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한국인 특이 장내미생물 분리, 동정 등을 통한 표준화 연구

2009~2011. / 1중단위 1세부과제

약물대사기반연구사업단

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3-1세부과제

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1. 최종 연구개발 목표 1) 세부과제의 목표 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·3 2) 세부과제의 목표달성 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·5 3) 국내 외 기술개발 현황 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·5

2. 연구개발 내용 및 방법 2-1.한국인 분변 시료 및 조직 시료에서 한국인에게 다량 존재 하는 50종 이상의 장내 혐기성 미생물 분리 및 배양, 동정 · ·7 2-2.한국인 특이 혐기성 장내 미생물 15종 이상의 신종 분리, 배양 및 동정 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·16

3. 연구개발 결과 3-1.한국인 분변 시료 및 조직 시료에서 한국인에게 다량 존재 하는 50종 이상 장내 혐기성 미생물 분리 및 배양, 동정 ·28 3-2.한국인 특이 혐기성 장내 미생물 15종 이상의 신종 분리, 배양 및 동정 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·30

4. 연구결과 고찰 및 결론 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·44

5. 참고문헌 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·45

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1. 최종 연구개발 목표 1) 세부과제의 목표

연구개발의 필요성 및 중요성 - 인간이 일상생활을 영위하는데 음식물 섭취는 절대로 필요한 사항임. 또한 현재 사용되고 있는 많은 의약품은 구강을 통해 장내에서 대사가 이루어지 고 있음. - 사람의 위장관에 존재하는 정상세균총(normal flora)은 영양분의 소화를 돕 고 외부 병원체에 대한 보호 역할을 하는 등 이로운 작용을 할 뿐만 아니라, 섭취한 식품 및 의약품 등과 상호작용하여, 대사에 의해 독성을 유발, 강화 하거나 황화수소나 biogenic amine류 등을 생성하여 위궤양, 간질환 및 소 화기계 암을 유발하고 있다고 알려져 있음. - 한국인의 식생활 습관은 다른 국가의 사람들 것과 차이를 보이고 있음. 예를 들어, 한국인은 짜고 매운 음식을 선호하고 젓갈과 장류와 같은 발효음식의 섭취율이 높아서 서구의 여러 나라에 비해 위장관 질환의 발병률이 높다는 특징이 있음. - 이와 같은 식생활의 차이는 결국 소화관 내에 분포하는 장내세균총의 분포 도 외국인들과는 차이를 보일 것으로 예상됨. - 본 연구의 총괄목표가 장내 세균에 의한 약물대사기반연구’라는 점과 장내 정상세균총의 95% 이상이 혐기성 세균으로 구성되어 있음에 비추어 한국인 특유의 장내 미생물 표준모델을 개발하기 위해서는 혐기성 세균에 초점을 맞출 필요가 있음. - 오늘날 장내 미생물에 의한 독성평가를 위해서 한국인 특유의 장내 미생물 표준모델이 요구되고 있으나, 아직까지 우리나라에는 이를 충족할 만한 모델 이 전혀 없다는 문제점이 있음. 약물대사기반연구사업단


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- 본 연구를 통해 한국인에서 분리된 혐기성 장내 미생물로 이루어진 모델을 제시할 수 있다면, ① 기존의 외국인에 적합한 대사체 분석 기술을 탈피할 수 있을 뿐만 아니라, ② 한국인에게 존재하는 혐기성 장내미생물을 통한 식 품 의약품 등의 대사체 평가기술의 기초 기반 구축에 좋은 정보를 제공할 수 있을 것으로 전망함.

연구목표

한국인 분변 시료 및 조직 시료에서 한국인에게 다량 존재하는 장내 혐기성 미생물 분리 및 배양, 동정과 동시에 한국인 특이 혐기성 장내 미생물을 분 리함으로써, 식품 의약품 등의 안전성 평가를 위한 한국인 장내 미생물 표준 모델 제시하고자 함.

분리 배양한 장내 혐기성 미생물을 이용하여 식품 의약품 등의 안전성 평가 를 위한

독성 평가방법의 개발을 위한 기초자료를 제공함과 동시에 표준작

업 수순서 제시하고자 함.

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2) 세부과제의 목표달성도

연구개발

목표

추진내용 최신 혐기성 장내미생물 배양 기술 확립

진행정도

달성도

최신 혐기성 장내미 최신 혐기성 장내미 생물 배양 기술 확 생물 배양 기술 및 100% 립

배양 조건 확립

한국인 분변 시료 및 조 직 시료에서 한국인에게

50종 이상의 한국 한국인 장내 미생물

다량 존재하는 50종 이

상의 장내 혐기성 미생물

리, 배양 및 동정

장내미생물

분 71종을 분리, 배양하 였음.

초과달성 142%

분리 및 배양, 동정 한국인 분변 시료 및 조 직 시료에서 한국인 특이 혐기성 장내 미생물 15 종 이상의 신종 분리, 배 양 및 동정

한국인 특이 장내미 생물 신종 15종 이 상 분리, 배양 및 동정

22종의 한국인 신규 장내미생물 분리, 배 양 및 동정

초과달성 147%

3) 국내 외 기술개발 현황 ○

국외 연구현황 ① 국외에서도 산업적 관점에서 새로운 신종 미생물 확보를 위해 매우 활발한 연구가 진행되고 있음. ② 이와 더불어 선진국에서는 장내 세균총의 유익한 기능뿐 아니라 분해 효소 규명, 장내세균총의 화학물질 대사에 의한 독성유발 연구 등이 꾸준히 진행되 고 있음. 이에 반하여 국내에서는 아직까지 장내미생물에 의한 독성연구 부분 은 취약하여, 관련 연구체계의 기반마련이 필요한 시점이라고 할 수 있음.

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국내 연구현황 ① 미생물은 고부가가치 의약용 단백질 생산, 생리활성 물질, 효소 등의 개발에 이용될 수 있는데, 선진국에서 개발된 미생물을 이용할 경우 막대한 특허료를 지불해야 함. 이을 극복하기 위하여 국내에서는 한국생명공학연구원, 농업생명 공학연구원 등에서 신미생물 자원의 확보를 위해 노력하고 있음. ② 이와 같이 국내에서는 산업화 측면에서의 접근이 활발한 반면, 식품 의약품 등의 대사체 평가기술의 기초 기반 구축을 위한 혐기성 장내미생물에 대한 연 구는 아직까지 미흡하다고 할 수 있음. ③ 최근 식약청 국립독성연구원은 장내세균총의 대사 분해 작용에 의해 독성이 증가하는 대상물질을 규명하고 독성정도를 평가하기 위한 「미생물응용기반 독 성연구」의 국내기반 마련을 위해 전문가 협의체 운영 등을 통한 기획연구를 추진하여 국내 독성평가 기술을 선진국형으로 도약시키고자 한다고 밝힌 바 있 음에 비추어 본 연구과제는 매우 시기 적절한 것으로 판단됨.

1. 연구개발 내용 및 방법 약물대사기반연구사업단


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2-1. 한국인 분변 시료 및 조직 시료에서 한국인에게 다량 존재하는 50종 이상의 장내 혐기성 미생물 분리 및 배양, 동정

가. 연구배경

서울대병원에 내원한 건강 검진자 및 환자를 대상으로 분변시료의 확보, 한 국인 조직 및 분변 시료를 중심으로 한국인에게 다량 존재하는 장내 혐기성 미생물 및 신종 장내 혐기성 미생물의 분리 및 배양, 동정.

한국인의 식생활 습관은 다른 국가의 그것과 차이를 보이고 있음. 한국인 특 유의 짜고 매운 음식 습관과 젓갈과 장류 같은 발효음식의 섭취 비율이 서 구 여러 나라에 비해 높기 때문에 장내세균총의 분포도 차이를 보일 것으로 예상하며, 기존에 알려지지 않은 장내미생물의 존재 가능성이 높음.

정상인 조직 및 분변 시료를 통해 배양 가능한 장내미생물을 조사함으로써, 한국인에 적합한 대사체 평가기술의 기초 기반 구축에 좋은 정보를 제공할 수 있을 것이며, 추후 안전성 평가를 위한 표준작업의 기초자료로 활용 가 능.

