장내미생물에 의한 대사체 분석연구
2009-2011. / 2 중단위 요약 (장내미생물에 의한 대사체 분석연구 )
약물대사기반연구사업단
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< 제 2 중단위 연구과제 >
1. 요약문 ···················································································································· 3 1-1. 2중과제 연구개발 내용 및 방법 ································································· 3 1-2. 연구결과 고찰 및 결론 ················································································· 9
2. 연구개발 목표 ································································································· 10 2-1 연구내용 ··········································································································· 11 2-2 기대성과 ·········································································································· 11 표. 세부과제별 연구목표와 내용 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·12
3. 연구내용 및 방법 ·························································································· 13
4. 최종 연구개발 결과 ······················································································ 14 <제2-1세부> 1차년도 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·14 2차년도 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·16 3차년도 ··························································································· 18 <제2-2세부> 1차년도 ·························································································· 22 2차년도 ·························································································· 23
5. 연구결과 고찰 및 결론 ···················································································· 24 <제2-1세부> ··········································································································· 24 <제2-2세부> ··········································································································· 27
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1. 요약문
1-1. 2중과제 연구개발 내용 및 방법
가. 연구내용
o 천연물 및 약물 대사체의 최신분석기법 활용 분석방법 개발 및 확보 - 약물 및 대사체를 혈액 및 뇨 시료에서 분석하기 위하여 유기용매를 사용하 여 최적의 정제과정을 확립하고 LC-MS/MS 분석기기의 최적조건을 설정하여 고감도 초정밀 분석법을 개발함. - UPLC-QTOF/MS, GC/MS, LC/MS/MS 분석기기를 사용하여, 내인성 대사 체를 검출할 수 있는 방법을 확립하고 장내미생물에 의한 내인성 대사체 프로 파일 변화를 관찰함.
o 항생제처리 rat 모델 대사체 구조확인 연구 - Rat에 항생제 혼합물을 투여하여 pseudo germ-free rat 모델을 유도하고 체내동태연구를
위하여
hesperidin,
gisenoside
Re,
actaminophen,
geniposide, baicaline, 및 esculetin을 투여하고 혈액시료를 취하여 혈 중 농도 약물대사기반연구사업단
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프로파일로부터 체내동태 파라미터를 항생제를 투여하지 않은 대조군과 비교하 여 장내미생물이 약물 또는 천연물의 체내동태에 미치는 영향을 연구함. - 혈액은 반감기를 고려하여 혈액시료 채취시간을 정하여 정맥에 cannulation을 통하여 정해진 시간에 시료를 채취함. - 뇨 시료는 대사체 연구를 위하여 사용하며 metabolic cage를 사용하여 6시 간, 12시간 간격으로 germ-free mouse 모델에 actaminophen과 geniposide 를 투여하여 체내동태 연구를 수행함
o 소장 precision-cut slice를 사용한 geniposide의 in vitro 독성연구 방법의 확립 - Tissue precision-cut slice를
제조하여 화합물을 독성평가 연구에 활용함
- Vibrotome에서 250-300 um 뚜께의 소장 slice를 배지에 넣고 배양 후 alkaline phosphatase, Na-K-ATPase, LDH 등의 활성을 평가함
o 분변으로부터 장내세균의 분리 및 배양 - 제 1-2과제에서 제공된 분변 (20인)에서 장내미생물을 배양하여 500 여 가 지의 균주를 관찰함 - 배양된 균주를 b-glucuronidase 등 21 가지 합성기질에 대하여 대사활성을 측정 후 활성이 높은 균주를 선별하고, 이 균주를 대량 배양하여 21 가지 효소 의 활성을 재측정 후 100 여개의 균주를 선별함.
o 장내세균의 장내활성 분석 - 활성이 우수한 7 개의 균주 (BL-3, BL-1, Gam-6, Gam-2, JY-6, A-44, L-BL-8)를 선별하여 21 가지 합성기질에 대하여 대사활성을 측정함 - 4가지 분리균주를 혐기성 배지에서 24 시간 배양, 원심분리, 초음파 처리하여 조효소액을 제조함 - 조효소액을 혼합 (BL-3: JY-6: A-44=1:10:10:5) 하여 microbial enzyme mixture를 제조하고 이 조효소액의 효소활성을 fecalase와 비교함
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o 장내미생물 및 대사체 관련 DB 구축 - 사용자 편의를 고려하여 Web 컨텐츠 및 Web 디자인 함 - DB 구축과 프로그래밍 언어와 DB 관리시스템으로 Javs ServerPages를 사용 함 - 서비스 시스템을 구축함 - 데이터베이스의 범위를 설정하고 검색목록을 지정함 - 프로그램의 개발 범위는 Mysql DB를 이용하고 웹상에서 제작하며, IP에 비의 존적인 방식을 택하며, JAVA 기술을 사용하여 update를 가능하게 하여 비용을 절약하며 이용자가 쉽게 접근할 수 있는 인터페이스를 사용하여 DB를 구축함 - DB 개발 도구로서 문서형식은 DHTML을 활용하며 폰트, 모양, 디자인을 향상 시키고, 그래픽 에디터는 Photoshop을 사용함
나. 연구방법
LC/MS/MS 분석기기를 활용한 약물 및 대사체의 분석방법 확립 - Hesperetin 및 대사체의 분석법: Hesperetin의 혈중 농도분석법을 LC/MS 방 법으로 확립함. MSn 분석기법을 이용한 hesperetin의 대사체 구조 규명; LC/MSD trap ion trap mass spectrometer를 사용하여 혈장, 뇨 및 변에서 약물과 대사체를 분석함 - Amaranth 분석법: LC/MSD iontrap mass spectrometer사용하여 MSn으로 분석함 - Esculetin 과 esculin의 분석법: 분석장비는 Finnigan TSQ Quantum Ultra mass spectrometer (Thermo, San Jose, USA) 와 UFLC-20AD XR binary pump system(Shimadzu, Toko, Japan)을 사용하여 모든 시료를 분석 함.
