.3).

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Os nutrientes necessários para o crescimento celular são fornecidos continuamente para o compartimento fermentador (culture vessel) por uma bomba conectada ao reservatório do meio de cultura. Resíduos de nutrientes e células são removidos do compartimento fermentador na mesma taxa por transbordamento, o que mantém o volume da cultura no fermentador constante. A taxa de diluição é um importante aspecto do cultivo em quimiostato, definida como o volume de meio fornecido por hora dividido pelo volume da cultura. Durante o cultivo, um estado de equilíbrio é alcançado, no qual a taxa de crescimento das células iguala-se à taxa de diluição. Quanto maior a taxa de diluição, mais

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Modelos Animais e Sistemas in vitro para Estudo da Microbiota Intestinal

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Microbiota Gastrintestinal | Evidências da Sua Influência na Saúde e na Doença

Figura 3.3 Representação esquemática de funcionamento do quimiostato Fonte: adaptada de Waldir et al., 2007.47

rapidamente os microrganismos podem crescer, até certo limite. A biomassa (concentração de células) no fermentador depende da concentração do nutriente limitante para o crescimento das células no meio fornecido ao sistema.46 As vantagens desse sistema é poder trabalhar de modo eficaz com elevada densidade de células microbianas (semelhante à encontrada no cólon) e controlar o metabolismo microbiano e as condições ambientais segundo a proporção e a composição de nutrientes fornecidos ao sistema.46 Um exemplo do emprego de quimiostato é para o estudo do efeito de diferentes antibióticos sobre a microbiota humana, uma vez que o uso de antibióticos pode impactar os seguintes aspectos da microbiota: mudança da contagem de bactérias e aspectos metabólicos, incidência de bactérias resistentes a antibióticos e mudanças na habilidade da microbiota residente de evitar colonização por enteropatógenos potenciais.36,38

Simulador do ecossistema microbiano intestinal humano (Simulator of the human intestinal microbial ecosystem – SHIME) O intestino grosso como um sistema rém essa descrição porque somente o

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é frequentemente descrito microbiano contínuo, poé algo muito simplista. Isso ceco e o cólon ascendente

exibem características de uma cultura contínua.

Essas porções do intestino recebem os produtos da digestão do intestino delgado e atuam como uma câmara de mistura. Os resíduos passam então para a porção distal do intestino para serem momentaneamente armazenados, e a mistura não mais ocorre. Devido às restrições no fornecimento do substrato, as bactérias crescem aceleradamente ou não. Por essa razão, é difícil reproduzir in vitro a dinâmica fermentativa em sua totalidade in vivo. O emprego de sistemas de culturas contínuos multiestágios se aproxima mais dessa consideração por facilitarem estudos em longo prazo e possibilitarem que perturbações da microbiota sejam investigadas sob condições em que o crescimento das culturas tenha alcançado a fase estacionária (steady-state). Um modelo baseado nesse sistema é mostrado na Figura 3.4, o qual tem cinco estágios, todavia modelos mais simples, como o de três estágios, também podem ser utilizados.37 Esse sistema, descrito por Molly et al. (1993)49 e utilizado por Decroos et al. (2006),50 é formado por cinco reatores sucessivos, que representam diferentes partes do TGI humano (estômago, intestino delgado, cólons ascendente, transverso e descendente). A divisão do sistema em vários estágios é justificada pelas diversas reações de fermentação que ocorrem nas diferentes regiões do intestino grosso.46 Os primeiros dois reatores funcionam por meio do princípio de enchimento e esvaziamento, simulando diferentes passos

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Monise Viana Abranches Tatiana Fiche Salles Teixeira

TEMAS ABORDADOS NESTE CAPÍTULO O intestino de mamíferos é um local onde residem comunidades complexas de trilhões de bactérias que interagem de maneira dinâmica com o sistema imunológico do hospedeiro. Determinar os princípios que regem a relação microbiota-hospedeiro é o objetivo de muitos estudos. Neste capítulo, será descrito como a microbiota intestinal pode influenciar o desenvolvimento do sistema imunológico e como este, por sua vez, regula a colonização de microrganismos intestinais.

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Microbiota Intestinal e Sistema Imunológico: Uma Via de Mão Dupla

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Microbiota Gastrintestinal | Evidências da Sua Influência na Saúde e na Doença

Introdução A principal interface do organismo com o seu ambiente é representada pelas superfícies co­ bertas por células epiteliais. O trato gastrintesti­ nal (TGI) é exposto a um incontável número de antígenos estranhos. Além de substâncias inge­ ridas pela alimentação, o TGI e outras superfí­ cies mucosas e epiteliais estão expostos a um número de células microbianas dez vezes maior (1014) que o número de células do corpo hu­ mano (1013).1 Nesse sentido, o organismo hos­ pedeiro precisa se proteger da ação de agentes externos patogênicos potencialmente nocivos e, ao mesmo tempo, tolerar outros microrga­ nismos residentes que auxiliam na absorção e na utilização de nutrientes. Para tanto, o TGI dispõe de uma rede única e complexa de meca­ nismos imunológicos e não imunológicos, de­ nominada “barreira mucosa gastrintestinal”.2 O termo “barreira mucosa gastrintestinal” é bastante amplo e se refere à interação de vários componentes do TGI: camada de células epite­ liais, células imunes e células especializadas do epitélio intestinal, estruturas proteicas como as junções de oclusão (tight junctions) e as subs­ tâncias liberadas pelas diversas células do TGI como citocinas, bacteriocinas e muco. Uma das funções dessa barreira é discriminar antígenos benéficos dos prejudiciais e assim evitar, por meio de interações locais e sistêmicas, a infec­ ção do TGI por patógenos, por exemplo, veicu­ lados por alimentos.1,2 A mucosa gastrintestinal apresenta mais cé­ lulas linfoides do que o baço, os linfonodos pe­ riféricos e o sangue, e as células B associadas ao intestino representam 80% de todas as células B do corpo.3 Esses dados indicam o quanto a mi­ crobiota intestinal tem potencial de influenciar o estado de saúde geral por meio de interações com o sistema imunológico gastrintestinal. As­ sim, desequilíbrios principalmente na atividade imunológica, os quais podem ser desencadea­ dos por alterações na composição ou na ativi­ dade metabólica da microbiota, têm o potencial de induzir processos inflamatórios locais e sis­ têmicos envolvidos com doenças infecciosas ou inflamatórias (alergias), doenças autoimunes, entre outras.1 O objetivo deste capítulo é forne­ cer evidências de como a microbiota intestinal pode influenciar o desenvolvimento do sistema imunológico e como este, por sua vez, regula a colonização de microrganismos intestinais.

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Estrutura do sistema imunológico do trato gastrintestinal Em geral, a elevada carga bacteriana não causa doença ao hospedeiro quando permanece den­ tro do lúmen intestinal em uma relação de co­ mensalismo ou simbiose. Porém, a translocação de microrganismos viáveis ou de partes de sua estrutura celular (como lipopolissacarídeo [LPS], flagelina, peptidioglicano) a partir do TGI de­ sencadeia respostas imunológicas, que, quando exacerbadas, podem causar prejuízos à fisiologia do hospedeiro. O crosstalk entre células imunes do hospedeiro e a microbiota parece contribuir para o desenvolvimento de uma barreira imu­ nológica. Comparações entre animais mantidos em condições germ-free e aqueles colonizados por bactérias demonstram que as bactérias no TGI estimulam a proliferação e a diferenciação de células B e subgrupos de células T mucosas.

Assim, as células imunes desenvolvidas pelo es­ tímulo de bactérias intestinais são adaptações do hospedeiro para estabelecer uma barreira contra a entrada de bactérias nocivas ou não.4 A barreira imunológica do TGI é composta por vários tipos celulares e estruturas organiza­ das e bem delimitadas. Para nos aprofundar­ mos nesse campo, é necessário, primeiramente, compreender as estruturas do sistema imunoló­ gico associado às mucosas: ■■ Tecido linfoide associado à mucosa organizado (O-MALT): formado por locais indu­ tivos especializados.5 ■■ Tecido linfoide associado à mucosa difuso (D-MALT): composto por locais efetores di­ fusos, os quais são separados da superfície mucosa por barreiras epiteliais.5 ■■ No intestino, o tecido linfoide associado à mucosa (MALT) recebe a sigla GALT, do inglês gut-associaed lymphoid tissue: as estruturas consideradas como locais induti­ vos no GALT são as placas de Peyer (PP) e os linfonodos mesentéricos (LNM), enquanto os locais efetores estão distribuídos ao longo da lâmina própria (LP).6 As PP têm aparência anatômica de órgãos linfoides secundários clássicos, com zonas de células B e T claramente definidas. As células imunológicas que compõem o GALT são as

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células T, B e dendríticas (CD) com caracte­ rísticas fenotípicas distintas, além de células únicas como células M (microfold cell), células de Paneth e linfócitos intraepiteliais. Na muco­ sa intestinal, as PP são recobertas por epitélio contendo células M, que, de maneira não espe­ cífica, captam antígenos do lúmen e os trans­ ferem para linfócitos, e células apresentadoras de antígenos abrigadas na região basolateral (Figura 7.1). Uma vez tendo ocorrido a apre­ sentação de antígenos às células T e B, estas se movem para os vasos linfáticos eferentes para se dirigirem até os nódulos linfáticos e, por fim, entrarem na circulação periférica por meio do ducto torácico. As células T e B ativadas por antígenos seletivamente retornam aos locais efetores da mucosa e fixam residência como linfócitos intraepiteliais ou como linfócitos da lâmina própria,7,8 seguida pela expansão clonal (proliferação), indução local de expressão de citocinas e produção de anticorpos, especial­ mente IgA5 (Figura 7.1).

