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한국인 특이 장내미생물 분석체계 구축
2009-2011. / 3 중단위 요약 (한국인 특이 장내미생물 분석체계 구축 )
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목
차
< 제 3 중단위 연구과제 >
1. 요약문 ·································································································· 3 1-1. 3중과제 연구개발 내용 및 방법 ··············································· 3 1-2. 연구결과 고찰 및 결론 ······························································· 9
2. 연구개발 목표 ·················································································· 9 2-1 연구내용 ···························································································· 9 2-2 기대성과 ························································································ 10 표. 세부과제별 연구목표와 내용 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·11
3. 연구내용 및 방법 ········································································ 12
4. 최종연구 결과 ··············································································· 18
5. 연구결과 고찰 및 결론 ·································································· 19
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1. 요약문
1-1. 3중과제 연구개발 내용 및 방법 가. 연구내용
○
한국인 특이적 장내 미생물 모델 개발 필요
- 한국인의 식생활 습관은 다른 국가의 사람들 것과 차이를 보이고 있음. 예를 들어, 한국인은 짜고 매운 음식을 선호하고 젓갈과 장류와 같은 발효음식의 섭 취율이 높아서 서구의 여러 나라에 비해 위장관 질환의 발병률이 높다는 특징 이 있음. 이와 같은 식생활의 차이는 결국 소화관 내에 분포하는 장내세균총의 분포도 외국인들과는 차이를 보일 것으로 예상됨. - 한국인과 외국인의 장내 미생물 균총이 다를 것은 분명한 사실이지만 이제까 지의 장내 미생물 다양성연구와 미생물 분리는 외국에서 주로 이루어졌음. 오늘 날 장내 미생물 독성평가를 위한 한국인 특유 장내 미생물 표준모델을 제시하 지 못하고 있음. 따라서 한국인의 장내 세균에 의한 약물대사 기반연구를 위해 서는 한국인 특유의 장내 미생물 표준모델을 개발하여야 하며 이를 위해서는 혐기성 세균에 초점을 맞출 필요가 있음. - 본 연구를 통해 한국인에서 분리된 혐기성 장내 미생물로 이루어진 모델을 제 시할 수 있다면,
기존의 외국인에 적합한 대사체 분석 기술을 탈피할 수 있을
뿐만 아니라, 한국인에게 존재하는 혐기성 장내미생물을 통한 의약품 등의 대사 체 평가기술의 기초 기반 구축에 좋은 정보를 제공할 수 있을 것으로 전망함.
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○
새로운 분석기술의 개발 필요
- 인체 미생물체 (장내, 피부, 점막 등) 연구는 전통적으로 배양법에 의존하여 진행되어 왔지만 자연을 흉내 낸 가상의 환경에서 자라지 않는 미생물이 다수 존재하기 때문에 배양법만으로는 인체 미생물의 다양성을 정확하게 밝힐 수 없 음. 최근 20여 년 동안 분자 생물학적 분석기술의 발달로 인하여 인체에 서식하 는 미배양 미생물의 다양성을 비교적 정확하게 확인할 수 있는 여러 기법들이 등장하였음. 이들 분자생물학적 기법들은 대부분 PCR에 의존적인 방법으로서 인체에 존재하는 소량 미생물의 유전자도 증폭시켜 분석할 수 있는 반면 증폭 과정에서 오는 왜곡현상으로 실제 미생물 다양성이 정확하게 표현되지 못하는 단점이 있음. - PCR 비 의존적인 방법으로는 미생물의 특정 유전자 혹은 몇십-몇백 base 길 이의 뉴클레오타이드만을 혼성화 (hybridization) 시켜 미생물의 다양성을 확인 하는 DNA chip이 있음. - DNA chip은 고집적으로 배열된 유전정보를 바탕으로 한 번에 수백 수천종의 미생물을 확인 할 수 있는 가장 강력한 기술 중의 하나지만 DNA chip조차도 환경에 미량으로 존재하는 미생물의 유전정보를 확인 할 수가 없고, PCR이나 여타 다른 종류의 증폭 과정을 피하기는 힘들기 때문에 대규모로 진행되는 최근 의 인체 미생물연구를 수행하기 위해서는 좀 더 진보된 형태의 DNA chip 기술 개발이 필요함.
