Ausgabe 1
Ein Magazin von Romer Labs®
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Herstellung von flüssigen Mykotoxin-Standards: Ein Blick hinter die Kulissen
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Die drei wichtigsten Herausforderungen bei externen Akkreditierungsaudits
Inhalt
Die drei wichtigsten Herausforderungen bei externen Akkreditierungsaudits
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Erfolgreich den wichtigsten Herausforderungen bei Akkreditierungsaudits begegnen: Rückverfolgbarkeit, Bestimmung von Messunsicherheiten und Matrixeffekten. Von Elisabeth PICHLER, PhD, Head of Quality Management, Romer Labs®
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Rückverfolgbarkeit und zertifiziertes Referenzmaterial
Die vollständige Rückverfolgbarkeit ist ein wichtiger Gesichtspunkt bei Audits. Zertifizierte und detailiert dokumentierte Referenzmaterialien sind eine Möglichkeit, dieser Frage souverän zu begegnen. Von Lilian KUSTER, PhD, Product Manager, Romer Labs®
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Matrix Effekte bei LC-MS/MS verringern Spot On ist eine kostenfreie, vierteljährlich erscheinende Publikation der Romer Labs Division Holding GmbH ISSN: 2414-2042
Die Validierung von Routinemethoden kann viele negative Effekte durch Matrices ausschließen, aber es kann trotzdem noch großen Spielraum für unzuverlässige Ergebnisse lassen. Von Lilian KUSTER, PhD, Product Manager, Romer Labs®
Editoren: Cristian Ilea, Simone Schreiter
Mitwirkende: Elisabeth Pichler, Lilian Kuster, Anna Lilek Grafik: Reinhold Gallbrunner Recherche: Kurt Brunner
Herausgeber: Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Austria Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com
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Herstellung von flüssigen Mykotoxin-Standards: Ein Blick hinter die Kulissen Ein Rundgang durch die Produktion von Referenzmaterialien für die Lebens- und Futtermittelindustrie. Von Anna LILEK, Quality Management, Romer Labs®
Spot On Ausgabe 1
Editorial Den Anforderungen in Audits gerecht werden Analytische Auftragslabore arbeiten heute unter enormen Druck. Kunden erwarten Ergebnisse in höchster Qualität für alle Matrices in kürzester Zeit. Dabei können die Kunden die Ergebnisse oft selbst nicht mit eigenen Daten vergleichen und sind darauf angewiesen, dass die Kompetenz des Labors durch externe Akkreditierung nach ISO 17025 nachgewiesen ist. Die Auswahlkriterien für ein Labor sind neben dem Preis in erster Linie die benötigte Untersuchungsdauer. Diese wiederum wird durch die von nationaler Seite im Rahmen der Akkreditierung geforderten Dokumentation, Methodenvalidierung, Kontrollproben, Rückverfolgbarkeit und Teilnahme an Ringversuchen und regelmäßigen Fortbildungen immer stärker beeinflußt. Es ist daher für alle Labore wichtig, einen möglichst effizienten Weg zu finden, all diesen Anforderungen gerecht zu werden. In dieser ersten Ausgabe von Spot On 2017, unserem Magazin für Mitarbeiter in der Analytischen Industrie, möchten wir daher drei wichtige Punkte aufgreifen, die während der externen Auditierung eine große Rolle spielen: Rückverfolgbarkeit der Proben, die Bestimmung von Messunsicherheiten und Matrixeffekten. Zertifizierte Referenzmaterialien mit umfassenden Analysezertifikaten können beim ersten Punkt helfen. Um Messunsicherheiten zu beurteilen, sind verschiedene Methoden verfügbar. Beim dritten Punkt können 13C-markierte Standards bei LC-MS/MS Analysen Matrixeffekten komplett kompensieren. Letztendlich geben wir einen kurzen Einblick, wie beim Produktionprozess von der ursprünglichen Schimmelkultur bis hin zum Versand des flüssigen Mykotoxin-Standards die Rückverfolgbarkeit gewährleistet wird. Wir hoffen, Sie genießen die erste Ausgabe 2017 unseres vierteljährlich erscheinenden Spot On Magazins.
