1-1세부과제 결과보고서 by drugmetabol ism

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장내미생물 배양법을 이용한 미생물 대사체 독성평가 시험법개발

2009~2011. / 1중단위 1세부과제

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목

차

1. 최종 연구개발 목표/ 7 1) 세부과제의 목표/ 7 2) 세부과제의 목표달성/ 8 3) 연구배경/ 9

2. 연구개발 내용 및 방법/ 12 1) 1차년도 연구내용 (1) 장내 미생물 배양기술의 개발 및 확립 연구/ 12 (2) 장내 미생물 대사체 분석 및 면역독성 평가/ 12 (3) 장내 미생물 대사체에 의한 세포 독성 및 세포 사멸에 대한 연구/ 13

2) 2차년도 연구내용 (1) 장내 미생물 대사체에 의한 유전독성 및 면역독성 연구/ 15 (2) 염증관련 유전자 발현 평가를 활용한 면역독성 평가기법의 개발/ 16

3) 3차년도 연구내용 (1) 장내 미생물 대사체에 의한 세포 독성 및 세포 사멸에 대한 연구/ 17 (2) 장내 미생물 대사체에 의한 유전독성에 대한 연구/ 18 (3) 장내 미생물 대사체에 의한 면역독성에 대한 연구/ 19

4) 연구방법 In vitro 대사체 규명: / 20 In vitro 임파구 증식능: / 20 세포 내 ROS 측정: / 21

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MTT assay를 이용한 세포독성 측정/ 21 배양액 내 lactate dehydrogenase (LDH) leakage측정 / 22 RT/ PCR을 이용한 세포 사멸 관련 유전자 발현 측정/ 22 Repoter assay를 통한 발현 조절 인자 측정 및 발현 조절 측정/ 22 Comet assay에 의한 유전독성 측정/ 22 In vitro 소핵 시험에 의한 유전독성 측정/ 23 RAW 264.7 세포배양 / 23 RT/ PCR을 이용한 COX/ 2 및 염증성 cytokines 유전자의 발현 측정/ 23 염증성 cytokines의 생성량 측정/ 24 COX/ 2 plasmid를 이용하여 transfection 및 Luciferase활성도 측정/ 24 pLUC(NF/ κB)3, pLUC(AP/ 1)3, transfection과 LUC 정량/ 24

3. 연구개발 결과

1) 1차년도 연구 내용 및 결과 장내미생물 배양법 개발/ 개발/ 25 (1) 장내미생물 중 시험균주 선정/ 25 (2) Minimal media 선정을 위한 증균배지와 혐기희석액의 독성평가/ 30 시험물질 및 대사체 분석법 개발/ 개발/ 40 (1) 시험물질 및 대사체 분석법/ 40 (2) 장내미생물 배양액 내의 시험물질 및 대사체 분석/ 46 면역독성 평가법 개발/ 개발/ 50 세포독성 평가법 개발/ 개발/ 66 (1) 세포독성 평가법 개발/ 66 (2) 활성산소 영향 평가법 개발/ 72 (3) 세포사멸(apoptosis) 평가법 개발/ 74 (4) 장내미생물 배양을 이용한 독성물질 대사체 독성평가/ 80

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2) 2차년도 연구 내용 및 결과 (1) 장내세균 효소복합체를 이용한 유전독성 평가기술 개발:/ 84 (2) 장내세균 효소복합체를 이용한 전사조절인자 영향 평가기술 개발/ 96

3) 3차년도 연구 내용 및 결과 (1) 장내세균 효소복합체를 이용한 세포사멸 평가기술 개발/ 102 (2) 장내세균 효소복합체(fecalase)과 장내미생물 대사효소계(intestinal 대사효소계(intestinal microbial enzyme mix)의 세포사멸 평가기술 개발 및 대사활성 비교 / 114 (3)

장내세균

효소복합체(fecalase)과

장내미생물

대사효소계(intestinal 대사효소계(intestinal

microbial enzyme mix)의 유전독성 평가기술 개발 및 대사활성 비교 / 125 (4)

장내세균

효소복합체(fecalase)과

장내미생물

대사효소계(intestinal

microbial enzyme mix)의 면역독성 평가기술 개발 및 대사활성 비교/ 131

4. 연구결과 고찰 및 결론 1) 1차년도 연구 결과 고찰 및 결론 장내미생물 배양기술 확립/ 확립/ 133 시험물질 및 대사체 분석법 개발/ 개발/ 133 장내미생물 대사체의 면역독성 평가/ 평가/ 134 세포독성평가법의 개발/ 개발/ 134 장내미생물 배양을 이용한 독성평가법 개발/ 개발/ 135

2) 2차년도 연구 결과 고찰 및 결론 장내세균 효소복합체를 이용한 유전독성 평가기술 개발/ 개발/ 136 장내세균 효소복합체를 이용한 전사조절인자 영향 평가기술 개발/ 개발/ 137

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3) 3차년도 연구 결과 고찰 및 결론

장내세균 효소복합체를 이용한 세포독성 및 세포사멸 평가기술 개발/ 개발/ 138 장내세균 효소복합체(fecalase)과 장내미생물 대사효소계 (intestinal microbial enzyme mix)의 세포사멸 평가기술 개발 및 대사활 성 비교/ 비교/ 139 장내세균 효소복합체(fecalase)과 장내미생물 대사효소계(intestinal 대사효소계(intestinal microbial enzyme mix)의 유전독성 평가기술 개발 및 대사활성 비교/ 비교/ 140 장내세균 효소복합체(fecalase)과 장내미생물 대사효소계(intestinal 대사효소계(intestinal microbial enzyme mix)의 면역독성 평가기술 개발 및 대사활성 비교 / 140

5. 참고문헌/ 141

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1. 최종 연구개발 목표 1) 세부과제의 목표 위장관으로 유입된 많은 화학물질들은 일부가 위장관에서 체내로 흡수되고 상당량은 위장관을 통과하여 분변으로 배설됨. 또한 위장관에는 약 300-500 종이나 되는 많은 장내 미생물이 고유의 미생물총(microflora)을 이루고 서식 하고 있으며, 각종 대사반응을 매개하고 있음. 위장관에서 흡수되지 않은 많은 화학물질이 위장관을 통과하면서 당연히 이 러한 장내미생물에 의해 대사를 받을 수 있음을 예측할 수 있으며, 실제 화학 물질에 의한 독성 유발 시 장내미생물의 역할에 관한 많은 논문이 보고된 바 있음. 대사과정이 독성발현에 요구되는 물질의 경우 지금까지는 host 대사계에 의 한 영향 평가가 주를 이루었으나, 앞서 언급한 바와 같이 장내미생물에 의한 대사과정 또한 화학물질의 독성작용에 매우 중요하여, 이에 관한 기반 조성이 절실히 요구되고 있음. 이에 본 연구에서는 장내미생물에 의한 독성대사체 생성과 독성평가 기반을 구축하기 위하여 장내미생물 배양법의 개발 및 확립연구와 장내미생물에 의한 독성 대사체 생성과 장내미생물에 의한 세포독성, 유전독성 및 면역독성 평가 연구를 수행하고자 함. 또한 개발 확립된 시험평가법에 대하여 표준작업수순서를 작성하여 장내미 생물을 이용한 독성평가법으로 활용될 수 있도록 하고자 하였음. 구체적으로 본 세부과제는 제1차년도에는 3 연구팀으로 구성하여 제1연구 팀에서는 장내미생물 배양법의 개발과 확립을 이룩하고자 하였으며, 제2연구팀 에서는 세포수준의 독성평가 체계를 면역독성 평가를 중심으로 구축하고자 하 였으며, 제3연구팀에서는 세포 및 분자수준의 독성평가 체계를 구축하여 장내 미생물에 의한 대사와 대사체 독성의 기작평가가 가능한 기반을 조성하고자 하 였음. 그리고 2, 3차년도에는 본격적으로 분자수준의 독성평가체계를 구축할 목적으로 독성기작연구팀 단독으로 연구진을 구성하였음.

2) 세부과제의 목표달성

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최근 식품 의약품 등이 장내세균총에 의해서 발생할 수 있는 안전성을 확보 하기 위해 정확하고 신속한 독성 평가법이 요구되고 있으며, in vitro 독성시험 을 위한 장내미생물, 효소복합체 (fecalase), 장내미생물 대사효소계(intestinal microbial enzyme mix) 개발 및 이를 활용한 독성 대사체 평가 방법을 개발 하였음. 1-2차년도에서 장내세균 효소복합체(fecalase) 또는 장내미생물에 의한 독 성 대사체 생성과 위를 활용하여 세포독성 평가,

apoptosis 유발능의 평가,

p53 활성 평가, 염증 관련 COX-2 유전자 발현 및 전사 조절인자 활성 등의 다양한 독성 지표를 통한 독성평가 체계를 확립하였음. 3차년도에서는 장내세균 효소복합체(fecalase) 또는 장내미생물 대사효소계 (intestinal microbial enzyme mix)를 활용한 독성 대사체 생성, 세포 독성, 유전 독성 비교를 통한 최적화된 독성평가 기술 기반을 구축하였으며, 장내미 생물에 의한 독성 대사체 생성과 이 방법을 활용하여 세포 독성, 유전독성, 면 역독성 평가 기술을 확립하였으며 장내미생물에 생성되는 독성 대사체에 대한 독성 평가연구에서 가시적인 성과를 얻었음. 장내세균 효소복합체(fecalase) 또는 장내미생물에 의한 독성 대사체 생성 과 위를 활용하여 이미 알려진 독성지표 유전자를 분자생물학 기법을 이용 독 성물질에 대한 독성반응을 측정할 뿐만 아니라 향후 그 유전자의 작용기전을 규명함으로써 세포 독성시험 모델을 제시하였음. 또한 장내세균 효소복합체(fecalase) 또는 장내미생물에 의한 독성 대사체 의 유전독성(comet assay, in vitro 소핵시험, p53 repoter gene 및 유전 독 성 관련 유전자 발현을 활용한 유전독성 방법을 활용), 면역 독성 (염증관련 유전자에 대한 reporter gene assay 및 유전자 발현 조사 방법을 활용) 평가 개발 기술을 보완 및 유효성을 검증하였으며, 독성평가 기법에 대한 표준작업 수순서를 작성하여 독성평가 기법을 보급하였음.

3) 연구배경 장내미생물이 위장관으로 유입된 화학물질의 대사에 관여하고 이들의 독성

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작용에 일정한 역할을 담당할 것은 쉽게 예측할 수 있으나, 실험상의 제약으로 많은 연구가 진행되지는 않은 것으로 보임. 특히 국내에서는 독성평가에 장내미생물의 대사에 대한 연구기법을 활용한 예가 없어 여기에서는 국외의 연구현황에 대해서만 기술하였으며, 이는 본 연 구가 조기에 확산되어야하는 당위성을 설명해 주는 일례라고 판단됨. 이에 관한 연구는 1970년대 말에 시작되었고, 초기에는 주로 실험동물의 장내미생물 또는 장 내용물의 homogenate를 대사효소원으로 활용하였음. Brown과 Dietrich(1979a; 1979b)는 Salmonella/microsome test를 이용하 여 약 70종의 anthraquinone류, 20종의 benzanthrone류, 70여종의 천연 또 는 합성 flavonoid류에 대하여 돌연변이원성을 시험하였음. 이 연구를 통하여 일반적인 Ames test에서는 음성의 결과를 보이던 몇 가 지

배당체

화학물질이

랫드의

대장으로부터

분리한

cell-free

extract(cecalase)를 작용시킬 때 양성의 결과가 나타난다는 사실을 밝혀 장내 미생물에 의한 대사과정이 화학물질의 독성에 중요한 역할을 담당할 수 있음이 제시되었음. 여기에

해당하는

배당체로는

alizarin-2-O-β-D-glycoside,

emodin-1(8)-monoglucoside,

lucidin-3-O-primveroside,

quercetrin(quercetin-3-O-rhamnoside),

rutin

rutinoside),

(quercetin-3-O-

robinin(kaempferol-3-O-galactosido-

rhamnoside-7-O-rhamnoside) 등이 있음. 이와 유사한 연구를 사람의 분변으로부터 cell-free extract (fecalase)를 분리하여 시험을 수행한 보고되어 있음. 즉,

식이를

통하여

노출될

수

있는

배당체인

rutin,

8-hydroxyquinonline-β-D-glucoside, quercitrin 등에 대하여 fecalase로 incubation 한 시료가 Salmonella 균주를 이용한 복귀돌연변이 시험에서 양성 이 나타나는 것을 밝혔고, 실제 사람 분변 extract가 배당체를 가수분해 시키 는 효소활성을 가지고 있음이 연구되어 있음. 특히,

이

연구에서는

적포도주,

적포도주스,

홍차

등도

fecalase와

incubation 할 때 Ames test에서 양성의 결과가 나와 실제 사람 분변 extract 가 배당체를 가수분해 시키는 효소활성을 가지고 있음이 제시되었음 (Tamura 등, 1980).

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사람 장내미생물 균주를 이용한 연구는 매우 활발히 진행된 분야로 판단됨. 여러 화학물질의 대사 및 독성연구가 장내미생물 배양을 이용하여 연구된 바 있는데, 다환 방향족 탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbon, PAH)도 해 당됨. Naphthalene, phenanthrene, pyrene 및 benzo[a]pyrene 등은 estrogen 활성이 없는 물질인데, 사람 대장 digest와 함께 배양 시 ethinylestradiol에 의한 estrogen 활성과 유사한 활성이 나타나는 대사체로 전환되는 것이 보고 되었으며, 실제 혐기조건에서 대장의 특정세균이 PAH를 수산화시킴이 확인되 었음 (de Wiele 등, 2005). 최근

미백화장품

원료로

각광받고

있는

arbutin(hydroquinone-β

-D-glucopyranoside) 중에는 독성이 강한 hydroquinone이 배당체 형태로 존재하는데, 위액에서는 배당체 구조가 안정하지만 사람의 분변에서 분리한

Eubacterium distasonsis,

ramulus,

Enterococcus

Bifidobacterium

casseliflavus,

adolescentis

등은

당을

Bacteroides 가수분해

시켜

hydroquinone이 유리되는 것이 확인되었으며, 이 hydroquinone이 Chinese hamster V79 세포주에서 돌연변이원성이 있음이 입증된 바 있음(Blaut 등, 2006). Hydroquinone은 포도주, 커피, 밀가루 제품, 브로콜리 및 여러 과일들에 배당체 형태로 존재하는 성분으로, 장내미생물이 독성발현에 매우 중요한 대사 활성화계로 작용할 수 있음을 암시해 주는 결과로 판단됨. 1-Nitropyrene은 환경오염물질 중 하나로 체내에서 대사활성화를 통하여 N-(deoxyguanosin-8-yl)-1-aminopyrene과

같은

DNA

adduct

및

1-nitropyrene 4,5- 및 9,10-oxide로 대사되어 돌연변이를 유발하는 것으 로 알려져 있는데, 일부는 glutathione conjugate 형태로 대사되어 담즙으로 배설되는 것으로 알려져 있음. 이렇게 배설된 glutathione conjugate는 장내미생물이 생산하는 cysteine conjugate β-lyase에 의해 추가적인 대사가 일어나 DNA adduct를 형성할 수

있음이

보고되었는데,

Peptostreptococcus

magnus,

cysteine

conjugate

Fusobacterium

varium,

β-lyase는

Fusobacterium

necrophorum, Eubacterium limosum 등의 장내미생물에 널리 분포할 뿐만 아니라, 간, 신장 등에도 존재하는 효소임 (Kinouchi 등, 1992; Kataoka 등,

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1995). 이 연구에서 저자들은 장내미생물에서 분리한 cysteine conjugate β -lyase가

1-nitropyrene

4,5-oxide

및

1-nitropyrene

9,10-oxide의

cysteine conjugate를 대사시켜 calf thymus DNA에 adduct를 형성하고 Ames test에서도 양성이 나타난다는 사실과 아울러 cysteine conjugate β -lyase의 선택적 억제제인 aminooxyacetic acid 존재 하에서는 이러한 독성 이 나타나지 않음을 밝혀 이 대사활성화 과정이 cysteine conjugate β -lyase에 의한 선택적인 반응임을 제시한 바가 있음. 한편 이러한 장내미생물의 중요성에도 불구하고 국내에서는 전혀 연구가 이 루어지지 못한 분야인 것도 사실임. 그 이유는 장내미생물의 배양의 어려움과 장내미생물에 의한 대사의 중요성 을 국내 독성학자들이 간과한데에 있는 것으로 판단됨. 즉, 국내 독성학자들의 구성이 독성평가와 독성기작의 연구 분야에 한정되 어 있었고, 주로 host의 대사계에 연구의 초점이 맞추어져 왔기 때문으로 판단 됨. 따라서 본 연구에서 확립된 장내미생물에 의한 독성 대사체 생성과 위를 활 용한 세포독성, 유전독성, 면역독성에 대한 연구는 국내외 연구가 미비한 분야 로 본 연구를 통하여 장내미생물에 의한 독성 대사체 생성과 그 독성 평가 기 반을 구축하였음. 또한, comet assay, in vitro 소핵시험, p53 repoter gene, 유전 독성 관 련 유전자 발현을 활용한 유전독성 방법 및 염증관련 유전자에 대한 reporter gene assay, 염증 관련 유전자 발현 조사 방법을 활용 한 면역독성 평가 방법 은 대사 작용에 의해 독성을 나타내는 식품, 의약품 등을 평가 할 수 있는 기 술을 확립하였음.

2. 연구개발 내용 및 방법 1) 1차년도 연구내용

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(1) 장내 미생물 배양기술의 개발 및 확립 연구 장내 미생물 대사체 분석 및 면역독성 평가 그리고 세포독성 및 세포 사멸 에 대한 연구를 위하여 신속한 in vitro assay가 가능한 장내 미생물을 배양할 수 있는 최소 영양배지(minimal medium)를 개발하였음. 최소 영양배지는 K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, sodium citrate·2H2O, MgSO4·7H2O, glucose를 기본 조성물로 하고 여기에 아미노산, Yeast extract 또는 여러 가지 단백질 가수분해물 첨가하여 장내 미생물에 의한 천연 물 및 약물의 대사가 가능하도록 하였음. 장내 미생물 모두에 대한 균수 변화를 확인할 수 없으므로 그중 대표적인 장내 미생물인

Bacteroides, Clostridium, Enterobacter, Enterococcus,

Bifidobacterium 속의 균주들을 대상으로 배양에 적합한 최소 영양배지를 개발 하였음. 이와 같이 개발된 배지는 이후의 면역독성이나 유전독성 평가에 영향을 미 치지 않아야 하므로 배지 개발 과정에서 배지 자체에 대한 면역독성이나 유전 독성을 평가하였음.

(2) 장내 미생물 대사체 분석 및 면역독성 평가 미생물배양팀에서 공급한 독성대사체 함유 시료에 대하여 독성물질 및 그 대사체

정량에

관한

연구를

수행하였음.

연구방법으로는

liquid

chromatography-mass spectrometry(LC-MS)를 활용하여 독성시험에 사용 한 시료 일부에 대하여 독성물질과 그 대사체를 정성 및 정량하며, 대조군과 시험군의 비교를 통하여 실제 장내미생물에 의한 대사의 중요성을 평가하였음. 미생물배양팀에서 공급한 독성대사체 함유 시료에 대하여 in vitro 비장세포 배양을 통하여 세포수준의 독성평가를 수행하였으며, 독성평가 방법에 관한 표 준작업수순서를 작성하였음. 본 연구에서 적용하고자하는 면역독성 지표로는 먼저 LPS 및 Con A를 이용한 비장세포 유약화반응을 활용함. 이 방법은 식품 의약품안전청 고시 <의약품등의 독성시험기준>에도 수재된 방법이었다. 또한 기타 세포수준의 면역독성 평가 지표를 적용하여 장내미생물 활용 독성평가법 으로써의 적용하였음.

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(3) 장내 미생물 대사체에 의한 세포 독성 및 세포 사멸에 대한 연구 활성산소종(reactive oxygen species) 관련 독성평가: 장내 미생물 대사체 및 독성유도 물질에 의한 세포 손상의 주요 원인은 독성물질의 대사체에 의한 세포내 ROS의 생성과 free radical (NO-, OH-, O2-)에 기인한다고 알려져 있음 (Roberts RA등, 2010) ). 불포화 지방산이 풍부한 세포막은 생성된 free radical에 의해서 지질과산화의 표적이 되어 세포소기관들이 정상적인 구조 및 기능을 잃게 되며, 국소적인 손상은 물론 알데하이드와 같은 지질과산화 분해 산물이 생성부위에서 멀리 떨어진 부위로 이동하여 세포손상을 일으키게 됨. 따라서 미생물 대사 독성 물질의 독성 유발이 ROS에 의해서 세포독성을 유발 하는지

알아보기

위해

ROS를

소거하는

물질로

잘

알려진

N-acetyl

cysteine(NAC)을 전 처리 한 후 미생물 대사 독성 물질을 처리하여 ROS 생 성능을 조사하였음 (Sadowska AM등, 2006).

세포독성 평가: 미생물 대사 독성 물질에 대한 안전성 평가를 하기 위하여 인체

세포주를

활용한

dehydrogenase(LDH)가 mitochondria내의

세포질내에 세포

succinate

밖으로

존재하는 누출되는

dehydrogenase를

효소인 정도를

측정하기

lactate 측정하고,

위하여

MTT

reduction test를 조사함으로서 가장 민감하고 신속한 in vitro 검색법을 활용 하였음.