○
한국인의 고유의 장내 미생물 다양성 확보 필요
- 인간 몸 안에 있는 세포의 10%만이 인간의 세포이고 나머지 90%는 미생물로 이루어졌을 정도로 장내에는 많은 수의 미생물이 서식하고 있지만 장내 미생물 중 배양 가능한 미생물은 전체의 20-30% 정도 밖에 되지 않으므로 기존의 배 양법으로 장내 미생물의 조성을 파악하는 것에는 한계가 있음. 따라서 한국인 특이 장내미생물 조성을 정확하게 규명하기 위해서는 배양에 의존하지 않는 분 자생태학적인 분석방법이 필요함. - 장내 미생물 균총은 인종, 민족, 지역, 가계, 생활습관, 섭식양태 등에 따라 달
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리 존재하며 나이, 건강상태, 영양조건 등에 따라 변화가 많은 것으로 밝혀져 있음. 한국인의 식이 및 문화는 외국의 그것과 상이하게 다르기 때문에 장내 미 생물의 균총 또한 상이하게 다를 것으로 예측됨. 하지만 현재까지 한국인 장내 미생물의 조성을 전체 균종에 대해 광범위하게 조사한 연구는 없음. - 인간 체내에서 일어나는 대사는 인간과 미생물 대사의 합이라고 할 수 있으므 로 장내 미생물은 인간의 건강에 중요한 역할을 함. 개인의 장내미생물 조성은 현재와 미래의 건강상태를 파악할 수 있는 중요한 지표가 될 수 있으며, 장내미 생물에 의해 유발되는 독성을 정확하게 평가하기 위해서와 보건정책을 수립하 는데 있어서 한국인의 장내 미생물의 조성을 정확하게 파악하는 것이 필요함.
나. 연구방법 o 한국인 특이 장내미생물 분리, 동정 등을 통한 표준화 연구 - 서울대병원에 내원한 건강 검진자 및 환자를 대상으로 분변시료를 확보함 - 동시에 대장내시경을 통해 장생검 조직 시료를 확보함 - 이를 위해 서울대 병원에 임상시험심사위원회(Institutional Review Board, IRB) 허가서를 신청함 - 장내 혐기성 미생물의 분리배양법을 확립하고, 확보된 시료를 바탕으로 한국인 장내미생물을 분리 배양하여 50종의 장내미생물 자원을 확보한다. 또한 신규 미생물을 분리하여, 이들의 특성을 규명하고, 추후 응용 방향을 검토했음 o 장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단 분석 기술 연구 - DNA chip을 이용한 혼성화 기법 확립: 메타지놈-메타지놈 혼성화 반응을 이 용하여 실제적인 메타지놈 어레이의 장내 미생물 분석능 파악함. - 메타지놈 DNA 추출 및 정제기법 확립: 메타지놈 어레이를 제작하기 위해서 순도 높은 DNA를 추출하고 정제하는 기술의 개발하고 질병인 및 정상인의 100 여개 샘플을 수집하고, 이들에서 메타지놈을 추출, 정제함. - 메타지놈 DNA chip 개발: 100 여개의 샘플을 이용하여 개인의 미생물체의
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변화를 거시적으로 관찰할 수 있는 국내 최초의 미생물체 마이크로 어레이의 개발함. - 메타지놈 DNA chip의 stringency 확립: 메타지놈 어레이의 특이성과 민감성 을 확인하기 위한 기본적인 정보를 조사하고 한국인 특이적 미생물체 분석용 어레이 제작에 사용함. - Group specific linker probe 설계 및 확보: 장내에 다수 존재하거나 혹은 중 요한 역할을 하는 것으로 알려진 Bacteroides, Clostridium, Fecalibacterium group의 specific linker probe를 설계하여 대량 샘플에서 이들 미생물의 정량 적 분석을 할 수 있는 미생물 검색 기술을 개발함. - 100배 이상의 신호 증폭기술 개발: 메타지놈 microarray를 제작하여 그 검출 효용을
높이는
방법으로서
linker
probe의
각
probe를
photobiotin으로
labeling하거나, multi-linker probe와 photobiotin-TSA 방법을 개발하여 낮 은
수준의
유전자
후보물질을
검출할
수
있는
기술을
개발
하려
함.
photobiotin-TSA (tyramide straptavidin-amplification)을 이용한 100배 이상의 신호 증폭기술 개발함 - 장내 박테리오파지 메타지놈 분석: 한국인 분변 중 장내 박테리오파지 메타지 놈 확보 기술을 확립하고, 분리된 DNA 샘플을 대용량 염기서열 분석법 (pyrosequencing)을 통해 메타지놈을 분석하여, 장내박테리아와 바이러스 간 의 상관성을 밝힘 o 연령, 식이 및 비만도에 따른 한국인 장내미생물 다양성 조사 - 한국인 분변 시료로부터 메타지놈 DNA 추출: 16S rDNA pyrosequencing 분석을 수행하기 위해 순도 높은 DNA를 추출하는 기술을 개발하여 한국인의 성별, 연령, 및 식이, 비만도 등에 따른 372개 장내미생물 메타지놈 DNA 샘플 을 확보함 - 16S rDNA pyrosequencing을 통한 장내미생물 다양성 분석: 16S rDNA 중 미생물간
변이를
부위의
염기를
합성하기
위한
primer를
제작하고
pyrosequencing을 통해 장내미생물의 V1~V3 부위의 염기서열을 확보, 비교 하여 장내미생물의 다양성을 분석함.
