Ausgabe 4
Ein Magazin von Romer Labs®
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Ist Genauigkeit der Preis, den wir für schnellere Ergebnisse zahlen?
Mykotoxine mit Wasser extrahieren - kann das funktionieren?
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Inhalt
Ist Genauigkeit der Preis, den wir für schnellere Ergebnisse zahlen?
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Geschwindigkeit oder Genauigkeit? Müssen wir uns entscheiden? Die Anwendung der richtigen Technologie und die Beachtung der Probenahmerichtlinien können die Analysendauer reduzieren, ohne die Genauigkeit zu beeinträchtigen. Von Alois SCHIESSL
Spot On ist eine vierteljährlich erscheinende Publikation der Romer Labs Division Holding GmbH, die kostenlos verteilt wird. ISSN: 2414-2042
Redaktion: Cristian Ilea, Simone Schreiter Mitwirkende: Michael Zheng, Alois Schiessl, Philipp Gruber Gra�ik: GraphX ERBER AG
Herausgeber: Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Österreich Tel .: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com
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Forschung: Kurt Brunner
Mykotoxine mit Wasser extrahieren geht das? Um Mykotoxine für ein Testverfahren zugängig zu machen, ist eine Extraktion notwendig. Während dieses Prozesses werden Mykotoxine, die im Getreidekorn eingeschlossen sind, in eine Flüssigkeit überführt. Dies wird normalerweise mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln durchgeführt – gefährliche Substanzen, die sowohl für den Anwender als auch für die Umwelt schädlich sind.
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By Philipp GRUBER
Spot On Ausgabe 4
Leitartikel Genauigkeit oder Geschwindigkeit: das Dilemma des perfekten Test-Kits Laut dem neuesten BIOMIN Mykotoxin Survey Report wurden bis zu 84% aller Futtergetreideproben, die bei der Ernte 2015 gesammelt wurden, positiv auf mindestens ein Mykotoxin getestet, und mehr als die Hälfte war mit mehr als einem Mykotoxin kontaminiert. Während der Klimawandel und jahreszeitlich bedingte Wetterschwankungen die Mykotoxin-Belastung verschlimmern, ist die gute Nachricht, dass die weltweit gestiegenen Mykotoxinanalysen die Verfügbarkeit erschwinglicher und einfach anzuwendender Testkits erhöht hat. Die gestiegenen Analysen haben auch zu einer Steigerung der Lebensmittelsicherheitsstandards geführt. Schnellere und einfachere Verfahren legen oft die Vermutung nahe, dass hiermit auch eine sinkende Analysenqualität damit verbunden ist. Sind schnelle, aber genaue Testverfahren somit einfach eine Illusion? Die Hersteller von Schnelltests arbeiten hart daran, das Gegenteil zu beweisen. Die Testqualität wird durch Matrixvalidierungen laufend verbessert und kontrolliert, was zeigt, dass Wissenschaft und Technologie nicht stehen bleiben. Die Träume von heute können oft zur Realität von morgen werden. Lateral Flow Streifentests sind hierfür ein Beispiel. Diese sehr einfach durchzuführenden Tests sind selbst für Anwender mit geringer Vorbildung geeignet. Eine der neuesten und aufregendsten Innovationen ist die Extraktion von Mykotoxinen auf Wasserbasis. Diese Methode ist für die wichtigsten Mykotoxine verfügbar und erfüllt die Kundenwünsche nach genauen Testverfahren, bei denen keine gefährlichen und teuren Substanzen wie organische Lösungsmittel verwendet werden müssen. In dieser Ausgabe von Spot On konzentrieren wir uns auf die Bedürfnisse von Vor-Ort-Schnelltests an Getreideannahmestellen und stellen eine Möglichkeit vor, wie Mykotoxine effektiv und sicher mit Wasser zu extrahieren sind. Wir wünschen Ihnen viel Spaß beim Lesen dieser Ausgabe von Spot On!