나. 연구내용 및 방법

분변 시료 확보 및 처리 - 서울대병원으로부터 확보 받은 검진자 및 환자의 분변시료를 혐기성 상태의 mineral solution에 넣고, 10배 비율로 희석. - 희석한 샘플을 아래와 같이 선택한 배지에 100 ul씩 접종. - 37℃, 혐기성 (N2:H2:CO2 = 90:5:5) 조건에서 배양.

장내 미생물에 따른 선택 배지 확립

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- Ruminococcus 속, Bacteroides 속, Enterococcus 속 선택배지 (BHI) - Brain Heart Infusion 37 g/L: Calf Brains 7.7 g, Beef Heart 9.8 g, Proteose Peptone 10 g, Dextrose 2 g, Sodium Chloride 5 g, Disodium Phosphate 2.5 g - Yeast extract 5 g/L - Hemin solution 1 ml/L (Hemin 1 mg) - Agar 1.5% - Cellulolytic bacteria 선택배지 (BC medium) - 매일 섭취하는 음식의 20-30%는 인간이 소화하지 못하는 섬유소와 같은 polysaccharide로써, 장내에 존재하는 특정 미생물에 의해 소화 가능한 분자 단위로 분해된다. 이 미생물에 의한 장내 발효과정은 사람의 건강에 이로운 역할을 할 뿐만 아니라 여러 가지 질병과도 깊은 연관성을 가지고 있다. 대표적으로 면역시스템과 관련된 염증 반응과 당뇨병, 비만 등의 질병 과 에너지 대사와도 깊은 연관이 있다고 보고되고 있다. 따라서 해당 미생 물의 분리 및 배양은 추후 후속연구에 큰 도움이 될 것으로 생각한다. - Yeast extract 0.5 g/L - Tryptone 1 g/L - Glucose 5 g/L - Cellobiose 2 g/L - NaCl 1 g/L - MgCl2 X 6H2O 0.5 g/L - KH2PO4 0.2 g/L - NH4Cl 0.3 g/L - KCl 0.3 g/L - CaCl2 X 2H2O 0.015 g/L - Hemin solution 1 ml/L (Hemin 1 mg) - Trace element SL-6 1 ml/L - Se / Wo solution 1 ml/L - Agar 1.5% - 멸균 후, 50℃이하에서 Vitamin solution 1 ml/L 첨가

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- Lactobacillus 속, Roseburia 속 선택배지 (YCFA medium) - 매일 섭취하는 음식의 20-30%는 인간이 소화하지 못하는 섬유소로 대표되는 cellulose (polysaccharide)로써, 장내에 존재하는 미생물에 의해 소화 가능한 분자 단위로 분해된다. 이 미생물에 의한 발효과정 (fermentation)은 사람의 건강에 이로운 역할을 할 뿐만 아니라 여러 가지 질병과도 깊은 연관성을 가지고 있다. 대표적으로 자가면역질환과 성인병 으로 대표되는 당뇨병, 비만 등의 질병과도 연관관계가 보고되고 있고, 에너지 대사와도 긴밀한 역할을 한다고 보고되고 있다. 따라서 해당 작용에 대한 정확한 역할 규명이 이뤄지려면 장내에 존재하는 미생물의 분리 및 배양이 수반되어야 할 것이다. - Lactate 0.2% - Glucose 0.2% - Starch 0.2% - Casitone 10 g/L - Yeast extract 2.5 g/L - NaCl 1g/L - MgCl2 X 6H2O 0.5 g/L - KH2PO4 0.2 g/L - NH4Cl 0.3 g/L - KCl 0.3 g/L - CaCl2 X 2H2O 0.015 g/L - Hemin solution 1ml/L (Hemin 1mg) - Trace element SL-6 1 ml/L - Se / Wo solution 1ml/L - Agar 1.5% - 멸균 후, 50℃이하에서 Vitamin solution 1 ml/L 첨가 - Bacteroides 속 선택배지 (Supplemented Brain Heart Infusion Medium, BHIS) - 전체 장내 미생물 중 약 20%를 차지하고 있는 미생물로써, Firmicutes와의 양적 변화는 앞서 언급한 비만과 깊은 관련이 있다고 최근 보고되고 있다. ① Bacteroides 속은 자연적으로 aminoglycoside 계열 항생제 및 β-lactam

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계열 항생제에 대한 저항성을 지니고 있다. 따라서 이런 항생제를 도입한다 면 장내 미생물로부터 Bacteroides 속만을 분리할 수 있을 것이다. - Brain Heart Infusion 37 g/L: Calf Brains 7.7 g, Beef Heart 9.8 g, Proteose Peptone 10g, Dextrose 2 g, Sodium Chloride 5 g, Disodium Phosphate 2.5 g - Hemin solution 10 ml/L (Hemin 10 mg) - L-cysteine 1 g/L - NaHCO3 (10% solution) 20 ml/L - Aminoglycoside 항생제: Gentamycin 50-200 mg/L 또는 Kanamycin 50-100 mg/L ② Eggerth-Gagnon (EG) 배지 - 최초로 분리된 Bacteroides species를 배양한 배지로써, 아직까지도 널리 이용되고 있는 배지이다. - Beef extract: 0.3% - Bacto peptone: 1.0% - Na2HPO4: 0.4% - Soluble starch: 0.5 g/L - Yeast extracts: 5.0 g/L - pH 7.8로 조정 - Agar: 1.5% - 멸균 후, 50℃ 이하에서 첨가: Sheep Blood: 5.0%과 Hemin solution (Hemin, 1mg) 1 ml - Bifidobacterium 선택배지 (Bifidobacterium Selective Medium, BSM) - high G+C content, Gram-positive bacteria로써, 전세계적으로 널리 사용 되는 probiotics중 하나이다. 전체적인 장내미생물 구성에서는 적은 양으로 존재한다고 보고되고 있지만, 아직까지 그 군집이 불확실하다. - Gram-positive에 효과적은 Mupirocin 항생제를 통해 bificobacterial bacteria만 견딜 수 있는 양을 첨가함으로써 bifidobacterial 균주만 분리할 수 있다. bificobacterial 선택배지로 널리 사용되고 있다.

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- Lactobacilli MRS medium 70g/L - Proteose Peptone 10.0 g/L - Beef Extract 10.0 g/L - Yeast Extract 5.0 g/L - Dextrose 20.0 g/L - Polysorbate 80 1.0 g/L - Ammonium Citrate 2.0 g/L - Sodium Acetate 5.0 g/L - Magnesium Sulfate 0.1 g/L - Manganese Sulfate 0.05 g/L - Dipotassium Phosphate 2.0 g/L - Agar 15.0 g/L - L-cysteine 0.05% - Mupirocin 50 mg/L - YCFAGSC medium - Reference를 바탕으로 pH에 따른 목표 장내 미생물에 차별을 두고자 하였음. 장내는 short-chain fatty acids에 의해 장관의 위치에 따라 다양한 pH를 보임. 이에 장내 pH 환경과 비슷한 환경을 제공해줌으로써, pH 영향에 따라 기존에 알려지지 않은 미생물 분리를 목적으로 함.