사용한
Column은
Kinetex
C18
(2.0
×
100
mm,
2.6
um,
Phenomenex, Torrance, USA)이며, flow rate는 0.5 ml/min 이고, Injection volume은 2 μL로 분석함. 이동상은 A (0.1 % formic acid in water) and B (0.1 % formic acid in acetonitrile) 으로 gradient elution program을 사 용함 - Genipin 및 geniposide의 분석법: LC/MS는 Agirent 6460 Triple Quad
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LC/MS를 사용함. Genipin은 negative ion mode에서 ESI (electrospray ionization) source를 이용하여 MRM (multiple reaction monitoring) 분석 조건을 확립함. Genipin은 m/z 225.2
101.2, geniposide는 433.4
225.1, 내부표준물질인 luteolin은 m/z 285.2
133.1의 MRM mode로 검출
함. 분석용 컬럼으로는 BDS hypersil C18 column (2.1 mm * 250 mm, 5 μ L)을
사용하고
acetonitrile
이동상으로는
(solvent
0.1%
B)를
formic
사용하였고
acid
유속을
(solvent
0.25
A)와
mL/min로
90% 하여서
gradient system에서 분석함. -
아세트아미노펜의
분석법:
3-cysteinylacetaminophen
표준
물질은
(APAP-Cys),
acetaminophen 3-methoxy
(APAP),
acetaminophen
(APAP-OMe), 3-methoxy acetaminophen (APAP-OMe), acetaminophen glutathione (APAP-Glc),
(APAP-Glth),
4-acetamidophenyl-beta-D-glucuronide
4-acetaminophen
sulfate
(APAP-Sul),
3-(N-acetyl-L-cystein-S-yl) acetaminophen (APAP-NAC) 등이며 내 부표준물질로
(APAP-d4),
acetaminophen-d4
4-acetamidophenyl-beta-D-glucuronide-d3 (APAP-Glc-d3) 등을 사용 함. 기기분석조건은 API 3200™ system 을 이용하여 LC-MS/MS 로 분석하 고, 이때 사용한 Column은 Capcell Pak C18 MG II (2.0 × 150 mm, 5 um, Shiseido, Japan)이며, Column flow는 300 μL/mL이고, 주입량은 5 μL로 분석함. 이동상 조건은 A (0.1 % formic acid in 5 % acetonitrile) and B (0.1% formic acid in 95 % acetonitrile) 으로 gradient system에서 분석함. 분석물질
및
MS/MS
조건은
혈장
및
뇨
중
APAP와
그
대사체들을
electrospray ionization LC/MS에서 분석하기 위하여 APAP와 그 대사체들의 이온화를 위한 조건을 확립하고 MS/MS fragment pattern을 규명함.
Pseudo germ-free rat model 및 Germ-free mouse 모델에서 체내동태 비교 연구 -
Pseudo germ-free rat model의 확립 : Sprague-Dawley(SD) rat
(240±10 g)을 사용하여, 실험기간동안 물과 사료는 자유로이 공급하고, 사육 실내의 온도는 23±2 °C, 습도는 55 ±10 %로 유지함. 실험동물은 2군으로
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나누고 한 군은 정상 대조군으로 정하고 (대조군), Pseudo germ-free rats은 정상 쥐에게 항생제 혼합액을 경구 투여하여 완성한 후 약물을 투여함. - 수술방법: 실험동물은 마취제를 복강 투여하여 마취한 후 수술대에 고정하고, 좌측 쇄골 유첨근 위를 1cm 가량 절개하고 핀셋으로 경동맥을 분리하여 들어 올린 후 위쪽과 아래쪽에 각각 봉합사를 걸쳐 놓음. SP-45 튜브는 1 mL 주사 기와 연결한 후 100 U/mL 헤파린을 채워 준비함. 25G 바늘을 사용하여 혈관 에 구멍을 내고, 준비된 SP-45 튜브를 심장방향으로 삽입한 후 봉합사로 위쪽 과 아래쪽을 걸쳐 둔 봉합사로 묶어서 고정함. 고정된 SP-45 튜브는 튜브 유 도관을 통해 등 뒤쪽까지 뽑아내고 autoclavable low profile button/tether assembly에 연결하여 보호함. - 약물의 투여:
항생제 처리 rat 모델에 hesperetin (40 mg/kg), ginsenosie
Re (50 mg/kg), geniposide 원료
(300 mg/kg), Baicalin (50 mg/kg), 아
세트아미노펜 (200 mg/kg), Esculetin 과 Esculin (40 mg/kg) 용량으로 경구 투여함. 투여 후 시간별로 200 μL 이상 채혈 후 원심분리하여 plasma 100 μL를 취함. plasma는 sample preparation 전까지 -80 ℃에서 보관함. 뇨 시 료 역시 각 약물의 경구 투여 후 시간에 따라 채취 한 후 분석 전까지 보관함. -Germ-free mouse 모델: 아세트아미노펜 (200 mg/kg, 300 mg/kg)의 경우 대조군 (SPF), 정착동물(Gnotobiota), 무균동물 (Germ-free)
3 군으로 나누
어 을 경구 투여하여 채혈하고 시료 전처리 과정 후 분석하여 혈중농도를 비교 함. Ginsenoside Re (50 mg/kg)의 경우 일반 및 germ-free mouse에 경구 투여하고 혈액 시료에서 모 약물 및 대사체를 정량 분석함. 시료의 전처리: Geniposide: 장내에서 직접 흡수되지 않는다고 알려졌고 미생물에 의해 genipin으로
대사된
후
흡수되며
genipin은
체내에서
대부분
대사되어
genipin-sulfate로 존재한다고 알려짐. 따라서 혈장 중의 genipin을 분석하고자 다음과 같은 전처리를 수행함. Plasma sample 100 μL에 sulfatase 50 μL, ascrobic acid (125 mg/mL) 20 μL 넣은 후 37°C에서 30분 반응시킴. 30 분후 내부표준물질 (2 μg/mL luteolin) 10 μL 넣고 ethyl acetate 0.5 mL 넣은 후 vortexing 진행한 후 13000 rpm에서 5분간 원심분리 시키고 상층액 을 N2 gas를 이용하여 휘발시킴. 남은 잔사에 50 % methanol 100 μL을 가 하여 용해한 후 LC/MS를 이용하여 5 μL를 주입하여 분석함.