Michael Zheng Vizepräsident F&E, Romer Labs Singapur
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Ist Genauigkeit der Preis, den wir für schnellere Ergebnisse zahlen? Geschwindigkeit oder Genauigkeit? Müssen wir uns entscheiden? Die Anwendung der richtigen Technologie und die Beachtung der Probenahmerichtlinien können die Analysendauer reduzieren, ohne die Genauigkeit zu beeinträchtigen. Von Alois SCHIESSL
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B LFDs sind eine der schnellsten verfügbaren Testmethoden.
ei einem Besuch auf einer Getreidesiloanlage sieht man in der Regel mehrere wartende LKW vor der Getreideannahmestelle. Während der Erntesaison können das schon mal bis zu 100 LKW an einem Tag sein. Die Annahmestelle muss jetzt schnell entscheiden, welche Lastwagen Getreide transportieren, das die geforderten Mykotoxinkontaminationsgrenzwerte unterschreitet, und daher in die Anlage eingelassen werden. In Erntejahren, in denen die Kontamination allgemein sehr hoch ist, wird unter Umständen die Ladung jedes Lkw vor der Einfahrt auf Mykotoxine untersucht. Dies muss schnell geschehen, um die Zeit in der Warteschlange so gering wie möglich zu halten. Schnelle Analysemöglichkeiten sind hierfür die Lösung, aber inwieweit beeinträchtigt das die Genauigkeit? Diese zwei wichtigen Gesichtspunkte sollen im Weiteren näher betrachtet werden, beginnend mit der richtigen Methodenwahl. Jeder LKW wird beprobt und nacheinander analysiert. Eine schnelle und einfach anzuwendende Testmethode ist daher erforderlich. Lateral Flow Device (LFD) -Tests, auch Streifentests oder Dipsticks genannt, sind eine der schnellsten verfügbaren Testmethoden und passen perfekt zu diesem Szenario. Aufgrund ihrer Einfachheit können diese Tests von nahezu jedem mit wenig Grundkenntnissen durchgeführt werden und führen in der Regel in weniger als zehn Minuten zu Ergebnissen. Dies ermöglicht eine schnelle Entschei-
Wie funktionieren Lateral Flow Streifentests? Um mittels einem Lateral-Flow Streifentest (LFD) ein schnelles Testergebnis zu bekommen, werden Getreideproben gemahlen und mit speziellen Puffern auf Wasserbasis extrahiert. Nach einer Entwicklungszeit von nur drei Minuten sind Test- und Kontrolllinien bereits sichtbar. Für eine Quanti�izierung wird ein handliches Lesegerät benötigt. Während der Entwicklung �ließt der Probenextrakt entlang dem Streifen und Mykotoxin-spezi�ische Antikörper auf der Testlinie reagieren mit freien, in der Probe vorhandenen Mykotoxinen. Diese blockierten Antikörperstellen können in Folge dann nicht mehr mit den markierten Goldkolloiden reagieren, welche für die Entwicklung der Testlinien verantwortlich sind. Je höher die Mykotoxinkonzentration in einer Probe ist, desto niedriger ist daher die Intensität der Testlinie. Die Kontrolllinie bindet die im Überschuss vorliegenden der Antikörper-Goldkonjugaten und erzeugt eine weitere Linie zur Bestätigung einer korrekten Testdurchführung. Keine andere kommerzielle Testmethode kann so schnell und günstig Testergebnisse liefern. Die Stärken dieser Methode liegen daher v. a. bei Anwendungen in der Wareneingangskontrolle.
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dungsfindung, ob die Ladung eines LKWs in dem Betrieb angenommen werden kann oder nicht.
