3-2세부과제 by drugmetabol ism

장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단분석 기술 연구

2009~2011. / 3중단위 2세부과제

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3-2세부과제

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목

차

1. 최종 연구개발 목표 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·3 1) 세부과제의 목표 ··································································································· 3 2) 세부과제의 목표달성 ······································································· 16 3) 국내 외 기술개발 현황 ····································································· 17

2. 연구개발 내용 및 방법 ··························································· 24

3. 연구개발 결과 ·············································································· 30

4. 연구결과 고찰 및 결론 ························································· 47

5. 참고문헌 ·························································································· 49

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1. 최종 연구개발 목표

가. 장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단 분석 기술 연구 ① 연구배경 ○

대규모 메타지놈 분석기술의 출현으로 인간미생물체에 대한 국제적 관심 증폭 - 건강한 성인의 경우 장내에 서식하는 미생물의 양은 한사람의 전체 세포수 보다 약 10배

가량 많으며, 인체의 세포 분화, 생리조절, 면역 활성 및 소화

에도 깊이 관여하고 있음. 최근 분석 기술의 발달로 이들 미생물의 분포와 역할이 상당부분 밝혀지긴 하였지만 아직까지 이들 미생물에 관한 연구는 많 이 부족한 실정임. - 2003년 휴먼게놈이 완전 해독되고, 당초 예상되었던 유전자의 수가 실제로 는 1/5에 불과함으로 밝혀짐에 따라서 인간의 ‘공생자’ 로서의 미생물에 대한 연구는 더욱 그 중요성이 강조되게 되었음. - 휴먼게놈 해독 후에 미국의 NIH에서는 최신의 기술들을 이용하여 장내 미 생물의 특성을 밝히고 인간의 질병과 건강에 대한 그들의 역할을 규명하기 위해서 Human Microbiome Project (HMP)를 시작하였음. - HMP에서는 기존에 한 미생물의 게놈을 분석하기 위해서 사용하던 게놈 sequencing 기술뿐 아니라, 미생물 생태의 광범위한 조사를 가능하게 하는 메타지노믹스 (metagenomics) 기술을 이용하여 실제의 자연에서 추출된 미 생물 생태의 다양한 유전물질들을 있는 그대로 분석하고 있음. - 또한 HMP에서는 ‘인간의 장내에 핵심적인 미생물이 존재 하는가?’ 하는 물음과 ‘장내 미생물의 변화가 인간의 건강에 미치는 영향은 무엇인가?’ 등을 밝히는데 그 목적을 두고 있으며, 약 1000종의 미생물 게놈을 완전 해 독, 인간 전체의 유전자보다 10배나 많은 200,000개의 유전자를 발굴하고 있음. 이러한 연구를 위하여 HMP는 NIH로부터 115백만 달러의 지원을 받 약물대사기반연구사업단

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고 있음. - 유럽의 경우에서도 장내 미생물과 인간과의 관계를 밝히기 위한 다양한 시 도가 진행 중임. 프랑스, 독일, 영국, 스페인, 이탈리아, 덴마크, 네덜란드 등 의

7개

나라가

컨소시엄을

구성하여

3000만

달러의

사업비로

Metagenomics of the Human Intestinal Tract (MetaHIT)을 시작하였음. - 이들의 사업은 장내 미생물과 비만 그리고 장 염증질환과의 연관관계를 밝 히는데 초점을 맞추고 있으며 사업의 결과로서 이미 비만인과 정상인의 장내 미생물 구성에서의 커다란 차이점을 찾아내었음. - 장내에서 일어나는 염증반응은 장내 미생물과 밀접한 연관이 있기 때문에 MetaHIT은 장내 대사물질들이 염증성 장 질환 환자들이 복용하는 치료제의 효과에 끼치는 영향에 대해서도 주목하고 있음. - 장내 미생물이 인간에 미치는 영향을 확인하기 위해서 MetaHIT는 메타지 노믹스 기술과 미생물 게놈해독기술을 이용하고 있으며, 장내 미생물의 차이 를 규명하기 위한 고집적 DNA chip과 새로운 형태의 고효율 기법들을 개발 하고 있음. - 이들 유럽 연합의 궁극적인 목표는 장내 미생물의 조성을 인간의 건강이 이 로운 방향으로 조절하는 방법을 발견하여 wellbeing의 시대를 만들어 가는 데 있으며, 미생물과 건강이라는 중요한 영역에서 유럽을 선두적인 위치로 끌어올리는 것임. - 일본의 경우에서도 2007년에 Human Metagenome Consortium, Japan (HMGJ)을 구성하여 16개의 주요한 장내 미생물의 게놈을 해독하고 있으며 중국 또한 유럽과의 공동사업과 함께 Meta-GUT Project를 진행하고 있음. - 인체 미생물체 (장내, 피부, 점막 등) 연구는 전통적으로 배양법에 의존하여 진행되어 왔지만 자연을 흉내 낸 가상의 환경에서 자라지 않는 미생물이 99%로 배양법만으로는 인체 미생물의 다양성을 정확하게 밝힐 수 없었음. - 최근 20여 년 동안 분자 생물학적 분석기술의 발달로 인하여 인체에 서식하 는 미배양 미생물의 다양성을 비교적 정확하게 확인할 수 있는 여러 기법들 이 등장하였음. 이들 분자생물학적 기법들은 대부분 PCR에 의존적인 방법으

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로서 인체에 존재하는 소량 미생물의 유전자도 증폭시켜 분석할 수 있는 반 면 증폭 과정에서 오는 왜곡현상으로 실제 미생물 다양성이 정확하게 표현되 지 못하는 단점이 있음. - PCR 비 의존적인 방법으로는 미생물의 특정 유전자 혹은 몇십-몇백 base 길이의 뉴클레오타이드만을 혼성화 (hybridization) 시켜 미생물의 다양성을 확인하는 DNA chip이 있음. - DNA chip은 고집적으로 배열된 유전정보를 바탕으로 한 번에 수백 수천종 의 미생물을 확인 할 수 있는 가장 강력한 기술 중의 하나지만 DNA chip조 차도 환경에 미량으로 존재하는 미생물의 유전정보를 확인 할 수가 없고, PCR이나 여타 다른 종류의 증폭 과정을 피하기는 힘들기 때문에 대규모로 진행되는 최근의 인체 미생물연구를 수행하기 위해서는 좀 더 진보된 형태의 DNA chip 기술 개발이 필요함.

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<기존의 인간 미생물체 분석기술의 종류> 기술명

도표

기술의 원리

분류, 동정을 위한 기술 적용

형광이 부착된 특이 probe를 시료의 생물종이 혼합된 환경시료에서의 FISH

생물체에 혼성화시켜 특정 분류군만을 난배양성 생물종의 분류군 별 검 형광현미경 하에서 검출

출 및 동정

형광 표지된 primer를 이용하여 분류 TRFLP

지표유전자의 증폭, 제한효소처리로 종 에 특이적인 형광단편을 제조

혼합 시료 내 각 생물 분류군의 동정 및 종조성의 정량적 분석

Real

특이적인 PCR primer를 제작하여 시 식품, 의료, 환경시료 등에서 특정

Time

료내의 특정 생물군의 량을 PCR 증폭 분류군을 실시간으로 정확히 동정

PCR

과 실시간으로 검출로 정확히 정량

분류지표유전자의 증폭 후 gradient가 DGGE

있는 gel상에서 전기영동을 시도하여 melting point에 따라 PCR product를 구분

RepPCR

게놈 상에 반복 염기서열 (repetitive sequence)을 특이적으로 PCR 증폭하 는 핑거프린팅 기법 분류지표유전자의 증폭 후 gradient가

DHPLC

있는

HPLC

column에서

chromatography를 수행하여 melting point에 따른 PCR product를 구분 분류지표유전자의 길이는 생물마다 차

SSCP

이를 보이므로 PCR 증폭후 product의 길이차이를 이용하여 특정 분류군 확인

하고 정량적으로 분석

다양한 생물종이 존재하는 각종 시료에서 각 분류군, 또는 종 수준 에서의 동정 및 정량적 분포 분석

생물 종 간 신속한 비교를 통한 분류 및 특정 분류군 동정

다양한 생물종이 존재하는 각종 시료에서 각 분류군, 또는 종 수준 에서의 동정 및 정량적 분포 분석

핑거프린트의 생성을 이용한 생물 종 간 분류 및 동정

oligomer

현재 최첨단 기술, High-throughput:

