Hacer realidad un sueño biotecnológico: que los cereales fijen nitrógeno

La ciencia avanza firmemente en lograr que los cereales sean fijadores de nitrógeno, algo que sin dudas revolucionará los sistemas agrícolas mundiales.

El nitrógeno (N) es un elemento clave en la vida de todos los organismos que habitamos el planeta. Forma parte de las grandes biomoléculas de las células, como proteínas y ácidos nucleicos, pero también de otras moléculas más pequeñas que posibilitan la vida, por ejemplo las clorofilas. Así, constituye el 2% del peso seco de las plantas. El N está presente en la atmósfera en un 78%, pero no está disponible en esta forma gaseosa para la nutrición de los cultivos. Requiere ser fijado, transformado y luego absorbido y asimilado para sumarse al pool de compuestos celulares con diversas funciones biológicas. Todo este conjunto de reacciones que involucran formas gaseosas, moléculas inorgánicas y moléculas orgánicas del N, y en el que participan el aire, el suelo y la biota es conocido como ciclo del N.

La fijación biológica de nitrógeno (FBN) en la biosfera es el segundo proceso biológico en importancia luego de la fotosíntesis. Dado que puede ser desarrollado por algunos microorganismos (denominados diazotróficos) de vida libre o de vida asociativa, permite reducir las cantidades de fertilizantes aplicados en los sistemas productivos.

La FBN ayuda a evitar la contaminación del agua y del aire, el agotamiento del ozono estratosférico, las zonas muertas hipóxicas y la generación de óxido nitroso (un gas de efecto invernadero 300 veces más potente que el dióxido de carbono). Los fertilizantes nitrogenados sintéticos, desde el proceso intensivo de energía de síntesis hasta la inevitable pérdida de fertilizantes del campo, causan un daño estimado en $200 mil millones cada año. Por este motivo, existe una necesidad apremiante de mitigar los impactos negativos del uso de fertilizantes nitrogenados mientras se aumenta el suministro de nutrientes para intensificar la producción de cultivos (Wen y col., 2021).

En términos de fijación biológica, el N se convierte en amonio (NH4) por la acción de microorganismos de vida libre o simbiótica. Todos ellos poseen una maquinaria enzimática conocida como el complejo de la nitrogenasa, cuya principal limitante es su sensibilidad por el oxígeno (este complejo es activo en un ambiente anóxico). En el caso de las asociaciones simbióticas, es muy conocida la interacción de las leguminosas con rizobacterias (donde la asociación implica la formación de nódulos en las raíces, un ambiente libre de oxígeno donde funciona la enzima), pero esta habilidad no está extendida a otras familias de plantas o cultivos.

Los fertilizantes nitrogenados sintéticos, desde el proceso intensivo de energía de síntesis hasta la inevitable pérdida de fertilizantes del campo, causan un daño estimado en $200 mil millones cada año.

Recientemente se describió la existencia de un mucílago rico en azúcares, presente en raíces aéreas de algunas variedades autóctonas de maíz mexicano, que funciona como nicho para albergar una comunidad de microorganismos diazotróficos responsables de fijar N atmosférico en cantidades significativas (Bennett y col., 2020).

La FBN resulta de particular interés para los cereales ya que los granos de cultivos como el arroz, el trigo y el maíz proporcionan el 50% de las calorías globales y son los destinatarios del 45% de las aplicaciones mundiales de fertilizantes. Sin embargo, existen dos obstáculos principales para la comercialización de inoculantes capaces de fijar N: el desafío técnico de permitir que los microorganismos operen en condiciones de campo y el desafío comercial de llevar con éxito dichos microorganismos al mercado y su adopción generalizada (Wen y col., 2021). Hasta la fecha, no hay evidencia de simbiosis de nódulos radiculares de rizobacterias con cereales, que sea comercialmente viable. Para lograr este anhelado objetivo y lograr que los cereales sean autodependientes en términos de producción de N2, la ciencia exploró muchas estrategias. Priyadarshini y col. (2021) discuten que tanto las plantas como las bacterias podrían servir como objetivos para la intervención biotecnológica para lograr una interacción entre cereales y rizobacterias.

