Ist es an der Zeit, Ihre Hygiene-maßnahmen zu überprüfen?

Ausgabe 8

Eine Publikation von Romer Labs®

Fotos: lisafx / IP Galanternik D.U.

Ist es an der Zeit, Ihre Hygienemaßnahmen zu überprüfen?

Reinigungsmittel, Desinfektionsmittel und andere Hilfsmittel für die Reinigung der Produktionsumgebung Schnellverfahren für die Reinigungskontrolle – ein tieferer Einblick

Inhalt

4-7 Verifizierungstools:

Reinigung der Produktionsbereiche Die Aufrechterhaltung einer sauberen und pathogenfreien Lebensmittelproduktion ist von entscheidender Bedeutung, um dem Verbraucher ein sicheres Produkt garantieren zu können. In dieser Ausgabe geben wir einen kurzen Überblick zu den Unterschieden von Reinigungsmittel, Desinfektionsreiniger, Desinfektionsmittel und Neutralisationsmittel.

Von Stefan Widmann, Produktmanager Romer Labs®

Spot On ist eine Publikation der Romer Labs Division Holding GmbH, die kostenlos erhältlich ist.

ISSN: 2414-2042

Redaktion: Joshua Davis, Cristian Ilea

Mit Beiträgen von: Meredith Sutzko, Stefan Widmann Grafik: GraphX Erber AG Recherche: Kurt Brunner

Verlag: Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Österreich Tel.: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com

©Copyright 2019, Romer Labs® Alle Rechte vorbehalten. Kein Teil dieser Publikation darf ohne schriftliche Genehmigung des Inhabers der Urheberrechte in jeglicher materieller Form für gewerbliche Zwecke vervielfältigt werden.

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8-11 Schnellverfahren für Reinigungskontrollen:

Im Fokus

In diesem Artikel erklärt Stefan Widmann die gängigsten Arten von Tests zur Überprüfung der Umfeldhygiene, um Ihnen die Auswahl der für Sie geeignete Methode zu erleichtern.

Von Stefan Widmann, Produktmanager Romer Labs®

Spot On Ausgabe 8

Editorial Die Produktionsbereiche sauber halten:

Herausforderungen und Lösungsansätze Die Lebensmittelsicherheit hängt zu einem wesentlichen Teil von den hygienischen Bedingungen in den Einrichtungen der lebensmittelherstellenden Betriebe ab. Eine hohe Belastung mit nicht-pathogenen Bakterien kann die Haltbarkeit und Qualität von Lebensmitteln beeinträchtigen. Ebenso wichtig ist es für den Lebensmittelproduzenten, die Lebensmittelsicherheit zu gewährleisten, damit z. B. Lebensmittel frei von Pathogenen (wie Salmonellen und Listerien) sind, die beim Menschen Krankheiten verursachen können.

Die Produktionsbereiche sind daher sehr sauber und frei von Verunreinigungen zu halten, um die Kontamination des Endprodukts so weit wie möglich zu vermeiden.

Die Chemikalien, die hierbei ausgewählt werden, sind für die Erreichung der Hygieneziele von entscheidender Bedeutung. So werden Reinigungsmittel verwendet, um physische Verschmutzungen zu entfernen. Desinfektionsreiniger helfen, die Bakterienlast zu reduzieren, während Sterilisationsmittel verwendet werden, um Mikroorganismen abzutöten. Typischerweise wird in Produktionsbereichen eine Kombination dieser Produkte angewendet.

Probenahmesysteme wie Schwämme und Tupfer werden daher in der Regel mit Neutralisierungsbouillons vor der Probenahme angefeuchtet. Diese dienen dazu, die Wirkung von Chemikalienresten auf den untersuchten Oberflächen zu neutralisieren, so dass vorhandene Mikroorganismen in ihrem Wachstum nicht gehemmt werden und mit der entsprechenden Testmethode nachgewiesen werden können. Angesichts der zahlreichen Auswahlmöglichkeiten sollten Sie unbedingt darauf achten, die richtige Kombination von Chemikalien zu wählen, damit Ihr Hygieneprogramm effektiv ist.

In dieser Ausgabe von Spot On befasst sich mein Kollege Stefan Widmann mit den verschiedenen Testverfahren, anhand derer Lebensmittelhersteller die Einhaltung ihrer Hygienestandards überprüfen können. Er geht unter anderem auf die Unterschiede zwischen ATP-Tests und routinemäßigen Keimzahlbestimmungen ein und erläutert die Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen DNA-basierten und immunologischen Methoden.