Considerando a complexidade da função de barreira intestinal e dos mecanismos de reco­ nhecimento dos antígenos patogênicos, são descritos na Tabela 7.1 os principais componen­ tes do TGI que participam desses processos.1

Microbiota e desenvolvimento do sistema imunológico A crença de que o feto é microbiologicamente estéril até o momento da primeira exposição microbiana durante o parto direcionou o pensa­ mento de que o sistema imunológico começaria a se desenvolver de fato no período pós-natal.9 Isso porque, após o nascimento, as superfícies mucosas são rapidamente colonizadas por mi­ crorganismos sob a influência de crescimento, idade, dieta e ambiente.10 O estabelecimento da microbiota no TGI após o nascimento, jun­ tamente com outros antígenos ambientais, es­

Figura 7.1 Representação esquemática das vias indutiva e efetora que ocorrem na mucosa intestinal em virtude da presença de antígenos patogênicos no lúmen intestinal Fonte: adaptada de Cerf-Bernsussan & Gaboriau-Routhiau, 2010;12 Ramiro-Puig et al., 2008.13

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Microbiota Intestinal e Sistema Imunológico: Uma Via de Mão Dupla

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Microbiota Gastrintestinal | Evidências da Sua Influência na Saúde e na Doença

Célula caliciforme produtora de muco

Célula epitelial intestinal

As células de Paneth contêm fosfolipase A2, lisozima, DNase, tripsina e inibidores de tripsina e peptídios antimicrobianos (defensinas)

Célula de Paneth

Pré-peptídios são liberados e ativados em resposta ao estímulo microbiano

Figura 7.2 Representação esquemática da cripta intestinal do intestino grosso evidenciando a célula de Paneth e a produção e liberação de substâncias antimicrobianas DNase: desoxirribonuclease.

Fonte: adaptada de Cerf-Bernsussan & Gaboriau-Routhiau, 2010;12 Ramiro-Puig et al., 2008;13 Dahan et al., 2007;28 Axelsson & Mahida, 2000.29

ativo foi demonstrado após a administração in­ tragástrica de Enterobacter cloacae a roedores.

Nesse caso, foi possível perceber que CD e ma­ crófagos interagem com essa cepa de maneiras distintas. Bactérias viáveis foram recuperadas somente nas CD residentes de LNM, e não nas células do baço ou outros tecidos sistêmicos, in­ dicando que essas células não são eficazes em eliminar microrganismos. O confinamento de bactérias vivas no LNM evitou a ativação sistê­ mica do sistema imunológico. Já os macrófagos isolados de LNM ou PP foram capazes de elimi­ nar a referida linhagem.21,30 Ambos, macrófa­ gos e CD, podem iniciar processos inflamatórios diante do contato com LPS. A grande diferença entre essas células é que os macrófagos, ao en­ trarem em contato com LPS, são ativados, ini­ ciam o processo inflamatório, mas persistem no tecido e posteriormente expressam um fenótipo anti-inflamatório a fim de restaurar a homeos­ tase tecidual. Já as CD adquirem a capacidade de migrar, produzir citocinas inflamatórias e, após sofrerem diferenciação terminal, morrem por apoptose.23 Bactérias comensais que sobrevivem nas CD locais intestinais induzem a secreção de IgA que contribui para a prevenção da translocação da microbiota comensal através da mucosa.22,30 A

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secreção de IgA e o recrutamento de células T para a mucosa são situações estritamente de­ pendentes de sinais derivados da microbiota.

Esses sinais influenciam diretamente a comu­ nicação entre células epiteliais e CD, modu­ lando a natureza e a intensidade das respostas das células B e T intestinais. Em camundongos imunocompetentes, a colonização intestinal esti­ mula a secreção de IgA, a diferenciação de cé­ lulas T helper efetoras para os padrões de res­ posta Th1, Th2 e Th17 e o desenvolvimento de células Treg.12 A diversidade de células presentes na PP, como subpopulações de CD mieloide (CD11c+ CD11b+), linfoide (CD11c+CD8α+) e duplo-ne­ gativa (CD11c+CD11b−CD8α−), indica que os diferentes fenótipos estejam associados a dis­ tintas funcionalidades que se complementam.

Embora as três subpopulações de CD expressem níveis semelhantes do MHC II e moléculas coes­ timulatórias, diante de estimulação, as CD mie­ loides da PP têm capacidade particular de secre­ tar interleucina (IL)-10, ao passo que as linfoides produzem predominantemente IL-12 p70. Além disso, somente as CD mieloides da PP estimu­ lam a rápida proliferação de células T antígenoespecíficas e induzem a produção, por essas células, de altas concentrações de IL-4 e IL-10,

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Márcia de Carvalho Vilela David Henrique Rodrigues

TEMAS ABORDADOS NESTE CAPÍTULO Há evidências recentes de que as interações do sistema imunológico com o sistema nervoso central e, em outro extremo, da microbiota com o sistema imunológico, indicam o potencial das bactérias intestinais em influenciar o funcionamento do sistema nervoso e, com isso, o comportamento do hospedeiro. Nesse sentido, o objetivo deste capítulo é descrever alguns mecanismos que têm sido propostos para explicar a influência indireta (via sistema imunológico) ou mesmo direta da microbiota intestinal sobre o sistema nervoso central.

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Interações entre a Microbiota Intestinal e o Sistema Nervoso

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Microbiota Gastrintestinal | Evidências da Sua Influência na Saúde e na Doença

Introdução A simbiose entre o corpo humano e a microbiota intestinal é imprescindível para a manutenção da vida. Além de participar do processo final de digestão e absorção de alimentos, as bactérias presentes no intestino também são essenciais para o correto funcionamento do sistema imunológico. Há trabalhos mostrando que a resposta imunológica em animais que não têm microbiota, denominados camundongos germ-free, é profundamente alterada1 e, recentemente, levantou-se a hipótese de que alguns elementos do sistema imunológico existem para que nosso corpo possa estabelecer a simbiose com essas bactérias.2 Sabe-se que uma das regiões em que a presença do sistema imunológico é bastante limitada é no sistema nervoso central. Entretanto, a literatura recente vem refutando o tradicional dogma de que o sistema nervoso é um órgão “imunoprivilegiado” e inacessível a influências imunológicas. Algumas das evidências da interação do sistema imunológico com o sistema nervoso central são: ■■ O sistema imunológico é capaz de modular o desenvolvimento e o funcionamento cerebral durante o crescimento e na vida adulta.3 ■■ Neurônios, astrócitos e micróglia expressam receptores de moléculas produzidas por células imunológicas4 e neurônios respondem a moléculas do sistema inato, como citocinas, quimiocinas e componentes da cascata do complemento.5 ■■ As citocinas (ou interleucinas) IL-1 e IL-6 impedem a potenciação de longa duração nas sinapses que conectam neurônios hipocampais da região do cornu Ammonis 3 (CA3) com os neurônios da região CA1. Essa sinalização neurológica é importante para a consolidação da memória e do aprendizado.6 Assim, considerando-se os vários pontos em que esses sistemas interagem, não é surpreendente que o comportamento, um fenômeno que é produto do sistema nervoso, seja influenciado por alterações no sistema imunológico.

Em diversas doenças, frequentemente em infecções virais, o paciente relata um estado de desânimo, anedonia, enfraquecimento e falta de apetite. Esse conjunto de sinais não específicos é coletivamente referido como comportamen-

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to do doente ou sickness behavior, pois ocorre tanto em animais quanto nos seres humanos7 e resulta de alterações no sistema imunológico do doente provocadas por infecções causadas por microrganismos.

Na condição em que o hospedeiro é infectado por bactérias, o sistema imunológico pode iniciar uma resposta inflamatória. As células do sistema imunológico produzem citocinas próinflamatórias e mediadores como as prostaglandinas, que são sinalizadoras para os sistemas nervosos central e periférico8 em resposta ao lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano. Funções cerebrais como termorregulação, controle endócrino, sono, comportamento social e aprendizagem são alterados nos pacientes acometidos por bactérias patogênicas.

Percebemos, então, que existe clara interação do sistema imunológico com o sistema nervoso central e, em outro extremo, interação da microbiota com o sistema imunológico (Figura 13.1). A questão seguinte, inevitável, é se a microbiota intestinal teria influência indireta (via sistema imunológico) ou mesmo direta sobre o sistema nervoso central.

Evidências da interação de microbiota intestinal e sistema nervoso central Qual seria o efeito sobre o comportamento se um animal estivesse privado da microbiota intestinal? Essa pergunta pode ser respondida utilizando-se animais criados em uma condição especial, em que eles não entram em contato com nenhum microrganismo e, assim, não adquirem a microbiota. Esses camundongos livres de microbiota representam uma interessante ferramenta para investigar as possíveis influências das bactérias intestinais no comportamento do hospedeiro.9

Ansiedade A ansiedade é um fenômeno comportamental provocado por estruturas do sistema nervoso central, particularmente a amígdala. A ansiedade pode ser definida como um senso de descontrole focado principalmente em possíveis ameaças ou potenciais eventos negativos futuros. Acompanhando esse estado emocional ne-

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Neurônio

Corrente sanguínea

Via nervo vago

Via fatores plasmáticos (intestino)

Corrente sanguínea

Células do intestino

Microbiota

Figura 13.1 Mecanismos de comunicação entre sistema nervoso central e microbiota intestinal. Fatores produzidos no intestino (círculos pequenos pretos) sob influência da microbiota (bastões) podem ser absorvidos por células do intestino, ter acesso à corrente sanguínea e se ligar a receptores presentes em neurônios no sistema nervoso central. Como alternativa, fatores produzidos no intestino podem se ligar ao nervo vago, que transmitirá o sinal para o sistema nervoso central

gativo, ocorre um componente fisiológico que pode refletir-se na ativação de alguns circuitos cerebrais.10 A ansiedade pode ser medida em animais por meio de testes padronizados, em que a reação do animal a determinado estímulo é classificada como de maior ou menor ansiedade. No contexto inflamatório, citocinas próinflamatórias podem acessar o sistema nervoso central e interagir com circuitos neuronais que regulam a ansiedade.11

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Na idade adulta, os animais livres de microbiota apresentam menos ansiedade do que animais que têm microbiota intestinal.9 Naqueles, há maiores níveis de neurotransmissores como a noradrenalina, a dopamina e a serotonina9 e alterações na expressão de genes relacionados com a ansiedade em regiões específicas do córtex frontal em relação aos animais que apresentam microbiota. Essas alterações parecem não ser permanentes nos animais livres de micro-

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Interações entre a Microbiota Intestinal e o Sistema Nervoso

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Joice de Fátima Laureano Martins Tatiana Fiche Salles Teixeira Hudsara Aparecida de Almeida Paula Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira

TEMAS ABORDADOS NESTE CAPÍTULO O uso de espécies de microrganismos com potencial de trazer benefícios à saúde de seus consumidores é uma tendência de mercado, e os produtos contendo esses microrganismos em níveis suficientes para exercer efeitos benéficos são considerados probióticos ou simbióticos. A fabricação e o marketing desses produtos são processos complexos. Neste capítulo, serão abordados aspectos gerais das principais etapas do processo produtivo de probióticos e as alegações de propriedade funcional.

