Hoe komt het allergeen lupine in roggebrood?

VASTSTELLEN VAN KRUISBESMETTING OF BRONBESMETTING BELANGRIJK

Een jonge vrouw kreeg in november 2020 een anafylactische reactie na het eten van een roggebroodje. De vrouw wist dat ze een lupine-allergie had, maar het etiket van het broodje vermeldde geen lupine. De NVWA stond voor een raadsel en vroeg Wageningen Food Safety Research (WFSR) de zaak te onderzoeken. Een puntbesmetting lijkt een mogelijke oorzaak.

Tekst Peter Verheijen, Nathalie Smits, Ioana Barbu, Marleen Voorhuijzen, Elise Hoek, Andries Koops (WFSR, WUR)

Ingewikkeld is dat er geen overeenstemming is over de grenswaarde

In een poging om een verklaring te vinden voor de overgevoeligheidsreactie van de jonge vrouw, verzocht NVWA aan WFSR na te gaan of in een ander sneetje van hetzelfde roggebroodje lupine kon worden aangetroffen. Dat was op dat moment de meest waarschijnlijke oorzaak voor de overgevoeligheidsreactie.

Verschillende analyses

WFSR heeft daarvoor drie verschillende analysemethoden gehanteerd: een immunoassay, LC-MS/ MS en een DNA-assay (zie kader voor uitleg van de drie methoden). Deze drie verschillende methoden leverden alle verschillende resultaten. Zo vonden de onderzoekers met de eerste methode – de immunoassay – geen aanwijzingen voor het feit dat er lupine in het roggebroodje zat. De ondergrens van de meting (ofwel LOD, limit of detection) voor lupine-eiwit met deze methode is 0,7 μg/gram. Dus als er lupine in de niet geconsumeerde resten van het roggebrood heeft gezeten, dan is het heel weinig geweest. Met de LC-MS/MS vonden de onderzoekers een spoortje van meerdere specifieke lupine-peptiden. Ook de real-time PCR-resultaten lieten een spoortje lupine-DNA zien. Het sequencen van dit DNA leverde weer nieuwe informatie op: we konden vaststellen dat de lupineverontreiniging afkomstig was van Lupinus angustifolius. Welke vragen roept dit op? De onderzoekers constateerden dat er een spoortje van lupine in het roggebrood aanwezig was. En dat er in het sample minder dan 0,7 μg lupine eiwit/gram roggebrood was. Is het mogelijk dat deze geringe hoeveelheid lupine de oorzaak was van de heftige reactie? Of was de lupine niet homogeen verspreid over het roggebrood? Of een afgeleide vraag: hoe verhoudt deze hoeveelheid lupine in het broodje zich tot de referentiedosis voor lupine waarop producenten hun eigen analyses baseren? En tenslotte: kunnen we iets zeggen over de mogelijke manier waarop lupine in het roggebrood terechtgekomen is?

Referentiedosis

De referentiedosis voor lupine geeft aan hoeveel mg lupine-eiwit in een product aanwezig zou mogen zijn zonder dat dit een allergische reactie zal veroorzaken bij consumenten. De referentiedosis is afgeleid van verzamelde klinische data over welke hoeveelheid lupine bij mensen een allergische reactie veroorzaakt. Wat het ingewikkeld maakt, is dat er geen overeenstemming is over wat de grenswaarde moet zijn om de allergische consument afdoende te beschermen. Het door het bedrijfsleven veelgebruikte VITAL 3.0, ontwikkeld door een panel van experts (waaronder TNO) en gepubliceerd bij het Allergen Bureau, hanteert een referentiedosis van 2,6 mg lupine eiwit per consumptiemoment. Het Belgische Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen (FAVV) zit hoger met 4,5 mg en NVWA fors lager met 0,83 mg als veilige dosis voor lupine-allergische consumenten.

LUPINE

Een bloeiend gewas blauwe lupine, die niet altijd blauw maar ook vaak wit bloeit. De blauwe lupine wordt ook wel de smalbladige lupine genoemd.

Immunoassay

Met de immunoassay – de Enzym Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) – wordt de aanwezigheid van lupine-eiwitten aangetoond. Er worden antilichamen gebruikt die lupine specifiek herkennen. Als het antilichaam aanwezige lupine herkent en bindt, kan dit vervolgens zichtbaar worden gemaakt met een kleurreactie, de kleurintensiteit is een maat van de hoeveelheid lupine.