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1-2.연구결과 1-2 연구결과 고찰 및 결론
○
3-1 세부과제: 다양한 혐기성 장내 미생물의 분리 및 배양을 통해 현재까지 적용되고 있는 배 양 기술은 다방면으로 축적하고 있음. 이는, 추후 장내 미생물의 생리학적 기 능을 규명하고, 이를 바탕으로 장관 내 생태학적 역할을 유추할 수 있는 기반 을 마련했다고 판단함. 당초 제안한 한국인에게 다량 존재하는 50종 이상의 장 내 혐기성 미생물 분리 및 배양, 동정은 이미 목표치를 초과한 상태임. 분리된 고유의 장내미생물은 추후 한국인 장내 생태를 연구하는 중요한 자원으로 사용 될 것이며, 선진국과 독립적인 생물 자원 및 데이터를 구축함으로써, 독자적인 연구가 가능할 것으로 기대됨. 현재까지 5종의 신규 장내 미생물을 분리 및 동 정, 계통분류학회지(IJSEM)를 통해 보고 및 등록하였으며, 3종 이상의 신규 미생물로 추정되는 장내 미생물의 특성을 지속적으로 규명할 계획임.
○
3-2 세부과제: 당초 제안한 메타지놈의 순수-균질화 기법을 연구 기간 내 확립하였으며 이를 토대로 메타지놈 DNA칩을 개발할 준비를 마쳤음. 51개의 한국인 장내 메타지 놈과 reference로서 2개의 토양 환경 메타지놈 그리고 E.coli의 genome을 이 용하여 100장의 메타지놈 DNA칩을 개발하였음. 개발된 메타지놈 DNA칩은 UV cross linking과 post-treatment과정을 거쳐 암소에 보관하였으며 linker probe를 이용한 한국인 장내 미생물 군집 분석에 이용되었음. 장내에 중요미 생물
검출용
linker
probe로
Bacteroides-prevotella,
Roseburia와
Faecalibacterium 그룹 검출용 linker probe를 설계 및 제작하였으며, 추후 장내 미생물 관여 질병에 따라 양적 변화를 보이는 미생물 그룹을 중심으로 linker probe 개발 계획임. DNA 칩의 신호 증폭 기술을 개발하기 위해 68개 의 미생물의 16S rRNA gene fragment를 이용한 DNA칩을 개발하였으며 biotin-TSA기법으로 기존의 cy5 probe보다 10배 이상의 신호 증폭, linker probe와의 결합으로 30배 이상의 신호 증폭 기술을 개발하였음. 3차년도에는 photobiotin이나 Quantom dot등을 이용한 기술을 추가 개발하여 100배 이상 의
신호
증폭
기술개발을
시도
및
완성하려함.
한국인
분변시료로부터
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virus-like particle만을 분리 및 농축과정을 확립하였고, 이들의 농도 단위 계 수법, 형태학적 관찰법 역시 확립하였음. 해당 enriched virus-like particles 로부터 virus genomic DNA를 추출하고, phi29 polymerase를 통해 증폭하여 다량의 DNA를 확보하였음. 또한, 대용량 sequencing 기술에 적용하여, 장내 박테리오파아지의 genomic DNA가 담고 있는 유전적 특성을 분석하였으며, 바이러스의
분류학적
정의를
바탕으로
박테리오파지인
dsDNA
Podo-,
Sipho-, Myophages와 ssDNA microphages가 장내 바이러스의 우점군으로 밝혀졌음. 하지만, 90%에 가까운 바이러스 유래 염기서열의 identity가 확인되 지 않았으며, 특히 장내 박테리아의 우점군인 Firmicutes-Bacteroidetes에서 분리된 박테리오파지에 대한 정보가 부족한 실정임. 따라서, 장내 바이러스의 분리 배양을 통한 접근과 메타지놈을 통한 분석이 꾸준히 동반되어야 할 것임. Single-stranded DNA Microviridae의 경우, Viral metagenomics를 통해 새롭게 주목받고 있는 바이러스 그룹으로, 해양이나 토양 등 광범위한 환경에 분포하는 것으로 밝혀지고 있으며, 이들의 다양성 또한 이전에 보고된 ssDNA phages에 비해 폭넓은 유전적 형태를 가지고 있는 것으로 알려져 있음. 본 연 구를 통해 장내 환경 또한 microphages가 우점하고 있는 환경으로 밝혀졌으 며, 이들의 생태학적 역할에 대한 관심이 필요함. 장내
우점균인
Bacteroides
&
Prevotella
strains의
유전체에
포함된
Prophage-like elements의 높은 유사도를 보이는 것으로 보아 Bacteroides & Prevotella가 장내 환경에 microphages의 숙주로 판단됨. 현재까지, viral metagenomics를 통해 알려진 microphages의 높은 다양성과 양적 존재에도 불구하고 그들의 숙주나 진화 형태, 유전적 특징 등이 뚜렷이 밝혀지지 않았 음. 본 연구를 통해 장관 내 microphage의 숙주를 유추할 수 있는 증거를 도 출하였으며, 이는 추후 microphage의 생태학적 특징을 이해하는데, 주요한 관 점으로 작용할 것으로 기대됨.
