Vermeidung von falsch-positiven Pathogen-Analysen

Ausgabe 3

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Ein Magazin von Romer Labs®

Vermeidung von falsch-positiven Pathogen-Analysen Acht Mythen der Pathogen-Analyse Schnellnachweissystem hilft bei der Reduzierung von Salmonella Enteritidis Infektionen in Eiern in der USA

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Inhalt

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Vermeidung von falsch-positiven Pathogen-Analysen Kostspielige und langwierige Nachuntersuchungen zur Vermeidung von falsch-positiven Ergebnissen können einfach reduziert werden.

Stefan Widmann, Produktmanager bei Romer Labs®

Acht Mythen der Pathogen-Analyse

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Was spricht gegen effiziente Pathogen-Analysen in Ihrem Unternehmen?

Spot-On betrachtet einige Mythen rund um das Thema Pathogen-Nachweis.

Meredith Sutzko und Stefan Widmann, Produktmanager bei Romer Labs®

Spot On ist eine kostenfreie, vierteltjährliche Publikation der Romer Labs Division Holding GmbH. ISSN: 2414-2042

Editors: Cristian Ilea, Simone Schreiter

Mitwirkende: Simon M. Shane, Mark Muldoon, Meredith Sutzko, Stefan Widmann Recherche: Kurt Brunner

Verleger: Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Austria Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com

©Copyright 2023, Romer Labs® All rights reserved. No part of this publication may be reproduced in any material form for commercial purposes without the written permission of the copyright holder except in accordance with the provisions of the Copyright, Designs and Patents Act 1998.

Foto: Kartinkin77

Graphik: Reinhold Gallbrunner

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Schnellnachweissystem hilft bei der Reduzierung von Salmonella Enteritidis Infektionen in Eiern in der USA

Die Überwachung von Salmonella Enteritidis ist für die Sicherheit der gesamten Produktionskette bei Eiern entscheidend. Sehr empfindliche und spezifische Lateral-Flow Immunoassays, z. B. RapidChek® Select™, können dabei die Kosten durch hochgenaue Screening-Ergebnisse drastisch reduzieren.

Simon M. Shane, FRCVS, BVSc, PhD, MBL, ACPV

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Spot On Ausgabe 3

Editorial Verbesserung von Lebensmitteltests: Rettung durch Viren!

Laut einem aktuellen Bericht der Weltgesundheitsorganisation (WHO) führen Lebensmittelinfektionen, verursacht durch die Einnahme von verschiedenen Bakterien, Viren, Parasiten, Toxinen und Chemikalien, geschätzt zu über 600 Millionen Erkrankungen weltweit pro Jahr (1 von 10 Personen) und über 420.000 Toten. 30 Prozent davon treten bei Kleinkindern unter 5 Jahren auf. Pathogene Bakterien wie E. Coli O157: H7, Salmonellen und Listeria monocytogenes, sind für einen Großteil der Krankheiten in diesem Bereich verantwortlich.

In vielen Regionen hat die Lebensmittelindustrie ein Erzeuger-VerbraucherKonzept für die Überwachung bakterieller Erreger als Bestandteil ihrer Gefahren-Präventionsprogramme etabliert. Dieses beinhaltet sowohl die Überprüfung der Produktions- und Lebensmittelverarbeitung, als auch Umgebungskontrollen und eine Lebensmittelendkontrolle auf Krankheitserreger. Das erhöhte Probenvolumen führte zu der Notwendigkeit, immer schnellere und doch höchst zuverlässige Testmethoden zu entwickeln, die gewährleisten, dass nur gesunde und nahrhafte Nahrungsmittel den Weg zum Teller des Verbrauchers finden. Nachdem diese Schnellmethoden weltweit in hohem Maße bei der Überwachung von Lebensmittelpathogenen Einzug gehalten haben (ca. 50 % aller Tests), sind nun innovative Wege erforderlich, um ihre Genauigkeit und Zuverlässigkeit sicherzustellen.