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Esculetin, Esculin: Plasma 100 μL에 내부표준물질(levafloxacine)이 포 함된 acetonitrile을 100 μL와 0.2 % ascorbic acid를 10 μL 가하여 혼합한 후 vortexing을 충분히 하여 혈장단백질을 제거한 후 원심분리하여 상층액 100 μL를 취한 후 2 μL를 LC-MS/MS에 주입함. 아세트아미노펜: 내부 표준물질로 APAP-d4 (acetaminophen-d4, 10 μ g/mL), APAP-Glc-d3 (acetaminophen -glucuronide-d3, 10 μg/mL) 의 혼합액을 사용함. Plasma의 경우, 100 μL에 내부표준물질 혼합액을 20 μL 씩 가하여 혼합한 후 methanol을 200 μL씩 가하고 vortexing을 충분히 하여 혈장단백질을 제거함. 그 후 14000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 200 μL 취하여 질소가스 하에서 건조시키고 분석 전까지 -20 ℃에서 보관 함. 분석을 실시하기 직전에 50% methanol 100 μL 으로 재조정함. Urine 의 경우, 100 μL에 내부표준물질 혼합액을 20 μL씩 가하여 혼합한 후 methanol을 180 μL씩 가하고 vortexing을 충분히 하여 혈장단백질을 제거 후 14000 rpm에서 15분간 원심 분리한 후 상층액을 150 μL 취하여 분석함.
o global metabolic profiling 연구 -항생제
처리한
모델
뇨시료에서
Ultrafree-MC
filter로
여과하고
UPLC-TOF-MS로 m/z 50-1200 범위에서 분석 비교하여 다변량분석과 data 검색으로 내인성 대사체를 추정함. -Global metabolic profiling 방법을 사용한 장내미생물의 존재 여부에 따른 대 사체 변화를 관찰하기 위하여 UPLC/QTOF-MS에 의한 대사체 분석을 위한 시 료의 전처리 법 개발 및 LC/MS에 의한 대사체 분석함. -담즙산, 그외 전구체 및 대사체 정량분석: 장내미생물에 의한 담즙산 농도 변 화를 뇨 시료를 효소가수반응하고 MTBE로 추출하여 GC/MS로 분석함.
o 소장 precision-cut slices를 활용한 Geniposide의 독성 연구 -SD rat의 소장을 적출하여 precision-cut small intestine slices 기법을 활 용하여 소장의 절편을 William E 배지에서 배양하여 geniposide와 genipin을 노출시킨
후
alkaline
phosphatase,
+ + Na /K -ATPase,
lactate
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dehydrogenase의 활성을 측정하여 독성효과를 측정함. -William E 배지에서 geniposide와 genipin의 HPLC 분석법을 개발함.
1-2. 연구결과 고찰 및 결론
○
2-1세부과제:
장내
미생물에
의한
내인성
대사체의
변화
및
약물의
pharmacokinetic 변화를 검출하기 위하여 항생제 처리로 장내 미생물을 사멸 시킨 항생제 처리 쥐 (pseudo germ-free rat)을 유도하는 방법을 개발하였 음. GC/MS, LC/MS, LC/MS/MS 방법을 활용하여 생체시료에서 극미량 약물 또는 천연물과 그 대사체들을 분석할 수 있는 분석법을 개발하였고, rat 또는 mouse 항생제 처리 모델의 혈액 또는 뇨 시료에서 약물 또는 천연물의 대사 체 구조를 동정하였으며, 원물질과 대사체 각각에 대해 체내동태을 확인하였음. 즉 hesperidin, baicalin, esculin, geniposide 및 아세트아미노펜 등을 각각 정상 쥐와 항생제 처리 쥐 (pseudo germ-free rat)하여 경구 투여하여 각각 에 대해 대사체들을 확인하였고, 원물질과 그대사체들 각각에 대해여 체내동태 가 정상 쥐와 항생제 처리 쥐 (pseudo germ-free rat)에서 차이가 있음을 확인하였음. 또한 내인성 대사체의 프로파일 변화를 확인할 수 있는 global metabolic profiling 방법과 담즙산 및 그 전구체를 정량 분석할 수 있는 GC-MS 분석법을 확립하고 장내미생물 활성과 관련하여 뇨 중 내인성 대사체 프로파일의 변화와 담즙산의 뇨 중 농도 변화를 확인하였음. 이를 통해서 확립 된 방법으로 장내 미생물이 약물 및 천연물 대사 및 체내동태에 미치는 영향과 내인성 대사에 미치는 영향을 평가할 수 있음을 증명하였음. 본 연구을 통해 확립된 방법들은 향후 다양한 약물 및 천연물 대사에서 장내 미생물의 역할과 그 기전을 연구하는데 활용도가 높을 것으로 사료됨.
○
2-2 세부과제: 약물대사 혼합효소의 제조는 식품 및 의약품의 대사활성 및 독 성에 분변효소가 미치는 영향을 파악하기 위하여 사람으로부터 분변효소를 채 취하는데 있어서 임상윤리위원회를 거치는 등 과정의 까다로움과 번거로움, 그 약물대사기반연구사업단
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리고 분변효소의 낮은 활성 및 쉽게 실활되는 분변효소(fecalase)를 대신할 수 있는 분변(20인)으로부터 200 여종 이상의 균주를 분리하고, 이들을 21가지 의 효소활성을 측정하고, 효소활성이 특이하게 보이는 170여개의 균주를 선별 하고 이중에서 9개만을 선별하여 제조한 intestinal microbial enzyme mix는 -80oC에서 냉동보관한 분변 효소액(fecalase) 효소활성이 1주일 이내에 50% 이상 소실되는 것에 반해, 1차년도에 제조한 4-mix 혼합효소액의 효소활성은 1주 동안에는 안정하였으며, 2주 보관 후에도 15% 정도만 소실되었음
2. 연구목표
o 식품첨가물, 한약, 천연물 신약 등 장내미생물총에 의해서 생성되는 대사체들 에 의한 독성평가를 위한 장내미생물의 대사활성을 평가하기 위한 in vitro 및 in vivo 장내세균총 대사활성시스템 확립, 대사체의 기기분석 방법 확립함. o 합성기질 및 천연성분의 대사활성에 대한 기질특이성을 분석하여 fecalase를 대신할 수 있는 약물대사효소계(intestinal microbial enzyme mix)의 제조
2-1 연구내용 [제2-1세부과제] o In-vitro 미생물세균총 대사활성 시스템 활용한 대사체 연구 o 항생제 처리 rat모델 대사체 구조 확인 연구 o 천연물 및 약물 대사체의 최신 분석 기법 활용 분석 방법 개발 및 확보
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[제2-2세부과제] o 건강한 한국인 분변으로부터 장내세균총을 분리하여 효소활성 분석 o 분리 장내미생물의 천연물 성분에 대한 대사활성 분석 o Fecalase 효소활성을 대신 할 수 있는 microbial enzyme mix의 제조