Si el foco es desarrollar una ingeniería genética de las plantas no leguminosas (cereales entre ellas), se pueden seguir dos caminos para posibilitar la FBN:

1) Ensamblar el conjunto completo de genes del complejo de la nitrogenasa bacteriana en las plantas de cereales (expresión de los genes nif).

2) Incitar la nodulación, de manera homóloga a lo que ocurre en las plantas leguminosas, pero esta vez en huésped no-leguminosa.

El primer camino es muy desafiante y ambicioso, ya que requiere obtener eventos genéticamente modificados que expresen esos genes en un ambiente anóxico, en mitocondria o cloroplasto, para lo que ya hay algunas evidencias alentadoras. Todas estas evidencias prácticas sugieren que la expresión de los genes nif en los cereales, para generar cereales fijadores de N2, probablemente no esté demasiado lejos, lo que ofrece un horizonte interesante para el sector productivo. Como se mencionó, compartimentar el sistema de nitrogenasa de las células vegetales productoras de oxígeno (en mitocondria o cloroplasto) es un aspecto importante en la ingeniería de cereales para la fijación de nitrógeno.

El desarrollo de nódulos en las raíces de los cereales puede ser una opción atractiva para la contención de oxígeno, como es el caso de las leguminosas, y a esto se refiere la segunda alternativa. Para ello, es necesario la expre- sión de genes codificantes de factores Nod (responsables de la nodulación) en las plantas de cereales. Los resultados de la investigación muestran evidencias de que los factores Nod tienen una similitud estructural con el factor Myc, conocido por mediar en las simbiosis micorrícicas. La percepción de estos dos factores conduce a la activación de la vía de señalización de simbiosis común (vía SYM) y se descubrió que es operativa en los cereales para llevar a cabo la simbiosis micorrízica. La vía SYM se puede diseñar en dos pasos: la percepción del factor Nod y luego la redirección de la ruta SYM para la expresión génica específica de la nodulación. En este sentido, los autores afirman que la ingeniería de la vía SYM, desde la señalización del calcio hasta la expresión génica específica de la nodulación, sería una opción factible y eficaz para lograr cereales con nódulos (Priyadarshini y col., 2021; Boujenna y García del Moral, 2021).

Si el foco es desarrollar ingeniería de bacterias fijadoras de N, se podría ayudar a mejorar su eficiencia de fijación de nitrógeno para cultivos que no son leguminosas. La escasez de diazotrofos naturales en la rizosfera puede cambiarse mediante la ingeniería de bacterias no diazotróficas asociadas a plantas para dotarlas de la capacidad de fijación de nitrógeno. Así, algunos componentes de la nitrogenasa se expresaron de forma estable en la bacteria E.coli, como también en otras bacterias no diazotróficas. Según estos estudios, se requieren pocos componentes genéticos para realizar la fijación de nitrógeno en un sistema heterólogo. Sin embargo, prácticamente en todos los estudios, los huéspedes heterólogos produjeron nitrogenasa con menos actividad en relación con los diazótrofos nativos, lo que indica la necesidad de optimizar los grupos de genes transferidos utilizando un enfoque de biología sintética.

El enfoque de biología sintética se aplicó con éxito para refactorizar grupos de genes nif en muchos diazotrofos, incluidos Klebsiella y Paenibacillus. Una primera estrategia a considerar es promover la excreción de amonio fijado por microorganismos en la rizosfera a través de un desacoplamiento de la regulación de la fijación de nitrógeno, de la disponibilidad de nitrógeno exógeno, o a través del bloqueo en la ruta de asimilación de nitrógeno o la adición del exportador de amonio o interrupción del transportador de amonio.

Compartimentar el sistema de nitrogenasa de las células vegetales productoras de oxígeno (en mitocondria o cloroplasto) es un aspecto importante en la ingeniería de cereales para la fijación de nitrógeno.

