Dr. Martin Schleef, PlasmidFactory

Abb.: PlasmidFactory/Bielefeld – Advertorial Was ist das Besondere am Zwei-Plasmid-System für die Transfektion von Prokuktionszelllinien für das Wachstumsfeld Adeno-assoziierte virale Vektoren?

Adeno-assoziierte Vektoren (AAV) gewinnen derzeit rasant an Bedeutung als Genfähren in verschiedenen therapeutischen Anwendungen, die aktuell in diversen klinischen Studien erprobt werden. Mit dem Zwei-Plasmid-System müssen die Protokolle für die Transfektion der Produktionszelllinie mit nur zwei statt drei Plasmiden optimiert werden. Auch die Produktionskosten für hochskalierte Produktion viraler Vektoren sinken, wenn man als Ausgangsmaterial ein Plasmid weniger benötigt. Dr. Martin Schleef Geschäftsführer PlasmidFactory GmbH & Co. KG Wie sichert Plasmid Factory die Qualität und Integrität der produzierten AAV-Vektoren?

Warum und mit welcher Technologie erzielen Sie signifikant höhere Ausbeuten an AAV-Vektoren?

Neben der Verwendung des Zwei-Plasmid-Systems können auch die Plasmide selbst signifikant verbessert werden: Minicircles sind kleinere und vereinfachte Derivate aus Plasmiden, letztlich nur noch das zirkuläre Gen, das man für die eigentliche Anwendung benötigt. Sie zeichnen sich durch eine geringere Größe und eine im Vergleich zu herkömmlichen Plasmiden höhere Transfektionseffizienz aus und tragen nahezu keine problematischen prokaryotischen Gensequenzen mehr in sich. Das verringert das Risiko einer Immunantwort oder einfach eine Stummschaltung der Transgene nach einer erfolgreichen Transfektion. Im Rahmen mehrerer Forschungskooperationen zur AAV-Herstellung haben unsere Partner erfolgreich Plasmide durch Minicircles für das Transfergen sowie auch für das Helper-und-Packaging-Plasmid ersetzt. Dabei zeigte sich eine deutlich erhöhte Ausbeute an intakten, also mit der korrekten Gensequenz versehenen Viruspartikeln. Insbesondere das sogenannte Retro-Packaging, das heißt das Verpacken falscher Gensequenzen aus den zur Herstellung verwendeten Plasmiden, tritt bei der Minicircle-basierten Herstellung nicht mehr auf, da die Minicircles diese zusätzlichen Sequenzmotive schlicht nicht mehr enthalten.

Im Transferplasmid ist das eukaryotische Gene of Interest von ITR-Sequenzen flankiert. Die Integrität dieser Repeatsequenzen ist von großer Bedeutung für die korrekte Replikation und Verpackung der AAV-Vektoren in der Produktionszelllinie. Neben „traditionellen“ Methoden wie Verdau mittels Restriktionsenzymen (und anschließender Analyse des Bandenmusters) und Sanger-Sequenzierung, bietet PlasmidFactory nun auch das Next-Generation-Sequencing als Plasmid-QC an. Dabei ist es erstmals möglich, den Anteil an korrekten ITR-sequenzhaltigen Plasmiden in einer Charge zu quantifizieren. Dies ermöglicht die Standardisierung und vor allem Optimierung der AAVVektorproduktion. ›