Apoptosis 유발능의 평가: 세포사멸은 세포가 외적 요인에 의해 심각한 손 상을 입었을 경우 세포 내부의 사멸 프로그램에 의해 유도되는 nucleoplasm과 cytoplasm의 condensation, 세포막의 손상, apoptotic body의 형성에 의한 세포의 분절과 주위세포에 대한 식균작용이 수반됨. 또한, 세포 사멸은 ATP 의존성이며, 세포사를 유도하는 효소의 활성, 새로운 유전자의 발현이 관찰되 고, DNA의 조각(DNA fragmentation)이 형성되고 hetero chromatin이 핵막 주위로 모이며 핵의 분리가 관찰되고 apoptosome(세포의 조각)을 형성함 (Ralph SJ 등, 2010). 세포사멸을 유도하는 인자로는 Anti cancer drug, UV, Radiation, Oxidant, Ceramide, 세포 사멸인자 (TNF, tumor necrosis factor; Fas 등)가 있으며 (Richardson A 등, 2008) 이 밖에도 생체에 필수

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요소임에도 불구하고 과량으로 존재 할 때 세포사를 유도하는 것들도 있으며 세포사의 기전은 세포에 따라, 환경에 따라 다양하고 변화하는데 주로 새로운 유전자의 발현 (p53, Bax, Aaf-1 등)과 mitochondria와 관련된 cytochrome C 그리고 caspase의 활성에 의한 세포사 신호전달 기전이 연구되고 있음 (그 림은 세포사와 관련된 신호전달 기전의 모식도임).

Fig. 1. Cell death and mitochondria 따라서 1차년도 연구에서는 미생물 대사 독성 물질에 대한 세포 사멸에 대 한 안전성 평가를 하기 위하여 인체 세포주를 활용한 세포 사멸 유전자(Bax) 와 세포 사멸 억제 유전자(Bcl-2, BCl-XL)의 발현, caspase-3 활성 및 TUNEL assay을 활용하여 미생물 대사 독성 물질에 의한 세포 사멸에 대한 독성 평가법을 제시하였음.

2) 2차년도 연구내용

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(1) 장내 미생물 대사체에 의한 유전독성 및 면역독성 연구 p53 유전자 발현 관련 독성평가기술 개발: 유전자 손상 복구 유전자는 세 포 내에 항상 일정한 수준을 유지하지만 유전자 손상이 심한 경우 복구 단백질 만으로는 손상을 정상화하기가 어려워 유전자 손상 감시 체계에 의한 유전자 복구 단백질들의 발현 증가가 요구됨. 따라서 p53 발현과 관련된 연구를 독성 평가에 활용한다면 매우 뛰어난 유전독성 평가기법으로의 활용이 가능해 질 것 으로 예측됨. Doxorubicin, actinomycin 등 유전독성 물질이 세포 손상 및 DNA 손상 등에 의한 각각의 유전자 발현의 증가는 다양한 전사 조절 인자에 의한 promoter 활성이 증가함으로 p53 유전자의 promoter를 제작하여 유전 독성 물질을 처리한 후 각각의

promoter 활성을 조사함으로서 유전독성에 대

한 영향 평가방법을 제시하였음. p53 유전자는 유전독성 물질에 의해서 유도되 는 유전자의 변이, DNA손상에 의해서 조절되는 유전자로서 이를 활용하여 분 자생물학적 유전독성평가 방법을 개발할 수 있을 것으로 사료됨. 유전독성 물 질에 의해 발생되는 DNA 손상 및 세포사멸 등에 관여하는 p53 유전자의 활성 도를 측정할 수 있는 reporter gene 클로닝

및 p53 유전자의 promoter 활

성을 활용한 유전독성 평가 방법을 구축하고자 하였음.

8-Oxoguanine glycosylase 발현을 이용한 유전독성 평가기법의 개발: 유 전정보를 지니고 있는 DNA는 활성산소에 의한 손상으로 인해 돌연변이로 이 어질 수 있으며, 이 돌연변이가 발암과 관련될 가능성이 제시되고 있음. 활성 산소에 의한 DNA 손상에는 여러 형태가 있지만, 최근 그 중요성이 부각되고 있는 대표적인 DNA 손상이 8-oxoguanine임. 따라서 본 연구에서는 미생물 대사 독성 물질에 의한 유전독성 영향을 8-oxoguanine glycosylase 유전자 발현 분석을 통하여 조사하고자 하였음.

(2) 염증관련 유전자 발현 평가를 활용한 면역독성 평가기법의 개발 외부 물질에 의하여 활성화된 대식세포(macrophages)는 반응성이 강한

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O ,

H2O2,

OH ,

nitric

oxide

(NO),

eicosanoids

및

inflammatory

cytokines을 비롯한 여러 물질을 분비함으로서 염증 반응을 촉진시켜 숙주방 어기전에 중요한 역할을 하고 있으며, 활성화되면 여러 종양세포와 미생물의 성장을 억제함.

Prostaglandin 합성의 주요 효소인 cyclooxygenase (COX)

는 COX-1과 COX-2의 두 가지 형태로 존재함. COX-1은 위장관에 다량으로 존재하는 구성요소이며 지속적인 prostaglandin의 생산을 통하여 점막의 구조 를 보존하는 것으로 생각되며, COX-2는 염증 반응 시에 주로 유도되는 효소 임. Arachidonic acid (AA)가 COX-2에 의해 대사 과정을 거쳐 최종 대사산 물인 Prostaglanidn E2 (PGE2)가 생성되며 COX-2에 의해 변화한 PG의생산 은 염증과 세포분화에 주요 인자로 작용하는 것으로 알려져 있음.

COX-2 에

의해 변화한 PG의 생산은 염증과 세포분화에 주요 인자로 작용하는 것으로 알 려져 있음. 따라서 본 연구에서는 COX-2 특이적인 primer을 제작하여 RT-PCR 방법을 통한 COX-2 유전자 발현에 대한 영향을 조사하였음.

Fig. 2. Intracellular signaling pathways of inflammation

전사인자 활성화 기법을 활용한 독성평가기술의 개발: 염증관련 유전자인 COX-2, iNOS 및 염증성 cytokines 유전자의 발현은 대표적으로 NF-κB, AP-1 (activator protein-1) 전사인자의 활성에 의하여 조절됨. 염증관련 유 전자의 발현의 증가는 NF-κB, AP-1의 전사인자의 활성을 증가시키므로 면 역계 독성물질에 의해 유발되는 염증 반응 시 관여하는 특이적 전사인자를 확 인하고자 하였음. NF-κB, AP-1의 전사인자의 특이적 결합의 증가에 의한 것인지를 조사하기 위하여, 본 연구에서는 NF-κB, AP-1 전사인자의 활성도 를 평가하고자 하였음. 장내세균 효소복합체(fecalase) 또는 장내미생물에 의

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

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한 독성 대사체을 처리하고 transfection을 수행하여 NF-κB, AP-1등의 전 사인자의 활성을 조사함으로서 면역독성에 대한 영향을 평가 할 수 있으며 이 는 장내세균 효소복합체(fecalase) 또는 장내미생물에 의한 독성 대사체 물질 에 대한 면역 평가방법으로 활용하였음.

3) 3차년도 연구내용 (1) 장내 미생물 대사체에 의한 세포 독성 및 세포 사멸에 대한 연구 활성산소종(reactive oxygen species) 관련 독성평가: 장내세균 효소복합 체(fecalase) 또는 장내미생물에 의해 생성된 독성 대사체의 세포 독성을 조사 하기 위하여 활성산소종(reactive oxygen species) 생성능을 측정하였음. 세포독성 평가: 장내세균 효소복합체(fecalase) 또는 장내미생물에 의해 생 성된 독성 대사체의 세포독성 평가를 하기 위하여 인체 세포주를 활용한 세포 질내에 존재하는 효소인 lactate dehydrogenase(LDH)가 세포 밖으로 누출되 는 정도를 측정하고, mitochondria 내의 succinate dehydrogenase를 측정하 기 위하여 MTT reduction test를 수행하였음. Apoptosis 유발능의 평가: 세포사멸은 세포가 외적 요인에 의해 심각한 손 상을 입었을 경우 세포 내부의 사멸 프로그램에 의해 유도되는 nucleoplasm과 cytoplasm의 condensation, 세포막의 손상, apoptotic body의 형성에 의한 세포의 분절과 주위세포에 대한 식균작용이 수반됨. 본 연구에서는 장내세균 효소복합체(fecalase) 또는 장내미생물에 의해 생성된 독성 대사체의 세포 사 멸에 대한 안전성 평가를 하기 위하여 apoptosis assay을 활용하여 미생물 대 사 독성 물질에 의한 세포 사멸에 대한 독성 평가법을 제시하고자 하였음.

(2) 장내 미생물 대사체에 의한 유전독성에 대한 연구

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1-1세부과제

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Comet assay를 통한 유전독성 연구: 과거 유전독성 연구는 소핵 검사나 Ames test가 수행되어왔으며, 그 외에 염색체 이상 및 자매염색체 교환등 방 법이 사용되어져 왔으나, 현재에는 분자생물학적 기법에 의한 유전독성 평가기 법으로

DNA

adduct,

chromosomal

aberration,

comet

assay

및

micronuclei 측정 등이 대체시험법으로 각광을 받고 있음. 그 중에서 comet assay는 DNA 손상을 알아보는 대표적인 방법이며, 단세포 전기 영동법 (single cell gel electrophoresis)이라고도 하며, 외부자극에 의한 DNA 단일 나선 절단을 전기영동에 의해 검출하여 단일 세포수준에서 DNA 손상여부를 알 수 있음. 따라서 본 연구에서는 인체 세포주를 활용하여 장내세균 효소복합 체(fecalase) 또는 장내미생물에 의해 생성된 독성 대사체의 유전 독성에 대한 영향을 comet assay 방법을 구축하여 평가하였음.

Fig. 3. Detection of genotoxic materials using the comet assay system.

In vitro 소핵시험(In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test): In vitro 소핵시험은 포유동물세포를 이용하여 염색체의 구조적이상(clastogenic) 및 수적이상(aneugenic)을 일으키는 물질을 측정하는 유전독성 시험법으로써 interphase 세포의 세포질에 존재하는 소핵을 측정함. 이 시험법은 현재 OECD guideline에 draft가 제출된 상태임. 따라서 본 연구에서는 장내세균 효 소복합체(fecalase) 또는 장내미생물에 의한 독성 대사체의 유전 독성에 대한 영향을 In vitro 소핵시험 방법을 구축하여 평가하였음. 이(2) 핵 세포 기준에 맞는 세포에서 관찰되는 소핵의 유형: 크기가 주핵 직경의 1/3 이하거나 (A), 소핵과 주핵이 접촉하지만 겹쳐지지 않은 경우 (B)

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1-1세부과제

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주핵이 연결되어 있으면서 소핵이 있는 경우 모두 소핵으로 인정함 (C, D).

Fig. 4. Micronuclei that meet the scoring criteria

(3) 장내 미생물 대사체에 의한 면역독성에 대한 연구 Prostaglandin 합성의 주요 효소인 cyclooxygenase (COX)는 COX-1과 COX-2의 두 가지 형태로 존재함. COX-1은 위장관에 다량으로 존재하는 구 성요소이며, 지속적인 prostaglandin의 생산을 통하여 점막의 구조를 보존하는 것으로 생각되며, COX-2는 염증 반응 시에 주로 유도되는 효소임. COX-1은 constitutive enzyme으로서 stomach의 mucosal epithelium의 integrity 유지 등의 역할을 담당하는 protective PGs을 생성하여 정상적인 생리작용에 기여 하며, COX-2는 inducible enzyme으로서 염증 등을 유도함. 따라서 본 연구에서는 염증 관련 유전인자인 COX-2 유전자 발현을 조사하 여 장내세균 효소복합체(fecalase) 또는 장내미생물에 의해 생성된 독성 대사 체의 면역 독성에 대한 영향을 평가하였음. 염증관련 유전자인 COX-2, iNOS 및 염증성 cytokines 유전자의 발현은 대표적으로 NF-κB, AP-1 (activator protein-1) 전사인자의 활성에 의하 여 조절됨. 염증관련 유전자의 발현의 증가는 NF-κB, AP-1등의 전사인자의 활성을 증가시키므로 장내세균 효소복합체(fecalase) 또는 장내미생물에 의한 독성 대사체의 염증 반응 시 관여하는 특이적 전사인자의 활성을 측정하였음.

4) 연구방법

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1-1세부과제

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In vitro 대사체 규명: 각 시험물질이 장내미생물에 의한 대사과정을 거쳐 생성되는 대사체의 종류와 구조를 규명하기 위하여 독성물질과 장내미생물을 일정시간 배양한 시료에서 대사체 분석실험을 수행하였음. 반응액 일정량에 1 ㎖의 ethyl acetate을 반응 액에 첨가하여 섞은 후 3000 rpm에서 10 분간 원심분리 후

800 ㎕의 유기

용매를 분리하였음. 분리된 유기용매층을 질소가스를 이용 휘발시키고 남은 잔 사에 100 ㎕의

HPLC grade 100% ACN을 첨가하였다. 위와 같은 전처리

과정을 거친 후 mass spectrometry를 사용하여 측정하였음. 시험물질의 처리 량, 대사체의 생성여부, 그리고 가능한 경우 대사체 구조의 규명에 관한 연구를 수행하였음.

시험기기 생성된

대사체의

구조를

확인하기

위한

LC/MS

system으로

surveyor

system(Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA)과 ESI source가 장착된 LCG advantage trap mass spectrometer (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA)을 사용하였음. 물질 분리를 위해 Waters Co.에서 구입한 Xetrra C18 (2.1×50 mm, 3.5 m)을 사용하고 이동상으로 20 mM ammonium formate buffer(pH 4.0)와 100 % acetonitrile을 210 ㎕/min의 조건을 유지 하였음. 물질의 이온화를 위해 sheath gas(70 arb), auxiliary gas (20 arb), capillary

temperature

(215℃)와

spray

voltage(4.0

kV)를

맞추고,

positive ion mode로 m/z 80-450에서 분석한다. 헬륨을 tandem mass spectrometric 실험을 위해 collision gas로 사용하였음.

In vitro 임파구 증식능: 독성 영향에 대사과정이 역할을 하는지를 파악하기 위한 연구의 일환으로 시험 물질을

비장세포

배양액에

처리하여

임파구

증식능

시험을

수행하였음.

Mitogen으로는 B-임파구 증식능을 측정하기 위하여 LPS를, T-임파구 증식 능의 측정을 위하여 Con A를 사용한다. 방법적으로는 비장을 무균적으로 적출 하여 단일세포액으로 만들고 RPMI 1640 배지로 2회 세척한 후, 5% fetal bovine

serum,

L-glutamine,

100

unit

penicillin,

100

μg

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1-1세부과제

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streptomycin 및 5×10

-5

M 2-mercaptoethanol을 함유하는 RPMI 1640

complete 배지에 균질화하고 세포의 농도를 1.11×106 세포/1 ml이 되도록 조정하였음. 그리고 180 μl의 세포액을 96-well 배양접시 (Costar)에 분주 하고 LPS (10 μg/ml) 또는 Con A (2 μg/ml)를 조제하여 well 당 총용량 이 200 μl이 되도록 통일시킨다. 모든 처리가 끝난 후, plate를 37℃의 CO2 incubator에서 72시간 동안 배양하여 유약화 반응을 유도하였음. Dye를 이용 한 세포유약화 반응의 측정을 위해서 배양 시작 후, 3일째에 Promega 사제의 Cell Titer 96

AQueous Non-radioactive Proliferation kit를 사용하였음.

20 μl의 dye를 각 well에 처리하고 37℃의 5% CO2 incubator에서 4시간 동 안 배양하여 발색을 유도한 다음 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서의 흡광도를 측정하였음.

세포 내 ROS 측정: 세포 내 ROS의 양은 형광 probe인 DCF-DA을 사용하여 측정함. 배양액에 DCF-DA (2',7'-Dichlorofluorescein diacetate)를 well당 25 μM로 처리하 여 15분간 배양한 후 미생물 대사 독성 물질을 처리한다. 반응 후 형성된 세포 내 과산화물은 excitation 파장 485 nm, emission 파장 530 nm에서 fluorescence를 측정하였음.

MTT assay를 이용한 세포독성 측정 96-well microtiter plate에 세포농도 5×106 cells/㎖로 조절하여 100 ㎕씩 well에 넣고 미생물 대사 독성 물질을 농도별로 처리 한 다음 1시간 배양하였 음. 배양액을 교환한 후 MTT labeling reagent에 electron coupling reagent 를 첨가하여 준비한 MTT labeling mixture를 각 well당 10 ㎕씩 (최종농도 0.5 ㎎/㎖) 4시간 처리한 후 550 nm 파장에서 흡광도를 이용하여 미생물 대 사 독성 물질의 세포독성을 조사하였음.

배양액 내 lactate dehydrogenase (LDH) leakage측정 -

LDH 활성은 기질 pyruvate가 lactate로 감소되는 정도를 조사하여 측정.

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1-1세부과제

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이 감소는 reduced NADH가 산화되고, 340 nm에서 최대 흡광도를 나타냄. 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) 2.7 ㎖을 cuvette에 넣고 0.1 ㎖ culture media를 첨가하고, 0.02 M sodium pyruvate 0.1 ㎖을 넣은 후, NADH (0.2 ㎎) 0.1 ㎖을 첨가하여 잘 섞어준 후 340 nm 흡광도에서 2분 동안 흡광도를 측정하였음.

RT-PCR을 이용한 세포 사멸 관련 유전자 발현 측정 시료를 4M guanidium thiocyanate에 용해시키거나 RNA zol 용액을 이용하 여 전체 세포내 RNA를 분리한 다음, oligo-d(T) cellulose spin column을 이용하여 mRNA를 분리한 후 0.5 μg oligo d(T)18 primer와 super-script reverse transcriptase을 이용하여 cDNA를 합성하였음. 합성한 cDNA를 이 용하여 세포 사멸 관련 유전자 발현을 이들 유전자에 특이적인 primer를 이용 한 PCR로 증폭시킨 후 이들 유전자의 발현 양상을 측정하였음.

Repoter assay를 통한 발현 조절 인자 측정 및 발현 조절 측정 p53 유전자의 발현을 활용한 유전독성 물질에 대한 이들 유전자의 전사 활 성도에 대한 영향을 조사하기 위하여 인간 genomic DNA에서 각각의 프로모 터 부분을 PCR 방법을 이용하여 luciferase 유전자가 발현되는 pGL3 벡터에 삽입하여 luciferase 유전자가 발현되도록 재조합 플라스미드를 제조하였음. 재 조합 플라스미드를 이용하여 인체 세포주을 LipofectAMINE Plus를 이용하여 형질전환 시킴. 즉 세포에 0.2μg의 pCMV-β-gal, 0.5μg의 각각의 플라스 미드, PLUS Reagent, 그리고 LipofectAMINE를 사용 형질전환시킨 후 미생 물 대사 독성 물질를 처리하고 24 h후에 세포 추출물을 얻어 Luciferase 활성 을 측정하였음.

Comet assay에 의한 유전독성 측정 세포를 6-well plate에 넣고 미생물 대사 독성 물질을 처리 한 후 24시간 동 안 배양후 새로운 배지를 교환 후 세포를 모아 PBS로 washing후 원심분리하 여 상측액을 버리고 0.5%-low melting point agarose를 적절히 혼합시킴. 0.65%-normal melting point agarose로 미리 입힌 slide위에 떨어뜨린 후

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1-1세부과제

23/ 23/144

cover slide를 덮고 20분간 굳힌 뒤, cover slide를 제거하고 그 위에 다시 0.5% LMPA를 떨어뜨린 후 cover slide를 덮고 상온에서 굳힌 후 lysis buffer에 담근 후에 빛을 차단한 채로 1시간 동안 lysis시킨 후 전기 연동하여 DNA 손상 정도를 측정하였음.

In vitro 소핵 시험에 의한 유전독성 측정 Cell을 24 well 에 3×104cell/ml 로 파종 후 PBS로 3회 세척 후 3 ㎍/㎖의 cytochalasine B 용액을 포함한 일반 배양액으로 교환한 후 20 시간 동안 배 양한 후 시료를 처리하고 Trypsin-EDTA 용액으로 세포를 떼어낸 후 원심분 리 튜브에 세포를 옮긴 뒤

1,500 rpm에서 5 분간 원심분리하여 상층액을 제

거함. 세포를 현탁한 다음 냉장 고정액으로 세포를 고정한 후 슬라이드에 도말 하여 건조가 끝난 슬라이드는 Gimsa 염색 용액에 3 분간 염색하였음.

RAW 264.7 세포배양 거식세포주 RAW 264.7 (ATCC TIB-71)은 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units/㎖ penicillin, 그리고 100 ㎍/㎖ streptomycin 이 함유된 RPMI 1640 배지를 이용하여 37℃ humidified 5% CO2 incubator 에서 배양하였음.

RT-PCR을 이용한 COX-2 및 염증성 cytokines 유전자의 발현 측정 시료를 4 M guanidine thiocyanate에 용해시키거나 RNAzol 용액을 이용하 여 전체 세포내 RNA를 분리한 다음, oligo d(T) cellulose spin column을 이 용하여 mRNA를 분리함. 분리한 mRNA 0.1 ㎍을 0.5 ㎍ oligo d(T)18 primer와 superscript reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성하고 합성한 cDNA를 이용하여 COX-2, IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현을 아래 의 primer를 이용하여 PCR로 증폭시킴. 또한 정량적 분석을 위하여 cloning하 여

제조한

artificial

competitor와

합성한

cDNA를

template로

하여

semiquantitative PCR을 이용하여 측정하였음.

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1-1세부과제

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염증성 cytokines의 생성량 측정 RAW 264.7을 배양하여 미생물 대사 독성 물질을 처리한 뒤 상층을 이용하 여 대표적 염증성 cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성량을 ELISA로 측정하였음.