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Probióticos e Simbióticos: Aspectos Tecnológicos e Alegações de Propriedades Funcionais

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Microbiota Gastrintestinal | Evidências da Sua Influência na Saúde e na Doença

Introdução Alimentos fermentados e alimentos contendo microrganismos vivos são conhecidos mundialmente. Tradicionalmente, a fermentação de alimentos era utilizada para possibilitar que os produtos pudessem ficar por mais tempo nas prateleiras devido à redução de pH, para melhorar o sabor pela produção de metabólitos microbianos ou para alterar a textura pela quebra de carboidratos.1,2 Inicialmente esses produtos eram obtidos por fermentação espontânea a partir do desenvolvimento da microbiota naturalmente presente nos alimentos crus. À medida que os alimentos fermentados foram ganhando mercado e exigindo produção em maior escala pela indústria alimentícia, os métodos de produção evoluíram para processos fermentativos altamente controlados e padronização do produto final. O uso de iniciadores da fermentação (denominados culturas starter) – definidos como uma preparação de número concentrado de células de pelo menos um tipo de microrganismo a ser adicionado a uma matriz alimentar para acelerar e direcionar o processo fermentativo – é comum na produção de alimentos fermentados.1 As bactérias produtoras de ácido lático (BAL) ocupam um papel central como culturas starter por causarem rápida acidificação da matriz orgânica devido à produção de ácidos orgânicos, principalmente ácido lático, além de terem um longo histórico de uso e segurança na produção de alimentos.1 O uso de microrganismos vivos na produção de alimentos foi considerado por muito tempo apenas uma maneira de acelerar o processo fermentativo e promover alterações da matriz original que agregassem valor ao produto, particularmente por características sensoriais.

A disseminação do conceito de alimentos fun­cionais e o aumento de evidências de que bactérias podem beneficiar a saúde e o metabolismo humano estimularam o desenvolvimento e a comercialização de uma subcategoria de alimento funcional – os alimentos probióticos e simbióticos − os quais podem proporcionar benefícios à saúde por conterem microrganismos vivos em quantidades adequadas.2 Os produtos probióticos e simbióticos (combinação de ingredientes probióticos e prébióticos) são elaborados de formas variadas, fermentadas ou não, como iogurtes, leites fer-

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mentados, sorvetes, sucos, queijos processados, cereais, produtos à base de soja, suplementos em cápsula, sachês ou pó.1,3-6 No entanto, produtos derivados do leite representam o maior segmento do mercado de produtos probióticos por duas razões:7 ■■ Élie Metchnikoff, considerado o precursor dos probióticos, identificou que o consumo de leite fermentado estava associado à longevidade de um grupo caucasiano e propôs que bactérias produtoras de ácido no leite poderiam evitar o acúmulo de toxinas no intestino. Mais tarde, isso despertou o interesse de outros pesquisadores na identificação de bactérias do ácido lático de origem intestinal, dando origem aos probióticos.6 ■■ Em geral, os consumidores são familiarizados com a noção de que produtos fermentados contêm microrganismos viáveis. Alimentos fermentados derivados do leite já contam com registros e tradições culturais de serem alimentos saudáveis, e essa imagem facilita a recomendação de consumo diário de probióticos.6 O desenvolvimento de produtos probióticos é um mercado em expansão, que paralelamente tem atraído esforços de vários setores (universidades, órgãos governamentais, indústria) para a elaboração de guias que proponham um modo de avaliação sistemática de um microrganismo probiótico,8,9 por meio da identificação e do estabelecimento de requerimentos mínimos necessários para o enquadramento do microrganismo como probiótico. Algumas recomendações incluem: a linhagem potencialmente probiótica deve ser avaliada e documentada independentemente; a extrapolação de resultados de linhagens relacionadas não é aceitável; somente linhagens, produtos e estudos populacionais bem definidos devem ser usados em investigações clínicas; quando possível, os estudos humanos devem ser preferencialmente randomizados, duplos-cegos e controlados por placebo; os resultados devem ser confirmados por grupos de investigadores independentes e publicados em jornais revisados.10 Sob uma perspectiva industrial, não basta demonstrar que um microrganismo exerce efeito benéfico em modelo animal ou humano, sendo importante também considerar os aspectos tecnológicos para viabilizar a produção em larga

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escala de produtos probióticos que mantenham a qualidade nutricional e funcional até o prazo de validade do produto. Nesse sentido, este capítulo aborda aspectos gerais das principais etapas do processo produtivo de probióticos e as alegações de propriedade funcional.

Desafios tecnológicos na produção de produtos lácteos diversificados O crescimento do mercado de alimentos funcionais e a busca dos consumidores por alimentos com propriedades de promover benefícios à saúde impõem desafios para a indústria no sentido de reduzir aditivos, preservar o produto e melhorar as propriedades organolépticas. Na busca por alternativas, um dos pontos-chave para intervenções na produção de alimentos fermentados como iogurte, queijos e leite fermentado é a seleção de culturas starters, as quais, quando cuidadosamente selecionadas, podem contribuir para que as propriedades desejadas sejam obtidas no produto in situ.11 É importante entender que um microrganismo probiótico veiculado em um alimento é de origem humana. Outras bactérias utilizadas no desenvolvimento do produto probiótico para

proporcionar características sensoriais, como as bactérias da cultura starter, embora não sejam de origem humana, podem acrescentar “valor probiótico” ao produto final (no sentido de proporcionar algum benefício para o organismo de quem consome o produto), por exemplo, pela liberação de enzimas que facilitam a digestão de nutrientes e produção de peptídios bioativos com ações imunomodulatórias ou anti-hipertensivas.11 Culturas starters, como Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e L. lactis proporcionam benefício ao hospedeiro, entretanto não são de origem humana e são menos resistentes ao suco gástrico e à presença de ácidos biliares do que bactérias probióticas (L. casei, L. rhamnosus, L. acidophilus, Bifidobacterium sp., B. bifidum e B. longum) in vitro.11 As culturas starter industrializadas muitas vezes são desprovidas de características necessárias para a diversificação de produtos. O uso de culturas starter de bactérias do ácido lático tem sido atualmente explorado para a diversificação dos produtos. As culturas que apresentam pelo menos uma propriedade inerente que contribua para a segurança do produto ou ofereça benefícios organolépticos, tecnológicos, nutricionais ou de saúde (Tabela 16.1) podem contribuir para o “valor probiótico” de alguns alimentos.1,11

Tabela 16.1 Benefícios do uso de bactérias do ácido lático como culturas starters Benefícios

Funcionalidade

Bactérias

Segurança

Produção de bacteriocinas in situ e prevenção de deterioração

L. lactis subsp. lactis L. reuteri (reuterina) L. plantarum

Organoléptica

Aumento da doçura pela produção de L-alanina

L. lactis, L. delbrueckii subsp. bulgaricus

Intensificação do sabor pela produção de compostos aromáticos a partir da atividade de peptidases microbianas em queijos

L. lactis subsp. cremoris

Melhora da textura pela produção in situ de exopolissacarídeos

L. delbrueckii subsp. bulgaricus S. thermophilus

Resistência a fagos

Várias linhagens

Aceleração do processo de maturação pela autólise de células starter induzida por bacteriocina (liberação de peptidases in situ)

L. lactis

Produção de vitaminas

L. delbrueckii subsp. bulgaricus S. thermophilus

Produção de peptídios bioativos

Várias espécies

Produção de poliol, com consequente redução de açúcar no produto

L. plantarum

Remoção da lactose

S. thermophilus

Tecnológica

Nutricionais

Fonte: adaptada de Leroy & Vuyst,

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Probióticos e Simbióticos: Aspectos Tecnológicos e Alegações de Propriedades Funcionais

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cação de estresse subletal antes da desidratação ajuda a garantir maior viabilidade de culturas bacterianas e retenção da atividade fisiológica.

O momento de aplicação desse estresse deve observar a fase de crescimento das células (log, lag, estacionária e morte), pois a resposta de maior resistência é superior na fase estacionária em comparação com a fase log.29,32 A sobrevivência de probióticos liofilizados é influenciada por temperatura de armazenamento, umidade do pó, umidade relativa, composição do pó, conteúdo de oxigênio e exposição à luz.

A viabilidade durante o estoque é inversamente proporcional à temperatura de armazenamento, sendo –18°C a temperatura recomendada para armazenamento em longo prazo. A oxidação de lipídios de membrana pode ser contornada pela adição de antioxidantes, e as células podem ser protegidas por microencapsulação por diferentes técnicas (emulsão, polímeros catiônicos, revestimento com outros polímeros).32 A reidratação do pó probiótico é o passo final crítico para a recuperação de células após a desidratação. Essa etapa é dividida em quatro passos: umedecimento, submersão, dispersão e dissolução. O primeiro passo é geralmente o passo de controle da reconstituição. A taxa de recuperação do estado viável, e consequentemente as taxas de sobrevivência, é influenciada pela solução de reidratação (osmolaridade, pH e fontes de energia nutricionais) e pelas condições do processo (temperatura e volume), que devem ser observadas antes da adição dos probióticos ao alimento.32 O conhecimento das propriedades tecnológicas dos microrganismos associado a uma noção do panorama geral do processo produtivo é essencial para o futuro desenvolvimento de produtos ou mesmo de novas tecnologias que resultem em maior rendimento de células viáveis ao final do processo de produção. A Figura 16.4 resume alguns aspectos de cada etapa de produção que precisam ser conhecidos e considerados para a escolha de alternativas tecnológicas que aumentem a sobrevivência e a viabilidade dos microrganismos de interesse.

