2-1세부과제 by drugmetabol ism

장내미생물에 의한 독성 대사 경로 및 대사체 분석연구

2009~2010. / 2중단위 1세부과제

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

2/82

목

차

1. 최종 연구개발 목표 1) 세부과제의 목표 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·5 2) 세부과제의 목표달성 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·5

2. 연구개발 내용 및 방법 (1) 1차년도 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·6 1) 최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·6 2) 항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구 · · · · · · · · · · · · · ·6 3) 장내미생물에 의한 내인성대사체 변화검출을 위한 global metabolic profiling 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·7 4) Geniposide 및 Genipin의 precision-cut small intestine slice 에서의 독성 평가 방법의 확립 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·7

(2) 2차년도 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·7 1) 항생제 투여에 의한 pseudo germ-free rat model의 대사변화를 위한 대사체 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·7 2) Pseudo germ-free rat model에서 아세트아미노펜의 대사변화 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·8 3) Germ-free mouse에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구 ·8 4) 장내미생물 대사가 ginsenoside의 체내동태에 미치는 영향 · ·8 5) 장내미생물 대사가 baicalin의 대사에 미치는 영향연구 · · · · · · · · · · ·8

(3) 3차년도 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·9 1) Esculetin 및 Esculin의 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·10 약물대사기반연구사업단

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2) 장내미생물 대사가 geniposide의 약동력학에 미치는 영향 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·13 3) Pseudo germ-free rat model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·18 4) Germ-free mouse model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·18 5) 장내미생물에 의한 내인성 대사체 변화 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·18

4. 연구개발 결과 (1) 1차년도 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·21 1) 최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·21 2) 항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구 · · · · · · · · · · ·21 3) 장내 미생물에 의한 내인성 변화검출을 위한 global metabolic profiling 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·22 4) Geniposide 및 Genipin의 precision-cut small intestine slice에서의 독성 평가 방법의 확립 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·25

(2) 2차년도 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·26 1) 항생제 투여에 의한 germ free rat model의 대사변화를 위한 대사체 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·26 2) Pseudo germ-free rat model에서 아세트아미노펜의 대사변화 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·28 3) Germ-free mouse에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구 29 4) 장내미생물 대사가 ginsenoside의 체내동태에 미치는 영향 29 5) 장내미생물 대사가 baicalin의 대사에 미치는 영향연구 · · · · · · · ·29

(3) 3차년도 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·30 1) Esculetin 및 Esculin의 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·30

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2) 장내미생물 대사가 geniposide의 약동력학에 미치는 영향 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·35 3) Pseudo germ-free rat model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·45 4) Germ-free mouse model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·47

5. 연구결과 고찰 및 결론 -장내미생물이 내인성 대사에 미치는 영향에 대한 연구 · · · · · · · · · · · ·74 -장내미생물 대사가 hesperidine의 약동력학에 미치는 영향 연구

-장내미생물 대사가 baicalin의 약동력학에 미치는 영향 연구 · · · · · · 76 -장내미생물 대사가 ginsenoside의 약동력학에 미치는 영향 연구

-Esculetin 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화 77 -장내미생물 대사가 geniposide의 약동력학에 미치는 영향 연구

-아세트아미노펜과 그 대사체의 LC-MS/MS를 이용한 동시 정량분석방법의 개발 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·78 -Pseudo germ-free rat model의 아세트아미노펜의 대사 및 약동력학 변화 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·79 -Germ free mouse model의 아세트아미노펜의 대사 및 약동력학 변화 연구 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·80

6. 참고문헌 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·81

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1. 최종 연구개발 목표 1) 세부과제의 목표

o 약물 등이 장내미생물총에 의하여 대사를 받아 독성을 유발하는 대사경로 연 구로 부터 독성과의 인과관계를 규명하기 위하여 다음의 내용을 확립하자고 함. o 미생물 특이 대사 시스템에 의하여 독성이 유발되는 약물의 독성 발현기전 규명하기 위하여 미생물대사를 구별할 수 있는 in vitro 및 in vivo 시스템을 확립. o MSn 분석을 통한 대사체 구조 규명 o 미생물에 의한 대사 경로 추적 및 독성과의 인과성 확립

2) 세부과제의 목표달성도

제1세부

In-vitro 미생물세균총 대사활성 시스템 활용, 대사체 연구

100

항생체 처리 rat모델 대사체 구조 확인 연구

100

천연물 및 약물 대사체의 최신 분석 기법 활용 분석 방법 개발 및 확보 미생물 대사 경로 규명

100 100

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2. 연구개발 내용 및 방법

구분

연구개발 내용

연구개발 방법

항생제모델을 활용한 대사체

항생제모델을 활용한 대상물질의 투여

분석연구

및 시료의 확보

천연물, 약물 등의 고감도 기

천연물 및 약물대사체의 LC/MS 최신

기분석법 개발 및 응용

분석기법을 활용한 분석방법의 개발

1세부 장내미생물총에 의해 대사를 받아 독성을 유발하는 대사경 로의 확인 연구

MSn 분석기법을 이용하여 장내미생 물에 의해 생성된 대사체의 구조 규명 장내미생물에 의한 내인성대사체의 변 화 검출

(1) 1차년도 1) 최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인 - 혈장시료 중 hesperetin의 LC/MS에 의한 정량분석법 확인: Hesperetin의 혈중 농도분석법을 LC/MS 방법으로 확립하였다. - Amaranth 분석법 개발: LC/MSD iontrap mass spectrometer사용하여 MSn으로 분석 - MSn 분석기법을 이용한 hesperetin의 대사체 구조 규명: LC/MSD trap ion trap mass spectrometer를 사용하여 혈장, 뇨 및 변에서 약물과 대사체 분석하였다. 2) 항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구

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- 항생제 처리 동물 모델 확립 및 hesperetin 투여 실험: 8주령 실험쥐에 항 생제혼합액을 1일 2회 6 일간 경구투여 후 2일이 경과한 후에 40 mg/kg hesperitin을 경구 투여하여 항생제를 투여하지 않고 hesperitin을 투여한 정 상군과 비교하였다. 3) 장내미생물에 의한 내인성대사체 변화검출을 위한 global metabolic profiling 연구 -

항생제처리한

모델

뇨시료에서

ultrafree-MC

filter로

여과하고

UPLC-TOF-MS로 m/z 50-1200 범위에서 분석 비교하여 다변량분석과 data 검색으로 내인성 대사체를 추정하였다. 4) Geniposide 및 Genipin의 precision-cut small intestine slice에서의 독성 평가 방법의 확립 - SD rat의 소장을 적출하여 precision-cut small intestine slices 기법을 활용하여

소장의

절편을

William

배지에서

배양하여 +

geniposide와

genipin을 노출시킨 후 alkaline phosphatase, Na /K -ATPase, lactate dehydrogenase의 활성을 측정하여 독성효과를 측정하였다. - William E 배지에서 geniposide와 genipin의 HPLC 분석법을 개발하였다.

(2) 2차년도 1) 항생제 투여에 의한 pseudo germ-free rat model의 대사변화를 위한 대사체 연구 - 내인성 대사체 변화 연구: 항생제 조성을 변경하여 확립한 새로운 pseudo germ-free rat model에 대하여 global metabolic profiling 방법을 사용한 장내미생물의

존재

여부에

따른

대사체

변화를

관찰하기

위하여

UPLC/QTOF-MS에 의한 대사체 분석을 위한 시료의 전처리 법 개발 및

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LC/MS에 의한 대사체 분석하였다. - Oxysterol 및 담즙산의 정량분석: 장내미생물에 의한 담즙산 농도 변화를 뇨시료를 효소가수반응하고 MTBE로 추출하여 GC/MS로 분석하였다 2) Pseudo germ-free rat model에서 아세트아미노펜의 아세트아미노펜의 대사변화 연구 - Pseudo germ-free rat model에 혈장 시료를 받아 체내동태연구를 하기 위하여 아세트아미노펜의 대사체를 LC/MS로 분석하여 체내동태파라미터를 구하여 두 군에서 비교하였다. 3) Germ-free mouse에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구 -대조군 (SPF), 정착동물(Gnotobiota), 무균동뮬 (Germ free)

3 군으로

나누어 아세트아미노펜 200 mg/kg을 경구 투여하여 채혈하고 시료전처리 과정 후 분석하여 혈중농도를 비교하였다. 4) 장내미생물 대사가 ginsenoside의 체내동태에 미치는 영향 - Ginsenoside Re 및 관련 대사체의 분석법을 LC/MS로 확립하였다 - 일반 및 germ free mouse에 ginsenosie Re 50 mg/kg을 경구투여하고 혈액시료에서 모약물 및 대사체를 정량 분석하였다. - 항생제 처리 rat에 50 mg/kg Re를 경구투여 투여 후 혈중농도 프로파일 을 분석하였다. 5) 장내미생물 대사가 baicalin의 대사에 미치는 영향연구 - Baicalin 50 mg/kg을 항생제 처리군과 대조군에 투여 후 혈장시료를 분석 하고 체내동태 연구를 하였다.

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(3) 3차년도 1) Esculetin 및 Esculin의 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화 가. 항생제 처리 모델 실험용 쥐 (8주령)에 cefadroxil (100 mg/kg), erythromycin (300 mg/kg), oxytetracycline (300 mg/kg)인 항생제 혼합액을 3일간 경구 투여하여 Pseudo germ-free 모델을 만든 후 마지막 투여 2일 후에 Esculetin 과 Esculin (40 mg/kg)을 투여하였다. 나. 수술 방법 및 혈액 채취 (1) 실험동물을 마취한 후 경동맥을 분리하여 헤파린으로 채워진 PE-50 튜브 를 심장 방향으로 삽입한 후 봉합하였다. (2) 하루 동안 회복시킨 후 Esculetin 및 Esculin을 투여 한 후 0, 2, 5, 10, 20, 30 분, 1, 2, 3, 4, 6 시간에 500 μl을 채취하였다. (3) 채취 한 혈액은 10000 rpm에서 10분간 원심분리하여 plasma를 100 μl 취한 후 분석 전 까지 70℃에서 보관하였다. 다. 시료의 전처리 (1) Plasma 100 μl에 내부표준물질(levafloxacine)이 포함된 acetonitrile을 100 μl와 0.2 % ascorbic acid를 10 μl가하여 혼합한 후 vortexing을 충 분히 하여 혈장단백질을 제거하였다. (2) 12000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 100 μl 취한 후 2 μl를 LC-MS/MS에 주입하였다. 라. 기기분석조건

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(1)

분석장비는

(Thermo,

San

Finnigan

TSQ

Jose,

USA)

Quantum 와

Ultra

mass

UFLC-20AD

spectrometer binary

pump

system(Shimadzu, Toko, Japan)을 사용하여 모든 시료를 분석하였다. (2)

사용한

Column은

Kinetex

C18

(2.0

100

mm,

2.6

um,

Phenomenex, Torrance, USA)이며, flow rate는 0.5 ml/min 이고, Injection volume은 2 μl로 분석하였다. (3) 이동상 조건은 A (0.1% formic acid in water) and B (0.1% formic acid in acetonitrile) 으로 gradient elution program을 사용하였다.

2) 장내미생물 대사가 geniposide의 약동력학에 미치는 영향 연구 가. LC/MS/MS를 이용한 genipin 및 geniposide의 대사체 분석기법 개발 (1) Genipin 및 geniposide의 혈중 농도 측정을 위하여 LC-MS/MS를 이용 하여 분석 조건을 확립하였다. LC-MS는 Agirent 6460 Triple Quad LC-MS를 사용하였다. (2) Geniposide와 genipin은 negative ion mode에서 ESI (electrospray ionization) source를 이용하여 MRM(multiple reaction monitoring) 분석 조건을 확립하였다. Genipin은 m/z 225.2

101.2, geniposide는 433.4

225.1, 내부표준물질인 luteolin은 m/z 285.2 825.2

133.1, digoxin은 m/z

779.2의 MRM mode로 검출하였다.

(3) 분석용 컬럼으로는 BDS hypersil C18 column (2.1 mm * 50 mm, 5 μ l)을 사용하고 이동상으로는 0.1% formic acid (solvent A)와 90% acetonitrile (solvent B)를 사용하였고 유속을 0.25 ml/min로 하여서 gradient system에서 분석하였다. Gradient 조건은 표 1에 나타냈다. (4) Plasma에서 검량선을 작성하기 위하여 blank rat plasma 90 μl에 genipin은 농도가 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 ng/ml가 되도록 10 μL씩 각각 첨가하고 sample과 똑같이 전처리한 후 LC-MS로 분석하였다. 검량선은 내부표준물질의 peak 면적에 대한 genipin의 면적비

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와 genipin 농도에 대해서 작성하였다. Geniposide도 blank rat plasma 90 μl에 농도가 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 ng/ml가 되도록 10 μl씩 각각 첨가하고 sample과 똑같이 전처리한 후 LC-MS로 분석하였 다. 검량선은 내부표준물질의 peak 면적에 대한 geniposide의 면적비와 geniposide 농도에 대해서 작성하였다. (5) Feces에서 검량선을 작성하기 위하여 blank rat feces 450 μl에 geniposide는 농도가 5, 10, 20, 100, 200, 5000, 10000 ng/ml가 되도록 50 μl씩 첨가하고 genipin은 농도가 20, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 ng/ml 가 되도록 50

μl씩 첨가하고 sample과 똑같이 전처리한 후

LC-MS로 분석하였다. 검량선은 내부표준물질의 peak 면적에 대한 약물의 면적비와 농도에 대해서 작성하였다.

나. 치자 색소 원료 중 geniposide의 함량 측정 (1) 확립된 LC-MS/MS 분석법을 이용하여 치자 색소 원료 중의 geniposide 의 함량을 측정하였다. (2) 측정된 함량을 기준으로 실험동물에서의 투여량을 산정하였다. 다. 항생제 처리 모델에서의 치자 색소 원료(geniposide) 투여 실험 (1)

실험용

쥐

(8주령)에

항생제

혼합액

cefadroxyl

(100

mg/kg),

terramycin (300 mg/kg) 및 erythromycin (300 mg/kg) 을 3일간 1일 1회 투여하여 항생제 처리 모델을 확립하였다. (2) 항생제 투여 2일후에 300 mg/kg 용량으로 geniposide 원료를 실험용 쥐 에 경구 투여하였다. (3) 혈장은 경동맥에 PE-50 tube를 cannulation 하여 tube를 통해 채취하였 다.

