CONTENIDO
1. Fiesta Cruceña
2. Evaluación de tres métodos de extracción y purificación de ADN a partir de muestras no invasivas, para sexar Parabas Frente Roja (Ara rubrogenys) mediante la técnica de PCR
3. Programa de Proyectos de Investigación
UPSA - ANCB-SC Gestión 2012 – 2013
4. Infomación: Red Iberoamericana de Bioenergías
5. Infomación: Reunión del Sector
Energía - Plan de Ciencia y Tecnología, Viceministerio de Ciencia y Tecnología
Fiesta Cruceña
Llega septiembre y la gente se empieza a alborotar. Cuando escribo “la gente” sólo me estoy refiriendo a una pequeña parte de la ciudadanía, la que participa y vive de la burocracia municipal, departamental o nacional. Esta “gente” en esta época se pone en campaña para preparar (inventar, es el verbo más adecuado) los “regalos” que el municipio, la gobernación o el gobierno van a dar a Santa Cruz en su aniversario cívico. No formo parte de esa “gente”, por tanto no estoy alborotado inventando regalos; sin embargo, como soy un cruceño que ama esta tierra, no quiero pasar por alto el inicio de septiembre, mes de la fiesta cruceña, para que junto a ustedes podamos recordar algunas de las cosas por las que los cruceños nos sentimos orgullosos.
Estoy seguro que muchos comparten conmigo el sentimiento común de tener el privilegio –sin merecerlo, sin haberlo pedido- de haber nacido en Santa Cruz de la Sierra o en los límites del departamento cruceño o por lo menos de vivir en esta ciudad. Tengo el convencimiento –porque lo he constatado muchas vecesque el sentimiento de pertenencia y amor a una ciudad a una región, es algo que se da a lo largo y ancho de este mundo tan diverso, aunque ha habido, hay y habrá muchos que creen estar por encima de estos sentimientos tan “provincianos” y pretenden ser ciudadanos del mundo, dueños de una cultura universal sin ni siquiera ser ciudadanos de su propio espacio.
INFORMACIÓN GENERAL:
CONSEJO EDITORIAL:
Acad. Francisco García G.
Acad. Gastón Mejía B.
Acad. Alcides Parejas M.
Acad. Mario Suárez R.
EDICIÓN:
Diseño gráfico: Yoshimi Iwanaga
Edición Financiada por la Fundación Universidad Privada de Santa Cruz de la Sierra - UPSA
DIRECCIÓN ANCB-SC:
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Este sentimiento de pertenencia y amor es el que nos hace disfrutar de la fiesta cruceña de septiembre sin necesidad de buscar papel celofán y moñas para posibles regalos, que en la mayor parte de los casos son como fuegos artificiales o fuego de chala. Lo que tenemos que hacer los cruceños es hacer un alto en el camino (estamos yendo tan de prisa y en forma tan atolondrada, que las ramas no nos están dejando ver el bosque, y, lo que es peor, estamos creyendo que los espejismos son la realidad) para mirarnos al espejo. En esa mirada tenemos que reconocernos tal y como somos, con nuestros defectos y virtudes, con nuestras acciones y omisiones. A estas alturas del partido, creo que vamos a necesitar una buena dosis de humildad para vernos tal cual y no como nos gustaría que nos vieran. Creo sinceramente que, a pesar de los pesares, es mucho de lo que los cruceños nos podemos sentir orgullosos y hacer fiesta. Entonces, empecemos la fiesta. Creo que debemos enorgullecernos de ser cruceños sin complejo alguno. En los últimos tiempos casi nos han convencido que hablar de cruceñismo (que no es otra cosa que un amor inclaudicable por la tierra que nos vio nacer y que nos cobija) es ir en contra de los intereses nacionales; que hablar de cruceñismo es algo excluyente; que los que hablamos de cruceñismo somos incapaces de ver al otro. Creo que estamos a tiempo de rectificar y decirle a nuestros detractores (entre éstos paradójicamente hay muchos cruceños) que no sólo tenemos el derecho, sino sobre todo la obligación de gritar a los cuatro vientos nuestro cruceñismo y repetir a voz en cuello: “¡Primero Santa Cruz!”. También tenemos que tomar conciencia de que no sólo sentimos orgullo de ser cruceños por el solo hecho de nuestro nacimiento, sino también porque somos herederos de una rica historia y una tradición cultural que nos da una identidad recia y especial.