*Reference:

pH

populations

and

and

peptide

short-chain

supply fatty

can acid

radically ratios

alter

within

bacterial microbial

communities from the human colon (2005) Walker et al., Appl Environ

Microbiol, 3692-3700)

a.Fimicutes (pH5.5) - D.W 950ml - 10g Casitone

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- 2.5g Yeast extract - 0.4g NaHCO3 - 2g glucose, starch and cellobiose - 1.0g L-Cysteine-HCl - 0.45g K2HPO4 and KH2PO4 (Buffer) - 0.9g (NH4)2SO4 - 0.9g NaCl - 0.09g MgSO4 7H2O - 0.09g CaCl2 - Bile salts 0.005% - SCFAs: 33mM acetate, 9mM propionate, 5mM butyrate and 1mM isobutyrate / isovalerate / valerate - Hemin sol. 10ml (0.01g Hemin) - Vitamin sol. 1.0ml (filter-sterilized) - Semisolid agar plate: 1.0 % b.Bacteroidetes (pH6.5) - All components are the same as above, except for K2HPO4 8.55g and KH2PO4 6.85g

- Minimal Medium - 기존의 분리 배���법은 복합배지를 통해 환경으로부터 다양한 미생물을 분리하고자 하였으나, 고영양의 배지를 통해서는 우점종 또는 생장속도가 상대적으로 빠르고, 환경변화에 민감하지 않은 미생물만이 분리되었음. 이에 저영양의 분리 환경을 적용함으로써, 우점종에 방해 받지 않고, 상대적으로 다양한 미생물의 생장을 유도하려 하였으며, 특정 carbon and energy source에 편중된 미생물 분리를 줄여 줄 것으로 예상함. - Yeast Extract 0.01%, 0.1g/L - 100X Salt Sol.: 10ml

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- NaCl 1.0g/L - NH4Cl0.3g/L - KH2PO40.2g/L - CaCl22H2O0.015g/L - MgCl20.5g/L - K2HPO40.2g/L - MnSO44H2O0.01g/L - CoCl26H2O0.01g/L - FeSO47H2O0.01g/L - Resazurin 0.0001% - Reductant: L-Cysteine 0.47g/L (3mM), Ti-Citrate(20% Ti) 769㎕ (1mM) - Hemin Sol. 10ml - Vitamin Sol. 1ml - Minimal Medium + addition - 장내 미생물 생장에 필요한 물질이 포함된 배지에 다양한 첨가물을 통해 특정 미생물만을 screening할 수 있을 것으로 판단, 아래와 같은 첨가물을 이용하였음.

a. Glucose: 미량의 탄소 및 에너지원만이 존재하는 mineral medium에 일반적으로 널리 알려진 glucose를 소량의 농도로 넣어 줌으로써, 탄소 원의 양에 따른 분리 미생물에 차별을 기대함. 원 참고 논문에서는 protein source를 변화시켰으나, 본 실험에서는 glucose를 통해 유사한 결과를 기대함.

*Reference:

pH

populations

and

and

peptide

short-chain

supply fatty

can acid

radically ratios

alter

within

bacterial microbial

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communities from the human colon (2005) Walker et al., Appl Environ

Microbiol, 3692-3700) b. Ampicillin and Erythromycin: 항생제를 통한 분리 방법은 이전에도 시도된 적이 있으며, 특정 항생제에 대한 resistance를 갖는 소군집만을 분리하기

위한

목적임.

Ampicillin은

beta-lactam계

항생제로써,

gram-positive 및 몇몇 gram-negative 미생물의 inhibitor로 알려져 있음. 장내 미생물 중 70%를 차지하는 Firmicutes에 대해 sensitive하 게

작용하고,

소수의

알려지지

않은

Bacteroidetes,

Proteobacteria, Actinobacteria의 분리를 기대함. - GAM (Gifu anaerobic medium) - 장내 미생물을 비롯한 anaerobic bacteria는 오래 전부터 일본 미생물학 자에 의해 꾸준히 보고되었으며, 이 중 상당수는 잘 알려지지 않은 새로운 미생물이 많은 비중을 차지함. GAM agar는 일본에서 분리된 장내 미생물 에

적용된

배지로써,

복합

배지임에도

불구하고,

genera

Sutterella,

Paraprevotella, Adlercreutzia, Dialister와 같은 흔하지 않은 genus에서 부터 Bifidobacterium과 같은 잘 알려진 미생물까지 광범위한 장내 미생물 분리에 적용되었다고 보고되었음. - Peptone 5g - Soy peptone 3g - Proteose peptone 5g - Serum powder 10g - Yeast Extract 2.5g/L - Beef extract 2.2g - Liver extract 1.2g - Glucose 0.5g - Starch 5g - NaCl 3.0g/L - KH2PO4 2.5g/L

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- L-tryptophan 0.2g - L-arginine 1.0g - Resazurin 0.0001% - Reductant: L-Cysteine 5.0g/L (3mM), Ti-Citrate(20% Ti) 769㎕ (1mM) - Hemin Sol. 10ml - Vitamin Sol. 1ml

다. 분리 및 동정

순수 분리 : 배양 후 형성된 집락 (colony)은 크기, 모양과 색 등의 형태학적 특성에 따 라 분류, 무작위로 선택하였으며, 3회의 계대배양을 통해 미생물을 순수 분리 한다.

16S rRNA gene sequence 분석을 통한 분리 미생물의 동정 : 순수 분리된 미생물의 16S rRNA 유전자 염기서열을 얻기 위해 colony PCR을 수행한다. 단일 colony로부터 1 toothpick 채취하여 PCR-premix (iNtRON Biotechnology, Korea)와 혼합한 후, bacteria (8f, 1492r)에 특이 적인 primer를 이용하여 16S rRNA gene을 증폭한다. 각 미생물 별로 조합 된 16S rRNA gene 염기서열을 Korea bioinformation center의 EzTaxon 과 Genbank database (NCBI database) 통해 기존에 보고된 미생물의 16S rRNA 염기서열과의 상동성을 비교한다.

2-2. 한국인 특이 혐기성 장내 미생물 15종 이상의 신종 분리, 배양 및 동정 약물대사기반연구사업단


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가. 연구 내용 ○

한국인 조직 및 분변 시료를 중심으로 한국인에게 특이적으로 존재하는 신규 장내 혐기성 미생물 분리 및 배양, 동정을 목적으로 함.

한국인의 식생활 습관은 다른 국가의 그것과 차이를 보이고 있음. 한국인 특 유의 짜고 매운 음식 습관과 젓갈과 장류 같은 발효음식의 섭취 비율이 서 구 여러 나라에 비해 높기 때문에 장내세균총의 분포도 차이를 보일 것으로 예상하며, 기존에 알려지지 않은 장내미생물의 존재 가능성이 높음. 이는 곳 한국인에 적합한 대사체 평가기술의 기초 기반 구축에 좋은 정보를 제공할 수 있을 것임.

나. 연구내용 및 방법

분변 시료 확보 및 처리

- 서울대병원으로부터 확보 받은 검진자 및 환자의 분변시료를 혐기성 상태의 mineral solution에 넣고, 10배 비율로 희석. - 희석한 샘플을 아래와 같이 선택한 배지에 100 ul씩 접종. - 37℃, 혐기성 (N2:H2:CO2 = 90:5:5) 조건에서 배양.

장내 미생물에 따른 선택 배지 확립

- Ruminococcus 속, Bacteroides 속, Enterococcus 속 선택배지 (BHI) - Brain Heart Infusion 37 g/L: Calf Brains 7.7 g, Beef Heart 9.8 g, Proteose Peptone 10 g, Dextrose 2 g, Sodium Chloride 5 g, Disodium Phosphate 2.5 g - Yeast extract 5 g/L - Hemin solution 1 ml/L (Hemin 1 mg) 약물대사기반연구사업단


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- Agar 1.5% - Cellulolytic bacteria 선택배지 (BC medium) - 매일 섭취하는 음식의 20-30%는 인간이 소화하지 못하는 섬유소와 같 은 polysaccharide로써, 장내에 존재하는 특정 미생물에 의해 소화 가능 한 분자 단위로 분해된다. 이 미생물에 의한 장내 발효과정은 사람의 건 강에 이로운 역할을 할 뿐만 아니라 여러 가지 질병과도 깊은 연관성을 가지고 있다. 대표적으로 면역시스템과 관련된 염증 반응과 당뇨병, 비만 등의 질병과 에너지 대사와도 깊은 연관이 있다고 보고되고 있다. 따라서 해당 미생물의 분리 및 배양은 추후 후속연구에 큰 도움이 될 것으로 생 각한다. - Yeast extract 0.5 g/L - Tryptone 1 g/L - Glucose 5 g/L - Cellobiose 2 g/L - NaCl 1 g/L - MgCl2 X 6H2O 0.5 g/L - KH2PO4 0.2 g/L - NH4Cl 0.3 g/L - KCl 0.3 g/L - CaCl2 X 2H2O 0.015 g/L - Hemin solution 1 ml/L (Hemin 1 mg) - Trace element SL-6 1 ml/L - Se / Wo solution 1 ml/L - Agar 1.5% - 멸균 후, 50℃이하에서 Vitamin solution 1 ml/L 첨가 - Lactobacillus 속, Roseburia 속 선택배지 (YCFA medium) - 매일 섭취하는 음식의 20-30%는 인간이 소화하지 못하는 섬유소로 대표되는 cellulose (polysaccharide)로써, 장내에 존재하는 미생물에 의해 소화 가능한 분자 단위로 분해된다. 이 미생물에 의한 발효과정(fermentation)은 사람의 건강에 이로운 역할을 할 뿐만 아니라