및 cDNA

최고 10만개의

microarar

반응으로 전체 생태계 분석 가능, 16S 법

probe에 대한 한번의 hybridization 기반의 미생물 검출

rDNA외 기능 유전자 분석 가능 약물대사기반연구사업단

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② 연구목적

○

메타지놈 microarray 개발을 통한 high-throughput 분석기술개발 - 하나의 유전자의 발굴로 새로운 고효율의 내열성효소, 난분해물질 분해효 소, methane 생성효소 등을 만들어 낼 수 있기 때문에 GPM과는 반대로 여러 샘플에서 미생물이나 효용성이 뛰어난 유전자를 찾아내는 것은 아직 까지도 산업계에서 중요한 이슈중의 하나임. - 하지만 이전의 올리고머를 바탕으로 한 마이크로어레이들은 그 민감성이 매우 낮기 때문에 PCR과 같은 증폭과정이 반드시 필요함. 또한 fosmid BAC clone library microarray 등에서도 상황은 마찬가지임. - 이에 메타지놈 microarray를 제작하여 그 검출 효용을 높이는 방법으로 서 multi-linker probe와 photobiotin-TSA 방법을 개발하여 낮은 수준 의 유전자 후보물질을 검출할 수 있는 기술을 개발 하여 새로운 효소 후 보물질의 발굴에 사용하려 함. - 또한 이 기술은 인체에 다수 존재하는 혹은 중요한 역할을 하는 미생물 의 유전정보들로도 프로브를 만들 수 있고, 대량 샘플에서 이들 미생물의 정량적 분석이 가능하기 때문에 기존의 정량 PCR보다고 그 효용이 훨씬 크다고 할 수 있음.

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<신호 증폭기술을 이용한 미생물 및 유전자 탐색>

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○

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메타지놈-메타지놈 혼성화를 이용한 질병 및 비질병 샘플 분석 - 인체 미생물 적용 가능성을 살피기 위해 장내 미생물을 대상으로 기초 실험을 수행하였음. 사람의 장내는 무균인 상태로 태어나서 이유식을 할 정도의 나이가 되면 성인의 장내 미생물 균총과 유사한 모습을 보였음. 건강한 사람의 경우 장내 미생물 다양성의 변화는 시간이 지나도 거의 변 화하지 않음. - 인체 미생물의 다양성을 확인하는 방법으로서의 GPM이 각 미생물의 조 성이 어떻게 변화하는 지를 살피는 것이라면 메타지놈-메타지놈 chip은 각 시간별로 장내의 메타지놈을 추출하여 개인의 장내 균총 변화를 거시 적으로 관찰하여 건강의 이상을 확인할 수 있음. - 본 연구팀은 8명의 사람에게서 시간별로 추출한 메타지놈이 개인에 특이 적이며 시간이 지나도 거의 변화하지 않음을 확인함. - 이 기술은 정상인의 장내 균총과 질병인의 메타지놈을 비교함으로서 둘 간의 차이가 얼마나 있는지 각 질병별로는 어떤 특색으로 미생물의 군집 이 유지 되는지 등을 확인할 수 있는 도구임.

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<메타지놈-메타지놈 혼성화 분석의 활용>

나. 대단위 염기서열 분석법 (pyrosequencing)을 이용한 한국인 장내 박테리오 파지 군집 분석 ① 연구배경

○

장내 미생물 연구의 필요성

인체 내에는 인간의 세포의 10 배 이상의 미생물(약 100조)이 약 1000종 이 상 서식하고 있으며, 전체 개체의 수와 유전체 규모만 하여도 인간의 것에 버 금갈 정도로 많은 양을 보유하고 있음. 장내 미생물의 생태계와 다양성은 아직까지 명확하게 밝혀져 있지 않지만, 사 람의 건강과 질병에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려짐. 장내 미생물은 약물대사기반연구사업단

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병원성 세균의 침범 억제, 표피세포의 손상 방지, 지방 축적 조절, 소화하지 못 하는 영양분을 분해하여 흡수 가능한 형태로 전환, 비타민 K의 생산과 철분 흡 수, 장 점막의 면역 증강 및 담즙산 대사에서 인간 마이크로바이옴의 역할에서 알 수 있듯이 인체의 대사 과정에도 직접적인 역할을 하고 있음 (EMBO J. 25:1419, 2006; Nature 439:484, 2006). 장내미생물은 인체의 다양한 범위의 질병과 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀 짐. 장염(inflammatory vowel disease) 이나 대장암(colon cancer)과 같은 대장 내의 각종 질병 외에도 자폐증(autism), 아토피(atopy), 비만 등과 같은 질병들까지 장내 미생물과 연관성이 제안되면서 그 연구 범위가 확대되고 있 음. 장내 미생물과 각종 질병과의 연관 관계는 환자의 대장과 정상인의 대장의 미생물 분포의 차이를 관찰하면서 밝혀지게 되었음. 이러한 인체 미생물체(human microbiome)에 대한 심층적인 연구가 필요하게 되었으며, 이때 가장 효과적이고 강력한 연구방법으로서 미생물체가 가지고 있 는 유전체 (metagenomes)을 직접 분석하고 해석하는 metagenomics 방법이 제안되었음. 최근 인체의 장내 미생물체 (human gut microbiome) 분석을 위해 균주의 분 리, 배양 및 동정을 거치지 않고 시료로부터 직접 환경유전체를 추출하여 분석 하는 대량의 메타지놈 연구 방법이 시도 되었으며 이로부터 다양한 정보가 얻 어지고 있음 (Science 308:1635, 2005; Science 312:1355, 2006). Metagenomics기법을 이용하여 인체 미생물체(human microbiome)를 이해한 다면 몸 안 또는 표면에 살고 있는 미생물들에 의해 섭취되는 영양분의 대사작 용 기작 및 미생물에 의해 생산되는 신약후보물질 발견과 같은 중요한 과학적 단서 얻을 수 있고 더 나아가 비만, 암, 또는 비정상적인 면역반응에 의해 야기 되는 천식 (asthma), inflammatory bowel diseases (IBD)와 같은 복잡한 질 환을 이해하는데도 큰 도움이 될 것으로 예상함. 장내 미생물 균총은 인종, 민족, 지역, 가계, 생활습관, 섭식양태 등에 따라 달 리 존재하며 나이, 건강상태, 영양조건 등에 따라 변화가 많은 것으로 밝혀져 있음. 한국인의 식생활 습관은 다른 국가의 사람들 것과 차이를 보이고 있음. 예를 들어, 한국인은 짜고 매운 음식을 선호하고 젓갈과 장류와 같은 발효음식 의 섭취율이 높아서 서구의 여러 나라에 비해 위장관 질환의 발병률이 높다는 특징이 있음. 이와 같은 식생활의 차이는 결국 소화관 내에 분포하는 장내세균

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총의 분포도 외국인들과는 차이를 보일 것으로 예상되지만 현재까지 한국인 장 내미생물의 조성을 광범위하게 조사한 연구는 없음.

○

바이러스 연구의 필요성

바이러스는 자연에서 존재하는 모든 생물체를 감염시킬 수 있으며, 생물이 존재 감염 하는 거의 모든 곳에 함께 존재할 수 있음. 뿐만 아니라 그 수와 다양성도 엄청난 것으로 밝혀지고 있음. 실제로 해양이나 토양의 경우 박테리아의 수보다 많이 존 재하는 것으로 추정되고 있으며 그 다양성도 어마어마한 것으로 알려지고 있음. 예를 들어 해양에 존재하는 바이러스의 양은 1 ml 당 최대 109개 까지 보고되고 있으며 해양 세균의 밀도보다 5-100배 큰 것으로 보고되고 있음. 바이러스는 숙주인 세균이나 조류(algae) 등의 세포를 파괴시켜서 생태계에 막 대한 영향을 영향 미치고 있음. 뿐만 아니라 바이러스는 세포의 유전자를 삽입, 변형시 키며, 다른 개체에 전달할 수 있기 때문에 다른 생물체의 진화에도 큰 영향을 미 치는 것으로 알려짐. 실제로 병원성을 일으키는 exotoxin을 바이러스가 유래시키거나 horizontal gene transfer의 중요한 원인으로 알려져 있음. 많은 수의 세균의 genome에 바 이러스의 유전자가 prophage 형태로 존재하고 있으며 특정한 조건에서 바이러 스의 형태로 세포 밖으로 배출되는 것이 보고되고 있음. 바이러스는 숙주의 다양한 유전자를 포함하거나 스스로 다양하고 특이한 유전자 를 가지고 있음. 또한 이러한 바이러스의 유전자는 변이속도가 매우 빠르기 때문 에 바이러스의 유전적 다양성은 무궁무진함. 무궁무진함 최근 환경에 다량으로 존재하는 바이러스를 연구하기 위하여 자연환경의 바이러 스를 세균 등과 분리하고 이들의 DNA와 RNA를 추출하여 바이러스 다양성을 조 사하는 연구가 진행되어 Science, Nature 등 주요 저널에 발표됨. 배양을 통한 바이러스 연구의 한계를 극복하기 위해서 개발된 방법으로 해양, 토 양 등에 존재하는 배양되지 않은 바이러스의 다양성을 밝혀내고 있으며 이러한 바이러스의 유전적 다양성이 매우 큰 것을 발견하였음. 예를 들어 바다에서 분석 된 바이러스 유래 유전정보의 60-90%가 아직까지 전혀 알려지지 않은 것으로 보고됨. 이러한 바이러스 메타지놈을 일컬어 Virome 또는 Viriome이라고 부르 Viriome