Los cruceños estamos de fiesta en septiembre, cuando florecen los tajibos, los alcornoques, los gallitos para saludar nuestra incorporación al proceso libertario. Estamos de fiesta porque hemos nacido en esta tierra, pero creo que nos tenemos que hacer merecedores de este privilegio, nos lo tenemos que ganar a pulso día a día.
01 TESAPE ARANDU AÑO 2 No. 07 Septiembre de 2012
Acad. Alcides Parejas Moreno Vicepresidente de Ciencias de la Naturaleza
Evaluación de tres métodos de extracción y purificación de ADN a partir de muestras no invasivas, para sexar Parabas Frente Roja (Ara rubrogenys) mediante la
1.- ANTECEDENTES
técnica de PCR
Causas de la declinación poblacional de la Paraba Frente Roja:
Comercio ilegal
Fragmentación de su habitat
• Apéndice I (CITES)
• En Peligro (UICN)
• En Peligro Crítico (Libro Rojo de la Fauna Silvestre de Vertebrados de Bolivia)
Sobrepastoreo de cabras
Población estimada: 1000 individuos.
Nuevas estrategias para la conservación:
Pérdida de especies
Pérdida de la vegetación nativa
Pérdida de información genética
Programas de Conservación Nuevas estrategias
Distribución: Santa Cruz, Cochabamba, Chuquisaca y Potosí
Anida en cañones, riscos y barrancos a orillas de los ríos Especie monotípica y endémica de los Andes Centrales de Bolivia
Hábitat Natural de la Paraba Frente Roja (Ara rubrogenys) Valles de Omereque - Cochabamba
Estudios que implican la Biología Molecular y Genética
Herramientas de mucha utilidad
para la conservación de la Biodiversidad
Muestras no invasivas:
Fuente de ADN para estudios moleculares, de genética, ecología y evolución
De gran utilidad en estudios con poblaciones salvajes amenazadas o en peligro de extinción
02 TESAPE ARANDU
=
+
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
Aquellas que no requieren manipulación excesiva del individuo
ADN generalmente degradado y en baja cantidad
Pelos
Uñas y garras
Almacenamiento simple y menos costoso
Cel. Epiteliales presentes en heces, orina y semen Plumas frescas Plumas mudadas
Extracción y Purificación de ADN
Lísis de células
Inhibición de nucleasas
Desproteinización: métodos químicos (solventes orgánicos, detergentes no iónicos) o enzimáticos (proteasas)
Precipitación de ácidos nucleicos: etanol absoluto o isopropanol
Lavado de los ácidos nucleicos
Reconstitución del ADN
Almacenamiento a 4 ºC, - 20 ºC, PCR
Principios de la PCR
Amplificación del ADN (PCR)
03 TESAPE ARANDU
Prueba de Sexaje Molecular:
Especies que no presentan dimorfismo sexual
Se basa en la Técnica de PCR Ventajas Primers específicos Evita la manipulación excesiva del ave
Amplifica regiones conservadas (exones) y secuencias de regiones no conservadas (intrones) del gen CHD
Sexaje de individuos inmaduros
Sexaje de individuos silvestres sin capturar
1) Área de estudio y colecta de muestras
Lab. Biología Molecular (PROINPA)
Plumas mudadas (Ara rubrogenys)
Habitat natural de la Paraba Frente Roja
Plumas frescas (Flia. Psittacidae, Flia. Culumbidae, Gallus sp.)
2) Tratamiento y procesamiento de las muestras
Prelavado y lavado de muestras
Procesamiento de las muestras
2. OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluar tres métodos de extracción y purificación de ADN a partir de muestras no invasivas, para sexar Parabas Frente Roja (Ara rubrogenys) mediante la técnica de PCR.
Objetivos específicos
• Estandarizar los métodos de extracción y purificación de ADN convencionales que utilizan CHELEX 5%, CHELEX 10% y un método comercial Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN Inc., EEUU.).
• Verificar de forma cuantitativa y cualitativa el ADN genómico extraído a partir de muestras no invasivas a través de los dos métodos convencionales y el kit comercial.
• Comparar los tres métodos de extracción y purificación de ADN, mediante el uso de la Prueba de sexaje molecular por PCR de Parabas Frente Roja (Ara rubrogenys).
3. METODOLOGÍA
Plumas mudadas de Ara rubrogenys, con sus respectivos datos de colecta
Diferentes estados y tamaños de las plumas colectadas
Plumas frescas de Parabas
3) Extracción y purificación de ADN a partir de plumas frescas y mudadas
kit comercial Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit
Método convencional basado en el uso de la Resina Chelex 100
Protocolo CHELEX 5%
Protocolo CHELEX 10%
Preparación de la Resina Chelex 100 al 10% (40 ml. H2O + 4 grs.) y 5% (5 ml. H2O + 5 ml. 10%)
Tejido + Resina CHELEX 100
Incubación a 100°C por 30 min.
