Perfil microbiológico de la almeja (Lucina pectinata), del ostión de mangle (Crassostrea rhizophorae) y de las aguas de extracción en Boquerón y Lajas, Puerto Rico
Y. Fontánez, M. Chaparro y J. M. Kubaryk, UPR-Mayaguez
Bivalvos bajo estudio
Lucina pectinata Crassostrea rhizophorae
Alimentación de bivalvos
• Los bivalvos se alimentan por filtración
• Concentración de microorganismos de las aguas donde se encuentran
• Concentración de patógenos hasta llegar a niveles infecciosos puede implicar enfermedad transmitida por alimento
• Consumo de producto crudo aumenta el riesgo de exposición a patógenos
Clasificación de aguas para extracción de bivalvos
• National Shellfish Sanitation Program (NSSP)
• Meta: controlar la seguridad de los bivalvos para consumo humano de evitando que sea extraídos de aguas contaminadas
• Usa 5 clasificaciones para aguas: aprobadas, aprobadas condicionalmente, restringidas, restringidas condicionalmente, prohibidas.
Control enfermedad por consumo de bivalvos
• Primer punto crítico de control para prevenir enfermedad por consumo de bivalvos es identificación de las aguas de crecimiento de bivalvos. Esto requiere un sondeo sanitario de esas aguas (“sanitary survey”).
• Incluye criterios microbiológicos.
“Sanitary survey”
• Es una evaluación de los factores ambientales que impactan la calidad del agua donde crecen los bivalvos
• Identificación y evaluación de fuentes de contaminación
• Evaluación de factores metereológicos
• Evaluación de factores hidrográficos que puedan afectar la distribución de contaminantes en el área
• Avalúo de la calidad del agua
“Sanitary survey”
• Hay que mantenerlo actualizado
• Estaciones de muestreo – hacer análisis periódico
• Verificar que la clasificación es aún válida
• Hay que repetirlo completo cada 12 años
Microorganismos de interés
• Coliformes fecales (contaminación del agua de mar con materia fecal)
• Enfermedad de transmisión fecal-oral
• Vibrios
• Habitantes normales del ambiente marino
Tabla 1. Comparación entre la almeja y el ostión de mangle
Organismo Habitat Localización Consumo
ostión mangle adherido a las superficies de las raíces vivo y crudo con limón, pique, salsa de tomate o sólo
almeja mangle enterradas en el fondo
Posibles microorganismos presentes
• Familia Vibrionaceae
• Vibrio parahaemolyticus
• Vibrio vulnificus
• Vibrio cholerae
• Vibrio mimicus
• Plesiomonas spp.
• Aeromonas spp.
• Familia Enterobacteriaceae
• Salmonella spp.
• Shigella spp.
• Escherichia coli
Distribución de casos de vibriosis
Figura 3. Distribución de casos de vibriosis a nivel mundial
India
Japón
Taiwán Bangladesh
Brotes en Estados Unidos
• Según el estudio de Daniels y colaboradores (2000) se reportaron 40 brotes de vibriosis entre los años 1973 y 1998 donde el agente etiológico fue Vibrio parahaemolyticus.
• 1,064 personas
• camarones, pulpo, cangrejo y langosta
• ostiones crudos
Daniels, N., L. Mac Kinnon, R. Bishop, S. Altekruse, B. Ray, R. Hammond, S. Thompson, S. Wilson, N. Bean, P.Griffin and L. Slutsker. 2000. Vibrio parahaemolyticus infections in the United States, 1973-1998. J. Infect. Dis., 181: 1661-1666.
Regulaciones a la industria de bivalvos en
E.U.
• Programa Nacional de Sanitización de Bivalvos (“NSSP”).
• Actualmente se llevan a cabo análisis bacteriológicos específicos para certificar que las zonas de extracción están abiertas para la cosecha de bivalvos.
¿Qué pasa en Puerto Rico?
• No existe un programa regulatorio para esta industria.
• Por la posición geográfica, P.R. posee un clima tropical que favorece la prevalencia de vibrios en el ambiente marino incluyendo a los bivalvos.
• No se han reportado casos de gastroenteritis atribuidos a la ingesta de bivalvos.