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(4) 대조군과 항생제 처리군에서 약동력학 프로파일을 비교하여 장내 미생물이 약물 대사에

미치는 영향을 연구하였다.

(5) Geniposide는 장내에서 직접 흡수되지 않다고 알려졌고 미생물에 의해 genipin으로

대사된

후

흡수되며

genipin

체내에서

대부분

대사되어

genipin-sulfate로 존재한다고 알려져 있다. 따라서 혈장 중의 genipin을 분 석하고자 아래와 같은 전처리를 하였다. Plasma sample 100 μL에 sulfatase 50 μl, ascrobic acid (125 mg/mL) 20 μL 넣은후 37°C에서 30분 반응시켰다. 30분후 내부표준물질 (2 μg/ml, luteolin) 10 μl 넣고 ethyl acetate 0.5 ml 넣은 후 vortexing 진행한 후 13000 rpm에서 5분 간 원심분리 시키고 상층액을 N2 gas를 이용하여 휘발시켰다. 남은 잔사에 50% methanol 100 μl을 가하여 용해한 후 LC-MS를 이용하여 5 μl를 주입하여 분석하였다. (6) Geniposide를 분석하기위하여 plasma sample 50 μl에 내부표준물질 (1 μg/ml digoxin)을 5 μl 넣고 solid phase exetration (SPE)를 진행하고 용매를 50°C에서 N2 gas로 증발시킨후 남은 잔사에 50% MeOH 100 μl 넣고 vortexing을 진행한 후 13000rpm에서 5분간 원심분리 시키고 상층액 을 LC-MS을 이용하여 5 μl를 주입하여 분석하였다. (7) Feces에서 약물을 분석하기 위하여 feces 500 μl에 내부표준물질 (10 ug/ml digoxin)을 20 μl 넣고 solid phase exetration (SPE)를 진행하고 용매를 50°C에서 N2 gas로 증발시킨 후 남은 잔사에 50% MeOH 100 μ l 넣고 vortexing을 진행한 후 13000 rpm에서 5분간 원심분리 시키고 상 층액을 LC-MS을 이용하여 5 μl를 주입하여 분석하였다.

표 1. LC gradient program

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Time (min)

A(%)

B(%)

Flow rate (ml/min)

0.25

1.0

0.25

4.0

0.25

4.1

0.25

8.0

0.25

3) Pseudo germ-free rat model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구 가. LC-MS/MS를 이용한 아세트아미노펜 및 대사체 분석기법 개발 (1) 표준 물질 acetaminophen

(APAP),

3-cysteinylacetaminophen

(APAP-Cys),

3-methoxy acetaminophen (APAP-OMe), 3-methoxy acetaminophen (APAP-OMe),

acetaminophen

glutathione

(APAP-Glth),

4-acetamidophenyl-beta-D-glucuronide

(APAP-Glc),

4-acetaminophen

(APAP-Sul),

sulfate

3-(N-acetyl-L-cystein-S-yl) acetaminophen (APAP-NAC) 등이며 내부표준물질로

acetaminophen-d4

(APAP-d4),

4-acetamidophenyl-beta-D-glucuronide-d3 (APAP-Glc-d3) 등을 사 용하였다. 표준물질은 농도가 1000 μg, L이 되도록 메탄올에 용해하여 stock solution을 만들고, 이 용액을 적정 농도로 희석하여 정량 분석하는데 사용하였다. (2) 기기분석조건 모든 samples은 API 3200™ system 을 이용하여 LC-MS/MS 로 분석하 고, 이때 사용한 컬럼은 Capcell Pak C18 MG II (2.0 × 150 mm, 5 um, Shiseido, Japan)이며, 유속은 300 μL/mL 이었고, 주입량은 5 μL로 분 석하였다. 이동상 조건은 A (0.1% formic acid in 5% acetonitrile) and B (0.1% formic acid in 95% acetonitrile) 으로 0-8 min 까지 A를 100%에서 20% 로 gradient 시키고 9 min 까지 A 20%로 유지 시킨 후 약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

14/ 14/82

9.5 min 까지 A 100%로 바꾼 뒤 다음 시료를 찍기 전에 6.5 min간 유지 시켰다.

(3) 분석물질 및 MS/MS 조건 혈장 및 뇨 중 APAP와 그 대사체들을 electrospray ionization LC/MS에 서 분석하기 위하여 APAP와 그 대사체들의 이온화를 위한 조건을 확립하 고 MS/MS fragment pattern을 규명함. 이때 선정한 compounds와 그때의 MRM (multiple reaction monitoring) 조건은 다음의 표2 에 나타내었으 며, 이 조건으로 모든 시료를 분석함. 이때 몇몇 대사체들에 있어서 negative mode에서 감도가 월등히 높은 이유로 보다 sensitive한 분석을 위해 두 가지 모드로 분석을 진행함. 분석을 위한 MS 조건은 다음의 표 3 에 나타내었다.

표 2. 분석물질의 LC/MS의 선택된 분자 이온의 정보 Ionization mode

Parent ion

Product ion

APAP

Pos

152.116

110.000

APAP-OMe

Pos

182.136

108.100

APAP-d4 (IS)

Pos

156.151

114.100

APAP-Glc

Neg

326.070

149.900

APAP-Sul

Neg

229.943

150.000

APAP-NAC

Neg

311.043

182.000

APAP-Cys

Neg

268.978

182.000

APAP-Glth

Neg

455.091

182.000

APAP-Glc-d3 (IS)

Neg

329.058

152.900

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

15/ 15/82

그림 1. 아세트아미노펜 및 대사체의 LC 크로마토그램

표 3. 아세트아미노펜 및 대사체 분석을 위한 MS 조건 Ionization mode

Positive mode

Negative mode

Acquisition mode

SRM

CUR (psi)

IS (V)

5000

-4500

TEM (℃)

500

GS1 (psi)

GS2 (psi)

CAD

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

16/ 16/82

나. 아세트아미노펜 및 대사체 분석기법 validation (1) Linearity 분석물질과 내부표준물질의 비율로 calibration curve를 그리고 이때의 squares linear regression을 weighting factor (1/x2)를 주어 linearity를 구하였다. (2) Precision and accuracy 분석법의 정확성 및 정밀성을 평가하기 위해서 최저정량한계 및 저농도, 중 간농도, 고농도를 대표하는 세 가지 퀄리티컨트를 샘플에 대해서 반복적으로 분석하여

Intra-day(하루에

5번),

Inter-day(각기

다른

5일간)

의

precision and accuracy를 구하였다. (3) 회수율과 matrix effect 분석물질의 회수율을 평가하기 위해서 생체시료에 분석물질을 가한 후 추출 하여 얻어진 검출 값과 기지 농도의 순수 표준물질의 검출 값을 비교하였으 며, matrix effect를 평가하기 위해서 생체시료에서의 분석물질의 검출 값과 neat solution에서의 분석물질의 검출값을 비교하였다. (4) 안정성 생체시료중의 약물의 안정성을 평가하기위해서 장기보관 (설정된 보관온도 에서 냉동, -80℃에서 4주간보관)과 단기보관 (실험대위, 실온에서 6시간 보관) 한 후 및 냉·해동 주기(-80℃에서 24시간 보관 후 완전해동)를 거 친 후의 안정성 및 stock solution의 안정성 (실온에서 6시간 보관), 전처리 후 안정성(4℃에서 24시간보관)에 대해서 샘플을 채취하고 취급하는 동안 분석물질의 안정성과 분석하는 동안 분석물질의 안정성에 대해 평가하였다.

다. 항생제처리모델에서의 아세트아미노펜 투여 및 샘플처리 (1) 실험 동물모델의 응용 Sprague-Dawley(SD) rat (240±10 g)을 사용하여, 실험기간동안 물과

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

17/ 17/82

사료는 자유로이 공급하고, 사육실내의 온도는 23±2 °C, 습도는 55 ±10 %로 유지하였다. 실험동물은 2군으로 나누고 한 군은 정상 대조군으로 정하 여 증류수를 투여하고 (대조군), pseudo germ-free rats은 정상 쥐에게 bacitracin(200

mg/kg),

neomycin(200

mg/kg),

streptomycin(200

mg/kg) 용량으로 증류수에 녹인 항생제 혼합액을 하루 두 번, 총 5일간 경 구 투여하여 완성하였다. (항생제 처리군, pseudo germ-free group) (2) 수술 도구 및 시약 수술 도구로는 수술용 가위, 핀셋, 포셉, 수술용 봉합사, 수술용 바늘, SP-45 튜브, autoclavable low profile button/tether assembly, 주사기, 수술대, 등을 사용함. 시약은 생리 식염수, 주사용 100 U 헤파린 용액, 마취 제 (zoletil:rompun (2:1) mix) 등을 사용하였다. (3) 수술 방법 실험동물은 마취제를 복강 투여하여 마취한 후 수술대에 고정하고, 좌측 쇄 골 유첨근 위를 1cm 가량 절개하고 핀셋으로 경동맥을 분리하여 들어 올린 후 위쪽과 아래쪽에 각각 봉합사를 걸쳐 놓았다. SP-45 튜브는 1 ml 주사 기와 연결한 후 100 U/ml 헤파린을 채워 준비하였다. 25G 바늘을 사용하 여 혈관에 구멍을 내고, 준비된 SP-45 튜브를 심장방향으로 삽입한 후 봉 합사로 위쪽과 아래쪽을 걸쳐 둔 봉합사로 묶어서 고정하였다. 고정된 SP-45 튜브는 튜브 유도관을 통해 등 뒤쪽까지 뽑아내고 autoclavable low profile button/tether assembly에 연결하여 보호하였다. (4) 아세트아미노펜의 체내동태 연구 아세트아미노펜은 50% PEG에 용해한 후 200 mg/kg 용량으로 경구 투여 하였다. 채혈은 경구 투여 후 0, 5, 15, 30, 60, 90분, 2, 4, 8, 12, 24 시 간에 200 μl이상 취하고,

14000 rpm에서 3분간 원심 분리하여 plasma

를 100 μl를 취하였다. plasma는 sample preparation 전까지

80℃에서

보관하였다. 채뇨는 경구 투여 후 0, 0-8, 8-24, 24-30 시간 간격으로 취하고, 각 시간별 양을 기록하였다. (5) 시료의 전처리

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

18/ 18/82

내부

표준물질은

APAP-d4

(acetaminophen-d4,

μg/ml),

APAP-Glc-d3 (acetaminophen -glucuronide-d3, 10 μg/ml) 의 혼합액 을 사용하였다. Plasma의 경우, 100 μl에 내부표준물질 혼합액을 20 μl씩 가하여 혼합한 후 methanol을 200 μl씩 가하고 vortexing을 충분히 하여 혈장단백질을 제거하였다. 14000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 200 μl 취하여 질소가스 하에서 건조시키고 분석 전까지 20 ℃에서 보관 하였다. 분석을 실시하기 직전에 50% methanol 100 μl 으로 재조정하였 다. 뇨의 경우, 100 μl에 내부표준물질 혼합액을 20 μl씩 가하여 혼합한 후 methanol을 180 μl씩 가하고 vortexing을 충분히 하여 혈장단백질을 제거하였다. 14000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상층액을 150 μl 취하 여 기계에 적용하였다.

4) Germ-free mouse model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구 1-3 세부연구에서 정상대조군(SPF), 무균동물군(Germ-free), 정착동물군 (Gnotobiota)군에 50% PEG400에 녹인 아세트아미노펜을 200 mg/kg 와 300 mg/kg로 투여한 후 1, 2, 6, 24시간에 채혈하여 혈장을 분리하였고, 혈 장에 대한 분석은 ‘(3) Pseudo germ-free rat model에서의 아세트아미노 펜의 대사변화 연구’에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 진행하였다.

5) 장내미생물에 의한 내인성 대사체 변화 연구 가. 장내 미생물에 의한 내인성 대사체 변화 검출을 위하 global metabolomic profiling (1) 시료 전처리 방법 채취한 뇨 시료를 원심 분리하여 불순물을 제거하였다. 상등액 100 μl를 취하 여 증류수200 μl를 가하여 희석하였다. 희석된 뇨 시료 5 μl를 UPLC (ultra performance

liquic

chromatography)-QTOF

(Quotrople

time

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

19/ 19/82

flight)-MS (mass spectrometry)에 주입하여 분석하였다. (2) 기기분석 조건 분석기기는

UPLC

(Waters)에

direct

interface로

연결된

Synapt

(Waters)를 사용하였다. 데이타 검출은 질량분석기의 positive ionization와 negative ionization에서 각각 진행하였다. Capillary voltage은 3.2 kV (positive ionization), 2.5 kV (negative ionization)이었고, cone voltage은 40 V이었으며, desolvation gas와cone gas의 흐름은 각각 600 L/h와 100 L/h이었다.

Source

temperature는

120℃를

유지하였고,

dissolution

temperature는 350℃로 하였다. leucine enkephalin을 lockmass로 사용하여 검출된 질량 값을 보정하였다. 질량 스펙트럼 데이터는 분리된 두 개의 채널에 서 수집되었는데, 한 채널에서는 낮은 collision energy을 사용하여 parent ion의 질량 값이 수집되고, 다른 한 채널에서는 높은 collision energy을 사용 하여 조각이온의 질량 값이 수집되었다. 두 채널은 빠른 시간동안 번갈라 가면 서 질량 값을 수집하여 한 파크에 대해서 모이온과 조각이온의 질량 값을 동시 에

확인할

수

있었다.