COX-2 plasmid를 이용하여 transfection 및 Luciferase활성도 측정 Raw 264.7 cell을 LipofectAMINE Plus를 이용하여 형질전환 시킴. 즉 세포 에 0.2μg의 pCMV-β-gal, 1 μg의 pPRO-Luc, PLUS Reagent, 그리고 LipofectAMINE를 사용 형질전환시킨 후 세포 추출물을 얻어 Luciferase 활 성도 측정에 사용하였음.

pLUC(NF-κB)3, pLUC(AP-1)3, transfection과 LUC 정량 COX-2 의 promoter 부위를 clonling 하여 이들을 Luciferase을 갖는 pLUC-promoter vector에 삽입시켜 재조합 플라스미드를 만들어, NF-κB, Ap-1 전사촉진제의 활성도에 의존적으로 Luciferase 유전자가 발현되도록 함. 세포에 LiphofectAMINE를 이용하여 pLUC(κB)3과

pLUC(AP)3를

transfection 시킨 다음 24시간 배양한 후, 미생물 대사 독성 물질을 처리 한 후, lysate를 만들고 상층액만을 취하여 Luciferase 활성도를 측정하였음.

3. 연구개발 결과

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1-1세부과제

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1) 1차년도 연구 내용 및 결과 장내미생물 배양법 개발

(1) 장내미생물 중 시험균주 선정 장내 균총은 사람이나 동물의 소화장내에 서식하고 있는 미생물 집단으로 (Mitsuoka T, 2005), 그 수는 분 1g 당 1014개 이상이며, 종류는 100~500 여종에 이르고, 분변 부피의 1/3~1/2를 차지함(Gorbach 등 1967; Salminen 등, 1998). 장내 균총은 장내 정착성 여부에 따라 장기간 서식하고 있는 정주 균총(resident flora, indigenous flora)과 일시적으로 유입하여 통과하는 통과 균(transient flora)으로 구분하지만 명확한 분류는 어렵움(Mitsuoka, 1978; Salminen 등, 1995). 사람의

장내

Bifidobacterium,

균총을

구성하는

Streptococcus,

Peptococcaceae,

Veilonella,

Treponema,

Lactobacillus,

미생물군으로는

Eubacterium,

Bacteroidaceae, Gemmiger,

Clostridium,

Stapylococcus,

Bacillus,

Megasphara,

Enterobacteriaceae,

Corynebacterium, Psudomonas, Yeasts 등이 있으며(Mitsuoka, 2005; Ji, 1994), 이외에도 수많은 여러 종류의 혐기성, 조건적 혐기성 또는 호기성 미생 물이 장내에 존재하는 것으로 보고되고 있음(Gorbach 등 1967). 이렇게 복잡한 장내균총은 그 구성에 있어서 사람의 위장과 위치에 따라 다 양성을

나타냄

(Table

1).

구강내

균총은

Bacteroides,

Streptococci,

Lactobacilli, yeasts 등의 조건적 또는 절대적 혐기성 미생물로 구성되어 있 음. 음식을 섭취한 직후에는 위에서 미생물의 수가 10

CFU/g 정도이지만,

pH의 감소에 따라 그 수가 감소하여, bacteria의 수는 103 CFU/g이하로 떨어 지게 됨. 이 후 회장에서 그 수준이 점차 증가하여 결장에서는 1011~1012 CFU/g에 달하게 됨(Mikelsaar 등 1998).

Table

The

composition

the

human

gastrointestinal

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1-1세부과제

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microflora(Simon, 1986; Salminen 1995)

장내 균총을 구성하는 세균은 그 수와 종류가 다양하고, 이들 미생물 효소 의 종류와 활성도 다양함(Salminen 등, 1998). Rowland(1992)는 장내 균총 은 발암과 노화의 원인이 되는 물질의 생성, 설사의 원인이 되는 세균 독소의 생산 등의 유해한 영향을 미치는 미생물과, 이에 반해 발암물질이나 노화 촉진 물질을 분해하여 무독화시키거나, 감염방어에 도움이 되는 유기산이나 항균성 물질을 생성하는 유익한 미생물 등 종류에 따라서 숙주와 복잡한 관계를 가지 고 있음.

사람의 대표적인 장내 유용균인 Bifidobacteria와 Lactobacilli는 잘 알려져 있으며, 이외의 각종 혐기성, 호기성 균의 대부분은 부패작용을 가지고 있어서 유해균으로서 작용함(Itoh, 1999; Glenn 등, 1995).

장내의 수많은 유해균은 단백질이나 아미노산으로부터 발암물질이나 발암촉 진물질을

생산하며,

이들에는

phenol류,

tryptophan

대사물(indole,

3-hydroxykynurenine, kynorinic acid 등), nitroso 화합물, ethionine 등이 있고, 지방 대사물로서는 2차 담즙산, nitrosamine, epoxide 유도체 등이 있 다.

또

식품첨가물,

의약품,

식품으로서

섭취되는

물질은

유해균의

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1-1세부과제

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-glucuronisase,

nitroreductase,

azoreductase,

7α-dehydroxylase,

cholesterol dehydrogenase 등에 의해 발암물질로 전화되어 인체에 나쁜 영 향을 미칠 수 있음(Frenandes 등, 1992)

이러한 장내 균총 중 본 세부과제의 목표를 달성하기 위한 시험균주로써

Bifidobacterium과 Bacteroides fragilis을 선택하였음. Bifidobacteria는 1899년 Tissier에 의해 모유를 먹는 유아의 분변에서 분 리되었으며, 현재 32종(species)을 포함하는 독립된 Bifidobacterium 속 (Genus)으로 분류되고 있음.

Bifidobacterium은 gram 양성균이며 glucose를 분해하여 acetic acid와 lactic acid를 3:2의 비율로 생성함. 장내 유익한 균총으로서 생후 2~5일 사이 에 나타나기 시작하여 1주일 안에 1010~1011/g 수준으로 우점하게 됨. Bifidobacteria는 이유시기를 기점으로 줄어들기 시작하여 노화가 진행되면 서 감소함.

Bifidobacteria는 사람(성인과 유아의 장, 질, 구강), 동물, 곤충, 오·폐수 (sewage) 등의 4가지 생태계(niches)에서 분리되며, 성인의 장내에서는 B.

pseudocatenulactum과 B. longum이 주종을 이루며, 구강에서는 치태(dental plaque) 형성에 관련 있는 것으로 보여지는 B. dentium가 주로 분리됨.

이에 성인 장내에서 주종을 이루고 있는 Bifidobacterium 중 B. longum와 B.

adolescentis를 시험균주로 사용하였으며, B. longum 중 신생아 분변에서 분리 한 B. longum HY81, B. longum HY82, B. longum HY84 및 B. adolescentis HY83을 시험균주로 사용하였음.

Bacteroides fragilis는 사람의 대장 정상 세균총의 1~2%를 점유하고 있으 며, 사람 임상 가검물에서 가장 흔하게 분리되는 혐기성 세균임. 이 균은 원래 서식하는 있는 장관을 벗어나 사람의 복강내로 이동하였을 때 농양이라는 질병을 초래하는데, 최근에 이 균중 enterotoxigenic B. fragilis라

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1-1세부과제

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는 균이 새롭게 분류되었고 이 균에 의해 설사를 일으킬 수 있음이 보고되고 있음(Mitsuoka, 1978; Salminen 등, 1995). 이 균으로부터 분비되는 분자량 약 20,000 dalton인 장독소(enterotoxin)가 설사 기전에 중심적인 역할을 하 고 있음이 밝혀짐에 따라 B. fragilis 장독소에 의한 인체 장상피세포의 면역병 리 기전 규명이 중요한 과제로 대두되었음.

이에 임상 가검물에서 흔하게 발견되는 B. fragilis KCTC3688를 분양받아 장내미생물 배양법 개발을 위한 시험균주로 사용하였음.

② 장내미생물 배양에 따른 표준작업수순서

선정된 시험균주는 균주 특성에 맞는 적절한 배지를 이용하여 배양 실험에 사용하였으며, 표준작업수순서를 작성하여 실적물로 제시하였고, 표준작업수순 서에 따라 배양한 후 면역독성 및 세포독성 연구와 대사체 분석 연구에 활용할 수 있었음.

표준작업수순서에 따라 시험균주를 각각 접종시켜 배양시킨 BL medium군 과 CM medium군 및 amaranth, arbutin, baicalin 등의 시험물질을 함께 접종 시킨 군에서의 장내미생물 생존수는 다음과 같았음.

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1-1세부과제

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(2) Minimal media 선정을 위한 증균배지와 혐기희석액의 독성평가

장내미생물을 이용한 화학물질의 대사 및 독성평가는 크게 두가지 방법으로 접근하였음. 첫째 방법은 장내미생물을 증균배지(BL 또는 CM 배지)에서 증식을 시키는 초기부터 시험물질을 동시에 첨가하여 대사를 유도하는 방법이고, 두 번째 는 증균배지 내에 존재하는 물질 중 동물세포 배양계에서의 독성평가 시 독성을 유 발할 수 있는 물질이 존재할 수 있기 때문에 이를 차단하기 위해 일단 증균배지에 서 장내미생물을 증식시키고 원심하여 배지를 제거한 다음, 몇 가지 미네랄만 함유 한 혐기희석액 존재 하에 시험물질의 대사를 유도하는 방법임. 즉, BL이나 CM 배 지 내의 성분 또는 장내미생물이 성장하는 과정에서 발생되는 부산물들에 의한 영 향을 배제하는 방법의 선택이 중요하였음.

이를 위해 B. longum HY81과 B. adolescentis를 극소량 BL 배지에 접종시키 고 시험물질인 arbutin (2 mM)과 함께 하루 이상 배양하면서 미생물의 성장이 최 대치가 되도록 한 시료와, 장내미생물을 먼저 증식시키고 증균배지를 제거한 음 arbutin을 넣어 혐기희석액에서 배양한 시료에 대하여 대사체 형성 여부를 분석하 였음. 이때, 두 시료간의 최종 장내미생물 농도는 거의 비슷한 수준으로 맞추었으 며, 증균배지 원액(1X)과 절반 희석액(0.5X)에서 미생물을 각각 증식시켰음.

그 결과, 아래 그림과 같이 미생물을 처음부터 접종하여 증균시킨 시료[BL 증 균배지 원액(1X)과 절반 희석액(0.5X)]와 BL 배지 없이 대수기에 균주만 접종시 킨 시료 간에 대사체의 생성은 유사하였음. 이러한 결과는 장내미생물에 의하여 arbutin이 두 조건에서 모두 hydroquinone으로 대사를 시킬 수 있음을 시사해 주 는 것으로써, 장내미생물 배양법을 통하여 대사체 독성평가가 가능할 것임을 알 수 있었음. 따라서 이러한 결과를 바탕으로 minimal media 선정을 위한 증균배지 및 혐기희석액의 독성평가를 계속 진행하고자 하였음.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

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약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

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Minimal media 선정을 위해 증균배지와 혐기희석액에서 배양된 시험물질에 서 장내미생물의 영향을 비교 분석하고자 하였음. 즉, BL 액체배지에 B. longum HY81 및 B. adolescentis를 각각 넣고 100 mM의 arbutin solution을 final 농도가 10 mM이 되도록 넣고 혐기조건으 로 37℃에서 24시간동안 배양시켰음. 배양이 완료된 증균배지는 원심분리하여 상등액을 취하고, 이를 0.2 ㎛의 membrane filter로 제균시킨 뒤 20배양의 ACN으로 제단백처리한 후 13,000 rpm에서 20분간 원심분리시켜 상등액을 취 하여 분석시료로 사용하였음.

CM 액체배지에도 B. fragilis와 100 mM의 arbutin을 첨가하여 arbutin의 최종 농도가 10 mM이 되도록 한 후 B. longum의 방법과 동일한 수준으로 혐 기배양하여후 동일한 전처리 과정을 거쳐 분석에 이용하였음.

혐기희석액 조건에서도 장내미생물에 의한 대사 영향을 살펴보고자, 20시간 동안 BL 배지에서 증식시킨 B. longum HY81 및 B. adolescentis를 혐기희석 액으로 세척하고, 장내미생물의 수를 일정하게 맞춘 뒤 최종농도 2 mM의 arbutin을 첨가하여 37℃에서 24시간 동안 혐기적으로 배양하였음. 배양이 완 료된 혐기희석액은 상등액을 취하여 2배로 희석한 뒤 0.2 ㎛의 membrane filter로 제균시킨 뒤 13,000 rpm에서 20분간 원심분리시켜 상등액을 취하여 분석시료로 사용하였음.

그 결과, Fig. 1과 같이 BL 증균배지내에서 arbutin과 hydroqinone의 분석 법을 마련하고 Fig. 2와 같이 장내미생물에 의한 대사체 생성을 확인할 수 있 었다. 즉, BL 증균배지 내에서는 B. longum HY81은 arbutin만 존재하였고 대 사체인 hydroquinone의 존재가 미미하였으나, B. adolescentis는 장내미생물 에 의한 대사로 arbutin의 양은 감소하고 대사체인 hydroquinone이 생성됨을 확인할 수 있었다. CM 증균배지에서 B. fragilis에 의한 대사체 생성은 거의 확인할 수가 없었음 (Fig. 3).

또한 혐기희석액으로 배양하였을 때에는 B. adolescentis 뿐 아니라 B.

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1-1세부과제

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longum HY81에서도 대사체 hydroquinone의 생성이 분명하게 나타났음 (Fig. 4).

이러한 결과는 장내미생물의 종류 및 배양조건에 따라 화학물질의 대사능에 있어 현저한 차이를 보일 수 있음을 의미하는 결과로써, 개인 간 장내미생물총 의 조성차이에 따라 장내에서의 화학물질의 대사에 있어서도 현저한 개인차를 보일 수 있음을 의미하는 중요한 결과로 판단되었음. 또한 장내미생물 배양을 이용하여 미생물대사체 독성평가 기술을 개발하기 위해서는 장내미생물의 종류 선정, 배양조건, 시험물질의 종류 등 고려해야할 사항이 다양하여 지속적인 연 구가 필요함을 알 수 있었음.

따라서, 이후 실험에서는 arbutin 대사에 관한 사항을 추가로 연구하고자 하였고, 이후 다른 시험물질의 대사에 대해서도 연구를 진행하고자 하였음.

혐기희석액 조건에서 장내미생물에 의한 대사를 보다 상세히 살펴보기 위하 여 arbutin의 최종농도를 증균배지와 동일한 10 mM이 되도록 높이고, 혐기희 석액 내에서 장내미생물과 시험물질의 배양시간을 6시간과 24시간으로 구분하 여 대사체 형성 유무를 확인하고자 하였음.

그 결과, Fig. 10과 같이 B. longum HY81에 의한 대사체 생성을 확인할 수 있었으며, 대사체 형성에 배양시간은 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타 났음. 그러나 B. longum HY82, B. adolescentis, B. fragilis에서는 대사체 생 성이 미미하였음. 또한, 동일한 혐기희석액 조건임에도 Fig. 5에서와 같이 많은 양의 hydroquinone이 생성되지도 않았음.

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1-1세부과제

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Figure 1. HPLC chromatograms of arbutin and hydroquinone in BL medium.

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1-1세부과제

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Figure 2. HPLC chromatograms of arbutin and hydroquinone in BL medium.

Bifidobacterium were cultured in the presence

of arbutin for 24 h.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

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Figure 3. HPLC chromatograms of arbutin and hydroquinone in CM medium. B. fragilis was cultured in the presence of arbutin for 24 h.

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1-1세부과제

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Figure

HPLC

anaerobic diluent.

chromatograms

arbutin

and

hydroquinone

Bifidobacterium were cultured in the presence of

arbutin for 24 h.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

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Figure

HPLC

anaerobic diluent.

chromatograms

arbutin

and

hydroquinone

Bif. longum HY81 were cultured in the

presence of arbutin for 6 h and 24 h.

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1-1세부과제

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이는 Fig. 4의 조건보다 Fig. 10에 첨가된 arbutin의 양이 5배 정도 많았기 에 시험물질의 첨가량이 장내미생물의 대사에 영향을 미치거나 대사로 인해 미 생물에 독성을 유발하는 것으로 추정되었고, 좀 더 명확한 결과를 위한 추가 실험이 필요한 것으로 판단되었음. 이상과 같이 혐기희석액과 증균배지 모두에서 장내미생물에 의한 대사체의 형성을 확인할 수 있었으나 보다 안정적인 결과를 도출하기 위하여 혐기희석액 과 증균배지 자체에 대한 면역독성 및 세포독성 실험을 진행하였음. 그 결과, 혐기희석액 및 증균배지를 고농도로 첨가한 군에서 약간의 세포독 성 및 비장세포 증식억제를 살펴볼 수 있었음. 특히 혐기희석액이 증균배지보 다 좀더 강한 독성결과를 나타내었음. 따라서 비장세포의 증식능이나 세포독성에 관한 영향이 보다 적은 증균배지 를 minimal media로 선정하였고, 모든 세포독성 및 면역독성 실험은 독성이 나타나지 않는 배율에서 진행하였다. 또한 minimal media로 선정된 증균배지 를 이용하여 arbutin 및 다른 시험물질에 대한 미생물 대사체 분석과 독성 평 가를 실시하였음.

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1-1세부과제

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시험물질 및 대사체 분석법 개발

장내미생물 배양액에 존재하는 시험물질 및 대사체의 분석법을 개발하기 위 하여 arbutin, sudan III와 이들 대사체는 HPLC 분석법으로, puerarin, baicalin 과 이들 대사체는 LC-MS 분석법을 이용하였음. 확립된 분석법은 장내미생물 배양액을 이용하여 실제 장내미생물에 의하여 대사가 이루어지고 독성 대사체가 생성되는지 확인하는데 사용하였으며, 이들 대사체 생성 유무 결과는 독성평가 결과와 유기적으로 연계시켜 장내미생물에 의한 독성 유발기전을 규명하는데 이바지 하고자 하였음.

(1) 시험물질 및 대사체 분석법 Arbutin(hydroquinone-β-D-glucopyranoside)은 월귤나무 등 다양한 식용식물에 함유되어 있고 방부제로도 사용해 왔음. 현재 arbutin은 강력한 미 백제로써 널리 사용되고 있으나 arbutin에는 독성이 강한 hydroquinone이 배 당체 형태로 존재하고 있음. Arbutin의

배당

체

쉽게

hydr

않지만

Eub

Bacteroides

dist

asonsis, Bifidobacterium adolescentis

등의

구조는

oquinone이

acterium

위액에서

안정하여

분리되지

ramulus,

혐기적 장내미생물에 의해 hydroquinone이 유리되는 것으로 보고되어 있음. 즉, arbutin 섭취 후 위에서는 안정했던 arbutin 배당체 가 장내미생물이 분비 하는 β-glucosidase 등의 효소작용을 받아 hydroquinone으로 대사되어 강한 변이원성과 발암성을 나타낸다고 보고되어 있음.

Arbutin은 그 화학구조가 비교적 단순하고, 이미 장내미생물에 의한 대사가 알려져 있었을 뿐 아니라 대사체인 hydroquinone의 분석도 비교적 용이할 것 으로 판단되어 본 세부과제에서는 장내미생물의 대사계 연구 및 독성평가법 개

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1-1세부과제

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발에 있어서 모델물질로 선정하여 1차적으로 연구에 착수하고자 하였음. 먼저 실제 장내미생물과의 배양이 arbutin의 대사에 어떤 영향을 미치는지 살펴보기 위하여 먼저 HPLC를 이용하여 arbutin 및 hydroquinone 표준품에 대한 분석조건을 확립하고자 하였음.

Arbutin 및 hydroquinone의 분석조건은 C18 칼럼(5 ㎛, 4.6×150 mm)을 사용하여 0.1% phosphoric acid 및 2% methanol을 첨가한 DW를 이동상으 로 하여 isocratic 조건으로 분석하였음. Flow rate는 1.0

ml, injection

volume은 10 ㎕ 이었다. 검출기는 UV detector를 이용하였으며 PDA를 사용 하여 최대 흡수파장을 scanning한 결과, arbutin과 hydroquinone 모두 195 nm 전후에서 최대흡수파장을 나타내었음. 그러나 이 파장에서는 배지 내 방해 피크 물질들이 너무 많이 존재하여 280 nm로 설정하여 분석하였음.

그 결과, arbutin 및 hydroquinone 표준품의 stock solution을 이용한 HPLC 분석에서 Fig. 6과 같이 크로마토그람 상에서 검출되었고, 동시 정량도 가능한 것으로 판단되었음.

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1-1세부과제

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Figure 6. HPLC chromatograms of arbutin and hydroquinone. Puerarin(daidzein-8-C-glucoside)은 Pueraria lobata의 뿌리나 Radix

pueriae에서 주로 분리되는 isoflavone 성분으로, ADP와 collagen으로 유도한 혈소판 응집을 억제하는 등 항혈전작용을 갖음. 또한 streptozotocin으로 당뇨 를 유발한 쥐에 정맥주사하면 혈액내 포도당 농도를 감소시키는 등의 혈당강하 작용, 항알러지작용 등 다양한 약리작용을 나타내는 것으로 알려져 있음. Puerarin의 배당체 구조인 daidzein은 puerarin의 당이 가수분해되어 떨어 짐으로써 생성되는 대사체로써, cyclic AMP phosphodiesterase의 활성을 억 제하거나 진경작용, 항혈전작용 및 혈압강하작용 등을 갖는 것으로 보고되고 있음. 특히 puerarin이나 daidzin으로부터 장내미생물에 의해 대사되어 생성되 는 daidzein의 약리활성은 대사전 물질에 비해 그 약리활성이 훨씬 높은 것으 로 보고되어 있음.