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며 새로운 유전자원의 보고로 큰 주목을 받고 있음 (Nature, Science, PNAS 등 대표 저널에 최근 3-4년간 계속적으로 보고되고 있음) 하지만 아직까지 이러한 기술을 국내에서 개발하려는 노력은 거의 이루어지지 않 았음. 았음. 메타지놈을 이용한 유용 물질 분리 방법은 많이 이용되고 있지만 바이러스 유래 메타지놈 연구는 수행되고 있지 않으며 바이러스 유전자원의 무궁무진함을 고려할 때 바이러스 메타지놈을 이용하여 많은 유용물질을 발굴할 수 있을 것임. 또한 기존의 방법들은 특정한 primer나 probe를 이용하거나, 무작위로 발현시킨 효소를 탐색하는 방법을 사용하였으나 이러한 방법은 새로운 유전자원을 찾기가 힘들거나, 시간과 노력이 많이 드는 단점을 가지고 있음. 본 연구에서는 대규모 서열 분석 방법을 통하여 바이러스 메타지놈을 분석하고 여기에서 얻어진 정보를 분석 이용하고자 함. 최근 들어 대규모 서열 분석 기술이 발전함에 따라서 메타지놈에서 직접 서열을 읽어 분석하는 방법이 점차로 각광을 받고 있음. 직접적으로 서열을 분석하는 방 법은 서열 분석 비용이 저렴해짐에 따라 기존의 방법에 비해서 시간과 노력을 줄 일 수 있고 지금까지 알려지지 않은 새로운 물질을 개발할 수 있음. 이러한 무작 위 서열 분석 방법의 효율을 높이기 위해서는 새롭고 유용한 유전자 풀을 분석하 는 것이 관건이라고 할 수 있는데 바이러스 메타지놈은 높은 진화적 변화로 인해 신규성이 매우 높아 가장 알맞은 신규 메타지놈 분석대상임. 분석대상임. 바이러스는 박테리아가 가지고 있지 못하는 특수한 유전자들을 가지고 있으며 여 기 생산되는 단백질들은 새로운 특성을 가지고 있는 것으로 알려져 있음. 실제로 많은 수의 상업적으로 이용되는 효소들이 바이러스에서 유래되고 있음. Reverse 유래 transcriptase, DNA or RNA polymerase, ligase, promoter, holin, lysin, lysozyme, helicase, RNase H 등 분자생물학에 이용되고 있는 많은 효소들에 virus 유래 효소들이 사용되고 있으며 바이러스에 유래 효소의 수는 매우 다양하 여 유전공학 관련 산업에 큰 응용가능성을 가지고 있음. 각종 효소 이외에도 M13, λ phage 등은 직접 transfection을 통한 cloning에 이용되고 있음. 예를 들어 최근에 널리 쓰이고 있는 phi29 DNA polymerase와 같은 경우도 Bacillus subtilis를 감염시키는 phi29 라는 파지에서 분리된 DNA polymerase 로서 whole genome amplification에 가장 많이 쓰이고 있는 아주

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유용한 효소임. Reverse transcriptase와 같은 경우도 retrovirus에서 분리되어 박테리아에서는 볼 수 없는 전혀 새로운 형식의 효소 작용을 매개하는 대표적인 예라고 할 수 있음. 바이러스를 이용한 유해 세균의 조절 연구도 많은 관심을 받고 있는데, 주로 파 지를 이용한 항생제 내성 세균의 치료에 대한 연구가 특히 새롭게 주목을 받고 있음. 파지가 세균을 용해시키는 과정에 있어서 결정적 효소 역할을 하는 holin과 lysin 등의 유전자를 확보하고 항생제 내성 세균 등의 치료에 이용할 이용 수 있을 것 음. 바이러스는 해양 동식물을 감염시키는 세균의 병원성의 원인 유전자를 제공 하거나, 직접적으로 질병을 매개하기 때문에 바이러스의 유전 정보는 질병의 원 인을 밝혀내는데 도움을 줄 수 있음. 바이러스의 빠른 돌연변이율과 다양성을 고려할 때 아직까지 거의 밝혀지지 않은 바이러스 관련 유전자원의 이용가능성은 무궁무진함. 이러한 바이러스 유래 단백 질을 이용하여 새로운 응용물질을 개발하게 되면 현재 외국의 기업들이 차지하고 개발 있는 분자생물학 관련 시장에서 새로운 경쟁력을 가질 수 있을 것임. 현재 국내에서도 많은 시약 회사들이 효소관련 제품들을 생산하고 있으나 주로 특허기간이 지나거나 특허에 걸려 있지 않은 효소들만을 생산하고 기존의 외국 업체들이 중요한 효소들에 대한 특허와 원천기술을 가지고 있기 때문에 수익을 내는데 많은 어려움을 겪고 있는 실정임. 바이러스 메타지놈 확보와 분석을 통하 여 이러한 한계를 극복하고 응용 물질을 탐색할 수 있다면 국내의 시약 회사들이 국내 내수 시장이나 수출 시장을 개척하는데 많은 도움을 줄 수 있을 것임. 국내의 미생물학 연구는 주로 세균에 집중되어 있으며 메타지놈을 스크리닝하는 집중 기술 또한 주로 세균에서 얻어진 유전자원을 바탕으로 하고 있음. 유전자원 확보 대상으로 바이러스는 진화적 다양성에 의한 신규성이 높아 상당한 장점을 가지고 있으며 새로운 미생물학 연구의 원천이 될 수 있음. 뿐만 아니라 세균에 집중되 어 있는 국내 미생물학 연구에 있어서 새로운 분야를 제시할 제시 수 있을 것으로 생 각됨 현재 국내의 생물산업은 외국에서 개발된 유전자원 (효소 및 종균)을 수입해 이 를 개량하는 수준으로 원천 기술과 특허가 부족하여 고부가가치 제품의 세계시장 점유가 어려운 상황임. 이를 타개하기 위해서 국내 고유의 유용 바이러스 유래

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생물자원 및 유전자원을 탐색, 확보하고 이런 소재에서 정밀화학소재 (효소등) 및 의약소재(항생물질, 재조합 의약품) 등을 발굴한다면, 국내 생물산업을 선진 국 수준으로 끌어올리는데 기여할 수 있을 것임.

② 연구목적 장내에

존재하는

박테리오파지는

장내미생물

군집에서

상당한

선택압

(selective pressure)으로 작용하는 것으로 알려져 있음. 그 결과 장내 박테리 오파지는 장내에서 미생물 환경의 자기 조절 작용에 있어서 중요한 역할을 하 고, 장내미생물 다양성 유지에 기여하는 것으로 생각하고 있음(Letarov

등,

2009). 그러나 아직까지 박테리오파지와 장내미생물군과의 관계, 더 나아가서 는 장내박테리오파지와 건강에 대한 관계에 대한 연구는 거의 없는 상태임. 또 한 장내박테리오파지의 메타지놈 분석 연구도 국내외적으로 거의 없는 상태임.

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2) 세부과제의 목표달성도

연구개발

목표

추진내용

진행정도

달성도

50종 이상의 장내 미생물 한국인 장내 메타 51개의 한국인 장내 메타 메타지놈을 획득하여 DNA 지놈 확보 및 순수 지놈을 확보하였으며, 메타 칩 제작을 위한 순수-균질 -균질화 기법 정 지놈의 순수-균질화 기법 화 기법을 확립

립

100%

을 확립하였음

50종 이상의 메타지놈을 직 메타지놈 칩의 제 51개의 한국인 장내 메타 접 프린팅한 DNA 칩 (메타 작

지놈과 2개의 환경샘플을

지놈 어레이)을 100장 이상

이용하여

제작

칩을 제작하였음

메타지놈 chip 상에서 여러 주요 장내 미생물 미생물 그룹을 한 번에 검 군 특이 probe 개 출할 수 있는 새로운 형태 발 의

링커

프로브

Q-dot

(linker

신규

메타지놈-메타지놈

기술 개발

통하여 동일 숙주의 시간에 미생물 따른 장내 미생물 군집변이 추적 를 추적

을 미치는 장내 박테리오파 지의 메타지놈을 분석

Faecalibacterium, Roseburia

와

그

연관

100%

probe를

이용하여

현재

30배 이상의 신호 증폭 기

100%

이용

군집변이 수집된 메타지놈 DNA칩 을 이용하여 장내의 미생 물군집이 개인마다 고유한 100% 지, 시간의 변화에 대하여 안정한지를 확인하였음.