Leider gibt es keine Wunderwaffe; Lebensmittelproduzenten müssen in der Regel auf eine Kombination verschiedener Methoden zurückgreifen. Kosten, Methodengenauigkeit, Benutzerfreundlichkeit und Auswertungsdauer sind entscheidende Faktoren bei der Auswahl der richtigen Verfahren zur Überprüfung der Produktionshygiene in Ihrem Betrieb.

Die Entscheidungen, die wir in Bezug auf Programme zur Hygiene- und Umgebungsüberwachung treffen, spielen für unser gemeinsames Ziel, den Verbrauchern sichere Lebensmittel zu bieten, eine große Rolle.

Wir hoffen, dass Sie Freude beim Lesen dieser Ausgabe von Spot On haben!

Meredith Sutzko Produktmanager, Romer Labs®

Ain E mea gPauzbi lni e k aot fi oRno vmoenr RLoam b se ®r L a b s ®

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Verifizierungstools:

Reinigung der Verarbeitungsbereiche Von Stefan Widmann, Produktmanager Romer Labs

Oberstes Gebot in der Lebensmittel­ industrie ist die Bereitstellung von Produkten, die für die Verbraucher sicher sind. Die Aufrechterhaltung eines sauberen und pathogenfreien Produktionsumfeldes ist ein entscheidender Punkt, um dieses Ziel zu erreichen. Die Kontamination mit pathogenen Umweltkeimen wie Listeria monocytogenes oder die Kreuzkontamination mit Keimen tierischen Ursprungs wie Salmonellen kann zu erheblichen Störungen im Betriebsablauf führen, insbesondere wenn Rückrufaktionen erforderlich sind. Jede Form von Kontamination kann den Ruf eines Unternehmens nachhaltig schädigen.

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Spot On Ausgabe 8

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ebensmittelhersteller sind beim Aufbau eines effektiven Hygienekonzepts mit einer Reihe von Entscheidungen konfrontiert und fühlen sich manchmal auf Grund der Vielfältigkeit bei der Auswahl überfordert. Hier geben wir einen Überblick über die wichtigsten Eigenschaften der Reinigungsmittel, Desinfektionsreiniger, Desinfektionsmittel und Neutralisationsmittel.

Wie sollte man bei der Reinigung der Produktionsbereiche vorgehen?

Zusammengefasst können lebensmittelverarbeitende Betriebe sicherstellen, dass ihre Verarbeitungsbereiche sauber und hygienisch sind, indem sie zuerst sichtbare Produktionsreste entfernen und anschließend einen Desinfektionsreiniger oder ein Desinfektionsmittel auftragen, um die Anzahl der verbleibenden Mikroorganismen zu reduzieren. Die mechanische oder physische Reinigung, die oft auch als „Vorreinigung“ bezeichnet wird, ist dabei ein sehr wichtiger erster Schritt bei jedem Reinigungsprogramm. Sie erhöht die Wirksamkeit des Desinfektionsmittels und erhöht in einigen Fällen die Log-Reduktionen.

Der Lebensmittelindustrie stehen eine Reihe von Produkten zur Reinigung bzw. Desinfektionsreinigung von Oberflächen zur Verfügung, die sich in Produktionsbereichen bewährt haben. In der Praxis wird ein einmal ausgewähltes Desinfektionsmittel oft jahrzehntelang verwendet. In Tabelle 1 sind die wichtigsten Überlegungen bei der Auswahl eines Desinfektionsreinigers aufgeführt. Im Folgenden werden die Unterschiede zwischen Reinigungsmitteln, Desinfektionsmitteln, Desinfektionsreinigern für die Lebensmittelumgebung, Sterilisations- und Neutralisationsmitteln dargestellt.

Tabelle 1. Eigenschaften des perfekten Desinfektionsreiniger

Leicht applizierbar

Für den Menschen ungiftig oder nur gering giftig Kein oder unauffälliger Geruch Hohe Eindringtiefe Nicht ätzend

Lange Haltbarkeit

Bei hartem Wasser anwendbar

Mit anderen Reinigungschemikalien kompatibel Schnelle Wirkung Restaktivität

Breites Anwendungsspektrum (grampositive und gramnegative Bakterien, Hefen, Schimmelpilze und Viren) Wirtschaftlich (kostengünstig)

Quelle: Romer Labs

Eine Publikation von Romer Labs®

Reinigungsmittel Ein Reinigungsmittel ist ein Detergens, das bei der physischen oder chemischen Beseitigung von Schmutz, Staub, organischen Substanzen und Allergenrückständen hilft. In der Regel ist es für die Verwendung in bestimmten Bereichen (z. B. Böden, Wände, Tische) vorgesehen und kann auf Oberflächen verwendet werden, die mit Lebensmitteln in Kontakt kommen. Reinigungsmittel können die Keimzahl zwar erheblich reduzieren, töten oder beseitigen die Mikroorganismen aber nicht.