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이에 한국, 중국, 일본 등지에 서 그 섭취빈도와 사용량이 매우 높은

puerarin이

장내미생물에

의해 실제로 어떻게 대사되는지 분석하기

위하여

puerarin의

puerarin

주요

daidzein의

및

대사체인 분석법을

LC-ESI-MS로 확립하였음.

Puerarin 및 daidzein의 분석조건은 Atlantis T3 column(2.1×50mm, 3 ㎛) 에 guard column(4×3 mm)를 부착하여 이동상(A)-MeOH(added 0.1% formic acid)와 이동상(B)-10mM ammonium acetate를 이용하여 gradient 조건으로 분석하였음. Gradient 조건은 이동상(A)를 0-6분 동안 15%-70%, 6-10분 동안 70-95%, 10-10.5분 동안 95%-15%로 변화시킨 후 15분까 지 이동상(A) 15%를 유지하였음. 이때 칼럼 온도는 35℃이었고, sample tray의 온도는 4℃를 유지하였음. Sample injection volume은 10 ㎕, flow rate는

200 ㎕/min

이었다.

Sheath

gas는

40 arb,

Aux

gas는

8 arb,

capillary temperature은 300℃, spray voltage는 3.00 kV 이었음.

그 결과, direct infusion에서 puerarin 및 daidzein은 모두 negative mode에서 [M-H]- 형태로 검출되었고 Fig. 7과 같이 puerarin은 m/z = 415.16, daidzein은 m/z = 253.28을 나타내었음. Puerarin 및 daidzein의 MS/MS pattern은 Fig.7의 아래와 같았으나 daidzein은 collision energy가 60%이상

되어야

fragmentation이

발생되었다.

Puerarin

및

daidzein의

LC-MS chromatogram은 Fig. 8에 나타내었음.

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1-1세부과제

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Figure 7. ESI mass spectra of puerarin and daidzein acquired in the negative ion mode. (upper) A full scan mass spectra of puerarin and daidzein. (lower) MS2 spectra of puerarin and daidzein.

Figure 8. LC-MS chromatogram for the determination of puerarin and daidzein in stock solution.

Baicalin은 wogonoside와 더불어 Radix scutellaria(황금)의 주요 flavonoid 성분으로 항알러지, 항산화 등 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있음. 황금에 함유되어 있는 baicalin은 glucuronic acid를 갖는 특이한 배당체로서 다른 배당체들과 마찬가지로 위나 소장에서 거의 흡수되지 못하고 대부분 장내 세균의 가수분해를 받아 비당체로 된다고 알려져 있음.

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1-1세부과제

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Baicalin은 장내미생물에 의해 baicalein으로 대사되고, 더 대사가 되는 경우에는 4-hydroxybenzoic acid, phenylacetic acid 등으로 대사된다는 보고가 있음. 이러한 반응을 촉매하는 장내 균주로는 Streptococcus, Bifidobacterium,

Lactobacillus속 균주들로 알려져 있다. 이렇게 장내미생물에 의해 생성된 대사 체는 혈소판응집 억제효과, 암세포에 대한 세포 독성 등에 강한 효과를 나타낸 다고 보고되고 있음.

Baicalin 및 LC-MS를

baicalin의

이용하여

주요

분석법을

대사체인

확립하고자

baicalein을 하였음.

분석하기 위하여

분석은

Atlantis

column(2.1×50mm, 3 ㎛)에 guard column(4×3 mm)를 부착하여 ACN과 DW를 이동상으로 하여 gradient 조건에서 실시하였음. 이동상 조건은 ACN를 70%-48%(0-4분),

48%-48%(4-6분),

48-35%(6-10분),

35-70%(10-10.5)로 변경하다가 70%ACN으로 15분까지 유지하였음. 칼럼 온도는 35℃, sample tray 온도는 4℃를 유지하였고, sample injection volume은 10 ㎕, flow rate는 200 ㎕/min 이었음. Sheath gas는 40 arb, Aux gas는 8 arb, capillary temperature은 300℃, spray voltage는 3.00 kV, capillary voltage는 -33.00 V, tube lens offset은 5 V 이었음.

ESI-MS에서 baicalin과 baicalein은 positive 및 negative ion mode에서 모두 분석이 가능하였으나 negative mode에서 좀더 안정적이고 방해피크의 간섭이 적었기에 negative mode로 분석하였음. 그 결과, Fig. 9와 같이 모두 [M-H]- 형태로 검출되었고 baicalin은 m/z = 445.00, baicalein은 m/z = 269.26을 나타내었음. Baicalin의 MS/MS 패턴은 Fig. 9에서와 같이 collision energy를 20-30%만 가하여도 쉽게 배당체가 떨어지고 비당체화되어 m/z = 269.16의 fragment를 나타내었음. Baicalin 대사체인 baicalein에 MS/MS를

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1-1세부과제

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행하면 m/z = 251.11이 주요 fragment로 나타났음.

Figure 9. ESI mass spectra of baicalin and baicalein acquired in the negative ion mode. (upper) A full scan mass spectra of baicalin and baicalein. (lower) MS2 spectra of baicalin and baicalein.

(2) 장내미생물 배양액 내의 시험물질 및 대사체 분석 장내미생물과 시험물질을 함께 배양했을 때 실제로 장내미생물에 의한 대사 가 일어나는지, 장내미생물의 영향으로 생성된 대사체는 무엇인지 규명하기 위 하여 장내미생물 배양액 내의 시험물질과 대사체를 분석하였음.

각각의 분석법은 시험물질과 대사체 분석을 통하여 확립된 방법을 이용하였 고, 장내미생물 배양액은 minimal media로 선정된 증균배지를 이용하여 표준 작업수순서에 따라 제조하였으며, arbutin, baicalin 등의 시험물질 첨가농도도 표준작업수순서에 준하였음.

먼저, 각 단계별로 제조된 장내미생물 배양액을 주사기를 이용하여 1 ml 취 o 하여 15,000 rpm에서 20분간(4 C) 원심분리한 후 상등액을 일정량 취하여

0.45 ㎛ membrane filter로 천천히 여과시킴. 여과액은 일정량 취하여 20배의 MeOH로 제단백 및 희석과정을 거쳐 전처리 한다. 전처리는 용매 제단백으로

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1-1세부과제

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4 C, 15,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등액 200 ㎕를 취하여 HPLC 및 LC-MS 분석에 이용하였음. 장내미생물과 배양된 arbutin은 HPLC를 이용하여 표준곡선을 작성하고 arbutin과 대사체 hydroquinone의 양을 각기 정량하였다. Baicalin이 첨가된 배양액은 LC-MS를 이용하여 장내미생물 종류에 따른 대사체 형성을 정성하 였음.

그 결과, 장내미생물과 arbutin이 첨가된 배양액에서는 arbutin의 주요 독성 대사체인 hydroquinone이 검출되었고, Fig. 10에 나타낸 것과 같이 장내미생 물의 종류에 따라 그 대사능에는 차이가 있었으며 hydroquninone의 생성양도 각기 달랐음. 장내미생물에 의한 arbutin의 대사는 Fig. 10에서와 같이 B. longum HY81과 B. fragilis에서 그 영향력이 가장 적어서 arbutin의 함량이 높게 나타 났고

대사체

hydroquinone은

매우

적게

검출되었음.

반면,

같은

Bifidobacterium이지만 B. longum HY82와 B. adolescentis는 arbutin의 양 이 감소하면서 hydroquinone의 양이 증가하였고, B. longum HY84는 arbutin 이 검출되지 않았고 hydroquinone만 높은 함량으로 검출되었음. 즉, B. longum HY84는 거의 전량의 arbutin이 대사되어 hydroquinone과 같은 대사체를 다량 형성하는 것으로 나타났으며 시험균주 가운데 arbutin에 관한 대사능이 가장 높은 것으로 나타났음.

이상의 결과에서 장내미생물 대사계 연구 모델로 선정한 arbutin이 실제 장 내미생물과의 배양에서 독성이 강한 hydroquinone으로 대사되어 강한 독성을 발현할 수 있음을 확인하였고, 이는 개인의 장내미생물총 조성에 따라 장내 화 학물질의 대사에 있어서 현저한 차이를 나타날 수 있음을 의미하는 중요한 결 과로 판단되었음.

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1-1세부과제

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Figure 10. Concentrations of arbutin and hydroquinone in BL medium and

medium

following

bacterial

cultures

with

arbutin.

Bifidobacterium and B. fragilis were cultured in the presence of arbutin for 20 h.

장내미생물과 배양된 baicalin 배양액은 원심분리 및 membrane filter를 거친 후 20배 MeOH로 제단백하고 LC-MS를 이용하여 negative mode로 분 석하였음.

그 결과, Fig. 11과 Fig. 12와 같이 장내미생물에 의하여 baicalin이 baicalein으로

대사되는

것을

확인할

수

있었으며,

장내미생물

균종간에

baicalin의 대사체 형성에 미치는 영향은 서로 다른 것으로 나타났음.

Fig. 11은 BL 배지를 이용하여 장내미생물과 baicalin을 함께 증균시키면서 배양한 배양액으로부터 baicalin과 대사체 baicalein을 분석한 것임. BL 배지만 배양시킨 것에는 baicalin과 baicalein이 모두 검출되지 않았고, BL 배지에 장 내미생물은 접종하지 않고 시험물질 baicalin만 접종한 배양액에서는 시험물질 baicalin만 검출되었고 대사체 baicalein은 검출되지 않았음. 그러나 BL 배지에 장내미생물과 baicalin을 함께 접종한 군에서는 모두 원물질 baicalin 뿐 아니 라 대사체 baicalein도 검출되었음. 장내미생물의 대사능은 B. longum HY82,

B. adolescentis 및 B. longum HY84에서 서로 비슷한 정도를 나타내었고, B. longum HY81은 다른 시험균주 보다 다소 높은 대사능을 보였음.

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Fig. 12는 CM 배지를 이용하여 장내미생물과 baicalin을 함께 증균하면서 배양한 배양액으로부터 baicalin과 대사체 baicalein을 분석한 것임. CM 배지 만 배양시킨 것에는 baicalin과 baicalein이 모두 검출되지 않았고, CM 배지에 장내미생물은 접종하지 않고 baicalin만 접종한 배양액에서는 baicalin만 검출 되었고 baicalein은 검출되지 않았음. CM 배지에 장내미생물 B. fragilis를 baicalin과 함께 접종하여 배양한 것에서는 시험물질 baicalin 뿐 아니라 대사 체 baicalein도 높게 검출되었음.

즉, baicalin은 장내미생물에 의하여 실제로 baicalein으로 대사됨을 확인할 수 있었으며, 장내미생물 종류에 따라 그 대사능력에는 각기 차이가 있음도 알 수 있었음. 시험균주 가운데에서는

B. longum HY81과 B. fragilis가 다른 시

험균주에 비해서 baicalein으로의 대사능이 다소 높은 것으로 나타났음.

그 외에 sudan III, puerarin 등의 물질에 대해서도 장내미생물 배양액을 제조하여 장내미생물에 의한 대사 영향을 평가하였으나 대사체의 형성을 확인 할 수 없었음. 이는 실제 장내미생물에 의하여 대사가 되지 않았다기 보다는 puerarin 처럼 시험물질의 접종 양이 너무 낮았거나 시험균주에 따른 차이로 생각되며 보다 명확한 결과 도출을 위하여 추가 실험이 필요한 것으로 판단됨.

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면역독성 평가법 개발

대사전 물질과 장내미생물에 의해 대사체를 대상으로 면역독성을 비교평가 하기 위하여 비장세포를 이용한 proliferation assay를 실시하였음.

비장은

BALB/c(female,

7주령)

mouse에서

적출하여

RPMI

1640

medium에 담근 상태에서 지방을 제거하고 세포를 분산시켜 single spleen cell로

만든

뒤

RPMI

mixture(RPMI

penicillin-streptomycin-glutamine(100×)

500

㎕,

1640 5%

fetal

46 ml, bovine

serum 2.5 ml, 2-mercaptoethanol(100×) 50 ㎕)로 부유 및 세척하여 비장 6

세포수가 1.24×10 cell/ml이 되도록 희석하였음. 96 well plate에 cell 160 ㎕, 시험물질 20 ㎕ 넣고 mitogen으로 LPS와 ConA를 각각 처리하여 37℃ incubator에서 68시간 배양하였다. 배양 후 MTS solution과 PMS solution를 20:1의 배율로 섞어서 각각의 well당 20㎕씩 접종하여 4시간 후에 492 nm에 서 흡광도를 측정하였음.

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1-1세부과제

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Figure 11. LC-MS chromatograms of baicalin and baicalein in BL medium. B. longum and Bif. adolescentis were cultured in the presence of baicalin for 20 h.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

52/ 52/144

Figure 12. LC-MS chromatograms of baicalin and baicalein in CM medium. B. fragilis were cultured in the presence of baicalin for 20 h.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

53/ 53/144

먼저, T 세포와 B 세포의 증식반응을 살펴 proliferation을 위한 적절한 LPS 및 ConA의 농도를알아보고자 용량 의존적인 비장세포 증식능을 시험하였 음. ConA는 T-cell mitogen으로, LPS는 B-cell mitogen으로 각각 0.2-4 ㎍/ml과 10-100㎍/ml을 첨가하여 mitogen 농도에 따른 영향을 측정하였음.

그 결과는 Fig. 13과 같이, LPS에서는 40 ㎍/ml, ConA에서는 4 ㎍/ml에 서 면역세포의 증식이 크게 나타나 이를 활용하여 mitogen 첨가량을 설정하였 음.

Figure 13. Proliferation of splenocytes in response to mitogens of different concentrations. 장내미생물 배양액에서 대사체에 의한 독성 영향을 정확하게 도출하기 위하 여 BL 및 CM 배지 자체의 독성과 장내미생물 자체의 독성을 확인하고자 하였 음. 먼저, 이를 위하여 표준작업수순서에 따라 BL 및 CM 배지를 배양하여 BL 및 CM 배지의 첨가농도에 따른 면역독성을 측정하였음. 그 결과, BL 배지에서 는 LPS, ConA 모두 1x, 0.5x 희석액까지는 비장세포 증식능이 억제되었고 0.1x 이상으로 희석시켜야만 세포 증식능의 억제가 일어나지 않았음 (Figure. 14, 15).

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1-1세부과제

54/ 54/144

장내미생물 자체의 독성을 평가한 결과, Fig. 16과 같이 1x, 0.5x 희석액에 서 비장세포 증식능이 크게 억제되었고 0.1x 희석액부터 세포증식의 억제가 완화되었음.

따라서 장내미생물 배양에 따른 시험물질의 대사 독성을 평가할 때에는 배 지 및 미생물 자체 독성의 영향이 낮았던 0.1x부터 면역독성을 평가하였음.

Figure 14. Proliferation of splenocytes in response to BL medium of different concentrations.

Figure 15. Proliferation of splenocytes in response to CM medium of different concentrations. 대사전 물질인 arbutin과 장내미생물에 의해 생성되는 hydroquinone에 관 한 면역독성을 평가하고자 arbutin과 hydroquinone의 첨가농도에 따른 비장세 포 증식능을 분석하였음.

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1-1세부과제

55/ 55/144

먼저, BL 배지에 장내미생물 없이 시험물질인 arbutin만 접종하여 배양시켰 을 때 나타나는 면역독성은 Fig. 17과 같이 0.061x 희석액까지 비장세포 증식 능이 다소간 약화되기는 하였으나 유의성있는 영향으로 판단되지는 않았음. 반 면, 장내미생물과 함께 배양된 arbutin은 대사체인 hydroquinone의 생성으로 인하여 LPS와 ConA 처리군 모두에서 비장세포 증식능이 억제되었으며 특히 LPS 처리군의 증식능이 현저히 저해되었다. 그러나 이러한 비장세포 증식능 억제에는 장내미생물 종류간에 현저한 차이를 나타내었음(Figure. 18, 19).

B. longum HY82, B. adolescentis, B. longum HY84에서는 0.1x, 0.06x 희석액 농도까지 LPS 및 Con A mitogenicity에 큰 영향을 보였고, 0.06x 농 도까지 T-cell 및 B-cell 증식능을 현저하게 억제하는 것으로 확인되었음. 특 히 B. longum HY84 처리군에서는 0.03x 농도까지도 강한 비장세포l 증식 억 제능을 나타내었음(Figure. 18).

CM 배지에 B. fragilis와 arbutin을 함께 배양한 처리군(Figure. 19)에서는

B. longum HY81과 마찬가지로 ConA mitogenicity에 아무런 영향을 미치지 않았음. 다만, B. longum HY81가 LPS 처리군에 농도 의존적으로 다소간의 세포 증식억제능을 나타낸 것과 달리, B. fragilis는 LPS 처리군에 유의적인 영 향을 거의 나타내지 못하였음.

이는 대사체가 원물질에 비해 더 독성이 강하며, 따라서 장내미생물에 의해 hyderoquinone으로 대사가 되면 독성이 강해질 수 있음을 의미함. 또한 이러 한 결과는 앞서 언급한 Fig. 10의 결과와도 상호 연관성이 있는 것으로, 독성 대사체 hydroquinone의 생성이 많았던 B. longum HY82, B. adolescentis 및 B. longum HY84 처리군에서 면역독성이 크게 나타났고, 독성 대사체 생성 이 적었던 B. longum HY81과 B. fragilis 처리군에서는 비장세포 증식능에도 별다른 영향을 미치지 못하였음.

이어서 sudan III이 장내미생물에 의해 실제로 대사되어 면역독성 지표에 어떠한 영향을 미치는지 규명하고자 하였음. 이를 위하여 BL 배지에 장내미생

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1-1세부과제

56/ 56/144

물 없이 sudan III만 접종시킴으로써 대사가 일어나지 않도록 처리한 군과 장 내미생물과 sudan III을 함께 배양하여 대사가 진행되도록 처리한 군으로 나누 어 비장세포 증식능을 평가하였음.

그 결과, Fig. 20과 같이 대사전 sudan III 자체의 독성은 0.06x 농도까지 LPS mitogenicity에 다소간의 영향을 나타내었으나 ConA mitogenicity에는 유의성 있는 영향을 나타내지 않았음. 대사후 물질에서는 Fig. 21 및 Fig. 22 와 같이 B. longum HY84 처리군에서 sudan III 자체 독성과 거의 유사한 양 상을 보였으며, 전농도에서 비장세포 증식능에 농도상관적인 억제작용은 나타 내지 못하였음. 반면, B. longum HY81, B. longum HY82, B. adolescentis 및 B. fragilis 군에서는 LPS 및 ConA 처리군 모두에서 sudan III의 독성이 오히려 다소나마 경감되는 결과를 보였음.

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1-1세부과제

57/ 57/144

Figure

16.

Proliferation

splenocytes

response

intestinal

bacteria of different concentrations.

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1-1세부과제

58/ 58/144

Figure 17. Effect of the incubation of arbutin with BL medium on the proliferation of splenocytes.

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1-1세부과제

59/ 59/144

Figure 18. Effect of the incubation of intestinal bacteria with arbutin on the proliferation of splenocytes. B. longum and B. adolescentis were cultured in the presence of arbutin with BL medium for 20 h.

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1-1세부과제

60/ 60/144

Figure 19. Effect of the incubation of intestinal bacteria with arbutin on the proliferation of splenocytes. Bac. fragilis was cultured in the presence of arbutin with CM medium for 20 h.

Figure 20. Effect of the incubation of sudan III with BL medium on the proliferation of splenocytes.

이는 앞서 보고하였던 arbutin이 자체 독성은 미미하나 장내미생물에 의해 대사되면 독성이 강한 hydroquinone이 생성되었던 것과 달리, sudan III은 장 내미생물에 의해 대사체가 생성되면 오히려 독성이 적어질 가능성을 나타낸 것 으로 추후 좀더 심도깊은 연구를 수행한다면 의미있는 결과를 얻을 수 있을 것 으로 예상됨.

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1-1세부과제

61/ 61/144

한편, 실제 장내미생물에 의해 황금의 주성분인 baicalin을 대사시켰을 때, 생성된 대사체는 면역독성 지표에 대하여 억제작용이 강해지는지 확인하고자 하였음. 그 결과, Fig. 23에 나타낸 바와 같이 baicalin 자체의 항균력 때문에 LPS 및 ConA 처리군 모두에서 비장세포의 증식능이 농도 의존적으로 크게 저해되 었음. 그러나 장내미생물 배양을 통하여 baicalin이 대사되면 원물질 baicalin과 는 좀 다른 양상을 나타내었음(Figure. 24, 25).

앞서 대사체 분석법에서 보고하였듯이(Figure. 11, 12) B. longum HY82,

B. adolescentis 및 B. longum HY84 처리군은 baicalein으로의 생성량이 적 었고 B. longum HY81과 B. fragilis 처리군은 대사체 baicalein의 생성이 높 았음. 대사체 생성능이 낮았던 B. longum HY82, B. adolescentis 및 B.

longum HY84에서는 LPS 및 ConA 처리군 모두에서 baicalin과 유사한 저해 능을 나타냈으나 대사체 생성능이 높았던 B. longum HY81과 B. fragilis에서 는 LPS 및 ConA 처리군 모두에서 비장세포 증식 억제능이 현저히 경감되었 음. 장내미생물에 의하여 baicalin이 baicalein으로 대사되었고, 이들 대사체 생 성으로 말미암아 비장세포 증식 억제능이 왜 둔화되었는지는 보다 심도깊은 연 구가 추가적으로 진행되어야 할 것임.