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3-1세부과제

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여러 가지 질병과도 깊은 연관성을 가지고 있다. 대표적으로 자가면역질환과 성인병으로 대표되는 당뇨병, 비만 등의 질병과도 연관관계가 보고되고 있고, 에너지 대사와도 긴밀한 역할을 한다고 보고되고 있다. 따라서 해당 작용에 대한 정확한 역할 규명이 이뤄지려면 장내에 존재하는 미생물의 분리 및 배양이 수반되어야 할 것이다. - Lactate 0.2% - Glucose 0.2% - Starch 0.2% - Casitone 10 g/L - Yeast extract 2.5 g/L - NaCl 1g/L - MgCl2 X 6H2O 0.5 g/L - KH2PO4 0.2 g/L - NH4Cl 0.3 g/L - KCl 0.3 g/L - CaCl2 X 2H2O 0.015 g/L - Hemin solution 1ml/L (Hemin 1mg) - Trace element SL-6 1 ml/L - Se / Wo solution 1ml/L - Agar 1.5% - 멸균 후, 50℃이하에서 Vitamin solution 1 ml/L 첨가 - Bacteroides 속 선택배지 (Supplemented Brain Heart Infusion Medium, BHIS) -

전체

장내

미생물

20%를

차지하고

있는

미생물로써,

Firmicutes와의 양적 변화는 앞서 언급한 비만과 깊은 관련이 있다 고 최근 보고되고 있다.

① Bacteroides 속은 자연적으로 aminoglycoside 계열 항생제 및 β-lactam 계열 항생제에 대한 저항성을 지니고 있다. 따라서 이런 항생제를 도

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3-1세부과제

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입한다면 장내 미생물로부터 Bacteroides 속만을 분리할 수 있을 것 이다. - Brain Heart Infusion 37 g/L: Calf Brains 7.7 g, Beef Heart 9.8 g, Proteose Peptone 10g, Dextrose 2 g, Sodium Chloride 5 g, Disodium Phosphate 2.5 g - Hemin solution 10 ml/L (Hemin 10 mg) - L-cysteine 1 g/L - NaHCO3 (10% solution) 20 ml/L - Aminoglycoside 항생제: Gentamycin 50-200 mg/L 또는 Kanamycin 50-100 mg/L ② Eggerth-Gagnon 배지 - 최초로 분리된 Bacteroides species를 배양한 배지로써, 아직까지도 널리 이용되고 있는 배지이다. - Beef extract: 0.3% - Bacto peptone: 1.0% - Na2HPO4: 0.4% - Soluble starch: 0.5 g/L - Yeast extracts: 5.0 g/L - pH 7.8로 조정 - Agar: 1.5% - 멸균 후, 50℃ 이하에서 첨가: Sheep Blood: 5.0%과 Hemin solution (Hemin, 1mg) 1 ml - Bifidobacterium 선택배지 (Bifidobacterium Selective Medium , BSM) - high G+C content, Gram-positive bacteria로써, 전세계적으로 널 리 사용되는 probiotics중 하나이다. 전체적인 장내미생물 구성에서 는 적은 양으로 존재한다고 보고되고 있지만, 아직까지 그 군집이 불확실하다. - Gram-positive에 효과적은 Mupirocin 항생제를 통해 bificobacterial

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

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bacteria만 견딜 수 있는 양을 첨가함으로써 bifidobacterial 균주만 분리할 수 있다. bificobacterial 선택배지로 널리 사용되고 있다. - Lactobacilli MRS medium 70g/L - Proteose Peptone 10.0 g/L - Beef Extract 10.0 g/L - Yeast Extract 5.0 g/L - Dextrose 20.0 g/L - Polysorbate 80 1.0 g/L - Ammonium Citrate 2.0 g/L - Sodium Acetate 5.0 g/L - Magnesium Sulfate 0.1 g/L - Manganese Sulfate 0.05 g/L - Dipotassium Phosphate 2.0 g/L - Agar 15.0 g/L - L-cysteine 0.05% - Mupirocin 50 mg/L - YCFAGSC medium - Reference를 바탕으로 pH에 따른 목표 장내 미생물에 차별을 두고자 하였음. 장내는 short-chain fatty acids에 의해 장관의 위치에 따라 다양한 pH를 보임. 이에 장내 pH 환경과 비슷한 환경을 제공해줌으로써, pH 영향에 따라 기존에 알려지지 않은 미생물 분리를 목적으로 함. *Reference:

pH

populations

and

and

peptide

short-chain

supply fatty

can acid

radically ratios

alter

within

bacterial microbial

communities from the human colon (2005) Walker et al., Appl Environ

Microbiol, 3692-3700) a.Fimicutes (pH5.5) - D.W 950ml - 10g Casitone

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3-1세부과제

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- 2.5g Yeast extract - 0.4g NaHCO3 - 2g glucose, starch and cellobiose - 1.0g L-Cysteine-HCl - 0.45g K2HPO4 and KH2PO4 (Buffer) - 0.9g (NH4)2SO4 - 0.9g NaCl - 0.09g MgSO4 7H2O - 0.09g CaCl2 - Bile salts 0.005% - SCFAs: 33mM acetate, 9mM propionate, 5mM butyrate and 1mM isobutyrate / isovalerate / valerate - Hemin sol. 10ml (0.01g Hemin) - Vitamin sol. 1.0ml (filter-sterilized) - Semisolid agar plate: 1.0 % b.Bacteroidetes (pH6.5) - All components are the same as above, except for K2HPO4 8.55g and KH2PO4 6.85g - Minimal Medium - 기존의 분리 배양법은 복합배지를 통해 환경으로부터 다양한 미생물을 분리하고자 하였으나, 고영양의 배지를 통해서는 우점종 또는 생장속도가 상대적으로 빠르고, 환경변화에 민감하지 않은 미생물만이 분리되었음. 이에 저영양의 분리 환경을 적용함으로써, 우점종에 방해 받지 않고, 상대적으로 다양한 미생물의 생장을 유도하려 하였으며, 특정 carbon and energy source에 편중된 미생물 분리를 줄여 줄 것으로 예상함.

- Yeast Extract 0.01%, 0.1g/L - 100X Salt Sol.: 10ml

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3-1세부과제

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- NaCl 1.0g/L - NH4Cl0.3g/L - KH2PO40.2g/L - CaCl22H2O0.015g/L - MgCl20.5g/L - K2HPO40.2g/L - MnSO44H2O0.01g/L - CoCl26H2O0.01g/L - FeSO47H2O0.01g/L - Resazurin 0.0001% - Reductant: L-Cysteine 0.47g/L (3mM), Ti-Citrate(20% Ti) 769㎕ (1mM) - Hemin Sol. 10ml - Vitamin Sol. 1ml - Minimal Medium + addition - 장내 미생물 생장에 필요한 물질이 포함된 배지에 다양한 첨가물을 통해 특정 미생물만을 screening할 수 있을 것으로 판단, 아래와 같은 첨가물을 이용하였음. a. Glucose: 미량의 탄소 및 에너지원만이 존재하는 mineral medium에 일반적으로 널리 알려진 glucose를 소량의 농도로 넣어 줌으로써, 탄소 원의 양에 따른 분리 미생물에 차별을 기대함. 원 참고 논문에서는 protein source를 변화시켰으나, 본 실험에서는 glucose를 통해 유사한 결과를 기대함. *Reference:

pH

populations

and

and

peptide

short-chain

supply fatty

can acid

radically ratios

alter

within

bacterial microbial

communities from the human colon (2005) Walker et al., Appl Environ

Microbiol, 3692-3700)

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3-1세부과제

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b. Ampicillin and Erythromycin: 항생제를 통한 분리 방법은 이전에도 시도된 적이 있으며, 특정 항생제에 대한 resistance를 갖는 소군집만을 분리하기

위한

목적임.