Was spielt sonst noch eine Rolle? Andere Mykotoxin-Schnelltestverfahren, wie enzymgebundene Immuno-Assays (ELISA), kommen ebenfalls zum Einsatz. ELISA-Tests benötigen jedoch neben einer zusätzlichen Standardkurve bei jeder Analyse, circa 20 Minuten Testdauer bis zum Ergebnis. Diese Methode ist daher nur sinnvoll, wenn mehrere Proben parallel mit der gleichen Kalibrierkurve analysiert werden. Eine weitere Möglichkeit für die Analyse von Mykotoxinen sind Referenzmethoden, wie Hochleistungsf lüssigkeitschromatographie (HPLC) sowie Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie-Detektion (LC-MS / MS). Dies sind typische Labormethoden, die mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit verbunden sind. Der Nachteil dieser Methoden ist, dass hochqualifiziertes Personal benötigt wird und die Analysendauer bis zu einem Tag betragen kann. Für die Anwendung in der Wareneingangskontrolle bei Getreidehändlern sind diese Methoden daher ungeeignet.
Die große Frage der Genauigkeit Je schneller eine analytische Methode ist, desto häufiger tauchen Bedenken hinsichtlich ihrer Genauigkeit auf. Wie genau sind LFD-Tests? LFD-Technologie und ELISA-Tests verwenden beide das Prinzip der Antikörper-Antigen-Reaktion, bei dem ein spezifischer Antikörper ein einzigartiges Antigen, in diesem Fall ein Mykotoxin, mit einer gegebenen Empfindlichkeit nachweist. Beide Testsysteme werden gegen zertifizierte Referenzmaterialien kalibriert und die Ergebnisse werden in Validierungsstudien mit akkreditierten Referenzmethoden regelmäßig verglichen. Trotzdem erfüllen einige Testmethoden möglicherweise nicht die Erwartungen des Anwenders.
Was kann schief gehen? • Eine korrekte Probenahme (siehe Kasten) ist eine Grundvoraussetzung für genaue Analyseergebnisse. Große Mengen Getreide (z. B. ganze Lastwagen oder Schiffsladungen) müssen auf Mykotoxine untersucht werden, bevor sie für die Annahme in einen Betrieb akzeptiert werden. Entscheidend für das Ergebnis ist, dass repräsentative Proben für die Analyse genommen werden. • Einer der wichtigsten Faktoren, die ein analytisches Ergebnis beeinflussen können, ist die Probenmatrix. Idealerweise werden Testmethoden entwickelt, Spot On Ausgabe 4
100% Gesamtfehler
um jede Art von Lebens- oder Futtermittelproben auf Mykotoxinkontamination zu analysieren. Ein limitierender Faktor ist jedoch, dass Lebens- oder Futtermittelproben unterschiedliche Komponenten enthalten können, die je nach ihrer chemischen Struktur und Eigenschaften das Analyseergebnis stören können. Antikörperbasierte Schnelltests werden oft von bestimmten Matrixkomponenten beeinflusst, die erhebliche Auswirkungen auf die Antikörper-Analyt-Bindungsreaktion haben können und möglicherweise fragwürdige Ergebnisse liefern. Die Hersteller stehen vor der Herausforderung, diese Wechselwirkungen beispielsweise durch spezifische Antikörperentwicklungen und Matrixvalidierungen zu reduzieren oder eliminieren. • Matrixabhängige Anwendungshinweise, die das Analyseverfahren und die Leistungscharakteristika angeben, sind in der Regel bei den Herstellern des Testkits verfügbar. Es ist wichtig, diese Anwendungshinweise zu befolgen, um genaue Ergebnisse zu erhalten, insbesondere wenn von der Standard-Validierungsmatrix (in der Regel: Mais) abgewichen wird. • Weitere Fehlerquellen können Umweltfaktoren wie z. B. die Umgebungstemperatur während der Testdurchführung sein. Die Antikörper-Antigen-Bindungsreaktion - das Detektionsprinzip aller immunochemischen Tests - ist temperaturabhängig. Um genaue Ergebnisse zu erzielen, haben die Hersteller Inkubatoren entwickelt, um die Temperatur konstant zu halten und Störungen durch Temperaturschwankungen zu vermeiden. • Anwender analytischer Tests müssen angemessen geschult sein, um die Tests genau durchzuführen. Unterschiedliche Testmethoden erfordern unterschiedliches Anwender-Know-how. Die LFD-Tests sind die am einfachsten durchzuführenden Mykotoxin-Tests. Eine kurze Einweisung reicht aus, um Bedienungsfehler dieser Methode auf ein Minimum zu reduzieren.