2-2 기대성과 o 미생물 특이적인 독성 발현을 규명함으로써 안전성 평가에 기여 o 장내미생물의 분해, 대사 작용에 의해 독성을 나타내는 식품, 의약품등을 평가 하여 기반자료를 제공함으로써 안전관리 정책에 기여 o 식품, 의약품 등의 장내 미생물응용 독성평가를 통한 과학적 규제 정책 지원
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구분
목표
연구 내용
o 장내미생물 연구를 위한 in vivo 모델 확보 및 식 품,
의약품
함유성분의
장내미생물대사체 분석방 법 및 분석 2-1세부 과제
정상동물, 항생물질처리군 및 무균동물에 서 대사체 분석 방법 및 체내동태 연구 에 의한 장내미생물의 영향 연구 Hesperitin, baicalin, 아세트아미노펜, ginsenoside, Re, geniposide, esculetin, esculin의 체내동태 파라미터 비교에 의한 장내미생물 영향연구 (geniposide, 아세트아미노펜은 gnotobiote mouse 군에 투여하여 체내 동태파리미터의 비교). Peusdo germ-free model에서 아세트 아미노펜 대사체 확인연구 장내미생물이 내인성대사체인 담즙산과 담즙산 대사체 및 oxysterol의 농도변화 에 미치는 영향 연구
o
독성평가를 intestinal
2-2세부 과제
위한
microbial
enzyme mix 제조
사람의 장내세균총으로부터 미생물분리 장내세균총에서 효소활성 분석
β-glucuronidase
등
o 분리 장내미생물의 천연물 및 한약, 읭 약품에서의 효소활성 분석 약물대사활성이 강한 균주 선별하여 intestinal microbial enzyme mix의 제 조
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3. 연구내용 및 방법
구분
연구 내용 항생제모델을 활용한 대사 체 분석연구
연구 방법 항생제모델을 활용한 대상물질의 투여 및 시료의 확보
천연물, 약물 등의 고감도 기기분석법 개발 및 응용 1세부
천연물 및 약물대사체의 LC/MS 최신 분석기법을 활용한 분석방법의 개발 MSn 분석기법을 이용하여 장내미생
장내미생물총에 의해 대사
물에
를 받아 독성을 유발하는 대
의해 생성된 대사체의 구조 규명
사경로의 확인 연구
장내미생물에 의한 내인성대사체의 변 화 검출
분변으로부터 2세부
장내세균의
분리 및 배양 장내세균의 장내활성 분석
검체수집, 분리균주의 동정 및 조 효 소액의 조제 합성기질을 이용한 효소활성의 측정
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4. 최종 연구개발 결과 <제2-1세부> : 1차년도 가. 최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인 - Hesperitin을 rat liver microsome을 사용하여 배양 후 생성된 대사체는 각 각 demethyltion 과 hydroxylation 대사체로 추정되는 대사체 확인하였다. n MS 의 분석 결과 이 대사체는 2-methoxyphenol group이 demethylation 된
대사체로 확인되었다. - Amaranth 분석법: ESI-MS positive ion mode에서 m/z 539 이온을 생성하 였다. CID fragmentation pattern을 규명하기 위해 MSn의 분석결과 m/z 521 의 dehydroxylation과 sulfate가 탈락된 m/z 457과 375이온이 생성되었다.
나. 항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구 - 항생체 처리 모델에서의 총 hesperetin 의 체내동태파라미터는 대조군의 AUC가 항생제 처리군보다 약 3 배가량 높았다. Cmax는 정상군에서는 578 ng/mL, 항생제처리군에서는 198 ng/mL로 정상군에서 더 높게 나타났다. -혈청시료 중 hesperetin의 분석법을 확립하였다. 내부표준물질을 terfenadine 으로 하고 2-1000 ng/mL에서 양호한 직선성을 나타내었다.
다. 장내 미생물에 의한 내인성 변화검출을 위한 global metabolic profiling 연구 - 항생제 처리 전 후의 rat 뇨를 UPLC-TOF-MS로 분석하여 PLS-DA의 3 차원 score plot을 분석한 결과 뚜렷한 두 군의 clustering이 구별되어 두 군
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사이에 대사의 변화가 관찰되었다. 이 data base의 분석결과 각 m/z 값에 해당 하는 물질로 추정되는 대사체를 검출할 수 있었다. - PLS-DA 결과로부터 좀 더 신뢰성 있는 대사체 검출을 위하여 VIP 값을 고 찰하였을 때, 그 값이 1.3 이상인 값을 분석하여 HCA를 수행하고 추정 대사체 를 확인한 결과, amino acid, sterol, steroid 량이 항생제 전후에 감소하거나 증가하여 이 대사체들이 영향을 받는 대사체 군임을 확인하였다.
라. Geniposide 및 Genipin의 precision-cut small intestine slice에서의 독성 평가 방법의 확립 - Percision-cut small intestine을 이용한 독성평가 방법의 확립하기 위하여 rat 소장을 250 μm의 slice로 만들어 William E 배지에서 배양하였다. -배양시간에 따른 Na+/K+ ATPase, NADPH oxidase, alkakine phosphatase 의 활성을 비교하여 2 hr, 6 hr에서 geniposide와 genipin의 영향을 비교하였 다. -Geniposide는 6 hr에서 10-100 μM 농도에서 Na+/K+ ATPase, alkakine phosphatase의 활성이 감소됨이 관찰되어 독성을 나타내는 것으로 확인하였다. 이에 비해 genipin은 6 hr에서 현저한 활성을 나타내지 않았다. -Genipin과 geniposide의 HLPC 분석법을 개발하였다. 내부표준물질은 methyl paraben 으로 하고 geniposide는 n-butanol로, genipin은 ethyl acetate로 추 출하여 정량분석 하였다.
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: 2차년도 가. 항생제 투여에 의한 pseudo germ-free rat model의 대사변화를 위한 대사체 연구 - Global metabolic profiling으로 내인성 대사체의 변화 확인 장내 미생물이 존재하였을 때와 존재하지 않았을 때의 내인성 대사체의 변화를 살펴보기 위하여 global metabolic profiling을 진행하였고, 변화를 보이는 대사 체들의 표준품을 이용하여 장내 미생물의 활성과 관련된 내인성 대사체 지표물 질을 확인하였다. - 담즙산, 그의 합성 전구체인 oxystrol의 정량 분석 장간순환에 의행 영향을 많이 받는 내인성 대사체인 담즙산과 그의 합성 전구 체인 oxystrol을 정량 분석하여 장내 미생물의 존재 유무에 따른 담즙산의 농 도변화를 확인하였다.