이상의

결과들을

종합해

볼

때

장내미생물에

의하여

arbutin이

hydroqinone으로 대사됨을 HPLC 분석을 통해 입증하였고, 동시에 장내미생물 이 시험물질의 대사에 영향을 미침으로써 독성 대사체가 발현되고 이로 인하여 면역독성이 발생될 수 있음을 규명할 수 있었음. 또한 장내미생물에 의하여 baicalin이 baicalein으로 대사됨을 LC-MS를 통해 규명하였고, 동시에 sudan III이나 baicalin 물질이 장내미생물에 의해 대사체가 생성되면 면역독성의 지 표변화에 억제 또는 상승작용을 할 수 있음도 제시할 수 있었음.

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1-1세부과제

62/ 62/144

Figure 21. Effect of the incubation of intestinal bacteria with sudan III on the proliferation of splenocytes. B. longum and B. adolescentis were cultured in the presence of sudan III with BL medium for 20 h.

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1-1세부과제

63/ 63/144

Figure 22. Effect of the incubation of intestinal bacteria with sudan III on the proliferation of splenocytes. B. fragilis was cultured in the presence of sudan III with CM medium for 20 h.

Figure 23. Effect of the incubation of baicalin with BL medium on the proliferation of splenocytes.

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1-1세부과제

64/ 64/144

Figure 24. Effect of the incubation of intestinal bacteria with baicalin on the proliferation of splenocytes. B. longum and B. adolescentis were cultured in the

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1-1세부과제

65/ 65/144

presence of baicalin with BL medium for 20 h.

Figure 25. Effect of the incubation of intestinal bacteria with baicalin on the proliferation of splenocytes. B. fragilis was cultured in the presence of baicalin with CM medium for 20 h.

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1-1세부과제

66/ 66/144

세포독성 평가법 개발

(1) 세포독성 평가법 개발 대사과정이 독성발현에 요구되는 물질의 경우 장내미생물에 의한 대사과정 은 독성작용에 매우 중요하기 때문에 장내미생물에 의한 독성 대사체 생성과 그 독성 평가 방법을 제시하고 그 독성 평가 연구를 수행하였음.

장내미생물에 의한 독성 대사체 생성과 독성 물질에 대한 안전성 평가를 하 기 위하여 세포질 내에 존재하는 효소인 lactate dehydrogenase(LDH)가 세 포

밖으로

누출되는

정도를

측정하고,

mitochondria

내의

succinate

dehydrogenase를 측정하기 위하여 MTT reduction test를 통하여 조사하였 음.

Arbutin, geniposide 및 장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된 hydroquinone, genipin의 세포 독성에 대한 영향을 조사하기 위하여 간 세포 주에 arbutin 및 hydroquinone의 농도를 선정하여 24시간 동안 처리한 후 MTT 및 arbutin,

LDH 방법을 이용하여 세포 독성을 조사하였음. 위 연구 결과 geniposide

자체는

독성을

나타내지

않았으나,

장내미생물(β

-glucosidase)에 의해 가수 분해된 hydroquinone, genipin의 경우 100 μM 이상 농도에서 세포 독성을 확인하였음 (Figure. 26-29).

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1-1세부과제

67/ 67/144

120

100

Cell viability (% of control)

120

100

10mM

5mM

2.5m M

1mM

100uM

10uM

1uM

10mM

5m M

Arbutin

2.5m M

1mM

100uM

10uM

1uM

H ydroquinone

Figure 26. Effect of arbutin and hydroquinone in hepatoma cells. The cells were cultured in the presence of various concentrations of arbutin and hydroquinone for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an MTT assay.

1200

120

LDH leakage (% of control)

1100

100

1000 900 800 700 600 500 400 300 200

100 0

0 NA

10mM

5mM

2.5mM

1mM

Arbutin

100uM 10uM

1uM

10mM

5mM

2.5mM

1mM

100uM 10uM

1uM

Hydroquinone

Figure 27. Effect of arbutin and hydroquinone in hepatoma cells. The cells were cultured in the presence of various concentrations of arbutin and hydroquinone for 24 h. Cell viability were estimated by LDH realase assay.

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1-1세부과제

68/ 68/144

100

Cell viability (% of control)

100

0 NA

500 uM

200 uM

100 uM

50 uM

20 uM

2 uM

500 uM

200 uM

100 uM

50 uM

20 uM

2 uM

genipin

geniposide

Figure 28. Effect of geniposide and genipin in hepatoma cells. The cells were cultured in the presence of various concentrations of geniposide and genipin for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an MTT assay.

200 180

LDH leakage (% of control)

100

160 140 120 100 80 60 40 20

0 NA

500 uM

200 uM

100 uM

50 uM

geniposide

20 uM

2 uM

0 NA

500 uM

200 uM

100 uM

50 uM

20 uM

2 uM

genipin

Figure 29. Effect of geniposide and genipin in hepatoma cells. The cells were cultured in the presence of various concentrations of geniposide and genipin for 24 h. Cell viability were estimated by LDH realase assay.

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1-1세부과제

69/ 69/144

Baicalin, puerarin, methyl-paraben 및 장내미생물에 의해 가수 분해된 baicalein, daidzein, benzoic acid의 세포 독성에 대한 영향을 조사하기 위하 여 간 세포주에 baicalin 및 baicalein의 농도를 선정하여 24시간 동안 처리한 후 MTT 및

LDH 방법을 이용하여 세포 독성을 조사하였음. 위 연구 결과 고

농도 baicalin, methyl-paraben에서 독성을 나타났으며, baicalein, benzoic acid의 경우 원 물질의 독성 보다 세포 독성이 적음을 확인하였음 (Figure. 30, 32).

또한, puerarin 자체는 독성을 나타내지 않았으나 장내미생물에 의해 가수 분해된 daidzein의 경우 200 μM 이상의 농도에서 세포 독성이 증가됨을 확 인하였음 (Figure. 31).

Baicalin Bacialein

Cell viability (% of control)

120

100

0 NA

1mM

500uM

200uM

100uM

50uM

20uM

1000

Baicalin Bacialein

LDH leakage (% of control)

900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 NA

1mM

500uM

200uM

100uM

50uM

20uM

Figure 30. Effect of baicalin and baicalein in hepatoma cells. The cells were cultured in the presence of various concentrations of baicalin and

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1-1세부과제

70/ 70/144

baicalein for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an MTT assay and LDH realase assay.

Puerain Daidzein

Cell viability (% of control)

120

100

0 NA

1mM

500uM

200uM

100uM

20uM

Puerain Daidzein

140

LDH leakage (% of control)

50uM

120 100 80 60 40 20 0 NA

1mM

500uM

200uM

100uM

50uM

20uM

Figure 31. Effect of puerarin and daidzein in hepatoma cells. The cells were cultured in the presence of various concentrations of puerarin and daidzein for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an MTT assay and

LDH realase assay.

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1-1세부과제

71/ 71/144

Methyl-paraben benzoic acid

Cell viability (% of control)

120

100

0 NA

4mM

2mM

1mM

500uM

LDH leakage (% of control)

250

200uM

20uM

2uM

Methyl-paraben benzoic acid

200

150

100

0 NA

4mM

2mM

1mM

500uM

200uM

20uM

2uM

Figure 32. Effect of methylparaben and benzoic acid in hepatoma cells. The cells were cultured in the presence of various concentrations of methylparaben and benzoic acid for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an MTT assay and LDH realase assay.

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1-1세부과제

72/ 72/144

(2) 활성산소 영향 평가법 개발 장내 미생물 대사체 및 독성유도 물질에 의한 세포 손상의 주요 원인은 독 성물질의 대사체에 의한 세포내 ROS의 생성과 free radical (NO-, OH-, 2-

O )에 기인한다고 알려져 있음. 불포화 지방산이 풍부한 세포막은 생성된 free radical에 의해서 지질과산화의 표적이 되어 세포소기관들이 정상적인 구 조 및 기능을 잃게 되며, 국소적인 손상은 물론 알데하이드와 같은 지질과산화 분해산물이 생성부위에서 멀리 떨어진 부위로 이동하여 세포손상을 일으키게 됨.

따라서 미생물 대사 독성 물질의 독성 유발이 ROS에 의해서 세포독성을 유 발하는지 알아보기 위하여 미생물 대사 독성 물질을 처리하여 ROS 생성능을 조사하였음.

Arbutin, geniposide 및

장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된

hydroquinone, genipin의 ROS에 의한 세포독성에 대한 영향을 조사하기 위하 여 간 세포주에 각각의 농도를 선정하여 2시간 동안 처리한 후 ROS 생성능 조사 방법을 이용하여 세포 독성을 조사하였음. 위 연구 결과 arbutin, geniposide

자체는

ROS

생성을

유발하지

않았으나

장내미생물(β

-glucosidase)에 의해 가수분해된 hydroquinone, genipin의 경우 100 μM 이상 농도에서 ROS 생성이 농도 의존적으로 증가됨을 확인하였음 (Figure. 33, 34).

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1-1세부과제

1.4

1.2

DCF fluorescnce (Fold of control)

73/ 73/144

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 NA

10mM

5mM

1mM

100uM

10uM

1uM

10mM

arbutin

5mM

1mM

100uM

10uM

1uM

Hydroquinone

Figure 33. Effect of arbutin and hydroquinone on the intracellular ROS formation. After the medium was removed, HepG2 cells were exposed to arbutin and hydroquinone for 2 h and fluorescence was then measured using fluorescence spectrophotometer.

2.5

1.2

DCF fluorescnce (Fold of control)

1.4

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 NA

500 uM

200 uM

100 uM

50 uM

20 uM

0.0 NA

geniposide

500 uM

200 uM

100 uM

50 uM

20 uM

genipin

Figure 34. Effect of geniposide and genipin on the intracellular ROS formation. After the medium was removed, HepG2 cells were exposed to geniposide and genipin for 2 h and fluorescence was then measured using fluorescence spectrophotometer.

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1-1세부과제

74/ 74/144

(3) 세포사멸(apoptosis) 평가법 개발 본 연구에서는 미생물 대사 독성물질이 세포사멸에 미치는 영향을 평가를 하기 위하여 인체 세포주에서 세포사멸 유전자(Bax)와 세포사멸 억제 유전자 (Bcl-2, BCl-XL)의 발현, caspase-3 활성, APOPercentage 방법을 활용하 여 미생물 대사 독성 물질에 의한 세포 사멸에 대한 독성 평가법을 제시하고자 하였음. 세포사멸 과정에서 실행경로의 활성화 과정에서 관여하는 caspase-3는 세 포사멸시 활성화 정도를 측정하여 세포사멸 정도를 파악할 수 있음. 따라서 arbutin,

geniposide

및

장내미생물(β-glucosidase)에

의해

가수분해된

hydroquinone, genipin이 caspase-3 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 간세포주에 arbutin 및 hydroquinone의 농도를 선정하여 24시간 동안 처리한 후 caspase-3 활성을 조사하였음. 위 연구 결과 arbutin, geniposide자체는 caspase-3 활성의 변화를 나타내지 않았으나, 장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된 hydroquinone, genipin의 경우 100 μM 이상 농도에서 caspase-3 활성이 농도 의존적으로 증가됨을 확인하였음 (Figure. 35, 36).

a rb u tin h yd ro q u in o n e

0 .8

0 .6

(FU/mg protein)

DEVD-pNA cleavage

0 .7

0 .5 0 .4 0 .3 0 .2 0 .1 0 .0 NA

10m M

1m M

100uM

1uM

Figure 35. Activation of caspase-3 by arbutin and hydroquinone in HepG2 cells. Cells were pretreated with z-DEVD-fmk for 1 hr, and then exposed to arbutin and hydroquinone for additional 24 h. The catalytic activities of caspase-3 in cell lysates were assayed using the specific substrate DEVD-pNA.

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1-1세부과제

75/ 75/144

0.3

DEVD-pNA cleavage (FU/mg protein)

geniposide genipin

0.2

0.1

0.0

500uM

200uM

100uM

50uM

Figure 36. Activation of caspase-3 by geniposide and genipin in HepG2 cells. Cells were pretreated with z-DEVD-fmk for 1 hr, and then exposed to geniposide and genipin for additional 24 h. The catalytic activities of caspase-3 in cell lysates were assayed using the specific substrate DEVD-pNA.

Arbutin, geniposide 및 장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된 hydroquinone, genipin이 세포사멸을 조절하는 Bax 및 Bcl-2에 미치는 영향 을 관찰하기 위하여, 간세포주에 arbutin 및 hydroquinone의 농도를 선정하여 24시간 동안 처리한 후 RT-PCR 방법을 활용하여 세포사멸 관련 유전자인 Bax 및 Bcl-2의 발현을 조사하였음. 그 결과, 가수분해된 hydroquinone, genipin의 경우 apoptotic effect로 잘 알려져 있는 Bax의 발현을 증가시켰으 며, anti-apoptotic effect로 잘 알려져 있는 Bcl-2의 발현을 농도 의존적으 로 억제시켰다. 그러나 대사전의 전구물질인 arbutin, geniposide은 Bax 및 Bcl-2의 유전자 발현에는 영향을 주지 않았음(Figure. 37).

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1-1세부과제

76/ 76/144

Figure 37. Effects of arbutin and hydroquinone on the expression of Bcl-2 family proteins: RT-PCR analysis of Bcl-2 family proteins in HepG2 cells. After 24 hr of incubation, the total RNA was prepared and real-time PCR was performed. GAPDH was used as a loading control.

Figure 38. Effect of geniposide and genipin on the expression of Bcl-2 family proteins: RT-PCR analysis of Bcl-2 family proteins in HepG2 cells. After 24 hr of incubation, the total RNA was prepared and real-time PCR was performed. GAPDH was used as a loading control.

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1-1세부과제

77/ 77/144

세포사멸이 유도되면 세포막의 유동성이 파괴되는 성질을 응용하여, 유동성 이 파괴되면 세포막을 침투하는 dye를 처리하고 세포사멸 정도를 형광 현미경 을 이용하여 측정하였음. 대사전 물질과 장내미생물에 의한 대사체(arbutin, geniposide, genipin)가

hydroquinone 및

세포사멸에 미치는 영향을 비교 평가하였음. 인체 간

세포주를 활용하여 조사한 결과, 대사전 물질인 arbutin 및 geniposide 자체는 세포사멸을 유도하지 않았으며, 장내미생물에 의해 대사된 hydroquinone 및 genipin의 경우 100 μM 이상 농도에서 세포 사멸이 농도 의존적으로 증가됨 을 확인하였음 (Figure. 39-40).

Figure

39.

Effect

arbutin

and

hydroquinone

apoptosis

hepatoma cells. The cells were cultured in the presence of various concentrations

arbutin

and

hydroquinone

for

After

the

treatment, APOPercentage assays were performed according to the manufacturer's instruction.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

78/ 78/144

Figure 40. Effect of geniposide and genipin on apoptosis in hepatoma cells.

The

cells

were

cultured

the

presence

various

concentrations of geniposide and genipin for 24 h. After the treatment, APOPercentage assays were performed according to the manufacturer's instruction.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

79/ 79/144

(4) 장내미생물 배양을 이용한 독성물질 대사체 독성평가 실제 장내미생물 배양 시 독성물질을 처리한 다음, 독성변화를 살펴보기 위 하여 본 연구를 통하여 확립된 MTT 시험법으로 간세포주에서 arbutin에 의한 세포독성 시험을 실시하였음. 그 결과 장내미생물 배양액인 CM 및 BL 배지에 arbutin을 처리한 경우 간세포주에서 세포독성이 유발되지 않았으나, HY8001 균주와 Youn 균주와 배양한 경우 세포독성이 강하게 나타났으며, 이는 두 균 주가 arbutin을 세포독성을 유발하는 대사체로 대사를 시켰음을 의미하는 결과 로 판단되었음(Figure. 41).

Cell viability (% of control)

140 120 100 80 60

NA Arbutin -3mM Arbutin -1.5mM Arbutin -1mM

160

Cell viability (% of control)

NA Arbutin -3mM Arbutin -1.5mM Arbutin -1mM

160

140 120 100 80 60

20 0

0 BL medium

BL medium+Bif. Longum HY81

Cell viability (% of control)

160

BL medium

BL medium+Bif. Longum HY82

NA Arbutin -3mM Arbutin -1.5mM Arbutin -1mM

140 120 100 80 60 40 20 0 CM medium

CM medium+Bac. fragilis

Figure 41. Effect of arbutin in hepatoma cells. The cells were cultured in the presence of various conditions of arbutin for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an MTT assay.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

80/ 80/144

한편, geniposide를 장내미생물과 배양한 실험에서도 arbutin의 경우와 마 찬가지로 CM 배지 및 BL 배지에 arbutin을 처리한 경우 간세포주에서 세포독 성이 유발되지 않았으나, HY8001 균주와 Youn 균주와 배양한 경우 세포독성 이 강하게 나타났으며, 이는 두 균주가 geniposide를 세포독성을 유발하는 대 사체로 대사를 시켰음을 의미하는 결과로 판단되었음(Figure. 42).

NA Geniposide -150uM Geniposide -100uM Geniposide -50uM

160

Cell viability (% of control)

160 140 120 100 80 60

140 120 100 80 60

NA Geniposide -150uM Geniposide -100uM Geniposide -50uM

BL medium

BL medium+Bif. Longum HY81

BL medium+Bif. Longum HY82

NA Arbutin -3mM Arbutin -1.5mM Arbutin -1mM

160

Cell viability (% of control)

BL medium

140 120 100 80 60 40 20 0 BL medium

BL medium+Bif. Longum HY82

Figure 42. Effect of geniposide in hepatoma cells. The cells were cultured in the presence of various conditions of geniposide for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an MTT assay.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

81/ 81/144

Sudan III를 장내미생물과 배양한 실험에서는 앞의 두 물질과는 다른 양상 을 보였음. 즉, CM 배지와 BL 배지와 Sudan III 만을 배양한 대조군의 경우 농도 의존적으로 독성을 띠는 양상을 보였고, HY8001 군주와 Youn 균주를 이용한 경우는 별 차이가 없었고, Bacteroides와 배양한 경우 Sudan III의 독 성이 오히려 경감되는 결과를 얻었음. 이는 앞의 arbutin 및 geniposide와는 달리 Sudan III는 그 자체가 독성이 있고, 대사체는 오히려 독성이 적을 가능 성을 시사하는 결과로 추후 좀더 다양한 연구 및 대사체 생성 양상에 대한 비 교가 필요할 것으로 판단되었음(Figure. 43).

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

82/ 82/144

Cell viability (% of control)

140

NA Sudan-10mM Sudan-5mM Sudan-2.5mM Sudan-0.5mM

160 140

Cell viability (% of control)

160

120 100 80 60 40

NA Sudan-10mM Sudan-5mM Sudan-2.5mM Sudan-0.5mM

120 100 80 60 40 20

20 0

BL medium

BL medium+Bif. Longum HY81

Cell viability (% of control)

160

BL medium

BL medium+Bif. Longum HY82

NA Sudan-10mM Sudan-5mM Sudan-2.5mM Sudan-0.5mM

140 120 100 80 60 40 20 0 CM medium

CM medium+Bac. fragilis

Figure 43. Effect of Sudan III in hepatoma cells. The cells were cultured in the presence of various conditions of Sudan III for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an MTT assay.

Amaranth의 경우 Bacteroides와 배양하였을 때 가장 독성을 현저하게 유 발하였으며, HY8001의 경우 최고 농도에서만 세포독성을 나타냈고, Youn 균 주의 경우 영향을 나타내지 않았음. 이는 장내미생물총의 대사능은 동일하지 않고 물질에 따라 대사능에 차이를 보이는 것으로 판단되었음(Figure. 44).

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

83/ 83/144

NA Amaranth-20mM Amaranth-10mM Amaranth-5mM Amaranth-1mM

140

120

Cell viability (% of control)

120

100

NA Amaranth-20mM Amaranth-10mM Amaranth-5mM Amaranth-1mM

140

100

0 CM medium

CM medium+Bac. fragilis

BL medium+Bif. Longum HY81

NA Amaranth-20mM Amaranth-10mM Amaranth-5mM Amaranth-1mM

140

120

Cell viability (% of control)

BL medium

100

0 BL medium

BL medium+Bif. Longum HY82

Figure 44. Effect of amaranth in hepatoma cells. The cells were cultured in the presence of various conditions of amaranth for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an MTT assay.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

84/ 84/144

2) 2차년도 연구 내용 및 결과 (1) 장내세균 효소복합체를 이용한 유전독성 평가기술 개발 유전자 손상 복구 유전자는 세포 내에 항상 일정한 수준을 유지하지만 유전 자 손상이 심한 경우 복구 단백질만으로는 손상을 정상화하기가 어려워 유전자 손상 감시 체계에 의한 유전자 복구 단백질들의 발현 증가가 요구됨.

본

연구에서는

유전

독성과

관련된

p53,

8-oxoguanine

glycosylase(OGG1) 유전자 발현 분석을 통하여 장내미생물에 의해 생성되는 독성 대사체의 유전 독성 연구를 수행하였음.

Arbutin

및

장내미생물(β-glucosidase)에

의해

가수분해된

hydroquinone의 p53, OGG1 유전자 발현에 대한 영향을 관찰하기 위하여, 간 세포주에 arbutin 및 hydroquinone의 농도를 선정하여 24시간 동안 처리한 후 RT-PCR 및 realtime-PCR 방법을 활용하여 p53 및 OGG1의 유전자 발 현을 조사하였음. 위 결과, arbutin 및 hydroquinone은 유전자 손상 복구 단백 질인 p53 유전자 발현이 증가하였음 (Figure 1). 그러나 OGG1의 경우 가수 분해된 hydroquinone에 의해서 발현이 증가하였으나 대사전의 전구물질인 arbutin은 OGG1의 유전자 발현에는 영향이 없었음 (Figure 2). 또한 arbutin 및 hydroquinone을 처리하고 transfection을 수행하여 p53의 전사인자의 활 성을 조사한 결과 p53 유전자 발현과 유사한 결과를 확인하였음 (Figure 3).