Ampicillin은

beta-lactam계

항생제로써,

gram-positive 및 몇몇 gram-negative 미생물의 inhibitor로 알려져 있음. 장내 미생물 중 70%를 차지하는 Firmicutes에 대해 sensitive하 게

작용하고,

소수의

알려지지

않은

Bacteroidetes,

Proteobacteria, Actinobacteria의 분리를 기대함. - GAM (Gifu anaerobic medium) - 장내 미생물을 비롯한 anaerobic bacteria는 오래 전부터 일본 미생물학자 에 의해 꾸준히 보고되었으며, 이 중 상당수는 잘 알려지지 않은 새로운 미 생물이 많은 비중을 차지함. GAM agar는 일본에서 분리된 장내 미생물에 적용된

배지로써,

복합

배지임에도

불구하고,

genera

Sutterella,

Paraprevotella, Adlercreutzia, Dialister와 같은 흔하지 않은 genus에서 부터 Bifidobacterium과 같은 잘 알려진 미생물까지 광범위한 장내 미생물 분리에 적용되었다고 보고되었음. - Peptone 5g - Soy peptone 3g - Proteose peptone 5g - Serum powder 10g - Yeast Extract 2.5g/L - Beef extract 2.2g - Liver extract 1.2g - Glucose 0.5g - Starch 5g - NaCl 3.0g/L - KH2PO4 2.5g/L - L-tryptophan 0.2g - L-arginine 1.0g - Resazurin 0.0001%

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3-1세부과제

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- Reductant: L-Cysteine 5.0g/L (3mM), Ti-Citrate(20% Ti) 769㎕ (1mM) - Hemin Sol. 10ml - Vitamin Sol. 1ml

다. 분리 및 동정

순수 분리 : 배양 후 형성된 집락 (colony)은 크기, 모양과 색 등의 형태학적 특성에 따 라 분류, 무작위로 선택하였으며, 3회의 계대배양을 통해 미생물을 순수 분리 한다.

16S rRNA gene sequence 분석을 통한 분리 미생물의 동정 : 순수 분리된 미생물의 16S rRNA 유전자 염기서열을 얻기 위해 colony PCR을 수행한다. 단일 colony로부터 1 toothpick 채취하여 PCR-premix (iNtRON Biotechnology, Korea)와 혼합한 후, bacteria (8f, 1492r)에 특이 적인 primer를 이용하여 16S rRNA gene을 증폭한다. 각 미생물 별로 조합 된 16S rRNA gene 염기서열을 Korea bioinformation center의 EzTaxon 과 Genbank database (NCBI database) 통해 기존에 보고된 미생물의 16S rRNA 염기서열과의 상동성을 비교한다.

Genomic DNA-DNA hybridization 기법을 이용한 신규 균주의 확인 일반적으로

미생물

분류

체계상

Genomic

DNA

relatedness가

70%미만이면 서로 독립적인 균주로 인정된다. 또한 16S rRNA 염기서열의 상동성이 97.0%미만이면 Genomic DNA relatedness가 70%미만이라는 것이 통계학적인 분석에 의해 증명되었다. 따라서 database에 등록된 균주들과의

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3-1세부과제

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16S rRNA 상동성 비교 결과, 장내 분리 균주와 16S rRNA 염기서열 상동성이 97.0%이상으로 나타나는 균주를 reference 균주로 선정하였다. 그리고 서로 간의 Genomic DNA-DNA relatedness를 분석하여 신규 미생물 여부를 확인하였다. 균주의 Genomic DNA는 G-spinTM Genomic DNA extraction kit (iNtRON Biotechnology)를 사용하여 추출하였다. 추출한 Genomic DNA를

polystyrene microplate에

분주한 후, overnight한다.

Dry-adsorption반응으로 분주된 Genomic DNA가 고정된다.

고농도

(500ng/ul)의

신규

균주

Genomic

DNA를

photobiotin으로

labellin하여, 고정된 Genomic DNA위에 분주한 후, 37℃에서 배양한다. 신규 균주의 Genomic DNA와 referece 균주 Genomic DNA 간에 재결합을 유도하는 과정이다.

3시간

배양

후,

streptavidine-β-galactosidase

효소와

4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside 기질을 넣어 주면 형광을 띠게 되는데, 이 때 발광정도를 통해 Genomic DNA간의 결함정도를 판단할 수 있다.

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3-1세부과제

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생리활성 테스트 미생물의 생장 환경에 대한 실험으로 pH, 온도, 염도에 따른 생장정도를 파악 한다. 이를 통해 최적의 생장환경을 알 수 있다.

혐기성 균주 biochemical description ① API 20A Kit 혐기성 균주에서 주로 관찰되는 21개의 생화학적 test를 수반하는 동정 kit으 로써, 균주의 대사과정을 통해 색 변화를 유도하고, 그 결과를 통해 해당 균주 의 특징을 알 수 있다. ② rapid ID 32 A 혐기성 균주의 enzymatic 특징을 규명할 수 있는 동정 kit으로, 균주에 존재하 는 효소에 의해 일어나는 색 변화를 통해 특징을 알 수 있다. ③ API ZYM 미생물의 효소활성을 검사하기 위해 제작된 kit로써, 각 well에 들어있는 기질 과의 효소반응이 색변화를 일으키고, 그 결과를 통해 해당 균주의 특징을 알 수 있다.

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3-1세부과제

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지방산 분석 지방산 분석법은 미생물의 분류 및 동정에 자주 쓰이는 분석법이다. 지방산은 주로 cytoplasmic membrane에 위치하며, Gram-positive의 lipoteichoic acids와 Gram-negative의 phospholipid, lipopolysaccharide의 구성물질이 다. 지방산의 길이, 불포화지방산의 유무, 곁가지의 유무 등과 같은 패턴이 미 생물에 따라 다양하고, 현재까지 가장 잘 발달된 분석법으로 알려져 있기 때문 에 분류 및 동정의 기준으로 널리 쓰인다. 지방산의 조성은 생장 환경 (배지, 온도, pH, 배양시간 등)으로부터 영향을 받기 때문에, 비교를 위해서는 동일 환경에서 얻은 cell을 사용해야 한다.

G+C 함유량 일반적으로 종(species) 단위 내에서 Guanine과 Cytosine 함유량 변화가 5% 를, 속(genus) 단위 내에서는 10%를 넘지 않는다. 따라서 동일한 G+C 함유 량을 보이는 균주는 동일한 분류군에 속한다고 판단할 수 있다. 그렇지만, G+C 함유량이 서로 겹치는 분류군이 많으며, 특정 범위에 많은 미생물 군이 속해 있기 때문에 상대적으로 그 중요성은 떨어지는 편이다.

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3-1세부과제

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3. 연구개발 결과 3-1. 한국인 분변 시료 및 조직 시료에서 한국인에게 다량 존재하는 50종 이상의 장 내 혐기성 미생물 분리 및 배양, 동정 - 1,2,3차년도 선택배지를 통해 분리된 장내 미생물 현황 No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Taxo n Bifido bacterium ad olescentis Co ll in sella a erofacien s Bif idobacteriu m bifidum Bifidobacterium longum subsp . infa nt is B ifidobact erium longum subsp. lon gum Bifidobacterium pseudocatenula tum Entero coccus du rans B acteroides ca ccae B acteroides cell ulosilyticus Bact eroides thet aiotaomicro n B acteroides uniformi s B acteroides xylaniso lvens

Medium EG medium Y CFAG SC medium Y CFAG SC medium EG medium M MA M MA EG EG medium EG medium EG medium EG medium EG medium

