18(supl)

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Revista MVZ Córdoba Journal MVZ Córdoba EDITOR

Marco González T. M.Sc. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COEDITOR CO-EDITOR

Salim Máttar V. Ph.D. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

ASISTENTES DEL EDITOR - ASSISTANT EDITORS Luis Carlos Salgado A. Ing. German Arrieta B, M.Sc. Diva Santana C, Lic. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COMITÉ EDITORIAL - EDITORIAL COMMITTEE James N. Mills Nelson Alvis G. Raúl Poutou P. Oscar Vergara G.

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA U. de Cartagena, Cartagena, Colombia Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá Universidad de Córdoba, Colombia

COMITÉ CIENTIFICO - SCIENTIFIC COMMITTEE Nicholas Komar Maria Aguero R. Joaquín Quilez C. Claudio C. Fonseca Priscila V. Logato Marcelo B. Labruna

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA N. Y. Medical College, USA U. de Zaragoza, España U. Fed. de Vioçosa, Brasil U. Fed. de Lavras, Brasil U. de São Paulo, Brasil

Jorge Salazar B. Juan Carulla F. Henry Grajales L. Claudia Jiménez E. Agustin Góngora O. Sandra Pardo C.

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

Texas Tech. University U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. de Los Llanos, Colombia U. Nacional, Colombia

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Revista MVZ Córdoba Journal MVZ Córdoba

Categoría A1 Impresa desde Volumen 1, número 1, año 1994 Printed effective with Volume 1, issue 1, 1994 Publicación cuatrimestral - Published triannualy ISSN 0122-0268 Rev.MVZ Córdoba © 2013 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia.

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Revista MVZ Córdoba Volumen 18

OCTUBRE

Suplemento

CONTENIDO EDITORIAL El índice de niebla y la escritura científica Marco González, Salim Mattar

3605

ORIGINAL Comportamiento predestete de cabritos cruzados en Guanajuato, México Sonia Castillo, Jorge Rivera, Arnoldo González, Juan Martínez

Efecto de la aplicación de GnRH y D-Cloprostenol en las tasa de gestación y prolificidad en ovejas Pelibuey Jaime Martínez, Oziel Montañez, Alejandro Ley, Fernando Izaguirre, María Velazco, Juan Aguirre

Supervivencia de postlarvas de camarón blanco Litopenaeus vannamei a diferentes salinidades y temperaturas Juan Arzola, Pablo Piña, Mario Nieves, María Medina

Selección por conformación de reproductores de tilapia roja Oreochromis sp., mediante prueba de progenie Hermes Pineda, Mónica Taborda, Alejandro Hernández

Evaluación biológica de una fracción de la esponja marina Topsentia ophiraphidites del Caribe colombiano Lina Blandón, Diana Márquez, Juan López, Maria Márquez

Efecto del alimento sobre variables productivas de dos especies de cladóceros bajo condiciones de laboratorio Angélica Otero, Marcela Muñoz, Víctor Medina-Robles, Pablo Cruz-Casallas

Evaluación in vivo de Lactobacillus plantarum como alternativa al uso de antibióticos en lechones Henry Jurado-Gámez, Cristina Ramírez T, Javier Martínez B

Productividad acumulada y su relación genética con características reproductivas en hembras Brahman Orlando Duitama, Luis González, Diogo Garcia, Michel Farah, Ricardo da Fonseca

Polimorfismos del gen BoLA-DRB3.2 en ganado criollo colombiano

Darwin Hernández, Andrés Posso, Jaime Muñoz, Guillermo Giovambattista, Luz Álvarez

Efecto del plasma seminal sobre el estado redox del semen equino criopreservado Edison Pizarro, Giovanni Restrepo, José Echeverry, Benjamín A Rojano

Oferta de pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum), tercio de lactancia y perfil de ácidos grasos lácteos Juan Vargas M, José Mojica R, Martha Pabón R, Juan Carulla F

3607

3612

3618

3626

3633

3642

3648

3658

3665 3672

3681

Revista MVZ Córdoba Volumen 18

OCTUBRE

Suplemento

Inhibición de colonización intestinal por Vibrio cholerae con Lactobacillus acidophilus1 en conejos lactantes Alvaro Pazos, Milena Guerrero

Caracterización de un modelo de diabetes tipo 2 en ratas Wistar hembra María Figueroa, Ismael Pérez, Ricardo Mejía

Identificación de un polimorfismo del gen Est9 relacionado con resistencia a piretroides en Rhipicephalus (Boophilus) microplus Edgar Diaz, Gustavo Vallejo

Evaluación de la nisina como sustancia inactivadora de Bacillus licheniformis en el extracto líquido de café Leidy Sierra, Olga Montoya, Héctor Ciro-V

Clarificación combinada y evaluación sensorial de jugo de marañón (Anacardium occidentale L.) Guillermo Arrázola, Armando Alvis, Jorge Osorio

Actividad mutagénica y genotóxica del material particulado PM2.5 en Cúcuta, Colombia Ricardo Beleño, Alfonso Quijano, Iván Meléndez

3689 3699

3708

3715

3722 3731

COMUNICACIÓN BREVE Identificación de ectoparásitos en oso melero (Tamandua tetradactyla), Estado LaraVenezuela María Forlano, Franklin Mujica, Johanmary Gallardo, José Rodríguez

3738

Instrucciones para los autores

3743

Journal MVZ Córdoba Volume 18

OCTOBER

Supplement

CONTENTS EDITORIAL The fog index and scientific writing Marco González, Salim Mattar

3605

ORIGINALS Pre-weaning performance of crossbred goat kids from Guanajuato, Mexico Sonia Castillo, Jorge Rivera, Arnoldo González, Juan Martínez

Effect of GnRH and D-chloprostenol application on pregnancy and prolificacy rates on Pelibuey ewes Jaime Martínez, Oziel Montañez, Alejandro Ley, Fernando Izaguirre, María Velazco, Juan Aguirre

Survival of white shrimp Litopenaeus vannamei poslarvae at different salinities and temperatures

3607

3612

Juan Arzola, Pablo Piña, Mario Nieves, María Medina

3618

Selection by conformation of broodstocks of red tilapia Oreochromis sp., by progeny testing Hermes Pineda, Mónica Taborda, Alejandro Hernández

3626

Biological evaluation of a fraction from the colombian Caribbean sponge Topsentia ophiraphidites Lina Blandón, Diana Márquez, Juan López, Maria Márquez

Effect of food intake on productive variables of two species of cladocera, under laboratory conditions Angélica Otero, Marcela Muñoz, Víctor Medina-Robles, Pablo Cruz-Casallas

In vivo evaluation of Lactobacillus plantarum as an alternative to antibiotics uses in piglets Henry Jurado-Gámez, Cristina Ramírez T, Javier Martínez B

Accumulated productivity and its genetic association with reproductive traits in females Brahman Orlando Duitama, Luis González, Diogo Garcia, Michel Farah, Ricardo da Fonseca

Polymorphism of BoLA-DRB3.2* gen in creole colombian breeds

Darwin Hernández, Andrés Posso, Jaime Muñoz, Guillermo Giovambattista, Luz Álvarez

Effect of seminal plasma on the redox state of cryopreserved stallion semen Edison Pizarro, Giovanni Restrepo, José Echeverry, Benjamín A Rojano

kikuyo grass (Pennisetum clandestinum) Allowance, state of lactation and milk fatty acid profile Juan Vargas, José Mojica, Martha Pabón, Juan Carulla

3633

3642

3648

3658

3665

3672

3681

Journal MVZ Córdoba Volume 18

OCTOBER

Supplement

Lactobacillus probiotics may prevent Vibrio cholerae colonization in rabbits newborn Alvaro Pazos, Milena Guerrero

Characterization of a type 2 diabetes model in female Wistar rats María Figueroa, Ismael Pérez, Ricardo Mejía

Identification of a gene polymorphism Est9 associated with resistance to pyrethroids in Rhipicephalus (Boophilus) microplus Edgar Diaz, Gustavo Vallejo

3689

3699

3708

Evaluation of the nisin as inactivator substance of Bacillus licheniformis into coffee liquid extract Leidy Sierra, Olga Montoya, Héctor J. Ciro-V

Combined clarification and sensory evaluation of cashew juice (Anacardium occidentale L.) Guillermo Arrázola, Armando Alvis, Jorge Osorio

Mutagenic and genotoxic activity of particulate matter PM2.5 from Cucuta, Colombia Ricardo Beleño, Alfonso Quijano, Iván Meléndez

3715

3722

3731

BRIEF COMMUNICATION Identification of ectoparasites from an lesser anteater (Tamandua tetradactyla), Lara State, Venezuela María Forlano, Franklin Mujica, Johanmary Gallardo, José Rodríguez

3738

Instructions to the authors

3743

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3605-3606, 2013.

EDITORIAL

El índice de niebla y la escritura científica The fog index and scientific writing Los géneros literarios grosso modo son el épico, el lírico, el dramático y el didáctico. Estos a su vez se dividen subgéneros que le dan más aún un carácter particular a cada obra (1). Por ejemplo, entre los subgéneros didácticos se encuentran la oratoria, la historia, la biografía, el ensayo, etc. (2). Este último, es definido por Pérez (3) como “un escrito en prosa que expone sin rigor sistemático, pero con hondura y sensibilidad, una interpretación personal sobre cualquier tema, sea filosófico, histórico, literario, científico, etc.”.

Tratando de clasificar de manera irreverente y ligera en qué género o subgénero podría clasificarse la escritura de artículos científicos, pensamos que quizás encajarían en el ensayo. No obstante, en nuestra experiencia como editores y autores de artículos científicos, consideramos que se nos olvida justamente que los artículos científicos no son obras literarias y escribimos más de la cuenta en muchas ocasiones, lo cual trae consecuencias negativas tanto para el escrito mismo como para los lectores. Entonces, si cada género literario tiene su propia finalidad, la de los artículos científicos es la de informar de manera clara, expositiva y argumentativa los resultados de una investigación (2).

Reconocemos que nosotros como autores de artículos científicos, en reiteradas ocasiones, no observamos algunas reglas gramaticales, lo que dificulta la comprensión del manuscrito por parte de los lectores, así como su traducción a otro idioma. En ese sentido, en nuestra labor editorial en la Rev. MVZ Cordoba se vela por la utilización de palabras comunes en el español internacional, con el fin de que podamos entendernos desde México hasta la Patagonia y en España. Además, es conveniente emplear palabras cuyo origen sea el latín para que los lectores no hispanohablantes puedan entender vocablos sin dificultad y para facilitar la traducción, lo cual es uno de los objetivos de la Rev. MVZ Cordoba. La escritura científica debe ser precisa para que el lector comprenda de manera exacta el significado de las palabras; por tanto, el lenguaje utilizado debe ser el denotativo, es decir, debe ser especieespecífico para hacer alusión a términos de las ciencias biomédicas y no el connotativo que está destinado para los géneros literarios. Sabemos también que cada autor tiene su propio estilo, pero se debe escribir de una manera sencilla, clara y directa, evitando la utilización de adornos literarios y de ambigüedades.

Si bien no existe una fórmula mágica que nos ayude a escribir (tarea nada fácil) someter nuestro escrito al cálculo del índice de niebla puede ser útil. El índice de niebla de Gunning (4), es una medida de la legibilidad de un escrito que se utiliza en lingüística. El índice se basa en dos indicadores: la longitud de las frases y de las palabras. Aunque el índice fue creado para el inglés y no para el español, puede ser un buen ejercicio aplicarlo a nuestros escritos para tratar de mejorarlos.

Para que el lector calcule el índice de niebla, debe seleccionar un fragmento de 100 palabras de su escrito sin omitir ninguna frase. Asimismo debe calcular el promedio de la longitud de 3605

3606

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

las frases dividiendo el número de palabras totales entre el número de frases del fragmento, contabilizar las palabras con tres o más sílabas (palabras complejas), no incluir nombres propios o palabras compuestas, sumar el promedio de longitud de las frases y el porcentaje de palabras complejas y multiplicar el resultado por 0.4. Un índice de niebla ideal deber estar entre 6 y 11. Si el resultado le da valores más altos, el lector debería revisar su escrito y tratar de simplificarlo. Pero si las cuentas no le dan, no se preocupe, en internet existen varios sitios gratis en donde se pueden hacer todos estos ejercicios automáticamente, así como las aclaraciones y ajustes del caso (5,6).

Creemos, entonces, que el cálculo del índice niebla, es un recurso que tenemos los escritores de artículos científicos para evaluar la redacción de nuestros propios manuscritos. Esperamos que lo utilicen y buena suerte.

Marco González T. M.Sc.

Salim Mattar V. Ph.D.

REFERENCIAS

1. Maestro JG. Crítica de los géneros literarios en el Quijote. Idea y concepto de género en la investigación literaria. Vigo, España: Editorial Academia del Hispanismo; 2009.

ISBN 978-84-96915-41-1 2. Bibliotecas virtuales. [sitio web en Internet].

Los géneros literarios. [consultado Octubre de 2013]. URL Disponible en: http://www. bibliotecasvirtuales.com/biblioteca/articulos/ literatura.asp.

3. Pérez H. Comprensión y producción de textos educativos. Bogotá, Colombia: Cooperativa Editorial Magisterio; 2006.

4. Antoja RF. Comunicación: lenguaje y niebla. Rev Lab Clin 2009; 2(4):153– 154. URL Disponible en: http://zl.elsevier. es/es/revista/revista-del-laboratorioclinico-282/articulo/comunicacion-lenguajeniebla-13143088 5. Ovares Barquero F, Rubí Barquero J. Variación del índice de niebla usando un corpus obtenido a partir de los libros digitalizados por Google.

UNICIENCIA 2010; 24(1):133-141.

6. Gunning Fog Index. [sitio web en Internet]. [consultada Octubre de 2013]. URL Disponible en: http://gunning-fog-index.com/index. html

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3607-3611, 2013.

ORIGINAL

Comportamiento predestete de cabritos cruzados en Guanajuato, México Pre-weaning performance of crossbred goat kids from Guanajuato, Mexico Sonia Castillo-Rodríguez,1 M.Sc, Jorge Rivera-Sandoval,2 M.Sc, Arnoldo González-Reyna,1 Ph.D, Juan Martínez-González,*1 Ph.D. Universidad Autónoma de Tamaulipas, Facultad de Ingeniería y Ciencias, Secretaría de Posgrado e Investigación. Tamaulipas, México. 2Gobierno del Estado de Guanajuato. Guanajuato, México. *Correspondencia: jmartinez@uat.edu.mx 1

Recibido: Abril de 2012; Aceptado: Mayo de 2013.

RESUMEN Objetivo. Los pesos al nacimiento y al destete fueron registrados para evaluar el comportamiento predestete de cabritos cruzado en ocho pequeñas fincas de producción de leche de cabra en Guanajuato, México. Materiales y métodos. Se usaron 234 registros de cabritos, las cabras fueron mantenidas en condiciones de pastoreo con suplementación de un concentrado comercial. Los cabritos eran cruzados, de las razas Sannen, Alpina y Toggenburg, los datos fueron analizados con un modelo estadístico que considero los efectos de rebaño (RE), grupo contemporáneo (GC), número de parto (NP), tipo parto (TP) y sexo del cabrito (SC). Resultados. Las medias de peso al nacer, peso a los 60 días de edad y la ganancia diaria de peso fueron 3.4±0.5 (rango 2.0 a 5.5), 13.7±1.8 (rango 8.0 a 17.5) y 0.17±0.02 (0.08 a 0.23 kg). El peso al nacimiento fue afectado (p<0.01) por RE, GC, NP, TP y SC. Sin embargo, el peso a 60 días y ganancia diaria de peso fueron afectadas (p<0.05) por RE y SC. Conclusiones.

El rebaño afectó el comportamiento de los cabritos.

Palabras clave: Cabritos, comportamiento, rebaños (Fuente: CAB).

ABSTRACT Objective. Birth and weaning weights were recorded, to valuate pre-weaning performance of crossbred kids, in eighth small milk goat flocks, from Guanajuato, Mexico. Materials and methods. Records of 234 kid dings were used; the goats were kept under grazing rangeland with supplementation of commercial concentrate. The kids were crossbred between Sannen, Alpine and Toggenburg breeds.

Data was analyzed by a statistical model in which the flock effects (FL), contemporary group (CG), parity number (PN), litter size (LS) and sex of the kid (SK) were considered. Results. Birth weights averaged 3.4±0.5 kg (range 2 to 5.5 kg) and weight at 60 days of age averaged 13.7±1.8 kg (range 8.0 to 17.5 kg); and daily weight gain averaged 0.17±0.02 kg (range 0.08 to 0.23 kg). Birth weights were affected (p<0.01) by FL, CG, PN, LS and SK. However, weight at 60 days and daily weight gain were affected (p<0.05) by FL and SK. Conclusions. The flock affected the performance of the kids.

Key words: Flocks, goats kids, performance (Source: CAB).

3607

3608

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

INTRODUCCIÓN En México el aprovechamiento de la cabra como animal productor de carne y leche data desde la época de la colonia, así fue como se generalizó el consumo de su carne a través de platillos como: el cabrito al pastor, la birria y la barbacoa. Hoy en día la caprinocultura se ha vuelto una actividad ganadera atractiva para los productores de bajos recursos (1). Es bien conocida la capacidad que tienen las cabras para convertir los forrajes toscos en fuentes de alimentos como la carne y la leche. También, las cabras proporcionan una diversidad de productos, destacando su fibra que se usa para la elaboración de mohair y vestidos de casimir.

El inventario de ganado caprino para el Estado de Guanajuato en el año de 2008 fue de 559,239 cabezas (2), en aproximadamente 400 granjas que se dedican a la producción de leche. El tamaño del rebaño en las granjas puede estar constituido desde 10 cabezas hasta algunos cientos de cabras con un promedio de 70 cabezas (3).

Algunos factores que limitan la productividad de las cabras son: el sistema de producción, los programas de alimentación, falta de programas reproductivos y falta de organización para la comercialización de los productos.

En México se pueden caracterizar tres sistemas de producción: el primero lo constituyen los sistemas extensivos, que se basan en el aprovechamiento de los agostaderos de las zonas áridas y semiáridas y en los que predominan los fenotipos Criollos o encastados con nubiana; el principal producto es el cabrito mamón y los animales de desecho. El segundo grupo lo conforman los sistemas semi-intensivos, que se ubican principalmente en la Laguna y el Bajío, generalmente manejan rebaños encastados o de razas especializadas como Saanen y Alpina, la base de la alimentación la conforman el pastoreo, el aprovechamiento de esquilmos agrícolas y concentrados. Mientras que el tercer grupo está conformado por sistemas intensivos (estabulados), dedicados a la producción de leche y/o de pie de cría.

Por otro lado, el mejoramiento genético de los caprinos deberá contestar algunas interrogantes para decidir el plan a seguir, como son: cuál es el sistema de producción, con qué razas, con qué recursos y las demandas del mercado al que se quiere acceder. Es importante mencionar que los pesos y las ganancias diarias de peso en cabritos se han mejorado. Sin embargo, no se conocen en México resultados en sistemas de producción semi-intensivos, como es el caso del altiplano.

Por tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar los efectos de algunos factores ambientales (rebaño, grupo contemporáneo, número de parto, tamaño de la camada y sexo del cabrito) sobre comportamiento productivo (peso al nacimiento, peso al destete y ganancia diaria de peso) de cabritos en el Estado de Guanajuato, México.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. El presente trabajo se realizó con la información registrada en ocho fincas caprinas del Estado de Guanajuato, México.

Localizado geográficamente a los 100º 59’ 50” LO, 20º 37’ 35” LN y a 1.750 msnm. El clima está clasificado como semi-caluroso y subalternohúmedo con las lluvias en verano, la precipitación y temperatura media anual son de 628 mm y 19.5ºC, respectivamente (3).

La vegetación está principalmente compuesta por bosques de encino (Querqus spp.), matorral espinoso (Acacias spp.) y pastizal amacollado arborescente, con predominio de especies forrajeras como zacatón (Panicum máximum Jacq.), lobero (Buchloe dactyloides Nutt.

Engelm), navajita (Bouteloua gracilis H.B.K. Lag. ex Steud), colorado (Panicum coloratum L.), lanudo (Holcus lanatus), cola de zorra (Setaria parvifolia), banderita (Bouteloua curtipendula Michx. Torr.), búfalo (Trichoposgon capitatum), mezquite (Prosopis laevigata Humb. & Bonpl. ex Willd. M. C. Johnst.) y otras especies como pingüica (Arctostaphylos pungens), nopal (Opuntia spp.), largoncillo (Acacia constricta var. Vernicosa standl), tepehuajes (Acacia acapulsensis Kunth.), palo blanco (Calycophyllun multiflorum), órgano (Carnegea gigantea) y garambullo (Myrtillocactus geometrizans) (4).

Muestra. Entre las fincas existe una gran diversidad en cuanto a infraestructura, algunas cuentan solo con corrales rústicos para el confinamiento del rebaño, construidos con postes de madera, tela borreguera y dos hilos de alambre de púas en la parte superior. Mientras que otras cuentan con corrales de mampostería y equipados para alojar un gran número de animales.

La alimentación consistió en el pastoreo de praderas nativas e introducidas y suplementación con un concentrado comercial, la reproducción fue con inseminación artificial y monta directa.

Al momento del parto los cabritos fueron pesados en las primeras 24 horas de vida y la cría fue natural para ser destetados aproximadamente

Castillo-Rodríguez - Comportamiento predestete de cabritos cruzados a los 60 días de edad, por lo que los pesos al destete fueron ajustados a esta edad. La ganancia de peso diaria fue estimada (GPD) por la diferencia entre pesos del nacimiento al destete divido entre los días trascurridos.

Análisis estadístico. Los datos fueron analizados usando el procedimiento de modelos lineales generales (5) que consideró los efectos de finca, grupo contemporáneo (GC), número de parto, tipo de parto, sexo del cabrito y sus interacciones, mediante el siguiente modelo estadístico: Yijklm = µ+FIi+GCj+NPk+TPl +(NP*TP)+SCm+ Eijklm Donde: Yijklm = variable de respuesta (peso al nacimiento, peso al destete y ganancia diaria de peso) µ = media general FIi = efecto de la i-ésima finca, GCj = efecto del j-ésimo grupo contemporáneo, NPk = efecto del k-ésimo número de parto, TPl = efecto del l-ésimo tipo de parto, (NP*TP) interacción, SCm = efecto del m-ésimo sexo del cabrito y Eijklmn = error experimental ~ (0, σ2).

Tabla 2. Medias de peso al nacer (PN), peso al destete (PD) y ganancia diaria de peso predestete (GDP) de cabritos en Guanajuato, México.

Característica

Tabla 1. Análisis de varianza para peso al nacer (PN), peso al destete (PD) y ganancia diaria de peso predestete (GDP) de cabritos en Guanajuato, México.

PN CM Pr>F 2.63 **

gl 4

PD CM Pr>F gl 5.06 * 4

GDP CM Pr>F 0.001 *

2.55

**

4

3.20

NS

4

0.001

NS

2.02

**

4

2.59

NS

4

0.001

NS

2

4.76

**

2

0.20

NS

2

0.001

NS

1

12.67

**

1

9.66

*

1

0.003

*

6

1.20

**

5

0.91

NS

5

0.003

NS

1 0.002 121 0.001

NS

Fuente de variación gl Finca 7 Grupo 4 contemporáneo Número de parto Tamaño de la camada Sexo de la cría NP*TC

4

Peso al nacer Error

209 0.35

1 78.59 121 1.58

Total

233

142

**

142

gl=grados de libertad, CM=Cuadrado medio, **=p<0.01, *=p<0.05, NS=no significativo.

PN (kg) Media

42 19 39 100 34

4.16 3.32 3.31 3.27 3.04

Tamaño de la camada Sencillo Gemelos Triates

45 152 37

3.62 3.43 3.04

Sexo del cabrito Macho Hembra

114 120

3.67 3.16

a b b b b

a a b

PD (kg) n Media

GDP (g) n Media

29 19 33 39 23

14.50 13.21 13.23 13.64 13.59

29 19 33 39 23

166 165 166 170 173

35 91 17

13.74 13.67 13.41

35 91 17

168 168 166

69 74

a b

14.31 13.04

a b

69 74

174 162

a b

a, b, c son diferentes p<0.05

De igual modo, se observaron diferencias significativas (p<0.01) de número y tipo de parto (Tabla 1). En este estudio las cabras de cinco partos produjeron los cabritos más pesados al nacimiento (3.81 kg; Figura 1). En cuanto al sexo del cabrito este también tuvo efectos significativos (p<0.01) sobre el peso al nacer (Tabla 1). Los cabritos pesaron 0.50 kg más al nacimiento que las hembras (Tabla 2).

Peso al nacer (kg)

Peso al destete (kg)

16 14 Peso (kg)

En el presente estudio la media general para peso al nacimiento fue de 3.41±0.83 kg. En la tabla 1 se puede observar que existieron diferencias significativas (p<0.01) de finca y grupo contemporáneo (GC). Los cabritos del GC 1 pesaron 1.07 kg más al nacimiento que los del GC 5 (Tabla 2). Los pesos de los cabritos variaron entre las fincas, siendo más pesados en las explotaciones donde se daban los niveles más altos de suplementación.

n

Grupo contemporáneo 1 2 3 4 5

Las diferencias entre medias de los efectos principales fueron estimadas a través de la prueba de Duncan (5).

RESULTADOS

3609

12 10 8 6 4 2 0 1

2

3

4

5

Número de parto

Figura 1. Medias de peso al nacer y peso al destete de cabritos de razas lecheras de acuerdo al número de parto de la cabra en Guanajuato, México.

Con relación al peso al destete ajustado a 60 días se encontró una media de 13.65±1.79 kg. En este estudio solo la finca y el sexo de la cria afectaron significativamente (p<0.01) los pesos al destete (Tabla 1). Los cabritos machos superaron a las hembras en 1.27 kg al destete (Tabla 2). El peso al nacimiento (como covariable) afectó el peso al destete (p<0.01), los cabritos más pesados al nacimiento también fueron más pesados al destete.

Con relación a la ganancia diaria de peso la media fue de 168±24 g. En la tabla 1 se puede apreciar que la finca y el sexo del cabrito afectaron (p<0.01) la ganancia diaria de peso. En este estudio los machos superaron a las hembras en 12 g más la ganancia diaria de peso (Tabla 2).

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DISCUSIÓN En el presente estudio la media de peso al nacimiento fue similar a la citada por Peña et al (6), Martínez et al (7), Merlos et al (8) y Leal et al (9), Mellado et al (10) y Martínez et al (11) quienes encontraron que el peso al nacer de los cabritos alcanzó los 3.4 kg en promedio.

Sin embargo, Martínez et al (12) encontraron pesos inferiores al del presente estudio. Brown et al (13) reportaron que los cabritos hijos de sementales Boer alcanzaron pesos al nacer de 4.1 kg por tratarse de una raza netamente productora de carne.

Como era de esperarse la finca y el grupo contemporáneo afectaron los pesos de los cabritos, siendo más pesados en las explotaciones donde se daban los niveles más altos de suplementación.

Merlos et al (8) también encontraron efecto significativo del año de nacimiento sobre el peso al nacer. Resultados que pueden ser atribuidos a las diferencias ambientales entre años en cuanto a precipitación, dado que la disponibilidad de forraje esta íntimamente relacionada con esta.

Sin embargo, Martínez et al (7) no observaron efecto del mes de nacimiento en rebaños bajo condiciones similares de manejo.

De igual modo, el número y tipo de parto fueron fuentes importantes de variación en el peso al nacer de los cabritos. Martínez et al (12) encontraron que los pesos al nacer para cabritos de simples, mellizos y trillizos fueron de 3.4, 3.0 y 2.6 kg, respectivamente. Similarmente, Merlos et al (8) citaron que los pesos al nacer de cabritos fueron 3.5 y 3.1 kg para los sencillos y gemelares, respectivamente. En este estudio los cabritos machos pesaron más al nacimiento (8,12).

El peso al destete fue similar al de otros estudios (8,9). Sin embargo, Martínez et al (12) encontraron un peso inferior (13.2 kg) para cabritos destetados en fincas ubicadas en la misma área de estudio.

Al igual que en el peso al nacimiento la finca y el sexo del cabrito afectaron el peso al destete.

Merlos et al (8) encontraron que el sexo del cabrito afectaba el peso al destete en el trópico seco del Estado de Guerrero. Las diferencias pueden probablemente ser explicadas por el manejo entre las fincas y los niveles de suplementación que suministraban individualmente. Además, en casi todas las especies, los machos siempre son más pesados que las hembras.

La media de ganancia diaria de peso encontrada en este estudio se puede considerar como aceptable, otros investigadores (14,15) encontraron ganancias diarias de peso a las 10 semanas de edad de 109 g. Similarmente, Díaz et al (16) encontraron que la ganancia diaria de peso de cabritos alimentados con diferentes niveles de soya en el sustituto de leche, tuvieron ganancias diarias de 138 g.

En este estudio la finca y el sexo del cabrito fueron fuentes de variación importantes en la ganancia diaria de peso. Meneses et al (14) al trabajar con diferentes manejos de la alimentación encontraron efectos significativos debido a manejo (p<0.05). El diferente comportamiento de los cabritos entre fincas se puede explicar probablemente por las diferencias en manejo y nivel de suplementación.

En conclusión los datos presentados aquí, representan una muestra muy pequeña de la población de cabras del Estado de Guanajuato, México por lo que los resultados deben interpretarse como tal. El peso al nacimiento, la ganancia diaria de peso y el peso al destete fueron más elevados que los tradicionalmente esperados para cabras productoras de leche. Los efectos de la finca sobre el comportamiento de los cabritos dan indicios que se pueden mejorar los parámetros productivos si se homogenizan los manejos entre las fincas. Como en casi todas las especies el número de parto de la cabra afectó el peso al nacer de las crías.

REFERENCIAS 1. Hernández ZJ. La caprinocultura en el marco de la ganadería poblana (México): Contribución de la especie caprina y sistemas de producción. Arch Zootec 2000; 49: 341-352.

2. Sistema de Información Agroalimentaria y Pesquera. 2008 (fecha de acceso 15 de marzo de 2010). México DF. Disponible en http://www.siap.gob.mx/ventana. php?idLiga=992&tipo=1

Castillo-Rodríguez - Comportamiento predestete de cabritos cruzados

3611

3.

Instituto Nacional de Estadística Geografía e Informática. 2007 (fecha de acceso 15 de octubre de 2009). México DF Disponible en http://www.inegi.gob.mx/inegi/default. aspx?s=geo&c=&e=11

10. Mellado M, Mellado J, Garcia JE, Lopez R. Lifetime reproductive performance of goats as a function of growth traits and reproductive performance early in life. J Appl Anim Res 2005; 27: 113-116.

4.

Carranza GE. Conocimiento actual de la flora y la diversidad vegetal del Estado de Guanajuato, México. Primera Semana Estatal de Ecología Guanajuato; 2002 Jun 3 a 7; Guanajuato, Guanajuato, México. Instituto de Ecología del Estado de Guanajuato; 2002.

11. Martínez JC, Zúñiga JH, Soto JJ, de León R. Peso al nacer y a la venta de cabritos en un sistema de pastoreo trashumante en Burgos, Tamaulipas. Memoria. II Taller sobre sistemas de producción ovina del Noreste y Golfo de México; 2002 Nov 26 a 29; Cd. Victoria, Tamaulipas, México. Universidad Autónoma de Tamaulipas; 2002.

5. SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 8.2, 6th Ed.). Cary NC: SAS. Inst. Inc., 2001.

6.

7.

Peña F, Doménech V, Acero R, Perea J, García A. Efecto de sistemas de crianza (leche de cabra vs. sustitutivo lácteo) y sexo en cabritos de raza Florida sobre su crecimiento y características de la canal.

Rev Cient (FCV-LUZ) 2009; 19: 619-629.

Martínez JC, Rivera JP, González A. Preweaning performance of crossbred goat kids, from Juventino Rosas, Guanajuato.

Proceeding of the 9th International Conference on Goats; 2008 Ago 31-Sep 5; Querétaro, Querétaro, México. International Goat Association; 2008.

8.

Merlos MI, Martínez RD, Torres G, Mastache AA, Gallegos J. Evaluación de características productivas en cabritos Boer x local, Nubia x local y locales en el trópico seco de Guerrero, México. Vet Méx 2008; 39: 323333.

9.

Leal MJ, Gonçalves HC, Silva M, Rodrigues L, Lara GI, Lemos BB, Giassetti AP. Desempenho e medidas biométricas de caprinos de diferentes grupos raciais. Rev Bras Zootec 2007; 36: 635-642.

12. Martínez JC, Rivera JP, Lucero FA, Castillo SP. Peso al nacer y al destete de cabritos de razas lecheras en la zona del Bajío. Memoria del XXXIV Congreso Nacional de Buiatría; 2010 Ago 5 a 7; Monterrey, Nuevo León, México. AMMVEB; 2010.

13. Sánchez C, García M. Comparación de características productivas en caprinos con suplementación de bloques multinutricionales. Zoot Trop 2001; 19: 393-405.

14. Meneses R, Pérez P, Pittet J, Galleguillos P, Morales MS. Estrategia de alimentación durante la crianza de crías caprinas criollas.

Agric Téc 2001; 61: 171-179.

15. Hernández ZJS, Herrera GM, Rodero SE, Vargas LS, Villarreal EO, Reséndiz MR, Carreón LL, Sierra VAC. Tendencia en el crecimiento de cabritos criollos en sistemas extensivos. Arch Zootec 2005; 54: 429-436.

16. Díaz GM, Ochoa MA, Torres G, Bisset P, Urrutia J, Morón FJ. Efectos de la inclusión de un concentrado de proteína de soya y dos fuentes de energía en el substituto de leche en el comportamiento productivo de cabritos nubios. Rev Cient (FCV-LUZ) 2007; 17: 597-605.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3612-3617, 2013.

ORIGINAL

Effect of GnRH and D-Chloprostenol application on pregnancy and prolificacy rates on Pelibuey ewes Efecto de la aplicación de GnRH y D-Cloprostenol en las tasa de gestación y prolificidad en ovejas Pelibuey Jaime Martínez T,1 Ph.D, Oziel Montañez V,2* Ph.D, Alejandro Ley De C,1 Ph.D, Fernando Izaguirre F,1 Ph.D, María Velazco Z,3 Ph.D, Juan Aguirre M,1 Ph.D. Universidad Autónoma de Chiapas, Facultad de Ciencias Agrícolas, Chiapas, México. 2Universidad de Guadalajara, Centro Universitario del Sur, Departamento de Desarrollo Regional. Enrique Arreola Silva 883, Ciudad Guzmán, Jalisco. 49000. México. 3Universidad Autónoma de Chiapas, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, México. * Corresponding: montanez77@ hotmail.com 1

Recibido: Febrero de 2013; Aceptado: Mayo de 2013.

ABSTRACT Objective. Was to evaluate the effect of GnRH and D-Chloprostenol application on pregnancy and prolificacy rates on Pelibuey ewes. Materials and methods. Forty five ewes were randomly allocated to one of three treatments: T1(n=15), day 0: sponges with 65 mg medroxyprogesterone acetate (MPA) + 200 IU equine chorionic gonadotropin (eCG) and sponge removal (day 12) + breeding by natural mating (days 12-15); T2 (n=15), day 0: 50 µg gonadotropin releasing hormone (GnRH) + 7.5 mg D-Chloprostenol (day 5) + 50 µg GnRH (day 7) + insemination at fixed time (AIFT) 12 to 14 h after last injection of GnRH; T3 (n=15), 100 µg GnRH (day 0) + 7.5 mg D-Chloprostenol (day 5) + 100 µg GnRH (day 7) + AIFT 12 to 14 h after last injection of GnRH. Results. The average concentration of progesterone (P4) in blood was 1.22 ± 0.74 ng/mL, which was used to verify ovarian activity at the beginning of the treatments. 100% of the T1 ewes presented estrus, beginning at 38.4±9.56 h after sponge removal. There were differences (p<0.05) for pregnancy rates, of 60, 33.33 and 46.66% respectively, among the treatments. Prolificacy was no different (p>0.05) among the treatments where the values were 1.2, 1.4 and 1.4 lambs/ewe for T1, T2 and T3, Conclusions. The results of this study show that the use of GnRH and D-Chloprostenol did improve pregnancy rates but did not improve prolificacy in tropical ewes.

Key words: Estrus synchronization, ewes, pregnancy (Source: USDA).

RESUMEN Objetivo. Fue evaluar el efecto de la aplicación de GnRH y D-Cloprostenol en la tasa de gestación y prolificidad en ovejas Pelibuey. Materiales y métodos. Cuarenta y cinco ovejas fueron asignadas aleatoriamente a uno de tres tratamientos: T1(n=15), día 0: esponjas con 65 mg de acetato de medroxiprogesterona (MPA) + 200 UI de gonadotropina coriónica equina (eCG) al retirar las esponjas (día 12), servidas con monta natural (día 12-15); T2 (n=15), día 0: 50 µg de hormona liberadora de

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Martínez - Effect of application of GnRh and D-chloprostenol on Pelibuey ewes

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gonadotropinas (GnRH) + 7.5 mg de D-Cloprostenol (día 5) + 50 µg de GnRH (día 7) + inseminación a tiempo fijo (IATF) 12 a 14 h después de la segunda inyección de GnRH; T3 (n=15), 100 µg de GnRH (día 0) + 7.5 mg de D-Cloprostenol (día 5) + 100 µg de GnRH (día 7)+IATF 12 a 14 h después de la segunda inyección de GnRH. Resultados. La concentración promedio de progesterona (P4) en sangre fue 1.22 ± 0.74 ng/mL, que demostró actividad ovárica. El 100% de las ovejas de T1 presentaron estro, iniciando a las 38.4 ± 9.56 h del retiro de esponjas. El porcentaje de gestación fue diferente (p<0.05) entre T1, T2 y T3, siendo 60, 33.33 y 46.66%, respectivamente. La prolificidad no presentó diferencias (p>0.05) para T1, T2 y T3, siendo 1.2, 1.4 y 1.4 corderos/oveja parida, respectivamente.

Conclusiones. Los resultados de este estudio indican que bajo condiciones tropicales el uso de GnRH y D-Cloprostenol, mejoró el porcentaje de gestación pero no la prolificidad.

Palabras clave: Índice de gestación, ovejas, sincronización de estro (Fuente: USDA).

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

Different estrus synchronization systems exist for ewes, which is used to increase the productiveness percentages. It is very common today to use, synthetic progestogens, such as fluorogestone acetate (FGA) and medroxyprogesterone acetate (MPA), for a period of 10 to 16 days, which have proven effective for synchronizing estrus in ewes (1). In addition, application of gonadotropins, such as equine chorionic gonadotropin (eCG) and human chorionic gonadotropin (hCG), have increased the rate of ovulation and fertility when used in combination with progestogens in sheep (2); however, the pregnancy rate, is lower than through their natural estrus cycle.

Location. The study was conducted between the months of October and November of 2011, at the facilities of the Centro Universitario de Investigación y Transferencia de Tecnología CUITT (University Center for Research and Technology Transfer), San Ramón, of the Universidad Autónoma de Chiapas, located in the municipality of Villaflores, Chiapas, Mexico at 16º 14’ N and 93º 15’ W at an altitude of 610 m. The predominant climate is warm sub-humid with an average annual precipitation of 2600 mm distributed between May and November, and an average temperature of 22ºC (5).

An estrus synchronization system, known as ovsynch exists for ewes (3). This system combines the gonadotropin-releasing hormone (GnRH) with prostaglandin F 2α (PGF 2α ) to overcome problems and limitations in detecting estrus. With this method, a follicular wave is produced for the increasing GnRH pulses, causing the dominant follicle atresia and a new follicular wave is produced two or three days later (4).

After a period of seven to nine days, luteolysis is induced by applying PGF2α. A second dosage of GnRH 48 h after PGF2α causes synchronization of ovulation 8 h later. Currently, methods to control the time of GnRH administration to predict ovulation more precisely are sought (3). More research is required, on the control of combined synchronization and ovulation induction to prevent low conception rates in ewes.

This study was conducted to evaluate the effect of sponges with MPA plus eCG with natural mating (as relative control), compared to the administration of two doses of GnRH plus D-ChloprostenolTM and insemination at fixed time (IATF) on the fertility rate in Pelibuey (PEL) ewes under tropical conditions.

Animals. The animals used were 45 PEL second lambing ewes, weighing 32.4±3.8 kg with a minimum of 60 d postpartum and a body condition score of three (6), were used in a completely randomized design with 15 ewes for treatment. Each group was housed in 10 × 10 m pens with fixed feeders, automatic watering devices for ad libitum access to water, and sufficient shade. The ewes were subjected to semi-intensive management which included grazing (7:00 to 16:00 h) in African star grass (Cynodon plectostachyus) pastures. They were offered 500 g of 16% CP supplement (mineral salt, kernel corn, sorghum, fishmeal, coffee husks, and molasses) per ewe, in metal troughs. Twenty days before the trial started, all of the ewes were dewormed orally (Albendazole 4%, Mexico) and were given an intramuscular injection (IM) of ADE vitamins (Vigantol TM, Mexico). Additionally, 2.5 mL of TriangleTM Bac 8V (Bacterin toxoid, Mexico) was administered subcutaneously.

Procedure. Estrus synchronization protocols were based on MPA (Sincro gestTM, Ovejero, Spain), eCG (Folligon TM, Mexico), GnRH (Fertagyl TM, Mexico), and PGF2α (D-chloprostenolTM, Mexico).

The treatments were as follows: T1) was

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considered the control treatment, in which on d 0 a sponge with 65 mg MPA was provided and withdrawn d 12 later when 200 IU eCG was injected IM. During days 12 to 15, ewes were bred through controlled natural mating. T2) was given 50 µg GnRH on d 0, and 7.5 mg D-ChloprostenolTM on d 5, 50 µg GnRH was administered again on d 7, and artificial insemination (AIFT) 12 to 14 h after second injection of GnRH was used. T3) received 100 µg GnRH on d 0, and then on d 5, 7.5 mg D-ChloprostenolTM and 100 µg GnRH again on d 7, plus AIFT 12 to 14 h after the second injection of GnRH. Six days before the beginning of the experiment, 3 mL blood samples were taken from the jugular vein. Samples were centrifuged at 1560 × g for 15 min and stored at 2ºC until analysis. The serum was sent to the reproduction physiology laboratory of the School of Veterinary Medicine and Animal Production of the Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) to determine serum concentrations of P 4 by solid phase radioimmunoassay (RIA); concentrations below 1 ng/mL were considered indicators of an anoestrus stage, and concentrations above 1 ng mLˉ¹ were considered indicators of a reproductive stage. In domestic species, physiological status it can be defined easily by an analysis of P4 in blood or milk (7). The onset, distribution and percentage of estrus, were only measured in T1 ewes, between sponge removal and natural mating, and these were not measured in T2 and T3 due to the use of fixed time artificial insemination.

Pregnancy rate. The pregnancy rate was determined 50 d after the last mount or AITF, with a real time B mode ecograph and a 3.5 MHz transabdominal convex transductor. The percentage of estrus occurrence during the 4 days after withdrawing the intravaginal devices was quantified. The ewes were mounted by three, previously tested for health and fertility rams, 12 h after withdrawing the devices to ensure they were mounted. The onset of estrus was determined when the ewes were mating and was measured as the time interval, in hours, between removal of the sponges and mounting of the ram.

Prolificacy was quantified after lambing in all of the treatments by dividing the number of lambs born by the number of ewes that gave birth.

Statistical analysis. The data obtained on pregnancy rates and prolificacy was analyzed by the chi-square test by the software MINITAB 14 (8).

RESULTS The onset, distribution and estrus percentage were only measured in ewes T1, between sponge removal and natural mating, we found that all ewes in T1, presented estrus during the first 72 h after removing the sponges. In the first 24 h interval from estrus onset to the last application of eCG, one T1 ewe presented signs of estrus. In the interval of 24 h to 36 h, three ewes (20%) were in estrus; between 36 h and 48 h, nine ewes (53.3%) were in estrus. After 48 h, three ewes (20%) were in estrus. In T1, of the 15 ewes bred through natural mating, 100% initiated estrus in an average time of 38.4 ± 9.56 h after sponge removal.

There were differences (p>0.05) in pregnancy rates between the treatments. The results obtained were 60%, 33.33% and 46.66% for T1, T2 and T3, respectively. No differences in prolificacy were found among the treatments (p>0.05; Table 1).

Table 1. Pregnancy rate and prolificacy in ewes treated with different hormonal protocols.

Pregnancy rate Prolificacy

T1 60.0a 1.2a

Treatments1 T2 33.3b 1.4a

T3 46.6a 1.4a

T1: Application of 65 mg MPA, plus 200 UI eCG with controlled mounting; T2: Application of 50 µg GnRH, plus 7.5 mg D-ChloprostenolTM, plus 50 µg GnRH and AIFT. T3: Application of 100 µg GnRH, plus 7.5 mg D-ChloprostenolTM, plus 100 µg GnRH and AIFT. a, b values with different literal are significant (p<0.05).

1

The results of the P 4 concentration indicate that three ewes (one in T1 and two in T2) were cycling only at the beginning of the experiment with P4 average value above 1.1 ± 0.7 ng/mL in the blood.

DISCUSSION Estrus induction results are similar to those reported by Martínez-Tinajero et al (9) and Zarakawi (10), who stated that when they applied sponges impregnated with MPA and eCG, estrus began after removing the sponges. In the study conducted by Martínez-Tinajero et al (11), when estrus was synchronized with the controlled internal drug releasing (CIDR) device impregnated with 0.3 g natural P4 for 12 d, combined with 200 IU eCG, they found 100% of the F1 ewes (Damara x Merino) in estrus after removing the CIDR. Likewise, Ortega (12) observed that 89.5% of Katahdin ewes treated with intravaginal sponges containing 65 mg MPA for 14 d, plus IM application

Martínez - Effect of application of GnRh and D-chloprostenol on Pelibuey ewes of 250 IU eCG on day 12 of the treatment, began estrus. Karaca et al (13) reported a percentage of estrus induction of 90% on Polwarth ewes synchronized with intravaginal sponges with 65 mg MPA plus 250 IU eCG. Estrus synchronization in ewes is possible using sponges inserted in the vagina for 12 d. When removed, they induce estrus by simulating the effect of a drastic reduction in P4 levels in the blood stream and luteolysis, followed by re-initiation of follicle activity and appearance of estrus 1 to 2 d later. Some authors have reported this previously on wool ewes (9,10) as well as in hair sheep (14,15).

The estrus distribution results were similar to those found by Perez et al in goats (16) using sponges impregnated with 60 mg MPA. MartínezTinajero et al (9) also obtained intervals between 36 and 60 h in adult ewes treated with intravaginal sponges impregnated with 65 mg MPA and eCG, while Karaca et al (13) reported no differences in estrus response time in ewes synchronized with MPA. Fierro et al (17) mentioned that provoking CL regression and inducing estrus in ewes with two injections of PGF2α separated by 8 d is not very efficient since intervals of up to 138±13.7 h after the last application of the treatment can be achieving due to luteus regression failure in a high proportion of ewes after the last injection.

Pregnancy rates for T1 were similar to those reported by Fonseca and Torres (18), who obtained 59.9% using 200 IU eCG; Cueto and Gibbons (19) also reported a pregnancy rate of 47% with MPA, while Catalano et al (20), using a higher dosage of eCG (500 IU) plus sponges with MPA, obtained a pregnancy rate of 54% in cross-bred ewes (Frisona x Corriedale).

Kridli and Al-Khetib (21) state that the use of sponges for estrus synchronization allows controlled lambing in a high percentage of ewes (95.7%) in a short period of time (10 days), with no negative effects in pregnancy rates (86.6%). In addition, Vázquez et al (2) mention that injecting 400 IU eCG 48 h before removing the MPA sponges increases ovulation rates and, consequently, pregnancy rates. Powell et al (22) report that ovulation synchronization with analogues of the hormone GnRH has been used with better results in cattle. The application of GnRH in cattle causes ovulation of the dominant follicle at the moment of treatment, whether in the growth phase of the static phase, causing atresia of the follicles that are not in condition to ovulate and then a new wave of follicle development occurs two or three days after treatment. Boggio (23) states that the use of GnRH in ovines aims to group estrus in shorter intervals and

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induce estrus and ovulation in periods in which fertility is reduced because of the season of the year, additional to the time of year or to their nutritional state at the time of treatment (24), or perhaps because ovulation did not occur in all of the animals after treatment. Nagatani et al (25) indicate that different environmental stimuli and nutrition were considered among the most important factors in regulating the reproductive function of the animals. For this reason, it is possible that the fertility rates obtained in this experiment were affected by the time of year in which the ewes were treated. Furthermore, Hopkins et al (26) mentions that ewes kept at high environmental temperatures exhibit a reduction in their reproductive and productive behavior.

The ovsynch method has been applied and studied more in cattle than in ovines; Chevel et al (27) determined the effects of re-synchronizing after using the ovsynch protocol, administering GnRH (100 µg) on day 21 after AITF in Holstein cows, which reported a pregnancy rate of 70.9% 21 days later. Stevenson et al (28) used the ovsynch protocol in cows plus application of CIDR (1.9 g P4) before the first injection of GnRH. The sponge was removed 1 to 2 h before the PGF2α injection.

They found a conception rate of 50% 28 d later.

There is not much information in the literature on reducing the dosage of GnRH in cattle under the ovsynch protocol, but Pursley et al (29) reduced the dosage to 50 µg and reported percentages of synchronization similar to those when 100 µg GnRH were used. They mention, however, that the complete recommended dosage of PGF2α should be used for the AITF protocols.

Akif and Kuran (30), state that the used of gonadotropins in ewes stimulates the release of FSH and LH by the anterior hypophysis, which results in an increase in the ovulation rate, and therefore, in the pregnancy rate. Induction of multiple ovulation is transcendental in the smaller ruminants since higher dividends can be obtained if the ewes produce more than one offspring at a time.

In conclusion the use of 50 or 100 µg GnRH, combined with D-Chloprostenol (PGF 2α) and AIFT, did improve pregnancy rates but did not increase prolificacy percentages in PEL ewes when compared to the MPA protocol plus eCG and natural mating. The combination of GnRH and PGF2α in AIFT protocols facilitates artificial insemination at a predetermined hour without the need of detecting estrus. There is not sufficient information on the ovsynch protocol in ewes, and we recommended that further studies be conducted on a larger number of animals, in order to obtain more information about this topic.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

REFERENCES 1.

Martínez-Tinajero JJ, Sánchez OL, Izaguirre FF, García CCG, Martínez-Priego G, Torres HG. Comportamiento Reproductivo de Ovejas Barbados Barriga Negra Sincronizadas con MPA y diferentes tiempos de aplicación de eCG durante la época de baja fertilidad. Rev Cien FCV-LUZ 2007; 17:47-52.

9.

2.

Vázquez AJF, Loya HFM, Quintero EJA, Cienfuegos REG, González RA. Efecto de la dosis de PMSG y tiempo de aplicación sobre la manifestación de estro y tasa de ovulación en ovejas de pelo. En: XXXII Reunión anual de la Asociación Mexicana de producción animal. Monterrey, Nuevo León México; 2004.p. 67-71.

10. Zarkawi M. Response of fat-tailed Syrian Awassi ewes to accelerated lambing systems. Trop Anim Health Pro 2011; 43:1311-1318.

3.

Martínez TJJ, Ruiz HI, Montañez VOD, Martinez PG, Velasco ZME, Izaguirre F. Reproductive performance in dorper ewes synchronized at estrus during non breeding season in tropical conditions. J Anim Vet Adv 2011; 10:221-223.

4.

Colazo MG, Kastelic JP, Martinez MF, Whittaker PR, Wilde R, Ambrose JD, et al.

Fertility following fixed-time AI in CIDRtreated beef heifers given GnRH or estradiol cypionate and fed diets supplemented with flax seed or sunflower seed. Theriogenology 2004; 61:1115-1124.