Elisabeth Pichler Head of Quality Management, Romer Labs®
Ein Magazin von Romer Labs®
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Photo: alphaspirit
Die drei wichtigsten Herausforderungen bei externen Akkreditierungsaudits
Der Umgang mit Kundenanforderungen und externen Akkreditierungsstellen ist die tägliche Herausforderung eines Laborleiters. Die in diesem Artikel beschriebenen drei Punkte sind eine Möglichkeit dieser zu begegnen. 4
Von Elisabeth PICHLER, Head of Quality Management, Romer Labs®
Spot On Ausgabe 1
Rückverfolgbarkeit und zertifizierte Referenzmaterialien
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xterne Prüfungen nach ISO 17025 können für ein Labor eine große Herausforderung für die Akkreditierung sein. Die Prüfer sind in der Regel Experten, die aus dem gleichen Fachgebiet kommen. Für die meisten Labore stellt die Dokumentation der Rückverfolgbarkeit von Ergebnissen und die Bewertung von Messunsicherheit und Matrixeffekten die größte Herausforderung während eines externen Akkreditierungsaudits dar.
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Rückverfolgbarkeit von Ergebnissen Dies ist ein Problem, mit dem jedes Labor zu kämpfen hat. Ein akkreditiertes Labor muss nachweisen, dass sich die Ergebnisse in seinen Berichten auf internationale Basiseinheiten (SI) zurückführen lassen. Im Falle eines durch HPLC (High Performance Liquid Chromatography) oder LC-MS (Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie) erhaltenen Ergebnisses in µg/kg (Mikrogramm pro Kilogramm) bedeutet dies eine klare Verfahrensdokumentation. Beide verwenden außerdem flüssige Standards zur Kalibrierung. Um deren Rückverfolgbarkeit auf die SI-Basiseinheit Kilogramm zu gewährleisten, werden vom Auditor auch Zertifizierungsberichte verlangt, die von Herstellerseite das gesamte Verfahren dokumentieren. (Für weitere Informationen, siehe "Rückverfolgbarkeit und zertifiziertes Referenzmaterial")
➋
Bestimmung der Messunsicherheiten Nach ISO 17025 muss jeder Prüf bericht für jede akkreditierte Methode eine Berechnung der Messunsicherheit enthalten. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, diese Messunsicherheit zu berechnen oder zu schätzen. Welche Methode letzendlich akzeptiert wird, hängt stark von der Präferenz der jeweiligen Behörde ab. Eine einfache und praktische Möglichkeit für kleine Labore, Messunsicherheiten zu schätzen, ist die Verwendung von Regelkarten. Es ist gute Laborpraxis, eine Matrix-basierte Kontrollprobe zu verwenden, die im Idealfall mit dem Analyten kontaminiert oder gespikt worden ist. Diese Probe wird dann für alle Untersuchungen als positive Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse dieser Kontrollprobe werden gesammelt und auf Kontrollkarten übertragen. Damit findet eine langfristige Bewertung und Ermittlung von Tendenzen jeder Methode statt. Als Messunsicherheit Ein Magazin von Romer Labs®
Die vollständige Rückverfolgbarkeit stellt einen sehr wichtigen Faktor bei Audits dar. Zertifizierte und detailliert dokumentierte Referenzmaterialien sind eine Möglichkeit, dem zu begegnen. By Lilian KUSTER, Product Manager, Romer Labs®
Für Referenzstandards in analytischen Methoden gibt es viele Begriffe, die diese beschreiben: Referenzmaterialien, zertifizierte Referenzmaterialien, Kalibrator, Standard, u.s.w. Zertifizierte Referenzmaterialien werden definiert als Materialien mit messtechnischer Rückverfolgbarkeit, einem zertifizierten We r t und einer d e f i n i e r te n Messunsicherheit. Sie erfüllen alle Anforderungen der ISO 17025, GLP, etc. und werden mit einer vollständigen Dokumentation geliefert: • Reinheitsprüfung des Rohstoffs