Arbutin

및

장내미생물(β-glucosidase)에

의해

가수분해된

hydroquinone의 ROS에 대한 영향을 조사한 결과 arbutin 자체는 ROS 생성 을 유발하지 않았으나 arbutin으로부터 생성되는 hydroquinone의 경우 ROS 생성이 증가됨을 확인하였음 (Figure 4).

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

85/ 85/144

P-53 GAPDH NA

100

Arbutin (uM)

P-53 GAPDH NA

100

Hydroquinone (uM)

Figure 1. Effect of arbutin and hydroquinone on the expression of p53. The cells were lysed and the total RNA was analyzed by RT-PCR in HepG2 cells. After 24 hr of incubation, the total RNA was prepared and PCR was performed. GAPDH was used as a loading control.

6 14

Relavive OGG1 gene expression

Relavive p53 gene expression

Arbutin Hydroquinone 5

Arbutin Hydroquinone

12 10 8 6 4 2 0

0 NA

1 uM

5 uM

10 uM

50 uM

100 uM

1 uM

5 uM

10 uM

50 uM

100 uM

Figure 2. Effect of arbutin and hydroquinone on the expression of p53 and OGG1. The cells were lysed and the total RNA was analyzed by RT-PCR in HepG2 cells. After 24 hr of incubation, the total RNA was prepared and real-time PCR was performed. GAPDH was used as a loading control.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

86/ 86/144

Relative p53 luciferase activity (Fold of control)

A rb u tin H yd ro q u ino n e

8 7 6 5 4 3 2 1 0 NA

1 uM

5 uM

10 uM

50 uM

100 uM

Figure 3. Effects of arbutin and hydroquinone on p53 luciferase activity in HepG2 cells. Cells were transiently co-transfected with pCMV-β-gal, p53 regulated luciferase reporter gene. After 4 h, cells were treated with the

1.4

1.2

DCF fluorescnce (Fold of control)

indicated concentrations of arbutin and hydroquinone for 24 h.

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 NA

10mM

5mM

1mM

100uM

10uM

1uM

10mM

arbutin

5mM

1mM

100uM

10uM

1uM

Hydroquinone

Figure 4. Effect of arbutin and hydroquinone on the intracellular ROS formation. After the medium was removed, HepG2 cells were exposed to arbutin and hydroquinone for 2 h and fluorescence was then measured using fluorescence spectrophotometer.

Arbutin은 그 화학구조가 비교적 단순하고, 이미 장내미생물에 의한 대사가 알려져 있었을 뿐 아니라 대사체인 hydroquinone의 분석도 비교적 용이할 것 으로 판단됨. 장내세균 효소복합체(fecalase)의 배양이 arbutin 대사에 어떤 영향을

미치는지

살펴보기

위하여

먼저

HPLC를

이용하여

arbutin

및

hydroquinone이 검출되는지 확인하였음.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

87/ 87/144

10 mM arbuin stock과 fecalase를 arbutin 50 ㎕, fecalase 150 ㎕ 의 1:3의 비율로 37℃ shaking incubator에 3 hr 반응 후 100 ㎕를 취해 MeOH 400 ㎕에 넣어 원심분리한 후 상층액 300 ㎕를 취해 분석 시료로 사용하였음. 그 결과, 장내세균 효소복합체에 배양한 arbutin의 HPLC 분석에서 Figure 5～7과 같이 크로마토그람 상에서 arbutin 및 hydroquinone 검출되었고, 동시 정량도 가능한 것으로 판단되었음.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

88/ 88/144

장내세균 효소복합체(fecalase)에 arbutin을 첨가하여 대사를 유도한 후 세 포 배양액에 처리한 후 p53 및 OGG1의 유전자 발현을 조사하였음. 위 결과, arbutin 및 hydroquinone은 유전자 손상 복구 단백질인 p53 유전자 발현이 증가하였으나 OGG1의 경우 가수분해된 hydroquinone에 의해서 발현이 증가 하였음 (Figure 8). 이는 산화적 스트레스 발생에 의해서 유전독성이 발생되며 이에 대한 보호 기전으로 OGG1의 유전자 발현이 증가함. 6

Relavive p53 gene expression

without Fecalase with Fecalase

0 NA

1 uM

50 uM

100 uM

Arbutin

Relavive OGG1 gene expression

without Fecalase with Fecalase

12 10 8 6 4 2 0 NA

1 uM

50 uM

100 uM

Arbutin

Figure 8. Effect of arbutin plus fecalase on the expression of p53 and OGG1. The cells were lysed and the total RNA was analyzed by RT-PCR in HepG2 cells. After 24 hr of incubation, the total RNA was prepared and real-time

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

89/ 89/144

PCR was performed. GAPDH was used as a loading control.

Geniposide 및 Geniposide의 장내미생물(β-glucosidase)에 의한 가수분 해 대사체인 genipin의 유전 독성에 대한 영향을 조사하기 위하여 p53 및 OGG1의 유전자 발현을 RT-PCR 및 realtime-PCR 방법을 활용하여

조사

하였음. 위 결과, 가수분해 대사체인 genipin처리에서 p53 및 OGG1 유전자 발현이 증가하였으나, 대사전의 전구물질인 geniposide는 p53, OGG1의 유전 자 발현에 영향을 주지 않았음 (Figure 9, 10). 또한 geniposide 및 genipin 을 처리하고 transfection을 수행하여 p53의 전사인자의 활성을 조사한 결과 p53 유전자 발현과 유사한 결과를 확인하였음 (Figure. 11). 또한, geniposide 및 장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된 genipin의 ROS에 대한 영향을 조사한 결과, geniposide자체는 ROS 생성을 유발하지 않았으나, 장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된 genipin 의 경우 ROS 생성이 증가됨을 확인하였음 (Figure 12). 장내세균 효소복합체(fecalase)에 geniposide을 첨가하여 대사를 유도한 후 세포 배양액에 처리한 후 p53 및 OGG1의 유전자 발현을 조사하였음. 위 결과, 유전자 손상 복구 단백질인 p53, OGG1의 유전자 발현이 증가하였음 (Figure 13, 14). 위 결과를 통하여 geniposide의 경우 장내미생물(β -glucosidase)에 의해 가수분해된 genipin에서 유전독성관련 유전자 발현이 증가되었음. P-53 GAPDH NA

125

Geniposide (uM)

P-53 GAPDH NA

125

Genipin (uM)

Figure 9. Effect of geniposide and genipin on the expression of p53. The cells were lysed and the total RNA was analyzed by RT-PCR in HepG2 cells. After 24 hr of incubation, the total RNA was prepared and PCR was performed. GAPDH was used as a loading control.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

90/ 90/144

Geniposide Genipin

Relavive p53 gene expression

14 12 10 8 6 4 2 0 NA

1 uM

5 uM

10 uM

50 uM

100 uM

10 uM

50 uM

100 uM

Relavive OGG1 gene expression

4.0

Geniposide Genipin

3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 NA

1 uM

5 uM

Figure 10. Effect of geniposide and genipin on the expression of p53 and OGG1. The cells were lysed and the total RNA was analyzed by RT-PCR in HepG2 cells. After 24 hr of incubation, the total RNA was prepared and real-time PCR was performed. GAPDH was used as a loading control.

G eniposide G enipin

Relative p53 luciferase activity (Fold of control)

14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 NA

1 uM

5 uM

10 uM

Figure 11. Effects of geniposide and genipin

50 uM

100 uM

on p53 luciferase activity in

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

91/ 91/144

HepG2 cells. Cells were transiently co-transfected with pCMV-β-gal, p53 regulated luciferase reporter gene. After 4 h, cells were treated with the indicated concentrations of geniposide and genipin for 24 h. 2.5

1.2

DCF fluorescnce (Fold of control)

1.4

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 NA

500 uM

200 uM

100 uM

50 uM

0.0

20 uM

500 uM

geniposide

Figure

12.

Effect

geniposide

200 uM

100 uM

50 uM

20 uM

genipin

and

genipin

the

intracellular

ROS

formation. After the medium was removed, HepG2 cells were exposed to geniposide and genipin for 2 h and fluorescence was then measured using fluorescence spectrophotometer.

Figure 13. Effect of geniposide plus fecalase on the expression of p53. The cells were lysed and the total RNA was analyzed by RT-PCR in HepG2 cells. After 24 hr of incubation, the total RNA was prepared and PCR was performed. GAPDH was used as a loading control.

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1-1세부과제

92/ 92/144

Relavive p53 gene expression

without Fecalase with Fecalase

0 NA

1 uM

50 uM

100 uM

Geniposide

Relavive OGG1 gene expression

without Fecalase with Fecalase 3

0 NA

1 uM

50 uM

100 uM

Geniposide

Figure 14. Effect of geniposide plus fecalase on the expression of p53 and OGG1. The cells were lysed and the total RNA was analyzed by RT-PCR in HepG2 cells. After 24 hr of incubation, the total RNA was prepared and real-time PCR was performed. GAPDH was used as a loading control.

Baicalin과 puerarin 및 장내미생물에 의한 가수 분해 대사체인 baicalein과 daidzein 각각에 대하여 유전 독성 영향을 조사하기 위하여, 간 세포주에 baicalin 및 baicalein의 농도를 선정하여 24시간 동안 처리한 후 real time-PCR 방법을 활용하여 유전독성 관련 유전자 p53, OGG1의 유전자 발현 을 조사한 결과, baicalin 및 가수분해된 baicalein의 경우 p53, OGG1의 발현 에 대한 영향이 없었음 (Figure 15).

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1-1세부과제

93/ 93/144

Puerarin에 의해 가수분해된 daidzein에서 p53, OGG1의 유전자 발현이 증 가하였으나 대사 전의 전구물질인 puerarin은 p53, OGG1의 유전자 발현에는 영향이 없었음 (Figure. 17). Baicalin, puerarin 및 baicalein, daidzein을 처 리하고 transfection을 수행하여 p53의 전사인자의 활성을 조사한 결과 p53 유전자 발현과 유사한 결과를 확인하였음 (igure 16, 18).

Relavive p53 gene expression

2.0

Baicalin Bacialein

1.5

1.0

0.5

0.0 NA

Relavive OGG1 gene expression

1.5

1 uM

50 uM

100 uM

Baicalin Bacialein

1.0

0.5

0.0 NA

1 uM

50 uM

100 uM

Figure 15. Effect of baicalin and bacialein on the expression of p53 and OGG1. The cells were lysed and the total RNA was analyzed by RT-PCR in HepG2 cells. After 24 hr of incubation, the total RNA was prepared and real-time PCR was performed. GAPDH was used as a loading control.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

94/ 94/144

Relative p53 luciferase activity (Fold of control)

2.0

Baicalin Bacialein

1.5

1.0

0.5

0.0 NA

1 uM

50 uM

100 uM

Figure 16. Effects of baicalin and bacialein on p53 luciferase activity in HepG2 cells. Cells were transiently co-transfected with pCMV-β-gal, p53 regulated luciferase reporter gene. After 4 h, cells were treated with the indicated concentrations of baicalin and bacialein for 24 h. 4.0

Relavive p53 gene expression

3.5

Puerarin Daidzein

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 NA

10 uM

100 uM

500 uM

Relavive OGG1 gene expression

3.0

Puerarin Daidzein

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 NA

10 uM

100 uM

500 uM

Figure 17. Effect of puerarin and daidzein on the expression of p53 and OGG1. The cells were lysed and the total RNA was analyzed by RT-PCR in HepG2 cells. After 24 hr of incubation, the total RNA was prepared and real-time PCR was performed. GAPDH was used as a loading control.

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1-1세부과제

95/ 95/144

Relative p53 luciferase activity (Fold of control)

Puerarin Daidzein 4

0 NA

10 uM

100 uM

500 uM

Figure 18. Effects of puerarin and daidzein on p53 luciferase activity in HepG2 cells. Cells were transiently co-transfected with pCMV-β-gal, p53 regulated luciferase reporter gene. After 4 h, cells were treated with the indicated concentrations of puerarin and daidzein for 24 h.

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1-1세부과제

96/ 96/144

(2) 장내세균 효소복합체를 이용한 전사조절인자 영향 평가기술 개발 본 연구에서는 장내미생물에 의한 독성대사체의 면역독성에 대한 영향을 조 사하기 위하여 인체세포 주에서 장내미생물에 의한 독성대사체의 COX-2 유전 자발현 및 COX-2 유전자 발현에 중요한 역할을 하는 전사조절인자 (NF-κ B,

AP-1)의

역할을

RT-PCR,

reporter

assay를

통하여

조사하였음.

COX-2 유전자의 발현은 NF-κB, AP-1 전사인자의 활성에 의하여 조절된 다고 알려져 있음. COX-2 유전자의 발현에 중요한 역할을 하는 전사조절인자 (NF-κB, AP-1)의 역할을 규명하기 위하여 전사조절인자 3 copy reporter gene을 제작하였음.

Geniposide 및 장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된 genipin의 면역 독성에 대한 영향을 조사하기 위하여 COX-2 유전자 발현을 RT-PCR 방법을 활용하여 COX-2의 유전자 발현을 조사하였음. 위 결과, COX-2 유전 자 발현은 가수분해된 genipin에서 유전자 발현이 증가하였으나 대사 전의 전 구물질인 geniposide는 COX-2의 유전자 발현에 영향이 나타나지 않았음 (Figure 19) 또한 geniposide 및 genipin을 처리하고 transfection을 수행하 여 COX-2 promoter의 활성을 조사한 결과 COX-2 유전자 발현과 유사한 결과를 확인하였음 (Figure 20).

Geniposide 및 genipin을 처리하고 COX-2 유전자 발현의 주요 전사조절 인자인 사한

NF-κB, AP-1를 transfection을 수행하여 위 전사인자의 활성을 조 결과 genipin에서 NF-κB, AP-1의

활성이 증가됨을

확인하였음

(Figure 21).

장내세균 효소복합체(fecalase)에 geniposide을 첨가하여 대사를 유도한 후 세포 배양액에 처리한 후 COX-2 promoter 및 전사조절인자 (NF-κB, AP-1)의 활성을 조사하였음. 위 결과, COX-2 promoter 및 전사조절인자 (NF-κB, AP-1)의 활성이 모두 증가하였음 (Figure 22, 23). 위 결과를 통 하여 geniposide의 경우

장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된

genipin은 NF-κB, AP-1의 전사 조절인자의 활성화를 통하여 COX-2 발현

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

97/ 97/144

을 증가시키는 것으로 판단되었음.

Figure 19. Effect of geniposide and genipin on the expression of COX-2. The cells were lysed and the total RNA was analyzed by RT-PCR in Raw 264.7 cells. After 24 hr of incubation, the total RNA was prepared and PCR was performed. GAPDH was used as a loading control.

Relative COX-2 luciferase activity (Fold of control)

Geniposide Genipin 3

0 NA

10 uM

50 uM

100 uM

Figure 20. Effects of geniposide and genipin on COX-2 luciferase activity in Raw 264.7 cells. Cells were transiently co-transfected with pCMV-β-gal, COX-2 luciferase reporter gene. After 4 h, cells were treated with the indicated concentrations of geniposide and genipin for 24 h.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

98/ 98/144

Relative NF-kB luciferase activity (Fold of control)

Geniposide Genipin

0 NA

10 uM

50 uM

100 uM

50 uM

100 uM

Relative AP-1 luciferase activity (Fold of control)

Geniposide Genipin 4

0 NA

10 uM

Figure 21. Effects of geniposide and genipin on NF-kB and AP-1 luciferase activity in

Raw 264.7 cells. Cells were transiently co-transfected with

pCMV-β-gal, NF-kB and AP-1 luciferase reporter gene. After 4 h, cells were treated with the indicated concentrations of geniposide and genipin for 24 h.

Relative COX-2 luciferase activity (Fold of control)

without Fecalase with Fecalase 3

0 NA

10 uM

50 uM

100 uM

Geniposide

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

99/ 99/144

Figure 22. Effects of geniposide plus fecalase on COX-2 luciferase activity in Raw 264.7 cells. Cells were transiently co-transfected with pCMV-β-gal, COX-2 luciferase reporter gene. After 4 h, cells were treated with the indicated concentrations of geniposide plus fecalase for 24 h. Each bar shows the mean±S.D. of three independent experiments, performed in triplicate.

Relative NF-kB luciferase activity (Fold of control)

without Fecalase with Fecalase 2

0 NA

10 uM

50 uM

100 uM

Geniposide

Relative AP-1 luciferase activity (Fold of control)

without Fecalase with Fecalase

0 NA

10 uM

50 uM

100 uM

Geniposide

Figure 23. Effects of geniposide plus fecalase on NF-kB and AP-1 luciferase activity in Raw 264.7 cells. Cells were transiently co-transfected with pCMVβ-gal, NF-kB and AP-1 luciferase reporter gene. After 4 h, cells were treated with the indicated concentrations of geniposide plus fecalase for 24 h. Each bar shows the mean±S.D. of three independent experiments, performed in triplicate.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

100/ 100/144

Baicalin 및 장내미생물에 의해 가수 분해된 baicalein의 면역 독성에 대한 영향을 조사하기 위하여 baicalin 및 baicalein의 농도를 선정하여 24시간 동안 처리한 후 RT-PCR 방법을 활용하여 면역독성 관련 유전자 COX-2 유전자 발현 및 주요 전사 조절 인자의 활성을 조사한 결과 baicalin 및 가수분해된 baicalein의 경우 COX-2 유전자 발현 및 주요 전사 조절 인자의 활성에 대한 영향이 없었음 (Figure 24-26).

Figure 24. Effect of baicalin and bacialein on the expression of COX-2. The cells were lysed and the total RNA was analyzed by RT-PCR in Raw 264.7 cells. After 24 hr of incubation, the total RNA was prepared and PCR was performed. GAPDH was used as a loading control.

Relative COX-2 luciferase activity (Fold of control)

1.5

Bicalin Bicalein

1.0

0.5

0.0 NA

1 uM

50 uM

100 uM

Figure 25. Effects of baicalin and bacialein on COX-2 luciferase activity in Raw 264.7 cells. Cells were transiently co-transfected with pCMV-β-gal, COX-2 luciferase reporter gene. After 4 h, cells were treated with the indicated concentrations of baicalin and bacialein for 24 h.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

101/ 101/144

Bicalin Bicalein

1.5

Bicalin Bicalein

1.0

0.5

0.0

Relative AP-1 luciferase activity (Fold of control)

Relative NF-kB luciferase activity (Fold of control)

1.5

1.0

0.5

0.0 NA

1 uM

50 uM

100 uM

1 uM

50 uM

100 uM

Figure 26. Effects of baicalin and bacialein on NF-kB and AP-1 luciferase activity in Raw 264.7 cells. Cells were transiently co-transfected with pCMVβ-gal, NF-kB and AP-1 luciferase reporter gene. After 4 h, cells were treated with the indicated concentrations of baicalin and bacialein for 24 h.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

102/ 102/144

3) 3차년도 연구 내용 및 결과 (1) 장내세균 효소복합체를 이용한 세포사멸 평가기술 개발 장내세균 효소복합체(fecalase)에 원물질을 첨가하여 대사를 유도한 후 세 포생존율과 apoptosis 등의 독성지표를 장내세균 효소복합체를 배양하지 않은 대조군과 비교하여 장내미생물에 의한 대사가 독성발현에 미치는 영향을 규명 하였음. 1-2차년도 연구를 통하여 확립된 세포 독성 및 세포사멸 시험법을 보 완하여 장내세균 효소복합체에 반응된 arbutin의 세포독성에 대한 연구를 수행 하였음.

3차년도 연구에서는 미생물 대사로 생성되는 독성물질이 세포사멸에 미치는 영향을 평가를 하기 위하여 인체 세포주에서 세포사멸 유전자(Bax)와 세포사 멸 억제 유전자(Bcl-2, BCl-XL)의 발현, caspase-3 활성, ROS 생성능, TUNEL 방법을 활용하여 대사 전 물질과 장내세균 효소복합체에 의한 대사체 (arbutin→hydroquinone)가 세포사멸에 미치는 영향을 규명하여 세포 사멸에 대한 독성 평가법을 제시하고자 하였음.

시험 결과 arbutin, hydroquinone 및 장내세균 효소복합체(fecalase)에 의 해 대사된 arbutin 혼합시료를 처리한 경우 arbutin에 의해서는 세포독성이 유 발되지 않았으나 장내미생물(β-glucosidase)의 대사체 hydroquinone 및 장 내세균 효소복합체(fecalase)에 의해 대사된 arbutin 혼합시료를 처리한 경우 세포사멸이 증가하였음 (Figure 1).

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

103/ 103/144

Figure 1. Effects of arbutin and hydroquinone on apoptosis in hepatoma cells. TUNEL assays were performed according to the manufacturer’s instructions. Apoptotic cells were visualized under a fluorescent microscope.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

104/ 104/144

장내세균 효소복합체(fecalase)에 반응된 arbutin이 세포사멸을 조절하는 Bax 및 Bcl-2에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, 장내세균 효소복합체 (fecalase)에 반응된 arbutin을 24시간 동안 처리한 후 RT-PCR 및 western blot 방법을 활용하여 세포사멸 관련 유전자인 Bax 및 Bcl-2의 발현을 조사 한 결과 장내세균 효소복합체(fecalase)에 반응된 arbutin은 apoptotic effect 로

잘

알려져

있는

Bax의

유전자

및

단백질

발현을

증가시켰으며,

anti-apoptotic effect로 잘 알려져 있는 Bcl-2의 유전자 및 단백질 발현을 농도 의존적으로 억제시켰음 (Figure 2, 3).