5.

García E. Modificaciones al Sistema de Clasificación Climática de Koppen.

Instituto de Geografía. Universidad Nacional Autónoma de México. 1987.

6. Oregui Oregui LM, Bravo MV, y Gabiña D. 2004. Relaciones entre el estado de carnes y parámetros reproductivos y productivos en ovejas Latxas. Arch Zootec 2004; 53:47-58.

7.

8.

Asmahuy T A M. Effect of ovaria synchornization protocols, using GnRH and PGF2α, on ovarian response and reproductive traits of Rahmani ewes.

Egyptian J Sheep Goats Sci 2012; 7:43-49.

Minitab. Minitab statistical software, release 14.1. [CD-ROM], Pennsylvania, State College, USA: Minitab Inc. 2003.

Martínez-Tinajero JJ, Sánchez TorresEsqueda MT, Torres-Hernández G, HerreraHaro JG, Bucio-Alanís L, Rojo-Rubio R, et al. Comportamiento reproductivo de ovejas F1 (Damara x Merino) sincronizadas con CIDR y dos tiempos de aplicación de GnRH. Universidad y Ciencia 2008; 24:175-182.

11. Martínez-Tinajero JJ, Sánchez-Torres EMT, Bucio AL, Rojo RR, Mejía VO, Mendoza MGD, Cordero MJL. Efecto de eCG e inseminacion laparoscópica sobre el comportamiento reproductivo en ovejas F1 (Damara x Merino). Rev Cien FCV-LUZ 2006; 16: 72-77.

12. Ortega AJ. Comparación de dos métodos de sincronización del estro en Ovinos de Pelo [Tesis]. Chihuahua: Universidad Autónoma de Chihuahua; 2006.

13. K a r a c a F, A t a m a n M B , Ç o y a n K .

Synchronization of estrus with shortand long-term progestagen treatments and the use of GnRH prior to short-term progestagen treatment in ewes. Small Ruminant Res 2009; 81: 185-188.

14. Quintero EJA, Macias CU, Álvarez VFD, Correa CA, González RA, Lucero MFA, et al.

The effects of time and dose of pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) on reproductive efficiency in hair sheep ewes.

Trop Anim Health Pro 2011; 43:1567-1573.

15. Uribe VLF, Sousa MIL, Osorio JH. Effect of time of prostaglandin administration on follicular response in ewes during oestrous cycle. Rev Bras Zoot 2011; 40:985-991.

16. Pérez CR, Garese RJA, Fleischmann TR, Ganzábal PA, González SC. Sincronización de celos en cabras en estación reproductiva: uso de esponjas de medroxiprogesterona o aplicación de prostaglandina después de cinco días de detección de celos. Rev Cien FCV-LUZ 2012; 22:245-251.

Martínez - Effect of application of GnRh and D-chloprostenol on Pelibuey ewes 17. Fierro S, Gil J, Viñoles C, Olivera MJ. The use of prostaglandins in controlling estrous cycle of the ewe: A review. Theriogenology 2013; 79:399-408.

18. Fonseca JF, Torres CAA. Administration of hCG 5 days after breeding and reproductive performance in nulliparous dairy goats.

Reprod Domest Anim 2005; 40: 495-499.

19. Cueto M, Gibbons A. Eficiencia de la Inseminación artificial con semen congelado en ovinos. IDIA XXI, 2004; 7:73-78.

20. Catalano RC, Machado CF, Ferragut S, Teruel M. Desarrollo de una calculadora que permite cuantificar la respuesta reproductiva de ovejas en diferentes situaciones de manejo. En: 38º JAIIO Congreso Argentino de AgroInformática; Mar de Plata, Argentina. 2009.p. 61-63.

21. Kridli RT, Al-Khetib SS. Reproductive response in ewes treated with eCG or increasing doses of royal jelly. J Anim Reprod Sci 2006; 92: 75-85.

22. Powell JG, Lester TD, Rowe MP, Williams CL, Rorie RW. Evaluation of a modified progestinSelect Synch estrous-synchronization protocol in beef cows and heifers. Prof Anim Sci 2011; 27:535-539.

23. Bo g g i o DJC. So b r e v i ve n c i a in vit ro de embriones ovinos congelados convencionalmente con 1.5 M etilenglicol y preparados para transferencia directa.

P r i m e ra c o m u n i c a c i ó n e n U r u g u ay.

Producción Ovina 1997; 10: 63-74.

24. S a k u ra i H , A d a m s B M , A d a m s T E .

Concentration of gonadotropin releasing hormone receptor messenger ribonucleic acid in pituitary tissue of orchidectomized sheep: Effect of passive immunization against gonadotropin releasing hormone. J Anim Sci 1997; 75: 189-194.

3617

25. Nagatani S, Guthikonda P, Thompson RC, Tsukamura H, Maeda H, Foster DL. Evidence for GnRH regulation by leptin: leptin administration prevents reduced pulsatile LH secretion during fasting.

Neuroendocrinology 1998; 139: 370-376.

26. Hopkins PS, Nolan CJ, Pepper PM. 1980.

The effects of the heat stress on the development of the fetal lamb. Aust J Agri Res 1980; 31: 763-771.

27. Chevel RC, Santos JE, Ronaldo LA, Cerri LR, Galvao KN, Juchem SO, Thatcher WW. Effect of resynchronization with GnRH on day 21 after artificial insemination on pregnancy rate and pregnancy loss in lactating dairy cows. Theriogenology 2003; 60:1389-1399.

28. Stevenson JS, Pursley JR, Garverick HA, Fricke PM, Kesler DJ, Ottobre JS, Wiltbank MC. Treatment of cycling and noncycling lactating dairy cows with progesterone during ovsynch.

J Dairy Sci 2006; 89: 2567-2578.

29. Pursley JR, Wiltbank MC, Stevenson JS, Ottobre JS, Garverick HA, Anderson LL. Pregnancy rates per artificial insemination for cows and heifers inseminated at a synchronized ovulation or synchronized estrus. J Dairy Sci 1997; 80: 295-300.

30. Akif CM, Kuran M. Effects of a single injection of hCG or GnRH agonist on day 12 post mating on fetal growth and reproductive performance of sheep. Anim Reprod Sci 2003; 80:81-90.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3618-3625, 2013.

ORIGINAL

Supervivencia de postlarvas de camarón blanco Litopenaeus vannamei a diferentes salinidades y temperaturas Survival of white shrimp Litopenaeus vannamei poslarvae at different salinities and temperatures Juan Arzola G,1 M.Sc, Pablo Piña V,1,2* Ph.D, Mario Nieves S,1,2 Ph.D, María Medina J,2 M.Sc. Universidad Autónoma de Sinaloa, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Programa Regional del Noroeste para el Doctorado en Biotecnología, Av. De las Américas y Blvd. Universitarios s/n.

Ap. Postal 1354. Culiacán, Sinaloa, México. Tel/Fax: 66 77 13 78 60. 2Universidad Autónoma de Sinaloa, Facultad de Ciencias del Mar, Paseo Claussen s/n. Ap. Postal 610. Mazatlán, Sinaloa, México. *Correspondencia: pablopina@live.com.mx 1

Recibido: Noviembre de 2012; Aceptado: Febrero de 2013.

RESUMEN Objetivo. Analizar el efecto combinado de salinidad (5, 15, 25, 35 y 45ups) y temperatura (15, 20, 25, 30 y 35oC) sobre la supervivencia y frecuencia de mudas en postlarvas (PL12) de Litopenaeus vannamei. Materiales y métodos. Los experimentos se realizaron por cuadriplicado por cada combinación de salinidad y temperatura. Las postlarvas se mantuvieron en acuarios de 3 L a una densidad de 100PL/l. La salinidad se incrementó disolviendo sal granulada libre de yodo, a partir de agua de mar, mientras que para alcanzar las salinidades menores se utilizó agua dulce filtrada.

Las postlarvas aclimatadas a 35ups y 28°C (condición inicial) fueron sometidas abruptamente a las salinidades y temperaturas experimentales por 30 minutos. Después, se filtraron y se colocaron nuevamente en su condición inicial para su recuperación. Transcurridos 30 minutos, se contaron las postlarvas vivas y las mudas. Los datos fueron analizados por un ANOVA de dos vías. Resultados.

Se determinó que la supervivencia y frecuencia de mudas fueron significativamente afectadas por la salinidad, temperatura y su interacción (p<0.05). Se obtuvo una supervivencia máxima y mínima de 99.8 y 94.4%. Los porcentajes de supervivencia y frecuencias de mudas disminuyeron a una baja salinidad en combinación a bajas y altas temperaturas, y aumentaron independientemente de la salinidad y temperatura, a excepción de 5ups con 15, 30 y 35°C. La mortalidad máxima de postlarvas fue de 5.6% (5ups y 30°C). Conclusiones. Se determinó que a temperaturas de 20 y 25°C en combinación a las salinidades utilizadas, fueron las mejores condiciones de supervivencia y de resistencia de las postlarvas ante dichas condiciones hidrológicas.

Palabras clave: Aclimatación, ambiente acuático, salinidad del agua (Fuente: DeCS).

3618

Arzola - Supervivencia de postlarvas de camarón blanco Litopenaeus vannamei

3619

ABSTRACT Objective. The combined effect of salinity (5, 15, 25, 35, and 45psu) and temperature (15, 20, 25, 30, and 35oC) was evaluated on survival and molt frequency in Litopenaeus vannamei postlarvae (PL12).

Materials and methods. Four repetitions were applied to each combination of salinity and temperature.

The PL were placed in 3 L beakers at a density of 100PL/l. Salinity was increased by dissolving commercial salt without iodine, into marine water, whereas fresh filtered tap water was used to decrease the salinity from seawater. The PL were adapted at 35psu and 28°C (initial conditions) during 30 minutes. Thereafter, they were transferred to each experimental combination of salinity and temperature by 30 minutes.

Following this procedure, the PL were filtered and retuned to their initial acclimatization conditions.

After 30 minutes of recuperation, the live PL and molts were counted. All data were analyzed using a two-way ANOVA. Results. Survival and molt frequency were significantly (p<0.05) affected by salinity, temperature and the interaction of both factors. The maximum and minimum survival rates of 99.8 and 94.4% were obtained. Survival and molt frequency rates were significantly (p<0.05) affected by salinity, temperature and the interaction of both factors. Survival and molt frequency percentage rates decreased at lower salinity in combination with lowest and highest temperatures, and significantly increased, independently from salinity and temperature conditions, with exception of 5psu at 15, 30 and 35°C. The highest mortality rate (5.6%) was obtained at 5psu and 30°C. Conclusions. It was determined that survival of postlarvae was higher at temperatures of 20 and 25°C given salinity combination, which are considered the best conditions for survival and resistance.

Key words: Acclimatization, aquatic environment, saline waters (Source: DeCS).

INTRODUCCIÓN El camarón blanco Litopenaeus vananmei es una especie comúnmente cultivada en el noroeste de México, donde la salinidad y la temperatura son dos de los factores importantes a considerar en el cultivo de esta especie y de otros peneidos (1). Sin embargo, cuando las postlarvas son comercializadas por los laboratorios de producción a las granjas de camarón, generalmente las postlarvas son distribuidas a diferentes condiciones de salinidad y temperatura dependiendo de su ubicación geográfica de las granjas camaronícolas.

Por ello, es importante que las postlarvas de camarón antes de ser sembradas en los estanques, sean sometidas a diferentes condiciones de salinidad y temperatura para estimar previamente su calidad en la supervivencia (2).

La prueba de salinidad y temperatura utilizada en el presente estudio para postlarvas de camarón blanco, es simple, rápida y no requiere de equipo especializado (1,3). Es una prueba recomendable para los laboratorios de producción comercial o granjas de camarón para evaluar la condición fisiológica de las postlarvas en cuanto a su supervivencia, aunque no necesariamente determine su éxito en su crecimiento y biomasa cuando han sido sembradas después en los estanques de engorda de camarón.

Algunos autores han analizado los criterios para asignar una calidad en la supervivencia de larvas y postlarvas de L. vannamei, para lo cual es necesario que se emplee simultáneamente la salinidad y temperatura (4). Otros investigadores

han considerado que la temperatura no es un factor importante en la supervivencia de postlarvas al momento de ser sembradas en los estanques de cultivo, pero han señalado que es más importante someter previamente a las postlarvas a pruebas combinadas de salinidad y amonio (1,2,5). De la misma manera, se estimó en las postlarvas que la salinidad a diferencia de su punto isosmótico, podría ser utilizado como un indicador de la calidad de las mismas, incluso, estos autores no consideraron como un indicador a la temperatura (6). Sin embargo, se ha indicado que una adecuada alimentación en los primeros estadios larvales en camarón blanco, han favorecido al crecimiento, supervivencia (7,8) y su resistencia a los cambios de salinidad y temperatura (9). Además, se ha indicado la necesidad de estandarizar la metodología para evaluar la calidad de las postlarvas ante las diversas pruebas mencionadas, aunque para ello debe considerarse tanto la salinidad como la temperatura (10).

Existen informes donde la salinidad y la temperatura en conjunto con otras variables hidrológicas, han determinado la influencia fundamental en la supervivencia y en el desarrollo de larvas y postlarvas de camarones peneidos (11-13), particularmente sometidas a pruebas de estrés (1,3,9).

Algunos autores, han indicado que las condiciones óptimas para la supervivencia de postlarvas de L. stylirostris correspondió a 25ups y 28°C (14).

En L. vannamei determinaron que la temperatura

3620

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

adecuada para la supervivencia de postlarvas resultó entre 26.1 y 31.4°C (15). Mientras que otros señalaron que la supervivencia de postlarvas de camarón blanco resultó significativa a la concentración de salinidad (16), contrariamente otros indicaron que las salinidades no influyeron directamente en la supervivencia de postlarvas (17).

Además, diversas investigaciones han señalado que el potencial de producción y la capacidad de carga biológica de un sistema de cultivo son generalmente determinados en conjunto por las condiciones del ambiente acuático, las cuales pueden alterar las tasas de actividad biológica y por consecuencia modificar el crecimiento de las larvas y postlarvas y en algunos casos pérdidas irreparables provocando su mortalidad.

Entonces, es necesario analizar las condiciones de supervivencia de las postlarvas de L. vannamei a diferentes salinidades y temperaturas, ya que pueden ser indicativos para su evaluación del estado fisiológico de las postlarvas y por lo tanto predecir el efecto causado por las variaciones de salinidad y temperatura, ya que estos, entre otros, son los factores abióticos dominantes en los sistemas acuícolas.

Como objetivo principal se analizó la supervivencia de postlarvas de L. vannamei sometidas a diferentes salinidades y temperaturas. Sobre todo, para poder determinar así la mejor condición de las postlarvas de camarón blanco ante estas variables a las cuales generalmente son sometidas las postlarvas durante su siembra en las diferentes granjas comerciales del país.

MATERIALES Y MÉTODOS Postlarvas y salinidad del agua. Se utilizaron postlarvas (PL12 –doce días en fase de postlarva-) de camarón blanco (L. vannamei) con un peso seco (PS) promedio de 0.20mg proporcionadas por un laboratorio de producción comercial (FITMAR) del sur de Sinaloa, México. Las postalrvas se transportaron al laboratorio en una hielera dentro de bolsas de plástico con agua a saturación de oxígeno y a temperaturas de 26 a 28 °C. Las postlarvas a las mismas condiciones de salinidad y temperatura de su procedencia, se colocaron en un tanque de plástico con una capacidad de 400 L con agua de mar filtrada a 10, 5 y 1µm y se adicionó aireación continua con un soplador (blower de 2.5 HP). Posteriormente, se mantuvieron las postlarvas con recambios diarios de 30%, la alimentación previa a los experimentos fue cada dos horas en forma de “microparticulado” de tipo Frippak PL+300 y Stresspack 1.2.3. La eliminación de heces y

del alimento sobrante, se realizó por un sifón protegido con una malla nytex de 200µm.

El oxígeno disuelto en los tratamientos fue de 6.95 a 9.71 mg/L y la concentración de amonio varío de 0.0002 y 0.005 mg/L/L/hPS. Para determinar la supervivencia de postlarvas, se realizó un experimento en combinación con cinco salinidades (5, 15, 25, 35 y 45ups) y cinco temperaturas (15, 20, 25, 30 y 35oC).

Para incrementar la salinidad (45ups), se añadió sal granulada (sin yodo) al agua de mar a una concentración de 10 g/L, para disminuir la salinidad, se agregó agua dulce filtrada a 10, 5 y 1µm (filtro de cartucho) al agua de mar, después se determinó la concentración de salinidad en los tratamientos con un refractómetro digital VITALSINE, SR-6.

Diseño experimental. Se utilizaron acuarios de plástico con una capacidad de 4 l, aunque las postlarvas se mantuvieron en 3 L a una densidad de 100 postlarvas/L. Por cada salinidad (5, 15, 25, 35 y 45ups) se utilizaron 20 acuarios distribuidos en cuatro repeticiones. Para mantener la temperatura del agua constante en los experimentos (15, 20, 25, 30 y 35oC), cada acuario contenía un calentador y un termorregulador FINNER, HC-0800.

Para estimar la supervivencia y frecuencia de mudas, se filtraron las postlarvas en la salinidad inicial (35ups), y se mantuvieron en un recambio de agua del 100% con la salinidad deseada (5, 15, 25, 35 y 45ups) durante 30 minutos. Posteriormente, las postlarvas en las diferentes salinidades se filtraron de nuevo y se regresaron a su condición salina inicial (35ups) por 30 minutos; posteriormente a este tiempo transcurrido se contaron las postlarvas vivas y las mudas, luego se registraron los porcentajes (%) de supervivencia (porcentaje de organismos vivos al final del experimento con respecto al inicio) y frecuencia de mudas (porcentaje de organismos muertos y frecuencia de mudas a diferencia del inicial).

Análisis estadístico. Los datos del porcentaje de supervivencia y en conjunto de mudas y mortalidad, fueron trasformados a arcoseno para su análisis estadístico. A los datos trasformados de supervivencia y mudas y mortalidad por cada combinación de salinidad y temperatura se les realizaron pruebas estadísticas de normalidad (Lillieford) y homoscedasticidad (Bartlett). Posteriormente se analizaron por un ANOVA de dos vías, como tratamientos la supervivencia y frecuencia de mudas, y como factor A, la salinidad (ups) y B, la temperatura (°C). Al resultar significativo el ANOVA de dos

Arzola - Supervivencia de postlarvas de camarón blanco Litopenaeus vannamei vías, se realizaron pruebas de comparaciones múltiples de Tukey; en todos los casos se utilizó un nivel de significancia (α) de 0.05 (18) y el ajuste de medias se calculó por el paquete Statistica, V 7.0 (19). Sin embargo, los datos de la supervivencia y mudas y mortalidad fueron trasformados nuevamente a sus porcentajes para su interpretación comparativa de los datos.

de las salinidades utilizadas. A 30 y 35°C entre las salinidades de 5 y 45ups, no se encontraron diferencias estadísticas entre los porcentajes de supervivencia, pero a 45ups comparado con 15, 25 y 35ups, la supervivencia de postlarvas no resultó con diferencias para dichas temperaturas mencionadas (Figura 1).

5 ups

RESULTADOS

15 ups

25 ups

35 ups

La supervivencia, estadísticamente resultó significativa con respecto a la salinidad, temperatura y su interacción (p<0.05). Estos resultados indicaron que la supervivencia de postlarvas de camarón blanco dependieron de las condiciones de salinidad, temperatura y de la interacción de ambos factores hidrológicos a los cuales fueron sometidas las postlarvas (Tabla 1). Lo que confirmó que las postlarvas de L. vananmei aún y cuando generalmente se caracterizan por su amplia tolerancia a una variación salina y térmica, el efecto de dichas variables y de su interacción, están relacionadas directamente con el éxito de la supervivencia de las postlarvas debido a que en promedio se obtuvo un porcentaje de supervivencia de 98.7% entre las diferentes combinaciones de salinidad y temperatura.

Supervivencia (%)

45 ups

Tem peratura P<0.05 Salinidad P<0.05 TxS P<0.05

103

Los porcentajes de supervivencia de postlarvas durante las diferentes combinaciones de salinidad y temperatura, oscilaron en valores altos de 94.4 y 99.8%, pudiendo ser consideradas las postlarvas de calidad para su posterior siembra en estanques de cultivo. En general, los menores porcentajes de supervivencia se observaron a una salinidad de 5ups en combinación con temperaturas de 15, 30 y 35°C. Aunque, la mayor mortalidad de postlarvas coincidió con una salinidad y temperatura de 5ups y 30°C, respectivamente.

3621

b

101

b b b

a

a a a

b

99

a a

a

a a

b

a

b b ab

97

b b

ab

a

a

a

95 93 15 °C

20 °C

25 °C

30 °C

35 °C

Temperatura

Figura 1. Supervivencia y desviación estándar de postlarvas sometidas a diferentes salinidades y temperaturas. Letras distintas indican diferencias significativas.

Los menores porcentajes de la resistencia (frecuencia de mudas y mortalidad) a los cambios de salinidad y temperatura se ubicaron a una salinidad de 5ups con temperaturas de 15, 30 y 35°C, correspondiendo a 7.3, 6.5 y 5.5%, respectivamente. Al igual que la supervivencia, los resultados en conjunto de la frecuencia de mudas y postlarvas muertas (Tabla 2), fueron afectados por la salinidad, temperatura y su interacción (p<0.05). Sin embargo, cuando se analizaron los datos entre los tratamientos, resultó que a una temperatura de 20 y 25°C la frecuencia de mudas y la mortalidad de las postlarvas no resultaron con diferencias estadísticas entre las salinidades utilizadas (Figura 2).

En particular, los promedios de la supervivencia de postlarvas presentaron una significancia entre los tratamientos de 5ups y 15°C con el resto

En general se consideró que bajo estas combinaciones de salinidad y temperatura a las cuales fueron expuestas las postlarvas de L. vannamei, presentaron condiciones favorables

Tabla 1. ANOVA para la supervivencia de postlarvas sometidas a diferentes salinidades (ups) y temperaturas (°C).

Tabla 2. ANOVA para la frecuencia de mudas y mortalidad de postlarvas sometidas a diferentes salinidades (ups) y temperaturas (°C).

FV Salinidad (ups)

SC

GL

CM

F

P

F

SC

GL

CM

F

P

F

1021.0

4

255.3

30.3

3.7X10-19

2.4

Salinidad (ups)

FV

312.1

4

78.0

26.8

2.4X10-17

2.4

Temperatura (°C)

342.6

4

85.7

10.2

2.0X10-7

2.4

Temperatura (°C)

115.7

4

28.9

9.9

2.9X10-7

2.4

Interacción

541.8

16

33.9

4.0

1.7X10-6

1.7

Interacción

182.6

16

11.4

3.9

2.8X10-6

1.7

Residual

1474.5

175

8.4

Residual

509.8

175

2.9

Total

3379.8

199

1120.2

199

FV: Fuente de variación, SC: suma de cuadrados, GL: grados de libertad, CM: cuadrados medios, F: estadístico, P: probabilidad.

Total

FV: Fuente de variación, SC: suma de cuadrados, GL: grados de libertad, CM: cuadrados medios, F: estadístico, P: probabilidad.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013 5 ups

15 ups

25 ups

35 ups

45 ups Tem peratura P<0.05 Salinidad P<0.05 TxS P<0.05

Frecuencia de mudas y mortalidad (%)

7.0 6.0

a

a

a

5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

b

b b b

a a

a

a

a

a

b

a a

a

b

b

a

b

b b

b b

0.0 15 °C

20 °C

25 °C

30 °C

35 °C

Temperatura

Figura 2. Frecuencia de mudas y mortalidad y desviación estándar de postlarvas sometidas a diferentes salinidades y temperaturas. Letras distintas indican diferencias significativas.

de supervivencia y de resistencia al efecto provocado por estas variables hidrológicas.

Aunque en condiciones de temperatura de 20 y 25°C en combinación con cualquier salinidad utilizada en el presente estudio, indicaron para las postlarvas los mejores porcentajes de supervivencia y de resistencia a los efectos de la salinidad.

DISCUSIÓN Para los acuicultores la supervivencia es un importante indicador para la toma de decisiones relacionadas con la modificación de las condiciones de cultivo y para la producción de postlarvas, por lo tanto, entre otros indicadores, la supervivencia refleja las condiciones de éxito o fracaso en las que los organismos son cultivados. Altas supervivencias están directamente relacionadas con condiciones apropiadas de mantenimiento, sin embargo, algunos investigadores analizaron el efecto combinado de la salinidad y temperatura en postlarvas de peneidos y concluyeron que la respiración, excreción y crecimiento en biomasa representaron mejores indicadores que la supervivencia (3,9,10). Aunque, se ha determinado que la salinidad y temperatura presentaron un efecto positivo en las supervivencias de postlarvas de L. vannamei y L. stylirostris (6,16,20).

En el presente estudio, los elevados porcentajes de supervivencia alcanzados independientemente de las diferentes combinaciones de salinidad y temperatura, indicaron que bajo estas condiciones se garantiza la supervivencia óptima de postlarvas de L. vannamei por los laboratorios de producción y granjas de camarón. Sin embargo, es probable que los mayores porcentajes de supervivencia estuvieron relacionados con los efectos de la temperatura sobre el metabolismo de los

organismos, debido a que las postlarvas durante el período experimental no fueron alimentadas (20), incluso, algunos autores señalaron la importancia del efecto de la temperatura en la actividad metabólica de las postlarvas de L. vannamei y su relación con la supervivencia (21).

En este estudio, se observó que las postlarvas por debajo de 20°C fueron prácticamente inactivas, por ejemplo, en las postlarvas su desplazamiento se manifestó con un nado débil y errático, no así a 35°C, donde las postlarvas fueron muy activas sobre la columna de agua.

La supervivencia de postlarvas obtenidas en el presente estudio, incluyendo las más bajas, fueron más altas que las registradas para L. vannamei en condiciones de pruebas salinas (9). Además, estos autores indicaron que supervivencias a pruebas salinas por encima de 60% es considerado indicativo para una buena calidad de postlarvas (22), como los porcentajes aquí registrados.

Algunos autores han señalado que la salinidad en postlarvas de L. vannamei no parece ser un factor crítico entre 1 a 8ups, además, las postlarvas han soportando comúnmente condiciones hasta los 35ups (10,13). Sin embargo, indicaron que a una mayor salinidad, la supervivencia de postlarvas disminuye (21). En el presente trabajo no se probó una salinidad menor a 5ups, pero sí por arriba de 35ups, aunque en general los resultados de la supervivencia obtenidos entre las diferentes combinaciones de salinidad y temperatura se ubicaron por encima de 94.4%, por lo tanto, las postlarvas sometidas a todas las salinidades y temperaturas que sobrevivieron, a excepción del tratamiento de 5ups con 15°C, se consideraron como postlarvas de calidad (3), asumiendo que presentaron condiciones fisiológicas (supervivencia) para soportar la tolerancia a los cambios de salinidad y temperatura a las cuales fueron colocadas experimentalmente.

Es probable que los porcentajes mínimos de frecuencia de mudas y mortalidad provocado en las postlarvas estén relacionados con el tiempo de exposición, debido a que algunos autores han señalado que tanto la edad de las postlarvas como el tiempo de exposición a los cambios de salinidad y temperatura, influyeron en el éxito de su resistencia, determinando así porcentajes de supervivencia menores al 50% cuando fueron sometidas a un tiempo mayor de exposición para diferentes postlarvas de peneidos (9,23,24), a diferencia del presente estudio donde se utilizó un menor tiempo (30 min) en las postlarvas expuestas al cambio de salinidad y temperatura. Los porcentajes de la mortalidad

Arzola - Supervivencia de postlarvas de camarón blanco Litopenaeus vannamei fueron similares a otras investigaciones al determinar en postlarvas de camarón blanco una mayor mortalidad en salinidades de 30 y 35ups con temperaturas de 30 y 35°C (21), además estos autores indicaron una elevada mortalidad (73%) de postlarvas en condiciones de salinidad de 50ups y temperatura de 35°C. Se observó que las postlarvas al ser sometidas a los cambios drásticos de salinidad de 35 a 45, 25, 15 y 5ups en todas las temperaturas utilizadas, aparentemente las postlarvas se dirigieron al fondo de los acuarios, sin mostrar ningún movimiento de apéndices, por lo que se consideraron como postlarvas muertas por algunos autores (3). Sin embargo, en el presente estudio esta “mortalidad” fue aparente, ya que las postlarvas se recuperaron a través del tiempo, sobre todo cuando se regresaron a la salinidad inicial (35ups). Incluso en este estudio se detectaron entre los tratamientos supervivencias altas después de su recuperación, considerándolas como postlarvas de calidad de acuerdo con los criterios establecidos para L. vannamei (1).

Los porcentajes de supervivencia obtenidos, confirmaron que a salinidades entre 5 y 45ups en combinación con temperaturas de 20 y 25°C, las postlarvas de camarón blanco soportaron una amplia variación salina, pero en condiciones de temperatura de 15, 30 y 35°C con una salinidad de 5ups, disminuyeron los porcentajes de supervivencia de postlarvas; sobre todo cuando no se cumplieran con los protocolos de producción de calidad de larvas y postlarvas (1), principalmente en cuanto a su selección de sus reproductores y del suministro del alimento en cantidad y calidad adecuada para el mantenimiento de las postlarvas. Los resultados de los porcentajes altos de supervivencias obtenidas en el presente estudio, son debido a que L. vannamei es una especie eurihalina que en condiciones naturales puede sobrevivir a una amplia variación salina (1,4), soportando así las postlarvas las salinidades entre 5 y 45ups a las cuales fueron expuestas.

Por otro lado, en el caso del tiempo de exposición ante los cambios salino y térmico sea considerado relativamente corto y el análisis de la supervivencia indicó que se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos de la salinidad, temperatura y su interacción, es conveniente recomendar la utilización de otros

3623

indicadores que permitan evaluar un mayor efecto de los tratamientos en las postlarvas de L. vannamei. Con este propósito, se han empleado pruebas que midieron la resistencia de las postlarvas a diferentes condiciones de salinidad y temperatura sobre el consumo de oxígeno, excreción de amonio y su crecimiento (3,5,22), de tal forma que los resultados fueron expresados generalmente a través de índices que reflejaron una mejor interpretación de la supervivencia de las postlarvas. En este estudio, es probable que diversos factores hayan influido sobre la supervivencia obtenida (combinación de baja salinidad y baja o alta temperatura), ya que la utilización de una sola variable (PL12) determinó que las similitudes o diferencias encontradas en los tratamientos ante las diferentes combinaciones de temperatura y salinidad, se debió al efecto de estas variables hidrológicas únicamente sobre el estadio (PL12), a diferencia de la utilización de diferentes estadios de postlarvas (23). Aunque existen evidencias de que postlarvas más jóvenes a PL12, son menos resistentes a los cambios drásticos de salinidad y temperatura, debido principalmente a que sus branquias no se han desarrollado completamente (23,24).

En conclusión se determinó que a temperaturas de 20 y 25°C en combinación con las salinidades utilizadas, las condiciones de supervivencia de postlarvas fueron mejores, lo cual coincidió con las características de la mayoría de los laboratorios de producción de postlarvas comerciales de L. vannamei ubicados cercanamente a aguas costeras del noroeste de México. Además, que estos valores de salinidad y temperatura, se encontraron dentro de los señalamientos adecuados para una supervivencia de postlarvas de camarón blanco ante las diferentes combinaciones de salinidad y temperatura a las cuales generalmente son sometidas a siembras en granjas comerciales del noroeste del país (25).

Agradecimientos A los proyectos UAS-CA-162, PROFAPI-135-2009 por los recursos otorgados, al CONACYT por la beca asignada al primer autor (CVU 256237), al personal del Laboratorio de Producción de Postlarvas FITMAR, a Martin Alejandro Guerrero Ibarra por la recolección de datos y Ph.D Miguel Ángel Hurtado Oliva por sus comentarios al manuscrito.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

REFERENCIAS 1.

Racotta I, Palacios E, Hernández R, Bonilla A, Pérez C, Ramírez JL. Criteria for assessing larval and postlarval quality of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei). Aquacult 2004; 233:181-195.

2.

Arzola GJ, Flores CL, Izabal CA, Gutiérrez RY. Crecimiento de camarón blanco (Litopenaeus vannamei) en un estanque rústico de baja salinidad. Rev Aquatic 2008; 28:8-15.

3.

Palacios E, Racotta IS. Salinity stress test and its relation to future performance and different physiological responses in shrimp postlarvae.

Aquacult 2007; 233:123-135.

4.

Martínez CL. Camaronicultura avances y tendencias. México: AGT Editor: 2002.

5.

Barbieri E. Acute toxicity of ammonia in white shrimp (Litopenaeus schmitti) at different salinity levels. Aquacult 2010; 306:329-333.

6. Alvarez AL, Racotta IS, Arjona O, Palacios E. Salinity stress test as a predictor of survival during growout in Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei). Aquacult 2004; 237:237-249.

7.

8.

9.

Piña VP, Nieves SM, Ramos L, Chavira CO, Voltolina D. Survival, growth and feeding efficiency of Litopenaeus vannamei protozoea larvae, fed different rations of diatom Chaetoceros muelleri. Aquacult 2005; 249:431-437.

Piña VP, Voltolina D, Nieves SM, Robles M. Survival, development and growth of the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei protozoea larvae, fed with monoalgal and mixed diets. Aquacult 2006; 253:523-530.

Gelabert R, Brito R, Gaxiola MG, Castro T, Rosas C. Efecto de nauplios de Artemia franciscana enriquecidos sobre el crecimiento, supervivencia y resistencia al estrés de postlarvas (PL5-40) de Litopenaeus vannamei.

Univ Cien 2008; 24:29-40.

10. Valenzuela W, Rodríguez G, Ponce PJ, Esparza H. Efecto de diferentes combinaciones de temperatura y salinidad sobre el consumo específico de oxígeno en el camarón blanco Litopenaeus vannamei. Rev Biol Mar y Oceanog 2011; 46:303-311.

11. Díaz F, Re AD, Sierra E, Diaz, IE. Effects of temperature and salinity fluctuation on the oxygen consumption, ammonium excretion and osmoregulation of the blue shrimp Litopenaeus stylirostris. J Shellfish Res 2004; 23:903-910.

12. Ramos CS, Ramos SE. Abundancia relativa de postlarvas de camarones peneidos en la bahía Salinas del Marqués, Golfo de Tehuantepec, México. Marzo a junio de 1999. Rev Biol Mar y Oceanog 2006; 41:121-128.

13. Valenzuela W, Rodríguez G, Esparza H. Cultivo intensivo de camarón blanco Litopenaeus vannamei en agua de pozo a baja salinidad como alternativa acuícola en zonas de alta marginación. Ra Ximhai 2010; 6:1-8.

14. Re AD, Díaz F, Sierra E, Gómez S. Consumo de oxígeno, excreción de amonio y capacidad osmorreguladora de Litopenaeus stylirostris expuesto a diferentes combinaciones de temperatura y salinidad. Ciencias Marinas, 2004; 30(3):443-453.

15. Hernández RM, Bückle LF, Palacios E, Barón SB. Preferential behavior of white shrimp Litopenaeus vannamei (Boone 1931) by progressive temperature-salnity simultaneous interaction. J Therm Biol 2006; 31(7):565-572.

16. Jaime B, Galindo J, Laria E, Cupul F, Vega F. Traslado de postlarvas de Litopenaeus vannamei a diferentes tiempos, salinidades y densidades y su efecto en la supervivencia y algunos marcadores bioquímicos. Rev Biol Mar Oceanog 2008; 43:681-686.

17. Ye L, Jiang S, Zhu X, Yang Q, Wen W, Wu K. Effects of salinity on growth and energy budget of juvenile Penaeus monodon.

Aquacult 2009; 290:140-144.

18. Zar JH. Biostatistical analysis. Upper Saddle River, USA: Prentice-Hall Inc; 2009.

19. StatSoft Inc. Statistica for Windows Manual version 7.0. Tulsa, Oklahoma, USA: StatSoft Inc; 2004.

Arzola - Supervivencia de postlarvas de camarón blanco Litopenaeus vannamei

3625

20. Spanopoulus M, Martínez CA, Vanegas RC, Rosas C, Ross LG. The combined effects of salinity and temperature on the oxygen consumption of juvenile shrimps Litopenaeus stylirostris. Aquacult 2005; 244:341-348.

23. Balbi F, Rosas J, Velásquez A, Cabrera T, Maneiro C. Aclimatación de postlarvas de diferentes edades y criaderos de camarón marino Litopenaeus vannamei. Rev Biol Mar y Oceanog 2005; 40:109-115.

21. Ponce J, Martínez CA, Ross LG. The effects of salinity and temperature on the growth and survival rates of juvenile White shrimp, Penaeus vannamei. Aquacult 1997; 157:107-115.

24. Tsuzuki M, Cavalli RO, Bianchini A. The effects of temperature, age and acclimation to salinity on the survival of Farfantepenaeus paulensis postlarvae. J World Aquacult Soc 2000; 31:459-468.

22. Barbieri E. Use of oxygen consumption and ammonium excretion to evaluate the sublethal toxicity of cadmium and zinc on Litopenaeus schmitti. Water Environ Res 2007; 79:461-466.

25. Martínez CL, Martínez PM, Cortes JE. Camaronicultura mexicana y mundial ¿actividad sustentable o industria contaminante?. Rev Int Contam Ambie 2009; 25:181-196.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3626-3632, 2013.

ORIGINAL

Selección por conformación de reproductores de tilapia roja Oreochromis sp., mediante prueba de progenie Selection by conformation of broodstocks of red tilapia Oreochromis sp., by progeny testing Hermes Pineda S,1* M.Sc, Mónica Taborda A,2 Tec Agr, Alejandro Hernández B,2 Ing Agr. Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, Facultad de Ciencias Agrarias, Medellín, Colombia.

Profesional Independiente, Medellín, Colombia. *Correspondencia: hrpineda@elpoli.edu.co

1 2

Recibido: Noviembre de 2012; Aceptado: Febrero de 2013.

RESUMEN Objetivo. Contribuir con la caracterización estadística y genotípica (media, media del error estándar, varianza y heredabilidad) de la Longitud Total (LT) y Longitud Altura del Lomo (LAL), y plantear una estrategia de selección para mejorar la calidad de la semilla de reproductores de tilapia roja Oreochromis sp. Materiales y métodos. El proyecto se realizó en la Granja Experimental y de Producción Piscícola (PCJIC), a un Km del municipio de San Jerónimo, distante 61 Km al Occidente de Medellín (Antioquia). Se conformaron tres grupos de cruzamientos, cada uno en proporción de 3 hembras por 1 macho así: un cruce Hembras Blancas (HB) x Macho Rojo (MR) y dos cruces Hembras Blancas (HB) x Macho Blanco (MB). Las progenies fueron medidas a los 60 días post eclosión, teniendo en cuenta los supuestos estadísticos. Resultados. El ANOVA mostró que las progenies difieren significativamente (p<0.001) para ambas variables continuas. La LT fue mayor para la progenie del cruzamiento HBxMB sin reversión (8.04±1.04cm) y LAL fue mayor para la progenie HBxMR (2.33±0.44cm). La correlación pareada entre las variables fue altamente significativa (r≥0.79, p<0.001). Las heredabilidades fueron 0.59 (LT) y 0.64 (LAL). Los porcentajes de manchas en las progenies fueron HBxMR (34%) y HBxMB no revertida (66%). Conclusiones. La progenie del Grupo 1 HBxMR tuvo los reproductores para una mejor selección por conformación, por lo que se sugiere aumentar el número de animales con mayor LAL. También, considerar la menor cantidad de manchas oscuras y realizar un manejo de reproductores por grupos independientes para selección masal.

Palabras clave: Heredabilidad, herencia, mejoramiento genético, morfometría, peces (Fuente: MeSH).

ABSTRACT Objective. Contribute to the statistical and genotypic characterization (mean, standard error, variance and heritability) of the Total Length (LT) and Height (LAL), and suggest a selection strategy to improve seed quality in broodstock of red tilapia Oreochromis sp. Materials and methods. The project was conducted in the Experimental and Production Fish Farm (PCJIC), one Km from the town of San Jerónimo, 61 Km to the west of Medellín (Antioquia). Three mating groups were formed, each

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Pineda - Selección por conformación de reproductores de tilapia roja Oreochromis sp. 3627 in proportion of 3 females and 1 male: a mating group of White Females (HB) x Red Male (MR) and two mating groups White Females (HB) x White Male (MB). The offspring were measured at 60 days post hatching, taking into account statistical assumptions. Results. The ANOVA showed that offspring differ significantly (p<0.001) for both continuous variables. The LT was greater for the offspring of HBxMB without reversion (8.04±1.04cm) and LAL was higher for the HBxMR offspring (2.33±0.44cm).

The paired correlation between variables was highly significant (r≥0.79, p<0.001). Heritability were 0.59 (LT) and 0.64 (LAL). The dark spot percentages of the offspring were HBxMR (34%) and nonreversed HBxMB (66%). Conclusions. The progeny of Group 1 HBxHR had the better broodstocks for selection by conformation. It is suggested that the number of animals with greater LAL is increased.

Additionally, it is important to consider the minor amount of dark spots in broodstock management by independent groups for mass selection.

Key words: Fish, genetic enhancement, heredity, heritability, morphometry (Source: MeSH).

INTRODUCCIÓN La venta de alevinos está siendo afectada por la baja disponibilidad y calidad de la semilla, ocasionada por el mal manejo genético de un reducido grupo de reproductores en los sistemas de producción piscícolas (1), efectos que no han sido documentados suficientemente en las especies de cultivo nativas y foráneas en Colombia.

En el caso del híbrido de tilapia roja Oreochromis sp, con el 76% de la producción en cautiverio, alrededor de 50.000 Kg/año (1), se procura mantener las características de buen color, sin manchas oscuras y lomo de mayor tamaño.

El uso de un reducido grupo de animales como reproductores, trae como falencias: un aumento de la endogamia, semillas menos resistentes a los agentes patógenos, menor adaptabilidad a las condiciones ambientales y bajo rendimiento productivo en cautiverio debido a los cruzamientos entre reproductores de un mismo pedigrí (2).

Ciertamente en el caso de este híbrido, lo anterior está asociado al inadecuado manejo genético que se ofrece a los reproductores y a la restricción gubernamental de importación de especies foráneas, que permita aumentar la variabilidad genética en los cultivos. En consecuencia, los piscicultores han señalado una gran necesidad de aplicar técnicas en el mejoramiento genético de la semilla disponible, considerando los recursos técnicos y financieros mínimos existentes que les permitan alcanzar una mayor competitividad en el mediano y largo plazo (3).

El presente trabajo buscó determinar los elementos básicos para aplicar un método estadístico y genotípico en dos características de conformación, aplicables al buen manejo de los reproductores de tilapia roja Oreochromis sp,

con el fin de obtener alevinos mejorados para la comercialización. De esta manera, se debe considerar la incertidumbre que proporcionan los reproductores de este híbrido y la respuesta que la interacción genético ambiental pueda establecer para cada granja piscícola en particular. Igualmente, proveer los lineamientos para un programa de mejora genética por selección direccional masal con un grupo reducido de animales.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. Este trabajo de tipo analítico, se realizó en la Granja Experimental y de Producción Piscícola John Jairo González Torres (06°26’37.57” N, 75°44’04.93” W) en el municipio de San Jerónimo (Antioquia), situado a una altura de 780 msnm y con temperatura ambiente de 27ºC. Se emplearon seis estanques de cemento de 5 m2 cada uno (tres para los reproductores y tres para sus progenies), con entrada y salida de agua independiente y aireación individual. El agua fue obtenida de la Quebrada Guaracú, y presentó los siguientes parámetros físico químicos: temperatura entre 23–25ºC, pH 7.5–8.0, dureza 120 ppm, oxígeno disuelto: 7.8 mg/l, amonio 1.46 ppm, Cl 6.0 ppm y alta turbidez en épocas de invierno (visibilidad menor a 20 cm).

Muestras biológicas. Se seleccionaron 12 reproductores por su conformación, considerando las variables numéricas continuas de Longitud Total (LT) y Longitud Altura del Lomo (LAL), también conocida como Profundidad del Cuerpo (Figura 1). Asimismo, con menos manchas y sin malformaciones, como características fenotípicas externas.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013 aspectos que fueron avalados por el Comité Pro témpore de la institución.

Figura 1. Mediciones morfométricas de tipo continuo consideradas en tilapia roja Oreochromis sp. 1. Longitud Total y 2. Longitud Altura del Lomo (Profundidad del Cuerpo). Fuente: PinedaSantis (4).

Se realizaron los siguientes cruzamientos: Grupo 1: tres Hembras B (LT ≈ 41±1; LAL ≈ 11.7±0.2) x un Macho R (LT = 42.5; LAL = 12.5).

Grupo 2: tres Hembras B (LT ≈ 41±1; LAL ≈ 11.7±0.2) x un Macho B (LT = 41.5; LAL = 12).

Grupo 3: tres Hembras B (LT ≈ 38.7±0.8; LAL ≈ 11.5±0.4) x un Macho B (LT = 31.5; LAL = 9.5).

Las progenies de los grupos 1 y 2 fueron alimentados con concentrado comercial no hormonado, con un alto porcentaje de proteína, mientras la progenie del grupo 3, fue alimentada durante un mes, con concentrado comercial (48% de proteína), suplementado con la hormona 17-α-metiltestosterona para los procesos de masculinización fenotípica. El manejo de todas las progenies fue realizado por un único operario, manteniendo el mismo esquema general para la alimentación y las variables físico químicas del agua. De los tres grupos de reproductores se tomó, en promedio por progenie, entre 39 y 50 alevinos de ambos sexos, de los cuales se obtuvo la LT y la LAL a los 60 días post eclosión.

Respecto al color de la piel en los reproductores, se estableció por comparación directa, un tono rojo menos intenso, algo rosado (más abundante en la granja piscícola), se denominó (B) y otro rojo más acentuado, se identificó como (R). No se conoce con certeza la causa de esta despigmentación, pero se apunta a las condiciones físico químicas del agua y al tiempo en cautiverio.

Aspectos éticos. Los reproductores tuvieron un manejo en campo, sujeto a las Buenas Prácticas Acuícolas. De esta manera, se consideraron las normas ambientales vigentes en la granja, relacionados con el uso de anestésicos y manejo general para un menor estrés de los animales,

Análisis estadístico. Se seleccionaron alevinos en forma aleatoria de cada una de las tres progenies. Los datos obtenidos para cada una de las variables de respuesta, cumplieron con el supuesto de normalidad según Shapiro-Wilk.

Se realizó la estadística descriptiva y el análisis de varianza (p<0.05) entre las diferentes progenies con las comparaciones de TukeyKramer, las correlaciones pareadas de Pearson entre las variables y se estimó la heredabilidad mediante el uso del paquete estadístico JMP® y la aplicación Excel Microsoft®. De la misma manera, se estableció el porcentaje de manchas en los animales para cada uno de los cruzamientos.

Los análisis de varianza para la estimación de la heredabilidad para la LT y la LAL, se realizaron considerando los enunciados de Ruales et al (5), bajo los supuestos de aleatoriedad e independencia, normalidad (Prueba de ShapiroWilk) y homocedasticidad (Prueba de Bartlett).

La partición entre grupos y dentro de grupos es la base para la estimación de la heredabilidad de la característica bajo estudio. Aquí se tiene en cuenta un supuesto adicional: la variación no genética es homogénea y se incluye en la variación dentro de grupos. Desde el punto de vista estadístico, el modelo de análisis fue: yij = µ + Gi + εij Donde, yij = valor de la característica en el individuo j (j=1,2,3) del grupo genético (G) i (i= 1, 2, 3), ni siendo el número de individuos por grupo. µ = promedio general de la característica Gi = efecto del grupo genético i εij = error aleatorio asociado con el individuo j dentro del grupo i Cálculo de heredabilidad (h2). Desde el punto de vista de la variación, el modelo sería: VF = VA + VNA + VE Donde; V F, V A, V NA, y V E son las varianzas fenotípicas, aditivas, no aditivas y del entorno, respectivamente de la característica bajo estudio.

La heredabilidad en sentido estricto, se calculó como:

Se utilizó el agrupamiento de hermanos completos ya que de un solo animal se generan muchos descendientes. Como el componente de varianza de hermanos completos, estima las varianzas aditivas y no aditivas, se dice

Pineda - Selección por conformación de reproductores de tilapia roja Oreochromis sp. 3629 que el agrupamiento de medios hermanos es un estimador sesgado de la heredabilidad.

Por lo tanto, la heredabilidad estimada por el agrupamiento de hermanos completos será:

Tabla 3. Análisis de varianza de la característica Longitud Total en las progenies de tilapia roja Oreochromis sp. con 60 días post eclosión.

h2 = VA / VF= 2*σ2HC / σ2HC+ σ2R Donde, σ2HC = varianza de hermanos completos σ2R = varianza de reproductores

RESULTADOS Las tres progenies presentaron diferencias significativas en la LT y la LAL (q=2.37; p<0.001). El mayor promedio en la LT, para animales con 60 días post eclosión fue registrado en la progenie HBxMB no revertida (8.04±1.04 cm) y el menor promedio fue para la progenie HBxMR (6.02±0.99 cm) (Tabla 1). Respecto a la LAL fue mayor para la progenie HBxMR (2.33 ±0.44 cm) y menor para la progenie HBxMB revertida (1.92±0.30cm), (Tabla 1). El Coeficiente de Variación no fue mayor a 30, asumiendo datos homogéneos, una confiabilidad en los datos y descartando los errores por azar. La normalidad se cumplió para los datos en todos los casos.

Tabla 1. Estadística descriptiva en tres progenies de tilapia roja Oreochromis sp con 60 días post eclosión.

Parámetros

Grupo 1 Grupo 2 Progenie 1 Progenie 2

Grupo 3 Progenie 3 Revertida

Con las varianzas se obtuvo los valores de heredabilidad de LT (h2=0.59) (Tabla 3) y LAL (h2=0.64) (Tabla 4).

ANOVA (F)

Fuente de variación

gl

suma de cuadrados

cuadrado medio

cuadrado medio esperado

Entre padres

2

69.634

34.82

0.66

Dentro padres

147

232.225

1.58

1.58

TOTAL

149

301.859

Heredabilidad = 2*(0.66/(0.66+1.58)) = 0.59

Tabla 4. Análisis de varianza de la característica Longitud Altura del Lomo en las progenies de tilapia roja Oreochromis sp. con 60 días post eclosión.

Fuente de variación

gl

suma de cuadrados

cuadrado medio

cuadrado medio esperado

Entre padres

2

10.362

5.18

0.10

Dentro padres

147

31.292

0.21

0.21

TOTAL

149

41.654

Heredabilidad = 2*(0.10/(0.10+0.21)) = 0.64

Con relación al porcentaje de manchas, la progenie HBxMR fue de 34%, más bajo que el porcentaje obtenido entre HBxMB no revertido (66%).

Longitud Total Media±SEM (cm) 6.02±0.15a N 39 CV 16.4

8.04±0.09b 50 13.0

6.63±0.25c 50 9.8

22.04***

Longitud Altura Lomo Media±SEM (cm) 2.33±0.04a

1.97±0.09b

1.92±0.05c

N

39

46

50

CV

18.8

14.6

15.6

24.34***

SEM = Error estándar Grupo 1: HBxMR; Grupo 2: HBxMB; Grupo 3: HBxMB. HB=Hembra Blanca; MR=Macho Rojo; MB=Macho Blanco. *(p<0.05); ** (p<0.01); *** (p<0.001)

La correlación entre las variables fue altamente significativa (r≥0.79, p<0.001), (Tabla 2).

Tabla 2. Correlación pareada de dos características en la progenie de tilapia roja Oreochromis sp. con 60 días post eclosión.