• Rückverfolgbarkeit zu nationalen Standards • Messunsicherheit und deren Berechnung • Homogenitäts-Studie • Lang- und Kurzzeitsstabilitäts-Studien • Beschreibung der bestimmungsgemäßen Verwendung
Zertifizierte Referenzmaterialien sind für die Überprüfung der laborinternen Standards, wie z. B. routinemäßig im Labor verwendeten Referenzstandards, bestimmt. Sie dienen zur Kalibrierung von Geräten und Methoden, vor allem in nach ISO 17025 akkreditierten Prüflaboratorien, wo die Rückverfolgbarkeit und Qualität der Ergebnisse von großer Bedeutung ist. Tabelle 1 zeigt die Unterschiede zwischen einem Referenzmaterial und einem zertifizierten Referenzmaterial, so wie sie unter der Marke Biopure™ erhältlich sind. Für ein zertifiziertes Referenzmaterial sind alle Unterlagen für eine lückenlose Rückverfolgbarkeit verfügbar. Darüber hinaus werden die Messunsicherheit und alle relevanten Daten des Produktionsprozesses und der Zertifizierung angegeben. Nur nach ISO Guide 34 akkreditierte Institutionen sind dazu berechtigt, zertifizierte Referenzmaterialien herzustellen. ISO Guide 34 definiert "Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz der Referenzmaterial-Hersteller" und basiert auf ISO 17025, einschließlich der zusätzlichen technischen Anforderungen für zertifizierte Referenzmaterialien.
Tabelle 1. Unterschiede zwischen Biopure™ Referenzmaterialien und zertifizierten Referenzmaterialien Reinheit des Rohmaterials Dokumentation
Stabilität
Homogenität Kompetenznachweis
Referenzmaterial BiopureTM
BiopureTM Zertifiziertes Referenzmaterial
gemessen mit HPLC-UV
gemessen mit akkreditierter qNMR Methode
verfügbar, aber keine systematische Untersuchung
Lang- und Kurzzeit Stabilitätsdaten nach ISO Guide 35 verfügbar und statistisch ausgewertet
Kein formaler Kompetenznachweis
Nachweis durch Akkreditierung
Analysezertifikat
Nicht verfügbar (Flüssigkeiten werden als homogen betrachtet)
Prozess und keine vollständige Transparenz Berechnung Geräte Verpackung
Verwendung von kalibrierten Geräten Schraubflasche aus braunem Qualitätsglas
Analysezertifikat und Zertifizierungsbericht
Homogenitäts-Studie nach ISO Guide 35 verfügbar und statistisch ausgewertet
Vollständige Nachvollziehbarkeit und Beschreibung im Zertifizierungs-Bericht
extern kalibrierte und zertifizierte Geräte Crimp Vial aus inertem Glas höchster Qualität
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Diese Werkzeuge helfen Laboren sich besser auf ein Audit vorzubereiten.
wird die zweifache Standardabweichung aller Ergebnisse herangezogen. In Europa wurde hierzu in der Verordnung (EG) Nr. 401/2006, welche die Methoden der Probenahmeverfahren und Analysemethoden für die amtliche Kontrolle der Mykotoxine in Lebensmitteln beschreibt, eine validierte Methode zur Berechnung der "Zweckmäßigkeit" veröffentlicht. Die folgende Formel stellt so eine Methode zur Berechnung der maximalen Standardunsicherheit dar:
!" =
(
!"# ! ) + (! ×!)! 2
• Uf = maximale Standardunsicherheit (μg/kg) • LOD = Nachweisgrenze der Methode (μg/kg) • α = konstanter, numerischer Faktor in Abhängigkeit von C • C = zu bestimmende Konzentration (µg/kg) Tabelle 1. Werte für α
Konzentration (μg/kg) ≤ 50
α 0,2
51-500
0,18
1 001 – 10 000
0,12
501 – 1 000
0,15
> 10 000
0,1
Ein weiterer Ansatz folgt den Schritten wie Tabelle 2 dargestellt und in JCGM 100:2008 Leitfaden für die Angabe von Messunsicherheiten (GUM) beschrieben. Dementsprechend resultiert eine Messunsicherheit aus unserer unvollständigen Kenntnis des Wertes der Messgröße in Kombination mit verschiedenen Einflussfaktoren. In Tabelle 3 sind mögliche Quellen der Messunsicherheit gelistet.