In dieser Ausgabe von Spot On werden verschiedene Aspekte des Nachweises von Pathogenen in der Lebensmittelindustrie beleuchtet. In einem der folgenden Artikeln wird z. B. eine neue Technologie vorgestellt, in der Bakteriophagen (bakterielle Viren, auch "Phagen" genannt) als Ersatz von Antibiotika dienen. Sie kontrollieren das Wachstum von der kompetitiven apathogenen Begleitflora, die oft in Lebensmittelproben störend wirkt, und sichern auf diese Weise den schnellen und genauen Nachweis von pathogenen Keimen. In einem späteren Artikel stellt Dr. Simon Shane, ein führender Wissenschaftler aus der Geflügelforschung, seine Sicht auf SchnelltestMethoden und deren direkte Unterstützung an kritischen Punkten der Lebensmittelsicherheit dar. Ein weiterer Artikel beschäftigt sich mit der Frage, wie Pathogen-Schnelltests effizient und sinnvoll als Vorort-Analyse auf Lebensmittel-Pathogene in einer Fabrik implementiert werden können.

Wir wünschen Ihnen viel Vergnügen mit der neuen Ausgabe des Spot On und den neuesten Romer Lab Innovationen im Bereich Lebensmittelsicherheit.

Mark Muldoon Director of Research and Development, Romer Labs Technology, Inc

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Vermeidung von falsch-positiven Pathogen-Analysen

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Spot On Ausgabe 3

Kreuzreagierende Bakterien führen oft zu falsch- positiven Ergebnissen und hemmen das Wachstum des gesuchten Pathogens. Sie werden durch den Einsatz von Phagen in ihrem Wachstum stark inhibiert, so dass kostspielige und langwierige Nachuntersuchungen auf falschpositive Ergebnisse beim PathogenNachweis deutlich minimiert werden.

Stefan Widmann, Produktmanager, Romer Labs

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alsch-positive Ergebnisse verursachen hohe Extrakosten für Lebensmittelproduzenten, ganz abgesehen von dem großen Zeitverlust, der bei der Bestätigung der Ergebnisse entsteht. Entsprechend den aktuellen ISO/ FDA/USDA Standards, beginnt der Nachweis zur Bestätigung der vorläufigen Ergebnisse mit dem Ausstrich der Voranreicherung der auffälligen Probe auf entsprechenden Selektivnährböden.

Diese Platten werden zwei Tage inkubiert, um das positive Ergebnis zu bestätigen. Die benötigten Temperaturen unterscheiden sich von denen der Routineproben, so dass hierfür meistens noch ein zweiter Inkubator benötigt wird und es im Zweifel zu weiteren Verzögerungen im Laborablauf kommt.

Ein weiterer Nachteil des Bestätigungsschritts ist, dass die selektiven Nährböden deutlich teurer sind und nur eine sehr begrenzte Haltbarkeit besitzen, so dass eine Bevorratung schlecht möglich ist. Zusammengefasst erfordert der Nachweis von falsch-positiven Ergebnissen unnötig viel Zeit und Geld.

Das Problem falsch-positiver Ergebnisse

Falsch-positive Ergebnisse können mit jeder PathogenNachweis Methode auftreten.

Falsch-positive Ergebnisse können bei jeder Pathogen-Nachweismethode auftreten. Es spielt dabei keine Rolle, ob eine DNS, biochemisch oder immunologisch (ELISA) basierte Technologie verwendet wird. Alle kämpfen mit dem gleichen Problem: höhere Sensitivität versus höhere Selektivität. Ein möglicher Lösungsansatz ist die Eliminierung nicht gesuchter, kreuzreagierender Bakterien vor dem Nachweis z. B durch den Einsatz von Antibiotika.. Leider fehlt den Antibiotika für die meisten Anwendungen die Selektivität.

Die Herausforderung: Steigerung der Selektivität ohne Zeitverlust Bakteriophagen (oder Phagen) sind die am häufigsten vorkommenden Organismen in unserer Umgebung und in großen Mengen in Wasser, Lebensmitteln und verschiedenen anderen Quellen vorhanden. Sie wurden im Jahre 1917 von dem kanadischen Biologen Félix Hubert d'Hérelle entdeckt. Ihr Name bedeutet „Bakterien-Esser”, was ihre Funktion in etwa beschreibt.

Bakteriophagen haben eine sehr hohe Wirtsspezifität bezüglich der von ihnen angegriffenen Bakterien. Der große Vorteil bei der Verwendung von Phagen ist, dass sie unschädlich für Menschen, Tiere und Pflanzen sind.