장내 박테리오파지 분리 기술 개발 확 립하고, 장내 박테 리오파지 군집 분 석

biotin-TSA기법과 linker

술을 개발하였음

반응을 메타지놈칩

장내미생물의 생태에 영향

Prevotella,

음

DNA 수 있는 신호 증폭

chip 신호증폭 기술을 개발

100%

linker probe를 개발하였

바이오틴-TSA, 검출 효용을 높일 등의

Bacteroides,

DNA

group을 검출할 수 있는

probe)를 10종 이상 개발 포토

메타지놈

분 변 시 료 로 부 터 virus-like particle을 분 리, 농축하고, DNA를 분석 하는 기술을 확립하였으며, 100% 이를 통해 한국인 장내 박 테리오파지 군집을 분석하 였음.

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3) 국내 외 기술개발 현황 가. ○

장내미생물

신속검출

및

정량을

위한

첨단

분석

기술

연구

국내 DNA chip 연구 현황 - 우리나라의 바이오칩 시장은 (주)올메디쿠스, (주)인포피아 (주)아이센스, 바이오포커스 등 몇 군데의 벤처기업에서 제품을 출시하고 있는 상태로 최근 매출이 상승하고 있음. - 최근에는 삼성전자가 차세대 성장엔진으로 소형 반도체 하나로 사람의 건강 상태를 점검할 수 있는 '바이오칩'을 개발 중에 있다며 발표, 대기업의 바이 오칩 진출이 심화될 조짐을 보이고 있음. - 현재 국내 바이오센서 기업들이 주로 관심을 가지고 있는 분야는 90% 이상 이 의료용 바이오칩으로, 아직 식품분석용과 환경용 및 그밖에 다른 분야의 바이오센서에 대한 관심 정도가 상대적으로 낮은 상태임. - 한편, 국내 바이오칩 시장규모는 2001년에 약 50억 원, 2003년에는 약 100억 원 정도의 시장이 형성된 것으로 분석되었으며 2007년 현재에는 500억의 시장규모를 가지고 있는 것으로 나타났음. - 우리나라는 약18.5%의 성장률을 보여 2010년에는 700억 규모로의 성장이 예상됨. - 기존의 DNA chip의 단점인 낮은 특이성과 민감성을 극복하고 환경에 존재 하는 미생물의 특정 유전자를 mining하여 유용자원으로 발굴할 수 있는 새 로운 형태의 DNA chip의 개발은 현재의 미생물 대량분석기술 요구에 부흥 하는 것뿐만 아니라 기존 DNA chip의 영역을 대체함으로서 새로운 부가가 치를 창출할 수 있으리라 예상되어짐.

약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

○

18/ 18/53

국제적 DNA chip 연구 현황 - 전 세계의 바이오칩 관련 시장은 평균 32%의 신장률을 기록하며 성장해 오 고 있다. 2007년 전 세계의 바이오칩 시장규모는 29억 달러이며, 미국, 일 본, 유럽이 (미국 37%, 유럽 42%, 일본 11%) 세계 시장의 90% 이상을 점 유하고 있으며 우리나라도 5000만 달러 규모의 시장을 가지고 있는 것으로 조사되어있음. - 그 중 미국은 전 세계의 바이오칩 시장에서 가장 큰 규모를 차지하는 시장 이며, 미국 내 바이오칩 관련 제품과 서비스는 매년 20%의 성장을 하여 2008년에는 총 21억불에 이를 것으로 예상되고 있음. - 이 가운데 8억 7천만불은 microarray를 이용한 바이오칩이 차지하고 있으 며, instrument, reagent, consumable software service가 나머지 약 12억 불 시장을 차지하고 있다. 시장을 주도하는 구심력은 빠른 변화와 성장을 보 이고

있는

protein

analysis와

gene

expression을

이용하는

durg

discovery, epidemiological research임. - 기술적인 측면에서는 보다 작고 고밀도의 microarray, protein chip, laboratory chip을 만드는 벽을 점차 허물어 가고 있음. 이러한 시장에서 기 업들은 살아남기 위하여 끊임없는 연구 개발을 통하여 특허분쟁과 같은 법적 분쟁과 sales & marketing이라는 다각적인 분야에서 성장해 나가고 있음. - Affimetrix 사가 이끌고 있는 미국 바이오칩 산업은 선발 기업이 가지고 있 는 핵심 기술을 후발 기업에 판매, 양도하며 성장해 가고 있음. 이외에도 Amersham Biosciences, Applera, Agilent Technologies, PerkinElmer Life

and

Analytical

Sciences,

Beckman

Coulter,

Ciphergen

Biosystems, Caliper life science 사 등이 미국 바이오칩 시장의 64%를 차지하고 있음.

약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

19/ 19/53

<바이오칩 시장의 성장률>

세계 국내

구분 금액 (백만$) 금액 (백만$)

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2013

1,354

1,774

2,292

2,921

3,206

3,527

3,911

4,377

19.0

30.0

50.0

70.0

4,377

[성장률:32.9%] 출처: 바이오칩 최근 기술이슈 및 시장동향. 한국 보건산업 진흥원 2005.2. 바이오칩/바이오센서 시장 및 기술 동향. 전자통신연구원 2006.6.

약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

20/ 20/53

<국내외 장내 미생물 탐색용 DNA칩 연구의 주요 현황 > 연구수행 기관 National center for toxicological research.(USAFDA) PI: Carl E. Cerniglia

(주)바이오니아

연구개발의 내용 100여종에 이르는 장내미생물을 탐지할 수 있는 microarray probe를 제작하여 각 probe별 specificity등을 조사하여 국제 저명 학술지에 게재.

장내미생물 중 몇 종을 탐지할 수 있는 DNA칩을 연구

연구개발성과의 활용현황 16S rDNA를 기반으로한 probe제작으로 민감도와 종 특이성이 낮고, PCR에 의존한 시스템이어서 정량적인 연구결과를 얻지 못함. 특허 출원되었으나, 민감도와 종 특이성이 낮고, PCR에 의존한 시스템이어서 정량적인 연구결과를 얻지 못함. 종수준의 특이성을 아직

폐수에 존재하는 몇 종의

확보하지 못하였으나, 최근

광주과학기술원

미생물을 탐지할 수 있는

여러 특허 및 Analytical

구만복 교수팀

random-amplified genome칩

Chemistry등 국제 저명

개발 완료

학술지에 논문게재하여

바이오테러에 이용될 수 있는

높은 기술을 인정받음. 16S rDNA를 기반으로한

포항공대 차형준 교수팀

병원성 미생물 탐지용 DNA칩을 probe제작으로 민감도와 개발 미생물 게놈을 직접 probe로

종 특이성이 낮음.

활용하여 150여 종의 유산균

게놈 혼성화 반응기반

분석 칩을 개발하여 실제

DNA칩으로서, 민감도와

경희대학교

김치내 미생물을 모니터링

종 특이성이 매우 높고,

배진우 교수팀

(AEM게재), 종 이하 수준의

PCR에 의존하지 않아

미생물을 탐지하기 위해

매우 정량적인 결과를

SSH기술을 적용한 DNA칩

얻음.