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Matrixeffekte Akkreditierte Labore stehen in der Regel vor der täglichen Herausforderung, Proben unterschiedlichster Herkunft zu untersuchen. Diese Labore validieren ihre Methoden für die am häufigsten untersuchte Matrix.
Zertifizierung ≠ Akkreditierung Die Begriffe Zertifizierung und Akkreditierung werden oft verwechselt. Wer etwas zertifizieren möchte, sei es nun ein Management-System, ein Produkt oder eine Person, muss für diese Aufgabe von einer offiziellen Akkreditierungsstelle akkreditiert werden. Eine Akkreditierung nach ISO 17025 berechtigt das Labor zur Ausstellung entsprechender Zertifikate, die auch in Gerichtsverfahren anwendbar sind.
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Tabelle 2. Die 8 Schritte der GUM Methode 1. Beschreibung des gemessenen Werts in Bezug auf den Messvorgang (Modell der Messung) 2. Eingangsgrößen auflisten 3. Bestimmung der Unsicherheit für jede Eingangsgröße 4. Kovarianzen/Korrelationen in Eingangsgrößen feststellen 5. Berechnung des gemessenen Wertes 6. Die Unsicherheitskomponenten richtig kombinieren 7. Die kombinierte Unsicherheit mit einem Erweiterungsfaktor multiplizieren. 8. Das Ergebnis in das richtige Format bringen Tabelle 3. Mögliche Quellen von Messunsicherheiten
1. Unvollständige Definition der untersuchten Probenmenge 2. Unvollkommene Realisierung der Definition der untersuchten Probenmenge 3. Nicht-repräsentative Probenahme 4. Unzureichende Kenntnis der Auswirkungen von Umweltbedingungen auf die Messung oder unvollkommene Messung von Umweltbedingungen 5. Individuelle Fehler beim Ablesen analoger Instrumente, einschließlich der Auswirkungen von Parallaxen 6. Endliche Auflösung oder Grenzwerte der Messapparaturen 7. Ungenauigkeit von Messstandards und Referenzmaterialien 8. Ungenauigkeit von verwendeten Parametern aus externen Quellen, die bei der Berechnung verwendet werden. 9. Annäherungen und Annahmen innerhalb der Messmethode und des Verfahrens 10. Variationen in Replikaten unter scheinbar identischen Bedingungen
Aber auch die Analyse einer scheinbar einfachen Matrix wie Mais wird stark durch die einzelnen Maissorten beeinflusst. Komplexere Proben wie Mischfutter oder stark verarbeitete Lebensmittel können die Ergebnisse enorm verändern. Die genaueste, heute verwendete Möglichkeit, dem zu begegnen, sind 13C markierte Standards für jeden Analyten und eine Berechnung basierend auf einer internen Kalibrierung. (Weitere Informationen, finden Sie im Kasten "Matrixeffekte bei LC-MS/MS verringern", Seite 7)
Zusammenfassung Die Dokumentation der Rückverfolgbarkeit und die Bewertung von Messunsicherheiten sowie Matrixeffekten stellen für Labore die größten Herausforderungen während eines externen Akkreditierungsaudits dar. Ein Zertifizierungsbericht eines akkreditierten Lieferanten kann hierbei sehr unterstützen. Zur Berechnung der Messunsicherheit stehen mehrere offizielle Methoden zur Verfügung. Allerdings kann man nur mit 13C-markierten internen Standards die Matrix-Effekte korrekt beschreiben. Spot On Ausgabe 1
Matrixeffekte bei LC-MS/MS verringern Wie bei jeder analytisch angewandten Technik werden die Ergebnisse der Flüssigkeits-ChromatographieTandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) von der zu analysierenden Matrix beeinflusst. Diese Matrixeffekte – verursacht durch Ionisierungseffekte – verursachen Über- oder Unterschätzungen der Messwerte des Analyten. Die Validierung der routinemäßig am häufigsten eingesetzten Methoden kann die meisten Auswirkungen in den gängigsten Matrices verringern. Es können aber schon verschiedene Sorten einer Grundmatrix wie Mais deutliche Einflüsse auf den Ionisierungsgrad zeigen. Dadurch ergibt sich eine große Wahrscheinlichkeit für Messunsicherheiten. Von Lilian KUSTER, Product Manager, Romer Labs®
Es gibt verschiedene Ansätze, um Matrixeffekten zu begegnen. Dazu gehören eine an die jeweilige Matrix angepasste Kalibrierung, Standardaddition zu jeder Probe oder die Messung mit internen Standards. Die ersten beiden Verfahren beinhalten zusätzliche Arbeit und Kosten in Bezug auf die Probenvorbereitung und die Anzahl der Proben. Weiterhin können weder eine auf die Matrix angepasste Kalibrierung noch Standardaddition die Matrixeffekte vollständig kompensieren. Die Wirksamkeit eines internen Standards bei der Kompensation von Matrixeffekten hängt von der Wahl des Kalibrierstandards ab.