컬럼은

Acquity

UPLC

HSS

column

(2.1×100 : particle size :1.8μm)을 사용하였으며 컬럼 온도는 40℃, 유속 은 400 μl/min으로 흘려주었다. 이동상으로는 0.1% formic acid가 함유된 1% 아세토나이트릴 (A)과 0.1% formic acid가 함유된 99 %아세토나이트릴 (B)을 사용하였으며 이동상 A에서 B로 12 분간 gradient을 주어서 분석하였 다. (3) Multivariate analysis (다변량 분석)과 data base 검색 모든

시료표본에서

얻어진

질량분석

데이터를

데이터

분석

프로그램인

MarkerLynx XS (version 4.1, Waters, USA)에 적용하여 시료표본의 모든 피크는 머무름 시간_질량 대 전하 비율(RT_m/z)로 표시하고, 각 피크의 이온 강도는 면적 값으로 표시하였다. 시료표본마다 프로파일링 된 모든 피크의 이 온 강도의 합으로 개별 피크의 이온강도를 표준화하였다. 장내 미생물이 아닌 투여된 항생제 및 그 대사체가 PLS-DA 및 HCA가 영향을 미치는 것을 피하 기 위하여 streptomycin (분자량: 581) 및 그 대사체인 sterptidine (분자량: 262)과 neomycin (분자량: 614), bacitracin(분자량: 1422)의 분자량에 해당

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

20/ 20/82

하는 m/z 값을 다변량 분석을 진행하기 전에 제거하였다. 각 시료의 피크값을 EZinfo software (Umetrics Inc., ume, Sweden)을 적용하여 직교부분최소 자승판별

분석(orthogonal

partial

square

discrimination

analysis;

OPLS-DA)을 진행하였다. OPLS-DA에서 VIP(variable importance plot) 차트는 모든 피크들을 관련성이 높은 순서대로 정렬하여 작성하고, S-plot는 피크들이 각 그룹에서의 신뢰도와 기여도에 따라서 좌표평면에 표시하여 작성 하였다. 유의한 값으로 인정되는 피크는 1.5이상의 VIP 값을 갖으면서 각 그룹 에서 신뢰도와 기여도가 높은 피크들로 선별하였다. 선별된 피크들은 모이온의 질량값을 이용하여 Human metabolome database, lipidomap, KEGG, 등 다 양한 데이터 베이스((Human metabolome: www.metabolomics.ca, Chemical Entities

MassBlank.jp-High

Biological

Interest:

Resolution

www.ebi.ac.uk/Databases/,

Mass

Spectral

Database

:www.massbank.jp/index.html), Scripps Center for Mass spectrometry: massspec.scripps.edu/index.php, LIPID MAPS-LIPID Metabolites and Pathways Strategy: www.lipidmap.org)에서 해당 대사체들을 찾고 조각이온 의 질량 값을 비교하여 대사체들을 확정하였다. 이들 대사체들에 대해서 유의 적 차이는 스튜던트 t-test를 실시하여 검증하였다.

나. 분석시스템의 안정화와 분석법의 재현성 확인 (1) QC 표본의 제작 QC 표본은 각각의 모든 뇨 시료에서 100 μl씩 취하여 혼합하여 제작하였다. 모든 시료의 정보를 담고 있으므로 분석 방법 확립과 안정성, 재현성 확인에 사용된다. QC 표본의 전처리 방법은 뇨 시료와 같은 방법으로 진행하였다. (2) 테스트믹스의 제작 테스트믹스는 positive ionization 모드에서는 QC 표본에 아세트아미노펜, 카 페인, reserpine 등을 가하여 제작하였고, negative ionization 모드에서는 hippuric acid, glycocholic acid, adipic acid, 등을 가하여 제작하였다.

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

21/ 21/82

(3) 분석 방법의 재현성과 안정성 확보 시료 분석 전에 또한 QC 표본에 대해 10회 분석을 진행하여 분석 시스템을 안정화하였다. 시료 분석에서는 QC 표본을 10개의 시료마다 분석을 진행하였 고, 테스트믹스는 시료분석 시작, 중간, 끝, 세 번 분석을 진행하였다. 모든 QC 표본과

시료들에서

얻은

피크

변동값에

대해서

주성분

분석(principal

component analysis; PCA)을 실시하여 도출된 score plot에서 모든 QC 표 본의 위치를 확인하였다. 주성분 분석의 score plot에서 가까이 위치할수록 개 체가 갖는 변동값이 유사함을 나타내기 때문에, 주성분 분석의 score plot에서 모든 QC 표본의 위치를 확인하여 분석방법의 재현성을 확인하였다.

4. 연구개발 결과 (1) 1차년도 1) 최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인 - Hesperitin을 rat liver microsome을 사용하여 배양 후 생성된 대사체는 각각 demethyltion 과 hydroxylation 대사체로 추정되는 대사체를 확인하였 다.

MSn의

분석

결과

이

대사체는

2-methoxyphenol

group이

demethylation 된 대사체 생성되었다. - Amaranth 분석법: ESI-MS positive ion mode에서 m/z 539 이온을 생 성. CID fragmentation pattern을 규명하기 위해 MSn의 분석결과 m/z 521 의 dehydroxylation과 sulfate가 탈락된 m/z 457과 375이온이 생성되었다. 2) 항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구 - 항생체 처리 모델에서의 총 hesperetin 의 체내동태파라미터는 대조군의 AUC가 항생제 처리군보다 약 3 배가량 높았다. Cmax는 정상군에서는 578 약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

22/ 22/82

ng/ml, 항생제 처리군에서는 198 ng/ml로 정상군에서 더 높게 나타났다. -

혈청시료

중

hesperetin의

분석법을

확립하였다.

내부표준물질을

terfenadine으로 하고 2-1000 ng/ml에서 양호한 직선성을 나타내었다. 3) 장내 미생물에 의한 내인성 변화검출을 위한 global metabolic profiling 연구 - 항생제 처리 전 후의 rat 뇨를 UPLC-TOF-MS로 분석하여 PLS-DA의 3 차원 score plot을 분석한 결과 뚜렷한 두 군의 clustering이 구별되어 두 군 사이에 대사의 변화가 관찰되었다 (그림 2). 이 data base의 분석결과 각 m/z 값에 해당하는 물질로 추정되는 대사체를 검출할 수 있었다. - PLS-DA 결과로부터 좀 더 신뢰성 있는 대사체 검출을 위하여 VIP 값을 고찰하였을 때, 그 값이 1.3 이상인 값을 분석하여 HCA를 수행하고 추정 대 사체를 확인한 결과 (그림 3), amino acid, sterol, steroid 량이 항생제 전 후에 감소하거나 증가하여 이 대사체들이 영향을 받는 대사체 군임을 확인하 였다 (표 4).

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

23/ 23/82

그림 3. 항생제 처리 전후의 뇨 중 대사체 peaks중 농도 변화가 관찰된 peaks에 대한 HCA

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

24/ 24/82

표 4. 항생제 투여 후 뇨에서 농도 변화가 예측되는 대사체 후보들 a. 뇨 중 농도 증가가 예측되는 대사체 후보들 M+H

Compound

Category

Ureidopropionic acid 133

L-Asparagine

Amino acid

Ornithine 170 271 365

3-Methylhistidine

Amino acid

2-Furoylglycine Estrone

Steroids

Tetrahydrocortisone

Steroids

Dihydrocortisol 5-Cholesten-3β,17α,20α-triol

419

412

Steroids

Dihydroxycholesterol

Sterol

cholestan-6-oxo-3,5-diol

Sterol

6α-hydroxycholestanol

Sterol

4) Geniposide 및 Genipin의 precision-cut small intestine slice에서의 독성 평가 방법의 확립 연구 - Percision-cut small intestine을 이용한 독성평가 방법의 확립하기 위하여 rat 소장을 250 um의 slice로 만들어 William E 배지에서 배양하였다. -

배양시간에

따른

Na+/K+

ATPase,

NADPH

oxidase,

alkakine

phosphatase의 활성을 비교하여 2 hr, 6 hr에서 geniposide와 genipin의 영향을 비교하였다. + + - Geniposide는 6 hr에서 10-100 uM 농도에서 Na /K ATPase, alkakine

phosphatase의 활성이 감소됨이 관찰되어 독성을 나타내는 것으로 확인하였 다. 이에 비해 genipin은 6 hr에서 현저한 활성을 나타내지 않았다. - Genipin과 geniposide의 HLPC

분석법을 개발하였다. 내부표준물질은

methyl paraben 으로 하고 geniposide는 n-butanol로, genipin은 ethyl acetate로 추출하여 정량분석 하였다. 약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

26/ 26/82

(1) 2차년도 1) 항생제 투여에 의한 germ free rat model의 대사변화를 위한 대사체 연구 - Global metabolic profiling으로 내인성대사체의 변화확인 항생제 처리로 변화가 예상되는 대사체의 표준품에 대해 UPLC-TOF-MS 의 chromatogram 상에서 retention time과 peak를 확인하고 (그림 4), 이 를 뇨 중 대사체 profile 과 비교하여 항생제 처리에 의해 감소하는 대사체 2 가지 (5β-dihydrocortisol과 3-methylhistidine)를 확정하였다. 장내미생 물이 존재하지 않았을 때의 뇨에서 5β-dihydrocortisol의 농도가 감소함을 확인함으로써 glucogenesis에 관여하는 glucocorticoid 농도가 감소하였음을 예측할 수 있었다. 또한 3-methylhistidine의 뇨 중 농도 감소를 확인함으로 써 질소의 장간 내 순환이 영향을 받아 근육단백질의 분해가 감소하였을 것 으로 예상할 수 있었다.

그림 4. 뇨 시료 중 대사체 peak와 표준품 peak와의 비교 약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

27/ 27/82

-정량분석에 의한 항생제 처리 전후의 뇨 중 oxysterol과 담즙산의 농도 비교 시료 중 oxysterol과 담즙산의 농도는 각 물질의 integrated peak area와 주입한

internal

standards

(5α-cholestane,

d4-cholic

acid)의

integrated peak area와 비교하여 정량화하였고 그 결과는 표 5에 정리하였 다.

표 5. 항생제 처리 전 후의 담즙산과 oxysterol의 뇨 중 농도 (ng/mg of creatinine) Normal control

Antibiotic treated

Mean± SD

7α-OH-cholesterol

53.56±22.18

63.40±36.47

7α-OH-4-cholesten-3one

120.46±67.83

166.69±140.41

7-keto-cholesterol

13.76±2.94

18.70±9.73

22(R)-OH-cholesterol

7386.15±2360.23

24S-OH-cholesterol

N/D

25-OH-cholesterol

106.73±34.92

70.62±33.82*

Cholesterol

4008.03±1592.70

Deoxycholic acid (DCA)

46.27±18.30

29.84±14.35*

α-Muricholic acid (α-MCA)

118.11±30.75

139.63±63.87

Chenodeoxycholic acid (CDCA)

94.96±20.28

158.98±111.33*

Cholic acid (CA)

55.10±17.04

79.66±57.85

Ursodeoxycholic acid (UDCA)

67.37±12.00

75.01±45.29

Lithocholic acid (LCA)

N/D

β-Muricholic acid (β-MCA)

53.91±13.58

74.43±43.61

47.58±10.16

77.73±51.49*

Compounds

5β-cholestane

3α,7α,12α

-triol

5661.41±1606.1 0

2866.83±1271.6 7*

*: ≤ 0.05 between normal control and antibiotic treated group N/D : not detected

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

28/ 28/82

2) Pseudo germ-free rat model에서 아세트아미노펜의 대사변화 연구 혈장 및 뇨 중 아세트아미노펜과 그 대사체들 (그림 5)를 electrospray ionization LC/MS에서 분석하기 위하여 APAP와 그 대사체들의 이온화를 위 한 조건을 확립하고 MS/MS fragment pattern을 규명하였다.

HO3S O

N H

HO O

APAP-sulfate

N H

O HOOC

NH2

H2N

NAPQI

O HO

HOOC

N H

APAP-Cys

APAP-glutathione

APAP

O O HO

COOH OH O O OH

N H

O HO

N H

3-OH-APAP

N H

APAP-glucuronide

H N

3-Mercaptoacetaminophen

O O

H 3CO

HO APAP-NAC

3-CH3O-APAP

그림 5. 아세트아미노펜의 체내대사과정

이때 선정한 compounds와 그때의 MRM (multiple reaction monitoring) 조 건은 다음의 표 2 에 나타내었으며, 이 조건으로 모든 시료를 분석하였다. 이 때 몇몇 대사체들에 있어서 negative mode에서 감도가 월등히 높은 이유로 보다 sensitive한 분석을 위해 두 가지 모드로 분석을 진행하였다. Pseudo germ-free 군에서 모약물인 APAP와, APAP-Sul를 제외한 대사 체 모두에서 AUC, 반감기(T1/2)가 증가하고 clearance (Cl/F)와 분포용적 (Vd/F)은 감소하는 경향을 보여 약효가 오래 지속될 수 있음이 관찰되었다. APAP-Sul의 경우 실험한 두 군에서의 반감기 (T1/2)는 거의 비슷하였으나 AUC는

다른

대사체의

경우와

같이

항생제

처리군에서

증가하였으며

clearance (Cl/F)도 감소하였다. 그러나 통계적으로 유의적인 차이는 확인할 수 없었으며, 개체 간 차이가 크게 남을 확인하였다. 약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

29/ 29/82

3) Germ-free mouse에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구 정착동물(Gnotobiota), 무균동물(Germ-free)에서 대조군에 비하여 APAP 및 APAP-OMe의 농도가 증가하는 경향을 보였으나 APAP-Cys에서는 약물 투여 초기에는 그 농도가 정착동물(Gnotobiota), 무균동물(Germ-free)에서 감소하다 APAP 투여 후 10 시간 이후에는 증가하여 일관된 결과를 보이지 않았으며

APAP의

경우

약물

투여

초기에만

그

농도가

검출되었고

APAP-OMe, APAP-Cys이외의 다른 대사체는 분석 감도에 도달하지 못하였 다. 따라서 분석 감도를 증가시키는 분석 방법을 재확립하고 각 그룹의 개체수 를 증가하여 실험을 재 진행하였다.

4) 장내미생물 대사가 ginsenoside의 체내동태에 미치는 영향 - 모든 mouse에서 parent compound인 ginsenoside Re가 검출되었고, 일 부 mouse에서 그 대사체인 ginsenoside Rg1과 ginsenoside Rg2가 검출되 었지만 그 외의 대사체는 검출 되지 않았다. Re 50 mg/kg용량으로 투여 시 최고 혈중 농도는 평균 33 ng/ml, AUC는 69.9 ng·hr/ml로 나타났다. 반면 germ-free mouse에서는 최고 혈중농도 평균 139 ng/ml, 202 ng·hr/ml 로 더 증가되어 ginsenoside Re의 흡수가 conventional mouse에서보다 germ-free mouse에서 더 잘된 것으로 나타났다. 그러나, 두 그룹에서의 pharmacokinetic parameter에서 통계적인 유의성은 검증할 수 없었다. - Germ free rat 모델을 이용한 시험에서 50 mg/kg의 Re를 투여하였을 때 혈중농도나 대사 프로파일에서 정상군과의 특별한 차이를 보이지 않았다.