나. Pseudo germ-free germ-free rat mode의 mode의 아세트아미노펜의 대사변화 연구 - 장내 미생물의 특이 대사시스템이 약물의 독성 유발 기전 및 약동력학 특징에 미치는 영향을 확인하기 위하여, bacitracin, neomycin, streptomycin 등의 항 생제를 투여하여 장내미생물을 제거한 pseudo germ free rat (antibiotics treated group, 항생제 처리군)을 완성하고, 장내 미생물에 의한 약물의 독성기 전 및 약동력학 특징 규명을 위한 in vivo system으로 사용하고자 하였다. 대 표적인 독성 약물인 아세트아미노펜을 정상 쥐와 pseudo germ-free 쥐 (antibiotics treated group, 항생제 처리군)에 경구 투여하고 모약물 및 대사 체 약동력학적 변화를 관찰하여 장내 미생물이 아세트아미노펜의 대사 및 약동 력학적 특징에 미치는 영향, 특히 독성 유발 대사체 변화에 미치는 영향을 확인 하였다.
약물대사기반연구사업단
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다. Germ-free mouse에서의 아세트아미노펜의 대사변화 연구 - 장내 미생물의 특이 대사시스템이 약물의 독성 유발 기전 및 약동력학 특징에 미치는 영향을 확인하기 위하여, germ free mouse에 acetaminophen 200 mg/kg으로 경구 투여하고 모약물 및 대사체를 정량분석하였다. - mouse를 대조군(SPF), 정착동물(Gnotobiota), 무균동물(Germ free)의 3군 으로 나누어 acetaminophen(APAP) 200 mg/kg/10 mL 50% PEG400에 녹 인 용액을 경구투여하고 시간에 따라 채혈하여 plasma를 취하여 분석하였다.
라. 장내 미생물 대사가 ginsenoside의 체내동태에 미치는 영향 -
Rat
혈장
중
Ginsenoside
Re
및
그
대사체들을
분석하기
위하여
triple-quadrupole LC/MS/MS를 이용한 분석법을 개발하였다. Ginsenoside Re는 945 → 475, Ginsenoside Rg1은 799 → 637, Ginsenoside Rg2는 783 → 475, Ginsenoside Rh1과 F1은 637 → 475, protopanaxatriol은 475 → 391, 그리고 internl은 standard인 digoxin은 779 → 649의 ion transition을 갖는 MRM (multiple reaction monitorite) mode에서 peak를 검출하였다. Ginsenoside Re는 머무름 시간 4.5분, Ginsenoside Rg1은 4.6 분, Ginsenoside Rg2는 6.4분, Ginsenoside Rh1은 6.6분, Ginsenoside F1 은 7.0분, protopanaxatriol은 9.9분, 그리고 internl은 standard는 5.0분에서 peak이 검출되었고, 방해 peak는 전혀 나타나지 않았으며 우수한 selectivity 를 나타내었다. - 검량선
Ginsenoside Re 및 그 대사체들의 검량선은 5~1000 ng/ml의 범위
2 내에서 이루어졌으며 검량선 r 값이 0.997이상으로 우수한 직선성을 나타내었
다. - Intra- 및 inter- day validation은 3개의 농도 (10, 100, 1000 ng/ml)에 서 5 일 동안 시행하였다. intra- 및 inter- day accuracy는 91.8 ~ 114%
약물대사기반연구사업단
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이며, precision은 relative standard devidation (RSD)으로 나타내었으며 모 두 1.04 ~ 10.7% RSD이었다. - Ginsenoside Re와 그 대사체들에 대하여 stability test를 진행하였다. Shor term (2 days in deep freezer), long term (2 weeks in deep freezer), 그리고 autosampler stability (2 days in autosampler)에 대하여 test를 진 행하였다. Accuracy는 86 ~ 115%, precision은 1.02 ~ 10.2% RSD로 stability에는 이상이 없음을 확인하였다.
마. 장내 미생물 대사가 baicalin의 대사에 미치는 영향 연구 - 항생제 처리군과 대조군에서 baicalin 체내동태 비교연구 항생제 처리군과 대조군에 각각 baicalin을 50 mg/kg 용량으로 경구투여하고 혈장 내의 baicalin의 농도를 측정하였다. Baicalin을 경구투여 후 항생제 처리 군과 대조군의 baicalin 혈중농도로부터 pharmacokinetic parameter를 구하였 다. 그 결과
AUC는
대조군이 항생제 처리군보다 1.4배 높았고 Tmax도 유
의성 있게 차이가 보였다. 이 결과는 항생제 처리군이 장내미생물이 감소하여 baicalin이
baicalein으로
대사되는
양이
감소함으로써
체내로의
흡수된
baicalein의 양이 감소되었고 따라서 체내의 baicalin의 양도 감소되었다고 볼 수 있다.
: 3차년도 가. 장내미생물 대사가 esculetin 과 esculin의 약동력학에 미치는 영향 연구 - Esculetin과 esculin의 혈장 중 농도를 LC/MS/MS 방법으로 분석하고 분석법 을 validation 하여 분석법을 확립하였다. Esculetin(40 mg/kg)의 경구 투여 후, 대조군과 비교시 항생제 처리모델에서 esculetin의 AUC에는 유의성 있는 차이가 없었다. 체내동태파라미터 중, k(hr-¹), t1/2(hr)은 대조군에 비해 항생
약물대사기반연구사업단
19/ 19/29
제 처리모델에서 통계처리상 유의성 있는 차이가 나타났다. -
Esculin의
투여
후
Esculin이
대사되어
Esculetin이
검출되었다.
또한
Esculetin, Esculin 혈장에서 모두 unkown peak이 검출되었다.
나. 장내미생물 대사가 geniposide의 약동력학에 미치는 영향 연구 - LC/MS/MS를 이용한 혈장시료 중 geniposide와 genipin의 정량분석법 개발 Rat 혈장 중 geniposide와 genipin을 분석하기 위하여 triple-quadrupole LC/MS/MS를 이용한 분석법을 개발하였다. Geniposide는 분자량이 388.14로 negative ion mode에서 molecular ion m/z 433.4가 검출되었으며 MS/MS product ion spectrum에서는 m/z225.1이 주요 fragment ion으로 검출되었고 genipin은 molecular ion m/z 225.2가 검출되었으며 MS/MS product ion spectrum에서는 m/z 101.2가 주요 fragment ion으로 검출되었다. 따라서 geniposide는 m/z 433.4
225.1, genipin은 m/z 225.2
준물질인 luteolin은 m/z 285.2
101.2, 내부표
133.1, digoxin은 825.2
779.2
transition을 이용한 MRM 방법으로 peak를 검출하였다. Geiposide, Genipin 과 internal standard들은 각각의 머무름 시간2.36, 2.54, 2.79, 2.77분 부근 에서 검출되었고 위에서 기술한 검출조건에서 타 물질에 의한 영향은 없었으며 우수한 selectivity를 나타냈다. - 치자 색소 원료 중 geniposdie의 함량 측정 Geniposide geniposide
표준품 및
(Wako,
genipin의
Japan)을
함량을
이용하여
측정하였다.