Desinfektionsreiniger

Die mechanische oder physische Reinigung stellt bei jedem Reinigungs­ programm den ersten wichtigen Arbeitsschritt dar.

Desinfektionsreiniger reduzieren die Keimzahl deutlich, beseitigen aber nicht alle Mikroorganismen. Sie werden in lebensmittelverarbeitenden Betrieben in der Regel als fester Bestandteil des HACCP Konzepts eingesetzt. Tabelle 2 enthält eine Liste verschiedener Desinfektionsreiniger.

Es gibt zwei Arten von Desinfektionsreinigern: 1. Desinfektionsreiniger mit desinfizierenden Eigenschaften für Lebensmittelkontaktflächen; diese sind für Oberflächen geeignet, die mit Lebensmitteln in Kontakt kommen (auch als food contact surfaces — FCS bezeichnet).

2. Desinfektionsreiniger, die nicht für Lebensmittelkontaktflächen geeignet sind. Sie dürfen nur für Oberflächen verwendet werden, die nicht mit Lebensmitteln in Kontakt kommen (auch als Non-FCS bezeichnet).

Desinfektionsmittel Generell weisen Desinfektionsmittel eine Kombination verschiedener Wirkungsspektren auf und zeichnen sich durch eine bakterizide, fungizide, viruzide, mykobakterizide, tuberkulozide bzw. sporizide Wirkung aus. Für die Prüfung der Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln gibt es verschiedene Vorschriften. Mit diesen Tests wird im Allgemeinen die Konzentration des Desinfektionsmittels nachgewiesen, die zur Abtötung bestimmter Mikroorganismen erforderlich ist. Die Verwendung von Desinfektionsmitteln ist für Oberflächen, die häufig berührt werden, sowie für Oberflächen mit potenzieller Keimbelastung geeignet.

Sterilisationsmittel Sterilisationsmittel reduzieren nicht nur die Keimzahl, sondern töten auch alle Arten von Mikroorganismen ab. Es darf kein Keimwachstum in Testproben nachgewiesen werden bzw. das Keimwachstum muss um 99,9999 % (106 log) reduziert werden. Zu den Sterilisationsmitteln gehören spezielle Chemikalien wie Glutaraldehyd, Formaldehyd und Peroxyessigsäure. Der Begriff Sterilisation bezieht sich auch auf die

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Reinigungsmittel können die Keimzahl zwar erheblich reduzieren, sie töten oder beseitigen die Mikroorganismen aber nicht.

nicht-chemische Eliminierung von Mikroorganismen, entweder durch trockene Hitze (wie in Öfen) oder feuchte Hitze (durch Dampfdruck oder Autoklavieren).

Neutralisationsmittel: Für welches sollte man sich entscheiden?

Probenahmestellen können mit Resten von Desinfektionsmitteln verunreinigt sein, die während des Reinigungsprozesses verwendet werden. Lebensmittelkontaktflächen werden nach der Desinfektion oft mit frischem Wasser abgespült und sollten daher keine oder nur geringe Mengen an Desinfektionsmitteln enthalten.

Manchmal vernachlässigen die Betreiber allerdings das Nachspülen von Abflüssen, Böden, Wänden und Maschinenteilen, so dass diese weiterhin Desinfektionsmittelrückstände auweisen. Das mikrobielle Wachstum wird zwar durch diese Chemikalien gehemmt, aber die verbleibenden Mikroorganismen leben noch und stellen eine potenzielle und permanente Gesundheitsgefahr dar.

Für die mikrobiologische Probenahme ist es wichtig, die Wirkung von Desinfektionsmittelrückständen zu reduzieren oder am besten ganz zu verhindern. Aus diesem Grund werden die Probenahmesysteme mit Lösungen angefeuchtet, die neutralisierend wirken. Zu den wichtigs-

ten Neutralisationsmedien gehören die Dey-Engley-Neutralisierungsbouillon (DE), die Letheen-Bouillon (LB) und sogenannte „Neutralisationspuffer“ (NB).