Tatsächlich werden Phagen von Menschen und Tieren durch Nahrung oder Wasser täglich in großen Mengen ohne negative Auswirkungen konsumiert. Phagen sind „die natürlichen Feinde” der Bakterien, für die sie spezifisch sind. In verarbeitetem Fleisch und FleischproEin Magazin von Romer Labs®

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Kreuzreagierende Bakterien können mit Hilfe von Phagen eliminiert werden.

dukten können in etwa 108 Phagen pro Gramm nachgewiesen werden. Eine ähnlich hohe Konzentration von Phagen ist auch in dem menschlichen Magen-DarmTrakt vorhanden. Bevor Antibiotika weitverbreitet zur Anwendung kamen, wurden Phagen zur Behandlung bakterieller Infektionen verwendet.

Seit Jahrzehnten benutzt Die sogenannte Phagen-Therapie wurde in den USA und der ehemaligen UdSSR entwickelt. Während man sich im Westen vor allem auf die Entwicklung von Antibiotika konzentrierte, wurde im ehemaligen Sowjetblock die Forschung an der Bakteriophagentherapie weitergeführt. In der Ära nach dem kalten Krieg wurden Forschungsaktivitäten im Bereich der Phagen vor allem in Georgien fortgesetzt, wo sie noch heute durchgeführt werden.

Phagen zeichnen sich durch eine sehr hohe Spezifität gegenüber ihren Wirts-Bakterien aus, ein Merkmal, das interessante Anwendungsmöglichkeiten in der Lebensmittel- und Biotech-Branche eröffnet. Phagen werden heutzutage bereits als Hilfsmittel dazu genutzt, um Pathogene in Lebensmitteln zu eliminieren, um Bakterien zu detektieren, oder, wie im Romer Labs SELECT™-Medium-System, um kompetitive Bakterienflora zu verringern oder sogar zu eliminieren, dies um das Wachstum der gesuchten Bakterien zu fördern. Sie sind selektiver als Antibiotika, und es konnte bis jetzt keine Resistenzbildung von Bakterien gegenüber Phagen nachgewiesen werden.

Kreuzreaktive Bakterien identifizieren

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Um die Phagen zu identifizieren, die in selektiven Anreicherungen oder andere Anwendungen in der Lage sind, die Begleitflora abzutöten, ist die entscheidende Frage: Wie kann ich sie finden?

Ein guter Ansatzpunkt sind Untersuchungen von Lebens- oder Futtermitteln, da diese in der Regel Bakterien enthalten, welche während der Anreicherung von Pathogenen gehemmt werden sollen. Bakterienstämme, die nur entfernt mit dem gesuchten Patho-

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genen verwandt sind, sind weniger interessant als Ziele für die Phagen, sondern jene mit hohem Verwandtheitsgrad, da gerade diese falsch-positive Ergebnisse hervorrufen können.

Gentechnik? Weit gefehlt!

Nachdem die möglicherweise kreuzreagierenden Bakterien identifiziert wurden, ist der nächste Schritt nach einem Phagen zu suchen, der diese angreifen kann. Phagen kommen überall in unserer Umwelt vor, z. B. in Abwässern, Oberflächenwasser, Nahrung und im Boden. Der einfachste Weg, sie aus einer festen Matrix zu extrahieren, ist die Zentrifugation. Die Phagen reichern sich hierbei im Überstand an, wohingegen andere Komponenten wie z. B. Bakterien als Pellet abgetrennt werden.

Im Überstand befindet sich dann eine heterogene Mischung aus verschiedenen Phagen. Als nächstes werden die verschiedenen Phagen isoliert und der spezifische, bakterielle Wirt muss identifiziert werden. Dies kann z. B. mit Hilfe der „Soft Agar Overlay“ Technik geschehen oder einfach durch „Spotting". Hierbei werden Bakterien auf einer einfachen Agarplatte als Rasen ausplattiert und dann die Phagen als kleine Tropfen appliziert. Nach einer Inkubation über Nacht sind im positiven Fall Phagen-Plaques (oder „Zonen Clearing“) mit dem bloßen Auge sichtbar. Plaques sind Bereiche, in denen durch die Anwesenheit von Phagen die vorhandenen Bakterien abgetötet wurden. Auf diese Art und Weise erhält man Klone von Phagen gegen definierte Bakterienstämme.

Wie können Phagen helfen?