Ergebnisse der LC-MS/MS weniger genau sind. Stickstoff-Isotope eignen sich nicht immer zur Herstellung von Standards, da Stickstoff nicht in allen Stoffen natürlich vorkommt. Kohlenstoff ist auf der anderen Seite natürlicherweise in den m e i s te n biologischen Ve r b i n d u n g e n und Natürliches DON 296 amu → +15 amu → 13C DON Mykotoxinen enthalten. Die Substitution von natürlich vorkommendem 12C durch 13C, verändert die gesamte Masse des Atoms nur leicht im Gegensatz zu deuterierten Standards. 13C-markierte Standards, z. B. 13C-markierte Mykotoxine, besitzen die gleichen Eigenschaften wie ihre natürlichen 12C-Analoga und eluieren zeitgleich von der Chromatographiesäule. Der Unterschied in der Masse zwischen 12C und 13C Mykotoxinen lässt, wie für Deoxynivalenol in Abbildung 1 gezeigt, die Trennung und Identifizierung von beiden eluierten Formen zu, wenn die Erkennung mittels Massenspektrometrie durchgeführt wird. Der 13C Peak stellt die bekannte Menge des zugegebenen isotopen-markierten Standards dar. Dieser Peak kann verwendet werden, um die unbekannte Menge des Analyten zu berechnen und kompensiert dadurch mögliche Ionisierungseffekte der Matrix.
Die Auswahl des internen Standards ist wichtig Als interne Standards kommen chemische Verbindungen und deren Derivate (z. B. Zearalanone für Zearalenon) oder ähnliche Verbindungen mit identischem Ionisierungsverhalten in Frage, die sich nur in Bezug auf die Masse der Atome (stabile Isotope) unterscheiden. LC-MS/MS-Analysen setzen auf die StabilisotopenVerdünnungsanalyse. Dabei werden Matrixeffekte durch die Zugabe von bekannten Mengen stabiler isotopenmarkierter Standards zur analysierten Probe überwunden. Stabile Isotopenmarkierung beinhaltet die Verwendung von nicht-radioaktiven Isotopen wie ²H, 13C oder 15N um das natürlich vorkommende Atom zu ersetzen. Standards, deren natürlich vorkommende Wasserstoffatome (1H) durch die doppelt so schweren Deuteriumatome(²H) ersetzt werden, können zu einer Verschiebung der Retentionszeiten führen, wodurch die
Bild 1. Komplettes MS Spektrum von (13C15)-Deoxynivalenol (Biopure) x 10 4
Natürlich vorkommendes DON �M-H�- m/z = 295 amu
2.5
13
13
295.12
Intensität
2.0
0.5 0.0
13
296.12
295
300
15 amu
310.17
C14-DON 15.8%
C13-DON 2.8%
297.12 298.12
290
C15-DON 81.4% 13
1.5 1.0
C-DON isotopen-markiertes Deoxynivalenol �M-H�- m/z = 310 amu
309.17 308.17 307.16
305
310
Rote Linie: natürlich vorkommendes DON. Blaue Linie: Biopure™ 13C interner Standard.