Bei der Wahl der richtigen Neutralisationslösung sind zwei Faktoren von entscheidender Bedeutung: die Toxizität der Lösung selbst und der Wirkungsgrad der zu neutralisierenden bioziden Wirkstoffe. Wie in Tabelle 3 dargestellt, ist jedem Biozid ein entsprechendes Neutralisationsmittel zugeordnet. Je mehr zusätzliche Neutralisationsmittel unnötigerweise verwendet werden, desto größer ist die Gefahr, die Ziel-Mikroorganismen zu schädigen.

Die Art des für die mikrobielle Probenahme verwendeten Neutralisationsmittels hängt zum einen davon ab, welches Desinfektionsmittel verwendet wird, zum anderen ist die Marktverfügbarkeit ein entscheidender Faktor. Eines der am häufigsten verwendeten Medien ist die Dey-Engley-Neutralisierungsbouillon. 1970 von Dey und Engley entwickelt, hat sie sich zu einer der wirksamsten Neutralisierungsbouillons entwickelt, was vor allem daran liegt, dass sie für ein breites Spektrum an Desinfektionsmitteln geeignet ist.

Nicht ohne Grund wird sie von der internationalen

Tabelle 2. Chemikalien, die zur Desinfektionsreinigung verwendet werden Chemikalie

MikroorganismenWirkspektrum

Chlor (am gebräuchlichsten: Calcium- und Natriumhypochlorite)

Bakterien, Pilze und Viren

Mischungen aus Wasserstoffperoxid und Peroxyessigsäure Saure anionische Desinfektionsreiniger

Carbonsäure (FettsäureDesinfektionsreinigern) Wasserstoffperoxid

Quartäre Ammoniumverbindungen Iodophore

Quelle: Romer Labs

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Bakterien, Pilze, Viren, Mycobacterium tuberculosis Bakterien, Pilze, Viren, Mycobacterium tuberculosis Bakterien, Pilze, Viren, Mycobacterium tuberculosis Bakterien, Pilze und Viren Vegetative Bakterien Bakterien, Pilze und Viren

Wirksam gegen Sporen

Wirksam gegen Biofilme

Resistente oder weniger empfindliche Mikroorganismen

JA

NEIN

Cryptosporidium spp., Giardia lamblia, Salmonella spp., Methicillinresistente Staphylococcus spp.

JA

JA

JA

JA

JA

JA

JA

NEIN

Listeria spp. (Biofilm)

NEIN

NEIN

Keine Resistenz

NEIN

JA

Biofilme von Listeria spp. (längere Einwirkzeit nötig), Salmonella spp. und Escherichia coli Biofilme von Listeria spp. (längere Einwirkzeit nötig), Salmonella spp. und Escherichia coli Biofilme von Listeria spp. (längere Einwirkzeit nötig), Salmonella spp. und Escherichia coli

Begrenzt gegen gramnegative Bakterien wirksam

Spot On Ausgabe 8

Bei der Wahl der

Tabelle 3. Wirksamkeit und Toxizität von chemischen Neutralisationsmitteln

Biozid-Klasse Glutaraldehyd, Quecksilberverbindungen Phenole, Alkohol, Aldehyde, Sorbat Aldehyde Quartäre Ammoniumverbindungen (QACs), Parabene, Bisbiguanide EDTA QACs, Iod, Parabene Quecksilberverbindungen Quecksilberverbindungen, Halogene, Aldehyde

Quelle: Romer Labs

Neutralisationsmittel Hydrogensulfat Verdünnung Glycin

Neutralisationsmittel ist giftig für: Nicht-sporenbildende Bakterien

Wachsende Zellen

Mg+2- oder Ca+2-Ionen Polysorbat (Tween)* Thioglycolat Natriumthiosulfat

Staphylococcus spp. und Sporen Staphylococcus spp.

Lecithin

Vereinigung amtlicher Chemiker, der AOAC International, empfohlen. Der Neutralisierungsbouillon wurden eine Zuckerquelle und ein pH-Indikator hinzugefügt, weshalb sie sich auch für Sterilitätstests eignet. Ein Abfall des pH-Werts deutet auf das Wachstum von zuckerfermentierenden Bakterien hin, wobei sich die Farbe der Lösung von violett zu gelb ändert. Diese Farbänderung ist jedoch nicht unbedingt hilfreich, da sie durch den Nachweis bzw. die Keimzahlbestimmung im Anschluss an die Probenahme überflüssig wird.

legende Aspekte berücksichtigt werden: die Toxizität der Lösung selbst und die Wirksamkeit

Schlussfolgerung: maßgeschneiderte Lösungen Welche Chemikalien zur Reinigung der Verarbeitungsbereiche und welche Neutralisationsmittel zur mikrobiellen Probenahme verwendet werden, ist letztendlich in hohem Maße von den Gegebenheiten im jeweiligen Betrieb abhängig.