Estado Libre Asociado de Puerto Rico. Departamento de Salud. División de Epidemiología. 2004. Enfermedades entéricas de notificación obligatoria en Puerto Rico, 1999-2003.
Objetivos de este estudio
• Establecer el perfil microbiológico de la almeja, del ostión de mangle y las aguas de extracción de bivalvos de la zona suroeste de Puerto Rico. Utilizar los datos obtenidos para crear un NSSP “puertorriqueñizado”.
• Determinar si las aguas de extracción de bivalvos cumplen con los límites establecidos por el programa federal.
• Proveer información a las agencias gubernamentales sobre los niveles de los aislados en bivalvos y la calidad de las aguas de extracción de la zona suroeste de Puerto Rico. Esto establecerá el “baseline” que será un punto de partida.
Revisión de literatura
• Mayoría de los estudios publicados se enfocan en miembros de la familia Vibrionaceae.
• Vibrio cholerae O1 había sido el Vibrio de mayor importancia a nivel de salud pública.
• El descubrimiento de nuevas especies de vibrios desplazó a Vibrio cholerae por Vibrio parahaemolyticus y Vibrio vulnificus.
Tabla 2. Descripción de la infección con Vibrio parahaemolyticus
Enfermedad Dosis infectiva Periódo de incubación Síntomas Comentarios
vibriosis desconocida 4-96 horas diarrea naúsea vómito calambre Se desarrolla una vez la bacteria se aloja en el intestino y libera toxina. Auto-limitante
Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). U.S. Food and Drug Administration. 1999. Bad Bug: Vibrio parahaemolyticus.
Distribución de vibrios en el ambiente marino
•
Temporada del año
•
El tipo de muestra
• Métodos analíticos de recuperación
Joseph, S., R. Colwell and J. Kaper. 1983. Vibrio parahaemolyticus and related halophilic vibrios. Crit. Rev. Microbiol. 10: 77-123.
Coliformes fecales
• Miembros de la familia Enterobacteriaceae
• Gram negativos
• Asporógenos
• Anaeróbicos facultativos
• Reservorio principal es el tracto gastrointestinal de animales de sangre caliente.
Brotes en Estados Unidos
• Desde 1978 hasta 1987 se reportaron 80 casos de salmonelosis donde el vehículo de transmisión fueron bivalvos.
• Desde 1993 hasta 1998 sólo se ha reportado un brote de salmonelosis en ostiones crudos.
Mater ales y Métodos
Figura 8. Mapa de los lugares de muestreados
Tipo de muestreo
• “Systemic random sampling monitoring strategy”
• Esta estrategia presume que un sondeo llevado a cabo siguiendo un itinerario preestablecido, a una frecuencia adecuada, capturará efectos por el clima que pueden alterar los recuentos obtenidos
pH
Parámetros físico-químicos
Recolección de la muestra
Salinidad Temperatura
Oxígeno disuelto
Recomendaciones de la APHA
Coliformes fecales
Homogenados
Figura 9. Diagrama de flujo sobre la metodología utilizada en el estudio
Figura 10. Flujograma de la metodología de aislación para especies de vibrios (BAM)
50 g de la muestra
Diluciones seriadas
Se incubó por 18 h a 35 ± 2°C
Se estrió platos de TCBS
Se incubó por 18 h a 35 ± 2°C
TSA 3% NaCl
Se incubó por 18 h a 35 ± 2°C
Tinción Gram y prueba de oxidasa
Se incubó por 18 h a 35 ± 2°C
Pruebas de halofilismo
Se incubó por 18 h a 35 ± 2°C
Identificó preliminarmente las especies
Pruebas bioquímicas
Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). U.S. Food and Drug Administration. 1998. Bacteriological Analytical Manual (BAM). 8th edition, Revision A. Association of Official Analytical Chemists International. Division of Microbiology, Gaithersburg, MD.