치자
색소
LC/MS/MS
원료
분석
중
결과,
geniposide의 함량은 47% genipin은 1.3%로 측정되었다. - 항생제 처리 쥐에서의 geniposide의 약동력학 연구 * 정상쥐와 항생제 처리 쥐에 각각 치자 색소 원료 (300 mg/kg geniposide)를 경구 투여한 후 혈장 중의 genipin 과 geniposide 농도를 측정하였다. * Geniposide 원료를 경구투여 후 효소 처리하여 항생제 처리군과 대조군의
약물대사기반연구사업단
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genipin 혈중농도를 측정한 결과 AUC와 Cmax는 비슷한 값을 보였다. *
Geniposide
혈중농도를
측정한
결과
AUC와
Cmax는
그래프상에서
antibiotics-treated군이 높은 수치로 보이지만 통계적인 유의성은 없었다, * 정상쥐와 항생제 처리쥐에 각각 치자 색소 원료 (300mg/kg geniposide)를 경구 투여한후 24시간까지 feces를 수집하여 feces중의 geniposide와 genipin 양을 측정하였다. * Geniposide는 항생제 처리쥐에서 정상쥐보다 29배정도 높았으며 유의성 있는 차이가
나타났다.
이는
항생제
처리군이
장내미생물이
감소함으로써
geniposide가 genipin으로의 대사가 감소되었다고 볼 수 있다. Genipin은 정상 쥐에서 항생제 처리쥐보다 4배 높았고 유의성 있는 차이는 없었다. - Germ-free, gnotobiotic mouse에서 geniposide의 약동력학 연구 정상 mouse, germ-free mouse 그리고 gnotobiotic mouse에서 geniposide 를 각각 경구투여한 후 효소 처리하여 혈장 중 genipin의 농도를 측정함. Genipin의 농도는 0.5시간에서 최고 농도를 보이며 점차 감소하였다. 정상쥐에 비해 germ-free mouse와 gnotobiotic mouse에서 genipin의 혈중 농도가 높 게 나타났다.
다. Acetaminophen과 대사체의 동시 정량분석방법의 개발 - LC/MS/MS를 이용하여 혈장 및 뇨 중 아세트아미노펜 및 6가지 대사체에 대 한 분석법을 확립하였으며 본 분석법을 이용하여 아세트아미노펜에 대한 약동 력학 연구를 수행하였다. - LC/MS/MS를 이용하여 아세트아미노펜 및 6가지 대사체에 대한 분석법에 대 하여 validation을 진행하였으며 모두 기준에 만족하였다.
라. Pseudo germ-free rat model의 model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구 - 정상쥐와 항생제 처리 쥐에 각각 아세트아미노펜을 투여한 후 혈장 중 아세트
약물대사기반연구사업단
21/ 21/29
아미노펜 및 6가지 대사체의 농도를 분석한 결과 두 그룹에서 아세트아미노펜 과 아세트아미노펜 글루타치온 포합체의 AUC 값이 유의적인 차이를 보였으며, 항생제를 처리하여 만든 pseudo germ-free 그룹에서 대조군에 비하여 두 가 지물질이 더 높게 나타났다. - 뇨 중 아세트아미노펜 및 6가지 대사체의 농도를 분석한 결과 두 그룹에서 모 약물인 아세트아미노펜의 총 배설량에서 유의적인 차이를 보였으며, 아세트아미 노펜의 배설량이 pseudo germ-free 그룹이 대조군에 비하여 더 적게 나타났 다. - 모약물인 아세트아미노펜의 뇨 중 배설량은 정상대조군에 비해 pseudo germ-free 군에서 더 작게 나타나는데 이는 동일 시간 동안에 혈중에 더 많은 아세트아미노펜이 남아있음을 나타내며, 이는 혈중약물의 PK parameter인 AUC data에서 확인하였다.
마. Germ free-mouse model의 model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구 - 정상대조군(SPF), germ-free군 그리고 정착동물군(Gnotobiote) 에서의 아 세트아미노펜 및 대사체에 대한 분석을 진행했으며, 이 세군에서 아세트아미노 펜 및 그 대사체의 AUC 등 PK parameter 상의 유의적인 차이를 확인하였다.
바. 항생제 투여에 의한 pseudo germ-free rat model의 대사변화를 위한 대사체 연구 - Global metabolic profiling 분석시스템의 안정화와 분석법의 재현성 확인 QC 표본과 테스트믹스에 얻은 데이터에 대하여 다변량 분석과 추출이온 크로 마토그램 확인을 통해서 분석이 진행되는 동안 이온 강도와 머무름 시간에 유 의적인 차이가 나타나지 않을 확인하였다. - Global metabolic profiling으로 내인성 대사체의 변화 확인
약물대사기반연구사업단
22/ 22/29
항생제 3가지 (neomycin, streptomycin, bacitracin)을 경구 투여하여 확립한 pseudo germ-free rat model에서 장내 미생물이 존재하였을 때와 존재하지 않았을 때의 내인성 대사체의 변화를 살펴보기 위하여 global metabolic profiling을 진행하였고, 변화를 보이는 대사체들에 대해서 extact mass와 조각 이온에 대한 정보를 확인하여 장내 미생물의 활성과 관련된 내인성 대사체 지 표물질을 확인하였다. 아미노산, 이소플라보노이드, 리보플라빈, 담즙산 등의 내 인성 대사체들의 변화가 관찰되었다. - 담즙산, 그의 합성 전구체 및 대사체 정량 분석 장간순환에 의행 영향을 많이 받는 내인성 대사체인 담즙산을 정량 분석하여 장내 미생물의 존재 유무에 따른 담즙산의 농도변화를 확인하였다.
<제2-2세부> : 1차년도 제1-2과제에서 제공된 분변(20인)으로부터 장내 미생물 배양(500여 가지 균주 관찰됨) 배양된 100여 균주를 21가지 합성기질에 대하여 대사활성 측정 후 활성이 높은 균주 선별하였음. 활성 높은 균주의 대량배양 및 활성 재측정 후, 100여개 선별 균주의 동정하 였음. 활성 우수한 7개 균주(BL-3, BL-1, Gam-6, Gam-2, JY-6, A-44, L-BL-8)를 선발하여 21가지 합성기질에 대하여 대사활성 측정하였음. 4가지 분리 균주를 혐기성배지에서 24시간 배양, 원심분리, 초음파 처리하여 조효소액 제조하였음. 조효소액을 혼합(BL-3 : Gam-6 : JY-6 : A-44 = 1:10:10:5) 하여 microbial enzyme mix 제조하였음. 제조된 microbial enzyme mix는 분변의 활성보다 약간 대사활성을 보였음.