Um zu ermitteln, welche Chemikalien und Verfahren am besten geeignet sind, sind betriebsinterne Bewertungen erforderlich.

Wirksamkeit durch hartes Wasser beeinträchtigt

Wirksamkeit durch organische Substanzen beeinträchtigt

Ätzend

Toxizität

Geruch

Reizend für Augen und Atemwege.

Brennende Schmerzen, Entzündungen und Blasenbildung.

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Kann Hautreizungen verursachen.

Reizend für Atemwege und Augen.

Abhängig von den Netzmitteln. Kann die Haut bleichen und Reizungen verursachen.

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tralisationslösung müssen zwei grund­

Bakterien

Rest­ aktivität

Abhängig von den Netzmitteln. Stark ätzend und extrem schädlich für die Haut. Können Blasenbildung, Juckreiz, Schuppung oder Hautverbrennungen verursachen.

Abhängig von den Netzmitteln. Stark ätzend und extrem schädlich für die Haut. Können Blasenbildung, Juckreiz, Schuppung oder Hautverbrennungen verursachen.

Abhängig von den Netzmitteln. Stark ätzend und extrem schädlich für die Haut. Können Blasenbildung, Juckreiz, Schuppung oder Hautverbrennungen verursachen.

geeigneten Neu­

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der zu neutralisie­ renden bioziden Wirkstoffe.

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Schnellverfahren für Oberflächen-Hygienetests:

Genauer betrachtet Von Stefan Widmann, Produktmanager, Romer Labs

Sie müssen Ihre strengen Hygienestandards erfüllen, und die Einhaltung der Standards muss wiederum verifiziert werden. Stefan Widmann erläutert ausführlich die gängigsten Tests für Reinigungs- und Hygienekontrollen von Oberflächen, damit Sie das für Ihren Betrieb geeignetste Verfahren auswählen können.

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ängige Testverfahren zur Umgebungsprüfung lassen sich allgemein in zwei Gruppen einteilen, von denen jede einen anderen Ansatz verfolgt: entweder die Prüfung auf Rückstände oder die Prüfung auf Mikroorganismen. In diesem Beitrag gehen wir auf die verschiedenen Technologien der jeweiligen Ansätze ein, auf ihre Funktionsweise sowie auf ihre Anwendbarkeit und Vorteile.

Rückstandsuntersuchungen ATP-Tests

Foto: shutterstock_ Sirirat

Adenosintriphosphat (ATP) ist ein Nukleotid, das in der Zelle als Coenzym zur Bereitstellung von Energie dient. Man kann es sich als die molekulare „Währungseinheit“ für den Energietransfer innerhalb aller lebenden Zellen vorstellen. Sämtliche Vorgänge auf zellulärer Ebene, einschließlich der Synthese von Proteinen und Membranen, der Zellbewegung und der Zellteilung, benötigen Energie. Bei der Spaltung von ATP in Adenosindiphosphat und Adenosinmonophosphat wird Energie übertragen.

Die Hydrolyse der kovalenten Phosphatbindungen setzt Energie frei, die für Reaktionen genutzt wird.

Kommerzielle ATP-Testsysteme nutzen die in der Natur weit verbreitete Luciferin-Luciferase-Reaktion, um mit der aus ATP freiwerdenden Energie sichtbares Licht zu erzeugen. Je mehr Licht emittiert wird, desto mehr ATP ist vorhanden, was auf einen höheren Gehalt an Lebensmittelrückständen oder Mikroorganismen hinweist. Dabei darf ein wichtiger Punkt nicht übersehen werden: Da diese Systeme häufig zur Validierung der Reinigungseffizienz eingesetzt werden, sind auch Desinfektionsmittel häufig an der Reaktion beteiligt. Diese Desinfektionsmittel können zwar die Zellwände der Mikroorganismen schädigen, die ATP in den Zellen bleibt jedoch erhalten. Aus diesem Grund besteht nicht immer eine reelle Korrelation zwischen den auf einer Oberfläche vorhandenen lebenden Organismen und den Ergebnissen der ATP-Messung.