개발완료 (NAR게재)

약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

21/ 21/53

나. 대단위 염기서열 분석법 (pyrosequencing)을 이용한 한국인 장내 박테리오 파지 군집 분석

- 장내 바이러스 다양성 연구의 국내 외 연구동향 및 환경변화 바이러스는 지구생태계에서 가장 많은 수를 차지하고 있는 생물학적 존재로 알려져 있으며 최근 메타지놈 분석 기술의 발달로 인하여 2000년대 초반부터 바이러스 메타지놈 연구가 선진국을 중심으로 행해져 오고 있음. 2002년에 해 수의 일부 바이러스를 대상으로 한 최초의 바이러스 메타지놈 라이브러리 구축 및 분석 논문이 미국의 국립 과학 협회지(PNAS)에 보고되었음 (Breitbart et

al., Proc Natl Acad Sci, 99:14250-5, 2002). 뒤를 이어 사람의 분변에서 바이러스 메타지놈 분석 논문이 발표되었으며 (Breitbart et al., J Bac, 185:6220-3, 2003), DNA 바이러스 외에도 사람의 분변의 RNA virus의 메 타지놈 연구가 탑 저널에 보고되었음 (Zhang et al., PLoS Biol 4:e3, 2006). 이후, 유아 분변에서 바이러스 메타지놈 분석 논문이 발표되었음 (Breitbart et

al., Res Microbiol, 159(5):367-73, 2008). 장내 바이러스 메타지놈 연구는 pathogenic RNA viruses와 연관성을 밝히기 위해 적용되기도 함. diarrhea 유아 장내 RNA viruses와의 연관성을 밝힌 논문이 발표되었으며 (Finkbeiner et al. PLoS Pathog. 2008 Feb 29;4(2):e1000011), 소아마비 (acute flaccid paralysis)의 장내 분석 또한 이뤄짐 (Victoria et al. J Bac, 2009 May;83(9):4642-51). 하지만, 현재까지 보고된 연구는 적은 수의 대상과 sequence만을 통해 분석한 것으로, 그 한계가 존재함. 최근 분자 생태학적 기술의 발달과 차세대 sequencing 기술의 도입으로 장내 미생물의 다양성과 바이러스 메타지놈에 관련 논문이 기하급수적으로 증가하고 있는 것을 알 수 있음. 장내 미생물의 중요성에 관한 관심이 계속적으로 증가 하고 있는 것과 동시에 미생물 다양성의 관점에서 바이러스 관련 연구도 계속 적으로 증가하고 있는 것을 알 수 있다. 작년 7월, 장내 미생물 연구 분야 대 가 중 한명인 Jefferey Gordon Lab에서 사람 장내 바이러스 특성 분석에 관 한 연구가 발표됨. 유전적 인자가 동일한 쌍둥이와 그 부모를 대상으로 장내 약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

22/ 22/53

바이러스 군집을 규명하고, 생태적 특징을 밝힌 것으로 세계 최고 저널인 Nature에 게재됨 (Reyes et al. Nature, 2010 Jul 15;466(7304):334-8). 이와 함께, Human Microbiome Project의 방향 중 하나로 virus 분석으로 이 동해야 한다고 할 정도로 그 관심이 증폭되고 있음. 본 연구팀이 확보하고 있는 수준은 메타지놈 확보 기술면에서는 선진국 대비 90-100% 정도의 수준에 도달해 있다고 생각됨. 메타지놈 분석 기술 또한 많 이 보편화되어 있기 때문에 충분히 선진국 현재 연구 수준을 따라 잡을 수 있 을 것임. 또한, 서양인을 대상으로 한 연구를 벗어나, 한국의 독자적인 기술로 한국인을 대상으로 한 연구가 반드시 필요하며, 따라서 본 연구의 의미는 더 중요해질 것임.

약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

23/ 23/53

표. 국내외 바이러스 (메타지놈) 및 phage 연구 현황 연구수행 기관

연구개발 기술 수준

연구개발성과의 활용현황

바다의 RNA 바이러스 군집의 메

2006년 Science 및 다수

타지놈 분석

의 논문 게제

기술수준 (%)

브리티시 컬럼비아대, 캐나다 (Curtis

100

A. Suttle) 산호초, 해수, 염전, 스트로마톨라 이트, 농업용 저수지, 모기의 바이 샌디에고 주립대, 미국 (Forest Rohwer)

러스의

메타지놈 연구 수행

바이러스 메타지놈 분석을 위한 생물정보학 그룹 운영 바이러스 메타지놈 연구의 선구자 및 대표적인 연구 집단

Coastal DNA virus, 분 변의 virus 등의 메타지놈 연구를 통하여 다수의 논 문 게제 (PNAS, Nature, J. Bac, PLOS Biology

100

etc) 바이러스 메타지놈

데이

터베이스

운영

(http://scums.sdsu.edu/) University of

샌디에고

주립대의

Forest

Singapore,

Rohwer lab과 공동연구를 통하여

싱가포르 (Yijun

사람의 분변의 RNA 바이러스 메

Ruan ) University of Delaware, 미국 (Eric

2006년 PLOS Biology 논문 게제

100

타지놈 분석 해수 및 토양 관련 바이러스 연구 수행

AEM 등에 논문 발표

최근 토양 바이러스 메타지놈 연

꾸준한 논문 출간

Wommack)

구

Washington

장내 미생물 분야 선두 그룹으로

세계

University, 미국

써, 최근 Forest Rohwer lab과

Science)에 논문 다수 게

(Jefferey I

공동 연구로 장내 바이러스 생태

재

Gordon)

저널(Nature, 100

연구 결과 발표 바이러스 메타지놈 확보 기술 연

본 연구팀

70-80

구 장내 미생물 분자생물학적 분석

토양 및 해양 바이러스 메타지놈 확보 및 분석 장내 미생물의 분자생물

90-100

학적 분석

약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

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2. 연구개발 내용 및 방법 가. 장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단 분석 기술 연구 ① 연구내용 - 인체 미생물체 (장내, 피부, 점막 등) 연구는 전통적으로 배양법에 의존하여 진행되어 왔지만 자연을 흉내 낸 가상의 환경에서 자라지 않는 미생물이 99% 로 배양법만으로는 인체 미생물의 다양성을 정확하게 밝힐 수 없었음. 최근 20 여 년 동안 분자 생물학적 분석기술의 발달로 인하여 인체에 서식하는 미배양 미생물의 다양성을 비교적 정확하게 확인할 수 있는 여러 기법들이 등장하였 음. 이들 분자생물학적 기법들은 대부분 PCR에 의존적인 방법으로서 인체에 존재하는 소량 미생물의 유전자도 증폭시켜 분석할 수 있는 반면 증폭 과정에 서 오는 왜곡현상으로 실제 미생물 다양성이 정확하게 표현되지 못하는 단점이 있음. - PCR 비 의존적인 방법으로는 미생물의 특정 유전자 혹은 몇십-몇백 base 길이의 뉴클레오타이드만을 혼성화 (hybridization) 시켜 미생물의 다양성을 확인하는 DNA chip이 있음. 하지만, DNA chip은 고집적으로 배열된 유전정 보를 바탕으로 한 번에 수백 수천종의 미생물을 확인 할 수 있는 가장 강력한 기술 중의 하나지만 DNA chip조차도 환경에 미량으로 존재하는 미생물의 유 전정보를 확인 할 수가 없고, PCR이나 여타 다른 종류의 증폭 과정을 피하기 는 힘들기 때문에 대규모로 진행되는 최근의 인체 미생물연구를 수행하기 위해 서는 좀 더 진보된 형태의 DNA chip 기술 개발이 필요함. - 이에 본 연구기관에서는 인체의 장내 메타지놈을 수집하고, 수집한 메타지놈 의 균질화 및 순수화 기법을 정립, 장내 메타지놈에 존재하는 미생물 group을 확인하기위한 linker probe를 개발중임. - 장내에 존재하는 박테리오파지는 장내미생물 군집에서 상당한 선택압 (selective pressure)으로 작용하는 것으로 알려져 있음. 그 결과 장내 박테리 약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

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오파지는 장내에서 미생물 환경의 자기 조절 작용에 있어서 중요한 역할을 하 고, 장내미생물 다양성 유지에 기여하는 것으로 생각하고 있음(Letarov

등,

2009). 그러나 아직까지 박테리오파지와 장내미생물군과의 관계, 더 나아가서 는 장내박테리오파지와 건강에 대한 관계에 대한 연구는 거의 없는 상태임. 또 한 장내박테리오파지의 메타지놈 분석 연구도 국내외적으로 거의 없는 상태임. 이에 분변시료로부터 장내 박테리오파지를 순수 분리하고, 메타지놈을 얻는 분 석 과정을 확립하였음.

② 연구방법

○

미생물 그룹 linker-probe 및 시그날 증폭기술 개발

Group specific linker probe 설계 및 확보 -

장내에

다수

존재하는

혹은

중요한

역할을

하는

Bacteroides,

Clostridium, Fecalibacterium group specific linker probe를 설계하여 대량 샘플에서 이들 미생물의 정량적 분석을 할 수 있는 미생물 검색 기술 을 개발.

메타지놈 마이크로어레이 신호 증폭기술 개발 - 메타지놈 microarray를 제작하여 그 검출 효용을 높이는 방법으로서 linker probe의 각 probe를 photobiotin으로 labeling하거나, multi-linker probe와 photobiotin-TSA 방법을 개발하여 낮은 수준의 유전자 후보물질 을 검출할 수 있는 기술을 개발 하려 함. photobiotin-TSA (tyramide straptavidin-amplification)을 이용한 신호 증폭기술 개발.