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m/z
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Herstellung von flüssigen Mykotoxin-Standards: Ein Blick hinter die Kulissen Viele akkreditierte Labore verwenden Referenzmaterialien, um die Rückverfolgbarkeit und Zuverlässigkeit ihrer Analyse-Ergebnisse zu demonstrieren. Weniger bekannt ist, wie Referenzmaterialien hergestellt werden. Von Anna LILEK, Quality Manager, Romer Labs®
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R
eferenzmaterialien oder Kalibrierstandards beschreiben Stoffe oder Gegenstände mit einer oder mehreren definierten, charakteristischen Eigenschaften, die als Referenz für Messverfahren verwendet werden. Angesichts des Verbraucherschutzes bei Lebensmitteln und Futtermitteln, beinhaltet die Überwachung von Mykotoxinen die Verwendung von Referenzmaterialien, um genaue und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten.
Allgegenwärtige Gefahr
Einige Toxine können aus einer übersättigten Lösung von polaren oder unpolaren Lösungsmitteln kristallisiert werden.
Mykotoxine sind natürlich vorkommende Sekundärmetaboliten von Pilzen und giftig für Tiere und Menschen. Schimmelpilze wachsen sowohl auf dem Feld als auch während der Lagerung. Ihre Metaboliten werden in fast allen landwirtschaftlichen Rohstoffen weltweit gefunden. Es sind über 380 Mykotoxine bekannt, deren Toxizität sehr unterschiedlich sein kann. Die zulässigen Höchstkonzentrationen von verschiedenen Mykotoxinen in pf lanzlichen Rohstoffen wie Getreide, Weizen und Mais zwingen Rohstoffproduzenten, ihre Proben in analytischen Laboren untersuchen zu lassen und so die Qualität ihrer Produkte zu überprüfen.
Gravimetrische Aufbereitung Pilze, die unter optimalen Bedingungen (warme Temperaturen, hohe Luftfeuchtigkeit und ein geeignetes Substrat) wachsen, produzieren häufig Mykotoxine. Unter Laborbedingungen beginnt die Herstellung von Referenzmaterial mit dem Versuch, die künstlichen Wachstumsbedingungen zu optimieren, um maximale Mykotoxinerträge zu erzielen. Dazu zählt die Verwendung eines geeeigneten Pilzstamms, da jeder Pilz seine eigenen charakteristischen Metaboliten produziert, teilweise an die hundert verschiedene. Die ständige Überprüfung der ausgewählten Pilzstämme
ist entscheidend für die Produktion. Ihre Vitalität und Funktionalität werden dazu ständig überwacht. Schimmelpilze sind lebende Organismen, die im Laufe der Zeit mutieren oder sogar degenerieren können und so zu sinkenden Mykotoxinerträgen führen. Neue Metaboliten können nach einer gewissen Lagerzeit gebildet werden, die den Isolierungsprozess immens beeinflussen. Die Stämme werden daher regelmäßig erneuert, um Mutationen, Verunreinigungen oder anderen unerwünschten Nebeneffekte entgegenzuwirken. Der erste Herstellungsschritt, die Fermentation, versucht dem Pilz die Laborumgebung buchstäblich so schmackhaft wie möglich zu machen, um sein
Tabelle 1. Herausforderungen bei der Herstellung von Referenzmaterialien Anforderung
Lösung
Mutationen von Pilzstammlinien (Bildung von anderen Metaboliten, Zu-/Abnahme der Ausbeute, Bildung von Verunreinigungen)
Überprüfung von Produktivität und Vitalität Erneuerung der Stämme, falls benötigt.
Standardisierung der Fermentation und Aufreinigung Unerkannte Verunreinigungen durch Überlagerung?
Finden von externen zertifizierten Referenzmaterialien für die Prozess- und Qualitätskontrolle
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Verwendung von modernen Techniken, Materialien und Geräten Nachweis eines nachhaltigen Reinigungsverfahrens
Alternative für die Identifizierung von Stoffen suchen, die zu isolieren sind – z. B. durch Analysen von akkreditierten Laboren, die eine Identifizierung und eine rückverfolgbare Reinheitsbestimmung ausführen können (quantitative NMR, LC-MS / MS, Elementaranalyse, etc.)