ATP-Methoden haben noch einen weiteren potenziellen Nachteil: Je nachdem, welche Lebensmittelrückstände nachgewiesen werden sollen, bestehen Unterschiede im Hinblick auf ihre Anwendbarkeit. So eignet sich beispielsweise ein ATP-Test nicht für den Nachweis von Weizenmehl, einer Matrix mit hohem Verarbeitungsgrad, deren Rückstände nur wenig ATP enthalten.

Rückstände von Fleischprodukten enthalten jedoch hohe Mengen an ATP.

Verfahren zum Nachweis von Gesamtprotein Ein weiteres Konzept in der Rückstandsuntersuchung ist der Nachweis von Gesamtprotein, wobei Eine Publikation von Romer Labs®

nicht die Mikroorganismen selbst, sondern Aminosäuren, Peptide und Proteine nachgewiesen werden. Diese Tests sind sehr schnell durchführbar und das Ergebnis liegt innerhalb von einer Minute vor. Allerdings ist die Methode nicht empfindlich genug, um Proteine von einzelligen Mikroorganismen nachzuweisen. Aus diesem Grund lässt ein negatives Ergebnis bei dieser Art von Test nicht auf die Abwesenheit von Mikroorganismen schließen. Darüber hinaus eignet sich die Methode nicht dazu, bestimmte Pathogene nachzuweisen.

Dennoch haben Testkits für den Proteinnachweis ihre Berechtigung, da sie auf schnelle und kostengünstige Weise Aufschlüsse über die Reinigungseffizienz geben.

Kommerzielle ATP-Testsysteme nutzen die LuciferinLuciferase-Reaktion; je mehr Licht emittiert wird, desto mehr ATP ist in der Probe vorhanden.

Nachweis von Mikroorganismen Kulturmethoden mit chromogenen Medien Dies sind die klassischen Methoden für das Hygienemonitoring in Verarbeitungsbereichen. Kulturmethoden werden in der ISO 18593 „Mikrobiologie der Lebensmittelkette — Horizontales Verfahren für Probenahmetechniken von Oberflächen“ behandelt.

Nicht-selektive und selektive Medien können zum Nachweis spezifischer Organismen verwendet werden.

Methoden, die auf chromogenem Agar basieren Grundsätzlich gibt es zwei Möglichkeiten, agarbasierte Methoden durchzuführen; entweder direkt oder indirekt über einen Verdünnungsschritt. Beide Methoden haben den Vorteil, dass sie quantitative Ergebnisse liefern.

Bei direkten Verfahren wird der Agar von Platten oder Dip-Slides direkt auf die zu untersuchende Oberfläche gedrückt. Kontaktplatten haben die Form von klassischen Petrischalen und typischerweise eine Oberfläche von 25 cm2. Dip-Slides sind doppelseitige Agarträger, die durch ein Kunststoffröhrchen geschützt sind und eine Agarfläche von 7-10 cm2 auf jeder Seite des Trägers aufweisen, was einer Gesamtfläche von 14-20 cm2 entspricht. Diese Systeme benötigen keine zusätzliche Ausrüstung und die Probenahme ist sehr schnell durchgeführt. Allerdings eignet sich diese Methode nicht für alle Probeflächen.

Tupfer, Tücher und Schwämme sind Hilfsmittel für die indirekte Probenahme. Nachdem ein Abstrich der zu prüfenden Oberfläche mittels Probenahmetools genommen wird, werden diese zur Verdünnung in eine Pufferlösung eingetaucht, die dann in herkömmlichen Petrischalen ausplattiert wird. Mithilfe dieser indirekten Methode können sowohl größere Oberflächen als auch schwer zugängliche, engen Stellen und Ritzen

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Für die Probenahme im Lebensmittelbereich stehen mehrere Hilfsmittel zur Verfügung, von Dip-Slides (links) bis hin zu Schwämmen (rechts).

Bei direkten Verfahren wird der Agar von Platten oder Dip-Slides direkt auf die zu untersuchende Oberfläche gedrückt.

beprobt werden. Indirekte Methoden haben jedoch auch Nachteile: Es sind mehr Arbeitsschritte erforderlich und es werden zusätzliche Verbrauchsmaterialien benötigt. Für den Pathogennachweis wird in der ISONorm die Beprobung einer Fläche von 1000 cm2 bis 3000 cm2 empfohlen; eine so große Fläche kann nur mit Schwämmen oder Tupfern bzw. Tüchern beprobt werden.