Parámetros

Grupo 1 Progenie 1

Grupo 2 Progenie 2

LT x LAL

0.79***

0.89***

Grupo 3 Progenie 3 Revertida 0.88***

LT = Longitud Total; LAL = Longitud Altura del Lomo Grupo 1: HBxMR; Grupo 2: HBxMB; Grupo 3: HBxMB. HB=Hembra Blanca; MR=Macho Rojo; MB=Macho Blanco. *(p<0.05); ** (p<0.01); *** (p<0.001)

DISCUSIÓN En cualquier sistema de producción animal se cruzan los mejores reproductores con el propósito de obtener progenies productivamente mejoradas, favoreciendo la frecuencia de genes con efecto aditivo, adaptados a las condiciones locales del estanque, haciendo el proceso de selección más eficiente (6,7). A pesar de este principio, menos del 10% de la producción acuícola mundial están basados en programas de mejoramiento genético (8), por lo que se hace necesario potenciar este manejo con el fin de enfrentar la creciente demanda de proteína animal para una humanidad en expansión (9).

Existen dos estrategias en donde la acción de los reproductores pueden cambiar las propiedades genéticas de la población: i. La selección de los animales que van a ser los padres y ii. El control de los cruzamientos, lo cual debe considerar la endogamia y la consanguinidad (10). En este caso, los resultados sugirieron que es posible seleccionar un grupo de reproductores de la granja piscícola para mejorar la calidad de la

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semilla en la primera progenie. Los animales del grupo 1 fueron los más pequeños en LT, pero sobresalen en la LAL, con una alta heredabilidad, sugiriendo un fuerte componente genético con lo cual se podrían realizar procesos de selección confiables para obtener un filete más grande. En este estudio no se consideró el color como criterio de selección, si bien, Garduno-Lugo et al (11) han sugerido una determinación homocigótica fijada para el color rojo mediante prueba de progenies en la quinta generación. Mather et al (12) sugirieron que el fenotipo rojo no afecta el crecimiento y puede ser mejorado por selección masal.

Las progenies de los Grupos 2 y 3 (HBxMB), presentaron diferencias en su conformación, debido al efecto genético y no al ambiental.

Ciertamente, el proceso de inducción a la reversión sexual durante el primer mes de vida para la progenie del Grupo 3, moduló la maduración gonadal para los procesos metabólicos reproductivos sin incidir sobre la selección. Si bien los efectos epigenéticos no fueron evaluados en este trabajo, se ha considerado que los cíclidos, poseen una alta plasticidad para la adaptación a pequeños cambios en los nuevos ambientes, lo que les ha permitido su expansión en diversos ecosistemas acuáticos en todo el mundo (13, 14).

Al iniciar el funcionamiento de la granja piscícola, hace más de diez años, se recibieron las líneas Gregory Nielsen, Santafé, Huila, Repelón y Costain de tilapia roja Oreochromis sp, para conocer su adaptación a las condiciones de calidad de agua. Por desconocimiento del manejo en estas variedades, se perdieron las características de cada línea, aumentando la variación y la consanguinidad. Si bien es cierto, no se conoce el grado de afectación endogámica y se descuidó el manejo genético, las sucesivas generaciones de reproductores no han manifestado progenies con malformaciones evidentes. Aún así, la presencia de manchas oscuras en los animales ha sido considerada como un indicador del cruzamiento endogámico, por acción de su origen híbrido ontogénico, el cual fue evidenciado en animales con mayor tiempo en la granja (Grupo 2) (4).

Los reproductores viables para el mejoramiento genético y la obtención de alevinos mejorados, apuntarían a la selección de animales con mayor LAL, evidenciado en la progenie del grupo 1. El reproductor masculino utilizado, una renovación de hace dos años, ofreció una mejor conformación. Doyle et al (6) consideraron el tamaño de los animales como característica apropiada para la selección, en lugar del peso

o la edad, que siguen siendo los parámetros más valiosos en la producción (15, 16). No se descarta, en algunos casos, una selección indirecta que asocie el peso con parámetros de conformación.

Algunos trabajos han reportado menores heredabilidades en Longitud Total y en la Longitud Altura del Lomo para tilapia nilótica Oreochromis niloticus (17, 18), trucha arcoíris Oncorhynchus mykiss (19) y salmón Atlántico Salmo salar (20) que oscilan entre 0.25 y 0.46. Por otra parte, existen otros reportes de altas heredabilidades para tilapia nilotica Oreochromis niloticus cultivados en tierra (21) y en jaulas (hapas) suspendidas en estanques fertilizados (h2>0.59) (22). Si bien los reportes han sido realizados para la tilapia nilotica Oreochromis niloticus, una especie válida y estable genéticamente, se considera que los resultados obtenidos para el híbrido de tilapia roja Oreochromis sp., cultivados en cemento, son confiables. Aún así, se deben continuar los procesos de trazabilidad para confirmar el desempeño durante la selección, lo anterior debido al escepticismo que predomina, sobre el manejo genético del híbrido.

En la granja piscícola es necesario aumentar el número de animales con mayor LAL que se encuentran en menor cantidad, y realizar cruzamientos con hembras de mayor LT, con menos manchas, para obtener progenies con un lomo más redondo o de mayor tamaño.

Para lo anterior, se sugiere formar dos grupos independientes, entre 50 y 100 animales, que se encuentren en el promedio (a) y otros con promedio mayor (b) de la variable LAL. De lo anterior, se establece el diferencial de selección (S) (valor de los animales de promedio mayor (seleccionados) menos el valor promedio obtenido), es decir, S=b-a. Es necesario que se obtengan los valores de las variables de los animales cada dos meses, para realizar su seguimiento y comparación con sucesivas progenies a la misma edad. Posteriormente, se obtendría la respuesta de la selección (R), el cual considera el valor promedio de la progenie obtenida (c), menos el promedio de los padres, a la misma edad (R=c-a). Lo anterior, permitirá calcular la heredabilidad de la característica en sentido estricto (h2 = R/S) (10). Este manejo, para pequeñas granjas con un reducido número de animales, fue sugerido por Doyle y Talbot (23), y probado por Brzeski y Doyle (24). Este manejo de animales, contribuiría a superar las falencias genéticas como endogamia a corto plazo, pérdida de variabilidad y reducción de frecuencias génicas asociadas a parámetros productivos, que siguen sin ser suficientemente documentados en las granjas piscícolas en Colombia. Por otro lado,

Pineda - Selección por conformación de reproductores de tilapia roja Oreochromis sp. 3631 si el propósito es ajustarse a una selección genotípica, se hace necesario considerar la selección asistida con marcadores moleculares, los cuales permitirían mejores respuestas a la selección.

En conclusión la progenie obtenida del grupo 1 HBxMR, tuvo los reproductores para una mejor selección por conformación, por lo que se sugiere aumentar el número de animales con mayor LAL. Asimismo, considerar animales con menor cantidad de manchas oscuras y

realizar un manejo de reproductores por grupos independientes para selección masal.

Agradecimientos A la Dirección de Investigación y Posgrado por el apoyo financiero a este proyecto. A los directivos y al técnico profesional Jorge Rodríguez por su estimable colaboración, en la Granja Experimental y de Producción Piscícola John Jairo González Torres, en el municipio de San Jerónimo (Antioquia).

REFERENCIAS 1.

2.

3.

4.

Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR). Diagnóstico del estado de la acuicultura en Colombia: Plan nacional de desarrollo de la acuicultura sostenible en Colombia (FAO INCODER). Bogotá, Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura, 2011.

Eknath AE, Doyle RW. Effective population size and rate of inbreeding in aquaculture of Indian major carps. Aquacult 1990; 85:293–305.

Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR). Agenda nacional de investigación en pesca y acuicultura. Bogotá, Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura, 2012.

Pineda-Santis H, Arboleda-Chacón L. Caracterización morfométrica de tilapia roja Oreochromis sp para el mejoramiento genético en la estación piscícola del Politécnico en San Jerónimo (Antioquia). San Jerónimo-Antioquia: Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid. 2007.

5.

Ruales FR, Manrique C, Cerón MF. Selección.

En: Fundamentos en mejoramiento animal.

Medellín, Vieco e hijas, 2007.

6.

Doyle RW, Shackel NL, Basiao Z, Uraiwan S, Matricia T, Talbot AJ. Selective diversification of aquaculture stocks: a proposal for economically sustainable genetic conservation. Can J Fish Aquat Sci 1991; 48 Supl 1:148-154.

7.

Bentsen HB, Olesen I. Designing aquaculture mass selection programs to avoid high inbreeding rates. Aquacult 2002; 204:349-359.

8.

Gjedrem T. Genetic improvement for the development of efficient global aquaculture: a personal opinion review. Aquacult 2012; 344-349:12-22.

9.

Gjedrem T, Robinson N, Rye M. The importance of selective breeding in aquaculture to meet future demands for animal protein: a review. Aquacult 2012; 350-353:117-129.

10. Falconer DS, Mackay T. Selection: I. the response and its selection. En: Introduction to quantitative genetics. 4th ed. London: Longman Group; 1996.

11. Garduno-Lugo M, Muñoz-Cordova G, Olvera-Novoa M. Mass selection for red colour in Oreochromis niloticus. Aquacult Res 2004; 35:340-344.

12. Mather PB, Lal SN, Wilson J. Experimental evaluation of mass selection to improve red body colour in Fijian hybrid tilapia (Oreochromis niloticus x Oreochromis mossambicus). Aqua Res 2001; 32:329-336.

13. Wagner CE, McIntyre PB, Buels KS, Gilbert DM, Michel E. Diet predicts intestine length in lake Tanganyika’s cichlid fishes, Func Eco 2009; 23:1122-1131.

14. El-Sayed AFM. Basic biology and ecology. En: Tilapia culture. 2006. CAB Internactional.

Oxfordshire (UK).

15. Gjedrem T. Selective breeding to improve aquaculture production. World Aquac 1997; 33-45.

3632

REVISTA MVZ CĂ&#x201C;RDOBA â&#x20AC;˘ Volumen 18 Suplemento 2013

16. Charo-Karisa H, Komen J, Rezk MA, Ponzoni RW, Van Arendonk J, Bovenhuis H. Heritability estimates and response to selection for growth of Nile tilapia Oreochromis niloticus in low-input earthen ponds. Aquacult 2006; 261:479-486.

21. Velasco RR, Janagap CC, De Vera MP, Afan LB, Reves RA, Eknath AE. Genetic improvement of farmed tilapias: estimation of heritability of body and carcass traits of Nile tilapia Oreochromis niloticus. Aquacult 1995; 137:280-281.

17. Rutten MJM, Bovenhuis H, Komen H. Genetic parameters for fillet traits and body measurements in Nile tilapia Oreochromis niloticus. Aquacult 2005; 246:125-132.

22. Charo-Karisa H, Bovenhuis H, Rezk MA, Ponzoni RW, Van Arendonk JAM, Komen H. Phenotypic and genetic parameters for body measurements, reproductive traits and gut length of nile tilapia Oreochromis niloticus selected for growth in low-input earthen ponds. Aquacult 2007; 273:15-23.

18. Nguyen NH, Khaw HL, Ponzoni RW, Hamzah A, Kamaruzzaman N. Can sexual dimorphism and body shape be altered in Nile tilapia Oreochromis niloticus by genetics means?

Aquacult 2007; 272:28-46.

19. Gjerde B, Schaeffer LR. Body traits in rainbow trout: II. Estimates of heritabilities and of phenotypic and genetic correlations.

Aquacult 1989; 80:25-44.

20. Powell J, White I, Guy D, Brotherstone S. Genetic parameters of production traits in Atlantic salmon Salmo salar. Aquacult 2008; 274:225-231.

23. Doyle RW, Talbot AJ. Effective population size and selection in variable aquaculture stocks. Aquacult 1986; 57:27-35.

24. Brzeski VJ, Doyle RW. A test of an on-farm selection procedure for tilapia growth in Indonesia. Aquacult 1995; 37:219-230.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3633-3641, 2013.

ORIGINAL

Evaluación biológica de una fracción de la esponja marina Topsentia ophiraphidites del Caribe colombiano Biological evaluation of a fraction from the colombian Caribbean sponge Topsentia ophiraphidites Lina Blandón G,1* M.Sc, Diana Márquez F,2 Ph.D, Juan López O,1 M.Sc, Maria Márquez F,1 M.Sc. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Grupo Biotecnología Animal, Línea Bioactividad de Productos Naturales y Sintéticos. Medellín, Colombia. 2Universidad de Antioquia, Facultad de Química Farmacéutica, Departamento de Farmacia, Grupo de Productos Naturales Marinos. Medellín, Colombia. *Correspondencia: lmblando@unal.edu.co 1

Recibido: Septiembre de 2012; Aceptado: Abril de 2013.

RESUMEN Objetivo. Evaluar la actividad antiproliferativa y genotóxica de una fracción con actividad citotóxica obtenida de la esponja marina del Caribe colombiano Topsentia ophiraphidites (Fracción T4). Materiales y métodos. La fracción T4 de la esponja marina Topsentia ophiraphidites fue obtenida en el laboratorio de Productos Naturales Marinos de la Universidad de Antioquia. La actividad antiproliferativa se evaluó mediante ensayos de eficiencia de clonación, función de acumulación y cinética proliferativa por intercambio de cromátidas hermanas (ICH); la actividad genotóxica se evaluó mediante electroforesis en gel de células individuales (Ensayo cometa) e intercambio de cromátidas hermanas (ICH). Todas las pruebas fueron realizadas sobre las líneas celulares Jurkat y CHO. Resultados. La fracción T4 afectó el ciclo celular de las células CHO y mostró daño genotóxica crónico en las células Jurkat.

Conclusiones. Se recomienda la evaluación de la fracción T4 en otras líneas celulares derivadas de tumor con el fin de determinar un posible efecto diferencial, además de evaluar otras actividades de tipo antimicrobiano, antimalárico, entre otros.

Palabras clave: Citotoxicidad, esponja, genotoxicidad, peces marinos (Fuente: CAB).

ABSTRACT Objective. To evaluate the antiproliferative and genotoxic activity of a fraction (T4 fraction) of the Colombian Caribbean marine sponge Topsentia ophiraphidites, with cytotoxic activity. Materials and methods. T4 fraction from the marine sponge Topsentia ophiraphidites was provided by the group of marine natural products from Universidad de Antioquia. The antiproliferative activity was evaluated by cloning efficiency tests, accumulation function, and proliferative kinetics by sister chromatid exchange (SCE), genotoxic activity was evaluated by SCE and gel electrophoresis of individual cells (Comet assay). All tests were performed on Jurkat and CHO cell lines. Results. The T4 fraction affected the cell cycle of CHO cells and presented chronic genotoxic damage in Jurkat cells. Conclusions. It is recommended to evaluate the T4 fraction in other derived tumor cell lines, in order to observe a possible differential effect, and to evaluate antimicrobial and antimalarial activities among others.

Key words: Cytotoxicity, genotoxicity, marine fisheries, sponge (Source: CAB).

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INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

Una de las principales causas de muerte en países en desarrollo es el cáncer, enfermedad que consiste en un crecimiento sin control de las células.

Los medicamentos usados para el tratamiento de la enfermedad han mostrado baja eficacia, especificidad limitada, daños en células y tejidos no cancerosos y generan resistencia a tratamientos como la quimioterapia (1).

Sitio de estudio y muestra. La muestra de la esponja Topsentia ophiraphidites fue recolectada mediante buceo autónomo en el Golfo de Urabá (Colombia) a una profundidad de 15-21 metros en 2002; luego se limpiaron cuidadosamente y posteriormente se conservaron a una temperatura de 4ºC y protegidas de la luz. Una parte de la muestra se encuentra en el Laboratorio de Productos Naturales de la Universidad de Antioquia.

En las últimas décadas, se ha incrementado la búsqueda de nuevas sustancias de origen natural con potencial antitumoral como alternativas de tratamiento. Debido a su gran diversidad biológica y química, los océanos constituyen una fuente inmensa para la búsqueda de fármacos antitumorales y las esponjas marinas son los organismos de estudio más promisorios ya que gracias a su naturaleza sésil y mecanismo de protección a predadores, producen metabolitos secundarios con gran potencial antitumoral (2-5).

A partir de las esponjas marinas se ha logrado obtener una gran cantidad de sustancias con potencial antitumoral (6). El análogo ara – C sintetizado a partir de los nucleósidos espongotimidina y espongouridina extraídos de las esponja Cryptotethia cripta es quizás uno de los compuestos más usados en el tratamiento de la leucemia mieloide aguda y su análogo fluorado Gemcitabina, es una importante herramienta terapéutica en el tratamiento del cáncer pancreático y de pulmón (7). Otras sustancias que han mostrado actividad antitumoral se encuentran en etapa preclínica avanzada, como las topsentinas (aislada de Topsentia genitrix, Spongosorites sp. y Hexadella sp.), la debromohymenialdisina (aislada de Plakellia flabellata, Hymeniacidon aldis y Stylotella aurantia), la halichondrina B (aislada de Halichondria okadai), la jasplakilonida (aislada de Jaspis sp. o Dorypleres splendens), el discodermolido (aislado de Discodermia dissoluta) y el mycaperóxido B (aislado de Mycale sp.).

Otros compuestos también aislados de esponjas marinas, como la isohomohalichondrina B, las espongistatinas y la lamellarina N, así como, un alcaloide citotóxico aislado de Biemna sp. y las bastadinas (aisladas de Ianthella sp.) han mostrado actividad in vitro contra líneas de células tumorales (8).

Por lo anterior, con el fin de contribuir con el conocimiento de la actividad biológica de las esponjas marinas colombianas, en este trabajo se evaluó el potencial antiproliferativo y genotóxico in vitro en las líneas celulares establecidas CHO y Jurkat de la fracción citotóxica T4 obtenida de la esponja marina Topsentia ophiraphidites colectada en el Golfo de Urabá (Caribe colombiano).

Preparación de extractos y tratamientos celulares. La muestra de esponja fue cortada en pequeños pedazos y secada a una temperatura inferior a 40ºC. La muestra seca se sometió a extracción inicialmente con diclorometano y posteriormente con etanol. Cada extracto fue filtrado y concentrado hasta sequedad a una temperatura no mayor de 40ºC, utilizando agitación constante y presión reducida. Los extractos secos obtenidos se conservaron refrigerados, protegidos de la luz, del aire, del calor y de la humedad.

El extracto etanólico de la esponja se sometió a fraccionamiento por cromatografía en columna instantánea en la cual la fase estacionaria fue sílica gel C18 y como fase móvil se utilizaron 500 ml de la siguiente serie elutrópica: agua, agua/metanol (1:1), agua/metanol (1:3), metanol, metanol/diclorometano (3:1), metanol/ diclorometano (1:1) y diclorometano. Cada fracción se concentró hasta sequedad a una temperatura no mayor de 40ºC, utilizando agitación constante y presión reducida. Las fracciones se nombraron en el mismo orden en que se hizo la elución con cada solvente, así: T1, T2, T3, T4, T5, T6 y T7. Las fracciones fueron diluídas en dimetilsulfóxido (DMSO) de donde se obtuvo una solución stock inicial de 40 mg/ml, de la cual se realizaron diluciones seriadas en medio simple (RPMI 1640, Gibco), con las que se trataron las dos líneas celulares durante 20 horas (equivalentes a un ciclo celular). De todas las fracciones, la T4 fue la fracción que mostró mayor efecto citotóxico (9) por esa razón se requiere evaluar su potencial antiproliferativo y genotóxico.

Líneas celulares. Para la realización de las pruebas antiproliferativas y genotóxicas (ensayo cometa e intercambio de cromátides hermanas) se empleó la línea celular CHO–K1 (ATCC CCL61) la cual es un subclón de la línea parental CHO derivada de ovario de hámster chino, crece adherida al sustrato y la línea celular Jurkat (ATCC TIB-152) de origen leucemoide, establecida de células de sangre periférica de un

Blandón - Evaluación biológica de la esponja marina Topsentia ophiraphidites niño de catorce años con leucemia aguda, crece en suspensión, adopta morfología de linfoblasto y forma racimo (10,11).

Las líneas celulares fueron mantenidas en medio RPMI 1640 suplementado con 5% (v/v) de suero bovino fetal (SBF), en atmósfera húmeda con CO2 al 5% (v/v) (Jurkat) e incubadas a 37°C (condiciones estándar). Todos los experimentos se realizaron con la viabilidad igual o superior al 95% y con los cultivos en fase exponencial de crecimiento.

Evaluación del efecto antiproliferativo. Para evaluar el efecto antiproliferativo de la fracción T4 se realizaron las pruebas de eficiencia de clonación, función de acumulación y cinética proliferativa por intercambio de cromátidas hermanas (ICH) y se tomaron concentraciones iguales o menores que la IC50 encontrada con las pruebas citotóxicas (9) con el fin de obtener una población celular mayor del 50% que fuese posible evaluar.

Eficiencia de clonación en células CHO. La prueba consiste en tratar las células con la concentración de la sustancia a evaluar, durante un tiempo equivalente a un ciclo celular, luego éstas se cuentan y se diluyen para sembrarlas de nuevo a baja densidad (200 a 400 células/plato multipozo de 6 pozos). Después de 15 días de incubación en condiciones de cultivo estándar, se evalúa el efecto de antiproliferación por conteo del número de colonias de cada cultivo tratado respecto al control negativo (células sin tratar)(12).

El protocolo empleado para la eficiencia de clonación en células CHO fue basado en el reportado por Fresney (12) con modificaciones.

Cultivos de células CHO en fase exponencial de crecimiento y subconfluentes fueron tratados con las diferentes concentraciones (58µg/ml ó IC50, 52 µg/ml, 29 µg/ml) de la fracción T4, desprendidas con tripsina (1X, Gibco), luego contadas y su viabilidad evaluada con azul de tripano al 0.4% (v/v). Las células fueron sembradas en una dilución de 200 células/ pozo en platos de 6 pozos en 2.5 ml de medio RPMI 1640 suplementado con 5% (v/v) de SBF e incubadas a 37°C durante 15 días. Después de este tiempo, se contabilizaron las colonias, se colorearon con cristal violeta (Sigma) al 4% (p/v) y luego se calculó la Eficiencia de Clonación Absoluta (ECA) y la Eficiencia de Clonación Relativa (ECR) con las ecuaciones 1 y 2 (12).

(1)

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Eficiencia de clonación en células Jurkat. El protocolo empleado para la eficiencia de clonación en células Jurkat fue basado en el reportado por Fresney (12) con modificaciones. Las células Jurkat de un cultivo subconfluente tratado con las concentraciones (33 µg/ml o IC50, 30 µg/ml y 17 µg/ml) de la fracción T4, fueron contadas y se determinó su viabilidad con azul de tripano al 0.4% (v/v). Luego las células se sembraron en una dilución de 300 células/pozo en platos de 6 pozos que contenían una primera capa de medio RPMI-1640 suplementado con 10% (v/v) de SBF y agar – agar al 0.6% (p/v) (medio semisólido), de manera que las células fueron adicionadas en una segunda capa de medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con SBF al 10% (p/v) y con agar – agar al 0.3% (p/v), (medio semisólido). Las células se incubaron a 37°C en atmósfera de CO2 al 5% (v/v) durante 15 días, después de lo cual se contaron las colonias formadas. Los cálculos de la ECA y ECR se realizaron de acuerdo con las ecuaciones 1 y 2 respectivamente.

Los controles utilizados para esta prueba, en ambas líneas celulares fueron el control del solvente (DMSO [0.03% (p/v)]) y un control negativo (células sin tratar).

Función de acumulación. La función de acumulación se obtiene después de tratar un cultivo celular con una sustancia a evaluar por un tiempo equivalente a un ciclo celular y posteriormente bloquearlo con un antimitótico durante otro período, equivalente a otro ciclo celular. Finalmente, se realiza una curva con los datos obtenidos, y el período en el cual se llega a la fase estacionaria de la curva, permite calcular el tiempo de generación (Tiempo en el cual se demora una célula en realizar el ciclo celular) y determinar de acuerdo al comportamiento de la pendiente, que tan largo o corto es el ciclo celular respecto al control no tratado con las fracciones. Esta información permite inferir el potencial efecto inhibitorio o acelerador de una sustancia que se quiera evaluar (13).

Se usó el protocolo propuesto por Puck y Steffen (13) con algunas modificaciones. Cultivos en crecimiento exponencial y subconfluentes de ambas líneas celulares, fueron tratados con la fracción T4 a las concentraciones de 29 µg/ml y 17 µg/ml para las células CHO y Jurkat respectivamente, equivalentes a la mitad de las IC50 encontradas con la prueba citotóxica de MTT (9). Posteriormente, se adicionó el antimitótico Colcemid (0.1% (p/v), G&M), se cosecharon y se obtuvieron extendidos cromosómicos por la técnica citogénetica convencional

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

(14), cada dos horas durante 14 horas para células CHO y cada dos horas durante 18 horas para células Jurkat, tiempos equivalentes al ciclo celular de cada una de ellas. Se realizó un control negativo (células sin tratamiento) y un control del solvente (DMSO [0.03% (p/v)]). En cada tratamiento se determinó el índice mitótico (IM) en 1000 células contadas (Ecuación 3).

(3) Cinética proliferativa mediante ICH. La técnica consiste en cambiar la estructura química de un cromosoma incorporando un análogo de la timidina, denominado 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU), durante dos ciclos celulares, lo cual puede ser visualizado con tinción diferencial Giemsa. En un primer ciclo de incorporación del BrdU, se logrará la sustitución de la timidina en las cromátidas hermanas, en el siguiente ciclo de duplicación, se tendrá una cromátida monosustituida (de coloración oscura) mientras que la otra será bisustituida (de coloración pálida), lográndo una diferenciación química de las dos cromátidas. La coloración diferencial permite visualizar los intercambios ocurridos entre las cromátidas hermanas (15).

Teniendo en cuenta que la prueba de cinética proliferativa por ICH es de tratamiento largo (dos a tres ciclos celulares), mientras que la de eficiencia de clonación es de un único ciclo, se pretendía evaluar el efecto sobre el ciclo celular dependiente de la dosis de la fracción, para determinar su efecto a medianas y bajas concentraciones comparadas con la IC50. En el experimento, las células fueron sembradas y después de 36 horas, se adicionó BrdU (1mg/ml, Sigma), luego de un ciclo de replicación (36 ó 60 horas para CHO y Jurkat, respectivamente), las células fueron tratadas con concentraciones de 33 µg/ml (IC50), 17 µg/ml, 8 µg/ml (células Jurkat) y 58 µg/ml (IC50), 29 µg/ml, 17 µg/ml (Células CHO) durante un ciclo adicional de replicación. Una hora antes de la obtención de las preparaciones cromosómicas, las células fueron tratadas con Colcemid (10µg/ml). Se realizaron los controles negativo (células sin tratamiento), control del solvente (DMSO al 0.03% (p/v)). Las preparaciones cromosómicas fueron coloreadas diferencialmente, según el protocolo descrito por Salah et al (16). Se evaluaron 60 metafases y se clasificaron en mitosis de medio ciclo (A), un ciclo (B), ciclo y medio (C), dos ciclos (D), tres ciclos (E) y mayores de tres ciclos (F) luego se calculó el número promedio de células y se estimó el tiempo de generación por cada tratamiento (Ecuaciones 4 y 5).

(4) (5) Efecto genotóxico por ICH. Se evaluó el efecto genotóxico crónico contabilizando los intercambios entre cromátidas hermanas (ICHs) observados en un promedio de 30 metafases de segundo ciclo (16).

Efecto genotóxico por ensayo cometa. El ensayo cometa es una técnica empleada para visualizar el daño en el DNA a nivel de células individuales luego de exposición aguda a un agente genotóxico. Para ello, un pequeño número de células son superpuestas entre dos capas de agarosa sobre un portaobjetos, son lisadas para remover proteínas y lípidos, llevadas a electroforesis y finalmente teñidas con un colorante fluorescente, para visualizar el daño en un microscopio de fluorescencia (17).

En este estudio se tomaron 100.000 células de las líneas celulares Jurkat y CHO en un volumen final de 250 µl de medio RPMI 1640 y se trataron con las diferentes concentraciones (58 µg/ml, 29 µg/ml y 17 µg/ml para las células CHO; 33 µg/ml, 17 µg/ml y 8µg/ml para las células jurkat) de la fracción T4 durante 6 horas con el fin de evaluar el daño agudo sobre el DNA por exposiciones cortas. Se realizaron los controles negativo, positivo (H 2O2 25 µM) y del solvente (DMSO [0.03% (p/v)]). Después del tratamiento, las suspensiones celulares se centrifugaron a 2400 rpm durante 10 min, se retiró el sobrenadante, se mezclaron las células con agarosa de bajo punto de fusión preparada previamente a una concentración de 0.05%, se depositaron sobre un portaobjetos previamente cubierto con agarosa de punto de fusión normal a una concentración de 1% (p/v), se cubrieron con cubreobjetos y se incubaron a 4°C durante 10 minutos para solidificar la agarosa de bajo punto de fusión. Se retiraron los cubreobjetos y las placas se sumergieron en un tampón de lisis durante una noche. A continuación, las placas se pusieron durante 20 minutos en una cámara de electroforesis con tampón de corrido (NaOH 10N, EDTA 200 mM) y luego se corrieron a 300 mA durante 30 minutos a pH 13. Posteriormente, los portaobjetos se deshidrataron con metanol, se tiñeron con Bromuro de etidio (0.02 mg/ml, Sigma) para su observación en una magnificación de 40X en un microscopio de fluorescencia (Nikon, eclipse 80i). Una vez obtenidas las imágenes, la forma del cometa, muestra la ubicación de los fragmentos de tamaño mayor, respecto a los fragmentos menor tamaño, los cuales se pueden

Blandón - Evaluación biológica de la esponja marina Topsentia ophiraphidites

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clasificar en 5 niveles: El nivel 1, representa una célula sin daño y el nivel 5, el máximo daño.

Con ayuda del programa Comet Score se midió el tamaño de la cola de los cometas formados en 60 células por tratamiento, se seleccionó el tamaño de la cola ya que en este caso el daño observado en el DNA era mínimo caso en el que este parámetro es recomendado (18,19).

Análisis estadístico. En cada experimento de eficiencia de clonación se realizaron tres réplicas por tratamiento y cada experimento se realizó por duplicado. El análisis estadístico se basó en la comparación de los promedios de las colonias contadas en los tratamientos y el control negativo, obteniendo la ECA y ECR mediante las ecuaciones 1 y 2.

La función de acumulación se analizó por regresión lineal para cada tratamiento y los controles negativos de cada línea celular. El eje Y es el log [1+IM] versus el tiempo de exposición de las células al antimitótico (13), lo cual permite linearizar la curva y comparar las pendientes del control negativo y de cada una de las concentraciones evaluadas.

En la cinética proliferativa por ICH se obtuvieron los tiempos de generación de controles y tratamientos mediante las ecuaciones 4 y 5.

Por otro lado, el efecto genotóxico por ICH y ensayo cometa se analizó mediante un ANOVA de una vía.

Figura 1. Eficiencia de Clonación Absoluta (ECA) y Relativa (ECR) observada en células CHO (A) y células Jurkat (B) luego de la exposición durante un ciclo celular a las diferentes concentraciones de la fracción T4. Control negativo células sin tratar [0 µg/ml].

RESULTADOS Evaluación de efecto antiproliferativo por eficiencia de clonación. En la figura 1, se muestran los resultados de eficiencia de clonación obtenidos para la fracción T4 en las células CHO (A) y Jurkat (B). Con esta prueba se evaluaron tres concentraciones, la IC50 hallada con las pruebas citotóxicas (7) y dos inferiores a la IC50 en cada una de las líneas celulares: 58 µg/ml (IC50), 52 µg/ml y 29 µg/ml para las células CHO; y para las células Jurkat 33 µg/ml (IC50), 30 µg/ml y 17 µg/ml. Las células CHO mostraron un efecto antiproliferativo dependiente de la dosis.

Evaluación del efecto antiproliferativo por función de acumulación. En la figura 2 se muestran las curvas obtenidas mediante la técnica de función de acumulación, con esta prueba se evaluó una concentración igual a la mitad de la IC50 en cada línea celular (29 µg/ ml para las células CHO, y 17 µg/ml para las células Jurkat).

Figura 2. Curvas de acumulación en células CHO (A) y células Jurkat (B) tratadas durante un ciclo celular con la fracción T4. Control negativo células sin tratar [0 µg/ml].

Cinética proliferativa por ICH. En la figura 3 se muestran los tiempos de generación obtenidos para cada una de las líneas celulares mediante la prueba de ICH. El tiempo de generación estimado para las células Jurkat con las tres concentraciones evaluadas (8, 17 y 33 µg/ml) fue aproximadamente de 33 horas al igual que

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013 Evaluación genotóxica por ensayo cometa.

En la figura 5 se muestran los resultados obtenidos mediante el ensayo cometa.

Figura 3. Tiempos de generación estimados mediante ICH obtenidos de células CHO tratadas 36 horas (A) y Jurkat tratadas 60 horas (B) con diferentes concentraciones de la fracción T4.

Control negativo, células sin tratar [0µg/ml].

el hallado para el control negativo, al contrario las células CHO mostraron valores de tiempo de generación diferentes al del control negativo evidenciándose un retraso prominente en la concentración de 17µg/ml.

Evaluación genotóxica por ICH. En la figura 4, se muestran los resultados obtenidos mediante la prueba de ICH, luego de exponer las células CHO y Jurkat a las diferentes concentraciones de la fracción T4.

Figura 5. Longitudes promedio del cometa, en células tratadas 6 horas con diferentes concentraciones de la fracción T4. Células CHO (A) y Jurkat (B).

Control negativo, células sin tratar [0 µg/ml].

Puede observarse que fue mínimo el daño genotóxico de tipo agudo, debido a la similitud en los promedios de la longitud del cometa de las concentraciones evaluadas con las de los controles negativos (células sin tratar [0 µg/ml]).

DISCUSIÓN

Figura 4. ICHs promedios obtenidos de células CHO tratadas 36 horas (A) y Jurkat tratadas 60 horas (B) con diferentes concentraciones de la fracción T4. Control negativo, células sin tratar [0µg/ ml]. ND: No determinado, todas las metafases observadas estaban en primer ciclo.

La primera evaluación in vitro para encontrar posibles sustancias antitumorales descrita por el Instituto Nacional de Cáncer de los Estados Unidos (NCI) utiliza un panel de líneas celulares derivadas de diferentes tumores, en las cuales se realizan pruebas de citotoxicidad usando un rango de concentraciones de las sustancias candidatas para determinar el grado relativo de inhibición del crecimiento o citotoxicidad en cada línea celular (20). Estas líneas celulares son conocidas como las líneas NCI – 60 y están conformadas por células provenientes de ocho melanomas, seis leucemias, ocho cánceres de mama, dos de próstata, nueve de pulmón, siete de cólon, seis de ovarios, ocho de riñón y seis de cáncer del sistema nervioso central. Con los resultados de las pruebas de citotoxicidad se halla la concentración inhibitoria media (IC50)

Blandón - Evaluación biológica de la esponja marina Topsentia ophiraphidites como la requerida para inhibir el crecimiento celular (21).

Estudios preliminares de los extractos de la esponja marina Topsentia ophiraphidites fueron evaluados mediante el ensayo colorimétrico de la Sulforhodamina B (22) y mostraron efecto in vitro de los extractos y fracciones sobre la viabilidad de líneas celulares tumorales de carcinoma de pulmón A 549, carcinoma de cólon HT29 y cáncer de mama, MDA-MB-231 (23). Por esa razón, la fracción T4 de la esponja marina Topsentia ophiraphidites fue evaluada con las pruebas de MTT y azul de tripano en otras líneas celulares de mamífero como CHO y Jurkat, en las cuales se encontró bioactividad (9).

Algunos reportes, muestran que las esponjas del género Topsentia producen varios tipos de compuestos, como esteroles, esteroides s u l f a t a d o s , d e r i va d o s d e á c i d o s g ra s o s (oxilipinas) y alcaloides especialmente tipo indol (24,25). La esponja T. genitrix posee alcaloides tipo indólico, los cuales han mostrado actividad ictiotóxica, antitumoral, antiviral, antiinflamatoria, antimitótica y antibacterial, entre otras (26,27).

Para evaluar el efecto antiproliferativo de la fracción T4 de Topsentia ophiraphidites, en este estudio, se realizaron las pruebas de eficiencia de clonación, cinética proliferativa por ICH y función de acumulación. En la eficiencia de clonación, se evaluaron tres concentraciones, igual e inferiores a la IC50 obtenida con MTT en cada una de las líneas celulares (9). Las células CHO tratadas con 29 µg/ml, 52 µg/ml y 58 µg/ml (IC50) mostraron un efecto antiproliferativo dependiente de la dosis, es así como a una concentración de 17 µg/ml se obtuvo una ECR de 68.92% mientras que a una concentración de 58 µg/ml se obtuvo una ECR de 38.15%. Por otro lado, las células Jurkat tratadas con 17, 30 y 33 µg/ml (IC50), mostraron efecto similar al control negativo.

Estos resultados muestran un efecto diferencial en ambas líneas celulares (Figura 1).

En la figura 2, la curva de acumulación correspondiente a la concentración equivalente a la mitad de la IC50 (29 µg/ml) para las células CHO, mostró un efecto distinto al del control negativo (Figura 2A), lo cual sugiere un retraso en el ciclo celular. Por otro lado, la curva de acumulación de las células Jurkat tratadas con 17 µg/ml de la fracción T4 muestra pendiente similar al control negativo, demostrando que el ciclo celular no es retrasado (Figura 2B). Datos concordantes con la eficiencia de clonación.

3639

La prueba de ICH permitió estimar el tiempo de generación (TG) de 21.98 horas en las células CHO tratadas una concentración de 29µg/ mL, por el contrario, el tiempo de generación a una concentración de 17 µg/mL mostró un retraso en el ciclo celular de aproximadamente 54 horas comparado con las 18.63 horas del control negativo. Este resultado aparentemente contradictorio muestra un efecto inverso de dosis y el efecto antiproliferativo encontrado, lo cual podría explicarse con la teoría química de las colisiones de las moléculas en solución, la cual podría facilitar la inactivación de las sustancias cuando se encuentran en gran cantidad, pero a la menor concentración puede afectar las células de manera más eficiente por estar diluida.

D e o t r o l a d o, e l t i e m p o d e g e n e ra c i ó n estimado para las células Jurkat con las concentraciones evaluadas (8, 17 y 58 µg/ml) es de aproximadamente 33 horas, similar al control negativo y no dependiente de la dosis evaluada. En estas células, el gen que codifica para la proteína p53 es mutado y aquellas células con mínimo daño en su DNA, no son detenidas en G2 (28). Por el contrario, las células CHO normales para el gen p53, pudieron haber sido detenidas en G2 para reparar el daño y luego continuar al siguiente ciclo. Lo anterior, podría explicar los resultados obtenidos con las pruebas de eficiencia de clonación, ICH y función de acumulación, ya que a pesar de haber sufrido daños en su DNA, las células Jurkat continuaron proliferando.

Es bien conocido que la radioterapia o quimioterapia usados como tratamiento del cáncer pueden inducir daños como quiebres de doble cadena en el DNA (29). Dependiendo del tipo de célula y la fase del ciclo celular, hay dos estrategias de reparación, una de ellas es la unión con un extremo no homólogo (NHEJ) y la otra es la recombinación homóloga (HR). Para reparar el daño producido durante la fase S, la HR necesita de una cadena homóloga como plantilla sin causar pérdidas en la información genética (30).

La prueba del ICH evalúa las HR que reparan el DNA de quiebres de doble cadena (16) evaluando daños genotóxicos de tipo crónico.

El análisis estadístico para la prueba de ICH, (ANOVA, valor p<0.05) en las células CHO y Jurkat demostró que las medias de todos los tratamientos incluida la del control negativo diferían entre sí en ambas líneas celulares, a pesar de que para las células CHO los promedios de ICH obtenidos son similares a los del control negativo, el promedio de ICHs de las células Jurkat es dos veces mayor que su control negativo. De lo anterior, podría deducirse que

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el efecto genotóxico crónico es diferencial entre las líneas evaluadas. Aun así, estos resultados, concuerdan con lo planteado sobre las células normales (CHO), las cuales posiblemente fueron detenidas en G2 con el fin de reparar su DNA, lo cual puede corroborarse en la baja concentración (17 µg/ml) donde hubo un retraso en el ciclo celular y no se pudieron visualizar metafases de segundo ciclo.

El ensayo cometa permite detectar daño genotóxico agudo a nivel de células individuales (31), bajo condiciones alcalinas (pH>13) y puede medir la magnitud de los quiebres de cadena sencilla y dobles en el DNA (32). El análisis estadístico de los resultados obtenidos con el ensayo cometa en las células CHO y Jurkat muestra que las concentraciones evaluadas de la fracción T4 no generan quiebres en el DNA en comparación con el control negativo. En ambos casos, el ANOVA de una vía (p>0.05) demostró que todas las medias de los diferentes tratamientos y el control negativo no variaban entre sí, lo cual implica que la fracción T4 no generó daño genotóxico agudo sobre las líneas celulares evaluadas. Estos resultados, concuerdan con los resultados diferenciales en la

prueba de ICH para las células CHO y Jurkat, a pesar de que estas muestran un leve incremento en el número promedio de ICHs comparada con la línea normal CHO. E n c o n c l u s i ó n l a f ra c c i ó n c i t o t ó x i c a T 4 perteneciente a la esponja marina del Caribe colombiano Topsentia ophiraphidites mostró efecto antiproliferativo diferencial sobre la línea celular normal CHO, pero no en la línea derivada de tumor Jurkat. De la misma forma no mostró efecto genotóxico de tipo crónico en las céluas CHO, pero sí un leve efecto en las células Jurkat.

Sin embargo, es recomendable evaluarla en otras líneas celulares con el fin de observar un posible efecto diferencial entre ellas y también evaluar otras actividades antimicrobianas, antimalaricas, entre otras.

Agradecimientos A la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad Nacional en Medellín por la financiación de este proyecto. Al profesor Sven Zea por su valiosa ayuda y colaboración en la identificación del material animal.

REFERENCIAS 1. Pereira JRCS, Hilário FF, Lima AB, Silveira MLT, Silva LM, Alves RB, et al. Cytotoxicity evaluation of marine alkaloid analogues of viscosaline and theonelladin C. Biomed Prevent Nut 2012; 2(2):145-148.

marine-derived anticancer agents. J Translat Med 2006; 4(1):3.

8.

Mora J, Zea S, Santos M, Newmark – Umbreit F. Capacidad antimitótica de extractos de esponjas del Caribe colombiano. Bol Invest Mar Cost 2007; 36:167–169.

9.

3. Galeano E, Martínez A. Antimicrobial activity of marine sponges from Urabá Gulf, Colombian Caribbean region. J Mycol 2007; 17(1):21-24.

Blandón LM. Evaluación del potencial bioactivo de las esponjas marinas Myrmekioderma gyroderma y Topsentia ophiraphidites. [Tesis de Maestría]. Medellín, Colombia: Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias; Área curricular de Biotecnología; 2012.

4. Laville R, Thomas OP, Berrue F, Marquez D, Vacelet J, Amade P. Bioactive guanidine alkaloids from two Caribbean marine sponges. J Nat Prod 2009; 72(9):1589-1594.

10. Cai X, Xing X, Cai J, Chen Q, Wu S, Huang F. Connection between biomechanics and cytoskeleton structure of lymphocyte and Jurkat cells: An AFM study. Micron 2010; 41(3):257-62.

5. Baerga-Ortiz A. Biotechnology and biochemistry of marine natural products. P R Health Sci J 2009; 28(3):251-257.

11. Ahn WS, Antoniewicz MR. Parallel labeling experiments with [1,2-13C]glucose and [U-13C] glutamine provide new insights into CHO cell metabolism. Metabolic Engineering 2013; 15:34-47.

2. Sepčić K, Kauferstein S, Mebs D, Turk T. Biological activities of aqueous and organic extracts from tropical marine sponges. Marine Drugs 2010; 8(5):1550-1566.

6. Sipkema D, Franssen MC, Osinga R, Tramper J, Wijffels RH. Marine sponges as pharmacy. Mar Biotechnol (NY) 2005; 7(3):142-162.

7. Jimeno J, Aracil M, Tercero JC. Adding pharmacogenomics to the development of new

12. Freshney IR. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. United States of America: John Wiley & Sons Inc; 2005.

Blandón - Evaluación biológica de la esponja marina Topsentia ophiraphidites 13. Puck TT, Steffen J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells I. A Method for localizing metabolic events within the life cycle, and its application to the action of colcemide ans sublethal doses of X - irradiation. Biophys J 1963; 3:379-397.

14. López JB, Márquez ME. Modelo experimental para el estudio cromosómico en células de mamífero.

Medellín- Colombia: Universdad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias; 2002.

15. Orta ML, Mateos S, Cantero G, Wolff LJ, Cortés F. Protection of halogenated DNA from strand breakage and sister-chromatid exchange induced by the topoisomerase I inhibitor camptothecin. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 2008; 637(1–2):40-48.

16. Ben Salah G, Kamoun H, Rebai A, Ben Youssef A, Ayadi H, Belghith-Mahfoudh N, et al. Sister chromatid exchange (SCE) and high-frequency cells (HFC) in peripheral blood lymphocytes of healthy Tunisian smokers. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 2011; 719(1–2):1-6.

17. Speit G, Vasquez M, Hartmann A. The comet assay as an indicator test for germ cell genotoxicity. Mutation Research/Reviews in Mutation Research 2009; 681(1):3-12.

18. Fairbairn DW, Olive PL, O’Neill KL. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology 1995; 339(1):37-59.

19. Liao W, McNutt MA, Zhu W-G. The comet assay: A sensitive method for detecting DNA damage in individual cells. Methods 2009; 48(1):46-53.

20. Boyd MR. Some practical considerations and applications of the National Cancer Institute In Vitro Anticancer Drug Discovery Screen. Totowa, Nueva Jersey: Teicher Humana Press Inc; 1995.

21. Chakravarti SK, Klopman G.. A structural analysis of the differential cytotoxicity of chemicals in the NCI-60 cancer cell lines. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2008; 16(7):4052–4063.

22. Rubinstein L, Shoemaker R, Paull K, Simon R, Tosini S, Skehan P, Scudiero D, Monks A, Boyd M. Comparison of in Vitro anticancer - drugscreening data generated with a tetrazolium assay versus a protein assay against a diverse panel of human tumor Cell Lines. 1990. J Natl Cancer Inst 1990; 82:1113-1118.

3641

23. Márquez DM. Estudio Químico y Evaluación Biológica de Esponjas Marinas del Caribe Colombiano. [Tesis Doctoral]. Medellín, Colombia: Universidad de Antioquia, Facultad de Química Farmacéutica; 2009.

24. Guzii AG, Makarieva TN, Denisenko VA, Dmitrenok PS, Burtseva YV, Krasokhin VB, et al.

Topsentiasterol sulfates with novel iodinated and chlorinated side chains from the marine sponge Topsentia sp. Tetrahedron Letters 2008; 49(50):7191-7193.

25. McKee TC, Cardellina II JH, Tischler M, Snader KM, Boyd MR. Ibisterol sulfate, a novel HIVinhibitory sulfated sterol from the deep water sponge Topsentia sp. Tetrahedron Letters 1993;34(3):389-392.

26. Gupta L, Talwar A, Chauhan PMS. Bis and tris indole alkaloids from marine organisms: new leads for drug discovery. Current Medicinal Chemistry 2007; 14(16):1789-1803.

27. Mal SK, Bohé L, Achab S. Convenient access to bis-indole alkaloids. Application to the synthesis of topsentins. Tetrahedron 2008;64(25):5904-5914.

28. Siddiqui RA, Jenski LJ, Neff K, Harvey K, Kovacs RJ, Stillwell W. Docosahexaenoic acid induces apoptosis in Jurkat cells by a protein phosphatase-mediated process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular Cell Research 2001;1499(3):265-275.

29. Clarke PR, Allan LA. Cell-cycle control in the face of damage – a matter of life or death. Trends in Cell Biology 2009; 19(3):89-98.

30. Sjögren C, Ström L. S-phase and DNA damage activated establishment of Sister chromatid cohesion—importance for DNA repair. Experimental Cell Research 2010; 316(9):1445-1453.

31. Speit G, Vásquez M, Hartmann A. The comet assay as an indicator test for germ cell genotoxicity. Mutation Research/Reviews in Mutation Research 2009; 681(1):3-12. DOI dx.doi.org/10.1016/j.mrrev.2008.03.005 32. Rosenberger A, Rössler U, Hornhardt S, Sauter W, Bickeböller H, Wichmann H-E, et al. Validation of a fully automated COMET assay: 1.75 million single cells measured over a 5 year period. DNA Repair 2011; 10(3):322-337.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3642-3647, 2013.

ORIGINAL

Efecto del alimento sobre variables productivas de dos especies de Cladóceros bajo condiciones de laboratorio Effect of food intake on productive variables of two species of cladocera, under laboratory conditions Angélica Otero P, M.Sc, Marcela Muñoz P, Biol, Víctor Medina-Robles,* M.Sc, Pablo Cruz-Casallas, Ph.D. Universidad de los Llanos, Instituto de Acuicultura. Grupo de Investigación sobre Reproducción y Toxicología de Organismos Acuáticos - GRITOX, km 12 vía Puerto López, Villavicencio, Colombia. *Correspondencia: mauriciomedina77@gmail.com Recibido: Julio de 2012; Aceptado: Abril de 2013.

RESUMEN Objetivo. Evaluar los efectos de diferentes tipos de alimentos sobre la productividad de Diaphanosoma sp., y Alona sp bajo condiciones de laboratorio. Materiales y métodos. Juveniles de Diaphanosoma sp., y Alona sp., fueron sembrados en acuarios de 20 L a una densidad de 6 org L-1 y mantenidos con aireación constante y fotoperíodo 12:12 (luz : oscuridad). Se alimentaron con Saccharomyces cereviseae y Chlorella vulgaris a concentración de 4 x 105 Cel/ml cada uno, en tres combinaciones: 1.

C. vulgaris, 2. S. cereviseae, 3. C. vulgaris + S. cereviseae en proporciones iguales; de cada tratamiento se realizaron 3 réplicas. Con el propósito de determinar la densidad poblacional, cada 3 días y durante un período de 27 días, y se midió la concentración de individuos por ml. Resultados. Se obtuvieron mejores resultados en el tratamientos de microalgas + levadura, con valores de TCE=0.1323±0.07 y 0.1598±0.04 días-1; R=0.010 ±0.004 y 0.019±0.01 org ml-1 día-1, TD=5.2±0.5 y 4.3±0.38 días para Diaphanosoma sp., y Alona sp., respectivamente, pero sin presentar diferencias significativas (p>0.05).

Conclusiones. La dieta mixta de levadura y microalgas produjo mayor eficiencia productiva en las dos especies estudiadas, constituyendo una alternativa de fuente de alimento vivo para la acuicultura.

Palabras clave: Chlorella vulgaris, cladóceros, zooplancton (Fuente: AIMS).

ABSTRACT Objective. Assess the effects of different types of food intake on the productivity of Diaphanosoma sp. and Alona sp. under laboratory conditions. Materials and methods. Young Diaphanosoma sp. and Alona sp. were planted in 20 L aquariums at a density of 6 org L-1 and maintained with constant aeration and a photoperiod 12:12 (light: dark). The organisms were fed with Saccharomyces cereviseae and Chlorella vulgaris at a concentration of 4 x 105 cells/ml in three combinations: 1.

C. vulgaris, 2. S. cereviseae 3. C. vulgaris + S. cereviseae); 3 replicas were carried out for each treatment. To determine the population density, every 3 days over a 27 day period, the concentration of

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Otero - Efecto del alimento sobre variables productivas en dos especies de Cladóceros 3643 individuals per ml was measured using a Bogorov camera. Results. The best results were obtained in treatments with microalgae and yeast, with values of TCE=0.1323±0.07 and 0.1598±0.04 days-1, R=0.010±0.004 and 0.019±0.01 org ml-1 days-1, TD=5.2±0.5 and 4.3±0.38 days for Diaphanosoma sp., and Alona sp., respectively, but without significant differences (p>0.05). Conclusions. The mixed diet of yeast and microalgae produced greater productive efficiency in the studied species, constituting an alternative source of live feed for aquaculture.