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2. 연구개발 목표
o 최신 혐기성 장내미생물 배양기술 확립. o 50종 이상의 한국인 특이 장내 미생물 분리 및 15종 이상의 신규 미생물 동 정. o 한국인에게 존재하는 혐기성 장내미생물에 의한 식품 의약품 등의 대사체 독성 평가기술의 기초 기반을 구축. o 한국인 미생물체 게놈을 50개 이상 획득하여 한국인 미생물체 분석용 차세대 DNA chip 개발. o 메타지놈 내 여러 미생물 그룹을 검출하기 위한 수 있는 새로운 형태의 탐침자 및 신호증폭 기술 개발. o pyrosequencing을 이용한 대규모 서열 분석 방법을 통하여 200개 이상의 한 국인 장내 메타지놈 분석 및 한국인 고유의 장내 미생물상 확립.
2-1 연구내용 o 최신 혐기성 장내미생물 배양 기술의 확립을 통하여 한국인의 분변 시료 및 조 직 시료에서 한국인에게 특이적으로 존재하는 장내 혐기성 미생물을 분리 및 배양, 동정함 o 온도, pH, 산소 내성, 배양 조건 등 특성 분석을 통해 혐기성 장내미생물에 대 한 독성 물질 평가방법 개발 및 표준작업 수순서 작성 o 메타지놈간의 비교를 위한 메타지놈 어레이 (metagenome array) 개발. o 메타지놈 chip 상에서 여러 미생물 그룹을 한 번에 검출할 수 있는 새로운 형 태의 프로브 (probe)개발 및 포토 바이오틴-TSA 등을 이용한 신규 DNA chip 신호증폭 기술 개발함. o 메타지놈 분석을 위한 pyrosequencing과 생물정보학 기술을 이용한 대규모 서열 분석 방법을 확립하고 한국인의 장내미생물 균총 조사를 통해 한국인의 성별, 연령, 및 식이, 비만도 등에 따른 장내미생물의 다양성 및 변화를 밝힘. o 장내에 존재하는 박테리아 외에 장내미생물 생태에 영향을 미치는 장내 박테리 오파지의 메타지놈을 분석함. 약물대사기반연구사업단
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2-2. 기대성과 o 한국인 고유의 장내미생물 다양성 정보를 확보함으로써 식이 및 비만도에 따른 한국인 건강 유지, 질병 예방 및 치료를 위한 지표를 확보할 수 있음. o 한국인의 장내에 고유하게 존재하는 미생물을 분리 동정함으로서 한국인의 인 체건강에 유익한 probiotics의 개발을 가능하게 할 수 있음. o 고속으로 다량의 샘플에서 미생물의 다양성을 확인할 수 있는 새로운 형태의 인체미생물체 탐색 기술을 개발함으로서 인체-미생물 상호작용 분석기술에서 외국에 비해 우위를 점할 수 있음. o 인체 (장내) 미생물의 다양성은 개인의 유전적, 면역적 소인과 연관되어 있으 며 암과 같은 질병이나 비만 시에도 미생물 분포가 변화하므로 각종 질병이나 비만을 구분 및 판단하는 마커 (marker)로 사용될 수 있음. o 200개 이상의 한국인 장내 메타게놈 시료 분석을 통하여 한국인 장내 미생물 의 특이성을 밝힘으로서, 한국인 특이의 장내 미생물이 인체 건강에 미치는 영 향을 예측할 수 있는 기반을 마련할 수 있음. o 한국인 고유 장내미생물 분석 체계 구축을 통한 학술적 연구성과 확대
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구분
3-1세부과제
목표
연구 내용
한국인 특이 장내미생물 분리, 동정 등을 통한 표 준화 연구
정상인의 분변 및 내시경 조직 수집
100배 이상의 신호 증폭 기술 개발
photobiotin 및 Q-dot을 이용하여 metagenome DNA칩 상에서 기존의 cy-fluorescence dye를 이용한 것보도 100배 이상의 신호를 증폭할 수 있는 기 술을 개발함.