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49

B cteroi des vulg atus Pa raba ctero ides dista nson is Anaerostipes butyra ti cus Cl ostridium lep tum Clostridium methylpent osum Flavonifractor plau tii Acidami nococcus ferm entans Al lisonella h istaminiformans Dialister su ccinati ph il us Mega sphaera el sden ii M itsu okel la ja lalud inii Phascolarctobacterium faecium Sutterella pa rvirubra Sutterel la wad sworthensis Blautia luti Blau tia wexlerae Coprococcu s co mes Coprococcu s eu tactu s D orea formi cigenerans Do rea longica tena Euba ct erium eligens Eubacterium rect al e Eubacterium ruminantium Eu bacterium ven triosum Lachnospira pectin oschiza Ro sebu ria faecis Roseburia hominis Rum inoco ccus bromii Ruminoco ccus gnavus R um inoco ccus obeum Catenibact erium mitsuoka i Lactob acillus g asseri Lactob acillu s reuteri Pa raprevo tella clara Prevotella copri Bilophila wadsworthia Shi gell a flexn eri

EG medium EG medium Y CFAG SC medium M MA M MA M MA Y CFAG SC medium Y CFAG SC medium M MA Y CFAG SC medium BC medium M MA M MA M MA BHIA Y CFAG SC medium PYG medium BHIA PYG medium PYG medium BH I M MA BHIA M MA Y CFAG SC medium Y CFAG SC medium M MA M MA +Gluco se MMA+Erythromycin Y CFAG SC medium Y CFAG SC medium BSM BSM M MA Y CFAG SC medium M MA BC medium

Phylogenetic g roup

Actin obacteria

Bacil lales

Bacteroides

Clo stri dium cluster IV

Clo stri dium cluster IX

Cl ost rid ium cluster XIVa

Clostridium cluster XVII Lactob acillales Prevotella Proteobacteri a

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

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: BC, EG, BSM, YCFAGSC, MMA와 GAM 배지 등을 통해 분리된 장내미생 물 현황임. 1-3차년도에 분리 배양된 장내 미생물은 총 71종이며, 그 중 신규 미생물을 제외한 49종의 장내미생물은 기존에 알려지 장내 미생물과 거의 일 치하며, 현재까지 분리된 장내 혐기성 미생물은 -80°C 냉장 상태로 장기 보 관되어 있음.

- 현재까지 분리된 장내 미생물의 계통분류학적 위치 현황 (1차 / 2차 / 3차 년도) 년도)

Isolation of previously-known gut microbiota Paraprevotella clara Prevotella capri

Bacteroides caccae Bacteroides cellulosilyticus Bacteroides thetaiotaomicron Bacteroides uniformis Bacteroides xylanisolvens Bcteroides vulgatus Parabacteroides distansonis

Shigella flexneri Bilophila wadsworthia

Blautia wexlerae Blautia luti Coprococcus comes Coprococcus eutactus Dorea formicigenerans Dorea longicatena Eubacterium eligens Eubacterium rectale Eubacterium ruminantium Eubacterium ventriosum Lachnospira pectinoschiza Roseburia faecis Roseburia hominis Ruminococcus bromii Ruminococcus gnavus Ruminococcus obeum Anaerostipes butyraticus Clostridium leptum Clostridium methylpentosum Flavonifractor plautii

Enterococcus durans Lactobacillus gasseri Lactobacillus reuteri

Collinsella aerofaciens Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium longum subsp. infantis Bifidobacterium longum subsp. longum Bifidobacterium pseudocatenulatum

Acidaminococcus fermentans Allisonella histaminiformans Dialister succinatiphilus Megasphaera elsdenii Mitsuokella jalaludinii Phascolarctobacterium faecium Sutterella parvirubra Sutterella wadsworthensis

Catenibacterium mitsuokai

49 species of 28 genera, 10 phylogenetic groups were isolated

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3-1세부과제

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3-2. 한국인 특이 혐기성 장내 미생물 15종 이상의 신종 분리, 배양 및 동정 가. 결과 - 16S rRNA gene sequence분석 및 Genomic DNA relatedness를 통해 기 존에 알려진 균주와의 상동성을 비교하였으며, 그 결과 독립된 균주로 판단된 다. - 총 22종의 신규 균주를 분리 및 배양하였으며, 5 균주 (Bacteroides

faecis, Bifidobacterium stercoris, Ruminococcus faecis, Blautia faecis, and

Blautia

stercoris)는

국제

미생물계통분류학회지인

IJSEM

(International Journal of Systematic and Environmental Microbiology) 및 국제 미생물학회지인 Journal of Microbiology에 개재되었음.

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Taxon Bifidobacterium stercoris Eg1 Bifidobacterium sp. nov. M45 Bifidobacterium sp. nov. G29 Olsenella sp. nov. Bacteroides faecis MAJ27 and MAJ26 Faecalibacterium sp. nov. Anaerostipes sp. nov. Oscillibacter sp. nov. G2 Ruminococcus faecies Eg2 Blautia stercoris GAM6-1 Blautia faecis M25 Blautia sp. nov. Y8 Eubacterium sp. nov. Coprococcus sp. nov. Clostridium sp. nov. Roseburia sp. nov. Hespellia sp. nov. Ruminococcus sp. nov. R1 / R2 / R3 Catenibacterium sp. nov. Clostridium gen. nov. H2 Clostridium gen. nov. Y2 Eggerthella sp. nov. E1

Medium BHI MMA MMA YCFAGSC medium EG BHI BHI MMA EG GAM GAM GAM BHIS MMA MMA MMA+Erythromycin MMA GAM YCFAGSC medium BHI BHI GAM

Phylogenetic group Actinobacteria Bacteroides Clostridium cluster IV

Clostridium cluster XIVa

Clostridium cluster XVII Eggerthella

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3-1세부과제

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A. 신규 미생물 분류학적 위치 ① Bacteroides faecis 100 / 100

Bacteroides tectus JCM 10003T (AB200228) Bacteroides pyogenes JCM 6294T (AB200229)

59 / − 100 / 100

Bacteroides coprosuis PC139T (AF319778) Bacteroides propionicifaciens SV434T (AB264625)

Bacteroides graminisolvens XDT-1T (AB363973) Bacteroides fragilis NCTC 9343T (CR626927) Bacteroides salyersiae WAL 10018T (AY608696) 70 / −

Bacteroides nordii WAL 11050T (AY608697)

68 / −

Bacteroides caccae ATCC 43185T (AAVM02000012) 61 / 77

Bacteroides acidifaciens A40T (AB021164) 55 / 72

Bacteroides xylanisolvens XB1AT (AM230650) 100 / 73

−/−

Bacteroides ovatus ATCC 8483T (AAXF02000050)

91 / 58

Bacteroides finegoldii JCM 13345T (AB222699) Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482T (AE015928)

85 / −

Bacteroides faecis MAJ27T (GQ496624)

96 / 60 100

Bacteroides faecis MAJ26 (GQ496623)

Bacteroides uniformis ATCC 8492T (AAYH02000049) −/− 81 / −

Bacteroides eggerthii DSM 20697T (ABVO01000045)

91 / 74

Bacteroides stercoris ATCC 43183T (ABFZ02000022)

85 / 56

Bacteroides gallinarum JCM 13658T (AB253732) Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838T (ACCH01000108) 100 / 99

Bacteroides intestinalis DSM 17393T (ABJL02000008) Bacteroides helcogenes JCM 6297T (AB200227) 100 / 100

98 / 93

Bacteroides vulgatus ATCC 8482T (CP000139) Bacteroides dorei DSM 17855T (ABWZ01000093) Bacteroides massiliensis B84634T (AY126616)

70 / 71

55

Bacteroides plebeius M12T (AB200217) Bacteroides coprocola DSM 17136T (ABIY02000115) Bacteroides salanitronis JCM 13657T (AB253731)

97 / 72

64 80 / 72

Bacteroides coprophilus DSM 18228T (ACBW01000012) Bacteroides barnesiae JCM 13652T (AB253726) Prevotella melaninogenica ATCC 25845T (AY323525)

0.02

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3-1세부과제

32/ 32/47

② Bifidobacterium stercoris

100 / 97

Bifidobacterium animalis subsp. lactis YIT 4121T (AB050136) Bifidobacterium animalis subsp. animalis JCM1190T (D86185)

73 / 78

Bifidobacterium choerinum ATCC 27686T (D86186)

72 / 61

Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum ATCC25865T (M58736) 57 / −