Una segunda estrategia es proteger la nitrogenasa de la acción del daño por oxígeno. Algunas bacterias, como la Azotobacter, inactivan de manera transitoria y reversible la enzima para evitar ese daño. Transferir por biología sintética esta capacidad a otras bacterias o hacer ingeniería de proteínas para diseñar una nitrogenasa insensible al oxígeno abre nuevas vías de investigación.

Una tercera alternativa propone mejorar la colonización de las bacterias diazotróficas en el ambiente rizoférico. Estas bacterias son capaces de establecer diferentes tipos de asociaciones con raíces de varias especies de plantas. Durante el proceso de interacción planta-bacteria, ambos socios sufren cambios moleculares y celulares. Varios pasos en la colonización bacteriana de las plantas implican el reconocimiento, la quimiotaxis, la adherencia, la invasión de raíces (solo endófitos), la colonización y el crecimiento. Los exopolisacáridos y los lipopolisacáridos de la superficie bacteriana suelen participar en la adhesión y colonización de las raíces de las plantas. La ingeniería de bacterias para mejorar el proceso de colonización podría ser un objetivo prometedor para mejorar la eficiencia de colonización en diazótrofos (Priyadarshini y col., 2021; Boujenna y García del Moral, 2021).

En síntesis, los cereales fijadores de nitrógeno serían un enorme desafío biotecnológico que podría revolucionar los sistemas agrícolas mundiales. Las dificultades más importantes para la transferencia directa de genes nif bacterianos a los cereales son la sensibilidad de la nitrogenasa al O2 y la complejidad y fragilidad de la biosíntesis de la nitrogenasa.

La fijación de nitrógeno es un proceso que demanda mucha energía, por lo que los cloroplastos y las mitocondrias se contemplan como posibles sitios subcelulares para la fijación de N, ya que pueden cumplir con los requisitos energéticos de la nitrogenasa. Debido a que la nitrogenasa es extremadamente sensible al oxígeno generado por los cloroplastos durante la fotosíntesis, la expresión de la nitrogenasa funcional en los cloroplastos requiere una separación temporal (día/noche), lo que limita la expresión de los genes nif sólo en períodos oscuros (noches) o, alternativamente, restringiendo espacialmente la expresión de los genes nif en tejidos no fotosintéticos como las raíces. La posibilidad de desarrollar simbiosis de nódulos de raíces similares a las leguminosas en cereales surge del conocimiento contemporáneo de que los cereales contienen la vía de señalización para formar asociaciones de micorrizas arbusculares con diversos rizobios diazotróficos. Sin embargo, falta conocimiento sobre la genética y la microbiología involucradas en la formación de un nódulo limitado en oxígeno para la fijación de N en las raíces de los cereales. Una alternativa es el uso de bacterias fijadoras de N y PGPR mixtas para desarrollar cereales con un mejor crecimiento de las raíces y una mejor explotación de los recursos ambientales y nutricionales. Para lograr esto, es fundamental diseñar sistemas que favorezcan una mayor colonización de endófitos diazotróficos para mejorar las posibilidades de que el diazotrofo inoculado colonice selectivamente la planta de cultivo, porque la fijación de N es muy variable dependiendo del diazotrofo asociado y la variedad de la planta (Boujenna y García del Moral, 2021).

• Bennett AB, Pankievicz VCS, and Ané JM. (2020). A Model for Nitrogen Fixation in Cereal Crops. Trends in Plant Science, 25: 226-235.

• Boujenna A and Garcia del Moral LF. (2021). Biotechnological approaches to develop nitrogen-fixing cereals: A review. Spanish Journal of Agricultural Research 19 (4), e08R01, 11.

• Priyadarshini P, Choudhury S, Tilgam J, Bharati A, Sreeshma N. (2021). Nitrogen fixing cereal: A rising hero towards meeting food security. Plant Physiology and Biochemistry 167: 912–920.

• Wen A, Haven KL, Bloch SE,… Temme K. (2021). Enabling Biological Nitrogen Fixation for Cereal Crops in Fertilized Fields. ACS Synth. Biol. 10: 3264−3277.