Jetzt gilt es, die Phagen zu finden, die die höchste Selektivität gegenüber den kreuzreagierenden Bakterien besitzen. Hierfür werden die Phagen sowohl gegen die kreuzreagierenden Bakterien sowie die Ziel-Erreger getestet. Dies geschieht mittels eines Screenings im Mikrotiter-Format, um Zeit und Geld zu sparen. Eine sichtbare Plaque-Bildung zeigt wieder, dass die Phagen gegen die Bakterien wirksam sind. Nach mehreren Studien werden schließlich die geeignetsten Phagen identifiziert – nämlich die Phagen, die gleichzeitig das Wachstum eng verwandter Stämme hemmen, während gleichzeitig kein Einfluss auf das Wachstum des Zielorganismus festzustellen ist.

Diese Phagen helfen so, die kreuzreagierenden Bakterien selektiv zu inhibieren und somit gleichzeitig zu einer Verringerung der Häufigkeit von falsch-positiven Ergebnissen zu führen. In einen Monitoring-Programm hinsichtlich von Pathogenen kann so eine Menge Geld und Zeit eingespart werden.

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MYTHEN

der PathogenAnalyse

Was spricht gegen effiziente Pathogen-Analysen in Ihrem Unternehmen? Spot-On betrachtet einige Mythen rund um das Thema Pathogen-Nachweis.

Meredith Sutzko und Stefan Widmann, Produktmanager bei Romer Labs®

Mythos 1 Pathogen-Untersuchungen von Umgebungsproben verbessern nicht die Lebensmittelsicherheit Die meisten gültigen Verordnungen fordern die Überprüfung des Endprodukts, bevor die Freigabe zum Vertrieb an den Endverbraucher gegeben werden kann.

Dabei gilt es einige Herausforderungen bei der Prüfung der Endprodukte zu meistern.

Variablen wie Begleitflora, Inhibitoren, pH und Salzkonzentrationen können den Erregernachweis sehr schwierig gestalten. Weitere Faktoren können zu starken Schwankungen der Ergebnisse führen, vor allem, wenn die Kontaminationen sehr niedrig sind. Wie können Lebensmittelhersteller garanieren, dass die Zahl der untersuchten Proben ausreichend ist, um nachzuweisen, dass die Lebensmittel frei von Pathogenen und sicher sind? Es zeigte sich, dass regelmäßige Umweltproben sehr nützliche Hilfsmittel in vielen HACCP-Programmen sind. Umgebungsproben ermöglichen einem Lebensmittelhersteller auch schwer zugängliche Stellen in Produktionsbereichen zu kontrollieren und sofort geeignete Gegenmaßnahmen zu ergreifen, um jedes Risiko im Zusammenhang mit Lebensmittelverunreinigung zu vermeiden.

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Bereiche mit einem hohen Kontaminationsrisiko sollten dabei im Fokus stehen, da die Umgebungsproben in erster Linie dazu dienen, schnell mögliche Gefahrenquellen zu identifizieren. Ziel der Überwachung ist es generell, potenzielle Krankheitserreger zu beseitigen, bevor tatsächliche Kontaminationen stattfinden und den Lebensmittelproduzenten frühzeitig Sicherheitslücken aufzuzeigen.

Lateral-Flow Teststreifen benötigen kein zusätzliches Equipment.

Mythos 2 In-house Pathogen-Nachweise erfordern erhebliche Investitionskosten Das mag zutreffen wenn die sehr zeitintensiven Standard-Kulturverfahren (FDA BAM, ISO) verwendet werden sollen. Andere Methoden wie ELISA und Real-Time PCR erfordern eine teure Ausrüstung.

Bei Lateral-Flow Streifentests wird als Laborequipment neben einem Brutschrank für die Anreicherungsphase nur eine Waage zum Einwiegen benötigt. Ein Autoklav ist von Vorteil, vor allem für die Entsorgung und wenn Sie Ihre Medien selbst herstellen wollen. Weitere Geräte sind bei der Verwendung von Lateral-Flow Teststreifen nicht notwendig. Die Ergebnisse können direkt abgelesen werden und die Investitionskosten somit sehr übersichtlich.

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Mythos 3 Pathogen Nachweise benötigen Fachkräfte

Small companies can test for

Schnellnachweise für Krankheitserreger wurden noch zu Zeiten entwickelt, als nur gut ausgebildete Mikrobiologen solche Tests zusammen mit unzähligen Röhren, Platten und einem scharfen Auge durchgeführt haben. Die Methoden erfordern oft immer noch eine Vielzahl von speziellen Fähigkeiten abhängig von der Methode. Trotzdem können bereits viele Test-Kits effektiv durch gut geschultes Personal durchgeführt werden und erfordern nicht mehr die bisherige Spezialisierung. Die Nachweismethoden sollten daher einfach und robust sein, mit kleinen Arbeitsschritten um die Fehlerquellen zu minimieren. Dazu gehört für die Labore auch der Nachweis, dass die Mitarbeiter in der vorherrschenden Testmethode ausgebildet wurden..

pathogens on their own.