5) 장내미생물 대사가 baicalin의 대사에 미치는 영향연구 - 항생제 처리군과 대조군에 각각 baicalin을 50 mg/kg 용량으로 경구투여 하고 혈장 내의 baicalin의 농도를 측정한 결과 AUC는 대조군이 항생제 처리 군보다 1.4배 높았고 Tmax도 유의성 있게 차이가 보였다.

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

30/ 30/82

(3) 3차년도 1) Esculetin 및 Esculin의 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화 - Esculetin의 머무름 시간은 3.75 min이고, Esculin의 머무름 시간은 3.28 min이며 내부표준물질로 사용된 levafloxacin의 머무름 시간은 3.98 min으 로 검출되었다. Esculin과 Esculetin의 투여 후 blank plasma에서는 검출이 되지 않은 peak이 검출되었는데 머무름 시간은 Esculetin 투여 후 검출된 peak은 3.30 min, Esculin 투여 후 검출된 peak은 3.35 min이었다(그림 6) - Esculetin과 Esculin의 검량선은 좋은 직선성을 나타내며 정량한계는 20 ng/ml이었다 (그림 7, 표 6) - Esculetin 과 Esculin의 투여 후 blank plasma에서는 검출되지 않았던 peak 이 검출되었다 (그림 8). - Esculetin의 투여 후 AUC에서 유의성 있는 차이는 보이지 않았으나 Esculin 의 투여 후 Esculin과 Esculetin의 AUC에서는 대조군과 항생제 처리군이 유 의성 있는 차이를 보였다 (그림 9, 표 7, 8). - Esculetin 투여 후 pharmacokinetics parameter에서는 k(hr-¹), t1/2(hr) 이 대조군과 항생제 처리군에서 유의성 있는 차이를 보였고 Esculin 투여 후 AUCINF, AUClast, CL/F에서 유의성 있는 차이를 보였다. - Esculin의 투여 후 항생제 처리군에서 AUC가 높았고 CL/F는 감소하였다. 대 사되어 나타난 Esuletin에서 역시 AUC가 항생제 처리군에서 더 높았다. - 대조군과 항생제 처리군의 pharmacokinetics parameter에서 차이를 나타내 는 것으로 보아 체내동태 영향을 주는 것으로 고려된다.

그림 6. MS spectrum of esculetin, esculin and levafloxacin 약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

31/ 31/82

그림 7. SRM Chromatogram. (A)Blank plasma에서 SRM Chromatogram (B) 검량선의 200 ng/ml 에서의 Escelin, Esculetin 의 SRM Chromatogram (C) Esculetin의 경구 투여 후 2분에서의 SRM Chromatogram (D) Esculin 의 경구 투여 후 2분에서의 SRM Chromatogram

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

32/ 32/82

그림 8. Esculetin과 Esculin의 검량선

표 6. Esculetin 과 Esculin의 Accuracy 과 C.V. Esculetin

Accuracy

(ng/mL) 10 20 50 100 200 500 1000 2000 3000

(%) 76.17 89.22 103.49 109.83 110.10 107.80 107.48 101.83 94.08

C.V.(%) 11.98 7.71 3.69 1.93 1.28 1.13 0.98 4.77 1.02

Esculin

Accuracy

(ng/mL) 10 20 50 100 200 500 1000 2000 3000

(%) 84.03 92.24 104.92 107.97 104.86 103.32 104.42 102.17 95.96

C.V.(%) 12.98 4.98 2.77 1.99 2.17 1.32 1.40 6.76 1.03

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

33/ 33/82

그림 9. Esculetin의 경구 투여 후 Esculetin의 Time-Concentration curve 및 metabolite의 ratios curve

표 7. Esculetin의 투여 후 Esculetin의 Pharmacokinetic parameter Pseudo

Germ-Free

Esculetin

Control Rat (n=5)

AUCINF(ng·hr/ml)

345.67±139.02

724.10±363.46

AUClast(ng·hr/ml)

339.68±136.72

692.66±384.66

Cmax(ng/ml)

1717.12±849.72

5715.90±3831.51

k(hr-¹)

2.60±1.17

5.52±0.92**

t1/2(hr)

0.31±0.13

0.13±0.02*

Tmax(hr)

0.07±0.06

0.053±0.03

Rats

(n=5)

**P<0.005, *P<0.05

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

34/ 34/82

그림

10.

Esculin의

경구

투여

후

Esculin(A)과

Esculetin(B)의

Time-Concentration curve 및 metabolite의 ratios curve(C).

표 8. Esculin의 투여 후 Esculin의 Pharmacokinetics parameter Esculin

Control Rat (n=5)

Pseudo

Germ-Free

(n=5)

AUCINF(ng·hr/ml)

829.06±43.30

1061.41±50.90**

AUClast(ng·hr/ml)

820.75±41.11

1052.58±47.85**

1668.20±237.28

2402.68±747.18

k(hr-¹)

2.65±0.13

3.39±1.28

t1/2(hr)

0.26±0.01

0.23±0.08

Tmax(hr)

0.25±0.10

0.21±0.08

Cmax(ng/ml)

Rats

**P<0.005, *P<0.05 약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

35/ 35/82

표 9. Esculin의 투여 후 Esculetin의 Pharmacokinetics parameter Esculetin

Control Rat (n=5)

Pseudo

Germ-Free

(n=5)

AUCINF(ng·hr/ml)

130.01±57.33

331.99±119.28*

AUClast(ng·hr/ml)

98.94±37.76

314.50±117.53*

4.77±2.08

9.61±2.90*

k(hr-¹)

0.17±0.08

t1/2(hr) Tmax(hr)

0.23±0.12

Rats

0.08±0.02 0.21±0.08

**P<0.005, *P<0.05

2) 장내미생물 대사가 geniposide의 약동력학에 미치는 영향 연구 가. LC/MS/MS를 이용한 혈장시료 중 geniposide와 genipin의 정량분석법 개발 Rat 혈장 중 geniposide와 genipin을 분석하기 위하여 triple-quadrupole LC/MS/MS를 이용한 분석법을 개발하였다. Geniposide는 분자량이 388.14로 negative ion mode에서 molecular ion m/z 433.4가 검출되었으며 MS/MS product ion spectrum에서는 m/z225.1이 주요 fragment ion으로 검출되었고 genipin은 molecular ion m/z 225.2가 검출되었으며 MS/MS product ion spectrum에서는 m/z 101.2가 주요 fragment ion으로 검출되었다. 따라서 geniposide는 m/z 433.4

225.1, genipin은 m/z 225.2

준물질인 luteolin은 m/z 285.2

101.2, 내부표

133.1, digoxin은 825.2

779.2

transition을 이용한 MRM 방법으로 peak를 검출하였다. (그림 11, 12). Geiposide, Genipin과 internal standard들은 각각의 머무름 시간2.36, 2.54, 2.79, 2.77분 부근에서 검출되었고 위에서 기술한 검출조건에서 타 물질에 의 한 영향은 없었으며 우수한 selectivity를 나타냈다 (그림 13, 14).

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

36/ 36/82

나. 치자 색소 원료 중 geniposdie의 함량 측정 Geniposide

표준품

geniposide

및

(Wako,

genipin의

Japan)을

함량을

이용하여

측정하였다.

치자

색소

LC/MS/MS

원료

분석

중

결과,

geniposide의 함량은 47%, genipin은 3.1%로 측정되었다 (그림 15). 다. 항생제 처리 쥐에서의 geniposide의 약동력학 연구 -

정상 쥐와 항생제 처리 쥐에 각각 치자 색소 원료 (300 mg/kg geniposide)를 경구 투여한 후 혈장 중의 genipin 과 geniposide 농도를 측 정하였다. Geniposide를 경구투여 후 항생제 처리군과 대조군의 genipin 혈 중농도는 그림 16에 나타내었고 pharmacokinetic parameter은 표 8에 나 타냈다. AUC와 Cmax는

대조군과 항생제 처리군이 비슷한 값을 보였다.

Geniposide 혈중농도는 그림 17에 나타내었고 pharmacokinetic parmeter 은 표 9에 나타냈다. AUC와 Cmax는 그래프상에서 antibiotics-treated군이 높은 수치로 보이지만 유의성 있는 차이는 없었다. -

정상 쥐와 항생제 처리 쥐에 각각 치자 색소 원료 (300 mg/kg geniposide)를 경구 투여한후 24시간까지 feces를 수집하여 feces중의 geniposide와 genipin 양을 측정하였다. Feces 양은 그림 18과 표 10에 나 타냈다. Geniposide는 항생제 처리 쥐에서 정상 쥐보다 29배정도 높았으면 유의성 있는 차이가 나타났다.

라. Germ-free, gnotobiotic mouse에서 geniposide의 약동력학 연구 -

정상

mouse,

germ-free

mouse

그리고

gnotobiotic

mouse에서

geniposide를 각각 경구 투여한 후 혈장 중 genipin의 농도를 측정하였다. 결과는 그림 19과 표 11에 나타냈다. Genipin의 농도는 0.5, 1, 4시간에서 모두 정상 mouse, germ-free mouse 그리고 gnotobiotic mouse 순으로 농도가 높은 것으로 나타났다.

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

37/ 37/82

그림 11 Product ion mass spectra of genipin (A) and geniposide (B)

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

38/ 38/82

그림 12. Product ion mass spectra of digoxin (A) and luteolin (B)

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

39/ 39/82

그림 13. Multiple reaction monitoring chromatograms of (A) genipin and luteolin standard (1000 ng/ml), (B) plasma spiked with genipin(1000 ng/ml) and luteolin (200 ng/ml), (C) plasma taken 4h after oral administration of geniposide and luteolin (200 ng/ml)

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

40/ 40/82

그림 14. Multiple reaction monitoring chromatograms of (A) geniposide (1000ng.ml) and digoxin standard (100 ng/ml), (B) plasma spiked with geniposide(1000 ng/ml) and digoxin (100 ng/ml), (C) plasma taken 0.5h after oral administration of geniposide and digoxin (100 ng/ml)

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

41/ 41/82

그림 15. Multiple reaction monitoring chromatograms of (A) genipin and (B) geniposide in the raw dye material from gardenia fruits

1 80 0 1 60 0

N orm a l A ntib iotic s-tre ated

1 40 0 1 20 0 1 00 0 80 0 60 0 40 0 20 0 0 0

T im e (h r)

그림 16. Plasma concentration of genipin after oral administration of the raw dye material from gardenia fruits (300 mg/kg as geniposide) to rats (n=5) 약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

42/ 42/82

표 10. Pharmacokinetic parameters for genipin Parameter

Normal

Antibiotics-treated

15.4 ± 5.3

17.9 ± 4.3

Tλ1/2 (hr)

3.2 ± 0.4

6.3 ± 1.1

Tmax (hr)

4.0 ± 2.4

3.7 ± 2.4

AUC

(μg·hr/mL)

Cmax (ng/mL)

1513 ± 366

1534 ± 291

1200 Normal Antibiotics-treated

1000

800

600

400

200

0 0

Time (hr)

그림 17. Plasma concentration of geniposide after oral administration of the raw dye material from gardenia fruits (300 mg/kg as geniposide) to rats (n=5)

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

43/ 43/82

표 11. Pharmacokinetic parameters for geniposide Parameter

Normal

Antibiotics-treated

9.5 ± 3.6

11.9 ± 2.1

Tλ1/2 (hr)

3.5 ± 1.1

3.3 ± 0.2

Tmax (hr)

2.1 ± 1.4

3.1 ± 2.4

AUC

(μg·hr/mL)

Cmax (ng/mL)

993.4 ± 215.8

1009.8 ± 41.7

20000

18000

Geniposide Genipin

16000

14000

12000

10000

8000

6000

4000

2000

0 Normal

Germ-free

그림 18. Total quantity of geniposide and genipin in feces after oral administration of the raw dye material from gardenia fruits (300 mg/kg as geniposide) to rats (n=5)

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

44/ 44/82

표 12. Total quantity of geniposide and genipin in feces

Geniposide (µg) Genipin (µg)

Normal

Antibiotics-treated

509.6 ± 876.7

14798.0 ± 3290.8

1601.6 ± 1467.8

397.5 ± 216.1

12000

Normal Germ-free Gnotobiotic

10000

8000

6000

4000

2000

0 0.5

Time (hr)

그림 19. Plasma concentration of geniposide after oral administration of geniposide to mouse (n=5)

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

45/ 45/82

표 13. Pharmacokinetic parameters for genipin

P< 0.05, Compared to nomal mouse.