Nachweismethoden auf der Basis chromogener Flüssigmedien Diese Kulturmethode wird nur für den qualitativen Nachweis bestimmter Organismen oder Organismengruppen eingesetzt. Sie liefert keine quantitativen Ergebnisse, da die Mikroorganismen nicht gezählt werden. Bei Verfahren, die auf Flüssigmedien basieren, werden die zur Probenahme verwendeten Tupfer anschließend in Röhrchen getaucht, die mit Selektivmedien gefüllt sind. Die Proben müssen durchschnittlich mindestens 48 Stunden lang inkubiert werden, um ein negatives Ergebnis sicher zu bestätigen. Positive Proben können anhand der Farbänderung oder Fluoreszenz der angereicherten Probe bei einer bestimmten Wellenlänge identifiziert werden. Diese Tests sind in der Regel einfach durchzuführen und kostengünstig.

Der Nachteil von Systemen auf der Basis von Flüssigmedien ist ihre geringe Empfindlichkeit. Diese resultiert aus der Verwendung hochselektiver Medien, die das Wachstum anderer Bakterien gezielt unterdrücken.

Bei dieser Methode besteht ein gewisses Risiko: Bakterien in der Verarbeitungsumgebung sind in der Regel bereits gestresst (geschädigt) und können absterben, wenn die Anreicherungsmedien zu selektiv sind. Andererseits kann es bei zu geringer Selektivität schwierig sein, bestimmte Mikroorganismen allein mithilfe selektiver Flüssigmedien nachzuweisen. Die Interpretation der Ergebnisse kann sich als schwierig erweisen

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und je nach Untersucher unterschiedliche Resultate liefern, da die Farbänderung bzw. die Fluoreszenz nicht immer kräftig genug ist, um ein eindeutiges Ergebnis erkennen zu lassen. Der Hauptvorteil von Methoden auf Basis von Flüssigmedien besteht darin, dass sie einfach durchzuführen und erschwinglich sind.

DNA-basierte Methoden Es gibt drei verschiedene DNA-basierte Methoden: die isothermale DNA-Amplifikation, Echtzeit- und traditionelle PCR. Bei der Echtzeit-PCR oder Realtime PCR handelt es sich um eine etablierte Methode zum Nachweis von DNA oder RNA, während die isothermale Amplifikation eine neuere Technologie ist. Die isothermale Amplifikation hat gegenüber der Realtime-PCR klare Vorteile: So wird für die isothermale Amplifikation kein Thermocycler benötigt, da die Reaktion bei konstanter Temperatur stattfindet. Die kostengünstigste, aber auch arbeitsintensivste DNA-basierte Methode ist die traditionelle PCR, da für den Nachweis amplifizierter DNA oder RNA nach der Amplifikation ein Hybridisierungsschritt oder die Verwendung eines unspezifischen Farbstoffs notwendig ist.

Allen Verfahren ist gemeinsam, dass bestimmte Teile der DNA oder RNA von spezifischen Primern erkannt und anschließend mithilfe des Enzyms Polymerase vervielfältigt werden. Die Empfindlichkeit dieser Methoden ist ausgesprochen hoch, und die Zielregionen in der DNA oder RNA sind hinreichend bekannt um größtmögliche Spezifiziät zu gewährleisten. Die größte Einschränkung dieses Systems ist, dass es auf Enzymbasis funktioniert. Enzyme benötigen spezifische Pufferlösungen, um einwandfrei zu funktionieren.

Inhaltsstoffe von Desinfektionsmitteln können die Enzymaktivität stark beeinträchtigen, was zu falsch negativen Ergebnissen führen kann. Darüber hinaus sind bei diesem Verfahren mehrere Pipettierschritte unter Spot On Ausgabe 8

Verwendung einer Mikropipette erforderlich, was eine Fehlerquelle darstellen kann.

Der größte Vorteil DNA-basierter Methoden besteht darin, dass aufgrund der hohen Sensitivität des Verfahrens nicht-selektive Medien für den Anreicherungsschritt verwendet werden können. Nicht-selektive Medien sind kostengünstig, bei verschiedenen Anbietern erhältlich und erfordern die niedrigste biologische Schutzstufe (Stufe 1). Mithilfe DNA-basierter Methoden ist es zudem möglich, geringe Mengen von Pathogenen auf Oberflächen der Lebensmittelumgebung auch ohne Anreicherung nachzuweisen. Allerdings ist die Empfindlichkeit im Vergleich zu Methoden mit Anreicherung gering. Abschließend sei darauf hingewiesen, dass falsch positive Ergebnisse aufgrund von DNA-Fragmenten bereits abgetöteter Pathogene ein großes Problem darstellen können.