Mythos 4 Sicherheitsvorschriften verhindern die Durchführung eigener Tests bei kleinen Firmen Lebensmittelpathogene der sogenannten Risikogruppe 2, z. B. Salmonella, Listeria und E. coli O157, können unter Berücksichtigung der wenigen baulichen Anforderungen der Sicherheitsstufe S2 auch in kleinen Betriebslaboren untersucht werden.

Nach den Richtlinien zum Umgang mit biologischen Arbeitsstoffen der EN 12128 (Europäische Norm), des US Zentrum für Seuchenkontrolle und – Vorbeugung sowie der Weltgesundheitsorganisation (WHO), sind S2 Labore mit dem Biohazard-Symbol zu kennzeich-

Tabelle 1. Selektivnährböden für einige Pathogene Pathogen

USDA MLG

FDA BAM

ISO

E. coli O157

Rainbow® agar

CT-SMAC Zweiter Selektivagar

Listeria monocytogenes

MOX agar

CT-SMAC Rainbow® Agar oder R&F ® E. coli O157:H7 Agar

Salmonella species

XLT4 BGS

Quelle: USDA MLG, FDA BAM, ISO

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Esculin-basierender Agar (OXA, MOX, Palcam) Chromogener Selektivagar (Chromagar Listeria, nach Ottaviani and Agosti)

XLD HE BS

Oxford Agar Palcam

XLD Zweiter Selektivagar

nen und müssen ein Sichtfenster in den Türen haben.

Die Zugangsberechtigung ist auf das zuständige Laborpersonal einzuschränken. Alle Oberflächen im Raum müssen resistent gegen die eingesetzten Chemikalien und Desinfektionsmittel und leicht zu reinigen sein.

Die sachgemäße Entsorgung des Probenmaterials muss gesichert sein. Diese Sicherheitsanforderungen können auch von kleinen Betrieben leicht umgesetzt werden.

Mythos 5 Probenmaterial kann nicht entsorgt werden Doch, das können Sie. Hier drei Möglichkeiten für eine sachgemäße Entsorgung: 1) Verwenden Sie einen Autoklaven bei 121° C für mindestens 20 Minuten. Das Material kann nun als Restmüll entsorgt werden.

2) Verwenden Sie ein klinisches Mikrowellen-Desinfektionssystem. Das Material kann nun als Restmüll entsorgt werden.

3) Beauftragen Sie ein Entsorgungsunternehmen für diese Aufgabe. In Spezialcontainern wird das kontaminierte Material gesammelt und durch das Unternehmen entsorgt. Sie erhalten sogar einen schriftlichen Nachweis über die korrekte Entsorgung.

Mythos 6 Ein positives Testergebnis muss nicht weiter untersucht werden Alle momentan im Handel erhältlichen Schnelltests sind Screening-Methoden, die eine kulturelle Bestätigung bei positiven Befunden benötigen. Hierfür werden die klassischen Ausstriche der Übernachtkulturen auf selektiven Nährböden gefordert. Dies gilt insbesondere für die Analyse von Lebensmitteln. Bei Umweltproben wird in der Regel auf eine kulturelle Bestätigung, da die Durchführung einer zusätzlichen Desinfektion schneller und effizienter ist.

Es gibt mehrere Optionen für Selektivagarplatten, die z. B. in den USDA Mikrobiologie Labor Handbuch (MLG), dem FDA Bakteriologisch-Analytisches Handbuch (BAM) oder den ISO-Referenz-Handbüchern gelistet sind (Tabelle 1).

Mythos 7 Es gibt keinen Grund auf Listeria-Arten zu testen, wenn nur L. monocytogenes reglementiert ist Listeria monocytogenes (L. mono) mag zwar die einzige reglementierte Listerien-Art sein, aber es ist nicht die einzige Pathogene. Listeria ivanovii ist eine weitere

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pathogene Art, die in Ihren Produktionsanlagen auftreten kann. Ein weiterer Vorteil für Testungen auf Listeria spezies, vor allem bei Umgebungskontrollen, ist das Wachstum in schwer zugänglichen Bereichen zu überwachen.