3) Pseudo germ-free germ-free rat model의 model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구 가. Validation 결과 1) Linearity 표 14. 아세트아미노펜 및 대사체의 linearity Compound

Concentration range (µg/mL)

Slope

Y-intercept

Linearity (r)

APAP

0.1-100

0.4700

0.0220

0.9973

APAP-Glc

0.1-100

0.1050

0.00365

0.9998

APAP-Sul

0.1-100

1.2200

0.02290

0.9982

APAP-NAC

0.01-5.0

0.6080

-0.00019

0.9996

APAP-Cys

0.01-5.0

0.0877

-0.00038

0.9967

APAP-Glth

0.01-2.5

0.0395

-0.00004

0.9974

APAP-OMe

0.01-1.0

1.3700

-0.00057

0.9998

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

46/ 46/82

(2) Precision and accuracy 표 15. 아세트아미노펜 및 대사체의 Intra- and Inter-day precision 및 accuracy Intra-day (n=5) Compound

APAP

APAP-Glc

APAP-Sul

APAP-Glth

APAP-NAC

APAP-Cys

APAP-OMe

Conc. (µg/mL)

Inter-day (n=5)

Measured

Accuracy

Precision

conc. (µg/mL)

(%)

(C.V.%)

Measured conc. (µg/mL)

Accuracy

Precision

(%)

(C.V.%)

0.1

0.091±0.004

91.3

4.2

0.093±0.004

93.0

3.8

0.6

0.620±0.039

103

6.3

0.646±0.026

107.6

4.0

5.798±0.379

96.6

6.5

5.940±0.195

99.0

3.3

58.84±3.840

98.1

6.5

56.62±1.398

94.4

2.5

0.1

0.099±0.009

98.9

8.7

0.100±0.004

100.1

4.4

0.6

0.645±0.036

108

5.6

0.655±0.033

109.2

5.1

6.082±0.279

101

4.6

6.252±0.172

104.2

2.7

61.80±2.035

103

3.3

60.20±1.529

100.3

2.5

0.1

0.106±0.012

106

11.6

0.100±0.007

100.1

6.6

0.3

0.319±0.024

106

7.6

0.302±0.035

100.8

11.5

5.942±0.545

99.0

9.2

5.831±0.374

97.2

6.4

57.53±4.387

95.9

7.6

56.12±2.484

93.5

4.4

0.01

0.010±0.002

100

16.5

0.011±0.001

112.4

5.5

0.03

0.032±0.003

106

9.4

0.033±0.001

108.8

2.4

0.15

0.161±0.013

107

8.0

0.153±0.004

102.3

2.3

0.6

0.601±0.032

100

5.3

0.641±0.028

106.8

4.3

0.01

0.011±0.001

105

6.3

0.009±0.001

95.0

11.1

0.03

0.032±0.002

105

5.4

0.031±0.002

102.8

6.1

0.15

0.150±0.002

100

1.2

0.154±0.007

102.5

4.5

0.60

0.578±0.041

96.4

7.1

0.625±0.023

104.1

3.7

0.01

0.011±0.001

107

11.2

0.010±0.001

96.5

11.1

0.03

0.028±0.001

93.7

3.0

0.030±0.001

98.7

4.7

0.15

0.148±0.012

98.7

8.1

0.149±0.005

99.1

3.0

0.60

0.575±0.043

95.9

7.4

0.618±0.048

103.0

7.8

0.01

0.009±0.001

90.7

9.0

0.009±0.000

92.3

4.0

0.03

0.028±0.001

94.0

4.0

0.028±0.002

92.0

5.6

0.15

0.140±0.005

93.2

3.4

0.140±0.004

93.0

2.6

0.60

0.611±0.026

102

4.3

0.606±0.043

101.0

7.0

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

47/ 47/82

(3) 회수율과 matrix effect 표 16. 아세트아미노펜 및 대사체의 회수율과 matric effect Compound

APAP

APAP-Glc

APAP-Sul

APAP-Glth

APAP-NAC

APAP-Cys

APAP-OMe

Concentration

Recovery (%)

Matrix effect (%)

0.6

97.86

97.75

101.23

96.26

104.91

105.50

0.6

99.57

99.35

98.94

98.69

97.91

104.51

0.3

95.69

131.66

97.73

114.79

94.74

103.02

0.03

98.41

89.83

0.15

73.92

92.84

0.60

74.13

98.57

0.03

83.50

98.88

0.15

90.27

102.42

0.60

92.64

103.18

0.03

80.00

85.02

0.15

72.34

85.18

(µg/mL)

0.60

83.43

87.26

0.03

87.19

89.65

0.15

93.08

88.21

0.60

97.96

89.15

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

48/ 48/82

(4) 안정성 표 17. 아세트아미노펜 및 대사체의 안정성평가 결과

Compound

APAP

APAP-Glc

APAP-Sul

APAP-Glth

APAP-NAC

APAP-Cys

APAP-OMe

Freeze

&Thaw

Accuracy(

( 3cycle ) Accuracy(

( 1cycle ) Accuracy(

Accuracy(

0.6

%) 106.6

%) 103.6

%) 95.10

%) 102.0

%) 110.6

100.9

104.5

91.75

103.8

108.8

102.4

106.4

98.83

108.4

110.8

0.6

102.0

100.0

94.35

101.6

100.0

99.07

102.5

91.24

99.8

100.4

99.59

104.3

99.47

107.1

103.2

0.3

98.14

109.4

90.00

100.6

87.19

96.27

104.1

90.63

110.7

99.46

100.9

99.79

94.42

110.3

106.7

0.03

93.00

92.54

26.36

98.71

104.7

0.15

93.30

93.52

15.38

104.2

113.1

Conc. (µg/mL)

Short-ter

Post-prepa

m (RT)

rative

Accuracy(

Long-term (-80℃)

0.6

101.7

95.85

29.65

86.09

107.9

0.03

106.0

104.7

23.32

99.56

94.34

0.15

97.12

103.1

13.56

102.6

112.6

0.6

99.01

106.7

13.32

103.8

106.6

0.03

107.8

104.9

24.09

91.96

103.2

0.15

106.0

98.47

20.04

102.6

107.5

0.6

115.2

102.9

12.92

94.03

105.1

0.03

98.93

98.35

74.70

86.45

97.67

0.15

96.99

98.12

68.97

88.52

104.4

0.6

99.14

98.95

75.42

93.56

94.23

표 18. 아세트아미노펜과 대사체 및 내부표준물질의 표준원액 안정성 Compound

Accuracy (%)

APAP

105.0

APAP-Glc

101.7

APAP-Sul

105.0

APAP-OH

101.1

APAP-Glth

104.3

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

49/ 49/82

APAP-NAC

101.5

APAP-Cys

102.7

APAP-OMe

102.8

APAP-d4

101.2

APAP-Glc-d3

97.18

나. Pseudo germ-free rat과 control rat에서의 아세트아미노펜 및 대사체 변화 (1) 아세트아미노펜 및 대사체의 혈중 농도 그림 20에 pseudo germ-free rat과 control rat에서 모약물인 아세트아미 노펜과 그 대사체들의 시간에 따른 농도 변화를 semi-log scale로 나타냈다.

그림 20. 아세트아미노펜 및 대사체의 혈중농도 profile

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

50/ 50/82

Control rat과 pseudo germ-free rat에서 모약물인 아세트아미노펜과 그 대 사체의 AUC를 비교하였을 때, 대조군에 비해 pseudo germ-free군에서 APAP-Sul를 제외한 5가지 대사체들과 모약물인 아세트아미노펜의 AUC가 증가되는 경향이 보였으나 통계적으로 유의적인 차이를 나타낸 것은 APAP와 APAP-Glth이었다. (2) PK parameter 시간에 따른 혈중농도 data를 Winnonlin program을 이용하여 처리하여 PK parameter를 구하여 표 19에 나타냈다. 표 19에서 *으로 체크한 부분은 T-test를 통해 p-value 값이 0.05이하를 나타내는 경우이다.

표 19. Pseudo germ-free 와 control rat에서의 PK parameter (A) APAP Control

Pseudo germ-free

p-valu e

T1/2(hour)

3.41±0.38

3.88±0.51

0.052

Tmax(hour)

0.23±0.19

0.44±0.34

0.363

Cmax(μg/ml)

48.55±26.69

76.80±12.52

0.242

AUClast(h×μg/ml)

211.40±90.67

384.38±73.32

0.035 *

216.58±86.90

391.28±72.97

0.028 *

Vd/F(ml/kg)

4.96±1.78

2.95±0.26

0.191

Cl/F (ml/h/kg )

1.03±0.39

0.52±0.09

0.105

AUCINF_obs(h×μg/ ml)

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

51/ 51/82

(B) APAP-Glc Control

Pseudo germ-free

p-value

T1/2(h)

2.82±0.34

2.82±0.64

0.978

Tmax(h)

1.60±0.49

1.25±0.42

0.277

Cmax(μg/ml)

31.58±13.71

37.28±13.50

0.535

AUC0-t(h×μg/ml)

162.32±68.38

225.99±94.06

0.247

163.76±76.11

227.35±95.34

0.250

Vd/F(ml/kg)

5.88±2.41

4.04±1.69

0.229

Cl/F (ml/h/kg )

1.47±0.63

1.00±0.36

0.229

AUC0-∞ (h×μ 0-∞(h×μ g/ml)

Pseudo germ-free

p-value

T1/2(h)

7.22±2.39

8.65±7.08

0.664

Tmax(h)

0.50±0.00

0.75±0.42

0.203

Cmax(μg/ml)

41.64±9.31

32.38±10.35

0.176

AUC0-t(h×μg/ml)

250.69±69.80

190.88±114.25

0.332

297.79±77.01

226.26±154.98

0.351

Vd/F(ml/kg)

7.30±2.61

12.32±9.40

0.261

Cl/F (ml/h/kg )

0.71±0.16

1.11±0.42

0.072

AUC0-∞ (h×μ 0-∞(h×μ g/ml)

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

52/ 52/82

(D) APAP-Glth Control

Pseudo germ-free

p-value

T1/2(h)

3.64±0.77

3.35±1.00

0.621

Tmax(h)

0.97±0.85

0.79±0.64

0.737

Cmax(μg/ml)

0.56±0.14

0.73±0.19

0.132

AUC0-t(h×μg/ml)

3.56±1.54

6.53±2.35

0.039 *

3.64±1.68

6.59±2.33

0.038 *

Vd/F(ml/kg)

361.83±188.11

158.52±64.44

0.096

Cl/F (ml/h/kg )

67.91±33.90

32.85±8.74

0.107

AUC0-∞ (h×μ 0-∞(h×μ g/ml)

가. (E) APAP-Cys Control

Pseudo germ-free

p-value

T1/2(h)

3.46±0.67

3.50±0.74

0.934

Tmax(h)

1.60±0.49

2.92±2.50

0.259

Cmax(μg/ml)

1.19±0.62

1.08±0.20

0.747

AUC0-t(h×μg/ml)

7.92±4.28

11.28±2.81

0.215

8.06±4.72

11.44±2.81

0.208

Vd/F(ml/kg)

174.50±101.16

93.98±36.44

0.191

Cl/F (ml/h/kg )

33.89±18.43

18.33±4.15

0.168

AUC0-∞ (h×μ 0-∞(h×μ g/ml)

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

53/ 53/82

(F)

APAP-NAC Control

Pseudo germ-free

p-value

T1/2(h)

4.05±0.63

4.52±0.93

0.363

Tmax(h)

2.20±0.98

4.92±3.38

0.111

Cmax(μg/ml)

0.60±0.27

0.61±0.15

0.924

AUC0-t(h×μg/ml)

4.67±2.33

7.38±2.13

0.100

4.82±2.53

7.67±2.26

0.086

Vd/F(ml/kg)

331.84±201.37

183.98±77.19

0.222

Cl/F (ml/h/kg )

53.82±27.39

27.99±8.00

0.133

AUC0-∞ (h×μ 0-∞(h×μ g/ml)

(G) APAP-OMe Control

Pseudo germ-free

p-value

T1/2(h)

5.57±1.49

5.21±1.58

0.728

Tmax(h)

1.25±0.67

1.58±0.49

0.423

Cmax(μg/ml)

0.02±0.01

0.03±0.02

0.288

AUC0-t(h×μg/ml)

0.14±0.07

0.31±0.18

0.083

0.16±0.08

0.32±0.18

0.081

Vd/F(ml/kg)

11595±3811

6722.6±5735.1

0.141

Cl/F (ml/h/kg )

1597.7±890.4

801.1±475.6

0.159

AUC0-∞ (h×μ 0-∞(h×μ g/ml)

T1/2: eliminationhalf-life Tmax: time required to reach Cmax Cmax: maximum plasma concentration AUC0-t:area under the plasma concentration-time curve from 0 to time t AUC0-∞ ∞: area under the plasma concentration-time curve from 0 to time infinity Vd/F: apparent volume of distribution

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

54/ 54/82

Cl/F: oral clearance. The values shown are the mean ± SD. Significantly different from control group *(p < 0.05)

Control rat과 pseudo germ-free rat에서 모약물인 아세트아미노펜과 그 대 사체의 AUC를 비롯한 PK parameter를 비교하였을 때, pseudo germ-free 군과 대조군에서의 수치적 차이를 보였으나, APAP과 APAP-Glth의 AUC값 에서만 유의적인 차이를 확인할 수 있었다. 두 물질 모두 pseudo germ-free 군에서 대조군에 비해 약 2배정도 높은 AUC값을 가지는 것을 확인할 수 있었 다. 대사율에 변화를 알아보기 위해서, 각 대사체별로 AUC0-t대사체를 AUC0-t전 구체로 나눈 값을 표 20에 나타내었다. 표 20에서 ** 로 체크한 것은 p-value < 0.01 이하로 유의성이 있음을 나타낸다. 표 20. 대조군과 pseudo germ-free 군에서 각 대사체별 AUC0-t대사체 /AUC0-tAPAP 비율

APAP-Glc /APAP APAP-Sul /APAP APAP-Glt h/APAP APAP-Cy s/APAP APAP

0. 66

0.107

1 1. 09

0.295

0.005

0.001

0.185

0.378

0.284

0.009**

0.004

0.427

0.009

0.908

0.006

0.751

0.000

0.308

7 0. ±

0.009

1 0. 01

2 0.

5 0. 03

p-value

7 0.

6 0. 01

germ-free

03 0 0.

0.005

0.000

8 APAP-OMe/APAP

Pseudo

Control

02 0 0.001

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

55/ 55/82

(3) Urine data urine 의 경우, 시간별로 취한 urine을 각각 분석한 뒤에서 0-30 시간동안의 data를 취합하여 나타내었으며 각 뇨 량으로 보정하였다 (표 21). 표 21. 아세트아미노펜 및 대사체의 뇨 중 배설량 Pseudo

Control

Mean

S.D.

Mean

S.D.

APAP-Glc

(mg)

27.7

23.6

32.2

9.02

0.74

APAP-Sul

(mg)

58.1

15.4

35.6

5.67

0.06

APAP-NAC

(mg)

6.23

4.03

7.38

2.06

0.62

APAP-Cys

(mg)

0.08

0.06

0.11

0.04

0.47

APAP

(mg)

5.3

0.5

3.24

1.14

0.01**

APAP-Glth

(mg)

APAP-OMe

(µg)

8.97

3.36

7.19

3.56

0.45

germ-free

P-valu e

대조군에 비해 pseudo germ-free 군에서 APAP의 뇨 배설량은 유의적 차이 를 보이며 감소하였고, APAP-Sul를 제외한 포합 대사체들의 뇨 중 배설량은 증가하는 경향을 보였으며,

APAP-Sul의 뇨 중 배설량은 감소하는 경향을 보

였다.

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

56/ 56/82

4) Germ-free mouse model의 model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구 (1) 아세트아미노펜 및 대사체에 대한 혈 중 농도 정량

200 mg/kg 용량 투여시의 시간에 따른 아세트아미노펜 및 대사체의 혈 중 농 도는 그림 21. 에 나타내었다. 그림 21. 시간에 따른 아세트아미노펜 및 대사체의 혈 중 농도 곡선

(200

mg/kg 용량 투여시) 300 mg/kg 용량 투여시의 시간에 따른 아세트아미노펜 및 대사체의 혈 중 농도는 그림 22. 에

나타내었다.