Dificuldades para adição de cultura A adição de bactérias probióticas aos produtos lácteos apresenta uma série de dificuldades,

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sendo as principais a pouca palatabilidade e o longo tempo de fermentação. Por exemplo, bactérias bífidas crescem pouco no leite, e a fabricação dos produtos que as contêm é demorada. Além disso, como as bactérias bífidas também são anaeróbias estritas, seu manuseio é difícil, o que requer um baixo potencial redox (Eh) para iniciar crescimento, além de uma série de fatores de crescimento. A taxa de produção de ácido de um produto lácteo é crítica e irá definir suas características de qualidade e vida de prateleira. Para a segurança da fabricação, um produto lácteo probiótico deve alcançar pH de 4,6 no máximo em 24h, e geralmente as culturas probióticas não têm essa capacidade. Para contornar essa situação, empregam-se os chamados microrganismos ajustadores biológicos (Tabela 16.4), principalmente dos gêneros Lactococcus, Streptococcus e Lactobacillus. O emprego dessas bactérias tem como objetivos aumentar taxa de produção de ácido, diminuir o tempo de fabricação e melhorar o aroma, a textura e o sabor.33 Desse modo, os principais fatores que influenciam a sobrevivência dos probióticos são: temperatura (ao longo de todo o processo, inclusive de transporte e armazenamento no local de comercialização); atividade de água (na atmosfera, de outros ingredientes liofilizados adicionados, excipientes); pH (durante a fermentação, de ingredientes ácidos adicionados ou mesmo da matriz alimentar); e compostos antimicrobianos (conservantes, compostos bioa­ tivos como antocianinas).25 As diretrizes gerais para a produção de alimentos probióticos são: ■■ Uso de estirpes resistentes às condições de produção.

■■ Proteção da estirpe.

O processo de microencapsulação é um exemplo de alternativa para proteção da estirpe em produtos. Gelatina, gomas vegetais ou alginato podem ser usados como membranas que encapsulam a célula microbiana, protegendo a mesma de lesões.25 ■■ Ajuste da matriz alimentar ao probiótico. A composição química do produto lácteo influencia a atividade metabólica do microrganismo, como: o tipo e a quantidade de carboidrato disponível; o grau de hidrólise de proteínas do leite (determina a disponibilidade de aminoácidos essenciais); a composição e o grau de hidrólise de lipídios do leite (de-

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Fermentação

 Adequação dos ingredientes do produto para favorecer o crescimento da estirpe  Adequação do ingrediente a ser fermentado para o público-alvo do produto (alergenicidade)  Ajustes de tensão de oxigênio, pH, temperatura (°C), agitação para otimizar condições de crescimento, rendimento e estabilidade

Concentração

 Importante concentrar as bactérias por meio de resfriamento, centrifugação e filtração em membrana

Estabilização

 Pode ser realizada por meio de crioproteção e secagem de proteção  Lactose comumente utilizada nesta etapa. Se for uma indústria que comercializa culturas para empresas que produzem alimentos para públicos especiais como lactose-free, métodos alternativos devem ser adotados  A redução da atividade de água melhora a estabilidade, mas é um desafio. Por exemplo, a liofilização pode formar poros na membrana das bactérias, mas o uso de açúcar+fosfato ajuda a estabilizar a membrana  As bactérias podem ser submetidas a um préestresse (como bile, calor, NaCl) para a seleção daquelas que respondem bem ao estresse

Congelamento e secagem

Blending

Embalagem e armazenamento

 A comercialização da cultura na forma de concentrado congelado pode implicar elevado custo de transporte, o qual deve ser feito congelado  O congelamento pode ser feito por meio de nitrogênio líquido  Para a escolha do método de secagem, o prazo de validade que se almeja para a cultura final é um ponto importante para a decisão do processo a se utilizar; liofilização (muito caro e muitos fatores interferem na eficiência do processo), spray-drying (mais econômico, mas as células não permanecem tão estáveis)  Considerar a atividade de água dos outros componentes  O processo deve ser homogêneo, em menor tempo possível, em ambiente com filtragem de ar e com baixa temperatura (porém, neste caso pode haver problemas de condensação)  Embalagem deve ser com material com baixa transferência de umidade e oxigênio  O armazenamento pode ser seco ou sob resfriamento, dependendo do produto final

Figura 16.4 Etapas gerais de produção de alimentos probióticos Fonte: adaptada de Vasiljevic & Shah, 2008;25 Lacroix & Yildirim, 2007.29

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A Acetogênese, 52 Ácido(s), 88 - biliares, 88 - - desconjugação e desidroxilação de, 232 - - metabolismo de, 58 - graxos, 55, 113 - lático, 230 - - bactérias do, 140 - orgânicos, produtos da fermentação microbiana de carboidratos com importantes implicações, 55 Actinobacillus actinomycetemcomitans, 150, 155 Actinobacteria, 67 Actinomyces, 67 Adiposidade, 89 - do hospedeiro, metabolismo de ácidos biliares, perfil lipídico e, 58 - regulação da, 89 Agnotobiótico, 36 AIDS, 197 (ver também HIV) Akkermansia muciniphila, 167 Alacepril, 127 Aleitamento, tipo de, 73 Alergia, 206 Alimentos probióticos, etapas gerais de produção de, 239 - e simbiótico, 233 Alteração(ões), 170 - da composição da microbiota intestinal pela perda de peso, 167 - fisiológicas, bioquímicas e microbiológicas após cirurgia de bypass gástrico, 170 Aminas, 88

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Aminoácidos, 10 - essenciais, 187 Amônia, 88 Amostragem e escala microbiológica do trato gastrintestinal, 16 Anemia, 141 Animal(is), 36 - germ-free, 36, 86, 89, 171, 184 - - alterações morfológicas e fisiológicas dos, 37 - imunodeprimidos, 194 - knockout, 101, 152 - modelos de (ver Modelos animais) - mudanças na microbiota intestinal de, recebendo dieta hiperlipídica ou dieta controle, 177 Ansiedade, 184 Antibiótico(s), 76 - e efeitos na microbiota intestinal, 79 - - de animais recebendo dieta hiperlipídica ou dieta controle, 177 - resistência a, 232 Aorta, formação de aterosclerose na, 152 ApoE, papel protetor de HDL e, contra endotoxinas bacterianas, 155 Archaea, 1, 5 Árvore evolutiva da vida, 3 - evolução, 3 - filogenia, 3 - os três domínios da vida, 4 Aspergillus oryzae, 206 Aterosclerose, 150, 161 Atopobium, 71 Autismo, participação da microbiota no, 188 AZT, 198

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Índice

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B Bactéria(s), 2, 53, 141, 235 - bioajustadoras de pH e principais produtos do metabolismo lático, 240 - comensais, 100 - do ácido lático, 140 - do gênero Bacteroides, 141 - Gram-negativas, 112, 157, 175 - Gram-positivas, 157 - intestinais, 54 - - seus substratos e produtos, 54 - - tolerância à, 106 - isolamento de, a partir de fezes de crianças amamentadas ao seio ou por fórmula artificial, 75 - patogênicas no trato gastrintestinal e os seus “artifícios de guerra”, 107 - probióticas, 241 - - métodos de adição de, aos produtos, 241 - - - como componente do fermento que dará origem ao produto, 241 - - - por adição de cultura concentrada após a fermentação, antes do envase, 241 - - - por adição de cultura concentrada junto com o fermento, no início do processamento, 241 - - método de enumeração de, 19 Bacteroides fragilis, 58, 167 Bacteroidetes, 67 Banco de dados, sequenciamento e, e o estudo da microbiota gastrintestinal humana, 22 - Illumina/MiSeq, 24 - microarranjo(s), 25 - - de DNA, 25 - - filogenéticos, 25 - - funcionais, 25 - pirossequenciador Roche 454, 23 Barreira mucosa gastrintestinal, 96 Bebidas lácteas probióticas e simbióticas, esquemas básicos de fabricação de algumas, 244 Bibliotecas, construção de, e o estudo da microbiota gastrintestinal humana, 21 Bifidobacterium, 53, 141, 235 - adolescentis, 72 - animalis, 74 - bifidum, 54, 72, 167

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- breve, 72, 179 - - Bb99, 206 - catenulatum, 74, 167 - gallicum, 72 - infantis, 74, 206 - lactis, 72, 142 - longum, 74, 167 Bifidobacterium sp., 231 Bifidobacterium spp., 234 Biologia, 92 - de sistemas, 10 - estudo de, de ecossistemas em 4D, 11 - molecular, 86, 92 Butirato, 88 Bypass gástrico, cirurgia de, 170

C Cadeia de polissacarídeos O, 112 Campylobacter, 67 Campylobacterium jejuni, 186 Camundongo(s), 37 - germ-free, 37, 184 - knockout, 101 - ratos e, pesquisa com, 36, 38 Câncer, 216 - potencial de alguns microrganismos probióticos no, 220 - potencial de efeitos benéficos do uso de probióticos no, 216 Candida albicans, 194 Carboidratos, 53 - fermentação microbiana de, produtos da, com importantes implicações, e ácidos orgânicos, 55 - metabolismo de, 53 - substrato da dieta e sua interação com a microbiota do hospedeiro, 53 Célula(s), 158 - B, 97 - cultura de, estudos da microbiota com emprego de, 46 - enteroendócrinas, 56 - epiteliais, 104 - - gengivais, 158 - - intestinais, 195 - - peças-chaves do sistema imunológico da mucosa, 103