메타지놈 칩을 이용한 한 국인 장내 미생물체 분석
metagenome DNA칩과 linker probe를 이용하여 한국인 장내에 존재하는 주요 미생물군 분석함.
메타지놈-메타지놈 반응 을통한 군집변이 분석
한국인의 메타지놈과 metagenome DNA 칩 기술을 이용하여 장내 미생물 군집의 개인 특이성과 안정성을 밝힘.
장내 박테리오파지 군집 분석
장내박테리오파지 분석기술을 대단위 sequencing에 적용하여, 장내박테리오파 지의 군집 분석.
3-2세부과제
장염 환자의 분변 및 내시경 조직 수집 한국인 장내미생물 분리 및 배양, 동정
3-2세부과제
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3. 연구내용 및 방법
1) 연구개발 내용
- 한국인 분변 시료 및 조직 시료에서 한국인에게 다량 존재하는 장내 혐기성 미생물 분리 및 배양, 동정과 동시에 한국인 특이 혐기성 장내 미생물을 분리 함으로써, 식품 의약품 등의 안전성 평가를 위한 한국인 장내 미생물 표준모델 제시하고자 함.
- 분리배양한 장내 혐기성 미생물을 이용하여 식품 의약품 등의 안전성 평가 를 위한
독성 평가방법의 개발을 위한 기초자료를 제공함과 동시에 표준작업
수순서 제시하고자 함.
- 메타지놈 microarray를 제작하여 그 검출 효용을 높이는 방법으로서 multi-linker probe와 photobiotin-TSA 방법을 개발함. 인체에 다수 존재하 는 혹은 중요한 역할을 하는 미생물의 유전정보들로도 프로브를 만든 후, 대량 샘플에서 이들 미생물의 정량 정성적 분석이 가능하게 함
- 장내 미생물 균총은 사람마다 다르며 질병이 있는 사람의 경우 미생물 균총 이 변화하는 것으로 보고되었음. 이에 메타지놈-메타지놈 혼성화를 이용하여 정상인의 장내 미생물 균총 변화를 조사하고, 질병 및 비질병 샘플간의 차이점 을 분석할 수 있는 메타지놈 microarray 혼성화 기법을 확립함.
- 대단위 염기서열 분석방법인 Pyrosequencing 기술을 이용하여 한국인의 성 별, 연령, 및 식이, 비만도 등에 따른 분변 시료 11월 초 현재 340개 시료의 장내미생물의 다양성 및 변화를 모니터링함.
- 분변으로부터 장내 박테리오파지를 분리하기 위한 최적의 방법을 개발하고, 장내 박테리오파지의 gDNA를 추출하여 pyrosequencing을 통해 박테리오파지 약물대사기반연구사업단
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의 메타지놈을 분석함.
2) 연구방법
○ 한국인 특이 장내미생물 분리, 동정 등을 통한 표준화 연구
(1) 분변 시료 및 조직 시료 확보 - 서울대병원에 내원한 건강 검진자 및 환자를 대상으로 분변시료를 확보함. - 동시에 대장내시경을 통해 장생검 조직 시료를 확보함 - 이를 위해 서울대 병원에 임상시험심사위원회(Institutional Review Board, IRB) 허가서를 신청할 예정임
(2) 혐기성 균 배양을 위한 시료 처리 A. 분변 시료 ① 분변 시료는 -70℃에 저장함 ② 분변 시료 1 gram을 10 ml의 anaerobic peptone water로 희석 ③ 희석 샘플을 50 μl를 배양 배지에 접종
B. 장생검 조직 시료 ① 장조직 검체는 4 ml의 anaerobic transport medium (Wilkins-Chalgren broth)가 포함된 멸균된 Bijoux bottle에 넣어 실험실로 운반 ② 조직검체를 멸균된 glass tissue homogenizer로 분쇄 ③ 1 ml의 분쇄물(homogenate)을 anaerobic peptone water로 10배 비율로 희석 ④ 희석 샘플을 50 μl를 배양 배지에 접종