LC-MS/MS

Met LC-MS/MS kan worden bepaald welke specifieke eiwitten in een monster aanwezig zijn. De eiwitfractie van het product wordt verknipt tot peptiden die vervolgens met vloeistofchromatografie (LC) in zoveel mogelijk fracties worden gescheiden. Een selectie van deze gefractioneerde peptiden wordt in de massaspectrometer (MS) tot nog kleinere brokstokken gefragmenteerd waarvan de exacte massa en identiteit wordt bepaald.

DNA-assay

De derde methode karakteriseert het DNA. Dat kan ook weer op verschillende manieren, bijvoorbeeld met behulp van real-time PCR of door middel van DNA-sequencing. Tijdens real-time PCR wordt een kort, specifiek DNA-fragment dusdanig vermenigvuldigd dat het real-time gemeten kan worden. Met behulp van DNA-sequencing kan exact worden vastgesteld welke soort lupine aanwezig was.

lupinegehalte in snee roggebrood (mg) referentiedosis lupine NVWA (mg) referentiedosis lupine FAVV (mg) referentiedosis lupine VITAL 3.0 (mg)

ELISA <0,04 0,83 4,5 2,6

DNA spoortje Een sneetje roggebrood weegt ongeveer 60 gram en op basis van de WFSR-analyse zou er minder dan (60 x 0,7μg) 0,04 mg lupine eiwit in het sneetje brood hebben gezeten. Dit is maar een fractie van de VITAL 3.0-referentiedosis en een-twintigste van de referentiedosis van de NVWA. Het is dus onwaarschijnlijk dat deze hoeveelheid lupine de heftige allergische reactie bij deze vrouw heeft veroorzaakt.

Andere verklaringen

“We kunnen niet uitsluiten dat de consument in deze situatie extreem gevoelig bleek, maar zijn er ook andere, wellicht meer waarschijnlijke verklaringen?”, vragen de onderzoekers zich af. DNA-sequencing leverde op dat het DNA afkomstig was van Lupinus angustifolius, de blauwe lupine. De blauwe lupine is de meest voorkomende lupinesoort gebruikt in bakkerijen en wordt voornamelijk geteeld in Duitsland en Polen. Ook de bakrogge die we in Nederlandse bakkerijen gebruiken (dat was hier het geval), komt voornamelijk uit Duitsland.

Contaminatie door de oogst

Belangrijk voor de interpretatie van deze casus is de wetenschap dat lupine en rogge op dezelfde grond worden geteeld: zandgrond met een lage pH. Het komt ook veel voor dat beide gewassen door hetzelfde bedrijf worden geteeld; dat kan op opeenvolgende jaren, in hetzelfde jaar op verschillende akkers, of zelfs in mengteelt. De teeltpraktijk levert daarmee een aantal mogelijke verklaringen voor de aanwezig-

Zaad van lupine.

heid van lupine in roggebrood als puntbesmetting en daarmee ook van de heftige reactie. • Lupine en rogge worden met dezelfde combine of maaidorser geoogst. Een niet goed schoongemaakte combine kan de roggeoogst dus met lupine verontreinigen. Omdat rogge eerder rijp is dan lupine wordt meestal eerst de rogge en dan de lupine geoogst. Dus lupinezaad dat via de combine in de roggeoogst terecht komt, is waarschijnlijk afkomstig van de lupineoogst van het jaar daarvoor. De boer of loonwerker heeft dan nagelaten om na het oogstseizoen zijn machines goed te reinigen. • Lupinezaad heeft in de bodem overwinterd en is als opslag mee geoogst in een daaropvolgend roggegewas. Niet waarschijnlijk, want de bonen, zoals erwt, lupine en soja ontkiemen meestal al in het najaar en rotten dan in de winter weg. • Bij mengteelt kunnen de zaden doorgaans als veevoer worden gebruikt, maar de oogst kan achteraf ook in aparte rogge- en lupinefracties worden gesorteerd. Zaden van de blauwe lupine zijn gemiddeld vier- tot vijfmaal groter dan roggezaden en daarom makkelijk te scheiden (het duizend-korrelgewicht van de blauwe lupine is 150 tot 200 gram, van rogge 30 tot 40 gram). De sorteermachine kan echter een gebroken lupinezaad doorlaten. Een kwart lupinezaad van 0,045 gram, met een geschat eiwitgehalte van 25 procent, bevat nog steeds 11 mg lupine-eiwit, viermaal hoger dan de referentiedosis gehanteerd door bijvoorbeeld VITAL.