Denn L. mono kann grundsätzlich auch überall dort wachsen, wo andere Listerien-Stämme gedeihen. Eine große Population nicht-pathogener Listeria Stämme in einer Probe, kann dazu führen, dass in einer Anreicherung diese die vorhandenen L. mono „überwuchern”. So kann es zu einem falsche-negativen Ergebnis kommen.

Mythos 8 Alle kommerziellen Methoden sind gleich

Tabelle 2. Typische Kriterien bei der Auswahl des Pathogen Nachweis System Kriterien

Definition

Inklusivität

Fähigkeit, verschiedene Stämme des gesuchten Erregers erkennen

Sensitivität

Wahrscheinlichkeit, dass ein negativer Test positiv ausfällt (z. B. wenig falsch positive zu erwarten sind)

Exklusivität Spezifität

Nachweisgrenze

Reproduzierbarkeit Wiederholbarkeit

Fähigkeit, Nicht-Zielorganismen nicht zu erkennen

Wahrscheinlichkeit, dass ein negativer Test positiv ausfällt (z. B. wenig falsch negative zu erwarten sind)

Mindestkonzentration an Zellen, die für einen positiven Test erforderlich sind (KBE/g oder KBE/mL) Wiederholbarkeit der Ergebnisse durch verschiedene Anwender und Labore Wiederholbarkeit der Ergebnisse mit gleichen Bedingungen

In der Fülle von Schnellmethoden auf dem Markt kann die Wahl zwischen ihnen schwierig sein. Alle im Handel erhältlichen Schnelltests bestehen aus zwei Teilen – eine Anreicherung gefolgt von einer Detektion. Der Hauptunterschied liegt in der Detektion. Immunreaktionen erkennen spezifische Proteine, während PCR-Methoden DNS erkennen.

Bei der Auswahl sollten folgende Kriterien berücksichtigt werden: Inklusivität, Exklusivität, Empfindlichkeit, Spezifität, Nachweisgrenze, Reproduzierbarkeit, Wiederholbarkeit und Zertifizierung (Tabelle 2). Schnelltests unterscheiden sich auch erheblich in Bezug auf ihre Handhabung und den möglichen Durchsatz. Weitere Unterscheidungsmerkmale sind notwendige Gerätekosten, Einarbeitung, Test-

dauer und Verbrauchskosten. All diese Dinge sollten bei der Implementierung eines Schnelltests berücksichtigt werden.

Keine einzelne Methode ist derzeit in der Lage, die Anforderungen aller Lebensmittelhersteller gleichermaßen zu berücksichtigen (Tabelle 3).

Tabelle 3. Pro und Kontra der unterschiedlichen Testsysteme

Automatisierter ELISA

Lateral Flow

Kompatibilität mit verfügbaren Standartmedien Verfügbarkeit von positiven Kontrollenstämmen bei der Anreicherung Zertifizierungen

Methode sollte die Verwendung eines Bakterienstamms ermöglichen, der von Wildtyp Stämmen zu unterscheiden ist, um möglichen Laborkontaminationen vorzubeugen Vorzugsweise AOAC oder AFNOR anerkannt

DNS Nachweis

Genauigkeit Sensitivität Spezifität Handhabung Gerätekosten Training Time to Result Kosten Durchsatz

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Schnellnachweissystem hilft bei der Reduzierung von Salmonella Enteritidis Infektionen Die Überwachung von Salmonella Enteritidis ist für die Sicherheit der gesamten Produktionskette bei Eiern entscheidend. Sehr empfindliche und spezifische Lateral-Flow Immunoassays, z. B. RapidChek® SELECT™, können dabei die Kosten durch hochgenaue Screening-Ergebnisse drastisch reduzieren.

Simon M. Shane, FRCVS, BVSc, PhD, MBL, ACPV

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ontaminationen von kommerziell produzierten Eiern mit Salmonella Enteritidis (SE) konnten in den letzten Jahren in den Vereinigten Staaten drastisch reduziert werden. Nach ersten Vorfällen in den frühen 70-ern innerhalb der EU, kam es im Jahre 1979 zu dem ersten Befund in New England.