99 / 90

Bifidobacterium pseudolongum subsp. pseudolongum JCM1205T (D86195) Bifidobacterium cuniculi ATCC 27916T (M58734)

99 / 90 78 / −

Bifidobacterium magnum ATCC 27540T (M58740) Bifidobacterium gallicum JCM 8224T (D86189) Bifidobacterium tsurumiense OMB115T (AB241106)

−/−

Bifidobacterium thermacidophilum subsp. porcinum P3-14T (AY148470)

51 / −

Bifidobacterium thermophilium ATCC 25525T (U10151)

70 / −

Bifidobacterium thermacidophilium subsp. thermacidophilium 36T (AB016246)

98 / 73

Bifidobacterium boum JCM 1211T (D86190) −/−

Bifidobacterium bombi BlucI/TPT (EU127549)

−/− −/−

Bifidobacterium asteroides YIT 11866T (AB437355) Bifidobacterium coryneforme YIT 4092T (AB437358)

97 / 82 99 / 90

Bifidobacterium indicum JCM 1302T (D86188) Bifidobacterium bifidum YIT 4039T (AB437356)

Bifidobacterium dentium ATCC 27534T (D86183) 92 / 85 −/−

Bifidobacterium adolescentis YIT 4011T (AB437354)

98 / 90

78 / −

Bifidobacterium stercoris Eg1T (FJ611793)

Bifidobacterium ruminantium JCM 8222T (D86197) −/−

Bifidobacterium merycicum JCM 8219T (D86192) Bifidobacterium angulatum ATCC 27535T (D86182)

81 / −

Bifidobacterium catenulatum YIT 4016T (AB437537)

55 100 / 76

Bifidobacterium pseudocatenulatum JCM 1200T (D86187) Bifidobacterium scardovii CCUG 13008T (AJ307005)

92 / 87

−/−

100 / 99

Bifidobacterium gallinarum JCM 6291T (D86191) Bifidobacterium saeculare DSM 6531T (D89328) Bifidobacterium pullorum JCM 1214T (D86196) Bifidobacterium breve ATCC 15700T (AB006658) Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697T (D86184)

87 / 70 100 / 98 − / 77

Bifidobacterium longum subsp. longum YIT 4021T (AB437359) Bifidobacterium longum subsp. suis ATCC 27533T (M58743)

Bifidobacterium minimum YIT 4097T (AB437350) −/−

Bifidobacterium mongoliense YIT 10443T (AB433856) 69 / 51

Bifidobacterium psychraerophilum T16T (AY174108) Bifidobacterium subtile DSM 20096T (D89378) Micrococcus lylae DSM 20315T (X80750)

0.01

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

33/ 33/47

③ Ruminococcus faecis Coprococcus eutactus ATCC 27759T (ABEY01000016) Coprococcus catus VPI C6-61T (AB038359)

Cluster XIVa 100 / 92 100 / 99 97 / 71

56 / 59

Blautia producta ATCC 27340T (X94966) Blautia coccoides ATCC 29236T (M59090) Blautia hansenii DSM 20583T (ABYU01000028)

99 / 75

Blautia schinkii BT (X94965) Blautia luti BInIXT (AJ133124)

99 / 94 98 / 97

75 / 65

Ruminococcus obeum ATCC 29174T (AAVO01000042) Ruminococcus gauvreauii CCRI-16110T (EF529620)

100 / 98

Ruminococcus gnavus ATCC 29149T (AAYG01000042)

73 / 78

Coprococcus comes ATCC 27758T (ABVR01000038)

78 / 68 95 / 83 79 / 57 70 / −

Ruminococcus lactaris ATCC 29176T (ABOU01000039) Ruminococcus torques ATCC 27756T (AAVP02000040) Ruminococcus faecis Eg2T (FJ611794) Clostridium lentocellum DSM 5427T (X71851)

Cluster XIVb

Clostridium colinum DSM 6011T (X76748)

100 / 100 −/−

Clostridium piliforme unculturedT (L07416) Clostridium lactatifermentans G17T (AY033434)

71 / 60

Clostridium neopropionicum DSM 3847T (X76746)

100 / 100 100 / 99

Clostridium propionicum DSM 1682T (X77841) Ruminococcus bromii ATCC 27255T (L76600)

98 / 89

Clostridium leptum DSM 753T (AJ305238)

Cluster IV

Ruminococcus albus ATCC 27210T (L76598)

100 / 100

Ruminococcus flavefaciens ATCC 19208T (L76603)

74 / 64 99 / 99

Ruminococcus callidus ATCC 27760T (L76596) Propionigenium modestum Gra Succ 2T (X54275)

Cluster XIX

73 / 81

Fusobacterium nucleatum subsp. fusiforme NCTC 11326T (X55403)

100 / 100

Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii ATCC 49256T (X006964) 100 / 100

52 / − 89 / −

Fusobacterium nucleatum subsp. animalis NCTC 12276T (X55404) Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586T (X55401) Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953T (X55402)

0.02

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

34/ 34/47

④ Faecalibacterium sp. nov. Ruminococcus callidus ATCC 27760T (L76596)

99

Ruminococcus flavefaciens ATCC 19208T (X83430)

92

Ruminococcus albus ATCC 27210T (L76598)

61

Ruminococcus bromii ATCC 27255T (L76600) Clostridium sporosphaeroides DSM 1294T (X66002)

100 91

99

Clostridium leptum DSM 753T (AJ305238) Eubacterium siraeum ATCC 29066T (L34625) Anaerofilum pentosovorans FaeT (X97852)

100 46

Anaerofilum agile FT (X98011) Subdoligranulum variabile BI114T (AJ518869)

100

73

100

Cluster IV

F. prausnitzii ATCC 27766 (X85022)

100

F. prausnitzii ATCC 27768T (AJ413954) 100

F. prausnitzii A2-165 (AJ270469) F. prausnitzii L2-6 (AJ270470)

80 99

Faecalibacterium sp. nov. H9

Eubacterium desmolans ATCC 43058T (L34618) Sporobacter termitidis SYRT (Z49863)

100 99

Papillibacter cinnamivorans CIN1T (AF167711) Clostridium viride T2-7T (X81125)

36

Clostridium orbiscindens DSM 6740T (Y18187)

100 100

Eubacterium plautii CCUG 28093T (AY724678)

Clostridium alkalicellulosi Z-7026T (AY959944) 100

Clostridium cellobioparum DSM 1351T (X71856) Ruminococcus gauvreaui CCRI 16110T (EF529620)

Cluster XIVa

Ruminococcus gnavus ATCC 29149T (AAYG01000042)

100

Coprococcus comes ATCC 27758T (ABVR01000038)

76

Ruminococcus torques ATCC 27756T (AAVP02000040)

89 69

Ruminococcus lactaris ATCC 29176T (ABOU01000039)

0.01

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

35/ 35/47

⑤ Anaerostipes sp. nov.

Anaerostipes sp. nov.

98 / 88

Anaerostipes caccae L1-92T (AJ270487)

69 / 73

Eubacterium hallii ATCC 27751T (L34621)

46 / 66

Parasporobacterium paucivorans SYR1T (AJ272036) Clostridium jejuense HY-35-12T (AY494606) Anaerosporobacter mobilis IMSNU 40011T (AY534872)

39 / 62

Clostridium populeti ATCC 35295T (X71853)

50 / 63 35 / 37

Clostridium polysaccharolyticum DSM 1801T (X77839) Desulfotomaculum guttoideum DSM 4024T (Y11568)

0.01

⑥ Clostridium gen. nov.

79 / 56

Clostridium ramosum DSM 1402T (X73440) Clostridium cocleatum DSM 1551T (Y18188) Clostridium saccharogumia SDG-Mt85-3DbT (DQ100445)

100 / 99

Clostridium spiroforme DSM 1552T (X73441)

69

0.02

Clostridium sp. Y2 98 / 45 100 / 100

Clostridium sp. H2 Coprobacillus cateniformis JCM 10604T (AB030219)

100 / 98

Catenibacterium mitsuokai JCM 10609T (AB030224) Lactobacillus vitulinus ATCC 27783T (M23727)

100 / 100

Sharpea azabuensis JCM 14210T (AB210824)

53 / 66 100 / 99

Lactobacillus catenaformis DSM 20559T (AJ621549) Streptococcus pleomorphus ATCC 29734T (M23730) Clostridium innocuum ATCC 14501T (M23732)

100 / 100

Eubacterium tortuosum ATCC 25548T (L34683)

98 87

Eubacterium dolichum ATCC 29143T (L34682) Clostridium cellulolyticum ATCC 35319T (X71847)

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

36/ 36/47

⑦ Eubacterium sp. nov.