그림 22. 시간에 따른 아세트아미노펜 및 대사체의 혈 중 농도 (300 mg/kg 용량 투여시)

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

57/ 57/82

(2) 아세트아미노펜 및 대사체에 대한 pharmacokinetic parameter 아세트아미노펜 및 대사체에 대한 혈 중 농도 데이터에 대해 Winnonlin 프로 그램을 이용하여 PK parameter (반감기(T1/2), Cmax, Tmax, AUC 및 분포용적 (Vd)과 Clearance를 구하였다 (표20, 표21, 그림 23). 표 22 와 23를 기반으 로 유의성 있는 결과에 한해 그림 23에 도식화 하였다. 표 22와 23에서 같이 APAP-Sul가 주대사체였던 rat의 결과와는 달리 mouse 에서는 APAP-Glc가 주 대사체여서 종간 차이를 확인할 수 있었다. 300mg/kg 투여 germ-free 군 에서 APAP와 APAP-Glc, APAP-Sul의 AUC이 대조군과 유의적 차이를 보 였는데, APAP와 APAP-Sul의 AUC는 증가하였고, APAP-Glc의 AUC는 감 소하였다. 200mg/kg 투여 germ-free 군에서는 APAP-Glth의 AUC가 대조 군과 유의적인 차이를 보이며 감소하였다. Clearance의 경우, AUC와는 반대 의 경향을 보였다. 표 22. 200mg/kg 로 아세트아미노펜 투여 시 pharmacokinetic parameter (A) APAP

Mean

T1/2(hour)

0.81

0.16

Tmax(hour)

1.00

0.00

Cmax(μg/ml)

13.61

4.29

29.64

13.82

AUClast(h×μg/ml ) AUCINF_ob s(h×μg/ml)

Vd/F(ml/kg)

Control SD

Germ-free Mean SD 0. 1.62 59 0. 1.20 45 4. 16.04 81 11 32.55

Mean

Gnotobiota SD

1.51

0.27

1.00

0.00

17.98

4.22

29.96

4.26

32.73

4.19

13523.86

2964.57

6197.64

857.52

1 11 29.88

13.79

30.69

.4 3 26

9487.4 0

4699.92

15546.7

.4 1 27

Cl/F

(ml/h/kg )

8021.6 4

3764.70

7285.93

65 .7 8

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

58/ 58/82

(B) APAP-Glc

Control M

l) AUCINF_obs

Gnotobiota

T1/2(hour) Tmax(hour) Cmax(μg/ml) AUClast(h×μg/m

Germ-free ea

Mean

2.27 1.20 130.86

0.19 0.45 37.07

2.68 1.40 48.32

0.41 0.55 5.33

2.32 1.00 55.64

0.17 0.00 6.77

383.08

170.67

213.09

32.11

280.29

29.12

(h×μg/ml) Vd/F(ml/kg)

383.30

170.60

213.67

32.43

280.48

29.15

2002.47

889.97

3667.09

585.18

2402.06

272.63

Cl/F(ml/h/kg )

598.78

229.89

954.49

153.05

719.04

72.05

Control

T1/2(hour) Tmax(hour) Cmax(μg/ml)

Mean 1. 09 1.

Germ-free SD

0.40 0.45

20 4.

2.33

Mean 1. 95 1.

SD 0.85 0.45

20 2.

0.57

Gnotobiota Mean 2.

SD 0.

49 1.

29 0.

00 3.

00 0.

AU Clast (h× μg/

5.14

1.60

ml) AUCINF_obs

(h×μg/ml)

4.98

43 Vd/F(ml/kg)

(ml/h/ kg )

1.72

8 73

22379.4

28129.4

03 Cl/F

27353.5

10406.0

25184.3

5429.45

20227.8 1

3199.39

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

59/ 59/82

(D) APAP-Glth

Control

Mean

T1/2(hour)

2.72

0.52

Tmax(hour)

1.00

0.00

Cmax(μg/ml)

5.31

3.10

12.85

5.40

12.88

5.39

AUClast(h×μg/m l) AUCINF_obs (h×μg/ml)

Vd/F(ml/kg)

Cl/F(ml/h/kg )

80861.5

67041.0

Germ-free Mean 2.

1. 1.

38775.2

0.55

58 5.

1.08

49 5.

1.08

50 13 52 95

19119.5

11518.2

37752.1

SD 0.

0.45

Mean 2.

0.36

Gnotobiota

8751.53

25865.9 6

7657.96

(E) APAP-Cys T1/2(hour) Tmax(hour)

Control Mean 2. 11 1. 20

Germ-free SD

0.13 0.45

26 Cmax(μg/ml)

AUClast(h×μg/m l) AUCINF_obs (h×μg/ml)

Vd/F(ml/kg)

2. 32 1. 20

SD 0.50 0.45

24 6.16

Mean 2.

26 8.04

31.24

31.23

29.54

29.51

2385.22

852.19

73 .4

2851.67

6 Cl/F (ml/h/kg )

Mean

Gnotobiota

2358.47

93 .2

4369.51

8 825.13

2720.20

1192.99

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

60/ 60/82

(F) APAP-NAC T1/2(hour) Tmax(hour)

Cmax(μg/ml)

AUClast(h×μg/ml ) AUCINF_obs (h×μg/ml)

Vd/F(ml/kg)

Control Mean 2. 25 1. 20 10 .1

Germ-free SD 0.25 0.45

3.13

7 38 .6

15.93

15.92

5995.09

6. 19

0.45

1.20

3.89

3.88

2 25 9766.74

65 Cl/F (ml/h/kg )

0.69

3 28

5 19 93

49 1.

3 38 .6

Mean 2.

79 1.

7812.13

74 2605.55

7170.21

990.54

Gnotobiota Mean 2.

12 1.

39 0.

3 40

3 11

7 17

7 10

5401.31

2125.52

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

61/ 61/82

표 23. 300mg/kg 로 아세트아미노펜 투여 시 pharmacokinetic parameter (A) APAP

Control M

Germ-free

Gnotobiota

Mean

T1/2(hour)

3.09

1.02

2.45

0.40

2.98

1.07

Tmax(hour)

1.00

0.00

1.00

0.00

1.00

0.00

Cmax(μg/ml) AUClast(h×μg/ml

23.76

3.62

30.38

4.63

30.18

13.47

58.51

12.63

84.25

12.06

100.77

30.23

59.27

13.42

84.39

11.99

101.81

30.76

) AUCINF_obs (h×μg/ml) Vd/F(ml/kg) Cl/F(ml/h/kg )

22649.5 6 5261.06

5817.71 1104.17

12857.1 7 3611.30

3427.04 497.01

13090.4 2 3205.97

3852.29 1123.80

(B) APAP-Glc

Control Mean

T1/2(hour) Tmax(hour)

Cmax(μg/ml)

AUClast(h×μg/ml ) AUCINF_obs (h×μg/ml)

Vd/F(ml/kg)

3. 97 1. 40 12 6.

Germ-free SD

1.63 0.55

45.14

48 47 6.

61.95

38 2. 00 77 .5

0.68 0.00

13.66

34.82

29 37 75.24

33.85

Mean 0.

32 1.

55 0.

60 70

55 13

6 42

9 10

43 46

64 82

.2 2

69 39

42 30

1000.66

624.00

938.32

0 107.76

805.82

.7 1

71.59

06 34

6 Cl/F(ml/h/kg )

6 37

04 49 1.

Mean

Gnotobiota

656.45

28 8. 50 122.18

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

62/ 62/82

Control M

Germ-free

Gnotobiota

Mean

T1/2(hour)

3.61

0.81

3.48

0.39

3.34

0.27

Tmax(hour)

1.20

0.45

1.40

0.55

1.00

0.00

Cmax(μg/ml) AUClast(h×μg/ml

4.15

1.29

5.53

0.93

3.63

1.42

13.65

3.12

23.83

3.16

15.76

3.52

13.91

3.38

24.04

3.17

16.87

2.46

113353

10017.41

86692.8

10694.6

1 18059.5

) AUCINF_obs (h×μg/ml) Vd/F(ml/kg) Cl/F(ml/h/kg )

22688.7 6

5884.19

63349.6 3 12670.1 3

9905.50 1836.11

2427.85

(D) APAP-Glth T1/2(hour) Tmax(hour) Cmax(μg/ml) AUClast(h×μg/ml ) AUCINF_obs (h×μg/ml)

Vd/F(ml/kg)

Cl/F(ml/h/kg )

Germ-fr

Control Mean

ee Mean

36 1.

50 0.

49 2.

89 0.

60 6.

55 1.

00 7.

00 1.

26 25

04 26

3 27

7 82

9 27

Gnotobiota Mean

3.41

0.81

1.40

0.55

4.50

2.03

20.39

8.27

21.87

9.33

3 55

73525.3

88 11700.0

46 11180.9

3698.18

1653.93

15539.5 3

26583.81

5961.14

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

63/ 63/82

(E) APAP-Cys

Mean

T1/2(hour)

5.68

Tmax(hour)

1.20

Cmax(μg/ml)

14.02

AUClast(h×μg/ml ) AUCINF_obs (h×μg/ml)

Vd/F(ml/kg)

Germ-fre

Control

68.33

SD 2. 40 0. 45 3. 58 22 .6

Mean

5.10

1.16

2.00

0.00

16.70

4.15

96.92

32.53

4 32 76.46

101.36

33.27

8 74 32444.4

24396.7

12046.19

7 Cl/F(ml/h/kg )

4388.45

1389.99

Gnotobiota

3235.49

1067.80

Mean

62 2.

26 2.

40 8.

07 1.

73 62

90 21

9 67

0 23

5 31

0 10

4753.74

1338.81

(F) APAP-NAC T1/2(hour) Tmax(hour) Cmax(μg/ml) AUClast(h×μg/ml ) AUCINF_obs (h×μg/ml)

Vd/F(ml/kg)

Cl/F(ml/h/kg )

Germ-fr

Control Mean

ee Mean

18 1.

33 0.

14 2.

67 0.

40 9.

55 1.

00 6.

00 0.

50 51

99 42

9. 87

5. 89

Gnotobiota Mean

3.50

0.54

1.60

0.55

6.13

0.53

41.92

17.73

47.20

16.07

4 52

6 43

1 33

9 61

2 42

36476.6

5861.26

1064.81

7011.23

962.44

5. 79 99

7056.85

17763.66

2837.79

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

64/ 64/82

그림 23. 아세트아미노펜 투여 후

AUC 와 Cl/F ; (A) APAP, (B)

APAP-Glc, (C) APAP-Sul, (D) APAP-Glth.

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2-1세부과제

65/ 65/82

(3) 아세트아미노펜와 그 대사체들의 비율 변화의 의의 대부분의 약물은 체내에서 여러 가지 대사효소에 의해 다양한 대사체를 생성 한다. 정상 상태에서는 체내 모약물 대비 약물 대사체들이 일정한 비율로 생성 되지만, 체내 대사 활성이 변화 등과 같은 생리적 변화에 의해서는 체내 모약 물 대비 약물 대사체들의 비율이 변화된다. 아세트아미노펜의 경우, 독성 유발 대사체를 갖고 있기 때문에 아세트아미노펜에 대한 대사체 생성 비율은 중요한 의의를 갖을 것으로 생각된다. 따라서 모약물 대비 대사체들의 생성 비율을 확 인하였다 (그림 24).

그림 24. 장내 미생물에 의한 아세트아미노펜 투여 후의 대사체/모약물 비율의 변화

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

66/ 66/82

그림 24에서 보는 바와 같이 대조군에 비해 germ-free 군에서 APAP-Sul를 제외한 포합대사율이 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. Mouse에서 아세트아 미노펜의 주대사체인 glucuronide 포합체의 생성율이 두 용량 투여 모두에서 감소함을 확인하였으며, 이로인해 혈중 아세트아미노펜의 혈 중 AUC의 증가에 기여할 것으로 사료된다. 또한 정착동물군(Gnotobiota)에서의 포합대사체 생성 비율은 germ-free 군과 정상대조군의 중간정도로 관찰되어 완전하지는 않지 만 대사율이 어느 정도 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 대사효율 회복은 APAP-Glth 생성율 변화에서 유의적인 차이를 보이며 뚜렷이 관찰되 었다. 5) 장내미생물에 의한 내인서 대사체 변화 연구 (1) global metabolomic profiling 분석법의 재현성 확인 기기분석에 얻은 모든 QC 표본과 시료들의 피크 변동값에 대해서 주성분 분석 (principal component analysis; PCA)을 실시하여 도출된 score plot에서 모 든 QC 표본의 위치를 확인하였다 (그림 25). 주성분 분석의 score plot에서 가까이 위치할수록 개체가 갖는 변동값이 유사함을 시사하기 때문에, 주성분 분석의 score plot에서 모든 QC 표본이 가까이 위피함을 확인하여 시료 분석 방법의 재현성을 확인하였다.

그림 25. 모든 QC 표본과 시료들의 피크 변동값에 대해서 주성분 분석 (principal component analysis; PCA)를 실시하여 작성한 score plot이다. a 은 포지티브 이온화 모드의 결과이며, b은 네가티브이온화 모드의 결과이다. QC 표본은 초록색으로 표시되었다.