Salmonella Enteritidis in Eiern verbreitete sich schnell über die mittleren Atlantik-Staaten in den frühen 80er Jahren und schließlich auch im Südwesten und den pazifischen Regionen in den 90er Jahren. Der Höhepunkt wurde 1995 erreicht, als in den USA 10.200 SE Fälle bestätigt wurden. Bis 2005 konnte dies auf 5.000 Fälle gesenkt werden. In den am stärksten betroffenen Regionen der mittleren Atlantikstaaten wurden im Jahr 1994 Infektionen von 9,1 pro 100.000 Einwohner dokumentiert. Bis zum Jahr 2007 konnte dies auf 2,5 pro 100.000 Einwohner reduziert werden. Nach Hochrechnungen des US Zentrum für Gesundheit und Prävention repräsentieren die 5.333 bestätigten Fälle von SE bundesweit 170.00 nicht bestätigter Fälle, von denen 108.000 auf den Verzehr von infizierten Eiern zurückgeführt werden. Unabhängig von der Gültigkeit dieser Hochrechnung und

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Salmonella enterica Serotype Enteritidis

basierend auf einer Reihe von strittigen Annahmen, war es doch offensichtlich, dass es ein Problem gab, das eine gemeinsame Intervention forderte.

Programme für die Qualitätssicherung von Eiern Ende der 90er Jahre führten einige Staaten Qualitätssicherungsprogramme für Eier ein. Produzenten wurden verpflichtet, die Einhaltung und Einführung minimaler Hygienestandards, Kühlketten, Herdenimpfungen, Herdenmonitoring auf Umweltverschmutzung und die Umleitung von Eiern aus infizierten Herden zur Pasteurisierung um zu setzen. Die Eliminierung von vertikal übertragenen Infektionen bei aufeinanderfolgenden Generationen, beginnend bei den Zuchtlinien über die Elterntiere, war entscheidend für die Erreichung einer sinnvollen Verringerung der Prävalenz von SE in den Herden.

Der Nationale Geflügel Verbesserungs Plan (NPIP) aus den frühen 30er Jahren koordiniert die Aufgaben von Bund, Ländern und Industrie bei der Bekämpfung vertikal übertragbarer Infektionen. Der Plan beschreibt die gültigen Betriebsverfahren, gültige diagnostische Tests und zertifiziert Brütereien von Küken. UrsprüngSpot On Ausgabe 3

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lich konzipiert auf die Beseitigung der Infektion mit Salmonella pullorum, war der NPIP jetzt mit dem Ausbruch von SE konfrontiert und anderen, neuen Geflügelkrankheiten. Die strikte Einhaltung des NPIP ermöglicht eine Versorgung der Produzenten mit zertifizierten Hennenküken aus SE-freien Brütereien. Diese Anstrengungen der Industrie sind eine wesentliche Grundlage zur Vermeidung von SE Infektionen in kommerziellen Herden. 2003 fand die Einführung einer landesweit vertriebenen Marke von Eiern statt, die eine rigorose Umsetzung des SE Präventionsprogramms mit Impfung und verbesserten Hygieneprogrammen von allen lizensierten Eierproduzenten verlangt.

Die Verwendung von Lateral-Flow ImmunoassayTest war dabei ein zentraler Punkt für die erfolgreiche Umsetzung des Programms. Da Herden fünfmal ab dem Tag der Einstallung bis zum Ende des zweiten Zyklus der Produktion aussortiert wurden, bedurfte es eines Schnelltests mit geeigneten Parametern anstelle des von der Food and Drug Administration (FDA) im Bakteriologisch-Analytischen Handbuch (BAM) geforderten mikrobiologischen Verfahrens.

RapidChek® SELECT™ Ein sehr sensitiver Test Der Romer Labs RapidChek® SELECT™ Lateral-Flow Schnelltest ist mittlerweile die Standardmethode zur Überwachung von D1-Salmonellen mit Schlepptupfern oder in Eiern. Das Verfahren ist der aufwändigeren und teuren BAM-Methode von der FDA gleich gestellt worden. Nach einer ersten Bewertung der RapidChek®-Methode wurde festgestellt, dass der Test eine Sensitivität von 100 Prozent aufweist. Ein entscheidendes Merkmal für einen Schnelltest, der keine falsch-negativen Ergebnisse aufzeigen sollte. Gleichzeitig wurden im Rahmen des Genehmigungsprozesses 141 D1 Salmonellen-Serotypen gegenüber 210 nicht-D1 Salmonellen-Serotypen getestet und eine Spezifität von 93 Prozent ermittelt.

Dies ist ebenfalls ein sehr wichtiger Parameter, da ein falsch-positiver Test bei einer 45 - Wochen alten Herde mit 125.000 Hennen erhebliche Kosten verursachen und die Abläufe empfindlich stören würde.