Centrifugar 1 min. a 14000 rpm
Transferencia del sobrenadante
ADN listo para usar
04 TESAPE ARANDU
Albergue de loros de Marcelo Antezana - Cbba.
4) Observación de la calidad de ADN genómico Electrofóresis en geles de agarosa 1%
2,4 grs. Agarosa + 80 ml. Buffer TBE 0.5X
Disolver - calentarpolimerizar
10 µl ADN + 3 µl Buffer de carga Ez-Vision
Migración del ADN por 1 hora y 35 min. a 90 voltios
Visualización de los productos de PCR (Fotodocumentador)
Dos bandas entre 300 y 400 pb (Hembras)
Análisis de los resultados
5) Amplificación de un fragmento del Gen CHD PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
P2: 5’ - TCTGCATCGTAAATCCTTT - 3’
P8: 5’ - CTCCCAAGGATGAGRAAAYTG - 3’ R=A/G, Y=T/C. GRIFFITHS et al. 1998
6) Separación y visualización de los fragmentos amplificados Electroforesis en geles de agarosa al 3%
2,4 grs. Agarosa + 80 ml. Buffer TBE 0.5X
Disolver - calentarpolimerizar
10 µl ADN + 3 µl Buffer de carga Ez-Vision
Una banda entre 300 y 400 pb (Machos) Una banda entre 300 y 400
Migración del ADN por 1 hora y 35 min. a 90 voltios
Visualización de los productos de PCR (Fotodocumentador)
4. RESULTADOS
Dos bandas entre 300 y 400 pb (Hembras)
Análisis de los resultados
50 plumas frescas y mudadas procesadas de Ara rubrogenys, Ara chloroptera, un individuo híbrido (Ara macao-Ara ararauna), Flia. Culumbidae y Gal lus sp.
05 TESAPE ARANDU
Condiciones de Amplificación 94 ºC 3 min. 94 ºC 30 seg. 49 ºC 45 seg. 35 ciclos 72 ºC 45 seg. 72 ºC 5 min. Concentración inicial Concentración final Volumen por tubo (1X) Buffer Colorless 5X 1X 4 µl MgCl2 25 mM 1,2 µl dNTPs 100 mM 0,2 mM 0,04 µl Primer P2 10 µM 1 µM 1 µl Primer P8 10 µM 1 µM 1 µl H2O Tridestilada Taq Polimerasa 5 U/µl 0,4 µl DNA 20 - 50 ng/ µl 1 - 8 µl Volumen Final 20 µl }
pb (Machos)
Extracción y purificación de ADN (Kit comercial Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit)
Plumas frescas:
• 12 muestras procesadas corresponden a 9 plumas de parabas (Flia. Psittacidae), 1 de paloma (Flia. Culumbidae) y 2 de gallina (Gallus sp.).
Plumas mudadas:
• 13 muestras procesadas corresponden a 13 plumas de Parabas Frente Roja (Ara rubrogenys) obtenidas de su hábitat natural.
Geles de agarosa al 1%, ADN genómico obtenido a partir de plumas frescas(imagen izquierda) y plumas mudadas (imagen derecha). Método de Extracción Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit.
No se encontraron diferencias significativas entre el uso de plumas frescas y plumas mudadas (X2 = 4,79, df = 2, p = 0,091)
Extracción y purificación de ADN genómico, Método convencional basado en el uso de la Resina Chelex 100
Plumas frescas
CHELEX 5%:
• 13 muestras procesadas corresponden a 10 plumas de parabas (Flia. Psittacidae), 1 de paloma (Flia. Culumbidae) y 2 de gallina (Gallus sp.)
Plumas frescas
CHELEX 10%:
• 12 muestras procesadas corresponden a 7 plumas de parabas (Flia. Psittacidae), 1 de paloma (Flia. Culumbidae) y 4 de gallina (Gallus sp.)
Se obtiene mayor cantidad de ADN con CHELEX 5%, que con CHELEX 10%
Concentración de Chelex 100 influye en el proceso de extracción del ADN a partir de plumas.
Plumas frescas: 100% (12) muestras positivas
Plumas mudadas: 69,2% (9) muestras positivas
DETERMINACIÓN DEL SEXO
100% (13) muestras positivas
100% (12) muestras positivas
DETERMINACIÓN DEL SEXO
Se obtuvo buena calidad y cantidad de ADN a partir de plumas frescas usando el kit Qiagen.