Immunologische Verfahren Immunoassays sind Testsysteme, bei denen Antikörper zum Nachweis von Mikroorganismen in Lösungen verwendet werden. Diese Antikörper können an Antigene, z. B. Lipopolysaccharide auf der Zelloberfläche oder Geißeln bestimmter Mikroorganismen, binden.

Nach einem ein- oder mehrstufigen Anreicherungsverfahren unter Verwendung selektiver Medien werden Zellen von Pathogenen wie beispielsweise Listerien mithilfe spezifischer antikörperbasierter Testsysteme nachgewiesen.

ELISA-Tests (enzyme-linked immunosorbent assay) waren die ersten Verfahren, bei denen spezifische Mikroorganismen mithilfe immunologischer Technologien nachgewiesen wurden. Der ELISA ermöglicht die Quantifizierung des nachgewiesenen Analyten.

Da jedoch ein Anreicherungsschritt erforderlich ist, ist die Berechnung der Anfangskonzentration nicht möglich. Nur geschultes Personal kann die bei der Durchführung von ELISA-Tests erforderlichen mehrfachen

Transfer- und Waschschritte durchführen. Die Entwicklung von Lateral-Flow-Tests, auch Streifen-Tests genannt, brachte die Lösung für dieses Problem: Das immunologische Nachweisverfahren wurde wesentlich vereinfacht und verkürzt und die zahlreichen Arbeitsschritte der ELISA-Tests entfielen. Lateral-Flow-Tests mit selektiven Antikörpern, die in Kombination mit leistungsstarken Anreicherungsmedien verwendet werden, liefern schnelle und genaue Ergebnisse, ohne dass teure Geräte oder Schulungskosten erforderlich sind.

Schlussfolgerung Die Wahl der richtigen Verfahren für Hygienetests ist nicht immer einfach. Die Entscheidung wird durch mehrere praktische Überlegungen beeinflusst: Wie viele Probestellen müssen beprobt werden und wie wichtig ist ein hoher Testdurchsatz? Wie können die Prüfer die Zeit bis zum Ergebnis optimieren, zumal die Untersuchung auf bestimmte pathogene Bakterien nicht jeden Tag durchgeführt wird und eher eine Überwachungsfunktion darstellt als ein Verfahren zur Qualitätskontrolle? Sind quantitative Ergebnisse erforderlich oder sind Anwesenheits-/Abwesenheits-Tests ausreichend? Da es nach wie vor nicht möglich ist, Keimzahlen unmittelbar nach der Reinigung zu bestimmen, müssen sich die Hersteller auf ATP- oder proteinbasierte Testsysteme verlassen. Diese dienen als grober Indikator dafür, ob es sicher ist, mit der Produktion zu beginnen, je nachdem, ob ATP oder Protein vorhanden ist oder nicht.

Auch nationale Bestimmungen können diese Entscheidung beeinflussen. Anreicherungsbasierte DNAoder immunologische Methoden sind anderen Verfahren in Bezug auf Sensitivität und Selektivität überlegen und für den Pathogennachweis am besten geeignet. Für den Nachweis und die Zählung von Indikatororganismen oder das generelle Hygienemonitoring können kostengünstigere Systeme wie Dip-Slides oder ATP-Systeme verwendet werden.

Tabelle 1. Vergleich von Technologien zur Überprüfung der Umgebungshygiene Methode

Sensitivität Selektivität Labor Kosten Analysendauer Quantitatives Ergebnis

Quelle: Romer Labs

ATPNachweis niedrig niedrig niedrig mittel sofort ja

niedrig niedrig niedrig niedrig

Chromogene Agarnährmedien mittel mittel mittel niedrig

Chromogene Flüssignährmedien mittel mittel mittel niedrig

ja

ja

ja

Protein

sofort

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langsam

langsam

ELISA

LFD

hoch hoch hoch mittel

hoch hoch mittel mittel

schnell nein

schnell nein

Die gängigen Testverfahren zur Umgebungsprüfung lassen sich allgemein in zwei Gruppen mit jeweils unterschiedlichem Ansatz unterteilen: die Prüfung auf Rückstände und die Prüfung auf Mikroorganismen.

DNA/ RNA sehr hoch hoch hoch hoch sehr schnell nein

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