Welche Verantwortung trägt der Testkit-Hersteller? Was kann ein Testkit-Hersteller tun, um sicherzustellen, dass die mit seinen Testkits erzielten Ergebnisse genau und zuverlässig sind? Zunächst muss auch ein Testkit-Hersteller die Benutzer über die Bedeutung einer korrekten Probenahme aufklären, da dies für die Ergebnisgenauigkeit entscheidend ist. Als nächstes wird er die Genauigkeit seines Testkits bestätigen, üblicherweise indem er eine Validierungsstudie durchführt, die USDA-GIPSA oder AOAC Richtlinien Ein Magazin von Romer Labs®
88% Stichprobenfehler
Charge
10% Fehler durch Probenteilung
Stichprobe
2% Analysenfehler
Teilprobe
Analyse
Nach Whitaker & Dicken, 1974
Der Stichprobenfehler Der Gesamtfehler eines analytischen Mykotoxin-Textergebnisses ist die Summe aus Probenahme-, Probenvorbereitung- und Analysefehlern. Hierbei trägt der Stichprobenfehler den größten Teil des Fehlers im Endergebnis bei. Dies ist darin begründet, dass Mykotoxine ungleichmäßig innerhalb einer Bulkware verteilt sind. Eine repräsentative Probenahme , vor der Probenvorbereitung und der eigentlichen Messung ist daher von großer Bedeutung. Um eine repräsentative Probe einer Bulkcharge zu erhalten emp�iehlt es sich mehrere inkrementelle Stichproben von mehreren Stellen zu nehmen. Diese inkrementellen Proben werden zu einer Sammelprobe gepoolt. Nach Homogenisierung wird eine kleine analytische Teilprobe für die anschließende Probenvorbereitung genommen. Diese Verfahren sind im Detail in den of�iziellen Probenahmeplänen von Behörden wie der Europäischen Kommission (EC 401/2006 & EC 519/2014) beschrieben. Der große Ein�luss der Probenahme auf das Analyseergebnis macht es erforderlich, dass Stichprobenfehler auf ein Minimum reduziert werden. Die Anzahl der Probenahmestellen sowie die Probengröße der inkrementellen Proben innerhalb eines Probenahmeplans zu erhöhen ist der einfachste Weg, dies zu erreichen.
folgt. Der Testkit wird oft offiziellen Stellen für eine externe Bewertung zur Verfügung gestellt, um die angegebenen Leistungscharakteristika der Analysemethode bestätigt zu bekommen. In Validierungsstudien werden typischerweise mehrere Probenquellen verwendet, z.B. Maisproben aus verschiedenen Kontinenten, um die Zuverlässigkeit der analytischen Methode zu zeigen. Um die Robustheit eines Testsystems weiter zu verbessern müssen auch Umweltfaktoren wie die Temperatur berücksichtigt oder am besten eliminiert werden. Dies kann z. B. durch Verwendung eines Inkubators erfolgen, so dass Inkubationen unter kontrollierten Bedingungen stattfinden.
Wenn man klaren und grundlegenden Regeln folgt, muss Geschwindigkeit nicht auf Kosten der Genauigkeit gehen.
Ist die Genauigkeit der Preis den Getreideverarbeiter für schnelle Ergebnisse zahlen? Am gezeigten Beispiel wird klar, dass für eine schnelle Beurteilung von Proben Streifentests die beste Methode sind. Sie erfüllen eindeutig alle Kriterien und reduzieren darüber hinaus aufgrund ihrer Einfachheit viele Fehlerquellen. Wenn alle Regeln streng befolgt werden, muss Geschwindigkeit nicht auf Kosten der der Genauigkeit gehen. Zuverlässige und genaue Ergebnisse können in weniger als zehn Minuten erzielt werden, und sind der Schlüssel zur effizienten Analyse und Bewertung von Getreide an einer Annahmestelle.