Figura 11. Flujograma de la metodología de aislación para los coliformes fecales y recuento total aeróbico (BAM)
25 g de la muestra
Recuento total aeróbico
225 ml de PBS
Se incubó por 24 h a 44.5 ± 0.02°C
Diluciones seriadas
NMP en LST
Se incubó por 24 h a 35 ± 2°C
EC broth y BGBB
Se incubó por 24 h a 35 ± 2°C
Se estrió en L-EMB
Se incubó por 24 h a 35 ± 2°C
Caldo lactosado
Se incubó por 24 h a 35 ± 2°C
Tinción Gram
Corroboró la identidad de las bacterias con API 20 E
Método rápido de identificación para E. coli O157:H7 (Bax® system)
Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). U.S. Food and Drug Administration. 1998. Bacteriological Analytical Manual (BAM). 8th edition, Revision A. Association of Official Analytical Chemists International. Division of Microbiology, Gaithersburg, MD.
25 g de la muestra
225 ml de caldo lactosado
1 hora temperatura ambiente
Diluciones seriadas
Se incubó por 18 h a 35 ± 2°C
RV y TT
Se incubó por 18 h a 42 y 43 ± 2°C
Se estrió XLD, BS y HE
Se incubó por 18 h a 35 ± 2°C
Tinción Gram
LIA y TSI
Se incubó por 18 h a 35 ± 2°C
Identificaron con API 20E
Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). U.S. Food and Drug Administration. 1998. Bacteriological Analytical Manual (BAM). 8th edition, Revision A. Association of Official Analytical Chemists International. Division of Microbiology, Gaithersburg, MD.
Resultados
Figura 13. Incidencia de vibrios en ostiones (Crassostrea rhizophorae ) y en las aguas de extracción del suroeste de Puerto Rico durante el período de julio de 2003 a junio de 2004.
Ostiones de Boquerón
Ostiones de Lajas
Agua de extracción de ostiones de Boquerón
Agua de extracción de ostiones de Lajas
Figura 14. Incidencia de vibrios en almejas (Lucina pectinata ) y en las aguas de extracción del suroeste de Puerto Rico durante el período de julio de 2003 a junio 2004.
Julio Agosto Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Enero Febrero Febrero Marzo Abril Mayo Junio
Meses del año
Almejas de Boquerón
Almejas de Lajas
Agua de extracción de almejas de Boquerón
Agua de extracción de almejas de Lajas
Microorganismos aislados
• Vibrio parahaemolyticus
• Vibrio mimicus
• Vibrio cholerae
• Vibrio vulnificus
• Otras especies no identificadas
Figura 15. Incidencia de coliformes fecales en ostiones (Crassotrea rhizophorae ) y en las aguas de extracción de bivalvos de la zona suroeste de Puerto Rico durante el período de julio de 2003 a junio de 2004.
Julio Julio AgostoSeptiembre OctubreNoviembreNoviembre Diciembre Enero Febrero Marzo Abril Mayo Mayo Junio Meses del año
Ostiones de Boquerón coliformes fecales
Ostiones de Lajas coliformes fecales
Agua de extracción de ostiones de Boquerón coliformes fecales
Agua de extracción de ostiones de Lajas coliformes fecales
Límite sugerido por la NSSP (2.36 log10 ufc/g de ostión)
Límite sugerido por la NSSP (1.69 log10 ufc/100 ml de agua)
Figura 16. Incidencia de coliformes fecales en almejas (Lucina pectinata ) y en las aguas de extracción de bivalvos de la zona suroeste de Puerto Rico durante el período de julio de 2003 a junio de 2004.
Julio Agosto AgostoSeptiembre OctubreNoviembre Diciembre Enero Febrero Febrero Marzo Abril Mayo Junio
Meses del año
Almejas de Boquerón coliformes fecales
Almejas de Lajas coliformes fecales
Agua de extracción de almejas de Boquerón coliformes fecales
Agua de extracción de almejas de Lajas coliformes fecales
Límite sugerido por la NSSP (2.36 log10 ufc/g de ostión)
Límite sugerido por la NSSP (1.69 log10 ufc/100 ml de agua)
Microorgansimos aislados
• Citrobacter freundii
• Enterobacter cloacae
• Enterobacter aerogenes
• Klebsiella planticola
• Klebsiella pneumoniae
• Escherichia coli
• Pseudomonas spp.
Figura 17. Recuentos totales aeróbicos en ostiones (Crassostrea rhizophorae ) y en las aguas de extracción del suroeste de Puerto Rico durante el período de julio de 2003 a junio de 2004.