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- imunes, 104 - M, 103 - somáticas, 15 - T, 97, 106, 153 Cepas de probióticos, 208 - potencial de algumas, no tratamento e na prevenção da obesidade, 217 Chlamydiae, 67 Chloroflexi, 67 Choque séptico, 118 Chryseomonas, 149 Cirurgia de bypass gástrico, 170 Citocinas, 152 - produção de, 114 - pró-inflamatórias, 113 Citometria de fluxo, 26 Clearance de endotoxinas, cinéticae, 117 Clostridium, 167 - botulinum, 192 - butyricum, 206 - coccoides, 140, 167 - difficile, infecção por, 193 - leptum, 167 Clostridium spp., 171 Coagulação, 116 - ativação da cascata de, 116 - intravascular disseminada, 118 Colesterol, níveis de, 152 Colina, 159 Cólon irritável, síndrome do, 206 Comorbidades psiquiátricas nas doenças gastrintestinais, 187 Compostos bioativos, microbiota e biotransformação de fármacos e, 123-130 Constipação, 206 Cripta intestinal do intestino grosso, 102 Crohn, doença de, 134, 188 Cryptosporidium parvum, 192 Cultivo, técnicas utilizadas no estudo da microbiota humana independentes de, 18 - eletroforese em gel com gradiente desnaturante, 19 - reação em cadeia da polimerase, 18 - - quantitativa em tempo real, 19 Cultura(s), 237 - celular, 46 - - estudos da microbiota com emprego de, 46

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- probiótica(s), métodos de produção de, 234 - - concentradas, 237 - - e desafios na manutenção da viabilidade, 234 - - - dificuldades para adição de cultura, 238 - - - microrganismos probióticos, 234 - - - tipos de cultura, 234 - starter, 230

D Dados, banco de (ver Banco de dados) Deficiência de vitamina, 141 Denaturing gradient gel electrophoresis (ver Eletroforese em gel com gradiente desnaturante) Depressão, 186 Diabetes, 86 - melito tipo 2, obesidade e microbiota intestinal, 165-182 - - composição da microbiota, 166 - - - alteração da, pela perda de peso, 167 - - mecanismos que relacionam microbiota intestinal com ganho de peso e hiperglicemia, 171 - - - expressão gênica, homeostase energética e modulação do metabolismo, 172 - - - extração de energia adicional da dieta, 171 - - - indução de inflamação e resistência à insulina, 175 - - - modulação do eixo cérebro-intestino e do sistema endocanabinoide, 178 - - probióticos, potencial na modulação do metabolismo, 179 Diarreia, 195, 206 Dieta, 78 - aterogênica, 152 - carboidratos, substrato da, e sua interação com a microbiota do hospedeiro, 53 - extração de energia adicional da, 171 - hiperlipídica, mudanças na microbiota intestinal de animais recebendo, 177 - rica em gorduras saturadas, 161 Dietéticos, 159 - interação de fatores, e microbiota intestinal, 159 - probióticos como adjuvantes, na saúde de indivíduos imunodeprimidos, 191-204 - - atividade imunomoduladora dos probióticos, 196

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- - função imunomoduladora da microbiota intestinal, 193 - - função protetora da microbiota intestinal contra patógenos intestinais, 192 - - mecanismos de ação dos probióticos contra patógenos, 194 - - recombinantes no controle da AIDS, 197 - - seleção do probiótico, 198 Digoxina, 126 Dinitrato de isossorbida, 128 Disbiose intestinal, 91 - causas, 91 - diagnóstico, 92 - manifestações clínicas, 91 - supercrescimento bacteriano, 91 Disfunção, 161 - endotelial, 161 - vascular, 160 Diversidade microbiana, estudo da, 18 DNA, 7, 74, 149 - estudos que avaliam a presença de, 151 - etapas de amplificação de, por PCR, 18 - microarranjo de, 25 Doença(s), 187 - autoimunes, 141 - cardiovascular(es), 147-163, 210 - - microbiotas oral e intestinal e risco cardiovascular, 148 - - - ativação de receptores tipo Toll, 150 - - - fator nuclear kappa B, 153 - - - Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas gingivalis, 157 - - - interação de fatores dietéticos e microbiota intestinal, 159 - - - moléculas de origem bacteriana na indução da inflamação, 153 - - - papel protetor de HDL e ApoE contra endotoxinas bacterianas, 155 - - - sinergismo entre LDL oxidada e endotoxinas, 155 - - - uso de estatinas e hipótese endotoxinalipoproteína, 157 - - potencial de alguns microrganismos na modulação de fatores de risco para, 213 - - potencial de efeitos benéficos do uso de probióticos nas, 210 - celíaca, 141, 187, 210

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- - papel da microbiota intestinal na, 141 - - potencial de efeitos benéficos do uso de probióticos na, 210 - - tratamentos e perspectivas na, 142 - crônica, potencial de efeitos benéficos do uso de probióticos nas, 205-228 - - câncer, 216 - - cardiovasculares, 210 - - celíaca, 210 - - imunoinflamação, 219 - - inflamatórias intestinais, 209 - - obesidade, 212 - - síndrome do cólon irritável, 206 - de Crohn, 134, 188 - gastrintestinais, comorbidades psiquiátricas nas, 187 - imunoinflamação, potencial de efeitos benéficos do uso de probióticos nas, 219 - inflamatórias intestinais, 132 - - potencial de efeitos benéficos do uso de probióticos nas, 209 - intestinais, microbiota e, 131-146 - - celíaca, 141 - - - papel da microbiota intestinal na, 141 - - - tratamento e perspectivas na, 142 - - inflamatórias, 132 - - - papel da microbiota intestinal, 133 - - - tratamentos e perspectivas, 134 - - intolerância à lactose, 138 - - - papel da microbiota intestinal na, 139 - - - tratamentos e perspectivas, 140 - - síndrome do intestino irritável, 135 - - - papel da microbiota intestinal na, 136 - - - tratamento e perspectivas na, 137 Dor de cabeça, 117

E Ecossistema(s), 11 - estudo de biologia de, em 4D, 11 - simulador do, 45 - - esquema do, 45 - - intestinal humano, 44 Eixo cérebro-intestino, 161 - modulação do, e do sistema endocanabinoide, 178 Eletroforese em gel com gradiente desnaturante, 19

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Endotoxemia, 118 Endotoxina(s), 116 - bacterianas, papel protetor de HDL e ApoE contra, 155 - clearance de, cinética, 117 - fontes de, para o hospedeiro, 116 - sinergismo entre LDL oxidada e, 155 Endotoxina-lipoproteína, uso de estatinas e hipótese, 157 Energia, extração de, adicional da dieta, 171 Enterobacteriaceae, 141 Enterococcus, 234 - faecalis, 75 Enterococcus spp., 149 Enterococos, 206 Enterocolite, 206 Enzima(s), 161 - betaglicuronidase, 89 - lipase lipoproteica, 161 - lipogênicas, 172 - MAPK, 155 Epitélio intestinal, 106 Escala microbiológica, amostragem e, do trato gastrintestinal, 16 Escherichia coli, 5, 133, 157, 187, 206 Esôfago, microbiota do, 67 Estado imunológico, 100 Estatinas, uso de, e hipótese endotoxina-lipoproteína, 157 Estômago, microbiota do, 69 Estreptococos, 206 Estresse, 187 Estudo(s), 18 - clínicos randomizados, 209 - com animais, 34-48, 171 (ver também Modelos animais) - com emprego de cultura de células, 46 - com ratos e camundongos, 38 - da diversidade microbiana, 18 - de biologia de ecossistemas em 4D, 11 - do metabolismo de fármacos pela microbiota gastrintestinal, métodos para, 125 - FINRISK, 155 - INVEST, 149 - que avaliam a presença de DNA bacteriano, 151 Estudo(s) da microbiota, 15-32

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- amostragem e escala microbiológica do trato gastrintestinal, 16 - citometria de fluxo, 26 - construção de bibliotecas, 21 - diferentes abordagens, 18 - metabolômica, 27 - projeto microbioma humano, 16 - proteômica e metaproteômica, 27 - sequenciamento e banco de dados, 22 - - Illumina/MiSeq, 24 - - microarranjo(s), 25 - - - de DNA, 25 - - - filogenéticos, 25 - - - funcionais, 25 - - pirossequenciador Roche 454, 23 - sistemas in vitro e modelos animais para, 34-48 - - comumente empregados em pesquisas, 36 - - - peixe-zebra, 40 - - - ratos e camundongos, 36 - - - suínos, 40 - - conceitos e definições, 34 - - histórico, 34 - - in vitro, 42 - - - cultura celular, 46 - - - quimiostato, 43 - - - simulador do ecossistema microbiano, 44 - técnicas utilizadas no, 17 - - independentes de cultivo, 18 - - - eletroforese em gel com gradiente desnaturante, 19 - - - reação em cadeia da polimerase, 18 Esvaziamento gástrico, 140 Eubacterium, 10, 166 - rectale, 140 Eukarya, 1, 5 Euryarchaeota, 67 Expressão gênica, homeostase energética e modulação do metabolismo, 172

F Faecalibacterium prausnitzii, 133, 142 Falência renal, 118 Fármacos, microbiota e biotransformação de, e compostos bioativos, 123-130 Fator nuclear kappa B, 153, 176 Fenol, 88 Fermentação, 52, 241

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- microbiana de carboidratos, produtos da, com importantes implicações, e ácidos orgânicos, 55 - metabólitos da, redução de pH pelos, 140 Fermento, 241 Fertilidade, problemas de, 141 Fezes, isolamento de bactérias a partir de, de crianças amamentadas, 75 Filo, 67 - Actinobacteria, 67 - Bacteroidetes, 67 - Chlamydiae, 67 - Chloroflexi, 67 - Euryarchaeota, 67 - Euryarchaeota, 67 - Firmicutes, 67 - Fusobacteria, 67 - Proteobacteria, 67 - Spirochaetes, 67 - Synergistetes, 67 - Tenericutes, 67 Filogenia, 3 Fingerprinting genético, técnicas de, 19 FINRISK, estudo, 155 Firmicutes, 67 Flatulência, 206 Fluxo, citometria de, 26 Fosfatidilcolina, metabolismo de, 159 Frequência cardíaca, 117 Fusobacteria, 67 Fungos, 67 Fusobacterium, 10, 67 - nucleatum, 157

