Diagnóstico de la resistencia a drogas antituberculosas
Servicio Micobacterias Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS “Dr Carlos G. Malbran” Argentina Laboratorio Supranacional OPS/OMS/La Union
Recomendaciones de OMS relacionadas con el diagn贸stico de tuberculosis resistente a las drogas 2007
Medio l铆quido para cultivo y PS
Con un incremento sustancial del costo y dependencia de la industria aumentan la sensibilidad del cultivo y reducen a la mitad el tiempo de detección Permiten disponer del resultado de la prueba de sensibilidad 2-14 días después de obtener un cultivo positivo
Identificaciòn de Mycobacterium. tuberculosis
molecular
inmunocromatográfico
Recientes recomendaciones de OMS relacionadas con el diagn贸stico de tuberculosis 2007
Medio l铆quido para cultivo y PS
2008
LPAs (Line probe assays) para investigar pacientes con riesgo de TBMR
Equipos comerciales para identificación de M. tuberculosis y detección de resistencia a R (+ H) por métodos moleculares LPAs (line probe assays) Amplifican e identifican segmentos ADN específicos de M. tuberculosis del gen investigado sin mutar y las mutaciones del bacilo asociadas a resistencia a rifampicina/ isoniacida más frecuentes En un par de horas
RESISTENTE SENSIBLE RESISTENTE
SENSIBLE ????
Recientes recomendaciones de OMS relacionadas con el diagnóstico de tuberculosis 2007
Medio líquido para cultivo y PS
2008
LiPAs (Line probe assays) para investigar pacientes con riesgo de TBMR
2009
Métodos no comerciales (MODS, Nitrato reductasa, colorimétricos) para investigar pacientes con riesgo de TB MR
Detección rápida de resistencia a rifampicina e isoniacida por métodos no comerciales Nitrato reductasa Son competitivos con el MGIT en tiempo para producir resultados y hasta más rápidos si son realizados directamente a partir de muestras clínicas baciloscopia + Pero con con un costo 10 a 100 veces menor y empleo de reactivos genéricos
Examen microscopico (MODS)
Azul alamar MTT Resarzurina(REMA)
Recientes recomendaciones de OMS relacionadas con el diagnóstico de tuberculosis 2007
Medio líquido para cultivo y PS
2008
LiPAs (Line probe assays) para investigar pacientes con riesgo de TBMR
2009
Métodos no comerciales (MODS, Nitrato reductasa, colorimétricos) para investigar pacientes con riesgo de TB MR
2010
PCR en tiempo real y en sistema cerrado (Xpert MTB/RIF) como primera prueba de diagnostico de TB pulmonar en pacientes con alto riesgo de TB MR y TB- HIV
Amplificación de ácidos nucleicos Hasta hace muy poco los métodos moleculares disponibles para el diagnostico de TB y de resistencia a las drogas eran los mas rápidos (horas) suficientemente sensibles en muestras BK+ (al menos 96%) y menos sensibles para muestras BK- (50-70%) pero requerian personal muy experimentado y estrictas condiciones experimentales (podian generar contaminación con amplicones por ser sistemas abiertos)
3 áreas distintas , flujo unidireccional de trabajo y mucho material descartable
PCR en tiempo real integrado en un casette cerrado Xpert MTB/RIF (Cepheid Sunnyvale, CA) Único proceso manual Muestra decontaminada Con solución NaOH- y isopropanol 15 minutos
Disminuye en 6-8 logs la viabilidad
Cรกmaras con soluciones y reactivos liofilizados
siringe
Vรกlvula rotatoria y reactivos para purificaciรณn de ADN o ARN
Tubo de PCR
Investigan el gen rpoB para detectar el bacilo y las mutaciones mรกs frecuentes que lo hacen resistente a rifampicina Raja et al.: Clinical Testing. Clinical Chemistry 51, 5, 2005
ร mbolo ( jeringa)
2 horas
la hibridación emite señal fluorescente captada y evidenciada automáticamente y en tiempo real mediante un sensor y un software que dibuja en una curva la señal cuantificada mostrando el progreso de la reacción
Emplea iguales principios que sistemas comerciales anteriores, pero en un contenedor cerrado y con proceso automatizado
Evaluación del sistema Xpert /MTB Rif para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar en adultos Sensibilidad
BK+ BK-C+
Especificidad
n
%
(IC 95%)
1706/1746
97,7
(99,0-98,4)
634/848
75,0
(71,9-77,7)
4443/4386
98,8
(98,5-99,1)
6980 Helb D et al J Clin Microbiol. 2010 ; 48:229-37
Vietnan Uganda
Boehme CC et al N Engl J Med. 2010 9; 363:1005-15
Peu Azerbajan Sudafrica India
Marlowe EM et al . J Clin Microbiol. 2011 ; 49:1621-3
EEUU
Moure R et al. J Clin Microbiol 2011, 49:1137-9
España
Malbruny B et al. Int J Tuberc Lung Dis 2011, 15: 553-5
Francia
Bowles EC et al Int J Tuberc Lung Dis 2011, 15: 988-9 Friedrich SO et al J Clin Microbiol 2011, 49:2827-31
Holanda
Ionnidis P et al J Clin Microbiol 2011, 49: 3068-70 Scott LE et al PLoS Med, 2011, 8: e1001061
Grecia
Sudafrica
15 publicaciones, 15 paises 1 muestra / paciente
Sudafrica