약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

○

26/ 26/53

인체 미생물체 분석용 메타지놈 어레이 개발

메타지놈 DNA 추출 및 정제 - 메타지놈 어레이를 제작하기 위해서 순도 높은 DNA를 추출하고 정제하는 기술의 개발하고 질병인 및 정상인의 50 여개 샘플을 수집하고, 이들에서 메타지놈을 추출, 정제함.

메타지놈 DNA chip 개발 - 50 여개의 샘플을 이용하여 개인의 미생물체의 변화를 거시적으로 관찰할 수 있는 국내 최초의 미생물체 마이크로 어레이의 개발.

메타지놈 DNA chip의 stringency 확인 - 메타지놈 어레이의 특이성과 민감성을 확인하기 위한 기본적인 정보를 조 사하고 한국인 특이적 미생물체 분석용 어레이 제작에 사용

DNA chip을 이용한 혼성화 확인 - 메타지놈-메타지놈 혼성화 반응을 이용하여 실제적인 메타지놈 어레이의 장내 미생물 분석능 파악.

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3-2세부과제

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나. 대단위 염기서열 분석법 (pyrosequencing)을 이용한 한국인 장내 박테리오 파지 군집 분석

① 연구내용 - 장내 박테리오파지의 메타지놈 분석 : 분변으로부터 장내 박테리오파지를 분리하기 위한 최적의 방법을 개발하고, 장내 박테리오파지의 gDNA를 추출하여 pyrosequencing을 통해 박테리오파지 의 메타지놈을 분석함. - 선행 연구를 통하여 토양 및 해양의 바이러스 메타지놈을 확보하고 분석하 는 기술을 확립하였기 때문에 장내 바이러스 메타지놈 과제 분석에 있어서 기 술적인 난관은 대부분 해결되었다고 할 수 있음. 단, 토양 및 해양과 다른 샘플 (즉, 분변)의 특성상 새로운 바이러스 분리 방법이 필요할 것으로 예상됨. 뿐만 아니라 적절한 샘플 채취 방법과 보관 방법이 필요함. - 바이러스 메타지놈 확보에 있어서 가장 중요한 것이 바이러스를 분리하고 DNA를 효과적으로 증폭시키는 것으로서 본 연구에서는 새로운 분자생물학적 기술 (WGA, LASL 등)을 이용하여 이러한 목표를 달성할 수 있을 것임. - 대규모 서열 분석을 위해서 GS-FLX, Solexa 등을 이용하여 현재 국내에 서 가장 활발하게 대규모 서열 분석을 수행하고 있는 기업과 접촉하여 서열 분 석을 수행한 바 있으며 연구가 진행 될 경우에는 협의를 통하여 최대의 효율로 대규모 서열 분석을 수행할 수 있도록 하고자 함.

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3-2세부과제

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② 연구방법

그림. 장내 바이러스 메타지놈 분석 방법

분변 또는 장내에서 바이러스 메타지놈 확보 기술 개발 - Tangential Flow Filtration 등 바이러스를 농축하고, 증폭할 수 있는 기술을 확립 - 분변에서 바이러스를 깨끗하게 분리할 수 있는 방법의 개발 (TFF, ultracentrifugation 등을 이용) - 소량의 DNA를 증폭하는 방법의 확립 - 차세대 서열 분석 기술을 이용한 서열 분석법 - 확보된 서열을 분석할 수 있는 생물정보학적 일괄 분석법 확립 확보된 기술을 이용한 장내 바이러스 메타지놈 확보 및 염기 서열 분석 - 사람별 바이러스 메타게놈 차이를 비교하기 위한 대상 선정 약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

29/ 29/53

- 분변 및 장내 바이러스 메타지놈 확보 - 10 Mb 이상의 염기서열 확보 - 생물정보학 기술을 이용한 염기서열 분석 장내 바이러스 메타지놈과 장내 생태계의 상관관계 이해 - 장내 바이러스 메타지놈과 장내 생태계의 상관관계 이해 - 상호 미생물 커뮤니티 분석 결과와 함께 장내 생태계의 이해

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3-2세부과제

30/ 30/53

3. 연구개발 결과 가. 장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단 분석 기술 연구 ① 한국인 장내 메타지놈 순수-균질화 기법 확립 및 메타지놈 DNA 칩 제작 6명의 성인 남성과 2명의 여유아, 총 8명의 사람으로부터 6회에 걸쳐 수집 한 48개의 분변 샘플과 3개의 성인 분변 샘플, 2개의 환경 샘플, 그리고 1 개의 E.coli reference를 수집하여 메타지놈 DNA 칩 제작을 준비하였음. 각 샘플의 메타지놈을 384-웰 마이크로플레이트에 각각 분주하고, 동량의 2X 마이크로어레이 스포팅 용액(ArrayItTM, Telechem International, Inc., Sunnyvale, CA)을 첨가하여 잘 섞이도록 한 뒤 프린팅 하였음. <그림 1> 인체의 분변에서 추출한 메타지놈을 이용하여 제작한 메타지놈 DNA 칩. 메타지놈 DNA의 슬라이드상의 위치와 실제 printing 된 모습 (A)과 DNA 칩에 spotting된 메타지놈 샘플의 순서 (B).

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3-2세부과제

31/ 31/53

② 주요 장내 미생물군 특이 probe 개발 장내에는 Bacteroidetes와 Firmicutes의 두 phylum(문)이 대다수를 차지 하는 것으로 알려져 있음. 이중에서도 특히 Bacteroidetes는 비만을 억제하 고 인체로 들어온 물질을 체내가 잘 흡수할 수 있도록 도와주는 역할을 하 는 것으로 알려짐. 이에 Bacteroides와 그 연관 미생물들을 검출할 수 있는

Bacteroides group linker probe를 제작하였음.

<그림 2> Bacteroides group linker probe의 구성과 16S rDNA에서의 target 부분. linker probe는 16S

rDNA 염기서열중 32번째, 303번째, 그리고 708번째 염기서열 부분을 타겟으 로 하며 각각의 probe는 염기가 붙지 않은 5개의 spacer로 연결되어 있음. linker probe는 원래의 probe sequence를 이용하는 two direction linker probe와

원

probe

sequence의

reverse

complement를

이용한

one

direction linker probe로 제작 되었음. 약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

32/ 32/53

장관의 colonocyte는 미생물이 식물 섬유로부터 전환시킨 SCFAs를 에너지 원으로 이용하여 인체의 mucosal barrier의 기능을 강화 외부의 미생물 침 입에 대항하는 것으로 알려져 있음. SCFAs중에서 butyrate는 장관세포의 핵심 에너지원으로서 Firmicutes의 Roseburia, Faecalibacterium group에 속하는 미생물이 butyrate생성에 크게 관여하는 것으로 밝혀져 있다. 따라 서 당해연도에는 인체의 외부 미생물에 대한 면역방어기능에 필수적인 butyrate를 생산하는 미생물 그룹 중 Roseburia, Faecalibacterium에 초점 을 맞추어 이들 미생물 그룹을 검출할 수 있는 linker probe를 설계, 제작 하였음. <그림 4> 인체의 장내에서 butyrate를 생산하는 미생물 그룹중의 하나인

Roseburia 그룹의 phylogenetic tree (A)와 Roseburia 속을 포함하는 상 위 family 미생물들의 16S rDNA 염기서열을 pairwise alignment하여 group specific probe 설계 (B).

Roseburia 그룹 linker probe의 염기서열은 다음과 같음. Roseburia group linker probe

Faecalibacterium 그룹의 경우 두 개의 sub-cluster로 이루어져 있으며, 각각의 cluster를 cover하는 probe를 설계한 후 이들 probe를 linker로 연 결하는 방식으로 전체 Faecalibacterium 그룹을 검출할 수 있는 linker probe를 제작하였음.

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3-2세부과제

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<그림 5> 인체의 장내에서 butyrate를 생산하는 미생물 그룹중의 하나인 Faecalibacterium 그룹의 phylogenetic tree (A)와 Faecalibacterium 속을 포함하는 상위 family 미생물들의 16S rDNA 염기서열을 pairwise alignment 하여 group specific probe 설계 (B).