G Garcinia mangostana, 198 Gardnerella vaginalis, 194 Gel, eletroforese em, com gradiente desnaturante, 19 Genes, 7 - pró-inflamatórios, 148 - transferência horizontal de, 7, 9 - - conceito de espécie microbiana e, 7 Genoma humano, 15 Giardia duodenalis, 192 Glicina, 88 Glicoesfingolipídios, 53 Gnotobiótico, 36

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Gorduras saturadas, padrão dietético ocidental, 161 Gradiente, eletroforese em gel com, desnaturante, 19 Gram-negativas, 112, 157, 175 Gram-positivas, 157 Granulicatella, 67, 149

H Haemophilus, 67 HDL, papel protetor de, e ApoE contra endotoxinas bacterianas, 155 Helicobacter pylori, infecções por, 206 Hidrogênio, 52 - sulfeto de, 88 Hiperglicemia, mecanismos que relacionam microbiota intestinal com ganho de peso e, 171 - expressão gênica, homeostase energética e modulação do metabolismo, 172 - extração de energia adicional da dieta, 171 - indução de inflamação e resistência à insulina, 175 - modulação do eixo cérebro-intestino e do sistema endocanabinoide, 178 Hiporresponsividade imunológica, 101 HIV, 192, 197 (ver também AIDS) Homeostase energética, expressão gênica e modulação do metabolismo, 172 Hormônios, 56 Hospedeiro, 53 - adiposidade do, metabolismo de ácidos biliares, perfil lipídico e, 58 - carboidratos, substrato da dieta e sua interação com a microbiota do, 53 - lipopolissacarídeos, estrutura e influência sobre o, 111-122 - - cuidados metodológicos nos estudos, 120 - - efeitos biológicos, 113 - - endotoxemia, 118 - - fontes de endotoxinas, 116 - - cinéticae clearance de endotoxinas, 117 - - mecanismo de tolerância, 119 - - métodos de detecção, 119 - - - imunoensaios, 120 - - - kit Limulus Amebocyte Lysate, 119 - - - rabbit pyrogen assay, 119 - - natureza química, 112

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- - - cadeia de polissacarídeos O, 112 - - - núcleo de oligossacarídeos, 113 - - - porção lipídica, 113 - papel da microbiota na fisiologia do, 85-94 - - disbiose intestinal, 91 - - - causas, 91 - - - diagnóstico, 92 - - - manifestações clínicas, 91 - - - supercrescimento bacteriano, 91 - - imunomodulação, 86 - - influência na estrutura e no funcionamento do trato gastrintestinal, 89 - - - composição do muco, 90 - - - função trófica, 89 - - - funções extraintestinais, 90 - - - integridade intestinal, 90 - - - reparo epitelial, 90 - - nutrição e metabolismo, 87 - - proteção contra patógenos, 89 - - regulação da adiposidade, 89 - princípios das relações estabelecidas entre microbiota e, 100 - tipos de associações entre microrganismos e, 37

I Illumina/MiSeq, 24 Imunodeprimidos, probióticos como adjuvantes dietéticos na saúde de indivíduos, 191-204 - atividade imunomoduladora dos probióticos, 196 - função imunomoduladora da microbiota intestinal, 193 - função protetora da microbiota intestinal contra patógenos intestinais, 192 - mecanismos de ação dos probióticos contra patógenos, 194 - recombinantes no controle da AIDS, 197 - seleção, 198 Imunoensaios, 120 Imunoglobulina(s), 105, 116, 193, 298 - contribuição das, para a defesa da mucosa intestinal, 105 Imunomodulação, 86 - potencial de, por probióticos, 222 Indol, 88 Infecção(ões), 206

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- do trato respiratório, 206 - por Clostridium difficile, 193 - por Helicobacter pylori, 206 Infiltrados inflamatórios, 148 Inflamação, indução da, 153, 175 - e resistência à insulina, 175 - moléculas de origem bacteriana na, 153 Insuficiência cardíaca crônica, 157 Insulina, resistência à, 175 Insulinemia, 175 Integridade intestinal, 90 Interações microbianas existentes no trato gastrintestinal, 9 Intestino, 135 - bactérias presentes no, seus substratos e produtos, 54 - cripta intestinal do, 102 - irritável, síndrome do, 135 - - papel da microbiota intestinal na, 136 - - tratamentos e perspectivas na, 137 Intolerância à lactose, 138 - papel da microbiota intestinal na, 139 - tratamentos e perspectivas, 140 INVEST, 149 Isolamento de bactérias a partir de fezes de crianças amamentadas, 75 Isospora belli, 192 Isossorbida, dinitrato de, 128

K Kit Limulus Amebocyte Lysate, método, 119 Klebsiella pneumoniae, 194

L Lactobacillus, 75, 235 - acidophilus, 219 - casei, 19 - crispatus, 75 - delbrueckii, 221 - gasseri, 216 - paracasei, 216 - pentosus, 219 - plantarum, 216 - reuteri, 219 - rhamnosus, 19, 206 Lactobacillus spp., 234 Lactococcus, 234 - lactis, 19, 75

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Lactose, 140 - intolerância à, 138 - - papel da microbiota intestinal na, 139 - - tratamentos e perspectivas, 140 LDL, sinergismo entre, oxidada e endotoxinas, 155 Leite materno, composição microbiana do, 76 Leptina, 174 Lesão, 152 - arterial, microrganismos e, 152 - aterosclerótica, 152 Leuconostoc, 235 - mesenteroides, 75 Leveduras, 206 Levodopa, 126 Lichia, 198 Linfócitos T CD4+, 197 Linhagem eucariótica, 5 Lipemia plasmática, 157 Lipopolissacarídeo(s), 176 - estrutura e influência sobre o hospedeiro, 111-122 - - cinética e clearance de endotoxinas, 117 - - cuidados metodológicos nos estudos, 120 - - efeitos biológicos, 113 - - endotoxemia, 118 - - fontes de endotoxinas para o hospedeiro, 116 - - mecanismo de tolerância ao lipopolissacarídeo, 119 - - métodos de detecção, 119 - - - imunoensaios, 120 - - - kit Limulus Amebocyte Lysate, 119 - - - rabbit pyrogen assay, 119 - - natureza química, 112 - - - cadeia de polissacarídeos O, 112 - - - núcleo de oligossacarídeos, 113 - - - porção lipídica, 113 - sinalização do, 176 - - proteínas auxiliares responsáveis por desencadear a, 114 Litchi chinensis, 198 Lúmen intestinal, 97

M Macrófagos, 103, 152, 159 Mecônio, percentual de amostras de, positivas para a presença de microrganismos, 73 Mercaptanos, 88

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Metabolismo, 53 - de ácidos biliares, 50 - de carboidratos, 53 - de fármacos, métodos para estudo do, 125 - de fosfatidilcolina, 159 - expressão gênica, homeostase energética e modulação do, 172 - lático, bactérias bioajustadoras de pH e principais produtos do, 240 - microbiano, aspectos gerais do, 50 - nutrição e, 87 - potencial na modulação do, e probióticos, 179 - primitivo, 3 - produtos da atividade metabólica da microbiota e suas implicações no, 49-62 - - ácidos biliares, perfil lipídico e adiposidade do hospedeiro, 58 - - aspectos gerais, 50 - - carboidratos, 53 - - - produtos da fermentação microbiana de, com importantes implicações e ácidos orgânicos, 55 - - - substrato da dieta e sua interação com a microbiota do hospedeiro, 53 - - utilização de proteínas pela microbiota, 57 Metabólito(s), 140 - da fermentação, redução de pH pelos, 140 - pró-aterogênico trimetil amina N-óxido, 159 Metabolômica, 27, 64 Metagenômica, 64 Metanogênese, 52 Metaproteômica, 27, 64 Methanobacterium thermoautotrophicum, 5 Methanobrevibacter smithii, 6 Método(s), 119 (ver também Técnicas) - de adição de bactérias probióticas aos produtos, 241 - - como componente de fermento que dará origem ao produto, 241 - - por adição de cultura concentrada, 241 - - - após a fermentação, antes do envase, 241 - - - junto com o fermento, no início do processamento, 241 - de enumeração de bactérias probióticas, 19 - de imunoensaios, 120 - de microbiologia clássica, 17 - de produção de culturas probióticas, 237

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- - concentradas, 237 - - e desafios na manutenção da viabilidade, 234 - - - dificuldades para adição de cultura, 238 - - - microrganismos probióticos, 234 - - - tipos de cultura, 234 - Kit Limulus Amebocyte Lysate, 119 - moleculares, evolução dos, 1 - para estudo do metabolismo de fármacos pela microbiota gastrintestinal, 125 - Rabbit pyrogen assay, 119 Metronidazol, 127 Mialgia, 117 Microarranjo de DNA, 25 Microbioma, 15 - central, redundância funcional e, 64, 66 Microbiota - composição e fatores determinantes, 63-84 - - ao longo do trato gastrintestinal, 65 - - - do esôfago, 67 - - - do estômago, 69 - - - do intestino, 69 - - - oral, 66 - - dieta, 78 - - que influenciam, fases da vida, 70 - - redundância funcional e microbioma central, 64 - - tipo de aleitamento, 73 - - tipo de parto, 71 - - tipo sanguíneo, 80 - - uso de antibiótico, 76 - e biotransformação de fármacos e compostos bioativos, 123-130 - e doenças, 131-163 - - cardiovascular, 147-163 - - - ativação de receptores tipo Toll, 150 - - - fator nuclear kappa B, 153 - - - Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas gingivalis, 157 - - - interação de fatores dietéticos, 159 - - - moléculas de origem bacteriana na indução da inflamação, 153 - - - papel protetor de HDL e ApoE contra endotoxinas bacterianas, 155 - - - sinergismo entre LDL oxidada e endotoxinas, 155 - - - uso de estatinas e hipótese endotoxinalipoproteina, 157