Key words: Chlorella vulgaris, cladocerans, zooplankton (Source: AIMS).

INTRODUCCIÓN El zooplancton vivo constituye una fuente importante de alimento para las larvas de crustáceos y peces, debido a su tamaño reducido y valor nutricional; siendo muchas veces un factor limitante en los procesos de larvicultura y alevinaje de las especies cultivadas. Entre los organismos zooplanctónicos, los cladóceros se destacan no sólo por su reproducción partenogenética y ciclo corto de vida, sino también por su capacidad de producción en períodos cortos de tiempo (1,2); además, por ser una fuente importante de aminoácidos, lípidos, ácidos grasos esenciales, vitaminas y enzimas (peptidasas, proteinasas, lipasas y amilasas) que sirven como exoenzimas en el intestino de las larvas de los peces (3). De igual manera presentan otras ventajas en larvicultura, no afectan la calidad del agua y sus características se mantienen por largos períodos. Dentro de los cladóceros se destacan los géneros Daphnia y Moina, los cuales son de gran importancia en la piscicultura (3).

El cultivo de cladóceros ofrece la ventaja de generar un gran número de individuos en cortos períodos de tiempo, siempre y cuando se le proporcione al cultivo las condiciones adecuadas de temperatura, calidad de agua y alimentación (4). Según algunos autores (5, 6), el valor nutricional y la cantidad de alimento suministrada, influye sobre la tasa de reproducción y sobre la frecuencia reproductiva de cladóceros y rotíferos; determinando el crecimiento de la población, por lo que se ha observado, en muchas especies de zooplancton, una relación directa entre la producción de huevos partenogenéticos y la cantidad de alimento disponible (7).

Existen varios métodos para evaluar los efectos del tipo de alimento sobre el crecimiento de las poblaciones cultivadas de zooplancton, entre los que se encuentran el análisis bromatológico y la cuantificación de la densidad de la población (8); sin embargo, el uso de especies nativas de cladóceros en la alimentación de larvas es aún muy limitado, debido a la ausencia de protocolos de cultivo que permitan su producción a escala

comercial, con la calidad y en la cantidad necesaria para suplir los requerimientos básicos de las diferentes especies de peces (3). Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue evaluar diferentes tipos de alimento sobre algunas variables productivas de dos especies de cladóceros (Diaphanosoma sp., y Alona sp.), bajo condiciones experimentales de de laboratorio.

MATERIALES Y MÉTODOS Localización y descripción del área de estudio. La investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Producción de Alimento Vivo del Instituto de Acuicultura de la Universidad de los Llanos, localizado a 4 km de la ciudad de Villavicencio. La zona de estudio presenta una altura promedio de 418 m.s.n.m, temperatura de 25°C, precipitación pluvial anual de 4050 mm y humedad relativa del 75%.

Cultivo de microalgas. La cepa de microalga Chlorella vulgaris fue obtenida del laboratorio de alimento vivo del Instituto de Acuicultura de la Universidad de los Llanos. Para el cultivo se utilizó como medio un fertilizante inorgánico del complejo NPK (REMITAL® m – 17-6-18) a razón de 1 g L-1 (9). El cultivo se mantuvo bajo condiciones controladas de temperatura de 18±1ºC, 24 horas luz y aireación constante.

Material biológico. Se utilizaron individuos juveniles de las especies Diaphanosoma sp., y Alona sp. proporcionados por el Laboratorio de Alimento Vivo de la Universidad de los Llanos.

Para evaluar los efectos del alimento sobre algunas variables productivas se seleccionaron aleatoriamente juveniles de cladóceros, los cuales fueron ubicados en acuarios de vidrio con capacidad de 20 L a una densidad inicial de 6 organismos L-1, conformando 6 tratamientos como se muestra en la tabla 1. Durante el experimento se mantuvo la aireación constante y se manejó un fotoperíodo de 12:12 (luz: oscuridad). Se alimentó una vez al día (10:00 a.m), la densidad del alimento se determinó

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mediante recuento en cámara de Neubauer (Brightline “Boeco®”, Germany), utilizando un microscopio óptico (“Nikon ®” Eclipse E200, Japón) con aumento de 40x y se utilizó la fórmula propuesta por Sipaúba –Tavares et al (7): [1]

Alona sp.

Diaphanosoma sp.

Donde: Ln2: Logaritmo natural de 2 K: Tasa instantánea de crecimiento (TCE).

Rendimiento. Número de organismos por día

Tabla 1. Tratamientos evaluados durante el cultivo de Alona sp. y Diaphanosoma sp., bajo condiciones de laboratorio.

Especie de Cladócero

[3]

Tratamientos

Alimento (4 x 105 Cel/ml)

T1

C. vulgaris

T2

S. cerevisiae

T3

C. vulgaris + S. cerevisiae (1:1)

T4

C. vulgaris

T5

S. cerevisiae

T6

C. vulgaris + S. cerevisiae (1:1)

[4] Donde: Nt1: Número final de organismos por ml Nt0: Número inicial de organismos por ml t: Tiempo en días.

Densidad máxima (Dm). Densidad máxima de organismos obtenidos en el cultivo Org L-1.

Día de máxima densidad (Dmd). Día de mayor número de organismos en el cultivo.

Densidad final del cultivo. Organismos/ml.

Se emplearon tres réplicas por tratamiento, asignadas aleatoriamente. Durante 27 días, cada 3 días, se midió la densidad del cultivo por medio del recuento en cámara Bogorov para zooplancton.

Se midieron parámetros físicos y químicos del agua, tales como temperatura y pH, por medio de un pH metro digital (Hanna pHep 5, Mauritius), oxígeno disuelto y conductividad, haciendo uso de una sonda multiparamétrica YSI (YSI 556 Professional Plus Ohaus, USA).

Variables observadas. Como variables de respuesta se evaluaron: Tasa instantánea de crecimiento (TCE), Tiempo de duplicación (TD), Rendimiento (R) y Densidad máxima (Dm), siguiendo las criterios reportados por Prieto et al (3) y Heugens (10): Tasa instantánea de crecimiento (TCE).

Determina el aumento de la población en un período específico.

[2] Donde: Nt1: Número final de cladóceros en ml Nt0: Número inicial de cladóceros en ml T: Tiempo del cultivo Tiempo de duplicación. Tiempo que tarda la población en duplicarse.

Análisis estadístico. Se realizó la estadística d e s c ri p t i va e x p re s and o l o s d at o s c o mo media±error estándar de la media (SEM). Para determinar los efectos de los tratamientos sobre las variables físicas y químicas, los resultados fueron sometidos a un análisis de varianza de una vía (ANOVA), previa verificación de los supuestos de homogeneidad de varianza (Prueba de Bartlett y Levene) y normalidad de los datos (Prueba de Kolmogorov- Smirnov). Una vez comprobada la normalidad de los datos fue aplicada una prueba de comparación de Tukey, con un nivel de significancia de p<0.05. Los datos fueron analizados con el software SAS versión 8.02 para Windows (1999-2001 por SAS Institute Inc, Cary, NC. USA).

RESULTADOS La tabla 2 muestra los resultados del monitoreo de las condiciones físicas y químicas del agua de cultivo. La temperatura no varió significativamente (p>0.05) entre tratamientos, siendo registrado el menor promedio en el tratamiento T3 y el mayor en el T4 (26.4± 0.2 y 27±0.1°C, respectivamente). Con relación al pH, los tratamientos T1 y T4 registraron valores inferiores (p<0.05) a los demás tratamientos. Las demás variables no variaron significativamente (p>0.05) entre tratamientos.

En la figura 1 se observa que ambas especies de cladóceros durante los primeros días del ensayo presentaron una fase de adaptación,

Otero - Efecto del alimento sobre variables productivas en dos especies de Cladóceros 3645 Tabla 2. Condiciones físicas y químicas del agua utilizada en el cultivo experimental de los cladóceros Alona sp., y Diaphanosoma sp. Los valores corresponden a la media ± SEM. n=27 Parámetros

T1

T2

T3

T4

T5

T6

T (oC)

26.7± 0.28

26.52 ± 0.24

26.3± 0.22

27± 0.14

26.79± 0.50

27.0± 0.10

pH

5.1 ± 0.22b

7.64 ± 0.16a

7.0± 0.14a

5.3± 0.28b

7.6± 0.24a

7.4± 0.15a

OD (mg/L)

2.7± 0.30

2.84± 0.31

3.0± 0.33

3.0± 0.27

3.16± 0.29

3.1± 0.29

C (µS/cm)

224± 26.17

184.1± 18.2

208 ± 28.16

204± 22.33

189± 17.79

250± 37.47

Para Alona sp., la tasa especifica de crecimiento (TEC), rendimiento (R) y el tiempo de duplicación (TD) fueron de 0.1598±0.04 días-1; 0.019±0.01 org ml-1 día-1 y 4.3±0.38 días, respectivamente; mientras que para Diaphanosoma sp., fue 0.1323±0.07 días-1; 0.010±0.004 org mL-1 día-1 y 5.2±0.5 días, respectivamente (Tabla 3).

Tabla 3. Variables productivas de Diaphanosoma sp., y Alona sp., cultivadas durante 27 dias en acuarios de vidrio y alimentadas con una mezcla de C. vulgaris y S. cerevisiae. Los valores corresponden a la media ± SEM. n=3 Variables

Diaphanosoma sp.

C. vulgaris + S. cerevisiae

Alona sp.

C. vulgaris + S. cerevisiae

TCE (días-1)

0.1323 ± 0.07

0.1598 ± 0.04

R (Org ml-1 día-1)

0.010 ±0.004

0.019 ± 0.01

TD (días)

5.2 ± 0.5

4.3±0.38

Dmd (días)

24

27

Dm (Org L-1)

550±500

383±200

T: Temperatura, OD: Oxígeno disuelto y C: Conductividad

durante la cual la tasa de crecimiento fue muy baja. A partir del día 15 se observó una tasa de crecimiento moderada, alcanzando una densidad de 115±110 y 85±30 orgL-1 para Diaphanosoma sp., y Alona sp., respectivamente, sin observarse diferencias significativas (p>0.05). El cultivo de Diaphanosoma sp., alcanzó la máxima densidad (550±500 orgL-1) el día 24, mientras que Alona sp., la alcanzó el día 27 con una densidad de 383±200 orgL-1 presentando diferencias significativas (p<0.05). A partir del día 27 el cultivo de Diaphanosoma sp., registró un descenso en la densidad, mientras que Alona sp., continuó su crecimiento.

Figura 1. Variación de la densidad poblacional durante 27 d de cultivos de Alona sp., y Diaphanosoma sp., realizados en acuarios de vidrio de 20 L y alimentadas con una mezcla de microalgas y levaduras. Valores mostrados como media ± SEM. n=3.

Los datos de los demás tratamientos no se muestran debido al no crecimiento poblacional.

TCE: Tasa Instantánea de Crecimiento; R: Rendimiento; Dm: Densidad Máxima; Dmd: Día de máxima densidad; TD: Tiempo de Duplicación.

Los datos de los demás tratamientos no se muestran debido al no crecimiento poblacional.

DISCUSIÓN La temperatura es un factor importante para el desarrollo y metabolismo de los organismos zooplanctónicos (11). La temperatura promedio en este estudio fue de 26.9°C, valor que se encuentra dentro del rango de 20–28°C, reportado como adecuado para el cultivo de cladóceros (7). Sipaúba-Tavares y Bachion (12) reportaron para las especies Diaphanosoma birgei y Moina micrura la utilización de temperaturas de cultivo de alrededor de 25°C, suministrando alimento a base de microalgas y suplemento de vitaminas; de igual manera para Moina sp., han sido reportadas temperaturas de cultivo entre 25 y 27°C y alimentos a base de Scenedesmus sp. (13). Estos autores concluyeron que la temperatura no altera de manera significativa las variables productivas, lo cual coincide con lo observado en este estudio. Las concentraciones de OD del agua no fueron limitantes para el cultivo de cladóceros, esta variable es poco reportada; sin embargo, algunos autores como Rottmann et al (14), reportaron que estos organismos toleran ambientes deficientes o sobresaturados de oxígeno, gracias a su capacidad de sintetizar hemoglobina cuando se someten a ambientes bajos de oxígeno.

El pH en los tratamientos T1 y T4 presentó un valor promedio de 5.2± 0.22; valor que se encuentra por debajo de lo reportado por otros autores. Prieto et al (3) y Romero (13),

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reportaron para Moina sp., pH de cultivos de 7.62 y 7.00 alimentados con Ankistrodesmus sp., más S. cereviseae y Scenedesmus sp., respectivamente. Esta disminución del pH puede relacionarse con el incremento en la densidad de la microalga; según Sipaúba-Tavares et al (7), al aumentar la densidad de algas en un medio, el pH tiende a disminuir. Esta pudo ser una de las razones que incidió para que no se presentara crecimiento en estos tratamientos.

Los cladóceros alimentados con la dieta a base de sólo levaduras, no presentaron crecimiento poblacional, lo cual coincide con los resultados reportados por Peña-Aguado et al (6) en M. macrocopa y Ceriodaphnia dubia. Lo anterior puede atribuirse a que estos organismos requieren en su dieta la presencia de ácidos grasos esenciales, tales como: ácidos grasos insaturados (HUFA) y polinsaturados (PUFA) y las levaduras se caracterizan por tener bajos contenidos de PUFA (20:5n-3 y 22:6n-3)(15). Autores como Prieto et al (3), recomiendan para cladóceros la utilización de dietas mixtas (microalgas y levadura) o utilizar otros suplementos alimenticios para mantener la estabilidad del cultivo, disminuir los efectos de los productos de degradación de la levadura y suplir la carencia de ciertas vitaminas. Lo anterior, coincide con lo observado en este estudio, siendo más eficientes los cultivos en aquellos tratamientos que incluyeron la mezcla de microalgas y levaduras. De igual manera, S. cereviseae ha sido ampliamente estudiada como dieta en otras especies de microcrustáceos: rotíferos, Daphnia sp., Artemia y copépodos, debido a su contenido nutricional (16-18).

Crecimiento poblacional se observó únicamente en los tratamientos en los cuales se utilizó como fuente de alimentos la mezcla de microalgas y levaduras, para ambas especies Diaphanosoma y Alona. Estos resultados coinciden con lo reportado por Prieto et al (3) en Moina sp., alimentadas con Ankistrodesmus sp. y S. cereviseae, en proporción 1:1, quienes observaron una densidad máxima de 12.300±300 org L-1. Por su parte, Sipaúba-Tavares et al (11) observaron densidades de 3.15 y 4.593 org L-1 con M. micrura

y D. birgei, respectivamente, alimentados con A. gracillis más vitaminas; lo cual confirma, que las dietas mixtas proporcionan mejores resultados y que las levaduras son eficaces cuando se complementan con algas, reduciendo los costos de producción de zooplancton a gran escala (6).

De igual manera se han reportado resultados importantes en el cultivo de cladóceros cuando son alimentados con microalgas. Un cultivo de D. birgei alcanzó una densidad de 140 x 102 organismos L-1 alimentados con A. gracillis (19), mientras otro de Moina sp., alimentada con Scenedesmus, densidades de 3.020 org L-1 (12).

En este estudio, los valores de las variables productivas TCE, TD y R para ambas especies fueron menores a aquellos reportados por Prieto et al (3) y Romero (12), quienes evaluaron dietas con Ankistrodesmus sp., más Saccharomyces cereviseae y Scenedesmus sp., en Moina sp., encontrando valores de TCE=0.36 y 0.13; TD=1.94 y 2.72 y R=1.1 y 0.36, respectivamente.

Estos valores bajos podrían atribuirse al hecho de haber utilizado una densidad poblacional inicial muy baja (6 org L-1) para ambas especies, ya que la mayoría de trabajos consultados reportan densidades de siembra de entre 2.000 y 5.000 org L-1.

En conclusión bajo las condiciones experimentales u t i l i z a d a s , l o s c l a d ó c e r o s A l o n a s p., y Diaphanosoma sp., alimentados con la mezcla de microalgas y levadura presentaron el mejor comportamiento productivo. La especie que presentó los mejores resultados con respecto a las variables evaluadas fue Diaphanosoma sp., la cual se recomienda como una especie con gran potencial para el cultivo comercial.

Agradecimientos El presente trabajo fue realizado en el marco del convenio N° 106 de 2010, SENA-Universidad de los Llanos, como parte del proyecto “Evaluación de aspectos reproductivos de zooplancton nativo bajo diferentes fotoperíodos como estrategia para su producción a escala comercial”.

REFERENCIAS

1. Sarma SS, Nandini S. Review of recent ecotoxicological studies on cladocerans. J Environ Sci Health B 2006; 41:1417-1430.

2. Hardy E, Castro JGD. Qualidade nutricional de três especies de clorofíceas cultivadas em laboratório. Acta Amazônica 2000; 30(1):39-47.

Otero - Efecto del alimento sobre variables productivas en dos especies de Cladóceros 3647 3. Prieto M, Cruz LDl, Morales,M. Cultivo experimental del cladócero Moina sp alimentado con Ankistrodesmus sp y Saccharomyces cerevisiae. Rev MVZ Córdoba 2006; 11:705-714.

12. Sipaúba-Tavares LH, Bachion MA. Population growth and development of two species of cladocera, Moina micrura y Diaphanosoma birgei, in laboratory. Braz J Biol 2002; 62(4A):701-711.

4. Sipaúba-Tavares L, Bachion M. Population growth and development of two species of cladocera, Moina micrura and Diaphanosoma birgei, in laboratory. Braz J Biol 2002; 62(4A):701-711.

13. Romero TJ. Desarrollo de Moina sp en condiciones de laboratorio alimentada con microalgas cultivadas en residuales pesqueros. REDVET 2009; 10(4):1-14.

5. Sarma SSS, Gulati RD, Nandini S. Factors affecting egg-ratios in planktonic rotifer populations under culture conditions.

Hydrobiología 2005; 546:361–373.

14. Rottmann RW, Graves JS, Watson C, Yanong RE. Culture Techniques of Moina: The ideal Daphnia for feeding freshwater fish fry.

IFAS Extensión. Florida, USA: University of Florida; 2003.

6. Peña-Aguado F, Nandinia S, Sarma SSS. Differences in population growth of rotifers and cladocerans raised on algal diets supplemented with yeast. Limnológica 2005; 35:298-303.

15. Ocampo LE, Botero M, Restrepo LF. Evaluación del crecimiento de un cultivo de Daphnia magna alimentado con Saccharomyces cerevisiae y un enriquecimiento con avena soya. Rev Colomb Cienc Pecu 2010; 23:78-85.

7. Sipaúba-Tavares L, Rocha O. Produção de Plâncton (fitoplâncton e Zooplâncton) para alimentação de Organismos Aquáticos. 1ra ed. São Carlos, Brasil: RIMA; 2003.

16. Jiménez D, Rosas J, Velásquez A, Millán J, Cabrera T. Crecimiento poblacional y algunos aspectos biológicos del cladocero Moina macrocopa (Straus, 1820) (Branchiopoda, Anomopoda), alimentado con tres dietas en tres salinidades diferentes. Ciencia 2003; 11:22-30.

8. Watanabe T, Tamiya T, Oka A, Hirata C, Kitajima C, Fujita S. Improvement of dietary value of live foods for fish larvae by feeding them on ω3 highly unsaturated fatty acids and fat-soluble vitamins. Nippon Suisan Gakkai Shi 1983; 50:1015–1022.

9. Muñoz-Peñuela M, Ramírez-Merlano JA, Medina-Robles VM, Cruz-Casallas PE, Velasco-Santamaría YM. Efecto del medio de cultivo sobre el crecimiento y el contenido proteico de Chlorella vulgaris. Rev Col Cienc Pec, 2012;25 (3):438-449.

10. Heugens E, Tokkie L, Kraak M, Hendriks A. Van SN and Admiraal W. Population growth of Daphnia Magna under multiple stress conditions: Joint effects of temperature, food, and cadmium. Environ Toxicol Chem 2006; 25:1399-1407.

11. Rodríguez-Estrada JC, Villaseñor F, MartínezJerónimo. Efecto de la temperatura y tipo de alimento en el cultivo de Moina micrura (Kurz, 1984) (Anomopoda:Moinidae) en condiciones de laboratorio. Hydrobiológica 2003; 13(3):239-246.

17. Fazeli Z, Takami G. The best time and concentration for yeast probiotic enrichment of Artemia urmiana Nauplii. Pakistan J Biol Sci 2006; 9:2159-2161.

18. Hamre K, Srivastava A, Ronnestad I, MangorJensen A, Stoss J. Several micronutrients in the rotifer Brachionus sp. may not fulfi l the nutritional requirements of marine fish larvae. Aquacult Nutr 2008; 14:51-60.

19. Sipaúba-Tavares, LH, Pereira AML. Large scale laboratory cultures of Ankistrodesmus gracilis (Reisch) Korsikov (Chlorophyta) and Diaphanosoma biergei Korinek, (Cladocera) 1981. Braz J Biol 2008; 68(4):875-883.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3648-3657, 2013.

ORIGINAL

Evaluación in vivo de Lactobacillus plantarum como alternativa al uso de antibióticos en lechones In vivo evaluation of Lactobacillus plantarum as an alternative to antibiotics uses in piglets Henry Jurado-Gámez,1* Ph.D, Cristina Ramírez T,2 Ph.D, Javier Martínez B,1 M.Sc. Universidad de Nariño, Facultad de Ciencias Pecuarias, Departamento de Producción y Procesamiento Animal, Programa de Zootecnia. Pasto, Colombia. Grupo de Investigación en Procesos Biotecnológicos Aplicados en la Producción Animal. 2Universidad del Valle, Escuela de Ingeniería de Alimentos, Grupo de Investigación en Ingeniería de los Procesos Agroalimentarios y Biotecnológicos GIPAB. Cali, Colombia. *Correspondencia: henryjugam@gmail.com 1

Recibido: Abril de 2012; Aceptado: Enero de 2013.

RESUMEN Objetivos. Evaluar el efecto in vivo de Lactobacillus plantarum como alternativa al uso de antibióticos en lechones. Materiales y métodos. 50 lechones fueron distribuidos en 5 tratamientos (n=10). (T0: sin probiótico; T1: con L. plantarum 1 H1; T2: con L. plantarum 1 H2; T3: con probiótico comercial; T4: sin probiótico comercial). Las cepas fueron identificadas molecularmente. Para la elaboración de los inóculos se utilizaron 10 g/L azúcar blanco; 15 g/L leche de soya; 150 g/L suero de leche; 15 g/L salvado de trigo y se analizó la viabilidad a temperatura ambiente y refrigeración. El efecto de los inóculos probióticos se evaluó en ganancia de peso, sobrevivencia y presentación de diarrea. La determinación del contenido de inmunoglobulina A se hizo por turbidimetría; colesterol total y BUN por espectofotometría. El recuento de polimorfonucleares neutrófilos mediante extendido de sangre.

Resultados. Las cepas correspondieron molecularmente a Lactobacillus plantarum. La producción de los inóculos, para el caso de L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 se almacenaron por 21 y 12 días a temperatura de refrigeración manteniendo viabilidades altas. Los animales sometidos a los tratamientos T1 y T2 no presentaron episodios de diarrea y la mayor ganancia de peso vivo final, así como las concentraciones más altas de IgA, polimorfonucleares neutrófilos, colesterol total y BUN fueron menores en T1 y T2. Se comprobó la adherencia de L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 en el intestino grueso. Conclusiones. La utilización de probióticos con L. plantarum 1 mostraron un efecto positivo en la salud, sobrevivencia y ganancia de peso de los lechones tratados.

Palabras clave: Diarrea, Lactobacillus plantarum, probióticos, tratamientos (Fuentes: CAB).

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Jurado-Gámez - Evaluación in vivo de Lactobacillus plantarum

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ABSTRACT Objectives. To evaluate the in vivo effect of Lactobacillus plantarum in piglets as an alternative to antibiotics. Materials and methods. Fifty piglets were allocated into 5 (n=10) treatment groups (T0: without probiotics; T1:with L. plantarum 1 H1; T2:with L. plantarum 1 H2; T3: with commercial probiotics; T4:without commercial probiotics). The strains were molecularly identified. The inoculate preparation used was 10 g/L white sugar, 15 g/L soy milk, 150 g/L whey, 15 g/L wheat bran, analyzing their feasibility at room temperature and refrigeration. The probiotics inoculate were evaluated in weight gain, survival and presentation of diarrhea. Immunoglobulin A was evaluated by turbidimetry, total cholesterol and BUN by spectrophotometry. The count of neutrophils by blood extension. Results. The Lactobacillus plantarum strains corresponded molecularly. The production of inoculate for the case of L. plantarum 1 H1 and L. plantarum 1 H2 was stored for 21 and 12 days in a refrigerated environment while maintaining high viabilities. T1 and T2 had no episodes of diarrhea and higher final live weight gain and higher concentrations of IgA, and polymorphonuclear neutrophil. Total cholesterol and BUN were lower in T1 and T2. We confirmed the accession of L. plantarum 1 H1 and L. plantarum 1 H2 in the intestine. Conclusions. The use of probiotic L. plantarum 1 showed a positive effect on the health, survival and weight gain of the piglets treated.

Key words: Diarrhea, Lactobacillus plantarum, probiotics, treatment (Sources: CAB).

INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

El destete de los lechones ocasiona estrés y cambios en su inmunidad, presentando desequilibrio en su microflora intestinal ya que patógenos como Escherichia coli, Clostridium perfringens, Salmonella spp., y rotavirus colonizan el tracto gastrointestinal; causando diarrea post destete (1). Los antibióticos han sido utilizados para prevenir infecciones entéricas, sin embargo, los patógenos desarrollan resistencia cruzada (2) con implicaciones negativas para la salud humana y animal.

Sitio de estudio. El presente estudio se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad del Valle, sede de Meléndez (Cali, Colombia), y en la finca “La Sierra”, (Candelaria, Valle del Cauca, Colombia).

Una alternativa al uso de antibióticos, es la utilización de microorganismos vivos con características probióticas en la dieta que depende en parte de la cepa utilizada, pues, no todas tienen la misma capacidad de modulación de la microflora intestinal o la misma capacidad para unirse a las células intestinales. Lactobacillus plantarum se ha utilizado en cerdos para el control de bacterias entéricas (3), e influenciar las comunidades gastrointestinales.

En este estudio se propuso la sustitución o complemento al uso de antibióticos mediante la utilización de inóculos probióticos de Lactobacillus plantarum junto con la ración de iniciación libre de antibióticos en fase de precebo y así, lograr un mejor control de las infecciones que causan diarrea. Además, se evaluó su efecto en los pesos vivos finales, niveles de inmunoglobulina A, colesterol total y nitrógeno ureico, eficacia de la colonización por microscopía electrónica de alta resolución y análisis microbiológicos de muestras histológicas del intestino grueso y materia fecal en los grupos seleccionados.

Identificación molecular de Lactobacillus plantarum. Medi ante ampl i fi caci ón del gen ribosomal 16S por la técnica del PCR, utilizando como molde el DNA genómico extraído directamente de las muestras. Los primers (oligonucleótidos sintéticos) utilizados para la reacción del PCR fueron p27f y p1401r, homólogos a las extremidades conservadas del gen RNA ribosomal 16S de bacterias.

Estos análisis fueron efectuados en el Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas y Agrícolas (PQBA) de la Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brasil.

Tratamientos. Se trabajó con un total de 50 lechones, distribuidos en cinco tratamientos, 10 lechones por tratamiento: T0 (Control) sin adición de probiótico ni antibiótico, únicamente con concentrado de iniciación; T1: L. plantarum 1 H1, y concentrado de iniciación; T2: L. plantarum 1 H2, y concentrado de iniciación; T3: probiótico comercial, y concentrado de iniciación; T4: Sin adición de probiótico. Se usó el concentrado de preiniciación e iniciación con antibióticos como promotores de crecimiento.

Se evaluaron los diferentes tratamientos por un período de seis semanas, que correspondió a la duración de la fase de precebo.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

Elaboración de inóculos. Utilizando el medio de cultivo seleccionado conocido para este ensayo como medio 4 (10 g/L azúcar blanco; 15 g/L leche de soya comercial; 150 g/L suero de leche pasteurizado; 15 g/L salvado de trigo comercial).

Para el proceso de elaboración la fermentación se interrumpió al final de la fase logarítmica a temperatura ambiente (29.5°C) y refrigeración (4°C) por 3 semanas, en volúmenes de 250 ml y 2 L, midiéndose la viabilidad en UFC/ml.

Inclusión de los probióticos en la ración. Se procedió a evaluar los probióticos de L. plantarum y probiótico comercial a nivel de laboratorio, antes y después de su inclusión en la ración de iniciación. La cantidad de inóculo probiótico añadido (relación v/p) fue del 20% (v/v), según lo recomendado por otros autores (4). El probiótico comercial, se suministró siguiendo las instrucciones para su adición.

La inclusión de los probióticos se realizó mezclando los inóculos de L. plantarum con el concentrado de iniciación, con una población microbiana producida durante la fermentación no menor de 109 UFC/ml. No se trabajó con el concentrado de pre-iniciación recomendado para las primeras cuatro semanas después del destete, por cuanto contenía antibióticos.

Posteriormente, se introdujo el concentrado en bolsas plásticas selladas al vacío; se las incubó por 3 días a 32oC. Finalmente, se procedió a suministrarla a los animales directamente en los comederos de tolva durante toda la duración del experimento, es decir, por un período de seis semanas.

Ensayos de desafío in vivo. Los animales utilizados fueron de la misma edad al momento del destete (28 días), machos, cuyo rango de peso vivo al inicio del experimento estuvo entre 8.05 y 8.1 kg y condiciones de manejo homogéneas, en donde el sistema de alimentación se basó en el suministro del alimento directamente en los comederos de tolva y repartido con una frecuencia de 3 veces al día por las primeras cuatro semanas y luego dos veces al día en las dos últimas semanas. La inclusión de los probióticos en la ración se realizó por mezclado directo de los inóculos con una población microbiana producida durante la fermentación no menor de 109 UFC/ml, para poder conseguir posteriormente poblaciones mínimas de 107 UFC/g en la ración de iniciación, de modo que continúen presentando una viabilidad adecuada, para de esta manera, ser suministrada a los lechones destetos. El suministro de estos inóculos probióticos junto con la ración y las diferentes mediciones del experimento se hicieron durante un período de seis semanas.

Evaluación del efecto de las cepas probióticas seleccionadas en la ganancia de peso, sobrevivencia y presentación de diarrea en diferentes tratamientos. Se tomaron datos semanales comenzando desde el primer día de inicio del experimento relacionados con sobrevivencia, mortalidad, consumo y conversión alimenticia de los lechones. El diagnóstico de las diarreas se basó en parámetros como: heces líquidas, olor e identificación microbiológica hecha en laboratorio.

Evaluación del efecto inmunoestimulante.

Mediante la técnica de turbidimetría se determinó la concentración de inmunoglobulina A. Evaluación de los niveles de colesterol sérico y nitrógeno ureico en sangre (BUN).

Estas muestras fueron tomadas al inicio y final del experimento en ayunas (7 a.m.).

Evaluación del epitelio intestinal y colonización por bacterias lácticas. Se realizaron cortes histológicos de ciego, colon transverso y recto de los tratamientos a los cuales se les aplicó el inóculo probiótico, utilizando dos animales por tratamiento mediante microscopia electrónica de alta resolución efectuada en el laboratorio de Microscopía Electrónica de la Universidad del Cauca. La verificación de la presencia y viabilidad de las bacterias ácido-lácticas en el epitelio intestinal se efectuó mediante análisis microbiológico de materia fecal y de intestino de los diferentes tratamientos efectuados.

Diseño y análisis estadístico. Se utilizó un diseño completamente al azar, para un número igual de repeticiones. Las diferencias entre los tratamientos se observaron por la prueba de Duncan usando el paquete estadístico S.A.S. (5).

RESULTADOS Los resultados de la identificación molecular indicaron que las secuencias parciales del gen que codifica para el RNA ribosomal 16S de las cepas de L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 presentaron una similitud del 97 al 99%, y del 95% respectivamente con las secuencias del gen del RNA ribosomal 16S de los linajes L. plantarum, L. pentosus, L. paraplantarum y L. plantarum subsp. argentorantensis, incluyendo los linajes tipo cuyos N° de acceso Genbak son D79210, D79211, AJ306297 y AJ 640078.

También presentaron entre el 99 y 100% de similaridad con las secuencias del gen RNA ribosomal 16S de aislados de Lactobacillus spp., presentes en las bases de datos consultadas Genbak y RDP.

Jurado-Gámez - Evaluación in vivo de Lactobacillus plantarum Para el proceso de elaboración de los inóculos, la fermentación se interrumpió al final de la fase logarítmica, es decir, a las doce horas, y posteriormente, se evaluó la viabilidad (UFC/ml) y pH a temperatura ambiente (29.5°C) y refrigeración (4°C) en volúmenes 250 ml y dos litros en períodos de: 12 horas, 7, 12 y 21 días para cada volumen.

Los resultados de la fermentación del medio 4 (10 g/L azúcar blanco; 15 g/L leche de soya comercial; 150 g/L suero de leche pasteurizado; 15 g/L salvado de trigo comercial) por un periodo de 12 horas en un volumen de 250 ml indican la alta viabilidad de los inóculos probióticos L. plantarum 1 H1 (2.0 x 1014 UFC/ml con pH de 3.73 y 9.0 x 1013 UFC/ml con pH de 3.53 a temperatura de refrigeración y ambiente respectivamente) y L. plantarum 1 H2 (2.0 x 1014 UFC/ml con pH de 3.68 y 3.51 a temperatura de refrigeración y ambiente respectivamente), confirmando los resultados obtenidos en la cinética y que permitieron escoger este medio 4 como el mejor para la producción de los inóculos, lo que garantizó una alta viabilidad en la ración de iniciación, así como, una buena colonización dado que se instalarían más fácilmente por presentar valores de pH muy cercanos a los de lechones en fase de precebo.

Al evaluar la viabilidad de las dos bacterias seleccionadas por un período de 7 días, presentaron una alta viabilidad tanto a temperatura de refrigeración como ambiental, con valores de 2.0 x 1014 con pH de 3.83 y 2.0 x 1012 UFC/ml con pH de 3.57 respectivamente para L. plantarum 1 H1 y, de 2.0 x 1014 con pH de 3.76 y 4.0 x 1012 UFC/ml con pH de 3.57 respectivamente para L. plantarum 1 H2.

La viabilidad para un período de 12 días mostró una diferencia marcada, por cuanto L. plantarum 1 H1 presentó valores superiores de 6.0 x 1013 UFC/ml en refrigeración, mientras que a temperatura ambiente (25ºC) fue de 1.0 x 109 UFC/ml. En cuanto al pH, presentaron valores de 3.51 y 3.43. Para el caso de L. plantarum 1 H2 indicó ser de igual manera, más viable en refrigeración (1.0 x 10 10 UFC/ml) que a temperatura ambiental (9.0 x 109 UFC/ml). Para el caso del pH, presentó valores de 3.60 y 3.46.

Estos resultados dieron el primer parámetro para la producción de los inóculos, ya que permitiría mantener en refrigeración hasta por 12 días los inóculos de L. plantarum 1 H2 manteniendo una viabilidad alta y un pH cercano al de los lechones destetos. Por el contrario, L. plantarum 1 H1 podría ser almacenado por más tiempo en refrigeración dada su alta viabilidad.

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Al observar las viabilidades para un período de 21 días, las dos bacterias seleccionadas presentaron altas viabilidades tanto en refrigeración como a temperatura ambiente. Los valores de pH, presentaron un ligero incremento con respecto a los demás períodos de tiempo. Sin embargo, esa variación en el comportamiento de su crecimiento con respecto al período de 12 días, permitió escoger este período de viabilidad en el tiempo para L. plantarum 1 H2, ya que garantizaba una constante en el crecimiento logarítmico desde el día 1 hasta el día 12 de almacenamiento en refrigeración.

Los resultados de la fermentación del medio 4 por un período de 12 horas en un volumen de 2 litros indican la alta viabilidad de L. plantarum 1 H1 (3.0 x 1014 UFC/ml con pH de 4.09 y 2.0 x 1014 UFC/ml con pH de 4.05 a temperatura de refrigeración y ambiente respectivamente), y de L. plantarum 1 H2 (3.0 x 1014 UFC/ml con pH de 3.94 y 4.0 a temperatura de refrigeración y ambiente respectivamente), confirmando los resultados obtenidos tanto en un volumen de 250 ml como en la cinética y que confirman que este medio 4 fue el mejor para la producción de los inóculos.

Al evaluar la viabilidad por un período de 7 días, se pudo determinar al igual que en un volumen de 250 ml, se mantiene una alta viabilidad tanto a temperatura de refrigeración como ambiental, con valores de 3.0 x 1014 UFC/ml con pH de 4.0 y 2.0 x 1014 UFC/ml con pH de 4.0 respectivamente para L. plantarum 1 H1 y, de 1.0 x 1014 UFC/ml con pH de 3.91 y 4.0 para L. plantarum 1 H2.

La viabilidad en el tiempo para un período de 12 días mostraron una diferencia marcada para L. plantarum 1 H2, ya que presentó un crecimiento óptimo en refrigeración (5.0 x 1013 UFC/ml con pH de 3.95), a diferencia de la temperatura ambiental (2.0 x 109 UFC/ml con pH de 3.94).

Estos resultados concuerdan con los obtenidos en un volumen de 250 ml y confirman que para la producción de los inóculos que han de ser incorporados a la ración de iniciación, se pueden mantener en refrigeración hasta por 12 días con L. plantarum 1 H2 y tendrán una viabilidad alta y un pH casi igual al de los lechones en fase de precebo.

Por el contrario, L. plantarum 1 H1 podría ser almacenado por más tiempo en refrigeración dada su alta viabilidad (1.0 x 1014 UFC/ml con pH de 4.09), coincidiendo con los resultados encontrados en un volumen de 250 ml. Sin embargo, también mostró una alta viabilidad a temperatura ambiente (1.0 x 1014 UFC/ml con pH de 3.85).

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Al observar las viabilidades para un período de 21 días, se pudieron apreciar claras diferencias con respecto a los resultados encontrados en un volumen de 250 ml. De esta manera, L. plantarum 1 H1 presentó la viablidad más alta a temperatura de refrigeración (1.0 x 1014 UFC/ml con pH de 4.09), que L. plantarum 1 H2 (1.0 x 1010 UFC/ ml con pH de 4.01). En ambos microorganismos no hubo crecimiento a temperatura ambiental.

Teniendo en cuenta los resultados anteriores, una vez efectuada la fermentación por 12 horas, para el caso de L. plantarum 1 H1 podría ser almacenado hasta por 21 días en refrigeración.

Para el caso de L. plantarum 1 H2 se podría almacenar por 12 y 21 días con viabilidades altas.

Sin embargo, se tomó la decisión de almacenarlo sólo por 12 días, ya que la fermentación de estos inóculos en el concentrado de iniciación se haría en condiciones de la finca y por lo tanto, no se contaba con un manejo adecuado de variables como temperatura y humedad relativa, ni de incubadoras donde efectuar la fermentación.

Además, así se garantiza en parte mayor disponibilidad de sustrato para el crecimiento de L. plantarum 1 H2 (Figuras 1 y 2).

Con respecto a la evaluación de la inclusión de los inóculos probióticos en la ración a nivel de laboratorio por 24 horas, se encontró que L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 mostraron unas viabilidades altas de 2.0 x 1012 UFC/ml con pH de 4.01 y 3.0 x 1012 UFC/ml con pH de 3.99 respectivamente.

L. plantarum 1 H2

Figura 1. Viabilidad de Lactobacillus plantarum 1 H1.

L. plantarum 1 H2

Figura 2. Viabilidad de Lactobacillus plantarum 1 H2.

En la evaluación por 24 horas en la finca, se pudo observar que L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 presentaron viabilidades altas de 3.0 x 1014 UFC/ml, con pH de 3.94 y pH de 3.95 respectivamente. Al comparar los resultados anteriores, se apreció que las viabilidades fueron similares, considerando las condiciones de finca y los volúmenes inoculados de ración.

En la evaluación por 3 días en la finca, L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 presentaron viabilidades altas de 3.0 x 1014 UFC/ml, con pH de 4.0 y pH de 3.99 respectivamente. Esto indica que, además que estos microorganismos colonicen y se adhieran más fácilmente al tracto gastrointestinal de los lechones, también facilitaría el manejo y almacenamiento de esta ración inoculada con probióticos, ya que los volúmenes de concentrado utilizados la producción porcina son elevados.

Los resultados de la viabilidad del probiótico comercial muestran una alta viabilidad en agua estéril con un valor de 8.0 x 1012 UFC/ml, con pH de 4.0, con respecto al medio 4 que fue de 1.0 x 107 UFC/ml, con pH de 4.2. Esto indica que la elección de este producto comercial de uso veterinario para cerdos fue adecuada como una medida de comparación, especialmente con los inóculos de L. plantarum 1.

En los ensayos de desafío in vivo, fue efectuado un análisis microbiológico para verificar la presencia de bacterias acido-lácticas en las heces de los lechones antes del suministro de las raciones con probióticos, encontrándose que no hubo presencia de BAL, lo cual puede ser característico de lechones destetos, dado el cambio brusco que sufren al cambiar de la fase de lactancia a la de precebo (6).

En cuanto al peso vivo final, existieron diferencias significativas (p<0.05) entre el grupo tratado con Lactobacillus plantarum 1 H2 (T2) y los demás tratamientos (T0, T1, T3 y T4). También se presentaron diferencias significativas (p<0.05) entre el grupo tratado con Lactobacillus plantarum 1 H1 (T1) con respecto a los tratamientos T0, T3 y T4; y entre el tratamiento T4 (Antibiótico) y los tratamientos T0 (Control) y T3 (Probiótico comercial). Entre el tratamiento T3 y T0 no hubo diferencias significativas (p>0.05).

Para el caso de la ganancia final de peso, existieron diferencias significativas (p<0.05) entre el grupo tratado con Lactobacillus plantarum 1 H2 (T2) y los demás tratamientos (T0, T1, T3 y T4). También se presentaron diferencias significativas (p<0.05) entre el grupo tratado con Lactobacillus plantarum 1 H1 (T1) con respecto a los tratamientos T0 y T3; y entre el tratamiento

Jurado-Gámez - Evaluación in vivo de Lactobacillus plantarum T4 (Antibiótico) y los tratamientos T0 (Control) y T3 (Probiótico comercial). Entre el tratamiento T1 y T4, así como, entre T3 y T0 no hubo diferencias significativas (p>0.05) entre ellos (Tabla 1).

Tabla 1. Peso vivo inicial, peso vivo final y ganancia de peso final en los lechones al final de la fase de precebo.

Tratamiento

Peso Vivo inicial (kg)

Peso Vivo final (kg)

Ganancia de Peso Vivo (kg)

T0

8.05ª

25.75 d

17.7 c

T1

8.1ª

28 b

19.9 b

T2

8.1ª

29 a

20.9 a

T3

8.05ª

26 d

17.95 c

T4

8.05ª

27 c

18.95 b

Letras diferentes en una misma columna indican diferencias estadísticamente significativas.

El coeficiente de variación presentado en estos valores fue bajo en forma general por debajo del 10%, siendo un coeficiente de variación excelente y que indica que los datos obedecen a condiciones de trabajo uniformes y homogéneas, reduciendo la variación en los resultados.

Los valores de la conversión alimenticia para los tratamientos T0, T1, T2, T3 y T4 fueron respectivamente de: 1.59, 1.42, 1.35, 1.57 y 1.49. Con respecto a la conversión alimenticia, existieron diferencias significativas (p<0.05) entre el grupo control (T0) y los tratamientos T1, T2 y T4. No se presentaron diferencias significativas (p>0.05) entre T0 y T3 (probiótico comercial).

También hubo diferencias significativas (p<0.05) entre el grupo T3 y los tratamientos T1, T2 y T4. El tratamiento T4 presentó diferencias significativas (p<0.05) con respecto a los tratamientos T1y T2. Finalmente, el tratamiento T1 mostró diferencias significativas (p<0.05) en relación a T2.

La eficiencia con que fue utilizado el alimento por los lechones fue adecuada, en donde los grupos tratados con L. plantarum 1 mostraron la mejor eficiencia en el aprovechamiento del alimento, siendo en todos los casos la media de la conversión alimenticia inferior a 2.0, lo cual se considera óptimo bajo estas condiciones.

Además, estos valores de conversión alimenticia están dentro de los parámetros manejados en la finca “La Sierra” de CERVALLE con valores óptimos de 1.5.

Durante el tiempo de utilización de los probióticos de L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 en los tratamientos T1 y T2 respectivamente, no se presentaron episodios de diarrea contribuyendo a la mejora de la salud de los animales tratados

3653

con respecto a los demás tratamientos, logrando un incremento en el potencial de crecimiento y estimulación de la respuesta inmune de los lechones. Esto se pudo evidenciar, en los casos con episodios de diarrea aguda para los tratamientos: T0 (5), seguido del T3 (3) y el T4 (2), y con una morbilidad del 50, 30 y 20% respectivamente.

Posteriormente se tomó cada tratamiento para cada variable: Concentración de IgA, Concentración de Polimorfonucleares Neutrófilos, Niveles de Colesterol Total y BUN. Cada tratamiento refleja su efecto sobre la variable de respuesta observando la media o mediana, pues bien, los tratamientos T0 y T1 generan diferencias en valor absoluto en su efecto, es decir, en el caso de la concentración de inmunoglobulina el efecto del tratamiento T1 incrementa su valor casi el doble con respecto a la concentración producida por el tratamiento 1. En el caso de niveles de colesterol, el tratamiento T3 difiere significativamente (p<0.05) del tratamiento T2 superándolo en miligramos %. En BUN el tratamiento T0 generó un efecto mayor en la variable mientras que el tratamiento T3 presentó el menor valor en términos de promedio sobre la misma (Tabla 2).

En la tabla 2 se puede observar como el coeficiente de variación es bajo en forma general por debajo del 10%, siendo un coeficiente de variación excelente y que indica que los datos obedecen a condiciones de trabajo uniformes y homogéneas, reduciendo la variación en los resultados.

Los resultados de la verificación de la presencia y viabilidad de las bacterias ácido-lácticas indicaron valores de 2.35 x 105, 1.5 x 105 y 8.0 x 104 en ciego, colon transverso y recto respectivamente para el tratamiento T2 (L. plantarum 1 H2).

Para el T1 (L. plantarum 1 H1), presentó valores de 1.0 x 105, 1.3 x 105 y 1.1 x 105 en ciego, cólon transverso y recto respectivamente. En el tratamiento Testigo (T0) no hubo crecimiento de las BAL en las diferentes secciones estudiadas.

Los resultados de la evaluación de epitelio intestinal y adhesión bacteriana de L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2, mediante microscopia electrónica se muestran en las figuras 3 y 4.

Esta adhesión es favorecida gracias a que en los inóculos evaluados la inclusión del prebiótico de salvado de trigo que permite una mejor adhesión de las bacterias al epitelio intestinal. Además que la leche de soya suministra también parte de prebióticos, rafinosa y estaquiosa que favorecen esta adhesión.

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Tabla 2. Media, Mediana, Desviación típica y Coeficiente de variación para cada tratamiento.

Tratamiento Tamaño

Media

Mediana

Desv. típ.

Coef. var. (%)

Concentración inmunoglobulina A (IgA) T0

3

174

173

2.65

1.52%

T1

3

333

332

2.65

0.79%

T2

3

300

299

2.65

0.88%

T3

3

300

300

1.00

0.33%

T4

3

267

267

2.00

0.75%

Total

15

274.8

299

56.50

20.56%

Concentración polimorfonuclear neutrófilos T0

3

49

48

4.58

9.35%

T1

3

55

55

2.00

3.64%

T2

3

65

66

2.65

4.07%

T3

3

51

50

2.65

5.19%

T4

3

60

59

2.65

4.41%

Total

15

56

55

6.59

11.77%

Nivel colesterol total T0

3

116.93

117.2

0.93

0.79%

T1

3

113.83

114

1.16

1.02%

T2

3

93.80

92.8

2.65

2.82%

T3

3

137.87

138.8

1.97

1.43%

T4

3

97.36

97.38

0.05

0.05%

Total

15

111.96

114

16.37

14.62%

Nitrógeno Ureico en Sangre (BUN) T0

3

9.70

9.6

0.26

2.73%

T1

3

7.83

7.83

0.03

0.38%

T2

3

8.76

8.75

0.04

0.41%

T3

3

7.20

7.1

0.26

3.67%

T4

3

9.63

9.63

0.03

0.31%

Total

15

8.62

8.75

1.03

11.93%

Las unidades de las variables fueron las siguientes: IgA (VN: hasta 200mg/100 ml), Polimorfonucleares neutrófilos (VN: 42-75 %), Colesterol total (VN: Hasta 220 mg%) y BUN (VN: Hasta 22 mg%).

Figura 4. Microfotografía electrónica de la mucosa del intestino grueso del cerdo. Se observa una bacteria de L. plantarum 1 H2, en ella se aprecia el material electrodenso que conforma la pared celular.

DISCUSIÓN El análisis filogenético confirmó la similaridad de L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 en un agrupamiento soportado con alto valor de bootstrap (100%), relacionado con los linajes tipo de las especies de Lactobacillus plantarum, L. pentosus, L. paraplantarum y L. plantarum subsp. argentorantensis.

Figura 3. Corte transversal de la mucosa intestinal. En su lámina propia se ven células plasmáticas (P) productoras de anticuerpos, en respuesta a un proceso inflamatorio causado por un agente externo. Se observa edema (Ed) del tejido conectivo como parte de la respuesta inmune. En la parte inferior del corte aparece una glándula intestinal (Gi) compuesta por células cilíndricas (Cc) y células caliciformes (Ca), referente histológico que identifica el intestino grueso. Azul de Toloudina. 100x.

La versatilidad de Lactobacillus plantarum se debe al tamaño de su genoma, el cual es 50% más grande que la mayoría de las BAL y tiene una gran capacidad metabólica, que le permite utilizar una gran variedad de fuentes de carbono; propiedad que resulta de un gran número de genes involucrados en el transporte y utilización de azúcar, y un metabolismo versátil del piruvato, el cual tiene el potencial de producir D y L-lactato, formato, acetato, etanol, acetoína y 2,3butanediol (7,8). Las BAL tienen la capacidad de crecer en una variedad de sustratos (9,10).

Marin et al (9), evaluaron la supervivencia de las cepas Lactobacillus plantarum LPBM10 y Lactobacillus casei ATCC 393, en sustratos de pulpa de uchuva y solución de glucosa (14% p/p), y almacenamiento a 4°C durante 15 días. A los 15 días obtuvieron viabilidades en pulpa y solución

Jurado-Gámez - Evaluación in vivo de Lactobacillus plantarum de glucosa, para L. plantarum de 3.23 ± 3.35 x 109 y 1.64 ± 1.57 x 109 UFC/ml, y para L. casei de 5.40 ± 2.36 x 108 y 7.34 ± 7.88 x 108 UFC/ ml, respectivamente. Los autores concluyeron que con niveles superiores a 106, son unos de los criterios considerados para definir un alimento con probióticos. Estos resultados coinciden con los encontrados para un período de 12 días (1112) a temperatura de refrigeración y confirman que L. plantarum 1 H1 y especialmente L. plantarum 1 H2 son viables a esta temperatura.

Young et al (13) investigaron el efecto de almacenamiento en frio sobre la viabilidad de L. plantarum en jugo de tomate fermentado, con viabilidades mayores de 106 UFC/mL aún después de 4 semanas de almacenamiento a 4°C. Estos resultados coinciden con los encontrados a los 21 días en la viabilidad de L. plantarum 1 H2 y especialmente para L. plantarum 1 H1 a 4°C (14).