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Um Mykotoxine für ein Testverfahren zugängig zu machen, ist eine Extraktion notwendig. Während dieses Prozesses werden Mykotoxine, die im Getreidekorn eingeschlossen sind, in eine Flüssigkeit überführt. Dies wird normalerweise mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln durchgeführt – gefährliche Substanzen, die sowohl für den Anwender als auch für die Umwelt schädlich sind. Von Philipp GRUBER
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Mykotoxine mit Wasser extrahieren geht das?
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Mykotoxin-Schnelltests: sicherer und umweltfreundlicher? Mykotoxine wie Aflatoxine oder Zearalenon sind nur mäßig in Wasser löslich.
Die Antwort liegt im Wasser.
Warum wurde nicht von Anfang an Wasser verwendet?
Während Fumonisine und Deoxynivalenol leicht mit Wasser extrahiert werden können, sind andere Mykotoxine wie Aflatoxine oder Zearalenon nicht besonders wasserlöslich. Dies hatte zur Folge, dass organische Lösungsmittel wie Chloroform, Acetonitril und Methanol im Extraktionsprozess eingesetzt werden mussten, obwohl Laboren die Nachteile der Verwendung von organischen Lösungsmitteln bekannt ist, wie ihre hohen Anschaffungs- und Entsorgungskosten und Probleme in Bezug auf die Umwelt und der Anwendersicherheit. Um Wasser in einem Extraktionsprozess hydrophober Analyten effizient zu nutzen, sollten zunächst einige Grundlagen verstanden werden.
Die Polarität von Substanzen Der Transfer von Mykotoxinen aus Getreide in eine Flüssigkeit ist nicht so einfach wie es scheint. Es hängt in erster Linie von den physikalischen Eigenschaften des zu extrahierenden Mykotoxins ab, wobei die Polarität in diesem Zusammenhang eine entscheidende Rolle spielt. Die Anordnung der einzelnen Elemente kann zu unterschiedlichen elektrischen Ladungen innerhalb eines Moleküls führen. Moleküle können so auf der einen Seite positive Ladungen und auf der anderen Seite negative Ladungen haben. Ein solches Molekül bezeichnet man als polar. Daher sind alle Substanzen einschließlich der Mykotoxinen in drei Hauptgruppen unterteilt:
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1) Polare Substanzen wie Wasser 2) Unpolare Substanzen wie Öl 3) Amphiphile Substanzen wie Seife, die sowohl polare als auch unpolare Eigenschaften haben Polare Moleküle werden auch „hydrophil” genannt, nach dem griechischen Wort für „wasserliebend”, da sie sich in Wasser lösen. Ihre Anziehung zueinander basiert auf ihren elektrischen Ladungen. Der negative Pol eines Moleküls wird elektrostatisch vom positiven Pol eines anderen Moleküls angezogen. Diese Wechselwirkung ist der Grund, warum sie mischbar sind. Salz und Zucker sind Beispiele für feste polare Substanzen. Zucker ist in Flüssigkeiten wie Kaffee perfekt löslich, zieht aber auch Feuchtigkeit aus der Luft an. Aus dem gleichen Grund werden Salze oft als Trockenmittel verwendet. Auf der anderen Seite werden unpolare Moleküle als hydrophob oder „wasserabweisend” bezeichnet. Ihre Anziehung zueinander ist eine Folge der gemeinsamen Abstoßung von Wasser und anderen polaren Substanzen. Amphiphile Moleküle haben sowohl unpolare als auch polare Eigenschaften. Seife kann zum Beispiel fettige (unpolare) Flecken von Haut, Haaren oder Kleidung anziehen und gleichzeitig an Wasser binden (polar), um sie abzuwaschen.
Die Suche nach einer harmlosen Extraktionslösung Um den Einsatz organischer Lösungsmittel zu vermeiden, wurde nach einfachen und harmlosen Möglichkeiten gesucht, Mykotoxine zu extrahieren. Spot On Ausgabe 4
Abbildung 1. Elektrostatische Anziehung: Der negative Teil eines Moleküls wird vom positiven Teil eines anderen angezogen.