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- - intestinais, 131-146 - - - celíaca, 141 - - - inflamatórias, 132 - - - intolerância à lactose, 138 - - - síndrome do intestino irritável, 135 - e o sistema nervoso, 183-190 - - comorbidades psiquiátricas nas doenças gastrintestinais, 187 - - evidências da interação de, 184 - - - ansiedade, 184 - - - depressão, 186 - - - estresse, 187 - - participação da microbiota no autismo, 188 - e sistema imunológico, 95-110 - - bactérias patogênicas no trato gastrintestinal e os seus “artifícios de guerra”, 107 - - células epiteliais, peças-chaves do sistema imunológico da mucosa, 103 - - contribuição das imunoglobulinas para a defesa da mucosa intestinal, 105 - - desenvolvimento do sistema imunológico, 97 - - estrutura do sistema imunológico do trato gastrintestinal, 96 - - princípios das relações estabelecidas entre microbiota e hospedeiro, 100 - - tolerância às bactérias intestinais, 106 - estudo da, 15-48 - - humana, 15-32 - - - amostragem e escala microbiológica do trato gastrintestinal, 16 - - - citometria de fluxo, 26 - - - construção de bibliotecas, 21 - - - diferentes abordagens para o estudo, 18 - - - metabolômica, 27 - - - projeto microbioma humano, 16 - - - proteômica e metaproteômica, 27 - - - sequenciamento e banco de dados, 22 - - - técnicas utilizadas no estudo, 17 - - sistemas in vitro e modelos animais para, 34-48 - - - com ratos e camundongos, 38 - - - comumente empregados em pesquisas, 36 - - - conceitos e definições, 34 - - - histórico, 34 - - - in vitro, 42 - função da, 192

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- - imunomoduladora, 193 - - protetora contra patógenos intestinais, 192 - métodos para estudo do metabolismo de fármacos pela, 125 - obesidade e diabetes melito tipo 2, 165-182 - - composição da microbiota, 166 - - - alteração da, pela perda de peso, 167 - - mecanismos que relacionam, com ganho de peso e hiperglicemia, 171 - - probióticos, potencial na modulação do metabolismo, 179 - papel da, na fisiologia do hospedeiro, 85-94 - - disbiose intestinal, 91 - - imunomodulação, 86 - - influência na estrutura e no funcionamento do trato gastrintestinal, 89 - - nutrição e metabolismo, 87 - - proteção contra patógenos, 89 - - regulação da adiposidade, 89 - produtos da atividade metabólica da, e suas implicações no metabolismo humano, 49-62 - - ácidos orgânicos, produtos da fermentação microbiana de carboidratos, 55 - - aspectos gerais do metabolismo microbiano, 50 - - carboidratos, substrato da dieta e sua interação com a microbiota do hospedeiro, 53 - - influência no metabolismo de ácidos biliares, perfil lipídico e adiposidade do hospedeiro, 58 - - utilização de proteínas, 57 Microrganismos, 10 - e lesão arterial, 152 - percentual de amostras de mecônio positivas para a presença de, 73 - potencial de alguns, na modulação de fatores de risco para doenças cardiovasculares, 213 - probióticos, 234 - - potencial de alguns, no câncer, 220 - tipos de associações entre, e hospedeiro, 37 Mimetismo molecular entre estruturas microbianas, 107 Modelo(s) animal(is), 34-48 - comumente empregados em pesquisas, 36 - - in vitro, 42 - - - cultura celular, 46

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- - - quimiostato, 43 - - - simulador do ecossistema microbiano intestinal humano, 44 - - peixe-zebra, 40 - - ratos e camundongos, 36 - - suínos, 40 - conceitos e definições, 34 - efeitos de alguns probióticos em, ou in vitro, 212 - histórico, 34 Moléculas de origem bacteriana na indução da inflamação, 153 Monócitos, 152 Monossacarídeos, 55 Motilidade intestinal, 175 Muco, composição do, 90 Mucosa, 96 - contribuição das imunoglobulinas para a defesa da, 105 - sistema imunológico da, 103 - tecido linfoide associado à, 96 - - difuso, 96 - - organizado, 96 Mycobacterium avium paratuberculosis, 134

N N-acetilglicosamina, 53 Nanoarchaeum equitans, 6 Neisseria, 67, 149 Núcleo de oligossacarídeos, 113 Nutrição e metabolismo, 87

O Obesidade, 212 - diabetes melito tipo 2 e microbiota intestinal, 165-182 - - composição da microbiota, 166 - - - alteração da, pela perda de peso, 167 - - mecanismos que relacionam microbiota com ganho de peso e hiperglicemia, 171 - - - expressão gênica, homeostase energética e modulação do metabolismo, 172 - - - extração de energia adicional da dieta, 171 - - - indução de inflamação e resistência à insulina, 175 - - - modulação do eixo cérebro-intestino e do sistema endocanabinoide, 178

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- - probióticos, potencial na modulação do metabolismo, 179 - potencial de efeitos benéficos do uso de probióticos na, 212 Oligossacarídeos, 53 - núcleo de, 113 Organismos alóctones, 66 Osteoporose, 141

P Pacientes imunodeprimidos (ver Imunodeprimidos) Paracetamol, 128 Parto, tipo de, 71 Patógenos, 194 - mecanismos de ação dos probióticos contra, 194 - proteção contra, 89, 192 Pediococcus, 235 Peixe-zebra, pesquisa com, 40 Perda de peso, alteração da composição da microbiota intestinal pela, 167 Perfil lipídico, metabolismo de ácidos biliares, adiposidade do hospedeiro e, 58 Periodontite, 154 Permeabilidade intestinal, 175 Peso, 167 - mecanismos que relacionam microbiota intestinal com ganho de, e hiperglicemia, 171 - - expressão gênica, homeostase energética e modulação do metabolismo, 172 - - extração de energia adicional da dieta, 171 - - indução de inflamação e resistência à insulina, 175 - - modulação do eixo cérebro-intestino e do sistema endocanabinoide, 178 - perda de, alteração da composição da microbiota intestinal pela, 167 Pesquisa (ver Estudo) Peyer, placas de, 193 pH, 240 - bactérias bioajustadoras de, e principais produtos do metabolismo lático, 240 - do trato gastrintestinal, 140 - redução de, pelos metabólitos da fermentação, 140 Pirossequenciador Roche 454, 23 Placas, 193 - ateroscleróticas, 156

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- de Peyer, 193 Polimerase, reação em cadeia da, 18 - quantitativa em tempo real, 19 Polissacarídeos O, cadeia de, 112 Porção lipídica, 113 Porphyromonas, 67 - gingivalis, 150, 155, 157 Prevotella, 67, 166 Probióticos, 205-250 - cepas de, 208 - - potencial de algumas, no tratamento e na prevenção da obesidade, 217 - como adjuvantes dietéticos na saúde de indivíduos imunodeprimidos, 191-204 - - atividade imunomoduladora, 196 - - função, 192 - - - imunomoduladora da microbiota intestinal, 193 - - - protetora da microbiota intestinal contra patógenos intestinais, 192 - - mecanismos de ação dos probióticos contra patógenos, 194 - - recombinantes no controle da AIDS, 197 - - seleção do, 198 - e simbióticos, 229-250 - - alegações de saúde ou propriedade funcional, 242 - - aspectos tecnológicos e alegações de propriedades funcionais, 229 - - desafios tecnológicos na produção de produtos lácteos diversificados, 231 - - - critérios de funcionalidade, 232 - - - critérios de segurança, 232 - - - critérios tecnológicos, 234 - - métodos de adição de bactérias probióticas aos produtos, 241 - - - como componente de fermento que dará origem ao produto, 241 - - - por adição de cultura concentrada após a fermentação, antes do envase, 241 - - - por adição de cultura concentrada junto com o fermento, no início do processamento, 241 - - métodos de produção de cultura probiótica e desafios na manutenção da viabilidade, 234 - - - dificuldades para adição de cultura, 238 - - - microrganismos, 234 - - - tipos de cultura, 234

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Índice

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Microbiota Gastrintestinal | Evidências da Sua Influência na Saúde e na Doença

- - representações simplificadas de fabricação de, 242 - - tipos de produtos,240 - efeitos de alguns, em modelo animal ou in vitro, 212 - fatores que influenciam a viabilidade de, 236 - gerações de, evolução dos métodos de seleção e caracterização, 241 - potencial de efeitos benéficos do uso de, nas doenças crônicas, 205-228 - - câncer, 216 - - cardiovasculares, 210 - - celíaca, 210 - - imunoinflamação, 219 - - inflamatórias intestinais, 209 - - obesidade, 212 - - síndrome do cólon irritável, 206 - potencial de imunomodulação por, 222 - potencial na modulação do metabolismo, 179 Produção, métodos de (ver Métodos de produção) Produto(s), 231 - da fermentação microbiana de carboidratos com importantes implicações e ácidos orgânicos, 55 - lácteos, 234 - - diversificados, desafios tecnológicos na produção de, 231 - - - critérios de funcionalidade, 232 - - - critérios de segurança, 232 - - - critérios tecnológicos, 234 - - fermentados, 242 - probióticos e simbióticos (ver Probióticos e simbióticos) Projeto microbioma humano, 16 Propionibactérias, 206 Propionibacterium, 10 - freudenreichii, 206 Proteção contra patógenos, 89 Proteína(s), 57 - auxiliares responsáveis por desencadear a sinalização induzida por lipopossacarídeos, 114 - FIAF, 161 - G, 178 - NOD1, 87 - NOD2, 87

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- utilização de, pela microbiota, 57 Proteobacteria, 67 Proteômica, 27 Pseudomonas fluorescens, 133 Pyrolobus fumarii, 6