약물대사기반연구사업단
23/ 23/29
: 2차년도 제1-2과제에서 제공된 분변(20인) 장내미생물 배양(500여 가지 균주 관찰 됨) 배양된 70여 균주를 21가지 합성기질에 대하여 대사 활성 측정 후 활성이 높 은 균주 선별 활성 높은 균주의 대량배양 및 활성 재측정 후, 51여개 선별 균주의 동정 활성 우수한 9개 균주(PHS-BL-8, E-BL-8, K-BL-3, Y-BL-10, BH-GAM-9, JJ-BL-4, Hoon-BL-7, JY-6, A-44)를 선발하여 21가지 합성기질에 대하여 대사 활성 측정 분리 균주를 혐기성배지에서 24시간 배양, 원심분리, 초음파 처리하여 조효소 액 5-mix, 7-mix 및 9-mix 제조 제조된 microbial enzyme mix는 분변의 활성보다 높은 효소활성을 보였음. 제조된 microbial enzyme mix(7-mix)는 fecalase보다 안정하였으며, 동결 건조로 보관 시 활성 손실이 적었음. 제조된 7-mix는 천연기질 또는 추출물에 대하여 fecalase와 유사한 유전독 성을 보였음. 제조된 7-mix는 천연물 성분의 대사에도 높은 대사활성 나타내었음. 2차년도에 제조된 7-mix 약물대사 혼합효소액은 21가지 효소활성을 비교분 석한 결과, 1)fecalase와 효소활성 패턴이 비스하나 효소활성은 도리어 높고, 2)천연물에 미치는 돌연변이원성을 검색한 결과 유전독성을 나타내는 패턴이 유사하고, 3)baicalin, geniposide, wognoside, ginsenoside Rb1, 및 rutin 등에 대한 대사활성을 조사한 결과 천연물의 대사활성이 비슷하고, 4)안정성 (stability)이 높아 fecalse를 대신할 수 있을 것으로 판단됨.
약물대사기반연구사업단
24/ 24/29
5. 연구결과 고찰 및 결론 <제2-1세부> - 장내 미생물에 의한 내인성 대사체의 변화 및 약물의 pharmacokinetic 변화 를 검출하기 위하여 항생제 처리를 하여 장내 미생물을 사멸시킨 항생제 처리 쥐 (pseudo germ-free rat)을 유도하는 방법을 개발하였다. - Rat 또는 mouse 항생제 처리 모델에서 혈액 또는 뇨시료를 사용하여 GC/MS, LC/MS, LC/MS/MS 방법을 활용하여 생체시료 극미량 분석법을 개 발하고 대사체 구조의 동정에 활용하였다. 또한 장내미생물 대사체 변화를 탐 지하기 위하여 global metabolic profiling 이나 다변량 분석법은 유용한 기법 인 것으로 사료된다. - 장내 미생물에 의한 내인성 대사의 변화를 관찰하기 위하여 정상 쥐와 pseudo germ-free rat(항생제 처리 쥐)의 urine 시료를 UPLC-TOF-MS로 분석 한 후 metabolomics 연구를 이용하여 두 군에서 유의성 있는 차이를 보 이는 대사체를 검출하였으며 그 결과
tryptophan, methionine등과 같은 아미
노산 대사체들과 이소플라보노이드나 리보플라빈과 같은 영양소 대사체들, 담 즙산과 그 전구체인 oxysterol들이 장내 미생물에 의해 변화하는 것으로 관찰 되었다. 따라서 장내미생물의 활성이 내인성 물질의 대사 프로파일에 중요한 역할을 함을 확인하였다. - 항생제 처리 전 후의 rat 뇨시료에서 담즙산과 그 전구체인 oxysterol의 농도 변화 및 대사 관련 효소 활성을 비교하였다. 항생제 처리군에서 합성 전구체 중 cholesterol과 25-OH-cholesterol의 농도가 현저히 감소하였고, 담즙산 중 deoxycholic -cholestane
acid의
농도도
감소하였다.
3α,7α,12α-triol와
간
반면
담즙산
독성을
대사체인
유발한다고
5β
알려진
chenodeoxycholic acid의 농도 증가가 뚜렷이 확인되었다. 이와 관련하여 cholesterol 7α-hydroxylase (cholesterol
7α-hydroxycholesterol)의
활성은 증가하였고, 7α-dehydroxylase (cholic acid 와 7α- dehydrogenase (chenodeoxycholic acid
deoxycholic acid) lithocholic acid)의 활 약물대사기반연구사업단
25/ 25/29
성은 감소하였음을 확인하였다. 그러므로 이 결과로부터 항생물질 투여로 장내 미생물이 없는 상태에서는 cholesterol 대사경로에 있는 대사과정에 변화가 생 길 수 있음이 관찰되었으며 chenodeoxycholic acid과 같은 간 독성을 유발 할 수 있는 내인성 물질의 농도가 증가함으로써 간독성이 나타날 수 있음을 암시 해주고 있다. - Rat의 항생제 처리군과 대조군에 각각 hesperidin 40 mg/kg
또는 baicalin
50 mg/kg을 경구투여하고 혈장 농도를 분석하여 체내동태파라미터 AUC 및 Cmax를 비교하였을 때, 두 물질 모두에서 공통적으로 대조군의 AUC가 항생제 처리군에서 보다 높게 나타났다. 이 결과로부터 항생제 처리군에서 장내미생물 이 감소하여 배당체인 hesperidin, 또는 baicalin의 대사가 감소되어 결국 흡수 되는 대사체의 량이 감소되기 때문인 것으로 사료된다. 따라서 천연물, 약물, 한 약의 배당체는 장내미생물에 의해 대사에 영향을 미치므로 경구투여로 복용 시 미생물 대사가 고려되어야 함을 시사해 주고 있다. 따라서 천연물, 약물 등의 주요 성분에 대해서는 미생물에 의한 대사 및 독성시험을 안전성 평가에 고려 되어야 할 것이다. - Esculetin(40 mg/kg)의 경구 투여 후, 대조군과 비교시 항생제 처리모델에서 esculetin의
AUC에는유의성
있는
차이가
없었다.