Faecalibacterium 그룹 linker probe의 염기서열은 다음과 같음. Faecalibacterium group linker probe

그 외 in silico analysis를 통해 7종류의 장내 미생물 타겟 프로브를 선정, 제작하였음. 약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

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③ 메타지놈-메타지놈 반응을 이용 미생물 군집변이 추적 8명의 한국인을 대상으로 제작되어진 메타지놈 DNA칩을 이용하여 장내의 미생물군집이 개인마다 고유한지, 시간의 변화에 대하여 안정한지를 확인하 였음. <그림 6> 메타지놈-메타지놈 혼성화를 이용한 한국인 장내 미생물 군집의 개 인

특이성

및

안정성

확인.

한

개인마다

3개의

메타지놈을

이용하여

Cy5-dUTP로 표지한 후 메타지놈 DNA칩으로 분석하였음. 한국인의 장내 미생물 조성을 확인하기 위해 각 개인 마다 초기, 한달 후. 두달 후의 장내 미생물 메타지놈이 이용되었으며 각각의 샘플이 메타지놈 DNA칩과 혼성화 (hybridization)된 양상을 그림에 나타내었음.

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3-2세부과제

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전체적으로 한 개인에서 유래한 미생물 메타지놈은 해당하는 개인의 메타지 놈과 더욱 강하게 혼성화 되는 경향을 보였으며, 비록 타인일 지라도 약간 의 DNA칩 시그날을 나타내었음. <그림 7> 메타지놈 DNA칩 상에서 나타난 한국인 장내 미생물 군집을 정량, 정성적으로 분석한 후, 각 샘플간의 유사도를 pearson coefficeint를 이용하여 계산하였으며, 이를 바탕으로 UPGMA clustering방법으로 표시하였음. UPGMA clustering결과 individual E를 제외한 모든 샘플에서 장내 미생물 군집이 개인에 특이적이고 시간의 변화에 따라서 거의 변함이 없음을 확인 하였음.

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3-2세부과제

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3-2세부과제

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④ 100배 이상의 신호 증폭기술 개발 일반적으로 DNA칩의 signal detection을 위해서는 Cy5 dCTP(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 형광 시약이 이용되지만 메타지놈을 이용한 DNA 칩에서는 Cy5 형광만을 이용할 경우 signal이 낮아서 샘플을 분석할 수 없는 경우가 상당수 존재함. 이에 본 과제에서는 기존의 Cy5 형 광 라벨법보다 높은 수준의 signal을 얻을 수 있는 DNA라벨링 기법을 개발 하고자 함.

<그림 8> E.coli 특이적인 probe를 이용하여 sgnal을 확인한 모습. E.coli 특 이적인

probe의

5‘말단에

cy5

형광시약을

부착한

probe를

이용하여

hybridization한 모습 (A)과 probe 말단에 biotin을 붙이고 Tyramide signal amplification을 통하여 signal을 증폭시킨 모습 (B).biotin probe와 TSA를 결합시켰을 때 slide상의 signal이 saturation되어 white로 나타나는 것을 확인 할 수 있음.

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3-2세부과제

38/ 38/53

<그림 9> Bac 303-cy5 probe를 이용하여 detection한 결과 (A)와 one or two direction Bacteroides linker probe를 이용하여 detection한 결과 (B). one direction linker probe의 경우 보다 향상된 signal을 확인할 수 있었음.

<그림

10>

linker

probe를

이용한

DNA

칩

signal

증폭의

개념도.

biotin-TSA법을 이용하여 기존의 cy5 형광 시약보다 10배 이상의 signal증폭 을 기대할 수 있고, linker probe와의 결합을 통해 30배 이상의 signal 증폭효 과를 이룰 수 있음. 특히 one direction Bacteroides linker probe의 경우에는 two direction linker probe보다 많은 spot을 detection하였으며 그 singal도 월등히 높게 나타났음. 앞서 Bacteroides linker probe의 특이성 (specificity)를 확인 하였던

바,

two

direction

linker

probe에서

non

specific한

cross

hybridization이 관찰 되었으므로 메타지놈 DNA 칩에서 미생물 분석을 위 한 linker probe로는 one direction probe가 민감도 (sensitivity)와 특이 성 (specificity) 면에서 모두 우수한 것으로 확인 됨. 앞서 기술한 biotin-TSA기법을 통해 cy5 형광보다 10배 이상의 signal을 얻을 수 있고, linker probe와 biotin-TSA기법을 조합하여 30배 이상의 신호 증폭기술을 개발 할 수 있었음. 추가적으로 photobiotin이나 Quantom dot 기법을 적용하여 100배 이상의 신호증폭기술을 확립하고자 함. 약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

39/ 39/53

나. 대단위 염기서열 분석법 (pyrosequencing)을 이용한 한국인 장내 박테리오 파지 군집 분석 ① 장내 바이러스 유사 물질 분리 및 계수

20대 성인 5명으로부터 수집한 분변샘플에서 filtration를 통한 size별 분 리와 Ultracentrifugation의 density별 분리를 통해 virus-like particles (VLPs)만을 분리하였으며, 분리된 VLPs로부터 DNA를 추출하였음. <표 1> 장내 박테리오파지 군집 분석 대상자 Individual

Sample ID

Individual 1

Birth Country

Age

Sex

Sample amount

F-A

Male

12.4g

Individual 2

F-B

Male

15.2g

Individual 3

F-C

Male

14.4g

Individual 4

F-D

Female

14.1g

Individual 5

F-E

Female

12.4g

South Korea

약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

40/ 40/53

Fluorescence dye를 통한 genomic DNA를 염색하여, 시료당 약 108-109 정도의 VLPs가 존재함을 확인하였음. 해당 내용은 그림 2에 나타내었음.

<그림 2> 형광염색을 통해 관찰 및 계수한 VLPs. 분변시료의 Filtration을 통 해 모은 VLPs를 형광염색하여 confocal microscopy로 관찰한 사진 (왼쪽). 초록색 점들이 각각의 VLPs임. 해당 VLPs를 시료별 계수한 결과, 시료당 약 108-109 정도의 VLPs가 존재함을 확인하였음 (오른쪽).

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3-2세부과제

41/ 41/53

② 전자현미경을 통한 장내 바이러스 형태학적 관찰 수집된 VLPs의 정확한 Morphology를 확인하기 위하여 Transmission Electron

Microscopy

(TEM)를

통해

관찰하였음.

Sipho-,

Podo-,

Microviridae와 그 외 다양한 형태의 virus를 관찰하였음.

<그림 2> TEM을 통해 관찰한 다양한 형태의 viruses

③ 농축된 바이러스로부터 유전물질 추출 및 증폭 분리한 VLPs로부터 vDNA를 추출하였으며, 추출된 각 vDNA를 phi29 polymerase를 통해 amplification하였음.

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3-2세부과제

42/ 42/53

1kbp ladder

100bp ladder

F-A

F-B

F-C

F-D

F-E

10kbp

2kbp

Extracted DNA

Negative

Amplified DNA

<그림 4> 시료별 추출된 vDNA 및 amplified 된 vDNA의 gel electrophoresis.

④ 대용량 염기서열 분석법을 통해 얻은 염기서열의 생물정보학적 분석 추출된 바이러스 유전체를 대용량 염기서열 분석법을 통해 sequencing하였 으며, 샘플별 평균 8만 read sequence를 얻었음. Viral sequences는 BLASTx-analysis를 통해 Genbank database와 비교 분석하였으며, 그 결과 전체 sequence의 약 90%가 이전에 알려지지 않은 새로운 sequence로 도출되었음. 이는, 장내 환경에 존재하는 바이러스의 대 부분이 새로운 바이러스이며, 이들이 가지고 있는 유전자 역시 이전에 알려 지지 않은 유전자로 판단됨.

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3-2세부과제

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Eukarya (0.066%) Bacteria (0.009%)

Virus (9.2%)

Bacteria (0.066%) Eukarya (0.009%)

Virus (7.4%)

Unclassified (88.36%)

Unclassified (92.5%)

Unclassified (90.72%)

Virus (6.33%)

Eukarya (0.015%)

Virus (11.63%)

Bacteria (0.029%) Eukarya (0.026%)

Virus (14.76%)

Unclassified (93.67%)

Unclassified (85.18%)

<그림 5> BLASTx-analysis를 통해 Genbank database와 비교 분석 결과.

약 10%의 annotated된 바이러스 sequence의 분류학적 위치를 살펴보니, 13

families에

Double-stranded

포함되었으며, DNA

그

Podoviridae,

중

박테리오파지

Siphoviridae,

그룹인

Myoviridae와

Single-stranded DNA Microviridae에 속하는 박테리오파지들이 가장 많 은 수로 존재하고 있음이 밝혀졌음.