Figure 2. Effect of arbutin plus fecalase on Bcl-2 and Bax expression. Total RNAs

were

isolated

from

arbutin

plus

fecalase

treated

cells

and

the

expression of Bcl-2 and Bax were measured by real time-PCR.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

105/ 105/144

Figure 3. Effect of arbutin metabolism by fecalase on Bcl-2 family and caspase-3 activity in HepG2 cells. Western blotting analyses of Bax, Bcl-2 and cleaved-caspase-3 family proteins in HepG2 cells.

장내세균

효소복합체(fecalase)에

의해

반응된

arbutin

혼합시료의

caspase-3 활성 및 ROS 생성능에 대한 영향을 조사하기 위하여, 장내세균 효소복합체(fecalase)로 대사시킨 arbutin 혼합시료를 24시간 동안 처리한 후 caspase-3 활성 및 ROS 생성능의 변화를 조사한 결과 장내세균 효소복합체 (fecalase)에 반응된 arbutin에 의해서 caspase-3 활성 및 ROS 생성능이 농 도 의존적으로 증가됨 (Figure 4, 5). 또한, NAC (N-acetyl cysteine)과 같 은 항산화제를 전 처리한 결과 장내세균 효소복합체(fecalase)에 반응된 arbutin에 증가된 ROS 생성능이 억제되었음.

Figure 4. Effect of arbutin metabolism on catalytic activity of caspase-3. The catalytic activities of caspase-3 in cell lysates were assayed using the specific substrate DEVD-pNA.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

106/ 106/144

Figure

Effect

arbutin

metabolism

fecalase

intracellular

ROS

formation. Cells were seeded in 48-well plates, cultured for 24 h, and then treated with arbutin, HQ or pre-activated arbutin by intestinal microflora for 20 h. Following the incubation, cells were treated with H2DCFDA for 30 min.

장내세균 효소복합체(fecalase)에 반응된 arbutin의 세포 사멸 기전을 규명 하기 위하여 NAC (N-acetyl cysteine)와 같은 항산화제를 전 처리하여 장내 세균 효소복합체(fecalase)에 의해 대사된 arbutin 혼합시료의 세포 독성 및 세포 사멸에 대한 영향을 조사한 결과 장내세균 효소복합체(fecalase)에 의해 대사된 arbutin 혼합시료에 증가된 세포 독성 및 세포 사멸이 NAC에 의해서 억제됨을 확인하였음 . 위와 같은 결과를 통하여 장내세균 효소복합체(fecalase)에 반응된 arbutin 은

장내세균

효소복합체가

arbutin을

세포독성을

유발하는

대사체

hydroquinone으로 전환시켜 활성산소를 증가시킴으로서 세포 사멸을 유도함을 확인하였음 (Figure 6, 7).

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

107/ 107/144

Figure 6. Effect of arbutin metabolism by fecalase on Cytotoxicity. To examine the protective effect of NAC on HQ or pre-activated-induced toxicity, cells werepretreated with 1 mM NAC 1 h prior to HQ and pre-activated arbutin treatment.

Figure 7. Effect of arbutin metabolism by fecalase on apoptosis in hepatoma cells. TUNEL assays were performed according to the manufacturer’s instructions. Apoptotic cells were visualized under a fluorescent microscope.

Geniposide, genipin 및 장내세균 효소복합체(fecalase)에 의해 대사된 geniposide 혼합시료를 처리하여 세포 독성을 조사한 결과 geniposide에 의해 서는 세포독성이 유발되지 않았으나 장내미생물(β-glucosidase)의 대사체 genipin 및 장내세균 효소복합체(fecalase)에 의해 대사된 geniposide 혼합시 료를 처리한 경우 세포사멸이 증가하였음 (Figure 8).

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

108/ 108/144

Figure 8. Effects of geniposide and genipin on apoptosis in hepatoma cells. TUNEL assays were performed according to the manufacturer’s instructions. Apoptotic cells were visualized under a fluorescent microscope.

장내세균 효소복합체(fecalase)에 반응된 geniposide이 세포사멸을 조절하 는 Bax 및 Bcl-2에 미치는 영향을 조사한 결과 장내세균 효소복합체 (fecalase)에 반응된 geniposide는 apoptotic effect로 잘 알려져 있는 Bax의 유전자 및 단백질 발현을 증가시켰으며, anti-apoptotic effect로 잘 알려져 있는 Bcl-2의 유전자 및 단백질 발현을 농도 의존적으로 억제시켰음 (Figure 9, 10). 장내세균 효소복합체(fecalase)에 의해 반응된 geniposide 혼합시료의 caspase-3 활성 및 ROS 생성능에 대한 영향을 조사한 결과 장내세균 효소복 합체(fecalase)에 반응된 geniposide에 의해서 caspase-3 활성 및 ROS 생성 능이 농도 의존적으로 증가됨 (Figure 11, 12). 또한, NAC (N-acetyl cysteine)과 같은 항산화제를 전 처리한 결과 장내세균 효소복합체(fecalase) 에 반응된 geniposide에 의해 증가된 ROS 생성능이 억제되었음.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

109/ 109/144

Figure 9. Effect of geniposide plus fecalase on Bcl-2 and Bax expression. Total RNAs were isolated from geniposide plus fecalase treated cells and the expression of Bcl-2 and Bax were measured by Real Time-PCR.

Figure 10. Effect of geniposide metabolism by fecalase on Bcl-2 family and caspase-3 activity in HepG2 cells. Western blotting analyses of Bax, Bcl-2 and cleaved-caspase-3 family proteins in HepG2 cells.

Figure 11. Effect of geniposide metabolism on catalytic activity of caspase-3.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

110/ 110/144

The catalytic activities of caspase-3 in cell lysates were assayed using the specific substrate DEVD-pNA.

Figure 12. Effect of geniposide metabolism by fecalase intracellular ROS formation. Cells were seeded in 48-well plates, cultured for 24 h, and then treated with geniposide, genipin or pre-activated geniposide by intestinal microflora for 20 h. Following the incubation, cells were treated with H2DCFDA for 30 min.

NAC (N-acetyl cysteine)와 같은 항산화제를 전 처리하여 장내세균 효소 복합체(fecalase)에 의해 대사된 geniposide 혼합시료의 세포 독성 및 세포 사멸에 대한 영향을 조사한 결과 장내세균 효소복합체(fecalase)에 대사된 geniposide 혼합시료에 증가된 세포 독성 및 세포 사멸이 NAC에 의해서 억제 됨을 확인하였음 (Figure 6, 7).

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

111/ 111/144

Figure 13. Effect of geniposide metabolism by fecalase on Cytotoxicity. To

examine

the

protective

effect

NAC

genipin

pre-activated-induced toxicity, cells werepretreated with 1 mM NAC 1 h prior to genipin and pre-activated geniposide treatment.

Figure 14. Effect of geniposide metabolism by fecalase on apoptosis in hepatoma

cells.

manufacturer’s

TUNEL

assays

instructions.

were

Apoptotic

performed cells

were

according visualized

to under

the a

fluorescent microscope.

장내세균 효소복합체(fecalase)에 반응된 geniposide의 상위 신호 체계를 규명하기 위하여 MAPK에 대한 영향을 조사한 결과 장내세균 효소복합체

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

112/ 112/144

(fecalase)에 반응된 geniposide는 MAPK 중 JNK의 인산화를 증가시킴. 또 한,

JNK의

억제제인

SP600125를

전

처리하여

장내세균

효소복합체

(fecalase)에 의해 대사된 geniposide 혼합시료의 세포 독성 및 세포 사멸에 대한

영향을

조사한

결과

장내세균

효소복합체(fecalase)에

대사된

geniposide 혼합시료에 증가된 세포 독성 및 세포 사멸이 SP600125에 의해 서 억제됨을 확인하였음.

위와

같은

결과를

통하여

장내세균

효소복합체(fecalase)에

반응된

geniposide는 장내세균 효소복합체가 geniposide를 세포독성을 유발하는 대사 체 genipin으로 전환시켜 MAPK중 JNK를 활성화시킴으로서 세포 사멸을 유 도함을 확인하였음 (Figure 16, 17).

Figure 15. Effects of activated geniposide on the JNK pathway. Western blotting analyses of p-JNK, p-ERK, and p-p38 proteins.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

113/ 113/144

Figure 16. Effect of geniposide metabolism by fecalase on Cytotoxicity. To examine

the

protective

effect

SP600125

genipin

pre-activated-induced toxicity, cells were pretreated with 1 mM SP600125 1 h prior to genipin and pre-activated geniposide treatment.

Figure 17. Effects of activated geniposide on the JNK pathway. TUNEL assays

were

performed

according

the

manufacturer’s

instructions.

Apoptotic cells were visualized under a fluorescent microscope.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

114/ 114/144

(2)

장내세균

효소복합체(fecalase)과

장내미생물

대사효소계(intestinal 대사효소계(intestinal

microbial enzyme mix)의 세포사멸 평가기술 개발 및 대사활성 비교 장내세균

효소복합체(fecalase)

및

장내미생물

대사효소계(intestinal

microbial enzyme mix)에 arbutin을 첨가하여 대사를 유도한 후, 세포생존율 과 apoptosis 등의 독성지표를 활용하여 장내세균 효소복합체(fecalase) 및 장 내미생물 대사효소계(intestinal microbial enzyme mix)의 대사활성을 비교 조사하였음.

장내세균 효소복합체 및장내미생물 대사효소계에 반응된 arbutin을 MTT, LDH assay 방법을 이용하여 세포 독성을 조사한 결과 장내세균 효소복합체 및 장내 약물대사효소계에 반응된 arbutin에 의해서 세포 독성이 증가하였으 며, 장내세균 효소복합체보다 장내 약물대사효소계에 반응된 arbutin의 세포 독성이

더

증가하였음

(Figure

18,

19).

또한,

세포사멸

정도를

APOPercentage kit를 사용하여 측정한 결과 위와 유사한 결과를 확인하였음 (Figure 20). 이는 Arbutin의 경우 장내 약물대사효소계가 장내세균 효소복합 체보다 독성 대사체 생성을 증가시켰을 것으로 사료됨.

Figure 18. Effect of cytotoxic activity of arbutin by intestinal microflora. The cells were cultured in the presence of various concentrations of arbutin for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an MTT assay.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

115/ 115/144

Figure 19. Effect of cytotoxic activity of arbutin by intestinal microflora. The cells were cultured in the presence of various concentrations of arbutin for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an LDH realase assay.

Figure 20. Effects of arbutin and its metabolites on apoptosis in HepG2 cells. The cells were cultured in the presence of various concentrations of arbutin and its metabolites for 24 h. After the treatment, APOPercentage assays were performed according to the manufacturer' sinstruction.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

116/ 116/144

장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 의해 대사된 arbutin이 세포사멸을 조절하는 Bax 및 Bcl-2에 대한 영향을 조사한 결과 apoptotic effector로 잘 알려져 있는 Bax의 유전자 및 단백질 발현을 증가시켰으며, anti-apoptotic effector로 잘 알려져 있는 Bcl-2의 유전자 및 단백질 발현을 억제시켰으며 장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 의해 대사된 arbutin의

caspase-3

활성

및

ROS

생성능의

변화를

조사한

결과

caspase-3 활성 및 ROS 생성능이 증가하였음 (Figure 21-23). 또한, 장내 미생물 대사효소계가 장내세균 효소복합체보다 일부 arbutin의 독성 대사체 생 성이 증가됨을 확인하였음.

Figure 21. Effect of arbutin plus fecalase and microbial enzyme mix on Bcl-2 and

Bax

metabolites

expression.

Total

RNAs

treated cells and

the

were

isolated

expression

from

arbutin

of Bcl-2 and

and

Bax

its

were

measured by real time-PCR.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

117/ 117/144

Figure 22. Effect of arbutin metabolism on catalytic activity of caspase-3. The catalytic activities of caspase-3 in cell lysates were assayed using the specific substrate DEVD-pNA

Figure 23. Effect of arbutin metabolism by fecalase and microbial enzyme mix intracellular ROS formation. Cells were seeded in 48-well plates, cultured for 24 h, and then treated with arbutin and its metabolite for 20 h. Following the incubation, cells were treated with H2DCFDA for 30 min.

장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 geniposide을 첨가하여 대사를 유도한 후 세포생존율과 apoptosis 등의 독성지표를 활용하여 장내세균 효소복합체 및 장내 약물대사효소계의 대사활성을 비교 조사하였음.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

118/ 118/144

장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 geniposide을 MTT, LDH assay 방법을 이용하여 세포 독성을 조사한 결과 장내세균 효소 복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 geniposide에 의해서 세포 독성이 증가하였으며

장내세균

효소복합체와

장내미생물

대사효소계에

반응된

geniposide의 세포 독성의 차이는 나타나지 않았음 (Figure 24, 25). 또한, 세포사멸 정도를 APOPercentage kit를 사용하여 측정한 결과 위와 유사한 결 과를 확인하였음 (Figure 26). 이는 geniposide의 경우 장내 약물대사효소계 와 장내세균 효소복합체가 geniposide의 독성 대사체 생성이 차이가 미비한 것으로 사료됨.

Figure 24. Effect of cytotoxic activity of geniposide by intestinal microflora. The cells were cultured in the presence of various concentrations of geniposide and its metabolites for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an MTT assay.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

119/ 119/144

Figure 25. Effect of cytotoxic activity of geniposide by intestinal microflora. The cells were cultured in the presence of various concentrations of geniposide and its metabolites for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an LDH realase assay.

Figure 26. Effect of geniposide and its metabolites on apoptosis in HepG2 cells. The cells were cultured in the presence of various concentrations of geniposide and its metabolites for 24 h. After the treatment, APOPercentage assays were performed according to the manufacturer' sinstruction.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

120/ 120/144

장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 geniposide가 세 포사멸을 조절하는 Bax 및 Bcl-2에 대한 영향을 조사한 결과 apoptotic effector로 잘 알려져 있는 Bax의 유전자 및 단백질 발현을 증가시켰으며, anti-apoptotic effector로 잘 알려져 있는 Bcl-2의 유전자 및 단백질 발현을 억제시켰으며

장내세균

효소복합체

geniposide의

caspase-3 활성

및

장내미생물

ROS

생성능의

대사효소계에 변화를

조사한

반응된 결과

caspase-3 활성 및 ROS 생성능이 증가하였음 (Figure 27-30). 또한, geniposide에 대한 장내미생물 대사효소계와 장내세균 효소복합체의 대사활성 의 차이는 나타나지 않았음.

Figure 27. Effect of geniposide metabolism by fecalase and microbial enzyme mix on Bcl-2 family and caspase-3 activity in HepG2 cells. Western blotting analyses of Bax, Bcl-2 and cleaved-caspase-3 family proteins in HepG2 cells.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

121/ 121/144

Figure 28. Effect of geniposide plus fecalase and microbial enzyme mix on Bcl-2 and Bax expression. Total RNAs were isolated from geniposide and its metabolites

treated cells and

the

expression

of Bcl-2 and

Bax

were

measured by real time-PCR.

Figure 29. Effect of geniposide metabolism on catalytic activity of caspase-3. The catalytic activities of caspase-3 in cell lysates were assayed using the specific substrate DEVD-pNA

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

122/ 122/144

Figure 30. Effect of geniposide metabolism by fecalase and microbial enzyme mix intracellular ROS formation. Cells were seeded in 48-well plates, cultured for 24 h, and then treated with geniposide and its metabolite for 20 h. Following the incubation, cells were treated with H2DCFDA for 30 min.

Baicalin 및 장내미생물에 의해 가수 분해된 baicalein의 세포 독성에 대한 영향을 조사하기 위하여 baicalin, baicalein, 장내세균 효소복합체 및 장내미생 물 대사효소계에 반응된 baicalin의 농도를 선정하여 24시간 동안 처리한 후 MTT assay 방법을 이용하여 세포 독성을 조사하였음. 위 연구 결과 원물질인 baicalin에서 독성을 나타났으며, baicalein의 경우 원 물질의 독성 보다 세포 독성이 적었으며, 장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 baicalin의 경우 세포 독성이 baicalein보다 세포 독성이 적음을 확인하였음. 이는 대사된 baicalein이 장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에서 다른 물질로 대사되어 독성이 나타나지 않은 것으로 사료됨 (Figure 31).

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

123/ 123/144

Figure 31. Effect of cytotoxic activity of bacalin by intestinal microflora. The cells were cultured in the presence of various concentrations of bacalin and its metabolites for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an MTT assay.

Methyl-paraben 및 장내미생물에 의해 가수 분해된 benzoic acid의 세포 독성에 대한 영향을 조사하기 위하여 methyl-paraben, benzoic acid, 장내세 균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 methyl-paraben의 농도를 선정하여 24시간 동안 처리한 후 MTT assay 방법을 이용하여 세포 독성을 조사하였음. 위 연구 결과 원물질인 methyl-paraben에서 독성을 나타났으며, benzoic acid의 경우 원 물질의 독성 보다 세포 독성이 적었으며 장내세균 효 소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 methyl-paraben에서 세포 독성 이 methyl-paraben보다 세포 독성이 적음을 확인하였음. 또한, 장내미생물 대 사효소계가 장내세균 효소복합체보다 methyl-paraben에 대한 대사 활성이 증 가함을 확인하였음 (Figure 32).

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

124/ 124/144

Figure 32. Effect of cytotoxic activity of methyl-paraben by intestinal microflora. The cells were cultured in the presence of various concentrations of methyl-paraben and its metabolites for 24 h. After the treatment, cell viability was measured with an MTT assay.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

125/ 125/144

(3)

장내세균

효소복합체(fecalase)과

장내미생물

대사효소계(intestinal 대사효소계(intestinal

microbial enzyme mix)의 유전독성 평가기술 개발 및 대사활성 비교 1-2년도 유전독성에 대한 연구 기반을 바탕으로 장내세균 효소복합체 또는 장내미생물 대사효소계에 의한 독성 대사체의 유전 독성에 대한 영향을 comet assay 및 in vitro 소핵시험을 통한 독성 평가 개발 기술을 보완 및 유효성을 검증하고자 하였음.

아직 공식적으로 유전독성시험법 guideline에 올라 있지는 않은 시험법이긴 하지만 현재 DNA damage 측정시험법으로서는 가장 각광받고 있는 시험법임. In

vitro

소핵시험은

포유동물세포를

이용하여

염색체의

구조적이상

(clastogenic) 및 수적이상(aneugenic)을 일으키는 물질을 측정하는 시험법으 로써 interphase 세포의 세포질에 존재하는 소핵을 측정하며 이 시험법은 현재 OECD guideline에 draft가 제출된 상태로 이를 활용한 유전 독성 연구가 활발 히 진행되고 있음.

따라서 본 연구에서는 장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 arbutin을 첨가하여 대사를 유도한 후 유전 독성에 대한 영향을 comet assay, in vitro 소핵시험 방법을 활용하여 유전독성 및 장내세균 효소복합체 및 장내 미생물 대사효소계의 대사활성을 비교 조사하였음.

위 결과 arbutin을 처리한 경우 간 세포주에서 유전독성이 유발되지 않았으 나 장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된 hydroquinone에 의해서 유전세포 독성이 증가하여 comet tail의 이동성이 증가하였음. 또한, 장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 arbutin의 경우 DNA손상이 발생이 높아 comet tail의 이동성이 증가하였으며 장내세균 효소복합체보다 장 내미생물 대사효소계에 반응된 arbutin의 comet tail의 이동성이 크게 나타났 음.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

126/ 126/144

In vitro 소핵시험 방법을 활용하여 arbutin 및 대사체의 유전독성을 조사한 결과 장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된 hydroquinone에 의해서 유전 독성 지표인 소핵 생성능이 증가하였음. 또한, 장내세균 효소복합체 및 장 내미생물 대사효소계에 반응된 arbutin에 의해서 소핵 생성능이 증가하였으며 장내미생물 대사효소계가 장내세균 효소복합체보다 arbutin의 대사활성 반응이 큰 것으로 나타남.

Figure 33. Effect of arbutin and its metabolites on DNA demage in HepG2 cells. DNA damage was measured by comet assay in HepG2 cells treated with arbutin and its metabolites for 24 h.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

127/ 127/144

Figure 34. Micronuclei in binucleate HepG2 cells. Cells were seeded in 6 well plate. Following 24-h treatment the cells were blocked at cytokinesis by the addition of fresh medium containing 3 mg/ml cytochalasin B. Cells were cultured for a further 24 h prior to fixation and staining with 5% Giemsa.

Figure 35. Comparison of the micronucleated cells in HepG2 cell in control and various treatment groups. Following 24-h treatment the cells were blocked at cytokinesis by the addition of fresh medium containing 3 mg/ml cytochalasin B. Micronucleus formation was scored in 1000 binucleate cells either as micronucleated binucleate cells or total number of micronuclei.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

128/ 128/144

Geniposide 및 geniposide의 장내미생물(β-glucosidase)에 의한 가수분 해 대사체인 genipin의 유전 독성에 대한 영향을 조사하기 위하여 p53의 유전 자 발현을 western blot 방법을 활용하여 조사하였음. 위 결과, 가수분해 대사 체인 genipin 처리에서 p53의 발현이 증가하였으나, 대사전의 전구물질인 geniposide는 p53, OGG1의 유전자 발현에 영향을 주지 않았음 (Figure 36). 또한, 장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 geniposide의 p53의 전사인자의 활성을 조사한 결과 유전자 손상 복구 단백질인 p53 유전 자 활성이 증가하였음 (Figure 37).

Figure 36. Effect of geniposide and genipin on the expression of p53. Western blotting analyses of p53 and beta-actin proteins in HepG2 cells.