Q Quimiostato, 43 - funcionamento do, 44

R Rabbit pyrogen assay, método, 119 Ratos, 89 - e camundongos, 38 - - estudos da microbiota com, 38 - - pesquisa com, 36 - germ-free, 89 Reação em cadeia da polimerase, 18 - quantitativa em tempo real, 19 Receptor(es), 159 - Gpr41, 174 - scavenger, 159 - tipo Toll, 152 Reparo epitelial, 90 Resistência a antibióticos, 232 Retocolite, 188 - hemorrágica, 195 - ulcerativa, 188 Risco cardiovascular, microbiota oral e intestinal e, 148 - ativação de receptores tipo Toll, 150 - fator nuclear kappa B, 153 - Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas gingivalis, 157 - interação de fatores dietéticos e microbiota intestinal, 159 - moléculas de origem bacteriana na indução da inflamação, 153 - papel protetor de HDL e ApoE contra endotoxinas bacterianas, 155 - sinergismo entre LDL oxidada e endotoxinas, 155 - uso de estatinas e hipótese endotoxinalipoproteína, 157 RNA, 5 - ribossômico, 1, 19 Roche 454, pirossequenciador, 23

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Rothia, 67, 149 Ruminococcus, 53

S Saccharomyces, 133 - boulardii, 206 - cerevisiae, 133 Salmonella, 187 - enterica, 192 - typhimurium, 101, 193 Sangue, tipo sanguíneo, 80 Sepse grave, 118 Simbióticos, probióticos e, 229-250 - alegações de saúde ou propriedade funcional, 242 - aspectos tecnológicos e alegações de propriedades funcionais, 229 - desafios tecnológicos na produção de produtos lácteos diversificados, 231 - - critérios de funcionalidade, 232 - - critérios de segurança, 232 - - critérios tecnológicos, 234 - métodos de adição de bactérias probióticas aos produtos, 241 - - como componente de fermento que dará origem ao produto, 241 - - por adição de cultura concentrada, 241 - - - após a fermentação, antes do envase, 241 - - - junto com o fermento, no início do processamento, 241 - métodos de produção de cultura probiótica e desafios na manutenção da viabilidade, 234 - - dificuldades para adição de cultura, 238 - - microrganismos probióticos, 234 - - tipos de cultura, 234 - representações simplificadas de fabricação de, 242 - tipos de produtos probióticos, 240 Simulador do ecossistema microbiano intestinal humano, 44 Síndrome(s), 135 - da dificuldade respiratória, 118 - da imunodeficiência adquirida (ver AIDS) - do cólon irritável, potencial de efeitos benéficos do uso de probióticos na, 206 - do intestino irritável, 135 - - papel da microbiota intestinal na, 136

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- - tratamento e perspectivas na, 137 - hemolítico-urêmica, 195 Sistema(s), 178 - biologia de, 10 - endocanabinoide, modulação do eixo cérebro-intestino e do, 178 - imunológico, 184 - - componentes bacterianos com efeitos sobre o, 101 - - microbiota intestinal e, 95-110 - - - bactérias patogênicas no trato gastrintestinal e os seus “artifícios de guerra”, 107 - - - células epiteliais, peças-chaves do sistema imunológico da mucosa, 103 - - - contribuição das imunoglobulinas para a defesa da mucosa intestinal, 105 - - - desenvolvimento do sistema imunológico, 97 - - - estrutura do sistema imunológico do trato gastrintestinal, 96 - - - princípios das relações estabelecidadas entre microbiota e hospedeiro, 100 - - - tolerância às bactérias intestinais, 106 - in vitro, modelos animais e, para estudo da microbiota intestinal, 34-48 - - comumente empregados em pesquisas, 36 - - - peixe-zebra, 40 - - - ratos e camundongos, 36 - - - suínos, 40 - - conceitos e definições, 34 - - histórico, 34 - - in vitro, 42 - - - cultura celular, 46 - - - quimiostato, 43 - - - simulador do ecossistema microbiano intestinal humano, 44 - nervoso, microbiota intestinal e o, 183-190 - - comorbidades psiquiátricas nas doenças gastrintestinais, 187 - - evidências da interação de, 184 - - - ansiedade, 184 - - - depressão, 186 - - - estresse, 187 - - participação da microbiota no autismo, 188 - simulador do ecossistema, parâmetros operacionais de um, 45 Spirochaetes, 67

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Microbiota Gastrintestinal | Evidências da Sua Influência na Saúde e na Doença

Staphylococcus, 141 - aureus, 157 - epidermidis, 75 Streptococcus, 235 - salivarius, 75 Suínos, pesquisa com, 40 Sulfassalazina, 127 Sulfato, 52 Sulfeto de hidrogênio, 88 Supercrescimento bacteriano, 91 - condições clínicas associadas ao, 92 Synergistetes, 67

T Taurina, 88 Tecido, 161 - adiposo visceral, 161 - linfoide associado à mucosa, 96 - - difuso, 96 - - organizado, 96 Técnica(s), 18 (ver também Métodos) - de fingerprinting genético, 19 - utilizadas no estudo da microbiota gastrintestinal humana independentes de cultivo, 17 Tenericutes, 67 Thermoplasma, 5 Tolerância, 106 - ao lipopolissacarídeo, mecanismo de, 119 - às bactérias intestinais, 106 Trânsito intestinal, 91 Transtornos neurológicos, 141

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Trato gastrintestinal, 140 - amostragem e escala microbiológica do, 16 - bactérias patogênicas no, e os seus “artifícios de guerra”, 107 - composição da microbiota ao longo do, 65 - - do esôfago, 67 - - do estômago, 69 - - do intestino, 69 - - oral, 66 - estrutura do sistema imunológico do, 96 - influência na estrutura e no funcionamento do, e o papel da microbiota na fisiologia do hospedeiro, 89 - - composição do muco, 90 - - função(ões), 90 - - - extraintestinais, 90 - - - trófica, 89 - - integridade intestinal, 90 - - reparo epitelial, 90 - interações microbianas existentes no, 9 - pH do, 140 Trato respiratório, infecções do, 206 Triacilgliceróis, 174 Triglicerídios, 161

V Vagotomia, 187 Veillonella, 67 Vida microbiana, evidências de, na Terra remota, 2 Vírus da imunodeficiência humana (ver HIV) Vitamina(s), 141 - A, 128

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Alessandra Barbosa Ferreira Machado Professora Convidada do Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG. Pós-Doutorado em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Ana Paula Boroni Moreira Professora-Assistente da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), MG. Doutorado em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Damiana Diniz Rosa Pós-Doutorado em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Pós-Doutorado em andamento em Agricultural and Biological Engineering pela University of Illinois, UrbanaChampaign.

Maria do Carmo Gouveia Peluzio

Doutorado em Bioquímica e Imunologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

O livro trata desde as bases microbiológicas necessárias à compreensão das associações biológicas até o uso de probióticos na correção de anomalias oriundas de deficiências nutricionais e doenças ou na prevenção de ambas. Discorre, ainda, sobre as técnicas e os métodos de estudos de microbiomas e pela compilação cuidadosa de dados coletados como evidências científicas desse tema tão instigante. O respaldo dado por trabalhos de notáveis cientistas, publicados nos mais respeitados periódicos científicos, possibilita que tal área, com relevância questionada até poucas décadas atrás, seja hoje fundamentada por ciência profunda e amplamente acreditada. O impacto desses conhecimentos permeia áreas como a Biologia, a Nutrição, a Bioquímica e a Medicina.

Tatiana Fiche Salles Teixeira Doutorado em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG. Mestrado em Ciência da Nutrição pela UFV.

Organizadoras

Rodrigo Siqueira-Batista / Andréia Patrícia Gomes / José Galvão-Alves / Alessandro Lisboa da Silva

Angelo P. Ferrari Jr.

Atlas Endoscópico de Doenças Inflamatórias Intestinais Marcelo Cury / Alan Colm Moss

BIZU Comentado – Perguntas e Respostas Comentadas de Endoscopia Digestiva Angelo P. Ferrari Jr. / Erika Pereira de Macedo / Fernanda Prata Martins / Gustavo Andrade de Paulo

BIZU Comentado – Perguntas e Respostas Comentadas de Gastrenterologia e Hepatologia Gerson Domingues / Carlos Terra

Cirurgia do Aparelho Digestório Cirilo P. M. Muraro

Doenças Inflamatórias Intestinais – Retocolite Ulcerativa e Doença de Crohn, 2a Ed. Dídia Bismara Cury / Alan Colm Moss

José Galvão-Alves

Microbiota

Gastrintestinal

Fisiologia Anorretal Lucia Camara Castro Oliveira

Intestino Saudável – Orientações e Receitas Lucia Camara Castro Oliveira / Flávia de Alvarenga Netto

Manometria Esofágica, pHmetria Esofágica e Manometria Anorretal – Como Fazer e Interpretar Ricardo Guilherme Viebig

Técnicas em Endoscopia Digestiva Angelo P. Ferrari Jr.

Saiba mais sobre estes e outros títulos em nosso site: www.rubio.com.br

Machado | Moreira Rosa | Peluzio | Teixeira

Gastrenterologia Microbiologia Nutrição

Antimicrobianos em Gastrenterologia – Guia Prático 2012/2013

Atlas de Endoscopia Digestiva, 2a Ed.

Evidê n c ias de Sua I n f l u ên ci a n a S a ú d e e n a D oen ça

Áreas de interesse

OUTROS TÍTULOS DE INTERESSE

Emergências em Gastrenterologia, 2a Ed.

Evidências de Sua Inf luênc i a na Saúde e na D oença

Professora-Associada da Universidade Federal de Viçosa (UFV), MG.

Microbiota Gastrintestinal – Evidências de Sua Influência na Saúde e na Doença aborda de maneira abrangente, cuidadosa e detalhada um dos temas mais atuais e palpitantes da Biologia. A visão do organismo animal isoladamente não é mais aceitável diante das evidências científicas da interdependência dos macro- e microrganismos. Todo o conhecimento acumulado de Ecologia tem sido revisto para acomodar a noção de que organismos ditos superiores são, na realidade, sistemas intrincadamente dependentes de microrganismos que com eles coevoluíram no curso de milhões de anos.

Microbiota Gastrintestinal

SOBRE AS ORGANIZADORAS

Alessandra Barbosa Ferreira Machado | Ana Paula Boroni Moreira Damiana Diniz Rosa | Maria do Carmo Gouveia Peluzio | Tatiana Fiche Salles Teixeira

9 788564 956919

CAPA – Microbiota Gastrintestinal.indd 1

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