2010 untersuchte ein unabhängiges Labor nach der BAM-Methode 2.412 Tupferproben von denen 1.477 als „verdächtig” eingestuft wurden und eine weitere Bestätigung erforderten. Von diesen Proben wurden letztendlich nur 2 positive SE bestätigt. Die kombinierten Ergebnisse zweier staatlicher Labore aus dem mittleren Westen, die den RapidChek®-Tests 2010 und 2011 zur Sondierung einsetzten, fanden 106 „verdächtige” Proben aus ca. 14.000 untersuchten Tupferproben. Nach den erforderlichen bestätigenden bakteriologischen Tests konnten 16 SE aus Ein Magazin von Romer Labs®

den eingereichten Routineproben der Hersteller bestätigt werden. Ein westliches Staatslabor hat weiterhin bei 1.162 Tupferproben den RapidChek®-Schnelltest auf D1 Salmonellen gegen die konventionelle mikrobiologische BAM-Methode verglichen. Mit dem immunologischen Schnelltest konnten elf „verdächtige” positive Proben identifiziert werden im Vergleich zu drei positiven SE Proben nach Anwendung des BAM-Verfahrens.

Praktische Erwägungen

Spezi�ität ist entscheidend bei der Beurteilung von potentiellen, �inanziellen Verlusten.

Die Spezifität eines Schnelltests ist entscheidend bei der Beurteilung von potenziellen finanziellen Verlusten. Einer Berechnung zur Folge, die eine falsch positive Umweltprobe verursacht, belaufen sich die Kosten auf mehr als 75.000 $ für eine Herde von 125.000 Hennen, abhängig von den aktuellen Marktpreisen für Schaleneier. Dabei wurde eine Herde mit 40 bis 45 Wochen alten Hennen zu Grunde gelegt, deren Eier vom Markt genommen oder zur Pasteurisierung umgeleitet werden, über einen Zeitraum von vier Wochen, der für die Bestätigungsuntersuchungen benötigt wird.

Kurz nach der Einführung der endgültigen Verordnung der FDA zur Vermeidung von Salmonellen in Eiern kam es 2010 im Zusammenhang mit einer Anlage in Iowa nochmals zu einer größeren Ausbreitung von SE und einer umfangreichen Rückrufaktion mit über 500 Millionen Eiern. Dieser Fall stellte aber eine Ausnahme dar, ausgelöst durch grobe Misswirtschaft, und spiegelt nicht die aktuellen Praktiken in dieser Branche wider.

Seit diesem Ausbruch 2010 werden regelmäßige Audits von der FDA durchgeführt. Die Anwendung der FDA BAM-Methode wies eine Infektionsrate von 2,5 Prozent der untersuchten Herden auf. Dieser Wert ist bis heute auf ein zu vernachlässigendes Niveau gesunken und, es wurden seit 2011 keine neuen Fälle von SE in Eiern mehr gemeldet. Dieses Ergebnis wurde dank konsequenter Umsetzung der aktuellen Verordnungen durch die FDA erreicht und basiert in hohem Maße auf der regelmäßigen und intensiven Überwachung von Umweltproben. Die Umsetzung gelang nur in Kombination mit Schnelltests wie dem RapidChek® SELECT™ SE, der sowohl von unabhängigen Laboren als auch von staatlichen Stellen zur Überwachung eingesetzt wird.

Epidemiologische Studien zeigen, dass aktuell die SE Infektionen in der Geflügelindustrie eher im Zusammenhang mit Hähnchenfleisch gefunden werden und dass SE Isolate in steigenden Zahlen in Karkassen gefunden werden. Dementsprechend wurden die Protokolle des RapidChek® SELECT™ SE Kit angepasst, damit dieser Test auch weiterhin als bevorzugte Untersuchungsmethode zur Überwachung der Geflügelherden in der US-Masthähnchen-Industrie eingesetzt werden kann.

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Making the World’s Food Safer Seit über 40 Jahren stehen Romer Labs Testkits, Referenzmaterialien, Reinigungssäulen und analytische Dienstleistungen als Zeugnis unseres Engagements dafür, die Nahrungsmittelsicherheit weltweit zu erhöhen.

Gestützt von unserem außergewöhnlichen Service haben unsere Lösungen das Vertrauen von Lebensmittel- und Futtermittelsicherheitsexperten weltweit gewonnen.

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