약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

44/ 44/53

dsDNA

ssDNA

F-A

F-E

F-D

Average

CAMERA_nr CAMERA_v SEED_nr

ssDNA

F-C

Preferentially amplified ssDNA viruses by MDA

dsDNA

F-B

Unclassified viruses Unclassified ssDNA viruses Microviridae Germiniviridae Anelloviridae Inoviridae Unclassified dsDNA viruses Bicaudaviridae Tectiviridae Poxviridae Phycodnaviridae Mimiviridae Adenoviridae Herpesviridae Iridoviridae Asfarviridae Unclassified Caudovirales Siphoviridae Podoviridae Myoviridae 20 40 60 80 Viral genomes (%)

100

Microvirus CAMERA_nr CAMERA_v SEED_nr

Podovirus

Siphovirus 0

20 40 60 80 Viral genomes (%)

100

Myovirus 40 60 80 100

100

<그림 6> Genbank database와 비교 분석을 통해 Identified된 sequence의 viral family description.

분변시료를 통해 박테리아 군집과 바이러스 군집의 다양성 지표를 동시에 분석한 결과, 종 다양성을 나타내는 지표인 Shannon index의 경우, 박테리 아 군집이 상대적으로 높았으며, 종 수를 나타내는 Richness 역시 박테리아 군집에서 상대적으로 높게 나타났음. 일반적인 환경에서, 바이러스의 유전적 다양성 및 양이 숙주 생물인 박테리 아에 비해 높게 나타나는 것으로 알려져 있으나, 장내 환경의 경우 이전과 상이한 결과를 나타내었음. 이는, 장내 환경에서 박테리아와 바이러스의 관 계가 자연계에 흔히 존재하는 Prey-pradator dynamics로는 설명할 수 없 는 특이한 관계를 이루고 있을 것으로 판단됨.

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3-2세부과제

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<표 2> 장내 박테리아와 바이러스의 다양성 정보

Viral assemblage

Bacterial community

Sample

Richnessa

Shannon-Wiener index (nats)

F-A

3.04

F-B

2.79

F-C

2.84

F-D

2.58

F-E

401

4.19

F-A

1636 / 2510

4.64

F-B

1214 / 1632

4.25

F-C

1607 / 2197

4.55

F-D

914 / 1247

4.67

F-E

1492 / 1953

4.59

⑤ 장내 ssDNA microphages 다양성 분석 Single-stranded DNA Microviridae의 경우, Viral metagenomics를 통해 새롭게 주목받고 있는 바이러스 그룹으로, 해양이나 토양 등 광범위한 환경 에 분포하는 것으로 밝혀지고 있으며, 이들의 다양성 또한 이전에 보고된 ssDNA phages에 비해 폭넓은 유전적 형태를 가지고 있는 것으로 알려져 있음. 이에 근거하여, 기존에 배양 기법을 통해 알려진 microphages와 본 연구와 같이 비배양적 viral metagenomics를 통해 발표된 여러 환경에 존재하는 microphages와의 유전적 거리를 정의하고, 계통분류학적 위치를 제시하였 음. 그 결과, 기존에 밝혀진 microphage와는 유전적으로 큰 차이를 보였으며, 장내 microphage내에서도 총 5 그룹의 새로운 유전적 형태를 지니는 것으 약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

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로 밝혀졌음. 또한, 장내 우점균인 Bacteroides & Prevotella strains의 유 전체에 포함된 Prophage-like elements의 높은 유사도를 보이는 것으로 보아 Bacteroides & Prevotella가 장내 환경에 microphages의 숙주로 판 단됨. 현재까지, viral metagenomics를 통해 알려진 microphages의 경우, 높은 다양성과 양이 존재하는 것에 관심을 가지고 있었으나, 그들의 숙주나 진화 형태, 유전적 특징 등이 뚜렷이 밝혀지지 않았음. 본 연구를 통해 장관 내 microphage의 숙주를 유추할 수 있는 증거를 도출하였으며, 이는 추후 microphage의 생태학적 특징을 이해하는데, 주요한 관점으로 작용할 것으 로 기대됨.

<그림 7> Single-stranded DNA microphage의 계통분류학적 위치 규명.

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3-2세부과제

47/ 47/53

4. 연구결과 고찰 및 결론 본 연구에서 당초 제안한 메타지놈의 순수-균질화 기법을 연구 기간 내 확 립하였으며 이를 토대로 메타지놈 DNA칩을 개발할 준비를 마쳤음. 51개의 한국인 장내 메타지놈과 reference로서 2개의 토양 환경 메타지놈 그리고 E.coli의 genome을 이용하여 100장의 메타지놈 DNA칩을 개발하였 음. 개발된 메타지놈 DNA칩은 UV cross linking과 post-treatment과정을 거쳐 암소에 보관하였으며 linker probe를 이용한 한국인 장내 미생물 군집 분석에 이용되었음. 장내에

중요미생물

검출용

linker

probe로

Bacteroides-prevotella,

Roseburia와 Faecalibacterium 그룹 검출용 linker probe를 설계 및 제작 하였으며, 추후 장내 미생물 관여 질병에 따라 양적 변화를 보이는 미생물 그룹을 중심으로 linker probe 개발 계획임. 2차년도에 제작한 메타지놈 DNA칩을 이용하여 8명의 한국인 장내 미생물 군집이 개인에 특이적으로 존재하고 시간의 변화에 따라서 거의 변화하지 않음을 밝혔음. DNA 칩의 신호 증폭 기술을 개발하기 위해 68개의 미생물의 16S rRNA gene fragment를 이용한 DNA칩을 개발하였으며 biotin-TSA기법으로 기 존의 cy5 probe보다 10배 이상의 신호 증폭, linker probe와의 결합으로 30배 이상의 신호 증폭 기술을 개발하였음. 3차년도에는 photobiotin이나 Quantom dot등을 이용한 기술을 추가 개발하여 100배 이상의 신호 증폭 기술개발을 시도 및 완성하려함. 한국인 분변시료로부터 virus-like particle만을 분리 및 농축과정을 확립 하였고, 이들의 농도 단위 계수법, 형태학적 관찰법 역시 확립하였음. 해당 enriched virus-like particles로부터 virus genomic DNA를 추출하고, 약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

48/ 48/53

phi29 polymerase를 통해 증폭하여 다량의 DNA를 확보하였음. 또한, 대용량 sequencing 기술에 적용하여, 장내박테리오파아지의 genomic DNA가 담고 있는 유전적 특성을 분석하였으며, 바이러스의 분류학적 정의 를

바탕으로

박테리오파지인

dsDNA

Podo-, Sipho-,

Myophages와

ssDNA microphages가 장내 바이러스의 우점군으로 밝혀졌음. 하지만, 90%에 가까운 바이러스 유래 염기서열의 identity가 확인되지 않 았으며, 특히 장내 박테리아의 우점군인 Firmicutes-Bacteroidetes에서 분 리된 박테리오파지에 대한 정보가 부족한 실정임. 따라서, 장내 바이러스의 분리 배양을 통한 접근과 메타지놈을 통한 분석이 꾸준히 동반되어야 할 것 임. Single-stranded DNA Microviridae의 경우, Viral metagenomics를 통해 새롭게 주목받고 있는 바이러스 그룹으로, 해양이나 토양 등 광범위한 환경 에 분포하는 것으로 밝혀지고 있으며, 이들의 다양성 또한 이전에 보고된 ssDNA phages에 비해 폭넓은 유전적 형태를 가지고 있는 것으로 알려져 있음. 본 연구를 통해 장내 환경 또한 microphages가 우점하고 있는 환경 으로 밝혀졌으며, 이들의 생태학적 역할에 대한 관심이 필요함. 장내 우점균인 Bacteroides & Prevotella strains의 유전체에 포함된 Prophage-like

elements의

높은

유사도를

보이는

것으로

보아

Bacteroides & Prevotella가 장내 환경에 microphages의 숙주로 판단됨. 현재까지, viral metagenomics를 통해 알려진 microphages의 높은 다양성 과 양적 존재에도 불구하고 그들의 숙주나 진화 형태, 유전적 특징 등이 뚜 렷이 밝혀지지 않았음. 본 연구를 통해 장관 내 microphage의 숙주를 유추 할 수 있는 증거를 도출하였으며, 이는 추후 microphage의 생태학적 특징을 이해하는데, 주요한 관점으로 작용할 것으로 기대됨.

약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

49/ 49/53

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3-2세부과제

50/ 50/53

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composition

and

development

atopic

약물대사기반연구사업단

3-2세부과제

51/ 51/53

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Gewirtz.

microbiota

2010. mice

Metabolic

lacking

syndrome

Toll-like

and

receptor

altered 5.

gut

Science

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3-2세부과제

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