Se obtuvo el 100 % de amplificación del ADN con los tres protocolos de extracción a partir de plumas frescas.
06 TESAPE ARANDU
ÉXITO DE AMPLIFICACIÓN ÉXITO DE AMPLIFICACIÓN
12 individuos total 12 individuos total 9 individuos total 7 individuos total
Hembras Machos Indeterminados 7 (58,3%) 5 (38,4%) 4 (30,8%) 4 (30,8%) 0% 5 (41,7%) Hembras Machos Indeterminados 8 (61,5%) 3 (25%) 5 (41,7%) 4 (33,3%) 3 (23,1%) 2 (15,4%)
Determinación del sexo (Amplificación del gen CHD)
Métodos de Extracción usados:
Protocolos Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit, CHELEX 5 % y 10%
No se observaron diferencias significativas respecto a la calidad de amplificación entre el protocolo CHELEX 5% y el protocolo CHELEX 10% (X2 = 4,62, df = 2, p = 0,099)
Comparación entre los protocolos de extracción de ADN y la amplificación de un fragmento del gen CHD:
CÓDIGO MUESTRA TAXA PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN ADN
SEXO CONOCIDO PRC (Amplificación gen CHD)
SEXO DETERMINADO POR PCR
5. CONCLUSIONES
La extracción de ADN a partir de plumas frescas y plumas mudadas mediante los tres protocolos de extracción, rindió cantidad suficiente de ADN genómico para permitir la amplificación de un fragmento del gen CHD.
Mejor protocolo para extraer ADN a partir de plumas frescas o mudadas es el kit comercial Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit
Alto costo =
• Mayor cantidad de ADN y menos degradado usando el protocolo CHELEX 5% en comparación del protocolo CHELEX 10%.
• Plumas frescas, fuente excelente de ADN en comparación de plumas mudadas. Sin embargo, esto no quiere decir que no se haya obtenido cantidad suficiente de ADN para su amplificación por PCR a partir de plumas mudadas.
• Estandarización de un protocolo de extracción y purificación de ADN genómico a partir de muestras no invasivas como las plumas frescas o mudadas.
5
4 Ara chloroptera (Paraba Colorada)
Ara rubrogenys (Paraba Frente Roja)
7
Ara rubrogenys (Paraba Frente Roja)
10 Flia. Culumbidae (Paloma)
78 Gallus sp. (Gallina)
79 Gallus sp. (Gallina)
N/R: No se realizó
Ojagen Macho
Positivo Macho
Chelex 5% Positivo Macho
Chelex 10% Positivo Macho
Plumas frescas y mudadas, fuente valiosa de material genético, adquieren valor agregado a la hora de realizar estudios en especies endémicas o amenazadas de extinción.
Ojagen Macho
Positivo Macho
Chelex 5% Positivo Macho
Chelex 10% Positivo Macho
Primer trabajo realizado en Bolivia para la especie Ara rubrogenys, especie endémica de Bolivia y en peligro crítico de extinción.
Ojagen Hembra
Positivo Hembra Chelex 5% Positivo Falso Macho*
Chelex 10% N/R
6. RECOMENDACIONES
Positivo Hembra Chelex 5% Positivo Hembra
Ojagen No conocido
Chelex 10% Positivo Falso Macho*
Realizar nuevos estudios para lograr una mejor estandarización de los protocolos de extracción de ADN basados en la utilización de la Resina Chelex 100, enfatizando en la posterior purificación del ADN y reducir los costos que implica la utilización de kit comerciales de extracción.
Ojagen Hembra
Positivo Hembra Chelex 5% Positivo Falso Macho*
Chelex 10% Positivo Hembra
Incentivar y apoyar las investigaciones dentro del área de la Biología Molecular, durante la formación de pregrado y sobre todo durante las formaciones de postgrado.
Incentivar y proponer la realización de estudios de postgrado en el área de la Biología Molecular en Bolivia.
Ojagen Hembra
Positivo Hembra
Chelex 5% Positivo Falso Macho*
Chelex 10% Positivo Falso Macho*
*Amplicación de una sola banda de hembras
Aunar esfuerzos para la construcción y equipamiento de un laboratorio de Biología Molecular y Genética de la Conservación, para la realización de investigaciones científicas exclusivamente con fauna y flora silvestres.
Esdenka Pérez Cascales
07 TESAPE ARANDU
Conferencia presentada en el 1er. Taller de Proyectos de Investigación, Programa UPSA - ANCB-SC, el 5 de mayo en Santa Cruz de la Sierra - Bolivia.