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

67/ 67/82

표 24. 테스트믹스에서 얻은 크로마토그램으로부터 특정한 추출 이온 크로마토그램 RT

Ion

intensity

Standard chemical in testmixture Positive mode

Average

CV%

Average

CV%

Acetaminophen

4.25

0.00

5959.00

732.50

12.29

Caffeine

5.00

0.01

0.23

7.98

0.00

3289.0 7 367.02

11.37

Reserpine

28916.0 0 2835.00

Negative mode Adipic acid

4.34

0.00

Hippuric

5.11

0.00

636.67 8511.00

27.01 305.18

8.25

0.00

19612.0 0

985.29

acid

Glycocholic acid

12.95 4.24 3.59 5.02

a. 머무름 시간, b. 이온 강도

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

68/ 68/82

표 25. QC 표본에서 얻은 크로마토그램으로부터 특정한 추출 이온 크로마토그램 XIC from QC samples RT

m/z

Ion intensity

Averag e

CV%

Average

CV%

Positive mode 1.45

166.08

1.47

0.00

76.00

2.12

271.15

2.14

0.01

0.54

21.66

3.87

568.27

3.91

0.00

2.21

4.12

384.12

4.13

0.00

47.80

5.71

221.12

5.73

0.01

0.20

157.25

7.13

410.18

7.15

0.00

152.29

12.11

300.30

12.13

0.00

0.86

1.6 1 0.5 9 0.2 9 2.3 4 1.9 7 4.9 9 0.0 7

2.12 2.74 12.89 4.89 1.26 3.28 8.24

Negative mode 1.58

231.10

1.57

0.00

19.28

3.00

215.10

3.01

0.00

28.62

4.73

188.04

4.75

0.01

0.12

19.23

5.46

429.08

5.46

0.00

36.25

8.75

141.13

8.75

0.00

7.20

3.76

388.14

3.77

0.01

0.31

3.75

10.88

221.15

10.89

0.00

1.83

0.7 4 0.2 3 1.9 5 1.6 7 0.6 3 0.0 4 0.0 9

3.84 0.81 10.14 4.60 8.72 1.14 4.94

a. 머무름 시간, b. 이온 강도

QC 표본과 테스트믹스에서 얻은 크로마토그램으로부터 특정한 추출 이온 크로 마토그램(extracted ion chromatogram;XIC)을 얻었고 이들의 이온 강도와 머무름 시간을 비교했다. 표 24, 25에서 알 수 있듯이 확인된 모든 XIC의 이 온 강도와 머무름 시간이 %변동계수(%CV)가 15% 이내로 유의적인 차이가 없음을 확인하여 분석방법의 안정성과 재현성을 확인하였다. 약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

69/ 69/82

(2) 장내 미생물에 의한 뇨 중 내인성 대사체 변화 검출을 위한 global metabolomic profiling 시료들의 피크 변 동값에 대해서 OPLS-DA을 실시한 결과 대조군과 pseudo germ-free군이 뚜렷이 구분됨을 확인되었다 (그림 26). 따라서 두 그룹 간 뇨 중 대사체 프로파일이 다름을 알 수 있었다.

그림 26. 시료들의 피크 변동값에 대해서 OPLS-DA를 실시하여 작성한 score plot. A은 positive ionization의 결과이며, b은 negative ionization의 결과이다. 빨간색 삼각형은 pseudo germ-free 군을 검정색 원은 대조군을 나 타낸다.

유의한 값으로 인정되는 피크들에 대해 데이터베이스 비교와 high resolution mass 분석에 의한 exact mass와 조각이온 분석을 실시하여 장내미생물에 의 해서 영향을 받는 대사체들은 표 26과 같다.

표 26. 장내미생물에 의해서 영향을 받는 대사체들 RT_m/z (Formula)

Fragmentation

Identified

metabolite

Fold change a

p-val ue

Amino acid metabolism 3.19_205.07 [M+H]

C9H8N(-C2H5NO2)

(C11H12N2O2)

C11H13N2O(-O)

Tryptophane

1.40

0.003 3

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

70/ 70/82

4.95_162.06 [M+H]

C8H6N(-CH2O2)

(C9H7NO2)

C9H6NO(-H2O)

Indole-3-carboxylic acid

0.23

0.000 1

3-Methyldixoyindole

0.00

Tryptophanol

0.12

0.005 1

0.62

0.043 4

0.27

0.000 3

0.07

0.000 6

0.28

0.002 5

10.25

0.002 3

C9H8NO(-O) 5.25_164.08 [M+H]

C8H10O(-CNO)

(C9H9NO2)

C9H8NO(-H2O)

0.000 2

C6H7(-C3H3NO2) 4.46_162.06 [M+H] (C10H11NO) 5.48_212.00 [M-H] (C8H7NO4S)

C10H10N(-H2O) C9H8N(-CH4O) C8H6NO(-O3S)

Indoxyl

sulfate

O3S(-C8H6NO)

5.46_194.09 [M+H]

C7H7(-C3H5NO3)

(C10H11NO3)

C9H10NO(-CH2O2)

Phenylacetylglycine

C9H12NO(-CO2) 5.65_283.08 [M-H] (C13H16O7)

C6H10O5(-C7H5O2)

p-Cresol

glucuronide

C7H7O(-C6H8O6) C5H8O4(-C8H7O3)

5.10_180.07 [M+H]

C7H5O(-C2H5NO2)

(C9H9NO3)

C6H5(-C3H5NO3)

Hippuric acid

C8H10N(-CO3) 1.17_314.13 [M+H]

C8H9O(-C6H11NO6

(C14H19NO7)

C5H4O2(-C9H16NO5)

5.55_239.9976 [M-H] (C6H11NO5S2) 0.85_153.07 [M+H] (C3H6NO4S) 4.30_356.14 [M+H] (C14H25N6O3S) 4.71_427.12 [M+H] (C13H22N4O8S2)

Tyramine

glucuronide

C3H8OS2(-C3H2

3-Mercaptolactate-c

0.0

NO4)

ysteine disulfide

0. 00 01

C2H5NS2(-C4H5 O5) C3H2NO (-H6O3S)

Cysteine

sulfinic acid

3.89

0.029

C5H11S(-C9H15N6O3)

S-Adenosylmethioninami ne

5.77

0.002 5

C11H17N5OS(-C3H9N O2) C9H15N3O4(-C4H8NO 4S2)

Cysteineglutathione disulfide

1.86

0.001 7

C4H8N2O2(-C9H15N2 O6S2) C5H9N2O3 (-C8H14N2O5S2)

4.41_336.07 [M-H]

C6H13N2OS(-C5 H5NO6)

0.01

0 . 00

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

71/ 71/82

04 (C11H19N3O7S)

C8H9N3O3(-C3H9 O4S)

Isoflavonoids and riboflavin 5.22_377.15 [M+H] (C17H20N4O6)

C12H11N4O2(-C5 H10O4)

Riboflavin

1.72

0.005 8

7-Hydroxy-6-methyl-8 -ribityl lumazine

0.13

0.000 0

Glycitin

5.87

0.000 0

Glycitein

5.92

0.000 1

Genistin

4.24

0.000 6

Daidzein

3.15

C10H10N3(-C7H11 NO6) C11H8N3O(-C6H1 3NO5)

6.44_327.11 [M-H] (C12H16N4O7) 6.01_445.08 [M-H] (C22H22O10) 5.54_285.08 [M+H]

C9H9N4O5(-C3H6 O5) C7H4N4O(-C5H11 O6 C15H9O5(-C7H12 O5) C5H5O3(-C17H16 O7) C15H10O5(-CH3)

(C16H12O5)

C6H6O3(-C10H7O2)

3.65_433.17 [M+H]

C6H6O2(-C15H15O8)

(C21H20O10)

C8H9O2(-C13H12O8)

5.47_255.07 [M+H]

C5H5O2(-C16H16O8)

(C15H10O4)

C8H7O(-C7H4O3)

6.29_243.11 [M+H]

C7H7O2(-C8H4O2)

(C15H14O3)

C9H9O(-C6H6O2)

Equol

0.01

C6H5O4 (-C3H15O7P)

1-(sn-Glycero-3-phosp ho)-1D-myo-inositol

7.49

2.96

0.000 3 0.000 1 0.000 6

Others 3.17_335.08 [M+H]

0.002 3

(C9H19O11P) 0 . 1.31_250.05 [M+H]

C8H12NO (-HO5P)

Pyridoxine 5'-phosphate

0.58

00 05

(C8H12NO6P) 5.40_349.10 [M-H] (C18H22O5S)

C17H17O2 (-CH3O3S)

3.69_580.26 [M+H]

C20H30O4S (-C6H16NO5S)

Pyridoxine 5'-phosphate Taurochenodeoxychol ate-7-

3.59

0.003 7

0.47

0.001 7

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

72/ 72/82

sulfate (C26H45NO9S2) 0 . 4.71_425.10 [M-H]

C5H2NO3 (-C10H23NO9_

(C15H26N2O12)

C6H5O4 (-C3H15O7P)

5.23_340.11 [M+H]

C14H13NO3(-CH5O5)

(C15H17NO8)

C9H10NO2(-C6H8O6)

2.63

00 16

6-Hydroxy-5-methoxyind ole glucuronide

0.01

0.000 2

C5H5O2(-C10H13NO6)

a. 대조군과 비교하였을 때, pseudo germ-free 군의 뇨 대사체의 변화률 b. pseudo germ-free 군의 뇨에서 검출되지 않은 대사체

이 결과 2차 년도의 global metabolic profiling에서 표준품의 머무름시간으로 확인한 steroid는 관찰되지 않았으며 장내미생물에 의해 변화되는 내인성 대사 체들은 tryptophan, methionine등과 같은 아미노산 대사체들과 이소플라보노 이드나 리보플라빈과 같은 영양소 대사체들만이 검출되었다. 그러나 담즙산과 그 전구체인 oxysterol은 장내미생물이 직접적으로 관련된 대사과정인 포합과 정에 중요한 역할을 하므로 좀 더 선택적이고 감도가 높을 GC-MS 정량분석 방법을 이용하여 장내 미생물에 의해 영향을 받는지를 평가하고자 하였다. 그 방법과 결과를 다음에 나타내었다.

(3) Pseudo germ-free model의 뇨 중 담즙산과 oxysterols의 농도 변화 연구 뇨 시료 중 oxysterol과 담즙산에 대하여

GC-MS 분석을 실시하여 정량화

하였다. 각 물질의 integrated peak area와 주입한 internal standards (5α -cholestane, d4-cholicacid)의 integrated peak area와 비교하여 정량화 하였고 그 결과는 표 27에 정리하였다.

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

73/ 73/82

표 27. Psuedo germ-free rat model에서의 담즙산과 oxysterol의 뇨 중 농 도 (ng/mg of creatinine) Normal control

Pseudo-germ-free

Mean± SD

13.66±6.94

10.58±10.43

17.51±31.50

57.24±48.57

0.92±0.52

2.94±3.63

622.67±378.39

4178.44±3866.48*

27.03±15.82

15.26±14.36

8145.48±3588.55

4657.67±3049.36*

3.68±4.36

6.69±9.84

9.97±14.05

8.33±12.31

α-Muricholic acid (α-MCA)

8.18±6.53

56.09±36.29**

Chenodeoxycholic acid (CDCA)

2.02±1.28

4.02±2.98

35.30±29.10

250.52±188.08**

3.30±3.15

6.53±4.83

Lithocholic acid (LCA)

30.96±18.44

49.19±72.87

β-Muricholic acid (α-MCA)

20.51±19.33

124.57±80.89**

Compounds 7α-OH-cholesterol 7α-OH-4-cholesten-3one 7-keto- cholesterol 22(R)-OH- cholesterol 24S-OH- cholesterol 25-OH- cholesterol Cholesterol 5β-cholestane 3α,7α,12α -triol Deoxycholic acid (DCA)

Cholic acid (CA) Ursodeoxycholic acid (UDCA)

*: P≤ 0.05 between normal control and pseudo germ-free rats, **: P≤ 0.01 between normal control and pseudo germ-free rats, ND: not detected Pseudo germ-free 군에서 cholesterol, 및 22(R)-OH- cholesterol과 같은 oxysterols의 농도는 감소하였으나 cholic acid, α-muricholic acid, β -muricholic acid와 같은 담즙산의 농도는 증가하였다. 따라서 담즙산에 의한 간독성 유발 가능성이 있음을 확인하였다.

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

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5. 연구결과 고찰 및 결론 이 연구의 목적은 rat 또는 mouse에 항생제를 처리한 pseudo-germ free model에서 천연물 또는 약물을 투여하고 대사체 및 체내동태 연구를 수행하 여 장내대사 및 체내동태에 미치는 장내미생물의 영향을 연구하고, 대사체 연구를 통하여 장내미생물 대사가 독성에 미치는 영향을 연구하는 것이다.

장내미생물이 내인성 대사에 미치는 영향에 대한 연구

○

2가지 항생제 혼합액(neomycin과 streptomycin) 처리 전 후의 rat 뇨를 UPLC-TOF-MS로 대사체를 분석한 후 PLS-DA로 통계 처리한 결과, 서 로 다른 amino acid, steroid, sterol의 양이 항생제 투여 전 후에 감소하거 나 증가하여 이 대사체들이 항생제 투여 전후에 영향을 받을 수 있음을 관 찰하였다.

이를

확인하기

위하여

각각의

대사체

표준품과

비교하여

retention time과 peak를 확인하고, 이를 뇨 중 대사체 profile과 비교하여 항생제

처리에

의해

감소하는

대사체는

5β-dihydrocortisol과

3-methylhistidine 임을 확인하였다. 장내미생물이 존재하지 않았을 때의 뇨에서

5β-dihydrocortisol의

농도가

감소함을

확인함으로서

glucogenesis에 관여하는 glucocorticoid 농도가 감소하였음을 예측할 수 있었다. 또한 3-methylhistidine의 뇨 중 농도 감소를 확인함으로서 질소의 장간내 순환이 영향을 받아 근육단백질의 분해가 감소하였을 것으로 예상할 수 있었다. ○

3 가지항생제 혼합액 (neomycin, streptomycin, bacitracin)을 투여하여 유 도된 pseudo germ-free rat model의 뇨 중 대사체 프로파일 변화를 확인 한 결과, 2가지항새제 혼합액을 처리하여 유도한 pseudo germ-free rat model의 뇨 중 대사체 변화보다 많은 대사체들의 변화를 관찰하였다. 아미 노산 대사와 관련해서는 tryptophan, tyrosine, 및 cysteine 등의 대사체들 의 변화가 뚜렷이 관찰되었으며, 식이유래 대사체들로 이소플라보노이드, 리 보플라빈 등의 대사체 농도 변화가 관찰되었다. 또한 담즙산과 스테로이드 대사체들 중 일부의 농도 변화도 관찰되었다. tryptophan과 tyrosine은 약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

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armatic 아미노산으로 분류되며, indole 기를 가지고 있다. 장내 미생물들이 indole 기를 갖는 화합물의 분해에 역할을 함은 이미 알려진 사실이다. 따라 서 뇨 중 이들 아이노산 대사체들의 농도 변화는 장내미생물의 활성 변화에 서 기인한다고 생각할 수 있다. 또한 이들 아미노산은 체구성성분, 신경 전 달물질의 전구체 역할을 함으로 이들의 대사경로 변화는 체내 생리활성에 영향을 줄 것으로 생각된다. 이소플라보노이드와 리보플라빈은 체내 전자전 달계의 구성요소이므로 이들 대사변화로 체내 활성에 영향을 줄 것으로 예 상된다. 이와 같이 뇨 중 대사체 농도 변화을 관찰함으로서 는 장내 미생물 의 활성에 의해 체내 다양한 생리활성이 변화되었음을 예측할 수 있었다. ○

2가지 항생제 혼합액(neomycin과 streptomycin) 처리 전 후의 rat 뇨 시료 에서 담즙산과 그 대사체, 대사 관련 효소 활성을 비교하여, 합성 전구체 중 cholesterol과 25-OH-cholesterol의 농도가 현저히 감소하였고, 담즙산 중 deoxycholic acid의 농도도 감소하였다. 반면 담즙산 대사체인 5β -cholestane

3α,7α,12α-triol와

간

독성을

유발한다고

알려진

chenodeoxycholic acid의 농도 증가가 뚜렷이 확인되었다. 이와 관련하여 cholesterol

7α-hydroxylase

(cholesterol

&#10230;

7α

-hydroxycholesterol)의 활성은 증가하였고, 7α-dehydroxylase (cholic acid

&#10230;

deoxycholic

acid)와

7α-dehydrogenase

(chenodeoxycholic acid &#10230; lithocholic acid)의 활성은 감소하였 음을 확인하였다.