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(3) 혐기성균 배양 ① Ruminococcus 속, Bacteroides 속, Enterococcus 속 선택배지 (BHI) ② Cellulolytic bacteria 선택배지 (BC medium) ③ Lactobacillus 속, Roseburia 속 선택배지 (YCFA medium) ④ Bacteroides 속 선택배지 (Supplemented Brain Heart Infusion Medium, BHIS) ⑤ Bifidobacterium 선택배지 (Bifidobacterium Selective Medium, BSM) ⑥ YCFAGSC medium: pH 변화에 따른 장내 미생물 배양 조건 확립 ⑦ Minimal Medium + addition: 장내 미생물 생장에 필요한 물질이 포함된 배지에 다양한 첨가물을 통해 특정 미생물만을 screening할 수 있을 것으로 판단 ⑧ GAM (Gifu anaerobic medium): 일본학자들에 꾸준히 사용되는 배지로, 특이 균주의 발견 배지로 인식됨. ⑨ 37℃ anaerobic chamber에서 2-3일 이상 배양 ⑩ 위에 기술한 배지를 기본으로 하고, supplement를 비롯한 배양 조건을 변 화시킨 뒤, 성장여부 등과 같은 특성 분석
(4) 분리된 혐기성균 동정 ① API 20A, rapid ID32A 및 API ZYM을 이용 ② 신종균으로 추정되는 분리균 ⓐ 기존에 보고된 혐기성균 16S RNA에 있는 house keeping gene에 대한 molecular assay를 시행하여, DNA sequence 확인 ⓑ Genomic DNA-DNA hybridization 기법을 이용한 신규 균주의 확인
(5) 독성물질 평가방법 개발: 체내에 들어온 식품 또는 의약품이 장내 혐기성 미생물에 의해 분해되어 독성화할 수 있는지의 여부를 평가할 수 있는 기술은 총괄사업단 내의 각 세부과제와 연계하여 아래와 같이 진행함.
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① 검사 대상 식품 또는 의약품 선정 ② 장내에서 분리한 혐기성균 배양 특성 D/B 구축: 장내미생물의 증식, 대사산 물 생산 등의 특성에 대한 주요 배양조건의 영향을 파악하고 상세 배양 data base 확보 ③ 장내 미생물에 의한 대사반응을 통하여 생성된 독성 대사물의 분석 ⓐ 미생물 배양 시료 전처리 조건 확립: 시료에서 대사체를 추출할 수 있는 전 처리 조건 확립 ⓑ GC/MS을 이용한 분석조건 확립: 시료 추출물에 대한 최적의 분석 조건 확 립 ⓒ 개발된 최적의 분석 조건하에서 시료 대사체의 분석: 최적의 분석 조건하에 서 대사체를 분석하여 DB 구축 ⓓ 대사체 DB의 chemometric analysis: GC-MS 대사체 DB의 다양한 chemometric analysis 수행 ④ 장내 혐기성균의 독성대사 경로 및 대사체 분석 기술 개발: 대사체 DB의 PCA 및 PLS-DA등의 chemometric analysis를 수행하여 장내미생물의 독성 대사 경로 및 대사체 분석 기술 개발
○ 장내미생물 신속검출 및 정량을 위한 첨단 분석 기술 연구
Group specific linker probe 설계 및 확보 -
장내에
다수
존재하거나
혹은
중요한
역할을
하는
것으로
알려진
Bacteroides, Clostridium, Fecalibacterium group의 specific linker probe 를 설계하여 대량 샘플에서 이들 미생물의 정량적 분석을 할 수 있는 미생물 검색 기술을 개발. 100배 이상의 신호 증폭기술 개발 - 메타지놈 microarray를 제작하여 그 검출 효용을 높이는 방법으로서 linker probe의 각 probe를 photobiotin으로 labeling하거나, multi-linker probe와 photobiotin-TSA 방법을 개발하여 낮은 수준의 유전자 후보물질을 검출할 수 약물대사기반연구사업단
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있는
기술을
개발
하려
함.
photobiotin-TSA
(tyramide
straptavidin-amplification)을 이용한 100배 이상의 신호 증폭기술 개발.
메타지놈 DNA 추출 및 정제기법 확립 - 메타지놈 어레이를 제작하기 위해서 순도 높은 DNA를 추출하고 정제하는 기술의 개발하고 질병인 및 정상인의 100 여개 샘플을 수집하고, 이들에서 메 타지놈을 추출, 정제함.
메타지놈 DNA chip 개발 - 100 여개의 샘플을 이용하여 개인의 미생물체의 변화를 거시적으로 관찰 할 수 있는 국내 최초의미생물체 마이크로 어레이의 개발.