La concentración del probiótico comercial que se use es importante y según algunos productos tienen una concentración de 6.0 x 1010 UFC/100 gramos. En cambio, si la viabilidad durante 1 día ó 3 días de fermentación en el medio 4 junto con el concentrado de iniciación mostró un valor de 3.0 x 1014 UFC/ml y si se toma como ejemplo, 2000 gramos de este concentrado al cual se le adiciona el 20% de probiótico. Entonces la concentración de los inóculos probióticos (L. plantarum 1) darían un valor de 6.0 x 1015 UFC/100 gramos de concentrado de iniciación, presentando una concentración microbiana muy superior comparada con el probiótico comercial. Además, el tipo de microorganismos y la cantidad de estos es muy diferente, por cuanto el producto comercial utiliza las cepas de Bifidobacterium bifidum, L. casei, L. acidophilus y Streptococcus faecium. Los inóculos probióticos estudiados corresponden a una sola cepa usada por separado (15).

Los mejores resultados se encontraron en los lechones que en la fase de precebo recibieron el tratamiento con los probióticos de L. plantarum 1 H2, seguido de L. plantarum 1 H1 (16).

Esto coincide con lo reportado por Shim et al (17), según lo cual, los lechones tratados con probióticos asimilan mayor cantidad de nutrientes y aumentan su peso vivo más que aquellos que no fueron tratados (18). Además, mejoran la absorción de nutrientes, la producción de vitaminas y ácidos grasos de cadena corta, que adicionalmente acidifican el lumen intestinal, todo lo cual mejora la digestibilidad de los nutrientes (19).

La metodología usada en esta investigación para el método de inclusión de los probióticos

3655

seleccionados en la ración de iniciación y las dosis de UFC/gramo, coinciden con los estudios llevados a cabo por Boucort et al (20). Los probióticos utilizando Lactobacillus mejoran la ganancia diaria de peso y reducen la incidencia de muerte prematura, al establecer una barrera profiláctica contra desórdenes gastrointestinales (21,22).

Un aspecto importante fue la disminución de costos en la alimentación, dado que no se emplearía los antibióticos requeridos para este período de precebo, los cuales representan un valor de US$ 292.94 /tonelada de concentrado.

Los probióticos de L. plantarum 1 tuvieron un efecto favorable en la salud de los lechones, por cuanto no se presentaron casos de diarrea durante el experimento, ya que los probióticos tienen una actividad inhibitoria sobre bacterias patógenas, refuerzan la inmunidad mucosal y disminuyen el pH en el ciego, incrementando los Lactobacillus (22,23).

Cuando el destete ocurre a los 35 días, la altura de las vellosidades se reduce de 410 a 299 μm en tan sólo tres días, y es más dramática cuando se desteta a los 21 y 28 días, ocasionando una pérdida en el área de superficie para la ab­ sorción de nutrientes caracterizado también por diarreas (24). Estos trastornos podrían ser contrarrestados con la aplicación de inóculos probióticos de L. plantarum 1 en la ración de iniciación, evidenciados en los tratamientos T1 y T2 (25-26). Otros autores como Río-Pérez y Rodríguez-Membribe (27), sostienen que el efecto de los probióticos se da principalmente a nivel de íleon, con un incrementado número de BAL; y en menor proporción, a nivel de ciego y cólon proximal.

Los resultados obtenidos en el estudio constituyen una herramienta valiosa contra el uso indiscri­ minado de antibióticos en la porcicultura, en donde cada día se buscan nuevas alternativas que promueven una producción más lim­pia sin el uso de aditivos que pongan en riesgo la salud humana y animal (28).

Mare et al (29) determinaron que L. plantarum 423 se adhería fuertemente al íleon y cólon posterior y L. salivarius 241 al duodeno en los lechones antes del destete. El elevado número de la cepa 241 se adhirió en el duodeno y el colón posterior de los lechones en fase de precebo, mientras que la cepa 423 se localizó en el íleon.

Además, estas cepas se adhieren a las diferentes secciones del tracto intestinal, dependiendo de la edad de los lechones. Estos resultados de L. salivarius coinciden con el sitio de adhesión de

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L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 que se identificaron por microscopía electrónica y por los análisis microbiológicos en cólon transverso.

Lactobacillus es altamente efectivo en la colonización de mucosa, tal como el tracto gastrointestinal. Un organismo de administración efectivo debe estar normalmente presente en el tracto gastrointestinal del organismo hospedador y dirigirse con precisión a los sitios mucosales de infección y adherirse a la superficie de las mucosas. Los Lactobacillus poseen ambas características, lo cual permitiría que el L. plantarum 1 estudiado en esta investigación,

sean de gran utilidad dado que son aislados de la misma especie a la cual se les suministró en la ración de iniciación (30).

Agradecimientos A la empresa Cerdos del Valle S.A. (CERVALLE), Cali, Colombia, por la financiación de esta investigación. A la Escuela de Ingeniería de Alimentos; al Dr. Germán Bolívar. A todas personas que de una u otra manera colaboraron para el desarrollo del estudio.

REFERENCIAS 1. Maxwella FJ, Duncanb SH, Holdc G, Stewartb CS. Isolation, growth on prebiotics and probiotic potential of novel bifidobacteria from pigs. Anaerobe 2004; 10(1):33-39.

2. Figueroa-Velasco JL, Chi-Moreno EE, Cervantes-Ramírez M, Domínguez-Vara IA. Alimentos funcionales para cerdos al destete.

Vet Méx 2006; 37(1):117-136.

3. De Angelis M, Siragusa S, Caputo L, Ragni A, Burzigotti R, Gobbetti M. Survival and persistance of Lactobacillus plantarum 4.1 and Lactobacillus reuteri 3S7 in the gastrointestinal tract of pigs. Vet Microbiol 2007; 123(1-3):133-144.

4. Ramírez C. Uso de bactérias lácticas probióticas na alimentação de camarões Litopenaeus vannamei como inibidoras de microrganismos patogênicos e estimulantes do sistema imune. [Tese de doutorado].

Curitiba: Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnología; 2005.

5. SAS Institute. SAS User´s Guide. Stadistics.

Version 9.1 2007. Cary: SAS Institute; 2007.

6. Iñiguez C, Perez R, Acedo E. Evaluation of probiotics properties in Lactobacillus isolated from small intestine of pigltes. Rev Latinoam Microbiol 2007; 49: 3-4.

7. Fredricks DN, Fiedler TL, Marrazzo JM. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N Engl J Med 2005; 353:1899-1911.

8. Ljungh A, Wadstrom T. Editores. Lactobacillus Molecular Biology. From Genomics to Probiotics.

Norfolk: Caister Academic Press; 2009.

9. Marín Z, Cortés M, Montoya O. Evaluación de la viabilidad de crecimiento de la cepa nativa Lactobacillus plantarum LPBM10 y la cepa comercial Lactobacillus casei ATCC 393 en pulpa de uchuva y en solución isotónica de glucosa. Rev VITAE 2009; 16(2):210-217.

10. Zhan YZ, Bon J, Joan MK. Production of lactic acid from renewable materials by Rhizopus fungi. Chem Eng Process 2006; 46:361-374.

11. González BA, Domínguez R, Alcocer BR. Aloe vera como sustrato para el crecimiento de Lactobacillus plantarum y L. casei. Ciencia y Tecnología Alimentaria 2008; 6(2):152-157.

12. Estela W, Rychtera M, Melzoch K, Quillama E y Egoavil E. Producción de acido láctico por Lactobacillus plantarum L10 en cultivos batch y continuo. Rev Perú Biol 2007; 14(2):271-276.

13. Young K, Woodams E, Hang Y. Fermentation of beet juice by beneficial lactic acid bacteria.

J Food Sci Technol 2005; 38(1):73-75.

14. Frede Damgaard. Probióticos en la granja – ¿Cómo hacer que trabajen? [En linea]. 2005.

URL Disponible en: http://www.aacporcinos. com.ar/nutricion_porcina/probioticos_en_ la_granja.html 15. Plevy S. The immunology of inflammatory bowel disease. Gastroenterol Clin North Am 2002; 31(1):77-92.

Jurado-Gámez - Evaluación in vivo de Lactobacillus plantarum 16. Rodríguez JC, Carmenate MC, Hernández JE, Guerra A, Calero I et al. Evaluación del suministro de un preparado biológico de Lactobacillus acidophillus y Streptococcus termophillus en cerdos en crecimiento.

Revista Computadorizada de Producción Porcina 2009; 16(1):54-58.

17. Shim SB, Verstegen MWA, Kim IH, Kwon OS, Verdonk JM. Effect of feeding antibiotic-free creep feed supplemented with oligofructose, probiotics or synbiotics to suckling piglets increases the preweaning weight gain and composition of intestinal microbiota. Arch Anim Nutr 2005; 59:419-427.

18. Álvarez JM, Rodríguez JC, Calero I, Hernández JE, Guerra A, Carmenate M et al. Evaluación del suministro de un preparado biológico de Lactobacillus acidophillus y Streptococcus termophillus en cerdos en crecimiento.

Revista Computadorizada de Producción Porcina 2009; 16(1):54-58.

19. Amigo S, Laurencio M, Pérez M, Piad R, Milián G et al. Determinación del contenido de bacterias ácido lácticas y Bacillus del TGI de pollos de ceba y obtención de una mezcla de exclusión competitiva a partir de esta microflora cecal. Rev Cubana Cienc Avícola, 2002; 26:17-22.

20. Boucourt R, Savón L, Díaz J, Brizuela MA, Serrano P et al. Efecto de la actividad probiótica de Lactobacillus rhamnosus en indicadores fisiológicos de lechones. Rev Cubana Ciencia Agrícola, 2004; 38(4):411-416.

21. Benavente D. Efecto del probiótico Sprinter® en lechones recién nacidos. Honduras: Programa de Ingeniería en Ciencia y Producción Agropecuaria. 2003.

22. Marin A, Rodríguez A, Marrero L, Manso MJ y González M. Estudio del efecto en lechones lactantes del probiótico de la biomasa proteica obtenida por la tecnología de cultivo de Lactobacilli y levaduras en miel “B”. Liv Res Rural Develop 2007; 19(12):195-196.

3657

23. García Y, García Y, López A, Boucourt R. Probióticos: una alternativa para mejorar el comportamiento animal. Revista Cubana de Ciencia Agrícola 2005; (39)2:129-140.

24. Gómez A, Vergara D, Argote F. Efecto de la dieta y edad del destete sobre la fisiología digestiva del le­chón. Rev Bio Agro 2008; 6(1):32-41.

25. Gómez A, Benavides C, Díaz C. Evaluación de torta de palmaste (Elaeis quneensis) en alimentación de cerdos de ceba. Rev Bio Agro 2007; 5(1):54-63.

26. Chinea R, Rodríguez JC, Hernández JE y Calero I. Evaluación de distintos esquemas de aplicación de un probiótico en cerdas paridas con sus crías. En: VII Congreso Centroamericano y del Caribe de Porcicultura; La Habana 30 mayo al 2 junio de 2005. Cuba: VII Congreso; 2005. p. 463-468.

27. RioPérez J y Rodríguez-Membribe ML. Probióticos: Alternativa en la alimentación porcina. Rev Mundo Ganadero 2000; 38-42.

28. Van Heugten E, Funderburke DW and Dorton KL. Growth performance, nutrient digestibility, and fecal microflora in weanling pigs fed live yeast. J Anim Sci 2003; 81:1004-1012.

29. Mare L, Wolfaardt GM, Dicks LMT. Adhesion of Lactobacillus plantarum 423 and Lactobacillus salivarius 241 to the intestinal tract of piglets, as recorded with fluorescent in situ hybridization (FISH), and production of plantaricin 423 by cells colonized to the ileum.

J Appl Microbiol 2006; 100(4):838-845.

30. Casas I, Jonsson H, Mollstam B, Roos S, inventores; Oficina Española de Patentes y Marcas. Lactobacillus que albergan genes de agregación celular y de fijación de mucina, como vehículos de aporte de vacunas.

España patente 09/039.773. 2005.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3658-3664, 2013.

ORIGINAL

Productividad acumulada y su relación genética con características reproductivas en hembras Brahman Accumulated productivity and its genetic association with reproductive traits in females Brahman Orlando Duitama C,1* M.Sc, Luis González H,2 Ph.D, Diogo Garcia,1 M.Sc, Michel Farah,1 M.Sc, Ricardo da Fonseca,3 Ph.D. Universidad Estadual Paulista UNESP, Departamento de Genética y Mejoramiento Animal, JaboticabalSP, Brasil. 2Universidad Tecnológica de Pereira UTP, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Pereira, Colombia. 3Universidad Estadual Paulista UNESP, Departamento de Zootecnia, Dracena-SP, Brasil. *Correspondencia:loralndo82@hotmail.com 1

Recibido: Noviembre de 2012; Aceptado: Abril de 2013.

RESUMEN Objetivo. Estimar parámetros genéticos para la característica de productividad acumulada (PAC) y correlaciones genéticas con edad al primer parto (EPP), intervalo entre el primero y segundo parto (IEP1) y longevidad (LONG). Materiales y métodos. Fueron usados 8584 registros de hembras Brahman, utilizando un modelo animal en análisis multi-característico con el método de máxima verosimilitud restricta, implementado en el software WOMBAT. Los modelos consideraron los efectos fijos de grupo contemporáneo, número de partos, y la covariable peso al destete del primer ternero; el único efecto aleatorio fue el genético aditivo directo. El peso al destete (P240) fue incluido para disminuir el efecto de la selección en la estimación de los componentes de varianza. Resultados. Las estimativas de heredabilidad fueron de 0.3±0.04, 0.11±0.03, 0.07±0.03 y 0.24±0.04 para EPP, IEP1, LONG y PAC respectivamente. Las correlaciones entre PAC y las otras características se presentaron de moderadas a altas y en sentido favorable. Conclusiones. PAC puede ser incluida en los programas de mejoramiento genético para Brahman, y utilizada como criterio de selección por su heredabilidad moderada y correlación genética favorable con las características reproductivas en estudio.

Palabras clave: Bovinos de carne, eficiencia reproductiva, heredabilidad, parámetros genéticos (Fuente: CAB, USDA).

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Duitama - Productividad acumulada y su relación genética

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ABSTRACT Objective. Assessment of genetic parameters for accumulative productivity trait (ACP) and genetic correlations with age at first calving (AFC), between calving interval of first and second parity (BCI1) and longevity (LONG). Materials and methods. 8584 Brahman female records were used with an animal model in multi-trait analysis with restricted maximum likelihood method, implemented using the WOMBAT software. The models considered the fixed effects of contemporary group, parity and weaning weight of first calf covariate, the only random effect was the genetic additive direct. Weaning weight (P240) was included to reduce the effect of selection on the estimation of variance components.

Results. The heritability estimates were 0.3±0.04, 0.11±0.03, 0.07±0.03 and 0.24±0.04 for AFC, BCI1, LONG and ACP respectively. Correlations between ACP and the other features were moderate to high and favorable. Conclusions. ACP can be included in breeding programs for Brahman, and used as selection criteria for its moderate heritability and genetic correlation with reproductive traits.

Key words: Beef cattle, genetic parameters, heritability, reproductive efficiency (Source: CAB, USDA).

INTRODUCCIÓN La producción de ganado de carne en Colombia se basa en razas cebuinas, con especial predominio de la raza Brahman, por presentar características de adaptabilidad a las condiciones tropicales.

Los programas de mejoramiento genético en el país son pocos e incluyen en su mayoría características de crecimiento, como peso a distintas edades y ganancias de peso diario por su facilidad de medición, y presentar coeficientes de heredabilidad moderados a altos (1,2). Sin embargo, las características reproductivas son de importancia económica al determinar la frecuencia con la que eventos productivos suceden, influenciando directamente la cantidad de carne, leche, etc., producida por año y la eficiencia económica del sistema (3,4).

(12) y productividad acumulada, que presenta heredabilidad moderada (11,13).

En razas cebuinas, diversos autores (5-8) han evaluado las características reproductivas con intención de incluirlas en programas de mejoramiento genético. Cada característica presenta ventajas y desventajas: la edad al primer parto, es fácil de medir, presenta heredabilidad moderada y muestra correlación favorable con longevidad (5-10); el intervalo entre partos, de forma general tiene heredabilidad baja (11), pero determina la frecuencia de nacimientos; la longevidad indica la habilidad reproductiva de la vaca, porque hembras que presentan fallas reproductivas son descartadas más rápido, sin embargo, es una característica de tardía medición, disminuyendo así su progreso genético (5).

Parámetros genéticos para el índice de productividad acumulada (PAC) en razas cebuinas son encontrados para Nelore (11,13,15), estimativas en Brahman no fueron encontradas.

El objetivo de este trabajo fue estimar parámetros genéticos para PAC y su asociación genética con las características reproductivas de: edad al primer parto (EPP), intervalo entre el primero y segundo parto (IEP1) y longevidad (LONG) en hembras Brahman; y definir si PAC puede ser usada como criterio de selección.

Con la intención de evaluar de forma integral el desempeño reproductivo de las hembras, se han creado índices que involucran varias características reproductivas como el caso de: Eficiencia reproductiva (6); índice vaca, utilizado en Colombia en ganado doble propósito

El índice de productividad acumulada, presenta ventajas sobre otros índices, porque incluye de forma indirecta la edad al primer parto y permite comparar vacas con diferente número de partos.

Productividad acumulada, indica la capacidad de la hembra de parir regularmente y destetar terneros más pesados, así como la precocidad al primer parto (14), lo que le permite ser un indicador de eficiencia reproductiva y económica, estas cualidades sumadas a la heredabilidad moderada que presenta, posibilitan su inclusión en programas de mejoramiento genético y su uso como criterio de selección.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio y condiciones de manejo.

Los datos utilizados en el presente trabajo fueron suministrados por la agropecuaria “La Ceiba S.A.”, fueron utilizadas informaciones de 8584 hembras de la raza Brahman, nacidas entre 1985 y 2008 distribuidas en dos fincas, una localizada en la región Caribe en el municipio

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de San Sebastián (Magdalena), y la otra en la región de los Llanos Orientales en el municipio de Puerto Gaitán (Meta). La población estaba constituida por animales puros registrados en ASOCEBU y animales comerciales. Los animales fueron criados en pastoreo rotacional con suplementación mineral ad-libitum, el destete ocurrió entre 8 y 9 meses de edad. El manejo reproductivo se hizo con monta natural continúa durante todo el año e inseminación artificial, los toros se manejaron de forma independiente con un grupo de vacas de forma que se conociera el padre de los terneros nacidos. Las hembras de remplazo fueron seleccionadas usando los criterios de peso corporal e histórico reproductivo de las madres, siendo retenidas las hembras con mayores pesos e hijas de vacas con desempeño reproductivo por encima del promedio; las novillas iniciaron su actividad reproductiva alrededor de los 24 meses de edad y con peso próximo a los 300 kg.

Los motivos de descarte de hembras fueron: destete consecutivo de terneros con pesos inferiores al promedio, anormalidades fisiológicas en el tracto reproductivo y dificultad para preñar nuevamente.

Tipo de análisis. Las características evaluadas fueron la edad al primer parto (EPP), intervalo entre primero y segundo parto (IEP1), longevidad (LONG) y productividad acumulada (PAC); también fue incluido en los análisis el peso al destete ajustado a 240 días (P240), con el propósito de mitigar el efecto en la disminución de la varianza genética, causada por la selección realizada en el destete (16).

La LONG fue definida como la diferencia entre la edad al momento del descarte y la edad al primer parto; PAC fue definida como citado por Lôbo et al (14), con la siguiente expresión:

En donde: PAC= productividad acumulada (Kg de ternero destetado por año); Pd = promedio de peso de los terneros destetados (kg); np=número total de terneros producidos por la vaca (terneros nacidos); Ca=constante igual a 365 días que permite expresar la fertilidad en base anual; EVPn=edad de la vaca al último parto (días); Ci=constante igual a 550 días, aproximadamente 18 meses, representando la edad a la primera concepción. En la medida que disminuya la constante Ci se estará haciendo mayor presión de selección para hembras más precoces, porque animales que tienen edades al primer parto menor tendrán mayores valores para PAC.

En el proceso de edición de las informaciones fenotípicas fueron eliminados los animales que tuvieran los dos padres desconocidos, por no aportar información para la estimación de la varianza aditiva; también fueron eliminados registros que estuvieran 3.5 desviaciones estándar por encima o por debajo del promedio, para evitar incluir registros outliers.

Para la estimación de componentes de covarianza fue empleada la metodología de Máxima Verosimilitud restringida libre de derivadas (REML), con un modelo mixto como presentado por Henderson (17).

Y = Xβ + Z1a + e donde: Y= vector de observaciones fenotípicas de cada característica (EPP, IEP1, LONG y PAC); X= matriz de incidencia asociada a los efectos fijos; β= vector de soluciones para los efectos fijos; Z1= matriz de incidencia asociada al efecto genético aditivo directo; a= vector de soluciones para el efecto aleatorio genético aditivo directo; e= vector aleatorio de residuos.

Para determinar los efectos fijos (ambientales) que influencian cada característica fue empleado el método de mínimos cuadrados del procedimiento GLM de SAS (18), fue considerado un modelo factorial: finca (2 niveles), año de nacimiento (23 niveles), época de nacimiento (4 niveles), número de partos (3 niveles) y la covariable de peso al destete del primer ternero. La época de nacimiento fue dividida en cuatro clases, la primera incluyo los meses de enero a marzo y las otras tres los meses subsecuentes siguiendo el mismo patrón. El número de partos fue dividido en tres clases, la primera incluyo vacas de uno a tres partos, la segunda de cuatro a seis y la tercera vacas que tenían más de seis partos.

El software WOMBAT (19) fue utilizado para la estimación de los componentes de varianza, con una estrategia de iteración que uso el algoritmo PX-EM (modificación del algoritmo EM) en los primeros ciclos y después el algoritmo AI, disminuyendo la sensibilidad que tiene el último algoritmo a los valores iníciales. La convergencia fue alcanzada cuando el cambio entre una interacción y otra fue menor que 1 x 10-9 para el Log de la función de verosimilitud.

Las características fueron analizadas usando un modelo animal, primero de forma unicaracterística para obtener estimativas de las varianzas, que posteriormente fueron usadas como valores iníciales en el análisis multicaracterística. En todos los análisis fue utilizada una matriz de parentesco con 11544 animales.

Duitama - Productividad acumulada y su relación genética El modelo multi-característica escrito em forma matricial puede ser representado como:

Donde Yi= vector de observaciones de la i-esima característica, b i =vector de efectos fijos de la i-esima característica, ai= vector aleatorio de efectos genéticos aditivos directos para la i-esima característica, ei= vector aleatorio de efectos residuales para la i-esima característica, Xi y Zi son las matrices de incidencia que relacionan los registros de la i-esima característica a los efectos fijos y aleatorios respectivamente.

Las presuposiciones con relación a los componentes del modelo fueron: Esperanzas.

E[yi]=Xiβi, E[ai]=0 y E[ei]=0 Varianzas.

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Tabla 1. E s t r u c t u r a d e l o s d a t o s p a r a l a s características, edad al primer parto (EPP), intervalo entre el primero y segundo parto (IEP1), longevidad (LONG) y productividad acumulada (PAC).

EPP (días)

IEP1 (días)

LONG (días)

PAC (kg)

Nº Animales Nº Madres Nº Toros

3885 2881 314

2349 1909 264

1607 1398 242

3474 2579 301

Media ± DS

1206±149

497.3±93

1981±1104

110.8 ±30.1

12.3

18.7

55.7

27.2

CV

DS= Desviación estándar; CV= Coeficiente de variación.

Tabla 2. Valores de probabilidad de f p(f) del análisis de varianza, considerando un modelo factorial para las características edad al primer parto (EPP), intervalo entre el primero y segundo parto (IEP1), longevidad (LONG) y productividad acumulada (PAC).

Factor

EPP

IEP1

LONG

PAC

<0.001**

<0.001**

<0.001**

<0.001**

Año nacimiento (2)

0.014*

<0.005**

0.021*

0.041*

Época nacimiento (3)

0.042*

0.121ns

0.410ns

0.336ns

Año primer parto (4)

–

0.048*

–

–

Número de partos (5)

–

–

–

0.033*

1*2

<0.001**

<0.002**

0.041*

0.019*

1*3

0.039*

0.098ns

0.391ns

0.276ns

1*2*3

0.041*

0.085ns

0.253ns

0.218ns

–

0.043

–

–

Finca (1)

Peso destete primer ternero (covariable)

*

y *= significativo al 5 y 1%, respectivamente; ns= no significativo; –= factor no incluido en el modelo. **

Donde gij= representa un elemento de la matriz [G] de varianzas y covarianzas para el efecto genético directo, A= es la matriz de parentesco entre los animales, rij= representa un elemento de la matriz [R] de varianzas y covarianzas residuales, I= matriz identidad.

RESULTADOS La estructura de los datos y la estadística descriptiva para los valores fenotípicos de las características en estudio son presentadas en la tabla 1.

El análisis de varianza, realizado para determinar los factores ambientales que afectan cada característica es mostrado en la tabla 2, sólo son presentadas las interacciones entre factores que fueron significativas por lo menos para una de las características.

Con base en el análisis de varianza fueron creados grupos contemporáneos (GC) con los factores que mostraron interacción para cada característica, con el propósito de disminuir los parámetros a ser estimados en el modelo mixto.

De esta forma el GC para EPP fue conformado por los factores de finca, año de nacimiento y época de nacimiento; para las características de IEP1, LONG y PAC fue conformado sólo por finca y año de nacimiento. Los GC que tuvieron menos de 8 animales, o que sólo tuvieran hijas de un único toro fueron eliminados, mejorando así la corrección para los efectos fijos en el modelo multi-característica.

Los efectos fijos considerados en el modelo para cada característica fueron: EPP=GC; IEP1=GC, año del primer parto y la covariable de peso al destete del primer ternero; LONG= GC; PAC= GC y número de partos de la vaca.

Las estimativas para los componentes de varianza y parámetros genéticos para el análisis multicaracterística son presentadas en la tabla 3.

La distribución de los registros entre las características reproductivas es presentada en

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Tabla 3. Estimativas de varianza, heredabilidad (diagonal principal), correlaciones genéticas (arriba de la diagonal) y correlaciones fenotípicas (abajo de la diagonal) con sus errores de predicción para las características, edad al primer parto (EPP), intervalo entre el primero y segundo parto (IEP1), longevidad (LONG) y productividad acumulada (PAC) Caract

EPP

IEP1

LONG

PAC -0.76 ± 0.04

EPP

0.3 ± 0.04

0.6 ± 0.12

-0.45 ± 0.19

IEP1

0.15 ± 0.04

0.11 ± 0.03

-0.65 ± 0.27

-0.4 ± 0.12

LONG

-0.18 ± 0.04

-0.03 ± 0.05

0.07 ± 0.03

0.74 ± 0.16

PAC

-0.58 ± 0.03

-0.31 ± 0.04

0.2 ± 0.05

0.24 ± 0.04

σ2a

4196

726

36187

90.7

σ2e

9693

5643

453403

288

σ2f

13889

6369

489590

378.7

σ2a =varianza genética aditiva, σ2e = varianza residual σ2f= varianza fenotípica

la tabla 4. El 89.2% de los animales tuvieron información por lo menos para dos de las características evaluadas, garantizando así una adecuada estructura de los datos para estimar las covarianzas y correlaciones.

Tabla 4. Total de observaciones por característica (diagonal) y registros compartidos entre características (fuera de la diagonal) para edad al primer parto (EPP), intervalo entre el primero y segundo parto (IEP1), longevidad (LONG) y productividad acumulada (PAC).

Característica

EPP

EPP

3885

IEP1

LONG

IEP1

229

LONG

1538

907

1607

PAC

3075

2277

1188

PAC

2349 3474

DISCUSIÓN El promedio para EPP fue de 40.2 meses siendo similar a los valores encontrados en ganado Nelore (14,20) y Brahman en Colombia (21), sin embargo, valores inferiores fueron reportados por (11,13). Indicando la necesidad de colocar más atención a la selección para precocidad sexual, esto traerá mayor eficiencia económica por dos motivos a) disminución del tiempo y el costo del levante de las novillas de remplazo y b) inicio de la vida productiva de las hembras más rápido.

Los valores fenotípicos para IEP1 y LONG se encuentran dentro de los valores reportados en la literatura para ganado cebuino en condiciones tropicales (6,19,22). Como se muestra en la tabla 1 la variabilidad fenotípica de LONG fue

alta como consecuencia de la influencia directa de los criterios de descarte utilizados y la tasa de remplazo; en la medida que esta última sea mayor, el tiempo de permanencia de la hembras será menor. Con base en LONG las vacas tuvieron en promedio 4 partos durante su vida productiva.

El valor promedio para PAC fue inferior a los reportados por Grossi et al (13) y Schwengber et al (23) y similar a los reportados por Azevêdo et al (15) en ganado Nelore. PAC presentó valores mínimo y máximo de 27.2 a 189 Kg, este amplio rango de valores es resultado de la influencia de factores ambientales, siendo el de mayor importancia el número de partos, porque vacas con menos de tres partos destetan terneros menos pesados y tienen mayores intervalos entre partos, mientras que vacas más viejas se tornan más eficientes.

Las estimativas de varianzas y parámetros genéticos son presentadas en la tabla 3. El valor de heredabilidad para EPP fue similar al encontrado por Mercadante et al (5) y Gressler et al (24) en ganado Nelore y mayor al reportado por Espinoza et al (25) y Vergara et al (22) en ganado Brahman. Mostrando que tiene suficiente variabilidad genética, y si se considera su importancia económica y facilidad para registrarla a edades tempranas debe incluirse en los programas de mejoramiento genético.

Las heredabilidades para IEP1 y LONG se presentaron próximas a los valores encontrados en la literatura para las razas cebuinas, que muestran que el componente genético explica poco de la varianza fenotípica observada (6,21,26). La alta influencia de factores ambientales en estas características dificulta los progresos a través de selección, por tal motivo es más ventajoso usar otras estrategias como el uso de cruzamientos y el mejoramiento de factores ambientales como la nutrición y el manejo reproductivo. LONG también tiene la desventaja de ser una característica de medición tardía lo que dificulta la inclusión en programas de mejoramiento genético, para contrarrestar esta desventaja se creó una característica binomial llamada habilidad de permanencia que es medida a edades más tempranas y presenta mayores valores de heredabilidad (8).

La heredabilidad para PAC fue similar a los valores encontrados para la raza Nelore (11,13), indicando que existe suficiente variabilidad genética y que es posible obtener progresos genéticos y fenotípicos a través del uso de selección, logrando así vacas más eficientes. PAC puede ser considerado como criterio de descarte de las hembras, porque es un índice que puede

Duitama - Productividad acumulada y su relación genética ser evaluado en cualquier edad, y considera características productivas y reproductivas, logrando resumir de forma muy eficiente el historial productivo de las vacas.

Las correlaciones genéticas son presentadas en la tabla 3 y la distribución de los registros entre las características reproductivas en la tabla 4.

De forma general, las correlaciones genéticas entre PAC y las características reproductivas se mostraron moderadas y en sentido favorable; las correlaciones fenotípicas presentaron la misma tendencia pero con valores mayores. Este comportamiento es esperado, porque, para el cálculo de PAC están involucradas de manera directa o indirecta las otras características.

La asociación genética entre PAC y EPP fue negativa y alta, pero en sentido favorable, concordando con los valores obtenidos por Grossi et al (13). Este valor de correlación indica que novillas preñadas a edades más tempranas producirán más kilos de terneros destetados por año. Esta correlación favorable ocurre, porque, EPP hace parte de forma indirecta en la fórmula de PAC, mediante la constante Ci (Edad esperada para la primera preñez=550 días), de forma que beneficia las vacas que tuvieron su primera preñez cerca de esta edad.

La correlación genética entre PAC y IEP1 fue moderada y en sentido favorable, esto era esperado, porque el intervalo entre partos está considerado dentro del cálculo de PAC por medio de los parámetros np (número de partos) y la diferencia de EVPn (edad ultimo parto) con C i en el denominador. No fueron

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encontrados valores de correlación para estás dos características.

PAC mostró una correlación genética alta y favorable con LONG, indicando que vacas más longevas tendrán mayores índices de PAC. Este comportamiento está relacionado con los criterios de descarte usados por el productor, porque, parte de ellos son considerados en el cálculo de PAC, de manera que las vacas más longevas son las que mejores parámetros productivos tienen.

Valores similares de correlación genética fueron reportados por Mercadante et al (5) entre el índice de eficiencia reproductiva y longevidad en ganado Nelore.

Basado en la correlaciones genéticas se puede concluir que la selección a favor del índice de productividad acumulada (PAC) traerá progresos genéticos favorable para las características de edad al primer parto y longevidad, y en menor intensidad para el intervalo entre el primer y segundo parto en ganado Brahman.

En conclusión la productividad acumulada puede ser incluida en el programa de mejoramiento genético de ganado Brahman y usada como criterio de selección por su moderado valor de heredabilidad y correlaciones genéticas favorables con características reproductivas de importancia económica.

Agradecimientos A la agropecuaria “La Ceiba S.A.” por facilitar el acceso a la base de datos y suministrar información adicional para llevar a cabo este trabajo de investigación.

REFERENCIAS 1. Manrique C. Parámetros genéticos de la raza Brahman en Colombia. Rev Col Cienc Pec 2003; 16 Supl VII ENICIP:48.

2. Montes DV, Vergara GO, Prieto ME, Rodrígez PA. Estimación de los parámetros genéticos para el peso al nacer y al destete en ganado bovino de la raza brahman. Rev MVZ Córdoba 2008; 13(1):1184-1191.

3. Ponzoni RW, Newman S. Developing breeding objectives for Australian beef cattle production.

Anim Prod 1989; 49:35-47.

4. Phocas F, Bloch C, Chapelle P, Bécherel F, Renand G, Ménissier F. Developing a breeding objetive for a French purebred beef cattle selection programme. Livest Prod Sci 1998; 57:49-65.

5. Mercadante ME, Lôbo RB, Oliveira HN. E s t i m a t i va s d e ( c o ) va r i â n c i a s e n t r e características de reprodução e de crescimento em fêmeas de um rebanho Nelore. Rev Bras Zootec 2000; 29(4):997-1004.

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6. Baldi F, Alencar MM, Freitas AR, Barbosa RT. Parâmetros genéticos para características de tamanho e condição corporal, eficiência reprodutiva e longevidade em fêmeas da raça Canchim. Rev Bras Zootec 2008; 37(2):247-253.

7. Boligon AA, Vozzi PA, Nomelini J, Rorato PR, Bezerra LA, Lôbo RB. Parâmetros genéticos para idade ao primeiro parto estimados por diferentes modelos para rebanhos da raça Nelore. Cienc Rural 2008; 38(2):432-436.

8. Buzanskas ME, Grossi DA, Baldi F, Barrozo D, Silva LO, Torres Júnior RA et al. Genetic associations between stayability and reproductive and growth traits in Canchim beef cattle. Livest Sci 2010; 132:107-112.

9. Martin LC, Brinks JS, Bourdon RM, Cundiff LV. Genetic effects on beef heifer puberty and subsequent reproduction. J Anim Sci 1992; 70:4006-4017.

10. Dias LT, El Faro L, Albuquerque LG. Estimativas de herdabilidade para idade ao primeiro parto de novilhas da raça Nelore. Rev Bras Zootec 2004; 33(1):97-102.

11. Faria CU, Magnabosco CU, Reyes A, Lôbo RB, Bezerra LA, Sainz RD. Bayesian inference on field data for genetic parameters for some reproductive and related traits of Nellore cattle (Bos indicus). Genet Mol Biol 2007; 30(2):343-348.

12. Galeano AP, Manrique C. Estimación de parámetros genéticos para características productivas y reproductivas en los sistemas doble propósito del trópico bajo colombiano.

Rev Med Vet Zoot 2010; 57:119-131.

13. Grossi DA, Frizzas OG, Paz CC, Bezerra LA, Lôbo RB, Oliveira JA et al. Genetic associations between accumulated productivity, and reproductive and growth traits in Nelore cattle. Livest Sci 2008; 117:139-146.

14. Lôbo RN, Madalena FE, Vieira AR. Average estimates of genetics parameters for beef and dairy cattle in tropical regions. Animal Breeding Abstract 2000; 68:433-461.

15. Azevêdo DM, Filho RM, Lôbo RN, Lôbo RB, Moura AA, Pimenta Filho EC, Malhado CH. Produtividade acumulada (PAC) das matrizes em rebanhos Nelore do Norte e Nordeste do Brasil. Rev Bras Zootec 2005; 34(1):54–59.

16. Meyer K. Estimating variances and covariances for multivariate animal models by restricted maximum likelihood. Genet Sel Evol 1991; 23:67-83.

17. Henderson CR. Best linear unbiased prediction of breeding values not in the model for records. J Dairy Sci 1977; 60(5):783-787.

18. SAS INSTITUTE. SAS Online Doc 9.1.3. Cary: SAS Institute, 2004.

19. Meyer K. WOMBAT. A tool for mixed model analyses in quantitative genetics by REML, J Zhejiang Uni 2007; 8:815-821.

20. Castellanos AF. Evaluación del desempeño reproductivo de hembras brahman de e x p o s i c i ó n e n c o l o m b i a . Re v i s t a d e Investigación Universidad La Salle 2007; 7:133-139.

21. Bertazzo RP, Freitas RT, Gonçalves TM, Pereira IG, Eler JP, Ferraz JB et al. Parâmetros genéticos de longevidade e produtividade de fêmeas da raça nelore. Rev Bras Zootec 2004; 33(5):1118-1127.

22. Vergara OD, Elzo MA, Cerón-Muñoz MF. Genetic parameters and genetic trends for age at first calving and calving interval in an Angus-Blanco Orejinegro-Zebu multibreed cattle population in Colombia. Livest Sci 2009; 126:318-322.

23. Schwengber EB, Bezerra LA, Lôbo RB. Produtividade acumulada como critério de seleção em fêmeas da raça Nelore. Cienc Rural 2001; 31(3):483-486.

24. Gressler MG, Pereira CC, Bergmann JA, Andrade VJ, Paulino MF, Gressler SL. Aspectos genéticos do peso à desmama e de algumas características reprodutivas de fêmeas Nelore.

Arq Bras Med Vet Zootec 2005; 57(4):533538.

25. Espinoza JL, Palacios A, Luna R, Ávila N, Guerra D, Gonzalez-Peña D et al. Componentes de (co)varianza para caracteres de crecimiento y reproducción en ganado cebú en cuba. Arch Zootec 2007; 56(216):919-927.

26. Montes D, Vergara O, Prieto E. Una nota sobre La estimación Del intervalo entre partos en hembras bovinas de ganado Brahman.

Livestock Research for Rural Development 2009; 21(1). URL Disponible en: http://www. lrrd.org/lrrd21/1/mont21002.htm

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3665-3671, 2013.

ORIGINAL

Polimorfismos del gen BoLA-DRB3.2* en ganado criollo colombiano Polymorphism of BoLA-DRB3.2* gen in creole colombian breeds Darwin Hernández H,1 M.Sc, Andrés Posso T,1 M.Sc, Jaime Muñoz F,1 Ph.D, Guillermo Giovambattista,2 Ph.D, Luz Álvarez F,1* Ph.D. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Laboratorio de Genética Animal, Palmira, Colombia. 2Universidad Nacional de la Plata, Facultad de Ciencias Veterinarias, Instituto de Genética Veterinaria IGEVET, La Plata, Provincia de Buenos Aires, República Argentina. *Correspondencia: laalvarezf@unal.edu.co 1

Recibido: Agosto de 2012; Aceptado: Abril de 2013.

RESUMEN Objetivo. Caracterizar el polimorfismo del gen BoLA-DRB3.2* en las razas bovinas criollas y colombianas. Materiales y métodos. En 360 muestras de ADN de ocho razas bovinas criollas (Blanco Orejinegro, Casanareño, Costeño con Cuernos, Chino Santandereano, Caqueteño, Hartón del Valle, Romosinuano y San Martinero), dos razas sintéticas Colombianas (Lucerna y Velásquez) y dos razas foráneas (Brahman y Holstein) se evaluó el polimorfismo del gen BoLA-DRB3.2 mediante técnicas moleculares (PCR-RFLP); se calculó el número promedio de alelos (NPA), las frecuencias, la heterocigocidad esperada (He) y observada (Ho), el equilibrio de Hardy-Weinberg, la estructura genética y los valores de FST y FIS. Resultados. El NPA fue 14.6 ± 3.8 siendo Caqueteño la raza con mayor NPA (25) y el menor el Chino Santandereano (10). Se encontraron 41 alelos BoLA-DRB3.2* los más frecuentes fueron *28, *37, *24, *23, *20, *27, *8, *16, *39 (0.17, 0.11, 0.10, 0.09, 0.09, 0.07, 0.07 y 0.06 respectivamente). Se encontró alta diversidad genética (He = 0.878) con mayor valor en Caqueteño (0.96) y menor en San Martinero (0.81). Todas las razas se encontraron en equilibrio de Hardy-Weinberg, se encontraron valores altamente significativos de diferenciación genética (FST= 0.044) y de coeficiente de endogamia (FIS = 0.249). Conclusiones. El ganado criollo colombiano posee alto polimorfismo del gen BoLA-DRB3.2* representado en los altos valores de NPA y diversidad génetica.

Palabras clave: Antígenos, biología molecular, diversidad genética (Fuente: CAB).

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ABSTRACT Objective. To characterize BoLA-DRB3.2*gen polymorphism in Colombian Creole breeds. Materials and methods. Using 360 DNA samples from eight Creole bovine breeds (Blanco Orejinegro, Casanareño, Costeño con Cuernos, Chino Santandereano, Caqueteño, Hartón del Valle, Romosinuano and San Martinero), two synthetic Colombian breeds (Lucerna and Velásquez) and two introduced breeds (Brahmán and Holstein), polymorphism of BoLA-DRB3.2* was evaluated using molecular techniques (PCR-RFLP). Allele average number (AAN), expected (He) and observed (Ho) allele frequencies, heterozygosity, Hardy-Weinberg equilibrium (HW), genetic structure and FST and FIS values were estimated. Results. AAN was 14.6 ± 3.8, Caqueteño breed displayed the highest AAN value (25) and Chino Santandereano the lowest (10). 41 alleles of BoLA-DRB3.2* were detected. The most frequent were *28, *37, *24, *23, *20, *27, *8, *16 and *39 (0.17, 0.11, 0.10, 0.09, 0.09, 0.07, 0.07 and 0.06 respectively). High genetic diversity was found (He=0.878) with the highest value for Caqueteño (0.96) and lowest for San Martinero (0.81). All breeds were in HW, and highly significant values of genetic differentiation (FST=0.044) and inbreeding coefficient (FIS=0.249) were found. Conclusions. The Colombian Creole breeds have a high BoLA-DRB3.2*gen polymorphism represented by the high AAN and genetic diversity values.

Key words: Antigens, molecular biology, genetic diversity (Source: CAB).

INTRODUCCIÓN El Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) de los bovinos es conocido como Antígenos de los Leucocitos Bovinos (BoLA) y se localiza en el cromosoma 23. Los Antígenos son glicoproteínas que se ubican en la superficie celular y su función principal es la presentación de péptidos a las células B y T (1).

Existen tres clases de antígenos leucocitarios bovinos, los antígenos clase I que constan de dos cadenas polipeptídicas codificadas por locus diferentes. Una de ellas atraviesa la membrana celular, tiene un peso molecular aproximado de 45000 D y la cadena más corta llamada microglobulina β2 tiene un peso aproximado de 12000 D. Los genes BoLA clase I codifican proteínas implicadas en el reconocimiento de las células del hospedero que han sido infectadas y en la presentación de péptidos a las células citotóxicas T y T CD8+ (1,2).

Los antígenos clase II son dos cadenas de un tamaño similar. Los genes clase II están localizados en dos partes diferentes del cromosoma 23, posee dos regiones llamadas clase IIa y clase IIb separadas por 15cM. La clase IIa contiene los genes DR y DQ y la clase IIb los genes DYA, DYB, DMA, DMB, DOB, DOA, TAP1, TAP2, LAPM2 y LMP7. Estos genes producen proteínas implicadas en la comunicación entre las células B y T, procesos antígenos extracelulares con células T CD4+ y otras funciones inmunes (1).

Mientras que, los genes clase III codifican proteínas del sistema de complemento, moléculas relacionadas con la inflamación y proteínas de choque térmico (2).

Los genes y los productos de la región clase IIa son los más estudiados porque presentan altos niveles de polimorfismo. Han sido identificados 14 genes en esta región: DRA, DRB (DRB1, DRB2, DRB3), DQA (DQA1, DQA2, DQA3, DQA4, DQA5) y DQB (DQB1, DQB2, DQB3, DQB4, DQB5) (1), donde el gen DRB3 es el más estudiado, este tiene una longitud de 11,4 Kbp con cinco intrones y seis exones, de los cuales el más polimórfico es el exón 2 (BoLA-DRB3.2) de un tamaño aproximado de 270bp (3).

Los genes BoLA-DRB3.2 han sido asociados con caracteres productivos como producción de leche, proteína y grasa en leche (4-6) y con enfermedades como linfocitosis persistente, carga proviral, brucelosis, mastitis y parásitos como las garrapatas (5,7-13).

Algunos autores (9,10) señalan que los bovinos criollos expresan características adaptativas de gran importancia como tolerancia al calor y humedad y resistencia a ciertas enfermedades, lo cual incrementa su valor como recurso genético.

El objetivo del presente trabajo fue caracterizar el polimorfismo del gen BoLA-DRB3.2* en las razas criollas y sintéticas Colombianas mediante técnicas moleculares (PCR-Semianidado y RFLP).

MATERIALES Y MÉTODOS Instalaciones y muestras de ADN. El estudio se realizó en el Laboratorio de Genética Animal de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira. Se utilizaron 30 muestras de ADN de

Hernández - Polimorfismo del gen BoLA-DRB3.2 en ganado criollo cada raza de ganado criollo (Blanco Orejinegro - BON, Chino Santandereano - ChS, Costeño con cuernos - CCC, Caqueteño - CQT, Casanareño CAS, San Martinero - SM, Romosinuano - RS, Hartón del Valle - HV), de cada raza sintética Colombiana (Lucerna - LUC y Velásquez - VEL) y razas foráneas (Brahman - B y Holstein - H) del banco de ADN del Laboratorio. La concentración se determinó utilizando ADN del bacteriófago lambda de concentraciones conocidas, visualizado mediante geles de agarosa al 0.8 % (p/v) teñidos con bromuro de etidio. El ADN fue diluido a 20 ng/µl.

Reacciones de amplificación por PCR. Se amplificó el segundo exón del gen BoLADRB.3, por un protocolo de PCR de dos pasos (semi-anidado) (14); con los cebadores: HL030 (5’-ATCCTC TCTCTGCAGCACATTTCC-3’), HL031 (5’-TTTAAATTCGCGCTCACCTCGCCGCT-3’), HL032 (5’-TCGC CGCTCAGTGAAACTCTC-3’); en la primer reacción de amplificación se utilizaron los oligonucleótidos HL030 y HL031 (1.25mM), en 25 μl de mezcla total, con 20 a 40 ng de ADN, 0.2 mM de cada dNTP, 1X de tampón PCR, 2.5 mM MgCl2 y 1U de Taq DNA Polimerasa (Fermentas®).

El programa de amplificación constó de una desnaturalización inicial de 4 minutos a 94°C, 10 ciclos de 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 60°C y 1 minuto a 72°C, con una extensión final de 5 minutos a 72°C (7). Para la segunda reacción se tomaron 4 μl de la primera reacción de PCR como molde y los oligonucleótidos HL030 y HL032 en un volumen total de 50 μl, con las mismas concentraciones de dNTPs, tampón PCR, MgCl2 y Taq DNA polimerasa. El programa de amplificación constó de una desnaturalización inicial de 4 minutos a 94°C y 25 ciclos de 1 minuto a 94°C, 30 segundos 65°C y 1 minuto a 72°C, con una extensión final de 5 minutos a 72°C (7). Todas las amplificaciones se realizaron en un termociclador modelo PTC-100® (Peltier Thermal Cycler BIO-RAD). El producto de ambas reacciones fue una banda de 282 pares de bases.

RFLP, Electroforesis e interpretación de los cortes. 10μl del producto de PCR de la segunda reacción se utilizaron como sustrato para la digestión con 5U de las enzimas RsaI, BstyI y HaeIII (Fermentas®) a 37°C durante 4 horas (7).

La electroforesis se realizó en geles de agarosa SFRTM (Super Fine Resolution, AMRESCO®) al 3% (p/v) y teñidos con bromuro de etidio en una cámara SUB-CELL® GT (BIO-RAD). La lectura de los alelos se basó en la nomenclatura del 5th BoLA workshop (15).

Análisis estadístico. Se formaron los siguientes grupos: criollos (BON, CAS, CCC, ChS, CQT, HV, RS y SM), sintéticas (LUC y VEL) y foráneas

3667

(B y H). El ganado criollo colombiano (GCC) está formado por las razas criollos y las razas sintéticas. Se determinó el número promedio de alelos, las frecuencias alélicas, la heterocigocidad esperada (He) y observada (Ho) y el equilibrio de Hardy – Weinberg (EHW). La estructura genética se infirió a partir del AMOVA basado en las frecuencias alélicas de las poblaciones, se determinaron los coeficientes de endogamia (FIS) y de diferenciación genética (FST) usando el programa ALERQUIN versión 3.5 (16).

RESULTADOS Se analizaron 360 animales, de los cuales 240 fueron criollos, 60 de razas sintéticas y 60 de razas foráneas. Se encontraron 41 alelos BoLA-DRB3.2*, de los cuales sólo 20 estuvieron presentes en las razas foráneas B y H. La frecuencia y distribución de los alelos de acuerdo con la raza se muestra en la tabla 1. Los alelos BoLA-DRB3.2 *23, *36 y *37 se encontraron en todas razas, mientras que los alelos *7, *9, *11, *19, *32, *33, *35, *39, *41, *45, *46, *48, *50 y *51 en sólo una raza, siendo estos alelos únicos para el GCC. El NPA para toda la población fue de 14.6±3.8, para las razas criollas de 14.6±4.6, para las sintéticas de 12.5±0.71 y para las foráneas de 15±1.41. El CQT presentó el mayor número de alelos (25 alelos) y el ChS el menor (10 alelos), mientras que en las razas sintéticas el mayor número de alelos lo presentó LUC (13 alelos) y en las razas foráneas B (16 alelos).

La raza CQT presentó el mayor número de alelos únicos (8 alelos), de otro lado el BON, SM, RS, CAS, LUC y VEL presentaron sólo uno. Las razas foráneas no mostraron alelos únicos.

El 58% de los alelos encontrados en el ganado GCC y el 36% en las foráneas tuvieron frecuencias menores a 5%. Los alelos con frecuencias superiores a 5% en el GCC fueron: BoLA-DRB3.2 *28 (0.15), *37 (0.128), *24 (0.089), *23 (0.093) y *20 (0.078). Las frecuencias en cada grupo racial se detallan en la tabla 1. En las razas foráneas los alelos con frecuencia mayor al 5% fueron los BoLA-DRB3.2 *13 (0.167), *37 (0.15), *36 (0.09), *23 (0.079), *28 (0.061) y el *25 (0.052).

Las razas sintéticas compartieron en promedio el 33% de sus alelos con las razas criollas que las conforman.

El promedio de He fue de 0.88±0.05 para los ganados criollos, para las sintéticas y las foráneas

3668

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

Tabla 1. Frecuencias alélicas y Número Promedio de Alelos (NPA) para cada raza*.