Lawn SDE et al PLoS Med, 2011, 8: e1001067 Sudafrica Theron G et al Am J Respir Crit Care Med , 2011, 18:132–140 Sudafrica Zeka A et al. J Clin Microbiol, 2011, 49: 4138-41 Turquìa Sudafrica , Peru, India, Azerbaijan, Filipinas , Uganda Boheme CC et al, Lancet 2011, 377: 1495-1505 Rachow A et al Plos One 2011, e 20458 Armand S et al J Clin Microbiol, 2012 49: 1772-76
Tanzania Francia
Otras aplicaciones
Xpert SA Nasal Staphilococcus aureus meticilino resistente Xpert EV Enterovirus (meningitis) Xpert vanA Enterococcus vancomicina resistente Clostridium difficile Flu A, Flu B, and 2009 H1N1 Marcadores oncol贸gicos
Xpert C. difficile Detection of Clostridium difficile
Costo Precios negociados por FIND/OMS
para el sector publico de 116 países con alta carga de TB y de bajo /mediano ingreso Sector publico Estado o instiuciones financiadas por el estado (MSAL, hospitales, FFAA, Servicio Penitenciario) ONGs reconocidas por por el MSAL o UN , organizaciones sin fines de lucro con principios humanitarios Mecanismos de financiamiento internacional e instituciones de asistencia (GDF, UNITAID, PEPFAR, AID, FM, C, la Unión)
Costo Xpert/MTB Rif más elevado que el del diagnóstico convencional Precios de referencia de OMS (FOB) US$ 17 el cartucho US$ 17.500 el equipamiento (4 módulos) US$ 1.400 la calibración anual
Argentina
+impuestos (estimado)
fuera de convenio
US $30-40
US$ 100
US $35.000
US$ 62.000
+ impuestos y tasas y gastos de transporte que podrían incrementar el costo 2 a 4 veces
M茅todos de detecci贸n de resistencia a drogas antituberculosas Revision de la evidencia publicada (OMS, Ginebra abril 2012)
Rifampicina Precision para detectar resistencia
sensibilidad
Isoniacida
Media IC 95%
Sensibilidad
Especificidad
Estreptomicina
Sensibilidad
Sensibilidad
Especificidad
Etambutol
Especificidad
Sensibilidad
Especificidad
Varios métodos validados para detectar rápidamente resistencia a R e I son precisos y reproducibles La resistencia a R es buen marcador de multirresistencia (MR) y buen predictor de fracaso de tratamiento con el esquema de primera línea Las pruebas rápidas para R (+ I) son útiles para identificar los casos que requieren esquemas de segunda linea y mejorar los resultados terapeúticos, salvar vidas de coinfectados con HIV evitar que se disemine la TB MR
En general, los mĂŠtodos rĂĄpidos tienen sensibilidad limitada para detectar resistencia directamente a partir de muestras con baciloscopia negativa
La pruebas de sensibilidad a S y E son menos reproducibles con cualquier método que se considere La resistencia a estas drogas no está significativamente asociada a fracaso con esquemas de primera línea No es recomendable introducir métodos alternativos al de referencia por el momento
La baciloscopia permite diagnosticar y monitorear el tratamiento rápida y económicamente
El cultivo sigue siendo necesario para confirmar el diagnóstico de 25- 30% adicional de casos BK detectar resistencia a R originada por mutaciones no investigadas por los sistemas moleculares comerciales y validar resultados dudosos investigar sensibilidad a otras drogas de primera y segunda línea
Inyectables
Via LE et al J Clin Microbiol 48:402-11
Conocimientos preliminares Asociación a resistencia a Mutacion
Estreptomicina
rrs 1401
±
rrs 530
±
rrs 1484
Amicacina Kanamicina + +
Capreomicina
+
+
±
±
+
+
rrs 1401 + rrs530
+
+
+
rpsl
+
-
-
rrs + rpsl
+
+
+
gidB
±
±
-
rrs + gidB
±
+
+
tly A + rrs
+
Fluorquinolonas Conocimientos preliminares
Mutacion gyr A 90 ` 91 ` 94
Asociaci贸n a resistencia a Ofloxacina Moxifloxacina + + +
+ +
Se estĂĄn desarrollando equipos y sistemas para la detecciĂłn de resistencia a inyectables y fluorquinolonas . Por ahora tienen baja sensibilidad para detectar resistencia a cada droga
Las mutaciones rrs A1401G y gyr A D94G y A90B podrĂan identificar alto porcentaje de casos XDR Evans J et al. J Antimicrob Chemother , 65: 897-900. 2010
Inyectables y Fluorquinolonas Falta conocimiento básico sobre mutaciones y patrones de resistencia cruzada
Ensayar todos los inyectables disponibles (kanamicina, amicacina, capreomicina) la quinolona adoptada en los esquemas del PNT para el tratamiento de la TB MR (levofloxacino ofloxacino) y moxifloxacino para los casos con TB resistente a esa quinolona
Por el momento OMS no recomienda ninguna prueba rĂĄpida para evaluar drogas de segunda lĂnea
Caso con indicaciĂłn de prueba de sensibilidad (con riesgo) Prueba rĂĄpida de resistencia a R e I
Resistente a R y/o I
PS de referencia SIRECAK una FQN en el Laboratorio de referencia
no se detecta resistencia (*)
Monitoreo con baciloscopia y cultivo
(*)si se trata de un caso HIV positivo o falla de tratamiento repetir la prueba por metodo de las proporciones o MGIT960 para descartar posibles errores y/o falta de sensibilidad (mĂŠtodos moleculares)