메타지놈 DNA chip의 stringency 확립 - 메타지놈 어레이의 특이성과 민감성을 확인하기 위한 기본적인 정보를 조 사하고 한국인 특이적 미생물체 분석용 어레이 제작에 사용
DNA chip을 이용한 혼성화 기법 확립 - 메타지놈-메타지놈 혼성화 반응 이용하여 실제적인 메타지놈 어레이의 장 내 미생물 분석능 파악
○ 연령, 식이 및 비만도에 따른 한국인 장내미생물 다양성 조사
한국인 분변 시료로부터 메타지놈 DNA 추출 - 16S rDNA pyrosequencing과 Real-Time QPCR 분석을 수행하기 위해 순도 높은 DNA를 추출하는 기술을 개발하여 한국인의 성별, 연령, 및 식이, 비만도 등에 따른 약 369개의 장내미생물 메타지놈 DNA 샘플을 확보함.
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16S rDNA pyrosequencing을 통한 장내미생물 다양성 분석 - 16S rDNA 중 미생물간 변이가 심하게 나타나는 부위인 V1~V3부위의 염 기를 합성하기 위한 바코드 primer를 제작하고 pyrosequencing을 통해 장내 미생물의 V1~V3부위의 염기서열을 확보, 비교하여 장내미생물의 다양성을 분 석함.
장내 박테리오파지 메타지놈 분석 - 한국인 분변 중 장내 박테리오파지 메타지놈 DNA 샘플을 확보하여 pyrosequencing을 통해 메타지놈을 분석함.
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4. 최종연구 결과
구분
목표
연구개발 수행내용 o 총 71종의 장내 미생물 분리 및 배양
정상인 및 장염 환자로부터
o 총 22종의 신규 추정 장내 미생물 분
3-1세부과 분변과 내시경 조직 수집하 제
리하였으며, 5종의 신규미생물이 발표
여 장내 미생물 분리, 배양
되었으며, 3종에 대한 동정을 진행 중
및 동정
임. o 51종의 한국인 장내 미생물 메타지놈을 획득하였으며 순수-균질화 기법을 확립
o 50종 이상 메타지놈 확
하였음.
보 및 순수-균질화 기
o 51종의 한국인 장내 미생물 메타지놈과
법 확립
2개의
o 50종 이상 메타지놈 탑
환경샘플,
reference 지놈을
재 DNA칩 100장 제작
1개의
E.coli
이용하여 100장의
DNA칩을 제작하였음. o 10종의 미생물 그룹 링 o
Bacteroidetes-prevotella linker
커 프로브 제작
probe를
제작하여
group용 메타지놈
DNA칩을 이용 linker probe의 효용성 을 확인하였으며, Clostridium cluster IV의 Faecalibacterium group을 target 으로
3-2세부과 제
o 메타지놈-메타지놈 반응 을 이용 미생물 군집변
하는
linker
probe와
Eubacterium faecies group을 target 으로 하는 linker probe를 설계하였음. o 메타지놈 DNA칩을 이용하여 8명의 한
이 추적
국인 장내 미생물 군집이 숙주에 따라 고유하게 존재하고 시간이 지나도 안정 o DNA칩 신호증폭 기술
적으로 유지됨을 밝혔음. o 포토 바이오틴-TSA기법을 이용하여
개발
기존의 DNA칩 시그날보다 30배 이상 o
장내박테리오파지 기술 개발
분석
신호를 증폭시킬 수 있는 신규 DNA chip 신호증폭 기술을 개발하였음. o 분변시료로부터 enriched virus-like particle을 분리하고, genomic DNA를 추출할 수 있는 기술 개발하였음.
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5. 연구결과 고찰 및 결론
다양한 혐기성 장내 미생물의 분리 및 배양을 통해 현재까지 적용되고 있는 배양 기술은 다방면으로 축적하고 있음. 이는, 추후 장내 미생물의 생리학적 기능을 규명하고, 이를 바탕으로 장관 내 생태학적 역할을 유추할 수 있는 기반을 마련했다고 판단함.
본 연구에서 당초 제안한 한국인에게 다량 존재하는 50종 이상의 장내 혐 기성 미생물 분리 및 배양, 동정은 이미 목표치를 초과한 상태임. 분리된 고 유의 장내미생물은 추후 한국인 장내 생태를 연구하는 중요한 자원으로 사 용될 것이며, 선진국과 독립적인 생물 자원 및 데이터를 구축함으로써, 독자 적인 연구가 가능할 것으로 기대됨. 현재까지 5종의 신규 장내 미생물을 분 리 및 동정, 계통분류학회지(IJSEM)를 통해 보고 및 등록하였으며, 3종 이 상의 신규 미생물로 추정되는 장내 미생물의 특성을 지속적으로 규명할 계 획임.