Puntbesmetting in de oogstfase van de rogge lijkt het best te passen bij de analyses

Wat is een puntbesmetting?

Een puntbesmetting duidt op een niet-homogene verdeling van een allergeen in een product, zodanig dat in één consumptie van het product of de verpakking – een sneetje, snoepje, hap of lik – het gehalte van de allergeen boven de limiet is, en in een ander stuk van hetzelfde product onder de limiet, of niet aantoonbaar. De puntbesmetting kan discontinu zijn: een fragment van lupinezaad in een grof roggedeeg, of meer versmeerd als het lupinezaad tezamen met de rogge is vermalen tot fijn meel. Ook in het laatste geval is het allergeen niet homogeen verdeeld over het gehele product: de ene hap kan een allergische reactie geven, de volgende niet. Contaminatie in de productie

Contaminatie kan ook verderop in de keten plaatsvinden, in de meelmaalderij of de bakkerij. In een veelzijdige bakkerij is er altijd kans op kruiscontaminatie. Er worden tientallen ingrediënten gebruikt, geexperimenteerd met nieuwe recepten, mogelijk vergissingen gemaakt of onvoldoende schoongemaakt. We rekenen een aantal scenario’s door om enig gevoel te krijgen bij een mogelijke contaminatieroute: • Lupinemeel is toegevoegd aan het roggemeel, maar niet op het etiket vermeld. Dit is helemaal niet ongebruikelijk, want lupinemeel wordt soms in roggebrood gebruikt vanwege goede emulgerende en waterbindende eigenschappen. De hoeveelheid lupine die als broodverbeteraar wordt toegevoegd aan bakproducten kan variëren van 0,5 tot 10 procent. Bij een lupinemeel-toevoeging van 0,5 procent zou de opgenomen dosis lupine-eiwit per roggesneetje van 60 gram ongeveer 75 mg (bij een zaadeiwitgehalte van 25 procent) zijn geweest. Ver boven alle grenswaarden, maar ook zoveel dat we dat zeker zouden hebben gedetecteerd met de ELI-

SA. Voor deze casus geen waarschijnlijke optie dus. • Lupinemeel is via verstuiving, contact met niet-gereinigde handen of apparaten onbedoeld in het roggebrood terechtgekomen. De lupine was daardoor niet homogeen verdeeld over het roggemeel of het broodje. Het geconsumeerde sneetje zou dan een lupinegehalte boven de referentiedosis gehad moeten hebben. In de andere sneetjes die WFSR analyseerde, zaten slechts spoortjes ver onder de vastgestelde referentiedoses voor lupine.

Puntbesmetting

De conclusie van deze case is dat de onderzoekers lupine hebben aangetroffen in een product dat de producent niet op het etiket had vermeld. De analyses toonden aan dat lupine als spoortje aanwezig was in het deel dat we tot onze beschikking hadden. De heftige fysiologische reactie van de consument daarentegen lijkt te suggereren dat het lupinegehalte in een ander deel van het broodje veel hoger was. Een puntbesmetting in de oogstfase van de rogge lijkt het best te passen bij onze analyses en de beperkte aanvullende informatie over het product.

Allergenenmanagement

Grondstofinformatie is een belangrijk element van goed allergenenmanagement. Rogge(meel) is een puur product dus voldoende onderscheidend. Maar gezien de teeltpraktijk is er risico op versleping van lupinezaden in de roggeoogst. Om allergische consumenten nog beter te beschermen, zouden gebruikers van roggemeel hun leveranciers kunnen vragen om aanvullende informatie: wordt rogge en lupine op dezelfde boerderij geteeld of komt zij zelfs als sorteerproduct uit een mengteelt met lupine? Incidentele puntbesmetting is dan een mogelijk risico. •