Clostridium glycyrrhizinilyticum ZM35T(A

65

Ruminococcus lactaris ATCC 29176T(ABOU01

93

Coprococcus comes ATCC 27758T(ABVR010000 96 87

Clostridium nexile DSM 1787T(X73443) Ruminococcus gnavus ATCC 29149T(AAYG0100

38

Clostridium bolteae ATCC BAA-613T(ABCC02

100

Clostridium lavalense CCRI-9842T(EF56427 21

84

Clostridium saccharolyticum DSM 2544T(Y1 100

Clostridium aerotolerans DSM 5434T(X7616 Lachnospira pectinoschiza 150-1T(L14675)

30 100

Eubacterium sp. nov. M39 Eubacterium ramulus ATCC 29099T(L34623)

50

Roseburia inulinivorans A2-194T(AJ270473 73

Eubacterium rectale ATCC 33656T(CP001107

34

Roseburia cecicola ATCC 33874T(L14676)

78 80 32 59

Roseburia faecis M72/1T(AY305310) Roseburia hominis A2-183T(AJ270482) Roseburia intestinalis L1-82T(AJ312385) Lachnobacterium bovis LRC 5382T(AF298663 Pseudobutyrivibrio ruminis DSM 9787T(X95 Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482T(A

0.05

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

37/ 37/47

⑧ Blautia stercoris GAM6-1

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

38/ 38/47

⑨ Blautia faecis

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

39/ 39/47

⑩ Blautia-like strain Y8

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

40/ 40/47

⑪ The genus Ruminococcus : GAM배지에서 분리된 strain R1, R2, R3

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

41/ 41/47

⑫ The genus Eggerthella : GAM배지에서 분리된 strain E1

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

42/ 42/47

⑬ The genus Bifidobacterium : MMA배지에서 분리한 strain M45와 G29

91

0.005

79

93

98

Bifidobacterium longum subsp. suis ATCC Bifidobacterium longum subsp. suis YIT 4 88 Bifidobacterium longum subsp. longum NCC 100 Bifidobacterium longum subsp. longum YIT Bifidobacterium longum subsp. infantis A Bifidobacterium breve DSM 20213T(ACCG010 Bifidobacterium scardovii YIT 11867T(AB4 Bifidobacterium pullorum JCM 1214T(D8619 100 Bifidobacterium saeculare DSM 6531T(D893 99 Bifidobacterium gallinarum JCM 6291T(D86 Bifidobacterium subtile DSM 20096T(D8937 Bifidobacterium bifidum YIT 4039T(AB4373 Bifidobacterium merycicum JCM 8219T(D861 Bifidobacterium angulatum DSM 20098T(ABY Bifidobacterium pseudocatenulatum JCM 12 100 Bifidobacterium catenulatum DSM 16992T(A Bifidobacterium dentium ATCC 27534T(D861 Bifidobacterium nov sp. CU3-7 Bifidobacterium stercoris Eg1T(FJ611793) 93 Bifidobacterium ruminantium JCM 8222T(D8 Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703T Bifidobacterium sp. M45T Bifidobacterium sp. G29 Bifidobacterium pseudolongum subsp. pseu Bifidobacterium pseudolongum subsp. glob Bifidobacterium gallicum DSM 20093T(ABXB Bifidobacterium tsurumiense OMB115T(AB24 Bifidobacterium boum JCM 1211T(D86190) Bifidobacterium thermophilum YIT 11868T( 100 Bifidobacterium thermacidophilum subsp. Bifidobacterium mongoliense YIT 10443T(A Bifidobacterium minimum YIT 4097T(AB4373 Bifidobacterium asteroides YIT 11866T(AB Bifidobacterium coryneforme YIT 4092T(AB Bifidobacterium indicum JCM 1302T(D86188 100

99

99

70

99 97

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

43/ 43/47

⑭ The genus Oscillibacter : MMA + Glucose 배지에서 분리된 strain G2

Clostridium sporosphaeroides DSM 1294T(X

100

Clostridium leptum DSM 753T(AJ305238)

89

0.05

Ruminococcus bromii ATCC 27255T(L76600) Clostridium methylpentosum DSM5476T(Y181 Ruminococcus albus ATCC27210T(L76598) Ruminococcus callidus ATCC 27260T(L76596

76 99

Ruminococcus flavefaciens ATCC 19208T(L7 Eubacterium siraeum ATCC29066T(L34625) Faecalibacterium prausnitzii ATCC 27768T

91

Anaerofilum pentosovorans FaeT(X97852)

99

100 Anaerofilum agile FT(X98011) Eubacterium desmolans ATCC 43058T(L34618 Sporabacter termitidis SYRT(Z49863)

88 100

Papillibacter cinnaminovorans CIN1T(AF16

96 100

89

Oscillibacter sp. G2 Oscillibacter valericigenes Sjm18-20T(AB Clostridium orbiscindens DSM 6740T(Y1818

99

Clostridium viride T2-7T(X81125) Clostridium cellulosi AS 1.777T(L09177) Clostridium butyricum ATCC19398T(AB07576 Aquifex pyrophilus Kol5aT(M83548)

약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

44/ 44/47

4. 연구결과 고찰 및 결론 - 다양한 혐기성 장내 미생물의 분리 및 배양을 통해 현재까지 적용되고 있는 배양 기술은 다방면으로 축적하고 있음. 이는, 추후 장내 미생물의 생리학적 기 능을 규명하고, 이를 바탕으로 장관 내 생태학적 역할을 유추할 수 있는 기반 을 마련했다고 판단함. - 현재까지 5종의 신규 장내 미생물을 분리 및 동정, 계통분류학회지(IJSEM) 를 통해 보고 및 등록하였으며, 3종 이상의 신규 미생물로 추정되는 장내 미생 물의 특성을 지속적으로 규명할 계획임. 허나, heterogenous한 미생물 집합체 인 장내 미생물의 특성으로 계통분류학적 정의가 쉽지 않음. - 최근, 보고한 Ruminococcus sp. nov.의 경우, 해당 균주가 속해 있는 Clostridial cluster XIVa 그룹 내 다양한 genera가 포함되어 있어, species novel임에도 불구하고 같은 그룹 내 속한 다른 genus와의 비교를 동반해야 한 다는 이유로 reject되었음. 이는 추후 신규 미생물로 추정되는 균주 중 계통분 류학적 위치 및 특징이 비교적 뚜렷한 균주만 동정이 가능할 것으로 판단됨. 이는, 당초 예상했던 인력과 비용을 웃도는 노력과 시간이 필요할 것으로 판단 됨. - 본 연구에서 당초 제안한 한국인에게 다량 존재하는 50종 이상의 장내 혐기 성 미생물 분리 및 배양, 동정은 이미 목표치를 초과한 상태임. 분리된 고유의 장내미생물은 추후 한국인 장내 생태를 연구하는 중요한 자원으로 사용될 것이 며, 선진국과 독립적인 생물자원 및 데이터를 구축함으로써, 독자적인 연구가 가능할 것으로 기대됨. - 또한, 분리배양법을 통해 획득한 장내 미생물을 무균동물 및 유전적 변이 동 물과의 결합하여 이미 선진국에서 시행되고 있는 장내미생물 역할 규명 연구 접근법으로 적용될 것이며, 장내미생물에 의한 면역 반응 평가 및 장내 미생물 생태학적 역할 규명이 가능해질 것으로 예측함. 이에, 분리배양법을 바탕으로 한 꾸준한 장내미생물 분리가 이뤄져야 할 것이며, 차세대 분리배양 기술 또한 개발되어야 할 것임. 약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

45/ 45/47

5. 참고문헌

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약물대사기반연구사업단


3-1세부과제

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3-1세부과제