Heterogenous한 미생물 집합체인 장내 미생물의 특성으로 계통분류학적 정의가 쉽지 않음. 최근, 보고한 Ruminococcus sp. nov.의 경우, 해당 균 주가 속해 있는 Clostridial cluster XIVa 그룹 내 다양한 genera가 포함되 어 있고, species novel임에도 불구하고, 같은 그룹 내 속한 다른 genus와 의 비교를 동반해야 한다는 이유로 reject되었음. 이는 추후 신규 미생물로 추정되는 균주 중 계통분류학적 위치 및 특징이 비교적 뚜렷한 균주만 동정 이 가능할 것으로 판단됨. 이는, 당초 예상했던 인력과 비용을 웃도는 노력 과 시간이 필요할 것으로 판단됨.
본 연구에서 당초 제안한 메타지놈의 순수-균질화 기법을 연구 기간 내 확 립하였으며 이를 토대로 메타지놈 DNA칩을 개발할 준비를 마쳤음. 51개의 한국인 장내 메타지놈과 reference로서 2개의 토양 환경 메타지놈 그리고 E.coli의 genome을 이용하여 100장의 메타지놈 DNA칩을 개발하였음. 개
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발된 메타지놈 DNA칩은 UV cross linking과 post-treatment과정을 거쳐 암소에 보관하였으며 linker probe를 이용한 한국인 장내 미생물 군집 분석 에 이용되었음.
장내에
중요미생물
검출용
linker
probe로
Bacteroides-prevotella,
Roseburia와 Faecalibacterium 그룹 검출용 linker probe를 설계 및 제작 하였으며, 추후 장내 미생물 관여 질병에 따라 양적 변화를 보이는 미생물 그룹을 중심으로 linker probe 개발 계획임.
DNA 칩의 신호 증폭 기술을 개발하기 위해 68개의 미생물의 16S rRNA gene fragment를 이용한 DNA칩을 개발하였으며 biotin-TSA기법으로 기 존의 cy5 probe보다 10배 이상의 신호 증폭, linker probe와의 결합으로 30배 이상의 신호 증폭 기술을 개발하였음. 3차년도에는 photobiotin이나 Quantom dot등을 이용한 기술을 추가 개발하여 100배 이상의 신호 증폭 기술개발을 시도 및 완성하려함.
한국인 분변시료로부터 virus-like particle만을 분리 및 농축과정을 확립 하였고, 이들의 농도 단위 계수법, 형태학적 관찰법 역시 확립하였음. 해당 enriched virus-like particles로부터 virus genomic DNA를 추출하고, phi29 polymerase를 통해 증폭하여 다량의 DNA를 확보하였음. 또한, 대 용량 sequencing 기술에 적용하여, 장내박테리오파아지의 genomic DNA가 담고 있는 유전적 특성을 분석하였으며, 바이러스의 분류학적 정의를 바탕 으로 박테리오파지인 dsDNA Podo-, Sipho-, Myophages와 ssDNA microphages가 장내 바이러스의 우점군으로 밝혀졌음. 하지만, 90%에 가 까운 바이러스 유래 염기서열의 identity가 확인되지 않았으며, 특히 장내 박테리아의 우점군인 Firmicutes-Bacteroidetes에서 분리된 박테리오파지 에 대한 정보가 부족한 실정임. 따라서, 장내 바이러스의 분리 배양을 통한 접근과 메타지놈을 통한 분석이 꾸준히 동반되어야 할 것임.
Single-stranded DNA Microviridae의 경우, Viral metagenomics를 통해 약물대사기반연구사업단
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새롭게 주목받고 있는 바이러스 그룹으로, 해양이나 토양 등 광범위한 환경 에 분포하는 것으로 밝혀지고 있으며, 이들의 다양성 또한 이전에 보고된 ssDNA phages에 비해 폭넓은 유전적 형태를 가지고 있는 것으로 알려져 있음. 본 연구를 통해 장내 환경 또한 microphages가 우점하고 있는 환경 으로 밝혀졌으며, 이들의 생태학적 역할에 대한 관심이 필요함.
장내 우점균인 Bacteroides & Prevotella strains의 유전체에 포함된 Prophage-like
elements의
높은
유사도를
보이는
것으로
보아
Bacteroides & Prevotella가 장내 환경에 microphages의 숙주로 판단됨. 현재까지, viral metagenomics를 통해 알려진 microphages의 높은 다양성 과 양적 존재에도 불구하고 그들의 숙주나 진화 형태, 유전적 특징 등이 뚜 렷이 밝혀지지 않았음. 본 연구를 통해 장관 내 microphage의 숙주를 유추 할 수 있는 증거를 도출하였으며, 이는 추후 microphage의 생태학적 특징 을 이해하는데, 주요한 관점으로 작용할 것으로 기대됨.
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