Criollos

Alelo BON

CAS

CCC

ChS

CQT

Sintéticos HV

0.051± 0.03

*2

0.033± 0.02 0.034± 0.02

*6

SM

0.020± 0.01

*3

0.020± 0.01

*8

0.051± 0.03

0.033± 0.02

Foráneas H

B

0.020± 0.01 0.020± 0.01

0.020± 0.01

0.020± 0.01

0.060± 0.03

0.008± 0.003

0.009± 0.008

0.020± 0.01

0.008± 0.003

0.017± 0.012

0.051± 0.03

0.013± 0.004

0.026± 0.015

0.001± 0.001 0.083± 0.04

0.035± 0.03

0.051± 0.03

0.020± 0.01

0.100± 0.04

0.033± 0.02

0.020± 0.01

0.020± 0.01

0.051± 0.03

0.051± 0.03 0.020± 0.01

*12 0.020± 0.01

0.051± 0.03 0.050± 0.03

*14

0.020± 0.01

0.050± 0.03

*15

0.034± 0.02

0.020± 0.01

0.125± 0.04

0.090± 0.04

*16

0.051± 0.03

0.040± 0.03

0.071± 0.03

0.070± 0.03

0.020± 0.01

*18

0.020± 0.01

0.020± 0.01

0.051± 0.03

0.103± 0.04

0.020± 0.01

0.125± 0.04

0.034± 0.02

0.071± 0.03 0.020± 0.01 0.071± 0.03

0.137± 0.05

0.040± 0.03

0.142± 0.05

*24

0.053± 0.03

0.070± 0.03

0.153± 0.05

0.071± 0.03

*25

0.020± 0.01

0.070± 0.03

*26

0.036± 0.03

0.060± 0.03

*27

0.090± 0.04

0.080± 0.04

*28

0.250± 0.06

0.020± 0.01

0.020± 0.01

0.020± 0.01

0.050± 0.03

0.083± 0.04

0.327± 0.06

0.009± 0.004

0.167± 0.035

0.007± 0.003 0.034± 0.02

0.133± 0.04 0.020± 0.01

0.020± 0.01

0.020± 0.01

0.034± 0.007

0.009± 0.008

0.067± 0.03

0.071± 0.03

0.020± 0.01

0.043± 0.008

0.043± 0.019

0.067± 0.03

0.035± 0.03

0.020± 0.01

0.031± 0.007

0.026± 0.015

0.003± 0.002 0.001± 0.001

0.050± 0.03

0.033± 0.083± 0.02 0.04

0.020± 0.01

0.100± 0.04

0.190± 0.133± 0.05 0.04

0.034± 0.02

0.070± 0.03

0.020± 0.01

0.067± 0.03

0.050± 0.03

0.033± 0.02

0.070± 0.03

0.350± 0.06

0.051± 0.03

0.053± 0.03

0.020± 0.01

0.053± 0.03

0.020± 0.01

0.020± 0.01

0.050± 0.03

0.100± 0.04

0.012± 0.04

0.034± 0.02

0.051± 0.03

0.093± 0.012

0.079± 0.025

0.089± 0.011

0.026± 0.015

0.012± 0.004

0.052± 0.021

0.019± 0.005

0.009± 0.008

0.015± 0.005 0.053± 0.03

0.070± 0.03

0.033± 0.02

0.050± 0.216± 0.03 0.05

0.155± 0.300± 0.125± 0.05 0.07 0.04

0.150± 0.014

0.020± 0.01 0.020± 0.01 0.036± 0.03

0.002± 0.001

0.020± 0.01

0.051± 0.03

0.020± 0.01

*35

0.061± 0.022

0.002± 0.001

*33 0.034± 0.02

0.017± 0.012

0.005± 0.002

0.034± 0.02

*32

*34

0.078± 0.011 0.020± 0.005

0.020± 0.01

0.403± 0.07

0.035± 0.02

0.018± 0.012

0.035± 0.03

*23

0.022± 0.006

0.007± 0.003

0.020± 0.01

*22

0.043± 0.019

0.034± 0.02

0.020± 0.01

*19 *20

0.013± 0.004

0.005± 0.002

0.020± 0.01

*17

TOTAL TOTAL GCC FORÁNEAS

0.001± 0.001

*11

*21

VEL

0.020± 0.01

*10

*13

LUC 0.020± 0.01

0.083± 0.04

*7

*9

RS

0.009± 0.004

0.026± 0.015

0.002± 0.001

*36

0.035± 0.03

0.051± 0.03

0.100± 0.04

0.178± 0.05

0.051± 0.03

0.050± 0.03

0.020± 0.01

0.033± 0.02

0.034± 0.02

0.033± 0.071± 0.103± 0.02 0.03 0.04

0.057± 0.001

0.090± 0.026

*37

0.250± 0.103± 0.06 0.04

0.020± 0.01

0.160± 0.05

0.103± 0.04

0.067± 0.03

0.050± 0.03

0.067± 0.03

0.33± 0.06

0.133± 0.196± 0.103± 0.04 0.05 0.04

0.128± 0.013

0.150± 0.033

0.066± 0.03

*39 *41 0.034± 0.02

*42 *43

0.020± 0.01

0.120± 0.04

0.100± 0.04 0.033± 0.02

0.020± 0.01

0.007± 0.003 0.020± 0.01

0.002± 0.001

0.034± 0.02

0.020± 0.005 0.071± 0.03

0.020± 0.01

0.017± 0.005

0.043± 0.019

Hernández - Polimorfismo del gen BoLA-DRB3.2 en ganado criollo *44

0.036± 0.03

0.020± 0.01

0.150± 0.05

0.020± 0.01

0.022± 0.006

0.034± 0.02

*45

3669

0.003± 0.002

*46

0.020± 0.01

0.002± 0.001

*48

0.020± 0.01

0.002± 0.001 0.033± 0.02

*50 *51 NPA

15

17

0.020± 0.01

12

10

25

14

16

12

13

12

0.003± 0.002

14

16

0.002± 0.001

14.6± 3.8

15± 1,41

*Los valores en negrilla muestran los alelos más frecuentes en cada raza.

fue 0.84±0.02 y 0.88±0.003 respectivamente.

En general la He fue mayor que la Ho para todas las razas. La raza con mayor diversidad genética (He) fue CQT seguido por CAS y RS, mientras que los valores más bajos de He los presentaron CCC y SM. El VEL mostró mayor valor de He que LUC. En las razas foráneas los valores de He fueron 0.86 y 0.90 para B y H respectivamente (Tabla 2).

Todas las razas de ganado criollo se encontraron en equilibrio de Hardy-Weinberg, aunque las razas criollas CAS y CQT y la VEL no mostraron diferencias altamente significativas (p<0.05).

El valor promedio de FIS fue 0.249 (Tabla 2). En el ganado criollo los valores más altos de endogamia lo presentaron CCC y el SM, en los sintéticos el LUC y en las foráneas el B (p<0.01). En las razas CAS y HV el FIS no fue significativamente diferente de cero (p<0.05) con bajos valores de fijación genética.

Tabla 2. Heterocigocidad esperada (He) y observada (Ho), equilibrio Hardy–Weinberg (EHW) y valores de FIS en cada raza evaluada.

Grupo Genético

Criollas

Sintéticas Foráneas

Promedios

Raza

He

Ho

EHW

FIS

BON

0.86

0.67

Sí**

0.28**

CAS

0.92

0.88

Sí*

0.07 ns

CCC

0.80

0.46

Sí**

0.52**

CHS

0.89

0.75

Sí**

0.22**

CQT

0.96

0.86

Sí*

0.13**

HV

0.91

0.88

Sí*

0.02 ns

RS

0.92

0.6

Sí**

0.28**

SM

0.81

0.5

Sí *

0.35**

LUC

0.82

0.53

Sí**

0.37**

VEL

0.85

0.63

Sí*

0.26**

H

0.90

0.86

Sí**

0.04 ns

B

0.86

0.60

Sí**

0.30**

Criollos

0.88 ± 0.05

0.70 ± 0.17

0.24**

Sintéticas

0.84 ± 0.02

0.58 ± 0.07

Foráneas

0.88 ± 0.003

0.73 ± 0.18

*p<0.05; **p<0.01; ns = no significativo

La estructura genética mostró un valor de FST de 0.044 (p<0.01) y un porcentaje de variación del 4.48% al comparar entre sí al GCC. El valor de FST fue menor al comparar los criollos con las razas sintéticas (0.043, p<0.01) y solo 0.41% de variación. Los mayores valores de FST se presentaron al comparar criollos y foráneas con 0.051 para B (4.46% de variación) y 0.052 para H (2.99% de variación) (p<0.01).

DISCUSIÓN Los 41 alelos BoLA-DRB3.2* encontrados es el mayor número de alelos reportados para este gen en ganados criollos; sin embargo, el NPA encontrado por raza es menor (14.6±4.6) que el reportado en criollos de México 34 alelos en el Tamaulipas y 18 en el Chihuahua (17), en el criollo Saavedreño de Bolivia 22 (18), 21 en el criollo argentino (19) y 22 en criollo de Uruguay (20). El valor bajo de NPA por raza se explica porque sólo fueron utilizados 30 por cada raza criolla colombiana y los demás autores presentan al menos 50 animales por raza (5, 12, 18-21). En razas foráneas presentes en América se reportan en el Holstein de Argentina valores que van desde 17 (13) a 26 (12) alelos, en la raza Gyr de Brasil se reportan 37 alelos (5) y en Holstein (21) y Brahman (9) de Colombia 27 y 11 alelos respectivamente. Un valore similar de NPA al aquí encontrado se reporta en Holstein (9).

En el ganado criollo colombiano sólo la raza BON tiene reportes de estudios en este mismo gen donde muestran 31 alelos (n=140) (9) y en 27 alelos (n=25), (21), en el presente estudio se encontraron 15 alelos para este mismo grupo racial.

El GCC compartió al menos un alelo con frecuencia mayor al 5% con otras razas criollas genotipificadas, el alelo *37 lo compartió con el Saavedreño (18), el *20 y *24 con el criollo argentino (19), con los criollos mexicanos Chihuahua y Tamaulipas el *23 y el *24 (17).

3670

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

No se encontraron alelos de alta frecuencia compartidos con el criollo uruguayo (20). Un resultado similar se encontró al comparar el GCC y las razas foráneas presentes en América, así los alelos *23 y *24 de alta frecuencia en el Holstein de Argentina (12,13) también lo fueron en el GCC, el *27 en el Gyr brasilero (5) y el *24 en el Holstein de Colombia (21).

Los alelos *28 y *37 los de más alta frecuencia en el GCC con presencia en todas las razas pueden ser considerados alelos fijos en el GCC. Por otro lado, en la raza CQT que tuvo el mayor número de alelos la mayoría de ellos presentaron bajas frecuencias (≤5%), por lo que se pueden catalogar como alelos únicos.

En la raza BON se reporta (9) que los alelos más frecuentes son el *11, *34, *1 y *12. Sin embargo, en el presente estudio no se encontró ninguno de estos alelos para el mismo grupo racial.

De igual manera, varios de los alelos aquí reportados han sido asociados con resistencia a algunas enfermedades, los alelos *11, *23 y *28 con la ausencia de linfocitos persistente (13), *11 y *12 con baja carga proviral del virus de la leucosis bovina (12), *23, *26 y *31 asociados con resistencia a Brucelosis (9), con resistencia a garrapatas el *8, *16, *20 y *27 (10), con diferentes tipo de mastitis el *3, *11, *31 y *33 (5,6). Esta metodología de genotipaje puede ser utilizada en programas de mejoramiento animal con el fin de aumentar la frecuencia de los genes relacionados con resistencia a enfermedades.

El valor de He fue mayor que el de Ho en todas las razas, lo que indica un posible déficit de heterocigotos, lo que puede ser explicados por

efectos de endogamia en la muestra evaluada.

El promedio de He (0.88±0.05) aquí reportado para el ganado criollo fue mayor que para los criollos argentinos (19) y mexicano Chihuahua (17) (0.865 y 0.83 respectivamente) pero menor que el reportado para los criollos boliviano Saavedreño (18) y mexicano Tamaulipas (17) (0.91 y 0.92 respectivamente). Un valor similar de He se reporta en Holstein (7).

Los altos valores de FIS encontrados en algunas razas, pueden ser explicados por la procedencia de las muestras evaluadas, algunas razas sólo fueron muestreadas en una sola finca como es el caso de BON, CAS, CCC, RS y VEL de los cuales sólo el CAS presentó un valor bajo (0.073) y no fue significativamente diferente de cero, por el contrario, razas que fueron muestreadas en diferentes localidades presentaron bajo valor de FIS, como es el caso del HV (8 fincas) y H (6 fincas).

Los valores de FST encontrados al comparar los criollos indica poca diferenciación genética (FST <5%). De otro lado, al comparar los criollos con las razas foráneas el valor de FST indica una diferenciación genética moderada.

Esta investigación corrobora la gran diversidad genética del ganado criollo colombiano y afirma la necesidad de desarrollar planes estratégicos de conservación y utilización, ya que ellos pueden convertirse en reservorios de genes de interés.

Agradecimientos A la Dirección Nacional de Investigación de la Universidad Nacional de Colombia-Palmira DIPAL, por la financiación (Proyecto 2030000).

REEFERENCIAS 1. Takeshima SN, Aida Y. Structure, function and disease susceptibility of the bovine major histocompatibility complex. Anim Sci J 2006; 77:138-150.

2. Lewin B. Genes IX, México, Mc Graw Hill; 2009. p. 570-604.

3. Russell GC, Smith JA, Oliver RA. Structure of the BoLA-DRB3 gene and promoter. Eur J Immunogenet 2004; 31:145-151.

4. Machado MA, Nascimento CS, Martinez ML, Silva MV, Campos AL, Teodoro RL, et al. Associação do loco BoLA-DRB3.2 com produção de leite em bovinos da raça Gir. Arq Bras Med Vet Zootec 2005; 5(3):380-389.

5. Do Nascimento CS, Machado MA, Martínez ML, Barbosa MVG, Martins MFG, Campos AL, et al. Association of the bovine major histocompatibility complex (BoLA) BoLADRB3 gene with fat and protein production and somatic cell score in Brazilian Gyr dairy cattle (Bos indicus). Genet Mol Biol 2006; 29(4):641-647.

Hernández - Polimorfismo del gen BoLA-DRB3.2 en ganado criollo 6. Zambrano JC, Echeverri JZ, López AH. Asociación de los alelos del gen BoLA DRB3.2 con características productivas en vacas del hato Paysandú de la Universidad Nacional de Colombia. Rev Colom Cien Pecu 2009; 22(3):448-449.

7. Dietz AB, Detilleux JC, Freeman AE, Kelley DH, Stabel JR, Kehrli ME. Genetic association of bovine lymphocyte antigen DRB3 alleles with immunological traits of Holstein cattle.

J Dairy Sci 1997; 80:400-4005.

8. Rupp R, Hernández A, Mallard BA. Association of bovine leukocyte antigen (BoLA) DRB3.2 with immune response, mastitis, and production and type traits in Canadian Holsteins. J Dairy Sci 2007; 90:1029-1038.

9. Martínez R, Toro R, Montoya F, Burbano M, Tobon J, Gallego J, et al. Caracterización del locus BoLA-DRB3 en ganado criollo colombiano y asociación con resistencia a enfermedades. Arch Zootec 2005; 54: 349-356.

10. Martínez ML, Machado MA, Nascimento CS, Silva MVGB, Teodoro RL, Furlong J, et al.

Association of BoLA-DRB3.2 alleles with tick (Boophilus microplus) resistance in cattle.

Genet Mol Res 2006; 5(3):513-524.

11. Castro GS, Trujillo EB, Duran CV. Polimorfismos del gen BoLA-DRB3 en el bovino sintético colombiano Lucerna y asociación con conteo de células somáticas y mastitis. Rev Col Cienc Pec 2006; 19(3):270-279.

12. Juliarena MA, Poli M, Sala L, Ceriani C, Gutierrez S, Dolcini G, et al. Association of BLV infection profiles with alleles of the BoLA-DRB3.2 gen. Anim Genet 2008; 39:432-438.

13. Panei CJ, Suzuki K, Echeverria MG, Serena MS, Metz GE, Gonzales ET. Association of BoLA-DRB3.2 alleles with resistance and susceptibility to persistent lymphocytosis in BLV infected Cattle Argentina. Int Dairy J 2009; 4(3):123-128.

3671

14. Van Eijk MJ, Russ I, Lewin HA. Order of bovine DRB3, DYA, and PRL determined by sperm typing. Mamm Genome 1992; 4:113–118.

15. Nomenclature. International Society for Animal Genetics. [en línea] [Fecha de acceso 20 de Julio de 2010]. URL disponible en http://www.projects.roslin.ac.uk/bola/ bolahome.html 16. Excoffier L, Lischer HEL. Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Mol Ecol Resour 2010; 10:564-567.

17. Fernández IG, Ríos JGR, Gayosso AV, Ulloa RA, Morales RAA. Polymorphism of locus DRB3.2 in populations of creole cattle from Northern Mexico. Genet Mol Biol 2008; 31(4):880-886.

18. Ripoli MV, Liron JP, De Luca JC, Rojas F, Dulout FN, Giovambattista G. Gene frequency distribution of the BoLA-DRB3 locus in Saavedreño creole dairy cattle.

Biochem Genet 2004; 42:231-240.

19. Giovambattista G, Golijow CD, Dulout FN, Lojo MM. Gene frequencies of DRB3.2 locus of Argentine Creole cattle. Anim Genet 1996; 27:55–56.

20. Kelly L, Nicolini M, D´Angelo A, Nimo G, Rincon J, Piaggio J, et al. Polimorfismos del gen DBR3.2 en bovinos criollos del Uruguay.

Arch Zootec 2003; 52:77-80.

21. Zambrano JC, Echeverri JZ, López AH. Análisis y frecuencias de los alelos del antígeno leucocitario bovino BoLA DRB3.2 en vacas del hato Paysandú de la Universidad Nacional de Colombia. Rev Colom Cien Pecu 2009; 22(3):448-449.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3672-3680, 2013.

ORIGINAL

Efecto del plasma seminal sobre el estado redox del semen equino criopreservado Effect of seminal plasma on the redox state of cryopreserved stallion semen Edison Pizarro L,1 Zoot, Giovanni Restrepo B,1* M.Sc, José Echeverry Z,2 Ph.D, Benjamín Rojano,2 Ph.D. Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, Carrera 48 No 7-151, Medellín, Colombia. 2Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, Calle 59A No 63-20, Medellín, Colombia. Correspondencia: grestrepo@elpoli.edu.co 1

Recibido: Septiembre de 2012; Aceptado: Febrero de 2013.

RESUMEN Objetivo. Determinar el efecto del plasma seminal sobre la generación de especies reactivas de oxígeno (ERO) y la peroxidación lipídica de semen equino criopreservado y su asociación con parámetros de calidad seminal. Materiales y métodos. El semen de cinco caballos de la raza criollo colombiano (dos eyaculados cada uno), fue criopreservado mediante un protocolo de congelación rápida, empleando un diluyente leche-yema de huevo, suplementado con 0%, 10% y 20% de plasma seminal equino. En muestras de semen fresco y criopreservado se evaluó la generación de ERO y la peroxidación lipídica por espectrofluorimetría, y los parámetros de calidad seminal de movilidad progresiva, vitalidad e integridad de membrana, mediante microscopia de contraste de fase. Para el análisis estadístico se ajustaron modelos mixtos y se realizaron análisis de regresión y correlación. Resultados. Se hallaron promedios post-descongelación de movilidad progresiva, vitalidad e integridad de membrana de 37.8%±20.2, 50.6% ± 14.6 y 37.8% ± 15.5, respectivamente. Para el semen fresco y criopreservado suplementado con 0%, 10% y 20% de plasma seminal, los promedios de producción de ERO (URF) fueron de 13.34±10.7, 16.15 ± 13.5, 17.32 ± 16 y 22.98 ± 19.4, respectivamente; mostrando un incremento estadísticamente significativo (p≤0.05) en la producción de ERO por efecto de la criopreservación y la suplementación con plasma seminal. Los promedios de peroxidación lipídica (nmolMDA/ml) para estos mismos tratamientos, fueron de 0.41 ± 0.25, 0.72±0.37, 0.51 ± 0.29 y 0.47±0.26, respectivamente; mostrando una reducción significativa (p≤0.05) de la peroxidación lipídica del semen suplementado con 10% y 20% de plasma seminal, respecto al semen no suplementado (0%). Conclusiones. El plasma seminal reduce la peroxidación lipídica del semen equino criopreservado.

Palabras clave: Antioxidantes, criopreservación, especies reactivas de oxígeno (Fuente: MeSH).

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Pizarro - Efecto del plasma seminal sobre el estado redox de semen

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ABSTRACT Objective. Determine the effect of seminal plasma on the generation of reactive oxygen species (ROS) and lipid peroxidation of cryopreserved stallion semen, and its association with semen quality parameters. Materials and methods. The semen of five stallions of Colombian creole breed (two ejaculates each) was cryopreserved by a rapid freezing protocol, using a milk-egg yolk extender supplemented with 0%, 10% and 20% of equine seminal plasma. The samples of fresh and cryopreserved semen were evaluated for ROS generation and lipid peroxidation by spectrofluorimetry, and semen quality parameters of progressive motility, vitality and membrane integrity using phase contrast microscopy. Mixed models were adjusted for statistical, regression, and correlation analysis.

Results. Post-thaw averages of progressive motility, vitality and integrity of membrane of 37.8% ± 20.2, 50.6% ± 14.6 and 37.8 ± 15.5%, respectively were found. For fresh and cryopreserved semen supplemented with 0%, 10% and 20% of seminal plasma, the averages of ROS production (RFU) were 13.34 ± 10.7, 16.15 ± 13.5, 17.32 ± 16 and 22.98 ± 19.4, respectively; showing a statistically significant increase (p≤0.05) of ROS production by effect of cryopreservation and seminal plasma supplementation. The averages of lipid peroxidation (nmolMDA / ml) for these same treatments were 0.41 ± 0.25, 0.72 ± 0.37, 0.51 ± 0.29 and 0.47 ± 0.26, respectively; showing a significant decrease (p≤0.05) of lipid peroxidation of semen supplemented with 10% and 20% of seminal plasma compared to unsupplemented semen (0%). Conclusions. Seminal plasma reduces lipid peroxidation of stallion cryopreserved semen.

Key words: Antioxidants, cryopreservation, reactive oxygen species (Fuente: MeSH).

INTRODUCCIÓN El uso generalizado y efectivo de semen equino criopreservado es aún limitado, principalmente por su asociación con la baja fertilidad. Como es conocido, los espermatozoides de esta especie son extremadamente sensibles a las alteraciones celulares generadas por la congelación (1).

El mejoramiento de los procedimientos de criopreservación de semen equino pueden derivarse en un uso más eficiente de biotecnologías reproductivas como la inseminación artificial, la transferencia de embriones y la fecundación in vitro. Diferentes técnicas y crioprotectores han sido evaluados (2,3). Sin embargo, han persistido alteraciones marcadas sobre la movilidad, la viabilidad y la morfología de los espermatozoides equinos (4,5), las cuales a la vez se han atribuido al estrés térmico, al estrés osmótico y principalmente al estrés oxidativo involucrado en los procesos de criopreservación (1,6). El peróxido de hidrógeno (H 2O 2) es la especie reactiva de oxígeno (ERO) más comprendida en el daño de los espermatozoides equinos, siendo generada por la acción de la superóxidodismutasa (SOD) sobre el anión superóxido, el cual es el principal radical libre producido por el espermatozoide equino (7). Cuando las ERO (especies reactivas de oxígeno) son generadas en exceso, se presenta una consecuente disminución de la fertilidad, principalmente como resultado de la peroxidación de los lípidos de membrana, lo cual es promovido por el alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados de los espermatozoides equinos (8,9).

Adicionalmente, se ha planteado que los procesos de congelación de semen, conducen a la perdida de la actividad de defensa antioxidante, por el daño estructural del citoesqueleto y de las enzimas antioxidantes (10, 11). Para contrarrestar, anular o minimizar los efectos de las ERO sobre los espermatozoides, se ha suplementado el semen equino con una variedad de sistemas antioxidantes, entre los cuales se encuentran SOD, catalasa (CAT), glutatión reducido, ácido ascórbico y α-tocopherol (12, 13). La remoción del plasma seminal durante el procesamiento del semen para su criopreservación, también favorece el estrés oxidativo del semen equino, toda vez que la mayoría de su capacidad antioxidante se encuentra allí (1). El plasma seminal equino posee actividades considerables de SOD y de glutatión-peroxidasa (GPx) (14), y otras moléculas presentes en el plasma seminal, como vitamina C, vitamina E, urato, albumina, taurina, hipotaurina, piruvato y lactato, podrían actuar como antioxidantes (15, 16).

El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de la suplementación con plasma seminal, en un diluyente para congelación, sobre el estado redox (producción de ERO y peroxidación lipídica) y la fertilidad potencial de semen equino criopreservado.

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MATERIALES Y MÉTODOS Recolección de material de investigación.

Cinco caballos de la raza criollo colombiano, localizados en un predio (latitud 6°23’41.50”N, longitud 75°25’27.95”O) del municipio de Girardota, Antioquia (Colombia), fueron utilizados para la recolección de dos eyaculados por animal, con una frecuencia semanal. Los ejemplares estuvieron entre los 2 y 8 años de edad, todos en un régimen de mínimo una colecta semanal, con fertilidad comprobada con crías nacidas vivas y con una condición corporal de 6 a 7 (escala entre 1 y 9, siendo 1 extremadamente delgado y 9 extremadamente obeso). Fueron sometidos a condiciones iguales de manejo en estabulación, a una alimentación a base de pasto estrella henificado (Cynodon nlemfuensis) suministrado a voluntad, 4kg diarios de concentrado distribuidos en 8 raciones, suplementación multi-vitamínica semanal, vermifugación semestral y vacunación anual contra el virus de la Encefalitis equina venezolana.

Recolección del semen. Se realizó por el método de vagina artificial, utilizando una vagina modelo Missouri lubricada con gel no espermicida. Una yegua fue empleada para la colecta, y la fracción en gel del eyaculado fue removida por filtración.

Posteriormente, el semen recién recolectado fue diluido en proporción 1:1 en diluyente EquiPro® (Minitube) a 37ºC. De cada eyaculado, entre 5 y 10 ml de semen (sin diluir) fueron sometidos a centrifugación a 3000 rpm durante 15 minutos; el plasma seminal fue recuperado con el fin de emplearlo posteriormente como suplemento para la criopreservación, mientras el precipitado de células espermáticas fue descartado. Tanto el plasma seminal como el semen diluido fueron transportados en refrigeración (5ºC) hacia el laboratorio, dentro de los 30 minutos siguientes.

Evaluación seminal. Utilizando un microscopio de contraste de fase Eclipse E200 (Nikon Inc.), se determinó la movilidad espermática promediando los porcentajes de movilidad progresiva de cinco diferentes campos de observación (400X). La concentración del semen fue determinada a partir de una gota de semen fresco, mediante un fotómetro Spermacue® (Minitube). La morfología y la vitalidad espermática se determinaron mediante la técnica modificada de eosinanigrosina (17). Sobre un portaobjetos temperado a 37°C, se depositó una gota de semen, y a su lado una gota de colorante eosina-nigrosina (Sigma-Aldrich 861006 y N4763) a 37°C; ambas gotas se mezclaron durante 30 a 60 segundos, y se realizó un extendido y la fijación del mismo con calor sobre una platina térmica.

Se observó la morfología individual de 200

espermatozoides al microscopio (1000X), y se clasificaron como morfológicamente normales o anormales (18). Se clasificaron como vivos aquellos espermatozoides que no incorporaron el colorante (espermatozoides blancos) y como muertos aquellos que incorporaron el colorante (espermatozoides rosados). Se establecieron porcentajes de espermatozoides normales (% de morfología normal), así como de espermatozoides vivos (% de vitalidad).

Se evaluó la integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides por la metodología de la prueba hipoosmótica (HOS) de acuerdo a lo reportado por Neild et al (19), para la cual se tomaron 100 µl de semen y se adicionaron a un tubo con 500 µl de una solución hipoosmótica de sacarosa 5.4% (100 mosmol/l).

Esta mezcla fue incubada a 38.5ºC por 30 minutos y luego se evaluó el hinchamiento espermático de 100 células en mínimo 5 campos diferentes (400X), utilizando un microscopio de contraste de fase Eclipse E200 (Nikon Inc.). Se determinó el porcentaje de células reaccionadas a partir de 100 espermatozoides contados. Como criterio de selección, solo fueron procesados los eyaculados con parámetros mínimos de 70% de movilidad progresiva, 100 millones de espermatozoides por ml, y 70% de espermatozoides morfológicamente normales (20, 21).

Criopreservación del semen. La criopreservación del semen se realizó mediante un protocolo modificado de congelación rápida de Bustamante et al (22). El semen diluido fue centrifugado por 10 minutos a 1500 rpm, y el 90% del sobrenadante fue descartado. El precipitado fue suspendido en un diluyente EquiPro® suplementado con 4% (v/v) de yema de huevo (3) y 5% de N,Ndimetilformamida (Sigma-Aldrich), en cantidad suficiente para una concentración final de 100 x 106 espermatozoides por ml. El semen diluido fue dividido en tres alícuotas para su suplementación con 0, 10 o 20% de plasma seminal equino (calculados como % de volumen de diluyente / volumen de plasma seminal). Posteriormente, el semen fue mantenido en refrigeración a 5°C por 15 minutos, y luego fue empacado en pajillas de 0.5ml. Las pajillas fueron sometidas a vapores de nitrógeno líquido por 15 minutos; para finalmente ser almacenadas en nitrógeno líquido de acuerdo a un protocolo modificado a partir del reportado por Medeiros et al (23). Después de dos semanas de almacenamiento las pajillas de semen fueron descongeladas en un baño de agua a 37°C por 1 minuto, y posteriormente fue evaluada la movilidad progresiva, la vitalidad y la integridad de la membrana plasmática, por las metodologías previamente descritas.

Pizarro - Efecto del plasma seminal sobre el estado redox de semen Determinación del estado redox. La determinación del estado redox se realizó mediante la medición de la producción de ERO y de la peroxidación lipídica tanto en semen fresco como descongelado para los diferentes tratamientos. La detección de especies reactivas se realizó por la metodología de la fluoresceína diacetato -FDA- (24), donde cada muestra contenía 30 μl de 40mM FDA (Intervet), 240 μl de solución buffer (pH 7.4), y 30 μl de semen. Se emplearon condiciones controladas de temperatura a 37°C, pH 7.4, y como referencia el antioxidante Trolox® (Merck). Las lecturas se realizaron mediante un espectrofluorímetro LS 55 (Perkin Elmer), a una λ de excitación 490 nm y slit de excitación 10, y una λ de emisión 530 nm y slit de emisión 15.

Los resultados fueron expresados como unidades relativas de fluorescencia (URF).

La evaluación de la peroxidación lipídica se realizó por la metodología modificada de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico-TBARS- (24); para lo cual 50 µL de semen fueron incubados por 1 hora a 37°C, y luego enfriados en agua con hielo durante 10 minutos. Posteriormente, se adicionaron 40 μl de ácido tricloroacético (TCA, Sigma-Aldrich) al 15%, y 80 μl de ácido tiobarbitúrico (TBA, Sigma-Aldrich) al 0.67% (p/v), la mezcla fue agitada e incubada por 20 minutos a 90°C, y luego enfriada en agua con hielo durante 10 minutos. Se adicionaron 300 μl de butanol (Sigma-Aldrich), para luego agitar cada muestra por inversión durante 1 min. Finalmente se tomaron 300 μl de la capa superior de la muestra para servirla en una placa múltipozo. El complejo fluorescente formado fue leído en un espectrofluorímetro LS 55 (Perkin Elmer) a una λ de excitación 500 nm y slit de excitación 5, y λ de emisión 550 nm y un slit de emisión 15. Los resultados fueron expresados como equivalentes de malonaldehido (nmolMDA/ ml de muestra).

Análisis estadístico. Para la evaluación de las ERO se efectuaron lecturas por cuadriplicado para cada eyaculado y tratamiento, cada 60 segundos durante 80 minutos. Para determinar el efecto de las fuentes de variación se ajustó un modelo mixto de medidas repetidas en el tiempo. El modelo empleado fue: Yijkl = µ Yijkl: µ: Ti: Ttoj:

+ Ti + Ttoj + Eq(Ey)k +eijkl, donde: Producción de ERO en el semen.

Media común a todos los tratamientos.

Efecto fijo del tiempo (i). (i=1…81).

Efecto fijo del tratamiento (j). (j=fresco, 0, 10, 20%).

Eq(Ey)k: Efecto aleatorio del eyaculado anidado dentro del equino (k). eijkl: Error aleatorio.

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Un modelo de regresión lineal múltiple fue ajustado independientemente para cada uno de los tratamientos, para determinar el efecto del tiempo sobre la producción de ERO, en cada uno. Posteriormente fueron comparados los coeficientes de regresión obtenidos y el ajuste de los modelos utilizados. El modelo de regresión fue: Y=β0 + β 1X1 + β 2X2 + β 3X3, donde: Y: Producción de ERO en el semen β 0: Intercepto β 1: Efecto del tiempo en la producción de ERO X1: Tiempo (minutos) β 2: Efecto de la edad en la producción de ERO X2: Edad (meses) β 3: Efecto de la movilidad progresiva en la producción de ERO X3: Movilidad progresiva (%) Para la evaluación de la peroxidación lipídica (TBARS) se ajustó un modelo mixto completamente aleatorizado con cuatro repeticiones por tratamiento. El modelo empleado fue: Yijklmn = µ + Ttoi + Rj + Movk + ERl+ Eq(Ey)m +eijklmn, donde: Yijklmn: Peroxidación lipídica en el semen µ: Media común a todos los tratamientos.

Ttoi: Efecto fijo del tratamiento (i). (i=Fresco, 0, 10, 20%).

R j: Efecto fijo de la repetición (pajilla) (j). (j=1…4).

Movk: Efecto fijo de la covariable movilidad progresiva (k). (k=0…100).

ERl: Efecto fijo de la covariable velocidad de producción de ERO (l). (l=0…100).

Eq(Ey)m: Efecto aleatorio del eyaculado anidado dentro del equino (m). eijklmn: Error aleatorio.

La velocidad de producción de ERO (URF/ minuto) en el semen fresco y el semen congelado para cada tratamiento, se halló mediante el cálculo de la pendiente (m). Para determinar la asociación entre las variables se realizó un análisis de correlación de Pearson de acuerdo con la expresión: r(X,Y) = cov(X,Y) / σxσy. Para la comparación de las medias ajustadas entre los tratamientos, tanto para la producción de ERO como para la peroxidación lipídica, se realizó una prueba de Tukey. Los resultados descriptivos fueron expresados como la media ± la desviación estándar. Todos los análisis fueron desarrollados mediante el programa SAS para Windows ®, versión 9.2, SAS Institute Inc.

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RESULTADOS Un total de 10 muestras de semen fresco (2 eyaculados por animal) fueron evaluadas y procesadas bajo los diferentes tratamientos.

El promedio para los parámetros espermáticos del semen fresco fueron: movilidad progresiva 77.5% ± 10.6, vitalidad 79.9% ± 8.74, morfología normal 83.6% ± 5.78, e integridad de membrana (HOS) 70.4% ± 15.5. Para el semen criopreservado, se hallaron promedios postdescongelación de movilidad progresiva, vitalidad e integridad de membrana de 37.8±20.2, 50.6±14.6 y 37.8±15.5, respectivamente.

A partir de un total de 1769 registros para la variable producción de ERO, se encontró un promedio de 18.92 URF ± 15.7. En el modelo mixto ajustado para esta variable, fueron significativos (p≤0.05) los efectos fijos de tiempo y tratamiento. Las medias ajustadas de producción de ERO se presentan en la tabla 1. El coeficiente de determinación (R2) del modelo para ERO fue de 0.77. Los coeficientes de regresión (p≤0.05) hallados para la producción de ERO en el semen bajo los diferentes tratamientos, se describen en la tabla 2.

Tabla 1. Resultados de producción de ERO y peroxidación lipídica en el semen equino.

Producción ERO (URF)

Peroxidación lipídica (nmMDA/ml)

Fresco

13.34 ± 10.7a

0.41 ± 0.25a

Plasma 0%

16.15 ± 13.5b

0.72± 0.37b

Plasma 10%

17.32 ± 16.0

0.51 ± 0.29

Plasma 20%

22.98 ± 19.4d

0.47 ± 0.26c

TRATAMIENTO

c

c

Letras diferentes indican diferencia estadística significativa (p≤0.05).

Tabla 2. Coeficientes de regresión para la producción de ERO en el semen equino fresco y descongelado para los diferentes tratamientos.

TRATAMIENTO

β0 (tiempo)

β 1 (edad)

β2 (movilidad)

R2

Fresco

0.006

0.02

-0.16

0.82

Plasma 0%

0.006

0.16

-0.33

0.64

Plasma 10%

0.008

0.01

-0.58

0.84

Plasma 20%

0.01

-0.03

-0.46

0.85

A partir de 122 registros se encontró un promedio para la variable peroxidación lipídica de 0.61 nmMDA/ml ± 0.32, mientras los promedios para las covariables incluidas en el modelo, movilidad progresiva y velocidad de producción de ERO fueron de 37.8% ± 20.2 y 0.0085 URF/min ± 0.004, respectivamente. En el modelo mixto ajustado para esta variable, fue significativo (p≤0.05) el efecto fijo del tratamiento, mientras no fueron significativos los efectos fijos repetición, ERO y movilidad progresiva. Se encontró un incremento estadísticamente significativo

(p≤0.05) de la peroxidación lipídica del semen criopreservado (0%, 10% y 20% de plasma seminal), respecto al semen fresco; al igual que una menor peroxidación (p≤0.05) del semen suplementado con 10% (v/v) y 20% (v/v) de plasma seminal, respecto al semen no suplementado (Tabla 1). El coeficiente de determinación (R2) del modelo para peroxidación lipídica fue de 0.74. Los resultados de los análisis de correlación se presentan en la tabla 3.

Tabla 3. Matriz de coeficientes de correlación (Pearson) entre los parámetros de fertilidad y del estado redox de semen equino criopreservado.

VARIABLE

Peroxidación

Peroxidación ERO

ERO 0.35

0.35

Movilidad Vitalidad

HOS

-0.30

-0.28

-0.21

-0.32

-0.34

-0.30

0.82

0.71

Movilidad

-0.30

-0.32

Vitalidad

-0.28

-0.34

0.82

HOS

-0.21

-0.30

0.71

0.70 0.70

DISCUSIÓN La criopreservación de semen equino ha sido permanentemente asociada con la baja fertilidad, por el alto impacto de las alteraciones que genera sobre los espermatozoides (1,25,26). Los resultados de esta investigación mostraron una notoria disminución en la movilidad progresiva, la vitalidad y la integridad de membrana en el semen criopreservado respecto al semen fresco.

Tradicionalmente se ha realizado la extracción del plasma seminal en los procesos de criopreservación de semen equino (27), toda vez, que se ha observado que cuando los espermatozoides están expuestos al plasma seminal, son incapaces de sufrir reacción acrosómica y completar la fecundación (28). Sin embargo, se reporta que la remoción del plasma seminal durante la criopreservación favorece el estrés oxidativo del semen equino, dado que la mayoría de su capacidad antioxidante se encuentra allí (1); de manera que las técnicas estándar de criopreservación producen un descenso en la actividad enzimática (21). Katila et al (29), encontraron que puede lograrse un mayor porcentaje de espermatozoides equinos móviles después de la criopreservación, cuando se conserva un 20% del plasma seminal. También se ha observado un efecto inmunosupresor del plasma seminal, al reducir la unión de los espermatozoides a los polimorfonucleares neutrófilos en el útero después de la inseminación artificial, favoreciendo el proceso de fecundación (30).

Se desconocen en gran medida los factores del plasma seminal relacionados con la fertilidad.

Pizarro - Efecto del plasma seminal sobre el estado redox de semen Recientemente, proteínas del plasma seminal como la proteína secretora rica en cisteína (CRISP3) ha sido asociada positivamente con la tasa de concepción, y es sugerida como un marcador de fertilidad (31). Pessanha et al (32), encontraron que la adición de diferentes concentraciones de proteínas de plasma en el semen equino durante la criopreservación, no mejora los parámetros espermáticos.

El estrés oxidativo ha sido ampliamente relacionado con la reducción de la fertilidad del semen equino (7), por lo cual conocer el aporte del plasma seminal al estado redox del semen destinado a la criopreservación, puede dilucidar sus aportes en la criotolerancia de los espermatozoides. Los resultados de este estudio mostraron como la criopreservación produce un incremento significativo en la producción de ERO en el semen criopreservado, y a la vez como el plasma seminal incrementa aún más dicha producción de forma proporcional cuando se suplementa con 10 y 20%.

Adicionalmente, en el análisis del modelo ajustado para la producción de ERO fue significativo el efecto del tiempo. De acuerdo con los coeficientes de regresión hallados por tratamiento (tabla 2), se produjo un incremento en la velocidad de producción de ERO entre 0.006 URF/min y 0.01 URF/min, lo que demuestra la continua producción de ERO en el semen, produciéndose una acumulación de las mismas que explicaría en parte las alteraciones de los espermatozoides, resultado del estrés oxidativo. La producción de ERO está ligada a la actividad metabólica de los espermatozoides, y depende en gran medida de la disponibilidad de moléculas energéticas, como las presentes en el plasma seminal, así como puede verse afectada por procesos como la centrifugación y la criopreservación (33).

Igualmente se observó un incremento en las ERO por efecto del aumento en edad del equino, probablemente por factores asociados al envejecimiento y a su conocida relación con el estrés oxidativo. Se ha descrito que los espermatozoides provenientes de los animales mas viejos, producen más radicales libres que los provenientes de animales jóvenes, al igual que poseen una reducida actividad antioxidante enzimática (34). También se encontró una reducción de las ERO a causa del aumento en la movilidad progresiva de los espermatozoides (Tabla 2), posiblemente relacionado con una menor presencia de células apoptóticas en el semen, las cuales son conocidas por generar altas cantidades de especies reactivas (35).

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Otro factor asociado con la pérdida de la movilidad, viabilidad, y capacidad para la fecundación de los espermatozoides, es el incremento en la peroxidación de los lípidos d e s p u é s d e l a c r i o p r e s e r va c i ó n . C o m o consecuencia de la peroxidación, la membrana plasmática pierde ácidos grasos poliinsaturados con una producción asociada de hidroperóxidos lipídicos, y radicales alcoxilo y peroxilo; los cuales promueven una reacción en cadena de peroxidación lipídica y en última instancia conducen a la producción de aldehídos citotóxicos como malondialdehido y 4-hidroxinonenol (36).

Esta situación desencadena alteraciones a nivel de la membrana plasmática, acrosomal y mitocondrial, provocando una reducción en su fluidez e integridad (9, 25). De acuerdo a los resultados obtenidos, la peroxidación lipídica presentó un incremento significativo en el semen equino criopreservado (0% plasma seminal), respecto al semen fresco. Este efecto ha sido evidenciado previamente en el semen de esta especie, siendo atribuido al estrés oxidativo del proceso, conjugado con el alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados en las membranas de los espermatozoides (25).

La adición del plasma seminal al 10% (v/v) y al 20% en la solución de congelación, permitió controlar los procesos de peroxidación lipídica en el semen equino criopreservado, en niveles cercanos a la peroxidación del semen fresco.

Este efecto podría atribuirse a la presencia de moléculas con función antioxidante en el plasma seminal. Villa et al (37), encontraron actividades de glutatión-peroxidasa (GPx) de 0.55 ± 0.05 U/ml y de SOD de 86 ± 7.1 U/ml en el plasma seminal de caballos de la raza criollo colombiano.

La catalasa se encuentra en grandes cantidades en todas las fracciones de un eyaculado a excepción del fluido pre-espermático (38). Otras moléculas presentes en el plasma seminal, como vitamina C, vitamina E, urato, albumina, taurina, hipotaurina, piruvato y lactato, podrían actuar como antioxidantes (15, 16).

El mantenimiento de menores niveles de peroxidación lipídica de los espermatozoides, a pesar del evidente aumento en la producción de ERO en el semen congelado bajo suplementación con plasma seminal, podría entenderse como un efecto contrario al esperado. Sin embargo, estudios mostraron que el incremento de la generación de ERO no está necesariamente acompañada de un incremento detectable en la peroxidación lipídica (39). Adicionalmente, la medición no diferencial entre los tipos existentes de ERO, a través de la metodología empleada (FDA); así como el desconocimiento de los posibles mecanismos enzimáticos y mediados por

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moléculas de bajo peso molecular, involucrados en la desintoxicación de las mismas, no permiten dilucidar los eventos específicos relacionados con el control de la peroxidación. Entre los hallazgos más relevantes en este sentido está la evidente participación del H2O2 como la principal ROS causante de citotoxicidad en el semen equino (7); la reducción de alteraciones citológicas por acción de la catalasa y el glutatión reducido (39), y la disminución del estrés oxidativo y el mejoramiento de la calidad del semen refrigerado por efecto de la SOD (12).

Las correlaciones calculadas (Tabla 2) mostraron una asociación positiva entre la producción de ERO y la peroxidación lipídica, así como una asociación negativa entre estas variables, con los diferentes parámetros evaluados de fertilidad potencial, lo cual es indicador del efecto contraproducente de las ERO sobre la integridad y la funcionalidad de las células espermáticas.

Las correlaciones positivas encontradas entre los parámetros: movilidad progresiva, vitalidad e

integridad de membrana (HOS), demostraron la alta asociación existente entre estos indicadores de fertilidad potencial.

Se concluye que la suplementación del diluyente para la criopreservación de semen equino con plasma seminal, incrementa la producción de ERO y reduce la peroxidación lipídica del semen equino post-descongelación. Son necesarios estudios más detallados de los diferentes tipos de especies reactivas y de moléculas antioxidantes involucradas en los procesos de criopreservación de semen equino, con el fin de dilucidar sus efectos en la alteración o protección de las estructuras espermáticas al estrés oxidativo.

Agradecimientos Dirección de investigaciones Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid. Laboratorio de Ciencia de los Alimentos, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín.

REFERENCIAS

1. Ball, B. Oxidative stress, osmotic stress and apoptosis: Impacts on sperm function and preservation in the horse. Anim Reprod Sci 2008; 107:257-267.

2. Squires E, Keith S, Graham J. Evaluation of alternative cryoprotectants for preserving stallion spermatozoa. Theriogenology 2004; 62:1056–1065.

3. Mantovani R, Rota A, Falomo M, Bailoni L, Vincenti L. Comparison between glycerol and ethylene glycol for the cryopreservation of equine spermatozoa: semen quality assessment with standard analyses and with the hypoosmotic swelling test. Reprod Nutr Dev 2002; 42:217-226.

4. Pesch S, Bostedt H, Failing K, Bergmann M. Advanced fertility diagnosis in stallion semen using transmission electron microscopy. Anim Reprod Sci 2006; 91:285-298.

5. Pommer A, Rutllant J, Meyers S. The role of osmotic resistance on equine spermatozoal function. Theriogenology 2002; 58(7):13731384.

6. Devireddy R, Swanlund D, Olin T, Vincente W, Troedsson M, Bischof J et al. Cryopreservation of equine sperm: optimal cooling rates in the presence and absence of cryoprotective agents determined using differential scanning calorimetry. Biol Reprod 2002; 66:222-231.

7. Burnaugh L, Sabeur K, Ball B. Generation of superoxide anion by equine spermatozoa as detected by dihydroethidium. Theriogenology 2007; 67:580-589.

8. Kankofer M, Kolm G, Aurich J, Aurich C. Activity of glutathione peroxidase, superoxide dismutase and catalase and lipid peroxidation intensity in stallion semen during storage at 5°C. Theriogenology 2005; 63:1354-1365.

9. Neild D, Gadella B, Colendrander B, Agüero A, Brouwers J. lipid peroxidation in stallion spermatozoa. Theriogenology 2002; 58:295-298.

10. Isachenko E, Isachenko V, Katkov I, Rahimi G, Schoèndorf E, Allmann P et al. DNA integrity and motility of human spermatozoa after standard slow freezing versus cryoprotectant-free vitrification. Hum Reprod 2004; 19(44):932-939.

Pizarro - Efecto del plasma seminal sobre el estado redox de semen

3679

11. Isachenko V, Isachenko E, Katkov I, Montag M, Dessole S, Nawroth F. Cryoprotectant-free cryopreservation of human spermatozoa by vitrification and freezing in vapor: effect on motility, DNA integrity, and fertilization ability.

Biol Reprod 2004; 71:1167-1173.

21. Perez-Osorio J, Mello F, Juliani G, Lagares M, Lago L, Henry, M. Effect on post-thaw viability of equine sperm using stepwise addition of dimethyl formamide and varying cooling and freezing procedures. Anim Reprod 2008; 5(3/4):103-109.

12. Cocchia N, Pasolinia M, Mancini R, Petrazzuolo O, Cristofaro I, Rosapane I et al. Effect of sod (superoxide dismutase) protein supplementation in semen extenders on motility, viability, acrosome status and ERK (extracellular signal-regulated kinase) protein phosphorylation of chilled stallion spermatozoa.

Theriogenology 2011; 75: 1201–1210.

22. Bustamante I, Pederzolli C, Sgaravatti A, Gregory R, Dutra C, Jobim M etal. Skim milkegg yolk based semen extender compensates for non-enzymatic antioxidant activity loss during equine semen cryopreservation. Anim Reprod 2009; 6(2):392-399.

13. Baumber J, Ball B, Linfor J. As­sessment of the cryopreservation of equine spermatozoa in the presence of enzyme sca­vengers and antioxidants.

Am J Vet Res 2005; 66(5):772–779.

14. Baumber J, Ball B. Determination of glutathione peroxidase and superoxide dismutase-like activities in equine spermatozoa, seminal plasma, and reproductive tissues. Am J Vet Res 2005; 66:1415-1419.

15. Ball B, Gravance C, Medina V, Baumber J. Liu I. Catalase activity in equine semen. Am J Vet Res 2000; 61(9):1026–1030.

16. Baumber J, Ball B, Gravance C, Medina V, Davies-Morel M. The effect of reactive oxygen species on equine sperm motility, viability, acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential and membrane lipid peroxidation. J Androl 2000; 21(6):895-902.

17. Brito L, Greene L, Kelleman A, Knobbe M, Turner R. Effect of method and clinician on stallion sperm morphology evaluation.

Theriogenology 2011; 76:745–750.

18. Graham J, Mocé E. Fertility evaluation of frozen/thawed semen. Theriogenology 2005; 64:492-504.

19. Neild D, Chaves G, Flores M, Mora N, Beconi M, Agüero A. Hypoosmotic test in equine spermatozoa. Theriogenology 1999; 51:721-727.

20. Henry M, Snoeck P, Cottorello A. Postthaw spermatozoa plasma integrity and motility of stallion semen frozen with different cryoprotectants. Theriogenology 2002; 58:245:248.

23. Medeiros A, Gomes G, Carmo M, Papa F, Alvarenga M. Cryopreservation of stallion sperm using different amides. Theriogenology 2002; 58:273-276.

24. Guthrie H, Welch G. Determination of intracellular reactive oxygen species and high mitochondrial membrane potential in Percolltreated viable boar sperm using fluorescenceactivated flow cytometry. J Anim Sci 2006; 84:2089-2100.

25. Morte M, Rodríguez A, Soares D, Rodrigues A, Gamboa S, Ramalho-Santos J. The quantification of lipid and protein oxidation in stallion spermatozoa and seminal plasma: Seasonal distinctions and correlations with DNA strand breaks, classical seminal parameters and stallion fertility. Anim Reprod Sci 2008; 106(1-2):36-47.

26. Salazar J, Teague S, Love C, Brinsko S, Blanchard T, Varner D. Effect of crypreservation protocol on postthaw characteristics of stallion sperm. Theriogenology 2011; 76:409-418.