Julio Julio AgostoSeptiembre Octubre Noviembre Noviembre Diciembre Enero Febrero Marzo Abril Mayo Mayo Junio
Meses del año
Ostiones Boquerón Agua de extracción de ostiones de Boquerón
Ostiones de Lajas Agua de extracción de ostiones de Lajas
Límite sugerido por la NSSP (5.70 log10 ufc/g de ostiones)
Figura 18. Recuentos totales aeróbicos en almejas (Lucina pectinata ) y en las aguas de extracción del suroeste de Puerto Rico durante el período de julio de 2003 a junio de 2004.
Julio Agosto Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Enero Febrero Febrero Marzo Abril Mayo Junio
Meses del año
Almejas de Boquerón Agua de extracción de almejas de Boquerón
Almejas de Lajas Agua de extracción de almejas de Lajas
Límite sugerido por la NSSP (5.70 log10 ufc/g de ostiones)
• Klebsiella spp.
• Enterobacter cloacae
• Escherichia coli
• Proteus mirabilis
• Serratia liquefaciens
• Citrobacter spp.
• Morganella morganii
• Shigella spp.
Metodología de Salmonella spp.
Discusión
• Se encontraron fluctuaciones en las poblaciones de los vibrios las cuales reflejan una tendencia similar a las zonas templadas.
• Debido a que se evidenció la uniformidad de la temperatura en las aguas de extracción de la zona suroeste de Puerto Rico, los datos que revela este estudio sobre la incidencia de vibrios en bivalvos y el agua de extracción podrían atribuirse a otras posibles causas.
Los resultados de este estudio no mostraron relación entre la incidencia de vibrios con la salinidad, el pH o la concentración de oxígeno disuelto.
• Posiblemente esta tendencia podría estar influenciada por otros factores abióticos y/o bióticos del área.
Incidencia de coliformes fecales
• Estudios previos demostraron que no se puede relacionar la presencia de virus y algunas bacterias entéricas cuyo reservorio natural es el ambiente acuático, con los niveles de coliformes fecales.
• Escherichia coli se aisló de los bivalvos y las aguas de extracción de ambos lugares monitoreados con una incidencia de 23.08% (en relación con todas las muestras identificadas).
Hood, M. Ness, G. and J. Blake. 1983. Relationship among fecal coliforms, Escherichia coli and Salmonella spp. in shellfish. Appl. Environ. Microbiol. 45:122-126.
Salmonella spp.
• Durante el transcurso de esta investigación no se detectó la presencia de Salmonella spp. en ninguna de las muestras analizadas.
• Posiblemente no se recuperó especies de Salmonella debido a que ésta podría encontrarse en números tan bajos que el método no sea capaz de detectarla o se encuentra en VBNC.
Baudart, J., K. Lemarchand, A. Brisabois y P. Lebaron. 2000. Diversity of Salmonella strains isolated from the aquatic environment as determined by serotyping and amplification of the ribosomal DNA spacer regions. Appl. Environ. Microbiol. 66: 1544-1552.
Conclusiones
• La mayoría de las muestras analizadas cumplen con las regulaciones de la NSSP para los niveles de vibrios, coliformes fecales y PCA.
• Las aguas de extracción de Boquerón y Lajas podrían clasificarse como “abiertas” para la cosecha de estos bivalvos si utilizamos los parámetros de uso en Estados
Unidos.
• En los lugares monitoreados la incidencia de vibrios no se vió afectada por la salinidad, el pH, la temperatura o la concentración de oxígeno disuelto.
Recomendaciones
• Estudiar la composición de nutrientes y el efecto de otros factores bióticos o abióticos del ambiente sobre la incidencia de vibrios.
• Diseñar guías preventivas que disminuyan la probabilidad de una intoxicación alimentaria a través del consumo de bivalvos crudos.
• Analizar el agua utilizada para almacenar temporalmente los ostiones y las almejas antes de ser vendidos al detal en Boquerón y Lajas.
• Estudiar la incidencia de Salmonella spp. en esta aguas a través del empleo de técnicas moleculares.
• Determinar la presencia de factores de virulencia en las bacterias aisladas en este estudio.
¿Preguntas?