Spot On Ausgabe 1
Abbildung 1. Produktionsweg eines flüssigen Mykotoxin Kalibrators
Gravimetrische Vorbereitung
• Temperierung des festen Mykotoxins auf Raumtemperatur • Abwiegen • Lösen • Homogenisieren
Qualitätskontrolle
• HPLC • UV Spektroskopie • HPLC-MS
Verpackung und Zertifizierung
• Abfüllen in einzelne Verpackungseinheiten • Dokumentation durch Analysezertifikat • Versand
Wachstum optimal zu fördern. Das Medium variiert von Stamm zu Stamm, genauso weitere Komponenten wie Salze und Mineralien, die als Quelle von Nährstoffen zur Verfügung gestellt werden. Die Pilze wachsen eine gewisse Zeit –von einigen Tagen bis wenigen Wochen – unter diesen optimierten Bedingungen. Während dieser Periode metabolisiert der Pilz das Medium und produziert die Mykotoxine. Im Anschluß an die Fermentation findet nach sorgfältiger Kontrolle des Prozesses die Extraktion des Mykotoxin aus dem Kulturmaterial mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel statt. Abhängig von der molekularen Struktur des Mykotoxins kann dies ein polares oder unpolares Lösungsmittel sein. Der daraus resultierende grobe Extrakt enthält neben dem gesuchten Toxin häufig noch weitere Metaboliten und Verunreinigungen wie Farbstoffe, Öle, etc. Durch verschiedene chromatographische und präparative Verfahren unterschiedlicher Selektivität wird das gesuchte Mykotoxin dann Schritt für Schritt näher an das angestrebte Ziel einer Reinheit > 98 % gereinigt und isoliert. Einige Mykotoxine haben günstige molekulare Strukturen und können aus einer gesättigten Lösung in polaren oder unpolaren Lösungsmitteln kristallisiert werden. Dies geschieht z. B. durch Kühlen oder Verdampfen des Lösungsmittels oder durch das Mischen von verschiedenen Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität. Andere Toxine können durch Gefriertrocknung in eine kristalline, pulvrige Form überführt werden. Die Ein Magazin von Romer Labs®
Kristallisation stellt einen weiteren Aufreinigungsschritt dar, der die Reinheit des Toxins weiter vergrößert.
Qualitätskontrolle UV-Spektrometrie, HPLC und HPLC-MS werden verwendet, um die Reinheit der produzierten Rohstoffe zu bestimmen. Abhängig von dem Toxin kann dies zum Beispiel durch HPLC in Kombination mit UV-Detektion, Fluoreszenz-Detektion oder ähnlichem, mit UV-Photometer (qualitative und quantitative Analyse der Verbindung) oder durch HPLC kombiniert mit Massenspektrometrie geschehen. Massenspektrometrie ist besonders für die oben beschriebene Bestimmung der Reinheit (z.B. > 98 % 13 C-Atome) von 13C Isotop-markierten Mykotoxinen erforderlich. Es ist manchmal schwierig im Handel Produkte zu finden, die zur Prozesskontrolle im Rahmen der Produktions- und Qualitätskontrolle einsetzbar sind. Tabelle 1 zeigt, welche Schwierigkeiten bei der Herstellung und Qualitätskontrolle entstehen können und welche Lösungen Romer Labs gefunden hat.
Versand Nach dem Bestehen der letzten Qualitätskontrolle werden die kristallinen Mykotoxine gelöst und als gebrauchsfertiges Referenzmaterial in Fläschchen abgefüllt. Das Analysezertifikat wird für jede Charge erstellt, mit Angabe aller Eigenschaften und der Berechnung des Unsicherheitswertes, und begleitet jeden einzelnen Kalibrator.
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Making the World’s Food Safer Seit über 40 Jahren stehen Romer Labs Testkits, Referenzmaterialien, Reinigungssäulen und analytische Dienstleistungen als Zeugnis unseres Engagements dafür, die Nahrungsmittelsicherheit weltweit zu erhöhen. Gestützt von unserem außergewöhnlichen Service haben unsere Lösungen das Vertrauen von Lebensmittel- und Futtermittelsicherheitsexperten weltweit gewonnen.
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