27. Moore A, Squires E, Graham J. Effect of seminal plasma on the cryopreservation of equine.

Theriogenologyy 2005; 63:2372-2381.

28. Lozano Benito D, Gil Huerta L, Álvarez San Martín C. Efecto de la adición de plasma seminal en el semen equino descongelado.

Sanid mil 2011; 67(3):284-290.

29. Katila T, Anderson M, Reilas T, Koskinen E. Post-thaw motility and viability of fractionated and frozen stallion ejaculates. Theriogenology 2002; 58:241-244.

30. Alghamdi A, Foster D, Troedsson M. Equine seminal plasma reduces sperm binding to polymorphonuclear neutrophils (PMNs) and improves the fertility of fresh semen inseminated into inflamed uteri. Reproduc 2004; 127(5):593-600.

3680

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

31. Novak S , Smith T, Paradis F, Burwash L, Dyck M, Foxcroft G. Biomarkers of in vivo fertility in sperm and seminal plasma of fertile stallions.

Theriogenology 2010; 74:956–967.

32. Pessanha M, Straggiotti J, Fagundes B, Costa J, De Souza G, Shimoya A. Efeito de proteínas do plasma seminal eqüino com massa superior a 10 kDa concentradas 10 vezes sobre a congelabilidade do sêmen. R Bras Zootec 2008; 37(12):2115-2119.

33. Vasconcelos A, Santana M, Santos A, Santero M, Lagares M. Metabolic evaluation of cooled equine spermatozoa. Androl 2010; 42:106–111.

34. Weir C, Robaire B. Spermatozoa have decreased antioxidant enzymatic capacity and increased reactive oxygen species production during aging in the Brown Norway rat. J Androl 2007; 28:229-240.

35. Brum A, Sabeur K, Ball B. Apoptotic-like changes in equine spermatozoa separated by density-gradient centrifugation or after cryopreservation. Theriogenology 2008; 69:1041-1055.

36. Aitken RJ, Paterson M, Fisher H, Buckingham DW, Van Duin M. Redox regulation of tyrosine phosphorylation in human spermatozoa and its role in the control of human sperm function. J Cell Sci 1995; 108:2017–2025.

37. Villa N, Castaño D, Duque P, Ceballos A. Actividad de la glutatión peroxidasa y la superóxido dismutasa en sangre y plasma seminal en caballos colombianos. Rev Colomb Cienc Pecu 2012; 25:64-70.

38. Koskinen E, Karlsson M, Reilas T, Sankari S, Esala A, Katila T. Catalase activity and total protein in fractionated stallion seminal plasma.

Theriogenology 2002; 58:337-340.

39. Baumber J, Ball B, Linfor J, Meyers S. Reactive oxygen species and cryopreservation promote DNA fragmentation in equine Spermatozoa. J Androl 2003; 24(4):621-628.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3681-3688, 2013.

ORIGINAL

Oferta de pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum), tercio de lactancia y perfil de ácidos grasos lácteos Kikuyo grass (Pennisetum clandestinum) allowance, state of lactation and milk fatty acid profile Juan Vargas M,1 Zoot, José Mojica R,2 M.Sc, Martha Pabón R,3 Ph.D, Juan Carulla F,1* Ph.D. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Ciencias para la Producción Animal, Bogotá, Colombia. 2Centro de investigación Motilonia, Corporación Colombiana de Investigación, Corpoica. Bogota, Colombia 3Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de Química, Bogotá, Colombia *Correspondencia: jecarullaf@unal.edu.co 1

Recibido: Marzo de 2012; Aceptado: Febrero de 2013.

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto de la oferta de kikuyo y el tercio de lactancia sobre el perfil de ácidos grasos en la grasa láctea de bovinos en pastoreo. Materiales y métodos. Se utilizaron 18 vacas de la raza Holstein con un peso promedio de 585 ±10 kg entre dos y cuatro partos, en primer y segundo tercio de lactancia. Las vacas se dividieron en tres grupos y fueron asignados al azar a uno de los tres tratamientos (ofertas de 2.6; 3.3 ó 4.0 kg MS/100 kg PV). Se determinó el perfil de ácidos grasos en la leche los días 14 y 21 del periodo experimental. Resultados. Los ácidos grasos C6:0, C16:0, C18:1c9 y C18:3 permanecieron constantes entre las diferentes ofertas de forraje y tercios de lactancia. En las mayores ofertas se presentó un aumento entre el día 14 y 21 de los ácidos C10:0 y C12:0 mientras que disminuyeron su concentración en estos mismos días los ácidos C18:1t11, C18:2c9c12, C18:2c9t11 y poliinsaturados. Se presentó una mayor concentración del ALC en animales de segundo tercio respecto a los de primero. Conclusiones. Debido a las variaciones entre los días de muestreo en el perfil de ácidos grasos de la grasa láctea fue imposible determinar si el aumento en la oferta mejora las concentraciones de ácidos grasos que han presentado efecto benéfico en la salud humana. La movilización de reservas de grasa podría explicar el comportamiento diferente de la concentración de ácidos grasos entre los días de recolección de muestras.

Palabras clave: Ácido linoleico conjugado (ALC), ácido transvaccénico, ácidos poliinsaturados, grasa láctea (Fuente: CAB).

ABSTRACT Objective. To evaluate the effect of kikuyu offer and stage of lactation on fatty acids profile on milk fat of grazing dairy bovines. Materials and methods. Eighteen Holstein cows with average weight of 585±10 Kg in two to four calvings on first and second lactation stages. Cows were divided in three groups and assigned randomly to one of three treatments (pasture allowances of 2.6, 3.3 or 4.0 KgDM/100 Kg LW). Milk fatty acid profiles were determined on days 14 and 21 of the experimental period. Results. Fatty acids C6:0, C16:0, C18:1cis9, C18:3 remained constant between different

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forage allowances and lactation stage were used. On the treatments of highest allowance, there was an increase between days 14 and 21 of C10:0 andC12:0 acids while C18:1t11,C18:2c9c12, C18:2c9,t11, and polyunsaturated fatty acids decreased their concentration. The lowest allowance had a different behavior. A higher concentration of ALC was observed in animals of second stage compared to first stage of lactation. Conclusions. It was not possible to conclude on the effects of forage allowance on the fatty acid profile of milk, due to variations between sampling dates. It is possible that mobilization of fat storage can explain the different behavior of fatty acid concentrations between sampling days.

Key words: Conjugated linoleic acid (CLA), milk fat, polyunsaturatedfattyacids, transvaccenic acid (Source: CAB).

INTRODUCCIÓN En las últimas décadas se han reconocido en la grasa láctea biomoléculas benéficas para la salud, entre las que se destacan el ácido butírico (C4:0), caprílico (C8:0), cáprico (C10:0), oléico (C18:1), ácidos omega 3 y 6, ácidovaccénico (C18:1 trans-11) y ácido linoléico conjugado (ALC C18:2 c9 t11), (1,2).

Algunos investigadores han sugerido que al aumentar los días de lactancia se presenta variación en la composición de la grasa láctea, evidenciándose en los primeros días una mayor concentración de ácidos grasos de cadena larga provenientes de la movilización de las reservas corporales, y posteriormente el incremento en los ácidos que se obtienen por síntesis de novo (3,4).

Kay et al (5), reportaron un incremento (51%) en la concentración de ácidos provenientes de la síntesis de novo (4:0 a 14:0), mientras que los ácidos grasos preformados (≥17:0) disminuyeron (15%) al aumentar los días en lactancia. Stoopet et al (6), reportaron que en la primera parte de la lactancia aumentan las concentraciones de ácidos saturados y disminuyen en la segunda mitad. Estos autores encontraron un aumento en la concentración de ALC en la medida que se incrementaban los días en lactancia.

La literatura reporta algunas estrategias que permiten modificar el perfil lipídico de la grasa láctea de bovinos, tanto en dietas TMR como en pastoreo (7,8). Los sistemas pastoriles han presentado mayor concentración de ciertos ácidos grasos benéficos para la salud como el ALC y ácidos poliinsaturados y una menor de ácidos grasos saturados (7,9). Sin embargo, en pocos trabajos se ha determinado el efecto de la oferta forrajera sobre el perfil lipídico de la grasa láctea. Bargo et al (3) reportaron que con un aumento en la oferta forrajera de 3.96 a 6.34 kg de materia seca (MS)/ 100 kg peso vivo (PV), aumentaban las concentraciones de ácidos grasos de cadena media y corta, saturados e insaturados y que disminuían las concentraciones de ácidos grasos de cadena larga, pero no se

encontraron diferencias en las concentraciones de ALC. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la oferta forrajera de kikuyo y el tercio de lactancia, sobre el perfil lipídico de la grasa láctea, principalmente la concentración de ácidos grasos benéficos para la salud (ácido vaccénico, ácido linoleico conjugado y ácidos grasos poliinsaturados).

MATERIALES Y MÉTODOS Localización. El experimento se realizó en el Centro Agropecuario Marengo de la Universidad Nacional sede Bogotá, localizado en la vereda San José, municipio de Mosquera (Cundinamarca), 4°42´ de latitud norte y 74°12´ de longitud oeste a una altitud de 2650 msnm con una temperatura promedio de 13°C con fluctuaciones entre 0 y 20°C y una humedad relativa de 80 a 85%. La precipitación anual promedio fue de 528.9 mm, con distribución bimodal del período lluvioso; uno entre los meses de abril y mayo y el otro desde septiembre hasta noviembre.

Diseño experimental. Se evaluaron ofertas de 2.6; 3.3 ó 4.0 Kg MS/100 Kg PV de pasto kikuyo.

Los animales se suplementaron de acuerdo con la producción de leche (1 Kg por 4.2 L de leche) utilizando un suplemento diseñado para el experimento (10).

Se seleccionaron 18 vacas Holstein con un peso de 585±10 kg entre dos y cuatro partos, en primer y segundo tercio de lactancia. Las vacas se dividieron en tres grupos teniendo en cuenta la producción de leche y los días en lactancia donde cada uno de los grupos tenía tres vacas en primer tercio y tres en segundo tercio. Uno de los tres tratamientos experimentales fue asignado al azar a cada uno de los grupos.

Vargas - Oferta de pasto de kikuyo y tercio de lactancia sobre perfil ácidos grasos La duración del período experimental fue de 21 días. Los primeros 7 días se utilizaron como período de ajuste de los animales al suplemento, los 7 días siguientes de ajuste a la oferta de pasto kikuyo y los últimos 7 días fueron utilizados para el período de medición.

Manejo del pastoreo. Se utilizó una pastura de kikuyo (Pennisetum clandestinum) con un área aproximada de 3 ha dividida en tres áreas de 1 ha, donde se distribuyeron al azar los tres grupos de animales. El kikuyo fue pastoreado a una edad de rebrote de 45 días. Para la evaluación de la producción de forraje verde se realizaron cortes a una altura de pastoreo de 10 cm por delante de la cuerda eléctrica utilizando un marco plástico de 1 m2. Se tomaron muestras de forraje para análisis de materia seca (MS), cada segundo día a partir del período de acostumbramiento y para el análisis de la composición química del forraje a los días 14, 17 y 20 del período experimental (10). La producción de forraje promedio fue de 2000 kg de MS/ha.

Se ajustó diariamente la oferta forrajera mediante el uso de cuerda eléctrica ofreciendo el área de pastoreo en metros cuadrados de superficie de pasto kikuyo en cada grupo experimental correspondiente a las ofertas de 2.6; 3.3 y 4.0 kg MS/100 kg PV, respectivamente, moviendo dos veces diarias la cuerda eléctrica, luego de cada ordeño (a.m. y p.m.).

Toma de muestras y análisis químicos.

Muestras de forraje y concentrado fueron secadas en horno de aire forzado, a 60°C durante 48 horas. Posteriormente se molieron usando una criba de 1 mm de diámetro. Se determinó humedad (11), fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente ácido (FDA) (12), proteína cruda por el método de Kjeldahl (11) y grasa total por extracción con éter (11).

La producción de leche se midió los días 0, 14 y 21 en el ordeño de la mañana y de la tarde. Para cada día de muestreo, se tomaron muestras de leche en cada ordeño (a.m. y p.m.) y posteriormente se mezclaron en partes iguales. Estas muestras fueron conservadas con bicromato de potasio en una concentración de 600 ppm. Para obtener la crema, la leche se centrifugó a 5000 rpm durante 15 min y la crema se congeló a -20°C hasta su análisis posterior (13).

Extracción de grasa y metilación de los ácidos grasos. Para la extracción de la grasa láctea, se descongeló la crema a 30° centígrados.

Se extrajo la grasa de la leche a través de una técnica de separación mecánica modificada (14).

Se colocaron 500 µl de la crema homogenizada

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en un tubo de ensayo. Se adicionaron 500 µl de una solución detergente preparada con 50 gramos de hexametafosfato de sodio y 24 ml de Tritón X-100® disueltos en un litro de agua. El tubo de ensayo se agitó vigorosamente, se colocó en un baño de agua a 90°C y se extrajo la capa superior que corresponde a la fracción lipídica.

De ésta se tomaron 100 μl y se disolvieron en 1000 μl de una solución cloroformo: metanol, en relación 1:1, y se agitó con vortex. Para preparar los esteres metílicos, se tomaron 20 μl de la solución anterior y se mezclaron con 160 μl de la solución cloroformo: metanol, y 20 μl de MethPrep II®. La muestra se conservó a 20°C para su posterior análisis por cromatografía de gases.

Para la extracción de los lípidos del kikuyo (Pennisetum clandestinum) se utilizó el protocolo adaptado de Palmquist (15). Se pesó un gramo del forraje seco dentro de un tubo de ensayo.

Luego se adicionaron 2 ml de tolueno y 3 ml de solución HClmetanólica al 10% (v/v), (se adicionaron 10 ml de HCl a 90 ml de metanol), se mezcló y se colocó en un baño de maría a 65°C durante dos horas. Después de este tiempo se dejó enfriar, se adicionaron 5 ml de hexano y 10 ml de una solución de carbonato de potasio al 6% (p/v), se mezcló y se centrifugó por 5 minutos a 500 g. La capa superior (solvente) se transfirió a tubos de ensayo que contenían 1 g de carbón activado y 1 g de sulfato de sodio y se centrifugó por 5 minutos a 500 g. El sobrenadante que contiene los lípidos se pasó por una micro columna que contenía 0.5 cm de sulfato de sodio en la parte superior de la columna, 6 cm de sílica gel para cromatografía en la parte intermedia y finalmente 2 cm de carbón activado, en la parte inferior. La columna se eluyó con hexano, se eliminó el exceso de hexano del eluido, la muestra se predisolvió en 0.5 ml de hexano y se transfirió a viales ámbar para su posterior análisis cromatográfico.

Análisis de los esteres metílicos mediante cromatografía de gases. Se hicieron dos análisis cromatográficos. El primero, para cuantificar los ácidos grasos diferentes al ácido vaccénico y a los ALC´s, fue realizado con una fase móvil de helio, en una columna capilar Omega wax 320 Supelco ® de 30 metros de longitud y 0.25 mm de diámetro interno. Se utilizó un programa isotérmico de 80°C por 2 min, pendiente de 10°C/min hasta los 190°C, durante 20 min, pendiente de 2°C hasta los 220°C, durante 10 min y un tiempo total de corrida de 58 min. En el segundo análisis cromatográfico se determinó el ácido vaccénico (C18:1 trans11) y el ALC (C18:2 c9t11), utilizando una columna capilar en sílica fundida con fase polar D-Wax Agilen ® , de 30 metros de longitud y 0.25

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mm de diámetro interno con un programa de temperatura de 190°C isotérmica por 2 min, pendiente 3°C por min hasta los 220°C, durante 3 min y un tiempo total de la corrida de 15 min.

Tabla 1. Perfil de ácidos grasos del kikuyo y suplemento alimenticio.

Kikuyo

Concentrado AG g/100g AG

Cadena corta

La muestra que contenía los esteres metílicos de los ácidos grasos fue inyectada en un cromatógrafo (Shimadzu C-R4A) equipado con un detector de ionización de llama (FID). Cada pico fue identificado y cuantificado utilizando como referencia los tiempos de retención de los patrones. El cálculo de la concentración de cada ácido graso se realizó tomando el área de cada pico de manera individual y relacionando con el número de áreas detectadas. Se utilizaron patrones comerciales para la determinación del perfil lipídico (SupelcoTM.Bellefonte, PA), vaccénicotrans 11 (Nu-Check®.Elysian, MA), y ALC´s, c9t11 y t10c12. (Nu-Check®. Elysian, MA).

C6:0

ND1

0.04

C8:0

ND

0.08

C10:0

ND

0.12

C11:0

ND

0.03

C12:0

0.39

1.44

Total

0.39

1.72

Cadena media C13:0

ND

0.06

C14:0

3.47

0,.76

C15:0

ND

0.07

C16:0

19.84

15.11

C16:1

ND

0.14

Total

23.31

16.14

C17:0

ND

0.04

C18:0

11.94

2.20

C18:1 c-9

3.73

24.53

Cadena larga

Análisis estadístico. Para el análisis del efecto de la oferta forrajera y el tercio de lactancia sobre la concentración de los ácidos grasos se utilizó un modelo de medidas repetidas con arreglo factorial 2x3 (dos tercios de lactancia y tres tratamientos). Se analizaron los efectos principales de los tratamientos, el tercio de lactancia y el día de toma de muestra; además, de las interacciones utilizando el procedimiento mixed del programa SAS (16). La comparación de medias se realizó por medio de la prueba de Duncan con un nivel de significancia del 5% (17).

C18:2 c9-c12

18.85

51.62

C18:3 c6, c9, c12

ND

0.09

C18:3 c9, c12, c15

40.72

2.38

C20:0

1.06

0.31

Total

76.30

81.17

Poliinsaturados

59.57

54.64

Monoinsaturados

3.73

25.00

Saturados

36.69

20.35

Omega-3

40.72

2.38

Omega-6

18.85

51.71

ND: No detectado

1

RESULTADOS Perfil lipídico del forraje y suplemento alimenticio. Los ácidos grasos más abundantes en el kikuyo (Pennisetum clandestinum) fueron en su orden linolénico (18:3), palmítico (16:0), linoleico (C18:2c9c12) y esteárico (C18:0). El suplemento alimenticio presentó una mayor concentración de linoléico (C18:2c9c12), oleico (C18:1) y palmítico (C16:0) (Tabla 1).

Perfil lipídico de la grasa láctea. El tercio de lactancia, la oferta forrajera y el día de la toma de muestra no tuvieron ningún efecto sobre las concentraciones de los ácidos capróico (C6:0), palmítico (C16:0), oleico (C18:1c9) y linolénico (C18:3 c9c12c15) en la leche. Adicionalmente, el efecto de los factores sobre las concentraciones de los demás ácidos grasos no se explicaron de manera independiente sino que se presentaron interacciones, principalmente entre la oferta forrajera y el día de muestreo. La respuesta del ácido mirístico (C14:0) a los tratamientos no fue clara pues se presentó una interacción triple (p<0.05)(Tabla 2).

Con una oferta de forraje del 4% se presentó una menor concentración de ácido caprílico (C8:0) en animales de primer tercio de lactancia (1.29 g/100 g de AG ) (p<0.05) mientras que no hubo diferencias entre ofertas de 3.3 y 2.6% (1.46 y 1.43 mg/g de grasa respectivamente).

En animales de segundo tercio de lactancia, se evidenció diferencias entre todos los niveles de oferta (p<0.05) resultando en una menor concentración para la mayor oferta (1.32 g/100 g de AG) y un aumento de la concentración conforme disminuía la oferta de forraje (1.37 y 1.41 g/100 g de AG , para la oferta media y baja, respectivamente).

La respuesta a la oferta en la concentración de los ácidos grasos cáprico (C10:0), laúrico (C12:0), vaccénico (C18:1t11), linoléico (C18:2c9c12), ALC (C18:2c9t11) y poliinsaturados, dependieron del día de muestreo. En el día 14, la concentración de ácido cáprico (C10:0) y laúrico (C12:0) fueron menores para las ofertas de 4.0 y 3.3% y mayores para la oferta de 2.6% (p<0.01).

Para el día 21 se observó un aumento en las concentraciones de éstos ácidos para las ofertas de 4.0 y 3.3% y una disminución en la oferta de

Vargas - Oferta de pasto de kikuyo y tercio de lactancia sobre perfil ácidos grasos

3685

Tabla 2. Composición de ácidos grasos (AG) en la grasa láctea de vacas con diferentes ofertas forrajeras.

Variable Grasa (%)

Oferta Kikuyo1

P<

4

3.3

2.6

Tto

Día

Tlac

Día x Tto

Tto x Tlac

Día x Tlac

Tto x Dia x Tlac

3.4

3.5

3.5

ns

ns

ns

ns

ns

*

ns

----- g/100g AG --Cadena corta C6:0

2.6

2.8

2.7

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

C8:0

1.3

1.4

1.4

ns

ns

ns

ns

*

ns

ns

C10:0

2.7

2.9

3.1

ns

*

ns

**

ns

ns

ns

C12:0

2.7

3.1

3.1

ns

*

ns

***

ns

*

ns

Total

9.4

10.2

10.2

C14:0

10.5

11.9

11.5

*

*

ns

ns

ns

ns

*

C16:0

29.1

32.6

28.6

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

Total

43.6

48.7

44.3

Cadena media

Cadena larga C18:0

15.0

13.4

15.0

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

C18:1 c9

24.9

22.3

24.6

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

C18:1 t11

3.6

2.6

3.3

*

**

ns

*

ns

ns

ns

C18:2 c9, c12

1.6

1.4

1.6

ns

ns

ns

**

ns

ns

ns

C18:2 c9, t11

1.2

1.0

1.1

*

*

***

**

ns

ns

ns

C18:3 c9,c12,c15

0.4

0.3

0.3

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

Total

46.9

4.2

45.5

Poliinsaturados

3.3

2.7

3.0

*

ns

ns

***

ns

ns

ns

Monoinsaturados

30.6

27.2

29.5

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

Saturados

66.2

70.1

67.4

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

Omega-3

0.4

0.4

0.3

ns

ns

ns

ns

ns

ns

ns

Omega-6

1.7

1.4

1.6

ns

ns

ns

**

ns

ns

ns

kg MS/100 kg PV. ns: No significativo. *<0.05. **<0.01. ***<0.001. Tto=Efecto de tratamiento, Día= Efecto de día de medición, Tlac= Efecto del tercio de lactancia, Tto x Tlac= Interacción tratamiento por tercio de lactancia, Tto x Día= Interacción tratamiento por día de medición, Tlac x Día= Interacción tercio de lactancia por día de medición, Tto x Tlac x Día= Interacción tratamiento por tercio de lactancia por día de medición.

1

2.6% (Figura 1). En el día 14, la concentración de los ácidos grasos vaccénico (C18:1t11), linoléico (C18:2c9c12), ALC (C18:2c9t11) y poliinsaturados, fueron mayores en la oferta de 4% que en las menores ofertas. En el día 21, se presentó un aumento en la concentración de éstos ácidos grasos en la menor oferta de forraje (2.6%) mientras la concentración disminuyó en las mayores ofertas (3.3 y 4%) (Figura 2).

Figura 1. Oferta de forraje y día de muestreo para los ácidos C10:0 (AC) y C12:0 (ALa).

Interacción oferta forrajera con día de muestreo p<0.01.

Se evidenció un aumento en las concentraciones de ALC en animales de segundo tercio respecto a los del primero (Tabla 2). También se presentaron variaciones en las concentraciones del ácido laúrico (C12:0) asociadas al día de muestreo y el tercio de lactancia (interacción p<0.05). En el día 14 no se presentaron diferencias en la concentración de ácido láurico entre animales de primero y segundo tercio. Sin embargo, en el día 21 el primer tercio aumentó las concentraciones

Figura 2. Oferta de forraje y día de muestreo para los ácidos C18:1t11 (AV), C18:2c9c12 (AL), C18:2c9t11 (ALC) y ácidos poliinsaturados (API). Interacción oferta forrajera con día de muestreo p<0.05.

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del ácido laúrico (3.2 g/100 g de AG) respecto al segundo tercio (2.9 g/100 g de AG).

Se presentó una correlación negativa entre los ácidos de cadena corta frente a los de cadena larga y poliinsaturados (r=-0.51, p<0.03 y r=-0.63, p<0.004, respectivamente).

DISCUSIÓN Forrajes y suplemento. En el presente estudio la proporción de ácido linolénico en los ácidos grasos del kikuyo fue de 41%. Sin embargo, Elgersma et al (18) reportaron que el contenido de ácido linolénico en forrajes verdes puede oscilar entre el 50 y el 70% del total de ácidos grasos. Estas variaciones pueden deberse a la edad de corte y/o condiciones ambientales (8,18). Es el caso de Aguilar et al (8), quienes reportaron una disminución del 10% en la concentración de ácido linolénico en kikuyo (Pennisetum clandestinum) de 70 días respecto a los de 50 días. La concentración de ácidos saturados fue similar a lo reportado por Aguilar et al (8) en pasto kikuyo y Bargo et al (19) en una mezcla de diferentes especies forrajeras.

El perfil lipídico del suplemento fue similar a lo encontrado por Elgersma et al (20,21). Sin embargo, Bargo et al (19) reportaron una mayor concentración de palmítico (C16:0) y oléico (C18:1) que de linoléico. Estas diferencias pueden ser debidas a las materias primas usadas en la preparación del suplemento alimenticio (10).

Grasa láctea. En el presente estudio, la concentración de ácidos grasos de cadena corta y media fueron similares a los reportados por Aguilar et al, (8) y Wijesundera et al (20), los de cadena larga, a lo reportados por Kelsey et al (4) y Stockdale et al (22). Sin embargo, se presentaron variaciones de acuerdo con los tratamientos evaluados, aunque la concentración de grasa fue similar entre estudios.

Oferta forrajera. La mayoría de los ácidos grasos en la leche no presentaron variaciones debido a la oferta forrajera únicamente, los ácidos grasos caprílico (C8:0), mirístico (C14:0), vaccénico (C18:1t11), ALC (C18:2c9t11) y poliinsaturados mostraron variaciones asociadas a la oferta que dependieron del día de muestreo o del tercio de lactancia. Aunque para el primer muestreo las concentraciones de los ácidos grasos deseables para la salud humana (vaccénico, ALC y poliinsaturados) fueron mayores en el tratamiento de mayor oferta estos disminuyeron su concentración entre los dos días de muestreo contrario al comportamiento de los animales

que recibieron la menor oferta. Por lo tanto, es difícil concluir sobre la bondad de aumentar la oferta de kikuyo para aumentar estos ácidos en la leche. Lo hallazgos en la literatura también parecen contradictorios. Wisejundera et al (20) encontraron un aumento del 6 y 13% en la concentración de ácido vaccénico y ALC respectivamente y una disminución de 14% en la concentración de linoleico, cuando aumentaba la oferta forrajera en una pastura de mezcla de gramíneas desde 3.7 a 7.6 kg de MS/ 100 kg PV. Bargo et al (19) también encontraron una disminución en la concentración de linoleico y oleico y no observaron diferencias en el vaccénico o ALC. Estos resultados difieren a los encontrados por Stockdale et al (22), quienes no reportan efecto de la oferta forrajera sobre los ácidos grasos antes mencionados, debido quizás a una menor oferta de forraje en sus experimentos, (4 vs. 6 kg de MS/ 100 kg PV) o un mejor estatus energético de los animales. Estos autores sugieren que el aumento en la concentración de los ácidos grasos de cadena larga en animales que consumen menor cantidad de forraje, podría deberse a un balance energético negativo, lo que conduce a una movilización de tejido graso y mayor concentración de éstos ácidos en la grasa láctea (23).

La concentración de los ácidos caprílico (C8:0), cáprico (C10:0), laúrico (C12:0) y mirístico (C14:0), fueron menores en animales que consumieron una mayor oferta de forraje. Este efecto se podría explicar por un mayor consumo de ácidos grasos de cadena larga. Algunos autores sugieren que un mayor consumo de ácidos grasos de cadena larga inhibe la síntesis de ácidos grasos de cadena corta; de esta manera un mayor consumo de forraje podría disminuir la concentración de ácidos grasos de cadena corta (23).

Con la menor oferta de forraje se aumentaron las concentraciones de los ácidos vaccénico (C18:1t11), linoléico (C18:2c9c12), ALC (C18:2c9t11) y poliinsaturados entre la primera y la segunda toma; por el contrario con mayores ofertas se disminuyeron las concentraciones de éstos ácidos grasos. La disminución de estos ácidos en aquellos animales que recibieron una mayor oferta podría ser debida a un descenso en la concentración de ácidos grasos precursores en el forraje, ya que el forraje ofrecido en la primera toma, era 7 días más joven que el de la segunda.

Aguilar et al (8), reportaron que en pasto kikuyo a mayor edad disminuye la concentración de precursores, especialmente ácido linolénico (C18:3) y se presenta un aumento en ácidos grasos saturados. Sin embargo, esto no explicaría el aumento en la menor oferta de forraje, lo que

Vargas - Oferta de pasto de kikuyo y tercio de lactancia sobre perfil ácidos grasos sugeriría un aumento en el aporte endógeno por posible movilización de tejido graso en animales que recibieron una menor oferta.

Bargo et al (19), Griinari et al (24) y Moate et al (7), sugieren que la concentración de ácidos grasos provenientes de la síntesis de novo presenta una correlación negativa en relación a la concentración de ácidos grasos poliinsaturados; resultados similares se encontraron en este trabajo. Sin embargo, estos resultados difieren del trabajo realizado por Aguilar et al (8), en el cual la síntesis de ácidos grasos de cadena corta no presentó una correlación negativa con las concentraciones de ácidos grasos poliinsaturados.

Tercio de lactancia. La literatura reporta que a medida que avanzan los días en lactancia, aumenta la concentración de ácidos grasos de cadena corta (25) pero en la semana 8 se estabiliza la concentración de éstos ácidos grasos seguido de un descenso que ocurre aproximadamente a los 3 meses de lactancia (26). Lo anterior podría explicar la mayor concentración de ácido caprílico (C8:0) en animales de primer tercio, respecto a los de segundo, debido a que los animales de primer tercio de lactancia superaban los 56 días de lactancia, logrando una mayor concentración, y los de segundo tercio superaban los 120 días, disminuyéndola levemente.

En este estudio, el perfil de ácidos grasos, con excepción al ALC, no fue modificado por el tercio de lactancia. El ALC presentó mayores concentraciones en animales de segundo tercio respecto animales de primer tercio de lactancia.

Resultados similares reportó Kay et al (25) y Stoop et al (26) en donde las concentraciones

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de ALC incrementaron al aumentar los días de lactancia. Los resultados de este trabajo sugerirían que los ácidos grasos varían poco debido al tercio de lactancia, contrario a lo reportado por otros autores que proponen que el aporte de ácidos grasos endógenos es mayor en el primer tercio de lactancia y los provenientes de la síntesis de novo aumentan en el segundo y tercer tercio, relacionado con un mejoramiento en el balance energético (25).

Este trabajo intentó determinar el efecto de la oferta forrajera y el tercio de lactancia sobre la composición de la grasa de la leche. Los resultados sugieren que la respuesta varía dependiendo del ácido graso y del día de toma de muestra.

Mientras los ácidos grasos C6:0, C16:0, C18:1 c9 y C18:3 permanecieron constantes entre las diferentes ofertas de forraje y tercios de lactancia, los ácidos grasos C10:0, C12:0, C18:1t11, C18:2 c9c12, C18:2c9t11 y poliinsaturados fueron afectados por las diferentes ofertas de forraje y el día de toma de muestra. En los tratamientos de mayor oferta se presentó un aumento entre el día 14 y 21 de para los ácidos C10:0 y C12:0 mientras que disminuyeron su concentración en estos mismos días los ácidos C18:1t11, C18:2c9c12, C18:2c9t11 y poliinsaturados.

Diferente comportamiento presentó la menor oferta forrajera. El tercio de lactancia afectó la respuesta del ácido C18:2c9t11 presentándose mayor concentración en animales de segundo tercio respecto a los de primero. Posiblemente, la movilización de reservas corporales, puede explicar el diferente comportamiento, entre los días de toma de muestra, para los animales que recibieron una menor oferta de forraje respecto a aquellos de mayor oferta.

REFERENCIAS

1. Rico J, Moreno B, Pabón M, Carulla J. Composición de la grasa láctea de la sabana de Bogotá con énfasis en ácido ruménicoCLA cis9 trans11. Rev Col Cienc Pecu 2007; 20:30-39.

2. Gagliostro G. Control nutricional del contenido de ácido linoléico conjugado (CLA) en leche y su presencia en alimentos naturales funcionales. 2. Producción de leche alto CLA de vaca. Rev Arg Prod Anim 2005; 24(3-4):137-163.

3. Bargo F, Delahoy J, Schroeder G, Muller L. Milk fatty acid composition of dairy cows grazing at two pasture allowances and supplemented with different levels and sources of concentrate. Anim Feed Sci Technol 2006; 125:17-31.

4. Kelsey J, Corl B, Collier R, Bauman D. The effect of breed, parity and stage of lactation on conjugated linoleic acid (CLA) in milk fat from dairy cows. J Dairy Sci 2003; 86:2588-2597.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

5. Kay JK, Weber WJ, Moore CE, BaumanDE, Hansen LB, Chester-Jones H, et al. Effects of week of lactation and genetic selection for milk yield on milk fatty acid composition in Holstein Cows. J Dairy Sci 2005; 88:3886-3893.

6. Stoop W, Bovenhuis H, Heck J, van Arendonk J. Effect of lactation stage and enegy status on milk fat composition of Holstein-Friesian cows. J Dairy Sci 2009; 92:1469-1478.

7. Moate P, Chalupa E, Bostom R, Lean I. Milk fatty acids I: Variation in the concentration of individual fatty acids bovine milk. J Dairy Sci 2007; 90:4730-4739.

8. Aguilar O, Moreno B, Cárdenas E, Pabón M Carulla J. Efecto del consumo de kikuyo (Pennisetumclandestinum) o ryegrass (Lolliumspp.) sobre la concentración de ácido linoléico conjugado y el perfil de ácidos grasos de la grasa láctea. Livest Res Rural Dev 2009; 21(49).

9. Elgersma A, Tamminga S, Ellen G. Effect of grazing versus stall-feeding of cut grass on milk fatty acid composition of dairy cows.

Proceedings of the Int. Occ. Symp. of the European Grassland Federation, Pleven, Bulgaria. Grass Sci Eur 2003; 8:271-274.

10. Mojica JE, Castro E, León JM, Cárdenas EA, Pabón ML, Carulla JE. Efecto de la oferta de pasto kikuyo y ensilaje de avena sobre la producción y calidad composicional de la leche bovina. Rev Corpoica 2009; 10:81-90.

11. A.O.A.C. Official methods of analysis.

Washington, D.C., USA: Association of Official Agricultural Chemists. 2005.

12. Van Soest P, Roberton L. Methods for dietary fiber, neutral fiber and no starch polysaccharides in relation to nutrition. J Dairy Sci 1991; 74:3583-3597.

13. Tilley J, Terry A. two-stage technique for in vitro digestion of forage crops. J Br Grass Soc 1963; 18:104-111 14. Díaz-González G, Gutiérrez R, Pérez N, Vega S, González M, Prado G, et al. Detección de adulteraciones de la grasa de la leche pasteurizada mexicana. Rev Salud Anim 2002; 24:54-59.

15. Palmquist DL. The feed value of fats. In: Orskov, E Editor. Feed Science. Amsterdam: Elsevier Science Publishing. 1983.

16. SAS. OnlineDoc 9.1.3. Cary, USA: SAS Institute Inc; 2007.

17. Martínez R, Martínez N, Martínez MV. Diseños de experimentos en ciencias agropecuarias y biológicas con SAS, SPSS, R y STATISTIX. 1 Ed. Bogotá (Colombia): Cooperativa de Profesores de la Universidad Nacional de Colombia; 2011.

18. Elgersma A, Tamminga S, Ellen, G. Modifying milk composition through forage. Anim Feed Sci 2006; 131:207-225.

19. Bargo F, Delahoy J, Schroeder G, Muller L. Milk fatty acid composition of dairy cows grazing at two pasture allowances and supplemented with different levels and sources of concentrate. Anim Feed Sci Technol 2006; 125:17-31.

20. Wijesundera C, Shen Z, Wales W, Dalley D. Effect of cereal grain and fibre supplements on the fatty acid composition of milk fat of grazing dairy cows in early lactation. J Dairy Res 2003; 70:257-265.

21. Elgersma A, Ellen G, van der Horst H, Boer H, Dekker P y Tamminga S. Quick changes in milk fat composition from cows after transition from fresh grass to a silage diet.

Anim Feed Sci Technol 2004; 117:13–27.

22. Stockdale R, Walker G, Wales W, Dalley D, Birkett A, Shen Z et al. Influence of pasture and concentrates in the diet of grazing dairy cows on the fatty acid composition of milk.

J Dairy Res 2003; 70:267-276.

23. Khanal R, Dhiman T, Boman R. Changes in fatty acid composition of milk from lactating dairy cows during transition to and from pasture. Livest Sci 2007; 114:164-175.

24. Griinari J, Corl B, Lacy S, Chouinard P, Nurmela K, Bauman D. Conjugated linoleic acid is synthesized endogenously in lactation dairy cows by ∆9 desaturase. J Nutr 2000; 130:2285-2291.

25. Kay JK, Weber WJ, Moore CE, BaumanDE, Hansen LB, Chester-Jones H, et al. Effects of week of lactation and genetic selection for milk yield on milk fatty acid composition in Holstein Cows. J Dairy Sci 2005; 88:3886-3893.

26. Stoop WM, Bovenhuis H, Heck JML, van Arendonk JAM. Effect of lactation stage and energy status on milk fat composition of Holstein Friesian cows. J Dairy Sci 2009; 92:1469-1478.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3689-3698, 2013.

ORIGINAL

Inhibición de colonización intestinal por Vibrio cholerae con Lactobacillus acidophilus1 en conejos lactantes Lactobacillus probiotics may prevent Vibrio cholerae colonization in rabbits newborn Alvaro Pazos M,1* Ph.D, Milena Guerrero F,1 M.Sc. Universidad de Nariño, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Departamento de Biología, Pasto, Colombia. *Correspondencia: alpazmo@udenar.edu.co.

1

Recibido: Octubre de 2012; Aceptado: Mayo de 2013.

RESUMEN Objetivo. Evaluar la capacidad in vitro e in vivo de Lactobacillus acidophilus1, aislado en este estudio, para prevenir enfermedad diarreica causada por Vibrio cholerae 01 OGAWA, en conejos lactantes.

Materiales y métodos. Se aisló Lactobacillus acidophilus1 a partir de heces de niños sanos, se seleccionó por su capacidad amilolítica a partir de un grupo de bacterias ácido lácticas (BAL). El mejor sustrato amiláceo para el crecimiento de la BAL fue estandarizado previamente. Con L. acidophilus1 se realizó un ensayo in vitro e in vivo de inhibición antagónica sobre el enteropatógeno y se evaluó la prevención de la colonización por V. cholerae 01 OGAWA en conejos lactantes. Resultados. De acuerdo con el análisis de varianza L. acidophilus1 presentó la mejor capacidad amilolítica respecto a las otras BAL aisladas, p<0.5. Se encontró que un inóculo con una densidad celular de 35x106 bacterias/ml en el fermento láctico es capaz de ejercer el mayor efecto antagónico in vitro sobre V. cholerae. Se demostró el efecto probiótico in vivo, ya que los conejos enfrentados con el patógeno y sin recibir probiótico tuvieron una probabilidad de sobrevida menor de 0.25 respecto al grupo de animales retados con el patógeno y simultáneamente alimentados con el probiótico cuya probabilidad de sobrevida fue de 0.95. Conclusiones. L. acidophilus1 se considera un microorganismo probiótico, capaz de sobrevivir a su paso por el tracto gastrointestinal en un modelo animal y prevenir la colonización intestinal por V. cholerae 01 OGAWA en conejos lactantes.

Palabras clave: Conejos, Lactobacillus acidophilus, probióticos, Vibrio cholerae, (Fuente: DeCS).

ABSCRACT Objective. To assess the capacity in vitro and in vivo of Lactobacillus acidophilus1 isolated in this study, capable of preventing diarrheal disease caused by Vibrio cholerae 01 OGAWA in rabbits newborn.

Materials and methods. Lactobacillus acidophilus1 was isolated from faeces of healthy children and was selected from a group of lactic acid bacteria (LAB). The better starchy substrate for the growth of the LAB was previously standardized. Using the L. acidophilus1, there was carried out an in vitro and in vivo assay of antagonistic inhibition on the enteropathogen and it was evaluated the prevention of colonization by V. cholerae 01 Ogawa in rabbits newborn. Results. L. acidophilus1 present the better amylolytic capacity, p<0.5 in the ANDEVA. It was found that an inoculum with a cell density of

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35x106 bacteria/ml in the lactic ferment is able to exert the greatest antagonistic effect in vitro over V. cholerae. The probiotic effect was demonstrated in vivo, since rabbits exposed to the pathogen without having received probiotic had a lower survival probability of 0.25 regarding the group of animals exposed with the pathogen and simultaneously fed with the probiotic whose probability of survival was of 0.95. Conclusions. L. acidophilus1 is considered a probiotic microorganism capable of surviving when passing through the gastrointestinal tract in an animal model and preventing intestinal colonization by V. cholerae 01 Ogawa in rabbits newborn.

Key words: Lactobacillus acidophilus, probiotics, rabbits, Vibrio cholerae (Source: MeSH).

INTRODUCCIÓN A nivel mundial las enfermedades infecciosas continúan siendo el principal problema por resolver en el siglo XXI. Según la OMS, las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de muerte en niños menores de cinco años.

En 2012, fueron reportados por la OMS 245.393 casos de cólera con más del 49% de los casos ocurridos en América, principalmente en Haití y Republica Dominicana (1). En Colombia, en el periodo Enero-Agosto de 2013 se documentaron 76 muertes por enfermedad diarreica aguda (EDA) en lo corrido del año y 1.878.989 casos, de los cuales 25.1% en niños menores de 5 años.

En comparación con el año 2012, hasta Agosto de 2013 en Colombia se registró un aumento de 14.4% de mortalidad por EDA (2).

Las bacterias de los géneros Shigella, Campylobacter y las especies V. cholerae, E. coli patogénica y rotavirus, son los principales agentes causantes de muertes por EDA en países emergentes. En Estados Unidos de 21 a 37 millones de casos de EDA se producen por año en una población de 16.5 millones de niños y en tales casos Salmonella, Campylobacter y E. coli 0157 enterohemorrágica y enteroagregativa son las bacterias mas frecuentes de infecciones transmitidas por alimentos (3). La alta incidencia de las infecciones asociadas a estos agentes se debe principalmente a su fácil diseminación, los perfiles de resistencia a los fármacos antimicrobianos y los complejos mecanismos moleculares de patogenicidad (4).

El cólera es la EDA más grave que se conoce y se caracteriza por su rápida diseminación que conlleva a epidemias en periodos cortos de tiempo. Es producida por la bacteria V. cholerae que se encuentra en el agua o alimentos contaminados y puede causar la muerte de 50% de los infectados.

En países como Haití y República Dominicana se reporta una letalidad alta por cólera; con un número de casos de muertes de 8258 y 453 casos acumulados hasta agosto de 2013

respectivamente (2), lo anterior sumado a que el flujo de inmigrantes y visitantes entre estos países y Colombia es considerable, creemos pertinente tener en cuenta el Plan Nacional para el Control del Cólera (PNCC) que se desarrolla en Colombia desde el año 2011, en particular con relación al desarrollo de estrategias de prevención que permitan evitar la aparición de brotes o epidemias. La creación del PNCC se sustenta en epidemias que sobrevinieron con el terremoto de Haití en 2009, con lo cual el número de casos en este país y República Dominicana y por tanto, el riesgo de brotes en Centroamérica y Suramérica se incrementaron considerablemente en los últimos años. Por otro lado, aun cuando se establecen las medidas sanitarias y de prevención, la alta incidencia de EDA se convierte en un serio problema de salud pública a nivel mundial, por lo cual los esfuerzos para conseguir estrategias de manejo y control de estas infecciones son de constante interés científico.

La microbiota gastrointestinal humana (MIH) juega un papel importante en la salud del individuo dado que la composición y la actividad de los microorganismos son responsables de funciones metabólicas colectivas, de barrera e interacciones con el huésped (5,6). Trillones de microorganismos habitan el intestino humano, formando una comunidad ecológica compleja que influencia en su normal funcionamiento y en la susceptibilidad a enfermedades (7). Las BAL autóctonas del tracto gastrointestinal humano (TGH) contribuyen a beneficios nutricionales en la salud, tales como el mejoramiento de la digestión de lactosa y el alivio de ciertos tipos de diarreas (5,8,9). La MIH es objeto de numerosas investigaciones, con especial interés en la secuenciación del genoma de las bacterias que la conforman (10), es así que en la actualidad se llevan a cabo el Human Microbiome Project (HMP) en USA y el Metagenomics of the Human Intestine (metaHIT) en Europa y sus investigaciones han reportado que el organismo humano consiste en 1013 células eucariotas y 1014 microbianas,

Pazos - Inhibición de colonización intestinal por vibrio cholearae donde las más de 1000 especies bacterianas en el ambiente gastrointestinal humano (AGH) inciden en la regulación del equilibrio homeostático con el hospedero o en el desenlace de una enfermedad (7). Estos avances describen aspectos importantes de la MIH tales como su capacidad de adherirse a las proteínas del hospedero (colágeno, fibrinógeno, fibronectina) y por lo tanto, la adherencia como un prerrequisito para una persistencia de las cepas bacterianas en el AGH (11). Asimismo, señalan beneficios de la interacción entre la microbiota y el organismo hospedero, atribuidos en gran parte a la MIH, tales como la participación en la formación de la pared intestinal, la resistencia a la colonización y la producción de ácidos grasos de cadena corta. Estos metabolitos juegan un papel fisiológico importante, como el ácido acético en los músculos, corazón y cerebro, el ácido propiónico en la gluconeogénesis y el ácido butírico en la función de los enterocitos (11,12). La MIH es capaz de mejorar las interacciones con el sistema inmune de las mucosas y la degradación de xenobióticos (6,11,13). La inmensa diversidad de la MIH, la variación interpersonal y fluctuaciones temporales en la composición, especialmente durante la enfermedad y su desarrollo temprano son retos que impactarán en el control de EDAs (5,7,11).

Los probióticos definidos por la FAO/WHO (2011), como microorganismos vivos que confieren beneficios a la salud del hospedero, incluyen Lactobacillus sp. y Bifidobacterium sp., microorganismos comúnmente utilizados como probióticos junto con ciertos tipos de levaduras y otras BAL (12,14). Las características de un probiótico fueron definidas por Kamlesh et al (2011) (14). L. acidophilus se encuentra en el TGI y en ese nicho resiste la acción de ácidos orgánicos, sales biliares, la acidez y puede competir por nutrientes con microorganismos patógenos. Un estudio reporta el potencial probiótico de L. acidophilus en el control de Salmonella (15). Otro reporta su capacidad para estimular la producción de IgA en TGI, la producción de linfocitos e inhibición de la adhesión e invasión de patógenos (13).

Actualmente se estudia el efecto antioxidante de L. acidophilus y en modelos in vivo se encontró una disminución en los niveles de glucosa en la sangre de pacientes con diabetes tipo 2 (16).

En este escenario, los probióticos se constituyen en una potencial herramienta para estimular la salud humana y animal (17-19). Por tanto, esta investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto inhibitorio in vitro e in vivo de L. acidophilus1 aislado de TIH, sobre la cepa patógena de referencia V. cholerae 01 OGAWA en conejos lactantes.

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MATERIALES Y MÉTODOS Aislamiento de BAL de tracto intestinal humano. Se aisló el microorganismo de muestras de materia fecal (MF) según recomendaciones descritas en literatura especializada (18,19).

Las BAL fueron aisladas de MF de cinco infantes (I1=tres años de edad, I2=dos meses, I3=cuatro años, I4=un año e I5=trece años) las cuales fueron tomadas durante cinco días consecutivos (a,b,c,d,e) para un total de 25 muestras. Se incluyeron niños con nulos antecedentes de diarreas y sin terapia con antibióticos.

Las colonias compatibles con BAL se repicaron en agar MRS azul de anilina hasta observar cultivos axénicos. La conservación se realizó en tioglicolato más glicerol a –25°C (20).

Capacidad amilolítica de BAL. Los cultivos en agar MRS-almidón fueron expuestos a vapores de iodo bisublimado que ante el almidón viró su color a un complejo café–azulado diferenciando sus límites con halos de hidrólisis del almidón.

Al cabo de 2 min de exposición se tomaron las mediciones (21). Los resultados del diámetro del halo de hidrólisis en mm se estudiaron mediante análisis de varianza y posterior prueba de Tukey.

Se seleccionó la bacteria con mejor capacidad amilolítica y el mejor sustrato amiláceo que permitió el crecimiento óptimo de la BAL fue estandarizado en un trabajo previo (20).

Identificación de BAL con mejor capacidad amilolítica. Se realizó mediante claves taxonómicas descritas en Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (22) y pruebas bioquímicas de degradación de carbohidratos y utilización de aminoácidos en galerías API CH50 (biomérieux, Marcy l’Etoile, France).

Evaluación de parámetros de fermentación.

Para estimar la producción de biomasa se utilizó el método de recuento en placa en agar MRS. La determinación de proteínas se realizó por el método de Lowry. La determinación de azúcares y ácido láctico se realizó por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) (20).

Ensayo de antagonismo in vitro del probiótico sobre V. cholerae 01 OGAWA. Se aplicó el método de difusión en pocillos descrito por Alvarado et al (23). A la BAL en el sustrato amiláceo elegido se le realizaron 3 diluciones (10-1,10-2,10-3) en SSF y en cada una de ellas se ajustó la densidad celular del inóculo en cámara de Neubauer. Posteriormente, se vertieron 40 µl de cada suspensión celular en pozos de 7 mm de diámetro en agar MRS. Luego se cubrió con una capa de agar TCBS con 25 µl de inóculo de

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V. cholerae. Lo anterior se incubó a 35°C por 48 h, tiempo en el cual se midieron los halos de inhibición del probiótico sobre el patógeno (20). Se aplicó un diseño irrestrictamente al azar con arreglo bifactorial combinatorio y 10 replicas, donde el factor A correspondió a dos niveles de sustrato: a1=melaza con leche en polvo y a2=MRS; y el factor B correspondió a cuatro niveles de dilución del sustrato, a saber: b1=sustrato puro, b2=10-1, b3=10-2 y b4=10-3.

La unidad experimental estuvo representada por una caja petri y un total de 80 unidades experimentales. Con el objeto de uniformizar las observaciones, previo análisis del Test de Bartley y Harley, estas se transformaron mediante raíz cuadrada de X, donde X fue la observación. Los datos se sometieron a ANDEVA y prueba de Tukey para comparar las medias de los tratamientos en aquellas fuentes de variación que resultaron estadísticamente significativas, p<0.1.

Ensayo de protección del probiótico contra V. cholerae 01 Ogawa en conejos lactantes.

El ensayo in vivo se realizó tomando como modelo animal, conejos lactantes. Luego de administrar una dosis de 0.5x108 bact/ml más del 95% de los conejos desarrollaron enfermedad diarréica y la sobrevida promedio después de ser retados con el enteropatógeno fue de 13 días, tiempo de seguimiento para el ensayo de protección. Se analizaron cuatro grupos con 60 conejos lactantes cada uno. Tres grupos recibieron tratamiento para evaluar el efecto protector y en el cuarto se evaluó el efecto terapéutico del producto alimenticio. El grupo 1 recibió el fermento láctico como parte suplementaria de su dieta: únicamente leche materna; como primer control, el grupo 2 recibió el sustrato amiláceo elegido, sin fermentar; como segundo control, el grupo 3 no recibió ningún suplemento, solo fueron lactados por sus madres; y el grupo 4 recibió el fermento láctico luego de ser retado con el patógeno, para observar el efecto terapéutico del probiótico. Todos los animales fueron lactados por sus madres durante los 21 días del ensayo. Para el ensayo de protección se utilizó L. acidophilus1, cultivado en el sustrato amiláceo elegido hasta el tiempo de cosecha. El patógeno para el reto fue V. cholerae 01 OGAWA, luego de incubación en caldo TCBS a 37°C por 12 h (24).