그러므로 항생물질 투여로 장내미생물이 없는 상태에서는

cholesterol 대사경로에 있는 대사과정에 변화가 생길 수 있음이 관찰되었으 며 chenodeoxycholic acid과 같은 간 독성을 유발 할 수 있는 내인성 물질 의 농도가 증가함으로서 간독성이 나타날 수 있음을 암시하였다. ○

3 가지항생제 혼합액 (neomycin, streptomycin, bacitracin)을 투여하여 유 도된 pseudo germ-free rat model의 뇨 중 담즙산과 그 대사체의 농도를 비교하였을 때, pseudo germ-free 군에서 cholesterol, 및 22(R)-OHcholesterol과 같은 담즙산의 합성 전구체의 농도는 감소하였으나 cholic acid, α-muricholic acid, β-muricholic acid와 같은 담즙산의 농도는 증 가하였다. 2가지 항생제 혼합액을 처리하여 유도한 pseudo germ-free rat model의 뇨 중 담즙산의 농도변화와 유사한 양상을 관찰하였고, 장내 미생 물의 활성과 간독성과 밀접한 관련성이 있음을 확인하였다.

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2-1세부과제

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장내미생물 대사가 hesperidine의 약동력학에 미치는 영향 연구

○

Hesperidin을 rat liver microsome으로 배양하여 LC/MS 분석기법으로 분 석하여 demethylation과 hydroxylation 대사체를 확인하고 MS/MS 방법으 로 2-methoxyphenol 군이 demethylation 된 것을 확인하였다.

○

항생제 처리군과 대조군에 각각 hesperidin을 40 mg/kg 용량으로 경구투여 하고 혈장 내의 total hesperetin (hesperetin+hesperetin glucuronide)의 농도를 측정하였다. 대조군에서 혈중농도가 항생제 처리군보다 유의성 있게 높은 것을 확인할 수 있었고 AUC와 Cmax는 대조군이 항생제 처리군보다 각각 2.7배, 2.9배 높았다. 이 결과는 항생제 처리군에서 장내미생물이 감소 하여 hesperidin (배당체)이 hesperetin으로 대사되는 양이 감소함으로써 체내로의 흡수된 양이 감소되었다고 볼 수 있다.

장내미생물 대사가 baicalin의 의 약동력학에 미치는 영향 연구

○

항생제 처리군과 대조군에 각각 baicalin을 50 mg/kg 용량으로 경구투여하 고 혈장 내의 baicalin의 농도를 측정하여 pharmacokinetic parameter를 비교한 결과, AUC는 대조군이 항생제 처리군보다 1.4배 높았고 Tmax도 유의성 있게 차이가 보였다. 이 결과는 항생제 처리군에서 장내미생물이 감 소하여 baicalin이 baicalein으로 대사되는 양이 감소함으로써 체내로의 흡수 된 baicalein의 양이 감소되었고 따라서 체내의 baicalin의 양도 감소되었다 고 볼 수 있으므로 이 물질의 대사에 미생물이 영향을 미침을 확인할 수 있 었다.

장내미생물 대사가 ginsenoside의 약동력학에 미치는 영향 연구

○

Conventional 및 germ-free mouse의 plasma에서 ginsenoside Re 및 그 대사체를 분석 결과, 모든 mouse에서 parent compound인 ginsenoside Re가

검출되었고, 일부

mouse에서

그

대사체인

ginsenoside Rg1과

ginsenoside Rg2가 검출되었지만, 그 외의 대사체는 검출되지 않았다. Ginsenoside Re의 혈중농도는 conventional mouse에서보다 germ-free

약물대사기반연구사업단

2-1세부과제

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mouse에서 더 높았으므로,

ginsenoside Re의 흡수가 conventional

mouse에서보다 germ-free mouse에서 더 잘된 것으로 나타났다. 그러나, 두 그룹에서의 pharmacokinetic parameter에서 통계적인 유의성은 검증할 수

없었다.

또한

순수한

ginsenoside

Re를

단독

투여하였을

경우

ginsenoside Re의 흡수가 매우 좋지 않아서 각 개체의 혈중 농도의 차이가 크게 나타난 것으로 보인다. Esculetin 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화

○

Esculetin (40 mg/kg)의 경구 투여 후 항생제 처리모델에서 대조군과 비교 하여

Esculetin에

대한

AUC의

유의성있는

차이가

없었으나,

pharmacokinetic parameter 중 k(hr-¹), t1/2(hr)은 대조군에 비해 항생 제 처리모델에서 통계처리상 유의성 있는 차이가 보였다. Esculetin을 투여 하였을 경우 Esculin은 혈액에서 검출되지 않았고, Esculetin의 머무름 시간 앞쪽에서 blank plasma에서는 검출 되지 않은 peak (metabolite로 추정)이 나타났으며, unknown metabolite를 내부표준물질의 비로 계산한 결과 항생 제 처리군에서 더 높게 나타나 장내미생물이 Esculetin의 체내동태에 영향 을 주었다고 고려되었다. ○

Esculin의 투여 후 대조군과 항생제처리군 모두에서 대사체인 Esculetin이 검출되었고 Esculetin 투여 후 대사체로 추정되었던 peak 또한 검출되었다. Esculin의 투여 후 항생제 처리 군에서 대조군에 비해 높은 AUC를 보였고 통계처리상 유의성 있는 차이가 나타났다. 대사체로 검출된 Esculetin의 AUC에서도 유의성 있는 차이가 나타났으며 대사체로 추정되고 있는 peak 의 그래프 역시 항생제 처리 군에서 더 높은 경향을 보였다.

○

Esculin 투여 후 나타난 Esculin pharmacokinetic parameter 중 AUCINF, AUClast, CL/F에서 대조군과 비교하였을 때 통계처리상 유의성 있는 차이가 나타났다. 또한 대사되어 검출된 Esculetin의 pharmacokinetic parameter 중에서 AUCINF, AUClast, k(hr-¹)이 통계처리상 유의성 있는 차이가 보였 다. 이를 보아 장내 미생물이 Escuin의 체내동태에 영향을 주었다고 고려되 었다.

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2-1세부과제

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장내미생물 대사가 geniposide의 약동력학에 미치는 영향 연구

○

LC/MS/MS를 이용하여 혈장 중 genipin 분석법을 확립하였으며 본 분석법 을 이용하여 genipin에 대한 약동력학 연구를 수행하였다.

○

치자 색소 원료 중 geniposide의 함량을 분석한 결과 약 47%로 확인하였으 며, 이에 근거하여 geniposide로서 300 mg/kg의 용량이 되도록 rat에 치자 색소 원료를 투여하였다.

○

정상쥐와 항생제 처리 쥐에 각각 치자 색소 원료를 투여한 후 혈장 중 genipin (genipin sulfate)의 농도를 분석한 결과 두 그룹에서 genipin의 plasma concentration profile 및 pharmacokinetic parameter는 유의적인 차이를 보이지 않았다.

○

정상군과 항생제 처리군의 분변시료를 분석한 결과 항생제 처리군에서 geniposide의 양이 대조군에 비하여 현저히 높게 나타남으로 미생물의 의한 geniposide에서 genipin으로의 대사가 억제된 것으로 나타났다.

○

정상군과 항생제 처리군에서 혈중 geniposide가 검출되었으며 이는 장내에 서 geniposide의 형태로도 흡수가 되는 것을 나타났다. 항생제 처리군의 geniposide의

혈중

농도가

대조군에

비하여

높게

측정되었으나

pharmacokinetic paramater에서 통계적인 유의성은 나타나지 않았다. ○

항생제 처리군에서는 미생물에 의한 genipin 생성이 거의 억제되었음에도 불 구하고 정상군과 항생제 처리군에서의 genipin 프로파일이 유사하게 나타난 것은 정상군의 경우 geniposide가 genipin으로 대사된 후 genipin이 위장관 에 존재하는 protein 등과 반응하여 혈중으로 흡수되지 못한 것으로 사료되 었다.

아세트아미노펜과 그 대사체의 LC-MS/MS를 이용한 동시 정량분석방법의 개발

○

LC/MS/MS를 이용하여 혈장 및 뇨 중 아세트아미노펜 및 6가지 대사체에 대한

분석법을

확립하였으며,

이때의

recovery

는

APAP-Glth

나

APAP-Cys를 제외한 나머지 물질들은 90% 이상을 보였다. 또한 matrix effect 대부분에서 90-110% 수준을 나타내어 이 분석법이 아세트아미노펜 및 대사체 분석에 적합함을 확인할 수 있었다.

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2-1세부과제

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○

LC/MS/MS를 이용하여 아세트아미노펜 및 6가지 대사체에 대한 분석법에 대하여 validation을 진행하였으며 모두 accuracy 및 precision은 모든 QC 에서 ± 15% 이내였으며, LOQ에서 ± 20% 를 만족하였다. 그 외에도 standard와 샘플을 저장 및 처리하는 조건하에 stability도 ± 15% 내에 기 준에 만족하였다.

Pseudo germ-free rat model의 model의 아세트아미노펜의 대사 및 약동력학 변화 연구

○

개발된 분석법을 이용하여 아세트아미노펜과 그 대사체에 대한 에 대한 약 동력학 연구를 수행하였다.

○

정상쥐와 항생제 처리 쥐에 각각 아세트아미노펜을 투여한 후 혈장 중 아 세트아미노펜 및 6가지 대사체의 농도를 분석한 결과 두 그룹에서 아세트 아미노펜과 아세트아미노펜 글루타치온 포합체의 AUC 값이 유의적인 차 이를 보였으며, 항생제를 처리하여 만든 pseudo germ-free 그룹에서 대 조군에 비하여 두 가지물질이 더 높게 나타났다.

○

항생제 처리군에서 APAP-Sul를 제외한 대사체와 모약물인 APAP 모두 에서 AUC, 반감기 (T1/2)가 증가하고 clearance (Cl/F)와 분포용적 (Vd/F)은 감소하는 경향을 보여 약효가 오래 지속될 수 있음이 관찰되었 다. APAP-Sul의 경우 실험한 두 군에서의 반감기 (T1/2)는 거의 비슷하 였으나 AUC는 다른 대사체의 경우와 같이 항생제 처리군에서 감소하였으 며 clearance (Cl/F)는 증가하였다. 그러므로 이러한 결과로부터 장내미생 물이 존재하지 않을 경우에는 약물의 약동력학(pharmaco kinetics)이 변 화할 수 있다고 생각되었다. 뇨 중 아세트아미노펜 및 6가지 대사체의 농도를 분석한 결과 두 그룹에서

○

모약물인 아세트아미노펜의 총 배설량에서 유의적인 차이를 보였으며, 아세 트아미노펜의 배설량이 pseudo germ-free 그룹이 대조군에 비하여 감소하 였다. ○

정상대조군에 비해 pseudo germ-free 군에서 모약물인 아세트아미노펜의 혈중 AUC는 증가하고 이로 인해 APAP-Sul를 제외한 대사체들도 전체적 으로 AUC 값이 증가하는 경향을 보였다. 특히나 APAP-Glth 의 경우 AUC 가 증가됨에 있어서 유의성이 확인되었다 (p-value < 0.05).

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2-1세부과제

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APAP-Sul는 rat에서 APAP의 주대사체이므로 APAP-Sul의 대사체 생 성 저하는 APAP의 혈중 AUC 증가에 기여했을 것으로 생각된다. 장내미 생물에 의해 아세트아미노펜의 sulfate 포합대사경로가 영향을 받았을 것 으로 사료된다. 모약물인 아세트아미노펜의 뇨 중 배설량이 감소는 장내 미생물의 활성이 아세트아미노펜의 배설경로에도 영향을 준 것으로 사료된 다. Germ free mouse model의 model의 아세트아미노펜의 대사 및 약동력학 변화 연구

○

1-3세부와 연계하여 정상대조군(SPF), germ-free 군 그리고 정착동물 군(Gnotobiote)에서의 아세트아미노펜 및 대사체 분석을 진행하였으며, 확 립된 아세트아미노펜 및 그 대사체들의 분석방법을 이용하였다. Mouse의 혈중 APAP-Glth, APAP-NAC, APAP-Cys 농도가 높기 때문에, rat에 서 확립한 방법을 적용하기 위해 혈액 시료를 희석하여 분석을 진행하였 고, 이를 환산하여 정량하였다.

○

분석결과

APAP-Sul가

주대사체였던

rat과는

달리

mouse에서는

APAP-Glc가 주 대사체로 확인되어 종간 차이를 관찰할 수 있었다. ○

300 mg/kg 용량으로 투여된 그룹에서 APAP와 APAP-Sul의 경우 대조 군에

비해

germ-free

군에서

AUC가

유의적으로

증가되었으나,

APAP-Glc의 경우 오히려 감소되는 것을 확인하였다. ○

200mg/kg 로 투여된 그룹에서 APAP-Glth의 경우는 대조군에 비해 germ-free 군에서 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다.

○

Germ-free군에서 대조군에 비해 APAP-Sul를 제외한 대사체에서, 모약 물이 대사체로 변화되는 비율이 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 정착동 물군(Gnotobiota)에서 유의적인 차이는 없으나 대조군과 유사해지려는 경 향성을 확인하였다.

○

Pseudo germ-free rat 과 germ-free mouse에서 아세트아미노펜에 대사가 완벽히 같은 방향성을 갖지는 않았지만, 모두 각각에 대조군과 비교 할 때 약동학적인 차이를 뚜렷이 확인할 수 있었다. 이는 장내미생물이 아 세트아미노펜에 대사에 중요한 영향을 미치고 있음을 시사한다.

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2-1세부과제

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