체내동태파라미터
중,
k(hr-¹), t1/2(hr)은 대조군에 비해 항생제 처리모델에서 통계처리상 유의성 있는 차이가 나타났다. Esculin(40 mg/kg)의 경구 투여 후, 대조군과 비교시 항생제 처리 모델에서 AUC가 더 높게 측정되었다. 체내동태파라미터 중, AUCINF, AUClast, CL/F에서 유의성 있는 차이가 나타났다. 또한 Esculin이 대 사되어 Esculetin이 검출되었다. - Rat 을 사용한 대조군 및 항생제 처리군에 치자추출물 (300 mg/kg geniposide)을 투여시 AUC에 유의성 있는 차이가 나타나지 않았으나, 분변시 료를 분석한 결과 항생체 처리군에서 geniposide의 양이 대조군에 비하여 현저 히 높게 나타남으로 미생물의 의한 genposide에서 genipin으로의 대사가 억제 된 것으로 나타났다. 그러나 혈중에 geniposide가 검출되었으며 이는 장내에서 geniposide의
형태로도
흡수가
되는
것을
나타냈다.
항생제
처리군의
약물대사기반연구사업단
26/ 26/29
geniposide의 혈중 농도가 대조군에 비하여 높게 측정되었으나 PK paramater 에서 통계적인 유의성은 나타나지 않았다. 항생제 처리군에서는 미생물에 의한 genipin 생성이 거의 억제되었음에도 불구하고 정상군과 항생제 처리군에서의 genipin
프로파일이
유사하게
나타난
것은
정상군의
경우
geniposide가
genipin으로 대사된 후 genipin이 위장관에 존재하는 protein 등과 반응하여 혈중으로 흡수되지 못한 것으로 사료되었다. - 혈장과 뇨 시료중의 아세트아미노펜과 6종의 대사체를 LC-MS로 분석하는 방법을 확립하였다. 정상 쥐와 psedo germ-free rat에 200 mg/kg의 아세트 아미노펜을 경구 투여하고 혈장과 뇨 시료를 채취하여 확립된 LC-MS 분석법 으로 분석하였다. 분석 결과 APAP-Sul를 제외한 모든 포합체의 혈중 농도는 증가하는 경향을 보였으며, APAP-Sul는 혈중 농도는 감소하였고 뇨 중 배설 도 감소하는 경향을 보였다. 간에서 생성된 포합체 대사체들은 장내 미생물에 의해 분해되어 enterohapatic circulation에 의해 재 흡수되는 정도가 낮다. 장 내미생물이 없는 상태에서는 장내미생물에 의한 대사체 분해가 진행되지 않으 므로 대사체들의 재 흡수율이 높아져서 혈중 대사체들의 농도가 증가되는 경향 을 보이는 것으로 사료된다. APAP-Sul은 정상상태에서 APAP의 대사체 중 가장 높은 비율로 생성되기 때문에 APAP의 sulfate 포합반응효율은 APAP의 체내동태에 큰 영향을 줄 것으로 사료된다. Pseudo germ-free rat에서 APAP-Sul의
혈 중 농도가 감소하는 경향을 보이는 것은 장내미생물의 활성
결여로 간에서의 sulfate 포합반응 효율이 영향을 받았다는 것을 암시하며 모약 물인 APAP의 혈 중 농도 증가의 한 원인으로 사료된다. - Germ-free mouse에서의 APAP의
체내동태 연구에서는
APAP-Glc가
APAP의 대사체 중 가장 높은 비율로 생성되었고, 대사체들의 체내 동태 변화 가 enterohepatic circulation에 의한 재 흡수율의 변화 보다는 포합대사효율의 변화에 기인하는 것으로 사료된다. 이는 장내미생물의 활성 변화의 영향이 종간 차이가 있음을 시사한다. Germ-free mouse에서 관찰되었던 포합 대사체의 체내동태 변화는 gnotobiota mouse에서 정상 mouse와 유사하게 회복되는 경 향을 보였지만 완전하지 않았다. 따라서 germ-free상태에서 정상상태로의 회 복은 실험진행기간보다 더 오랜 기간이 필요하거나, 완전하지 않을 것으로 사료
약물대사기반연구사업단
27/ 27/29
된다. <제2-2세부> - 본 연구과제의 목적은 합성기질과 천연성분의 대사활성에 대한 기질 특이성을 분석하여 분변효소
(fecalase)를 대신할 수 있는 약물대사 혼합효소
(intestinal microbial enzyme mixture)를 제조하는데
있다.
- 약물대사 혼합효소의 제조는 식품 및 의약품의 대사활성 및 독성에 분변효소 가 미치는 영향을 파하기 위하여 사람으로부터 분변효소를 채취하는데 있어서 임상윤리위원회를 거치는 등 과정의 까다로움과 번거로움, 그리고 분변효소의 낮은 활성 및 쉽게 변질되는 여러 문제를 해결하기 위할 뿐만 아니라 학술적인 목적으로도 그 가치가 높다고 보인다. o
- 이에 대한 증거로 -80 C에서 냉동보관한 분변 효소액(fecalase)의 β -Glucuronidase에 대한 효소활성이 1주일 이내에 50% 이상 소실되는 것에 반해, 1차년도에 제조한 4-mix 혼합효소액의 효소활성은 1주 내에는 안정하였 으며, 2주 보관 후에도 15% 정도만 소실되었다. - 따라서, 약물대사 혼합효소를 제조하기 위하여 먼저 분변에 존재하는 다양한 미생물로부터 분변활성을 대표할 수 있는 균주들을 분리, 대량배양, 및 이로부 터 조효소액을 얻는 것이 필요하다. - 따라서, 1, 2차년도 연구에서 사람의 신선한 분변(20인)으로부터 1,000 여종 이상의 균주를 분리하고, 이들을 21가지의 효소활성을 측정하고, 효소활성이 특이하게 보이는 170여개의 균주를 선별하였다. - 분리된 균주는 그람 염색, 혐기/호기적 배양조건 및 16S rRNA gene partial sequence 분석을 하고, 이를 NCBI Blast search로 비교 분석하여 동정하고, 이들의 21가지 효소활성을 측정한 후 대표적인 균주들을 선별하였다.
약물대사기반연구사업단
28/ 28/29
- 균주로부터 조효소액의 제조조건 확립, 안전성 및 보관방법에 의한 효소활성 의 변화 등을 검토한 결과, 균주액을 초음파로 7분 처리한 후 여과하고, 이를 동결건조한 경우 효소활성이 가장 안정된 것을 파악하였다. - 선별균주들을 4-mix, 5-mix, 7-mix, 9-mix등 다양한 조합의 약물대사 혼 합효소액을 제조하고, 이들의 효소활성을 분변효소(fecalase)의 효소활성과 패 턴을 비교하였다.
약물대사기반연구사업단
29/ 29/29
약물대사기반연구사업단