Figure 37. Effects of geniposide plus fecalase and and microbial enzyme mix on p53 luciferase activity. Cells were transiently co-transfected with pCMV-β -gal, p53 luciferase reporter gene. After 4 h, cells were treated with the indicated concentrations of geniposide and its metabolite for 24 h.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

129/ 129/144

장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 geniposide을 첨가하여 대사를 유도한 후 유전 독성에 대한 영향을 comet assay 방법을 활용하여 조 사한

결과

geniposide는

유전독성이

유발되지

않았으나

장내미생물(β

-glucosidase)에 의해 가수분해된 genipin에 의해서 유전세포 독성이 증가하 여 comet tail의 이동성이 증가하였음. 또한, 장내세균 효소복합체 및 장내미생 물 대사효소계에 반응된 geniposide의 경우 DNA 손상율이 높아 comet tail의 이동성이 증가하였으며 장내세균 효소복합체와 장내미생물 대사효소계 사이에 comet tail의 이동성의 차이는 나타나지 않았음.

In vitro 소핵시험 방법을 활용하여 geniposide 및 대사체의 유전독성을 조 사한 결과 가수분해물인

genipin에 의해서 유전 독성 지표인 소핵 생성능이

증가하였음. 또한, 장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 geniposide에 의해서 소핵 생성능이 증가하였으며, 장내미생물 대사효소계과 장내세균 효소복합체의 geniposide의 대사활성 반응은 차이가 나타나지 않았 음.

Figure 38. Effect of geniposide and its metabolites on DNA demage in HepG2 cells. DNA damage, measured by comet assay in HepG2 cells treated with geniposide and its metabolites for 24 h.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

130/ 130/144

Figure 39. Micronuclei in binucleate HepG2 cells. Cells were seeded in 6 well plate. Following 24-h treatment the cells were blocked at cytokinesis by the addition of fresh medium containing 3 mg/ml cytochalasin B. Cells were cultured for a further 24 h prior to fixation and staining with 5% Giemsa.

Figure 40. Comparison of the micronucleated cells in HepG2 cell in control and various treatment groups. Following 24-h treatment the cells were blocked at cytokinesis by the addition of fresh medium containing 3 mg/ml cytochalasin B. Micronucleus formation was scored in 1000 binucleate cells either as micronucleated binucleate cells or total number of micronuclei.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

131/ 131/144

(4)

장내세균

효소복합체(fecalase)과

장내미생물

대사효소계(intestinal

microbial enzyme mix)의 면역독성 평가기술 개발 및 대사활성 비교 장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 geniposide를 첨가하여 대사를

유도한

후

면역

독성에

대한

영향을

조사하기

위하여

COX-2

promoter를 transfection을 수행하여 COX-2 promoter의 활성을 조사한 결 과 장내세균 효소복합체 및 장내 약물대사효소계에 반응된 geniposide에 의해 서 COX-2 promoter의 활성이 증가하였음 (Figure 41).

장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 geniposide를 첨가하여 대사를 유도한 후 COX-2 유전자 발현의 주요 전사조절인자인

NF-κB,

AP-1를 transfection을 수행하여 위 전사인자의 활성을 조사한 결과 장내세 균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 geniposide에서 NF-κB, AP-1의 활성이 증가됨을 확인하였으며, 장내미생물 대사효소계과 장내세균 효소복합체의 geniposide의 대사활성 반응은 차이가 나타나지 않았음 (Figure 42).

Figure 41. Effects of geniposide plus fecalase and and microbial enzyme mix on COX-2 luciferase activity in

Raw 264.7 cells. Cells were transiently

co-transfected with pCMV-β-gal, COX-2 luciferase reporter gene. After 4 h, cells were treated with the indicated concentrations of geniposide and its metabolite for 24 h.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

132/ 132/144

Figure 42. Effects of geniposide plus fecalase and and microbial enzyme mix on AP-1 and NF-kB luciferase activity in

Raw 264.7 cells. Cells were

transiently co-transfected with pCMV-β-gal, AP-1 and NF-kB luciferase reporter gene. After 4 h, cells were treated with the indicated concentrations of geniposide and its metabolite for 24 h.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

133/ 133/144

4. 연구결과 고찰 및 결론 1) 1차년도 연구 결과 고찰 및 결론 장내미생물 배양기술 확립

먼저 5종의 장내미생물을 선정하여 독성대사체 대사를 유도하기 위하여 배양 법을 확립하고자 하였으며, 독성물질과 배양한 배양액을 시료로 사용하여 대사 체 분석법 및 생성여부를 조사하였고, 각종 독성평가를 실시하였음. 특히 장내 미생물 배양초기부터 시험물질을 첨가하여 대사를 유도하는 경우와 일단 미생 물 배양을 먼저 진행하고 시험물질의 대사를 유도하는 경우를 구분하여 시험하 였음.

장내미생물의 배양조건은 비장세포의 증식능이나 세포독성에 관한 영향이 보다 적은 증균배지를 minimal media로 선정하였고, 모든 세포독성 및 면역독 성 실험은 독성이 나타나지 않는 배율에서 진행하였다. 또한 minimal media로 선정된 증균 배지를 이용하여 arbutin 및 다른 시험물질에 대한 미생물 대사체 분석과 독성 평가를 실시하였음.

시험물질 및 대사체 분석법 개발

장내미생물 배양액에 존재하는 시험물질 및 대사체의 분석법을 개발하기 위하 여 arbutin, sudan III와 이들 대사체는 HPLC 분석법으로, puerarin, baicalin 과 이들 대사체는 LC-MS 분석법을 이용하였으며, 이들 대사체 생성 유무 결 과는 독성평가 결과와 유기적으로 연계시켜 장내미생물에 의한 독성 유발기전 을 규명하는데 이바지 하고자 하였음.

Arbutin, puerarin, baicalin 각 시료의 분석법 및 대사체의 분석법을 개발 하였고, 장내미생물 배양액 내의 시험물질 및 대사체 분석을 통하여 arbutin이

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

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실제 장내미생물과의 배양에서 독성이 강한 hydroquinone으로 대사되어 강한 독성을 발현할 수 있음을 확인하였고, 이는 개인의 장내미생물총 조성에 따라 장내 화학물질의 대사에 있어서 현저한 차이를 나타날 수 있음을 확인하였음. 또한,

baicalin이 장내미생물에 의하여 baicalein으로 대사되는 것을 확인할

수 있었으며, 장내미생물 균종간에 baicalin의 대사체 형성에 미치는 영향은 서 로 다른 것으로 나타났음. 그 외에 sudan III, puerarin 등의 물질에 대해서도 장내미생물 배양액을 제조하여 장내미생물에 의한 대사 영향을 평가하였으나 대사체의 형성을 확인할 수 없었음. 이는 puerarin 처럼 시험물질의 접종 양이 너무 낮았거나 시험균주에 따른 차이로 생각되며 보다 명확한 결과도출을 위해 서는 추가 실험이 필요한 것으로 사료됨.

장내미생물 대사체의 면역독성 평가

마우스 비장세포 배양에서 B-cell 및 T-cell mitogenicity에 미치는 미생물 대사체의 독성을 평가하기 위하여 arbutin과 그 대사체인 hydroquinone에 대 하여 비교평가를 실시한 다음, 실제 장내미생물과 arbutin을 배양한 시료를 대 상으로 비장세포 증식능을 시험하여 대사 후 독성이 증강되는 결과를 얻을 수 있었음. 또한, sudan III이나 baicalin 물질이 장내미생물에 의해 대사체가 생성되면 면역독성의 지표변화에 억제 또는 상승작용을 할 수 있음도 제시할 수 있었음.

세포독성평가법의 개발

Arbutin, 장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된 hydroquinone, geniposide 그리고 장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된 genipin 를 시료로 하여 각 물질의 세포 독성에 대한 영향을 MTT 및 LDH 방법을 이 용하여 활성산소 생성 및 세포독성을 조사한 결과, arbutin 및 geniposide 자 체는 독성을 나타내지 않았으나 장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해 된 hydroquinone 및 genipin은 ROS 생성 및 세포독성이 증가하였음.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

135/ 135/144

Baicalin, puerarin, methyl-paraben 및 장내미생물에 의해 가수 분해된 baicalein, daidzein, benzoic acid의 세포 독성을 위와 같은 방법으로 조사한 연구

결과

고농도

baicalin,

methyl-paraben에서

독성을

나타났으며,

baicalein, benzoic acid의 경우 원 물질의 독성 보다 세포 독성이 감소하였음. 세포사멸 과정에서 실행경로의 활성화 과정에 관여하는 caspase-3 활성에 대한

영향을

조사한

연구

결과

hydroquinone

및

genipin에

의해서

caspase-3 활성이 농도 의존적으로 증가됨을 확인하였다. 또한, 세포사멸 관 련 유전자인 Bcl-2 family의 발현에 대한 영향을 조사한 결과, arbutin 및 geniposide 자체는 영향을이 나타내지 않았으나 hydroquinone 및 genipin에 서

apoptotic

effect로

잘

알려져

있는

Bax의

발현을

증가시켰으며,

anti-apoptotic effect로 잘 알려져 있는 Bcl-2의 발현을 농도 의존적으로 억 제시켰으며 hydroquinone 및 genipin에서 세포 사멸이 증가하였음.

장내미생물 배양을 이용한 독성평가법 개발

실제 장내미생물 배양 시 시험물질 arbutin 및 geniposide를 첨가한 다음 배 양액을 세포독성 평가를 수행한 결과, 미생물배양액에 시험물질을 첨가한 대조 군에 비하여 세포독성이 현저하게 증가되는 결과를 얻어 장내미생물에 의한 화 학물질의 대사가 host의 대사계와 마찬가지로 체내로 유입되는 화학물질의 독 성대사체로의 전환에 매우 중요한 요소임을 확인할 수 있었음.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

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2) 2차년도 연구 결과 고찰 및 결론 장내세균 효소복합체를 이용한 유전독성 평가기술 개발

p53과 8-oxoguanine glycosylase 유전자는 유전독성 물질에 의해서 유도되 는 유전자의 변이, DNA손상에 의해서 조절되는 유전자로서 이를 활용하여 분 자생물학적 유전독성평가 방법을 개발하였음.

Arbutin

및

장내미생물(β-glucosidase)에

의해

가수분해된

hydroquinone의 p53, OGG1 유전자 발현에 대한 영향을 조사한 결과, arbutin 및 hydroquinone은 유전자 손상 복구 단백질인 p53 유전자 발현이 증가하였으나 OGG1의 경우 가수분해된 hydroquinone에 의해서 발현이 증가 하였으나 대사전의 전구물질인 arbutin은 OGG1의 유전자 발현에는 영향이 없 었음.

또한

arbutin

및

hydroquinone을

처리하고

p53

repoter

gene

transfection을 수행하여 p53의 전사인자의 활성을 조사한 결과 p53 유전자 발현과 유사한 결과를 확인하였음. 장내세균 효소복합체(fecalase)에 arbutin 을 첨가하여 대사를 유도한 후 세포 배양액에 처리한 후 p53 및 OGG1의 유 전자 발현을 조사한 결과 위 결과와 유사한 결과가 나타남. 이는 산화적 스트 레스 발생에 의해서 유전독성이 발생되며 이에 대한 보호 기전으로 OGG1의 유전자 발현이 증가한 것으로 판단됨.

Geniposide 및 geniposide의 장내미생물(β-glucosidase)에 의한 가수분 해 대사체인 genipin의 유전 독성에 대한 영향을 조사하기 위하여 p53, OGG1 유전자 발현 및 p53 활성을 조사한 결과 가수분해 대사체인 genipin처리에서 p53 및 OGG1 유전자 발현이 증가하였으나, 대사전의 전구물질인 geniposide 는 p53, OGG1의 유전자 발현에 영향을 주지 않았으며 p53의 전사인자의 활 성을 조사한 결과 p53 유전자 발현과 유사한 결과를 확인하였음.

장내세균 효소복합체(fecalase)에 geniposide을 첨가하여 대사를 유도한 후 세포 배양액에 처리한 후 p53 및 OGG1의 유전자 발현을 조사한 결과 위

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

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결과와 유사한 결과가 나타남. 따라서 geniposide의 경우 장내미생물(β -glucosidase)에 의해 가수분해된 genipin에서 유전독성관련 유전자 발현이 증가되었음 확인하였음.

장내세균 효소복합체를 이용한 전사조절인자 영향 평가기술 개발

장내미생물에 의한 독성대사체의 면역독성에 대한 영향을 조사하기 위하여 인 체세포

주에서

장내미생물에

의한

독성대사체의

COX-2

유전자발현

및

COX-2 유전자 발현에 중요한 역할을 하는 전사조절인자 (NF-κB, AP-1) 의 역할을 RT-PCR, reporter assay를 통하여 조사하였음.

Geniposide 및 장내미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된 genipin의 면역 독성과 관련한 염증 유발 효소계에 대한 영향을 측정한 결과, 가수분해된 genipin에서 염즈 유발과 관련된 COX-2 유전자 발현이 증가하였음. 장내세균 효소복합체(fecalase)에 geniposide을 첨가하여 대사를 유도한 후

COX-2

유전자 발현에 대한 영향을 조사한 결과 위 결과와 유사한 결과를 얻었음. 또 한

geniposide의

경우

장내미생물(β-glucosidase)에

의해

가수분해된

genipin은 NF-κB, AP-1의 전사 조절인자의 활성화를 통하여 COX-2 발현 을 증가시키는 것으로 조사되었음. 또한 위 결과를 통하여 Geniposide는 장내 미생물(β-glucosidase)에 의해 가수분해된 genipin을 생성시킴으로서 염증을 유발시킬 수 있는 가능성이 있을 것으로 사료됨.

Baicalin 및 장내미생물에 의해 가수 분해된 baicalein의 면역 독성과 관련 한 염증 유발 효소인 COX-2 유전자 발현에 대한 영향을 조사한 결과, Baicalin 및 가수분해된 baicalein의 경우 COX-2 유전자 발현 및 관련 주요 전사 조절 인자의 활성에 대한 영향이 없었음.

또한, 장내세균 효소복합체(fecalase)를 1-2세부과제로부터 제공받아 독성 평가기술의 개발에 활용한 결과, 1차년도의 장내미생물 배양계와 유사한 대사 활성을 보이는 것이 확인되었으며, 미생물배양과정이 생략되는 장점이 있어 효

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

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소복합체(fecalase)의 표준화가 진행되면 각종 독성평가 시 장내미생물의 역할 규명에 매우 유용한 것으로 사료됨.

3) 3차년도 연구 결과 고찰 및 결론 장내세균 효소복합체를 이용한 세포독성 및 세포사멸 평가기술 개발

장내세균 효소복합체(fecalase)에 원물질을 첨가하여 대사를 유도한 후 세포 독성 및 세포사멸 시험법을 보완하여 장내세균 효소복합체에 반응된 arbutin의 세포독성에 대한 연구를 수행하였음. 또한, 독성 기전을 규명함으로서 장내세균 효소복합체에 의한 대사체(arbutin→hydroquinone, geniposide→genipin)가 세포사멸에 대한 영향 규명 및 세포 사멸에 대한 독성 평가법을 제시하고자 하 였음.

장내세균 효소복합체(fecalase)에 원물질을 첨가하여 대사를 유도한 후 세 포생존율과 apoptosis 등의 독성지표를 장내세균 효소복합체과 배양하지 않은 대조군과 비교하여 조사한 결과 arbutin, geniposide을 장내세균 효소복합체 (fecalase)와 배양한 경우 세포 사멸이 농도 의존적으로 증가되었음. 이는 장 내세균 효소복합체가 arbutin, geniposide을 세포독성을 유발하는 대사체로 대사 를 시켰음을 의미하는 결과로 판단됨.

또한, 장내세균 효소복합체(fecalase)에 반응된 arbutin, geniposide은 활 성 산소를 증가시킴으로서 세포 사멸 유전자(Bax)와 세포 사멸 억제 유전자 (Bcl-2, BCl-XL)의 발현을 조절하고 caspase-3 활성화 시키는 것으로 측정 되어 ROS를 소거하는 물질로 잘 알려진 N-acetyl cysteine(NAC)을 전 처리 한 결과 장내세균 효소복합체(fecalase)에 반응된 arbutin, geniposide에 증가 된

ROS 생성능, 세포 독성 및 세포 사멸이 억제되었음. 위 결과를 통하여 장

내세균 효소복합체(fecalase)에 반응된 arbutin, geniposide이 세포독성을 유 발하는 대사체 hydroquinone, genipin으로 전환시켜 활성산소에 의한 세포사 멸을 유도한 것으로 확인하였음.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

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장내세균 효소복합체(fecalase)과 장내미생물 대사효소계 (intestinal microbial enzyme mix)의 세포사멸 평가기술 개발 및 대사활성 비교 1, 2차년도의 연구 수행을 통해 확립한 세포독성 및 세포 사멸 시험기술을 통 한 fecalase 효소활성을 대신할 장내미생물 대사효소계의 비교 분석을 통한 대 사활성을 조사하였음.

장내세균

효소복합체(fecalase)

및

장내미생물

대사효소계(intestinal

microbial enzyme mix)에 arbutin을 첨가하여 대사를 유도한 후 세포생존율 과 apoptosis 등의 독성지표를 활용하여 세포 독성 및 세포 사멸을 조사한 결 과 장내세균 효소복합체보다 장내미생물 대사효소계에 반응된 arbutin의 세포 독성 및 세포 사멸이 더 증가하였음. 장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사 효소계에 반응된 arbutin이 세포사멸을 조절하는 Bcl-2 family, caspase-3 활성 및 ROS 생성능의 변화를 조사한 결과 장내미생물 대사효소계가 장내세균 효소복합체보다 미약하지만 arbutin의 독성 대사체 생성이 증가됨을 확인하였 음. 이는 arbutin의 경우 장내미생물 대사효소계가 장내세균 효소복합체보다 독성 대사체 생성을 증가시켰을 것으로 판단되나 그 차이는 유의성이 없었음.

장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 geniposide을 첨가하여 다양한 독성 지표를 활용하여 조사한 결과 geniposide에 의한 대사체 독성은 증가하지만 장내미생물 대사효소계와 장내세균 효소복합체에서 세포 독성은 차 이가 나지 않았음.

Baicalin, methyl-paraben 및 장내미생물에 의해 가수 분해된 baicalein, benzoic acid의 세포 독성에 대한 영향을 조사하기 위하여 장내세균 효소복합 체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 baicalin, methyl-paraben에 대한 세 포 독성을 조사한 결과 원물질에서 독성을 나타났으며 대사체의 경우 원 물질 의 독성 보다 세포 독성이 줄어들었으며, 장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 baicalin, methyl-paraben은 세포 독성이 나타나지 않았 음.

약물대사기반연구사업단

1-1세부과제

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Baicalin은 장내미생물에 의해 baicalein으로 대사되고, 더 대사가 되는 경 우에는 4- hydroxybenzoic acid, phenylacetic acid 등으로 대사된다는 보고 가 있음. 따라서 장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 반응된 baicalin, methyl-paraben에서 대사체보다 독성이 나타나지 않은 것으로 판단 됨.

장내세균

효소복합체(fecalase)과

장내미생물

대사효소계(intestinal 대사효소계(intestinal

microbial

enzyme mix)의 유전독성 평가기술 개발 및 대사활성 비교

1, 2차년도 유전독성에 대한 연구 기반을 바탕으로 comet assay 및 in vitro 소핵시험을 통한 장내미생물 독성 평가 개발 기술 개발하였으며, comet assay 및 in vitro 소핵시험의 경우 유전 독성을 평가하는 지표로 활용되고 있음. 장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 arbutin 및 geniposide을 첨가하여 대사를 유도한 후 유전 독성에 대한 영향을 comet assay, in vitro 소핵시험 방법을 활용하여 유전독성을 조사한 결과

장내세균 효소복합체 및

장내미생물 대사효소계에 반응된 arbutin 및 geniposide에서 comet tail의 이 동성과 소핵 생성능이 증가하였음.

장내세균

효소복합체(fecalase)과

장내미생물

대사효소계(intestinal 대사효소계(intestinal

microbial

enzyme mix)의 면역독성 평가기술 개발 및 대사활성 비교 Geniposide의 면역독성과 관련한 염증 유발 효소인 COX-2유전자 발현에 대 한 결과는 2차년와 유사하며 장내세균 효소복합체 및 장내미생물 대사효소계에 서 생성되는 것으로 알려진 geniposide에서 COX-2 promoter, NF-κB, AP-1의 활성이 증가됨을 확인하였으며 장내미생물 대사효소계과 장내세균 효 소복합체에서 geniposide에 의한 염증 유발 효소인 COX-2유전자 발현은 차 이가 없었음.

특히 본 연구에서 개발한 기술은 모두 포유동물 세포주를 이용한 독성평가 기술로 기존의 미생물 이용 시험보다 포유동물 세포주를 이용함으로써 인체에 서 발생할 수 있는 장내 미생물에 의한 화학물질의 대사활성화로 유도되는 대

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사체의 독성평가를 in vitro 포유동물 세포주를 이용함으로써 in vivo 동물 실 험을 대체할 수 있는 장점이 많은 시험기술일 뿐만 아니라 독성기작을 분자 및 세포수준에서 확인할 수 있는 시험법들이어서 향 후 독성평가기술의 선진화를 이룰 수 있는 장점이 있음.

본 연구 수행을 통해 확립한 시험기술을 다양한 시험물질에 적용하여 독성 평가법으로 표준화시킬 수 있으며, 세포독성, 유전독성, 면역독성 평가를 in vitro 세포주를 이용하여 평가할 수 있는 가이드라인을 제시할 수 있었음.

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