Bild 1. Die stark hydrophobe Ober�läche des Lotusblattes weist Wasser ab. Die Wassermoleküle haften aneinander und nehmen eine nahezu kugelförmige Gestalt an.
Im Wasser gelöste Detergenzien haben sich als vielversprechenden Ansatz erwiesen. Detergentien, wie Seifen, sind amphiphile Substanzen. Ihre duale Natur erleichtert die Mischung von unpolaren Verbindungen wie Aflatoxinen mit Wasser. Auf molekularer Ebene gruppieren sich die Detergenzien um das unpolare Mykotoxin mit ihrem unpolaren Anteil, während der polare, wasserlösliche Rest im Wasser verbleibt. Diese Eigenschaft ermöglicht es Detergenzien, unpolare Mykotoxine aus festen Lebens- oder Futtermitteln buchstäblich in Wasser auszulaugen. Ein weiterer Vorteil eines solchen Verfahrens besteht darin, dass Detergentien auf der einen Seite die unpolaren Substanzen extrahieren, während gleichzeitig das Wasser, die polaren Substanzen extrahiert. Auf diese Weise können mit einer einzigen Extraktion verschiedene Mykotoxine mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften in Lösung gebracht werden.
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Wasserstoffbrückenbindung
WATEX - Die umweltschonende Lösung, die funktioniert Aufgrund der unterschiedlichen Arten von Mykotoxinen und ihrer jeweiligen Polaritäten kann Wasser allein nicht die Lösung sein. Es ist die Kombination von Wasser und Detergentien (in Form von löslichen Pufferbeuteln), die in der Lage ist, mehrere Mykotoxine mit verschiedenen chemischen Eigenschaften gleichzeitig zu extrahieren. Da der Extraktionspuffer frei von gefährlichen Substanzen ist, können die Anwender sicher und schnell Mykotoxinanalysen durchführen, ohne die Umwelt zu belasten.
Wasser alleine kann nicht die Lösung sein.
Was haben Wäsche waschen und Mykotoxine extrahieren miteinander gemeinsam Wenn Kleidung gewaschen wird, müssen Öltröpfchen, die Schmutzpartikel (a) enthalten, entfernt werden. Durch Zugabe eines Waschmittels während des Waschzyklus vermischen sich Seifenmoleküle mit Wasser und kommen mit dem Textilgewebe in Kontakt (b). Die „ölliebenden” (hydrophoben) Enden der Seifenmoleküle werden an dem Öl / Schmutz angelagert, während ihre wasserliebenden (hydrophilen) Enden im Wasser verbleiben. Wenn sich genügend Seifenmoleküle an den a
b
Ölpartikel angelagert haben, bildet sich ein Vesikel, der in Wasser löslich ist (c). Die Taumelbewegung während des Waschzyklus schlägt die ölhaltigen Vesikel ins Waschwasser und entfernt sie aus dem Textilgewebe. So wie hydrophobe Schmutzpartikel aus Textilien entfernt werden, werden hydrophobe Mykotoxine aus den Getreidepartikeln in Lösung gebracht. Die Schüttelbewegung während der Extraktion bringt die eingekapselten Mykotoxinvesikel in Lösung und macht sie damit für den Nachweis zugänglich. c
Quelle: Beatrice the Biologist
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MYKOTOXIN-ERGEBNISSE
SCHNELL ZUVERLÄSSIG VOR ORT. SAMPLE ID:
BR-11071 COMMODITY:
CORN
3.4 ppb Deoxynivalenol: 0.8 ppm Aflatoxin:
AgraStrip® Pro WATEX® ermöglicht die schnelle und einfache Vor-Ort-Quantifizierung von Mykotoxinen in einer Vielzahl von landwirtschaftlichen Rohstoffen. Der optimierte Arbeitsablauf reduziert die Schritte auf ein absolutes Minimum, während unabhängige und gleichzeitige Tests für bis zu vier Proben neue Maßstäbe in Genauigkeit und Benutzerfreundlichkeit setzen. Erfahren Sie mehr unter www.romerlabs.com