Respecto a la alimentación con el probiótico, el grupo 1 de conejos se alimentó con éste desde el día del nacimiento hasta el día 21, con un volumen de 50 µl que contenía 1x105 bacterias durante 3 veces al día. El grupo 2 se alimentó con el sustrato amiláceo elegido en iguales dosis; el grupo 3 no recibió ningún suplemento alimenticio y el grupo 4 se alimentó con el producto probiótico a partir del mismo día que aparecieron los síntomas de diarrea, en iguales dosis que los anteriores. El reto de los

animales se realizó con una dosis previamente estandarizada del patógeno (0.5x108 bact/ml) siete días después de su nacimiento. Esta cantidad fue distribuida a su vez en 4 dosis de 250 µl cada 6 h con cánula esofágica de 1.0 mm de diámetro útil.

El poder de colonización del lactobacilo y la inhibición de la colonización del patógeno se evalúo indirectamente, practicando recuentos de colonias de bacterias lácticas y V. cholerae de heces de conejos lactantes, tanto de retados como no retados. Las muestras se tomaron diariamente durante los 13 días del ensayo pos infección.

Los datos se analizaron con el programa STATA 10.0. El plan de análisis requirió de una base de datos con las medidas de peso diario de los conejos, sobrevida y cuantificación del número de UFC de L. acidophilus1 y V. cholerae 01 OGAWA, e incluyó el test de análisis de variantes de una vía, prueba de rangos múltiples DUNCAN y un análisis de estimación de sobrevida por Kaplan-Meier. Se utilizó el test de ANOVA, para evaluar la significancia de los resultados de protección en el modelo animal.

Esta investigación fue avalada por el Comité de Ética en Investigación de la Universidad de Nariño.

RESULTADOS Aislamiento de BAL. Se obtuvieron 75 aislados en agar MRS-azul de anilina compatibles con BAL. La pureza de los cultivos se verificó con la coloración de Gram encontrando bacilos Gram positivos y catalasa negativos (20).

Capacidad amilolítica. 8 de los 75 aislados fueron positivos en la prueba de hidrólisis del almidón. La BAL con mejor capacidad amilolítica fue seleccionada luego de analizar el diámetro de los halos (en mm) de degradación de almidón mediante análisis de varianza y prueba de Tukey, p<0.5. Así, de los 8 fue seleccionado el aislado del individuo (I) de dos meses de edad (2), de la primera y quinta muestra (a) y (e), purificado a partir de la dilución 10-5 (5), identificados como I2a5 e I2e5 (Figura 1).

Identificación del aislado. Los resultados de las pruebas microbiológicas, fisiológicas y bioquímicas realizadas, permitieron identificar el aislado como Lactobacillus acidophilus1 (Tabla 1).

Elección del sustrato. Se seleccionó el medio de melaza-leche para el cultivo de L. acidophilus1, teniendo en cuenta las condiciones de crecimiento recomendadas por Heczko et al (8). Las condiciones de fermentación fueron estandarizadas previamente (20).

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Figura 1. Promedios (en mm) de los halos de hidrólisis del almidón para BAL y resultados de la prueba de Tukey. Las barras con los promedios (mm) y la misma letra (A, AB y B) no presentaron diferencias significativas entre ellas. Individuos de dos meses de edad I2a5, I2b5, I2c5, I2e5, I2e3 e I2e4, a partir de las cuales fueron aisladas las BAL. I4c5 e I4d3 BAL aisladas a partir de niños de un año de edad.

Tabla 1. Características microbiológicas, fisiológicas y bioquímicas de L. acidophilus1.

Características microscópicas

Propiedades Fisiológicas

Bacilos Gram positivos, cortos, en empalizada, no esporulados.

Temperatura óptima de crecimiento 30-36°C, tolerante de 18-40°C. Crecimiento a 45°C negativo. Tolerante al rango de pH 3.8–6.5.

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Figura 2. Cromatograma de producción de ácido láctico por HPLC. A las 24 horas de fermentación en el medio melaza-leche L. acidophilus1 produjo 67.3 g/l de ácido láctico. Fuente esta investigación.

Protección intestinal contra V. cholerae 01 OGAWA por cultivos probióticos en modelo animal. El ensayo de protección intestinal contra V. cholerae 01 OGAWA a través de la administración oral de un fermento láctico que contuvo L. acidophilus1 revistió la mayor relevancia del presente estudio y condujo a probar la hipótesis de protección intestinal in vivo (Figura 3).

Homofermentativa. Altamente productora de ácido láctico.

Metabolismo

Producción de ácido acético, succínico, fórmico, propiónico y cítrico.

Prueba de NaCl 10% negativa; glucosa, sacarosa, trehalosa, lactosa, manosa, esculina, maltosa y salicina positiva; gelatina, caseína, rafinosa, ramnosa, xilosa y arabinosa negativas.

Evaluación de parámetros de fermentación de L. acidophilus1 en el medio melaza-leche. En este sustrato amiláceo se obtuvo alta producción de ácido láctico (67.3 g/l) y un alto rendimiento de ácido láctico en relación con el consumo de azúcares (Figura 2). Al estimar la masa celular y la producción de proteína se determinó el tiempo de cosecha a las 14 h, con 75x108 UFC de L. acidophilus1/ml y una concentración proteica de 14.5 g/l.

Ensayo de inhibición antagónica in vitro. Los resultados del análisis de varianza y la prueba de Tukey (p<0.1) para los halos de inhibición, permitieron determinar que el fermento láctico inhibe el crecimiento in vitro del patógeno V. cholerae a una densidad celular de 35x106 bact/ ml presente en la dilución 10-1, respecto al sustrato puro (sin diluir) y a las diluciones 10-2 y 10-3.

Figura 3. Ganancia de peso promedio en conejos retados con V. cholerae según tipo de alimento. En los tres grupos de conejos retados con el patógeno se observan diferencias en el peso promedio.

El grupo con mayor ganancia en peso es el tratado con probióticos (cuadros rojos) 130.7 g, luego el grupo tratado con sustrato amiláceo sin BAL (cuadros verdes) 100.2 g y por último el grupo control, alimentado solamente con leche materna (cuadros azules) con 50.3 g, al final del ensayo, p=0.00.

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Estos resultados significarían que la administración oral de probióticos está relacionada con una mejor nutrición de los animales, evidenciado por la ganancia en peso del grupo tratado con el fermento láctico.

Por otra parte, hubo una pérdida de peso promedio, a los 7 días de nacidos, en dos grupos de conejos inoculados con V. cholerae 01 OGAWA, los conejos infectados con síntomas de diarrea perdieron peso hasta un día posterior al tratamiento con probióticos (Figura 3). Así mismo, hubo una ganancia gradual de peso promedio en el grupo tratado con probióticos, respecto al grupo de conejos lactados (Figura 3, 4).

Figura 4. Desviaciones estándar (DS) y diferencias promedio de pesos de conejos pre y post reto con V. cholerae según tratamientos. La DS del promedio de peso de conejos alimentados con probióticos (rojo o verde) y las DS de los lactados (azul o fucsia). g.=gramos. Pre reto: Día 7 del ensayo. Pos reto: Día 21 del ensayo.

N=número de individuos vivos.

Del análisis pre y post reto según tratamientos, se puede decir que hubo una menor ganancia promedio de peso antes del reto p<0.05 en los grupos de animales que no recibieron probióticos (DS azul o fucsia). Las diferencias de pesos promedio a los 21 días del ensayo fueron estadísticamente significativas, p<0.05. Después del reto el beneficio del probiótico se observó en los animales protegidos y retados (DS en rojo), pues tuvieron ganancia de peso similar al grupo control (DS en fucsia), de ésta manera se logró evidenciar que la ausencia del reto y la protección con probióticos favorecen el crecimiento y desarrollo de los animales significativamente.

El efecto terapéutico del probiótico se manifestó en la recuperación y la ganancia de peso observada luego del proceso infeccioso, en comparación al grupo lactado (control). Los promedios de pesos al final del ensayo fueron 70.8 g y 50.3 g para los grupos tratados y no tratados con probióticos respectivamente.

Análisis de sobrevida. La protección intestinal del probiótico contra V. cholerae fue demostrada en el análisis de sobrevida ( F i g u ra 5 ) . S e p u e d e o b s e r va r q u e l o s conejos enfrentados con el patógeno y sin recibir probiótico (lactados) tuvieron una probabilidad de sobrevida menor respecto al grupo de animales retados con el patógeno y simultáneamente alimentados con probióticos, cuya probabilidad de sobrevida fue mayor.

Figura 5. Estimación de sobrevida por Kaplan-Meier en conejos retados con V. cholerae según tratamiento. Se observa a la derecha de la figura una linea escalonada que describe la mortalidad de los animales retados y no alimentados con probióticos, estos tienen un probabilidad de sobrevida de 0.25 a los 21 dias, en comparación a 0.95 de probabilidad de los conejos retados y alimentados con probióticos.

Evaluación del poder de colonización de L. acidophilus1 y V. cholerae 01 OGAWA en heces. En la figura 6 se observa al día ocho o un día post-reto la aparición de un pico de infección por V. cholerae 01 OGAWA (cuadro verde, Figura 6), coincidiendo con los síntomas de diarrea y pérdida de peso observados entre el octavo y décimo día del ensayo (cuadros verdes y azules, Figura 3).

La colonización por V. cholerae 01 OGAWA solo se manifestó en los recuentos de colonias promedios de las muestras de heces de los conejos retados dos días post-reto (cuadro verde), sugiriendo que existe una protección contra la colonización de V. cholerae 01 OGAWA en los siguientes días del ensayo en el grupo tratado con probiótico, lo que no sucedió con el grupo control (lactados), en los cuales los recuentos de UFC V. cholerae 01 OGAWA/g de heces en los siguientes días post inóculo tuvieron su expresión máxima en el día 9 con 1.2x107 UFC/g de heces y cayeron gradualmente hasta el día 11.

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(5) se debe posiblemente a que con la edad el cambio en la dieta, en el metabolismo y la exposición a infecciones concomitante con el uso de antibióticos, induce un aumento en la variabilidad del microbioma intestinal nativo (7,12,26).

Figura 6. Recuento de L. acidophilus y V. cholerae 01 OGAWA en coprocultivos de conejos alimentados con probióticos. Los cuadros rojos son UFC/g de heces de L. acidophilus1 del grupo alimentado con probiótico a los 7 días de retado con V. cholerae. Los cuadros azules son UFC/g de heces de L. acidophilus1 del grupo alimentado con probiótico pero no retado con V. cholerae; el cuadro verde son UFC/g de heces de V. cholerae del grupo control a los 7 días de retado con V. cholerae y los cuadros amarillos son UFC/g de heces de V. cholerae del segundo grupo control lactado pero no retado con V. cholerae.

DISCUSIÓN L o s p r o b i ó t i c o s s e u t i l i z a n p a ra t ra t a r enfermedades gastrointestinales, incluyendo enfermedades inflamatorias del intestino, síndrome del intestino irritable y EDAs (25).

Los mecanismos por los cuales los probióticos protegen contra las enfermedades intestinales incluyen la optimización del equilibrio microbiano, exclusión competitiva de patógenos, promoción de la secreción de moco, producción de bacteriocinas, mejora de la integridad de la barrera y maduración de la inmunidad intestinal (6,25).

En humanos, la administración del probiótico L. acidophilus, reduce significativamente la incidencia de la enterocolitis en recién nacidos (26). Un mecanismo importante incluye la función de barrera, garantizada por el mantenimiento y estabilidad de las uniones celulares. Esta BAL tiene efecto anti-inflamatorio y citoprotector, más específicamente en EDA donde se puede constituir en una nueva herramienta de prevención en la población vulnerable, como recién nacidos y prematuros (19,26).

Las BAL aisladas con capacidad amilolítica se obtuvieron en mayor proporción de niños recién nacidos porque en niños de más de un año no fue posible seleccionar BAL con las características requeridas. Este hallazgo según Gibson et al

L. acidophilus1 se puede considerar un microorganismo probiótico dado que en el presente estudio se evidenció que su consumo puede proporcionar beneficios en la salud de los animales, además es resistente a la acidez del TGI y cuando se ingiere es capaz de sobrevivir a su paso por el TGI dado que fue recuperado a partir de heces frescas de conejos lactantes tratados con el alimento probiótico. Así, todas estas características se ajustan a las descritas por Kamlesh et al (14) y Khani et al (19) para un microorganismo ser considerado como probiótico.

Los ensayos de fermentación permitieron conocer la respuesta metabólica de L. acidophilus1 a diferentes fuentes de carbono y nitrógeno (20).

Los azúcares consumidos del medio de cultivo favorecen la producción de ácido láctico en altas concentraciones, este comportamiento permitió determinar el carácter homofermentativo de la bacteria L. acidophilus1 y su potencial industrial para la producción de este metabolito.

Se encontró que L. acidophilus1 inhibe el crecimiento in vitro del patógeno V. cholerae a una densidad celular de 35x106 bact/ml presente en la dilución 10-1 respecto al sustrato puro y a las diluciones 10-2 y 10-3, resultados concordantes con un estudio previo (16).

La sobrevida de los conejos infectados con V. cholerae del grupo tratado con probiótico fue mayor respecto a los grupos control, pues así lo confirma el análisis de sobrevida p<0.05.

Se puede concluir entonces que el probiótico tiene un efecto protector en conejos contra el patógeno V. cholerae 01 OGAWA. El beneficio del probiótico se observa en forma contundente en los animales protegidos y retados, pues tuvieron ganancia de peso similar al grupo control (lactado), lo que sugiere que la ausencia del reto y la protección con probióticos favorecen el crecimiento y desarrollo de los animales, resultados que concuerdan con los hallazgos de Ritchie et al (27). El efecto protector o profiláctico del probiótico es mucho más evidente que el efecto terapéutico pues luego de la estimación de sobrevida por Kaplan-Meier, sólo el 10% de los conejos murieron, en comparación del 60% observado cuando se hizo uso del probiótico pos-reto. La medida terapéutica tomada en el estado álgido de la infección diarreica, se comportó de manera positiva, manifestándose

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en la inhibición de la colonización de V. cholerae, similar al hallazgo de Lee et al (28) evidenciado en la desaparición de la diarrea, resolución de la infección, ganancia promedio de peso de los animales, más no en la restauración del equilibrio de la microbiota láctica endógena, en contraste con la microbiota encontrada por Combes et al (34) y Chamorro et al (29) en conejos recién nacidos luego de la administración de formulas dietarias.

Nuestros hallazgos sugieren en un futuro el uso de L. acidophilus1 para restablecer o mantener el equilibrio de TGI luego del contacto con V. cholera y controlar la infección, en contraste a los recientes reportes sobre el uso de BAL como L. lactis para la elaboración de vacunas de administración oral, que potencia la respuesta inmune de la mucosa e inmunidad sistémica específica tipo IgA contra el patógeno V. cholerae 01(6,30,31) y la comprensión de cómo el sistema inmune adaptativo hace frente al notable número y diversidad de microbios que colonizan el TGI, este probiótico es muy prometedor para establecer nuevos enfoques de modulación de redes inmunes para tratar y prevenir la enfermedad (6).

Los resultados obtenidos en ratones permiten recomendar la administración oral de probióticos en humanos en riesgo de infección o incluso en situaciones de epidemias, debido al efecto altamente protector observado (30,32).

En el futuro, si se tiene en cuenta que la interacción de las toxinas bacterianas con receptores de la superficie de las células hospederas (31) -tales como el receptor de Lipopolisacárido LPS- es un paso indispensable en la patogénesis del cólera, el bloqueo de tales interacciones es una potencial y atractiva estrategia terapéutica que conlleva al diseño y caracterización de la expresión de probióticos recombinantes, simulando la unión entre el receptor GM1 (galactomanósido 1) y Ctx (toxina cólera) e infectando ratones para comprobar los cambios con V. cholerae virulento.

Sin embargo, es de tener en cuenta en el diseño y aplicación de vacunas o métodos profilácticos, que para V. cholerae se han documentado elementos genéticos móviles, integrones,

fagos, islas de patogenicidad y otros elementos genéticos del “mobiloma” (10,33) como resultado de los eventos de evolución genómica y procesos de transferencia lateral, que han conllevado a la emergente aparición de variantes de éste patógeno con capacidad de adaptación y poder patogénico incrementados, razón por la cual las investigaciones destinadas al diseño y uso de microorganismos probióticos u otras herramientas profilácticas o terapéuticas deberán tener en cuenta estos mecanismos. Los microorganismos probióticos son una herramienta promisoria para el equilibrio de la MIH, permite el subyacente control de V. cholerae, pues su capacidad de producir enzimas y activación de complejas vías metabólicas puede ayudar a generar ambientes hostiles para el patógeno.

En conclusión este trabajo encontró que existe una protección de la colonización de V. cholerae 01 OGAWA en el grupo de conejos lactantes tratados con L. acidophilus. Se pudo comprobar la hipótesis de estudio pues la sobrevida del grupo de conejos tratado con probióticos fue mayor a la del grupo lactado por sus madres y alimentado con el sustrato puro; entonces L. acidophilus tiene un efecto protector en conejos contra la cepa patógena de V. cholerae 01 OGAWA. Una perspectiva de interés es comprender cómo la MIH afecta a la salud y la enfermedad y la biología de sus relaciones con L. acidophilus, de tal manera que propicie un cambio en la concepción de patógenos individuales como únicos agentes causales, hacia un enfoque ecológico teniendo en cuenta la comunidad y las condiciones del micro-nicho en su conjunto (6,7,10).

Agradecimientos A la Vicerrectoría de Investigaciones-VIPRI, de la Universidad de Nariño por la financiar el trabajo. Al Departamento de Biología. Al Grupo de Investigación Salud Pública de la Universidad de Nariño. A las Biólogas con énfasis en Microbiología. Nubia Yandar y Sofía Guzmán de la Universidad de Nariño. Al Profesor Luis E Bravo de la Universidad del Valle.

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REFERENCIAS 1. World Health Organization WHO. Number of reported cholera cases. Global Health Observatory (GHO); 2013.

2. INS. Boletín Epidemiológico No 35. Bogotá, Colombia: Instituto Nacional de Salud INS; 2013. URL Disponible en: http://www.ins. gov.co/boletin-epidemiologico/Boletn%20 Epidemiolgico/2013%20Boletin%20 epidemiologico%20Semana%2035.pdf 3. Nomoto K. Prevention of Infections by Probiotics. Review. J Biosci Bioeng 2005; 100(6):583-592.

4. Binns C, Lee KM. The use of probiotics to prevent diarrhea in young children attending child care centers: A review. J Exp Clin Med 2010; 2(6):269-273.

5. Gibson GR, Probert HM, Loo JV, Rastall RA, Roberfroid MB. Dietary modulation of the human colonic microbiota: updating the concept of prebiotics. Nutr Res Rev 2004; 17(2):259-275.

6. Maynard CL, Elson CO, Hatton RD, Weaver CT. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature 2012; 489(7415):231-241.

7. Lozupone C, Stombaugh J, Gordon J, Jansson J, Knight R. Diversity, stability and resilience of the human gut microbiota.

Nature 2012; 489(7415):220-230.

8. Heczko PB, Strus M, Kochan P. Critical evaluation of probiotic activity of lactic acid bacteria and their effects. J Physiol Pharmacol 2006; 57(Suppl 9):5-12.

9. Ljungh A, Wadström T. Lactic acid bacteria as probiotics. Curr Issues Intest Microbiol 2006; 7(2):73-89.

10. Weinstock GM. Genomic approaches to studying the human microbiota. Nature 2012; 489(7415):250-256.

11. Aureli P, Capurso L, Castellazzi AM, Clerici M, Giovannini M, Morelli L, et al. Probiotics and health: An evidence-based review.

Pharmacol Res 2011; 63(5):366-376.

12. Tr e m a r o l i V, B ä c k h e d F. F u n c t i o n a l interactions between the gut microbiota and ho s t me t ab o l i s m. N at ure 2012; 489(7415):242-249.

13. Galdeano CM, de Leblanc AM, Carmuega E, Weill R, Perdigón G. Mechanisms involved in the immunostimulation by probiotic fermented milk. J Dairy Res 2009; 76(4):446-454.

14. Kamlesh S, Basavaraj K, Ajay K, Vidhi T. Probiotics: A review. Asian Pac J Trop Biomed 2011; S287-S290.

15. Castillo NA, Moreno A, Maldonado GC, Perdigón G. Probiotics: An alternative strategy for combating salmonellosis Immune mechanisms involved. Food Res Int 2012; 45(2):831–841.

16. Chandrakant A, Marcia P, Duane G, Kalidas S. In vitro bioassay based screening of antihyperglycemia and antihypertensive activities of Lactobacillus acidophilus1 fermented pear juice. Innov Food Sci Emerg Technol 2012; 13(4):221–230.

17. Quigley EM. Gut microbiota and the role of probiotics in therapy. Curr Opin Pharmacol 2011; 11(6):593-603.

18. Guarner F, Khan AG, Garisch J, Eliakim R, Gangl A, Thomson A, et al. World gastroenterology organization global guidelines: probiotic and prebiotics. J Clin Gastroenterol 2012; 46(6):468-481.

19. Khani S, Hosseini HM, Taheri M, Nourani MR, Fooladi A. Probiotics as an alternative strategy for prevention and treatment of human diseases: A review. Inflamma Allergy Drug Targets 2012; 11(2):79-89.

20. Guerrero M, Guzmán S, Yandar M, Pazos A. Efecto inhibitorio de Lactobacillus acidophilus sobre el enteropatógeno V. cholerae 01 Ogawa in vitro. Universidad y Salud 2002; 1(3):8-14.

21. De Roissart IH, Editors. Bacteries Lactiques.

4th Ed. Montpellier: IRD; 1995.

22. Sneath P, Holt J.G. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Vol III. 9th Ed. Estados Unidos: Williams and Wilkins Co; 1994.

3698

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

23. Alvarado CC, Díaz CG. Efecto antagónico de Lactobacillus plantarum aislado de pastizal de finca lechera. RESPYN [en linea]. 2009; 10(1). URL Disponible en: http://www. respyn.uanl.mx/x/1/articulos/articulo_ lactobacillus_plantarum.htm.

29. Chamorro S, de Blas C, Grant G, Badiola I, Menoyo D, Carabaño R. Effect of dietary supplementation with glutamine and acombination of glutamine-arginine on intestinal health in twenty-five-day-old weaned rabbits. J Anim Sci 2010; (1):170-180.

24. CDC’s Global Disease Detection (GDD) Manual: Rapid Diagnostic Test for Cholera.

2011.

30. Zamri HF, Shamsudin MS, Rahim RA, Neela V. Oral vaccination with Lactococcus lactis expressing the Vibrio cholerae Wzm protein to enhance mucosal and systemic immunity.

Vaccine 2012; 30(21):3231–3238.

25. Gareau MG, Sherman PM, Walker WA. Probiotics and the gut microbiota in intestinal health and disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2010; 7(9):503-514.

26. Sheng S, Yueyue Y, Guo Y, He S, Haikaeli M, Hoenig J, et al. Synergistic Protection of Combined Probiotic Conditioned Media against Neonatal Necrotizing EnterocolitisLike Intestinal Injury. PLoS One 2013; 8(5):6-19.

27. Ritchie JM, Rui H, Bronson RT, Waldor MK. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. MBio 2010; 18(1):1-10.

28. Lee DJ, Drongowski RA, Coran AG, Harmon CM. Evaluation of probiotic treatment in a neonatal animal model. Pediatr Surg Int 2010; 16(4):237-242.

31. Linares DM, Geertsma ER, Poolman B. Evolved Lactococcus lactis strains for enhanced expression of recombinant membrane proteins. J Mol Biol 2010; 401(1):45–55.

32. Focareta A, Patón JC, Morona R, Cook J, Patona AW. Recombinant Probiotic for Treatment and Prevention of Cholera.

Gastroenterol 2006; 130(6):1688-1695.

33. Safa A, Nair GB, Kong RY. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol 2010; 18(1):46-54.

34. Combes S, Michelland RJ, Monteils V, Cauquil L, Soulié V, Tran NU, et al. Postnatal development of the rabbit caecal microbiota composition and activity. FEMS Microbiol Ecol 2011; 77(3):680-689.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3699-3707, 2013.

ORIGINAL

Caracterización de un modelo de diabetes tipo 2 en ratas Wistar hembra Characterization of a type 2 diabetes model in female Wistar rats M Consuelo Figueroa G,1 M.Sc, Ismael H Pérez H,2 M.Sc, Ricardo Mejía Z,2* Ph.D. Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Circuito Interior S/N Av. Universidad No. 3000. Del Coyoacán. México, DF. 2Unidad de Biomedicina FESIUNAM. Av. de los Barrios No. 1, Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, México. *Correspondencia: rmejia@ campus.iztacala.unam.mx 1

Recibido: Noviembre de 2012; Aceptado: Marzo de 2013.

RESUMEN Objetivo. Caracterizar un modelo de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) en ratas hembra. Materiales y métodos. Se utilizaron 20 ratas Wistar hembra de 48 horas de edad; a 10 se les administró estreptozotocina (STZ), [135 mg/kg de peso corporal] en 50 µl de amortiguador de citratos a pH de 4.5, vía intraperitoneal (inducidos) y a 10 se les administró 50 µl del amortiguador (testigo).

Resultados. Los animales inducidos presentaron glicemias de 7.8±2 mmol/L (52.9% más que el testigo; p<0.005) y un peso de 334.4±12 g (51.6 g menor que el testigo; p<0.05) al final del estudio.

La concentración de colesterol fue del doble en el grupo inducido. La concentración de triglicéridos no presentó diferencia entre grupos al primer mes de edad, pero al segundo fue 50% mayor en los animales inducidos (p<0.05). La concentración de hemoglobina glicada fue de 4.3% en los testigos y de 5.9% en animales inducidos (p<0.05). La curva de tolerancia mostró alteración en el grupo inducido con glicemias superiores a 7.4 mmol/L hasta los 240 min. Conclusiones. De acuerdo con los parámetros de las pruebas comúnmente utilizadas para el diagnóstico y control de la diabetes en humanos, los valores obtenidos en el presente estudio convalidan el desarrollo de un modelo de DM2 en ratas hembras mediante el uso de STZ. Palabras clave: Colesterol, hiperglicemia, rata (Fuente: DeCS).

ABSTRACT Objective. Characterization of a type 2 diabetes mellitus (DM2) model in female rats. Materials and methods. 20, 48 hour-old wistar female rats were used; 10 were intraperitoneally injected with streptozotocin (STZ) [135 mg/kg body weight] in 50 μl citrate buffer pH 4.5 (induced group) and 10 were injected with 50 μl of citrate buffer (control group). Results. The induced group had average glycemias of 7.8±2 mmol/L (52.9%; p<0.005) and a body weight of 334.4±12 g (51.6 g lower than the control group; p<0.05) at the end of the treatment. The cholesterol concentration was two-fold higher in the induced group. Triglyceride concentration was not different during the first month, but it

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was 50% higher on the second month for the induced group (p<0.05). The concentration of glycated hemoglobin was 4.3% for the control group and 5.9% for the induced group (p<0.05). The glucose tolerance curve was altered in the induced group with blood glucose concentrations in diabetic animals over 7.4 mmol/L until 240 min. Conclusions. According to the parameters currently used for diagnostic and control of diabetes in humans, the results displayed in this study support the development of a DM2 model in female rats through the use of STZ. Key words: Cholesterol, Hyperglycemia, rat (Source: DeCS).

INTRODUCCIÓN La Organización Mundial de la Salud (OMS) calcula que en el mundo hay más de 250 millones de personas con diabetes, de las cuales el 90% de los pacientes son diagnosticados como Tipo 2; es probable que esta cifra aumente a más del doble en 2030 y se estima que un 30% de la población con DM2 no ha sido diagnosticada (1). La diabetes se clasifica en las siguientes categorías: Diabetes Mellitus Tipo 1 (DM1), producida por una deficiencia absoluta en la secreción de insulina; Diabetes Mellitus Tipo 2 (DM2), causada por una combinación de múltiples factores, como resistencia a la acción de la insulina y/o una inadecuada respuesta compensatoria del páncreas; diabetes gestacional (DMG), se presenta por alteraciones hormonales durante el embarazo y diabetes idiopática (transitoria) (2-3).

De acuerdo con la Asociación Americana de Diabetes (ADA, por sus siglas en inglés) y la OMS, los criterios para el diagnóstico de la diabetes mellitus son: a) la presencia de síntomas clásicos (polidipsia, polifagia, poliuria y pérdida de peso), con el hallazgo casual, sin considerar el tiempo pasado desde la última comida, de un nivel de glucosa en sangre (glucemia) por encima de 200 mg/dl (11.1 mmol/L); b) concentración de glucosa en ayunas superior a 126 mg/dl (7 mmol/L) y c) concentraciones de glucosa por encima de 200 mg/dl (11.1 mmol/L) en un análisis de dos horas posterior a una sobrecarga oral de glucosa de 75 g (test realizado según los criterios de la OMS). El hallazgo aislado de cualquiera de estos criterios no es suficiente para establecer el diagnóstico (2).

De igual manera se pueden evaluar algunos otros indicadores de alteraciones en el metabolismo de carbohidratos y lípidos que concuerdan con el desarrollo de la enfermedad como son: concentraciones sanguíneas alteradas de colesterol, triglicéridos, péptido C, el índice de resistencia a la insulina (HOMA-IR; homeostatic model assessment) y hemoglobina glicada (3).

La fisiopatología de la DM2 es compleja e implica factores ambientales (el sedentarismo, la edad,

bajo peso al nacer y dietas hipercalóricas que conducen a la obesidad) y genéticos. Existen tres alteraciones constantes en este padecimiento: resistencia a la acción de la insulina en los tejidos periféricos (músculo, tejido adiposo y especialmente hígado); secreción alterada de la insulina en respuesta al estímulo de glucosa y aumento en la producción de glucosa hepática (3). La resistencia periférica a la insulina se presenta con una fase preclínica (en estadio de tolerancia alterada a la glucosa), además una elevación moderada de la concentración de glucosa en sangre y elevadas concentraciones de colesterol y triglicéridos (4,5). Con frecuencia este tipo de diabetes es diagnosticada varios años después de iniciada ya que en sus primeras etapas es casi asintomática (3).

El uso de los animales como modelos de experimentación en el estudio de la fisiopatología de la diabetes ha permitido entender algunas de sus causas y consecuencias, además de obtener avances en el tratamiento y control de este síndrome, aun cuando los signos y alteraciones no se reproducen con exactitud. En la literatura se han reportado modelos experimentales de diabetes en diferentes especies que van desde el perro, gato, conejo, cerdo, borrego, ratón hasta la rata (4,6). En animales de laboratorio, específicamente en la rata, la diabetes se puede presentar de forma espontánea o inducida experimentalmente por distintos métodos (710). En la inducción experimental de diabetes se utilizan sustancias químicas que destruyen en forma selectiva las células β del páncreas como son la alloxana (Alx) y la estreptozotocina (STZ). La inducción de la DM1 se realiza en animales adultos con dosis de 40 mg de Alx/kg de peso corporal (10) o de 50-60 mg de STZ/kg de peso (8,11). Para el desarrollo de la DM2, se pueden utilizar neonatos de 1 a 5 días de vida y concentraciones de STZ entre 100 y 200 mg/kg de peso corporal (9,12).

Existe abundante información acerca de las características y datos clínicos de la DM1 en ratas de laboratorio (7-8, 10); sin embargo, casi todos ellos han sido desarrollados en machos.

Figueroa - Caracterización de un modelo de diabetes en ratas wistar Por otra parte, existe menos información de modelos experimentales en animales para la DM2 y prácticamente no se encuentran datos de ninguna de las dos categorías en hembras. En los modelos experimentales con animales se usa en forma convencional a los machos ya que el comportamiento de ciertos parámetros a lo largo del tiempo tiene menos fluctuaciones debido a que estos no presentan estados fisiológicos como el ciclo estral y el menstrual, la gestación y la lactancia, en los que cambios hormonales provocan ajustes en el metabolismo.

El objetivo de este trabajo fue caracterizar un modelo de diabetes mellitus tipo 2 en ratas Wistar hembras.

MATERIAL Y MÉTODOS Animales de experimentación. Se utilizaron 10 ratas Wistar hembras de 9 semanas de edad, con un peso promedio de 250 g, albergadas en forma individual en jaulas de polisulfonato con sistema de microaislamiento, con alimento y agua ad libitum y fotoperíodo de 12 horas luz y 12 obscuridad, obtenidas del Bioterio de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala-UNAM. Se realizó frotis vaginal a los animales para diagnóstico de estro, aquellos que resultaron positivos se pusieron con machos sanos de la misma estirpe toda la noche para su apareo.

Durante la mañana se realizó diagnóstico de apareo mediante frotis vaginal.

Tratamiento. Se seleccionaron ratas hembras de 48 a 72 horas de edad, obtenidas en pares (con lo que cada animal sometido a tratamiento tenía su control de la misma camada) en un sistema completamente aleatorio. A 10 ratas se les indujo diabetes tipo 2 mediante la administración vía intraperitoneal de 135 mg de STZ/kg de peso corporal en 50 μl de amortiguador de citratos a pH de 4.5 y 10 fueron utilizadas como grupo testigo con la administración de 50 μl del mismo amortiguador. Los animales fueron mantenidos con la madre hasta el destete (cuatro semanas de edad) y posteriormente albergadas en grupos de 3 animales, en cajas de polisulfonato con microambiente y fotoperíodo de 12 horas luz, 12 horas oscuridad a 22°C en promedio, con alimento (2040 de Harlan®) y agua ad líbitum. Se tomó como criterio de inclusión en el grupo tratado que los animales tuvieran una concentración de glucosa sanguínea menor a 200 mg/dl (11.11 mmol/l) en ayuno de 8 horas y menor de 110 mg/ dl (6.1 mmol/L) en el grupo testigo. Los animales fueron mantenidos hasta las 16 semanas de edad, siguiendo los lineamientos de bioética marcados en la norma oficial mexicana (NOM

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062-ZOO-1999) (13) y al término del estudio los animales fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico, vía intraperitoneal como lo marca la norma.

Cuantificación de glucosa. Se determinó glucosa (una vez por semana) a partir de la cuarta semana y hasta las 16 semanas de edad, con un equipo Accutrend® de Roche.

Cuantificación de triglicéridos y colesterol.

Las cuantificaciones de colesterol y triglicéridos en sangre se realizaron una vez por mes a partir de la cuarta semana hasta la semana 16, con un equipo Accutrend® de Roche.

Cuantificación de hemoglobina glicada. La cuantificación de hemoglobina glicada se realizó a las 16 semanas de edad con un equipo para medición instantánea A1CNow+ de Bayer®.

Curva de tolerancia a la glucosa (CTG). Se realizó a las 16 semanas de edad, mediante la administración oral (con sonda esofágica) de 3 g de dextrosa/kg de peso corporal en 3 ml de agua; previa medición de los niveles basales de glucosa sanguínea. Posterior a la administración de la dextrosa, se realizaron mediciones de las concentraciones de glucosa sanguínea, cada 30 minutos, hasta 240 minutos.

Cuantificación de peso corporal. La medición del peso corporal se realizó (una vez por semana) a partir de la cuarta semana y hasta las 16 semanas de edad, con una báscula granataria.

Para la realización de las pruebas se mantuvo a los animales en ayuno durante 8 horas y las mediciones se realizaron a las 18:00 horas.

Análisis estadístico. Los resultados obtenidos fueron analizados por medio de un análisis de varianza (ANOVA) de una vía y prueba de Tukey para identificar diferencias entre tratamientos (p<0.05), usando el software JMP (Versión 7.0) (14).

RESULTADOS Los animales inducidos a DM2 en este estudio presentaron glicemias por arriba de los parámetros marcados como normales en el 75% de los tiempos evaluados, mientras que los animales del grupo testigo, el 100 % de las ocasiones se mantuvieron por debajo del límite máximo considerado como normal (6.1 mmol/L), (Figura 1). La concentración promedio de glucosa en el grupo testigo fue de 5.1±0.88 mmol/L, mientras que los animales inducidos

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a DM2 tuvieron concentraciones promedio de 7.8±2 mmol/L, observándose diferencia estadísticamente significativa entre tratamientos (p<0.05) en el período de 80 a 105 días de edad.

Figura 1. Comportamiento Tiempo/tratamiento de la concentración de Glucosa (mmol/l) en ratas inducidas a diabetes tipo 2 (STZ 135 mg/ kg) y su control no inducido. * p < 0.05.

En la figura 2 se presentan las curvas de crecimiento del grupo inducido a diabetes y su testigo. Se puede observar que el peso de las ratas testigo (386±18 g) es mayor que el de las ratas inducidas a DM2 (334.4±12 g) a las 16 semanas de edad. La ganancia diaria de peso de los animales diabéticos durante el estudio es menor que la del grupo testigo, encontrando que en el 60% de los momentos estudiados existe diferencia estadísticamente significativa entre tratamientos (p<0.05).

Figura 2. Curva de crecimiento en ratas inducidas a diabetes tipo 2 y su control. * p < 0.05.

La concentración de colesterol entre el primer y cuarto mes de edad en los animales del grupo testigo (entre 85 y 98 mg/dl) es 50% menor que en los inducidos a diabetes (entre 169 y 178 mg/dl), existiendo diferencia estadísticamente significativa entre tratamientos (p<0.05).

(Figura 3).

Figura 3. Concentración de Colesterol en ratas inducidas a diabetes tipo 2 y su control. * p <0.05.

En la figura 4 se presentan los resultados de la concentración de triglicéridos. Se puede observar que no existe diferencia estadísticamente significativa entre grupos en el primer mes de vida (83.2±8.2 mg/dl en testigos vs. 90.3±7.7 mg/dl en inducidas). A partir del segundo mes de edad existe una tendencia a incrementar la concentración en ambos grupos, donde siempre es significativamente (p<0.05) mayor la concentración de triglicéridos en las ratas inducidas (123.8±12.1, 125.8±6.5 y 235±17 mg/dl a 2, 3 y 4 meses respectivamente en el grupo testigo y de 187±18.6, 199.8±25 y

Figura 4. Concentración de Triglicéridos en ratas inducidas a diabetes tipo 2 y su control. * p < 0.05.

Figueroa - Caracterización de un modelo de diabetes en ratas wistar 288±15.8 mg/dl a 2, 3 y 4, meses en el grupo inducido).

E n e l p r e s e n t e e s t u d i o s e o b s e r va r o n concentraciones de hemoglobina glicada de 4.3% en los animales testigo y de 5.9% en animales inducidos a diabetes Tipo 2, con diferencia estadísticamente significativa (p<0.05) (Figura 5).

Figura 5. Concentración de Hemoglobina glicada en ratas inducidas a diabetes tipo 2 y su control. * p < 0.05.

En la curva de tolerancia a la glucosa (CTG), el grupo testigo muestra una concentración de 5.1 mmol/L al inicio de la prueba, llega a valores máximos (9.7 mmol/L) a la media hora después de la descarga oral de dextrosa y regresa a niveles basales a los 60 minutos. Los animales inducidos a diabetes alcanzaron concentraciones pico de 19.3 mmol/L a los 60 minutos y un retorno a 7.4 mmol/L hasta los 240 minutos, sin alcanzar el valor inicial de 6.6 mmol/L, como se observa en la figura 6.

Figura 6. Curva de tolerancia a la glucosa en ratas inducidas a diabetes tipo 2 y su control. * p < 0.05.

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DISCUSIÓN El comportamiento aparentemente errático de la concentración de glucosa sanguínea a través del tiempo en las ratas inducidas a DM2 con STZ durante el estudio es una respuesta lógica a las necesidades de readaptación metabólica del individuo y los sistemas de contrarregulación hormonal de la glucosa (15). En pacientes humanos con diabetes tipo 2 no controlada, son comunes los hallazgos de glicemias que pueden ir de valores tan bajos como 2.77 mmol/L a valores que sobrepasan los 22.2 mmol/L. Esta condición es una de las principales características que indican una mala utilización y/o síntesis de la insulina (16-18), aunque es necesaria la confirmación a través de pruebas como HOMA-IR, concentración de insulina y péptido C en plasma.

Se conoce que la STZ actúa específicamente sobre las células β del páncreas utilizando al transportador de glucosa (GLUT 2) para entrar a la célula, causando daño y muerte de esta por la polirribosilación del DNA y la generación de radicales a través de la vía xantina-oxidasa (10).

En este trabajo se utilizó una concentración de STZ de 135 mg/kg de peso corporal, suficiente para disminuir a casi su totalidad las células β– pancreáticas. Sin embargo, en animales neonatos el páncreas tiene la capacidad de regenerar y/o diferenciar parcialmente la población celular, lo que resulta en un animal adulto con hiperglucemias moderadas. Lo anterior ha sido demostrado por nuestro grupo de trabajo mediante la utilización de técnicas de inmunohistoquímica que evidencian la disminución de la población de células b, estos datos fueron corroborados por la baja concentración de insulina en sangre y episodios de hiperglicemia característicos de DM2 (19).

Probablemente la dispersión de los datos de las concentraciones de glucosa sanguínea observados en la figura 1, se relaciona con los procesos de homeorresis utilizados para mantener la glicemia en condiciones estables. Sin embargo, la glucotoxicidad y la lipotoxicidad permanentes continúan causando daño lo que lleva nuevamente al aumento de la glucemia.

La DM2 se diagnostica por la presencia de los signos y síntomas clásicos, glucemia elevada en ayunas y/o curva de tolerancia a la glucosa alterada. En pacientes con sintomatología de diabetes la ADA especifica que sólo se necesita una glicemia mayor a 6.1 mmol/L en ayuno de 8 horas, o de 11.1 mmol/L en forma aleatoria para su confirmación. La OMS da como positivos a aquellos pacientes que en forma repetida dan como resultado una concentración de glucosa sanguínea mayor a 6.1 mmol/L en ayuno de 8 horas (2, 20).

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La concentración de glucosa sanguínea en los animales con DM2 es 52.9% más alta que la reportada en la literatura (5.27 mmol/L) (2). Los valores promedio en ratas con DM2 reportados por diversos autores van de 6.6 a 19.4 mmol/L, dependiendo del manejo nutricional y estado fisiológico de los animales. En humanos, una concentración de glucosa sanguínea mayor a 6.1 mmol/L es un indicador de la disminución de la sensibilidad del receptor de insulina y se reportan como pacientes pre-diabéticos, a los cuales hay que realizar una prueba de tolerancia a la glucosa para confirmar o descartar DM2. La administración de STZ a una dosis de 135 mg/kg de peso corporal vía intraperitoneal en ratas Wistar hembras a los 2 días de edad, genera glicemias entre 5.4 y 10.6 mmol/L, teniendo un promedio muestral a lo largo del tiempo de 7.8±1.45 mmol/L, la dispersión de los valores obtenidos es consistente con el desarrollo de un modelo de Diabetes de Tipo 2 (Figura 1).

Uno de los parámetros afectados en pacientes diabéticos es el peso corporal. La literatura señala que los pacientes, previo al desarrollo de la diabetes Tipo 2, cursan con síndrome metabólico caracterizado por sobrepeso, intolerancia a la glucosa y alteración del metabolismo de los lípidos; sin embargo, ya establecida la enfermedad los pacientes presentan pérdida progresiva de peso corporal (21). En el presente estudio se puede observar que el efecto de la diabetes sobre esta variable (pobre ganancia de peso) concuerda con los datos reportados en la literatura donde se han realizado estudios para evaluar el efecto de ciertos fármacos sobre la concentración de la glucosa en sangre y ganancia de peso corporal en ratas (Figura 2). Hay que considerar que en este estudio los animales utilizados se encuentran en la etapa de desarrollo, definiéndose la pobre ganancia de peso como un estado de desnutrición celular, ocasionado por el ineficiente aporte de glucosa, teniendo como resultado el aumento en el catabolismo y un bajo anabolismo (3,5).

La insulina, además de regular la utilización de la glucosa, tiene como función la regulación del metabolismo del tejido adiposo (almacenamiento, movilización y utilización de triglicéridos). Una de las alteraciones metabólicas observada en pacientes con diabetes Tipo 2 es el metabolismo de los lípidos, lo cual se ve reflejado en aumento de la concentración de triglicéridos y colesterol en sangre. Los datos reportados en la literatura para la concentración de estas moléculas en suero de ratas normales es de 70 mg/dl para colesterol (22) este valor es cercano al que se observó en los animales del grupo testigo (entre 85 y 98 mg/dl) mientras que los animales inducidos a diabetes

Tipo 2 este valor se incrementa al doble (Figura 3), lo cual es similar a lo que ocurre en pacientes con DM2. La exposición crónica de células β a altas concentraciones extracelulares de ácidos grasos produce la pérdida de la sensibilidad a la glucosa mostrando un patrón de hipersecreción de insulina a bajas concentraciones del azúcar y una incapacidad de adaptar la respuesta secretora a incrementos en la glucemia.

La síntesis de insulina se ve severamente disminuida y se observa además una deposición exagerada de lípidos, cuya degradación se ve reducida incluso tras varios días en condiciones normoglucémicas, aumentando la posibilidad de daños por lipotoxicidad (18).

Por otro lado, es interesante el hecho de que al primer mes de tratamiento, la concentración de triglicéridos es la misma en los dos grupos, lo cual significa que aún no se ha generado daño en lo que al metabolismo de los triglicéridos se refiere. Sin embargo, para el segundo mes de tratamiento y en adelante, hay un claro aumento en ambos grupos, aunque este es mayor en el grupo inducido a diabetes (Figura 4). Este fenómeno puede estar relacionado con cambios en el medio ambiente, ciclos hormonales y/o factores estresantes en ambos grupos; sin embargo el mayor incremento en el grupo inducido sugiere además alteración en la actividad y efectos de la insulina, entre los que se encuentran promover el almacenamiento de grasa e inhibir el catabolismo de ésta (3,15).

Los valores de triglicéridos en ratas reportados por diversos autores son variables y van de concentraciones de 80 a 160 mg/dl por lo que se tomó como valor de comparación el obtenido en este estudio.

La medición de la homoglobina glicada es una de las pruebas que se sugieren para el monitoreo del correcto control de los niveles de glucosa a través del tiempo, ya que es una reacción que se da de forma espontánea en un cierto porcentaje del total de esta proteína y es proporcional al tiempo de exposición y concentración de glucosa sanguínea. En ratas normales se ha observado que la concentración de la hemoglobina glicada es de 4.6%, similar a la encontrada en el presente estudio. Para el grupo inducido se obtuvieron concentraciones de 37.2% por arriba del grupo control, similares a las reportadas en animales con DM1 (5.3%) (16, 23), (Figura 5). Un factor que modifica las concentraciones de hemoglobina glicada es el período de vida del eritrocito (45 a 50 días), en la rata existen cinco tipos de poblaciones de eritrocitos, el I, II y III presentes al nacimiento, son sustituidos por IV y V entre los días 20-24 de vida del animal. La población IV desaparece el día 84,

Figueroa - Caracterización de un modelo de diabetes en ratas wistar después de lo cual la población V constituye la variante definitiva, por lo que la medición de la hemoglobina glicada en períodos tempranos de vida es un valor poco confiable. En este estudio se realizó en animales de corta edad y por un período de 16 semanas, por lo que es probable que el tiempo de exposición de la hemoglobina de los eritrocitos V a las altas concentraciones de glucosa no fue suficiente con lo cual el porcentaje de glicación de esta proteína puede ser variable.

Los criterios utilizados para definir la condición de anormalidad en una CTG se basa en el nivel o pico alcanzado por la glicemia a los 60 minutos, y la falta de retorno al nivel normal dos horas después de la ingestión, siendo esto último lo más importante. Los datos encontrados en la literatura señalan que la concentración máxima de glucosa sanguínea a los treinta minutos en CTG en animales normales es de 7.32 mmol/L, con un regreso al nivel basal (4.9 mmol/L) a los 120 minutos (24-25). En machos inducidos a DM2 se reportan concentraciones pico de 27.3 mmol/L a los 30 minutos con un retorno a niveles iniciales de 12.1 mmol/L a los 180 minutos.

En el presente estudio, tanto el grupo testigo como el diabético tuvieron un comportamiento similar al reportado en machos (19, 24, 26).

Los valores plasmáticos de insulina y glucosa en ayuno y posterior a la ingestión de una carga de carbohidratos, guardan relación mutua. Por esta razón la respuesta de estas moléculas a la CTG puede pronosticarse con base en los valores respectivos durante el ayuno, habiendo una mayor correlación con la insulina que con la glucosa (24).

El incremento agudo de insulina disminuye la concentración de glucosa plasmática, mientras que a largo plazo disminuye la acción de la hormona, alterando la unión de ésta a sus receptores de membrana. La elevada concentración de glucosa

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sanguínea a largo plazo disminuye la secreción de la hormona gluco-inducida, que es una de las manifestaciones del fenómeno de toxicosis por dicho carbohidrato. El resultado global de este sistema homeostático y sus circuitos es que las dos variables (concentración de insulina-glucosa sanguínea) varían siempre en proporción directa y mutua (salvo que disminuya la secreción de insulina) (26-28).

La diabetes es una enfermedad multifactorial y multisistémica, en la cual el desarrollo, incidencia y prevalencia de la misma está relacionada con factores inherentes a variables como edad, etapa fisiológica, genotipo y sexo, además de la influencia de factores ambientales (3,5,27,29). Se requiere del desarrollo de modelos experimentales que reproduzcan la historia natural de la enfermedad en hembras en los diferentes estados fisiológicos.

En el presente estudio se desarrollaron las alteraciones fisiologías reconocidas en la diabetes tipo 2 de acuerdo a los criterios para el diagnóstico de ésta propuestos por la OMS y la ADA. Considerando los parámetros de las pruebas comúnmente utilizadas para el diagnóstico y control de la diabetes en humanos, los valores obtenidos son representativos del síndrome, sin embargo, se recomienda realizar algunas otras mediciones para la confirmación del diagnóstico como son mediciones de insulina, péptido C y el HOMA-IR. Agradecimientos A CONACYT por el otorgamiento de la beca Doctoral número 25340 a MCFG en el Posgrado FMVZ- UNAM. Al Biólogo Tomas Villamar Duque y al M en C Fernando Barrón, Bioterio de la FESIUNAM. Este trabajo fue financiado por el Proyecto PAPIIT IN228610-3 DGAPA-UNAM.

REFERENCIAS 1

2

Feudtner C. Diabetes: la paradoja de la tecnología moderna. Boletín de la Organización Mundial de la Salud 2011; 89:90–91. doi:10.2471/BLT.11.040211. URL Disponible En: http://www.who.int/bulletin/ volumes/89/2/11-040211.pdf American Diabetes Association. Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus.

Diabetes Care 2011; 34(SUPPLEMENT 1), S62-S69. DOI: 10.2337/dc11-S062.

3

Stumvoll M, Goldstein BJ, Haeften TW. Type 2 diabetes: principles of pathogenesis and therapy.

The Lancet 2005; 365(9467):1333-1346.

4

Claypool MD, Entes LJ, Experimental rodent models of type 2 diabetes: a review. MFECP 2009; 31(4):249-261.

3706

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

5

Muoio DM, Newgard CB. Molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and β-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol 2008; 9:193-205.

16 Carvajal SG, Zamudio CP, Carvajal JME, Juárez CE. Prevención de los daños producidos por la diabetes mellitus y la senescencia. Gac Méd Méx 2007; 143(1)51-59.

6

Entes LJ, Claypool MD, Pinkett JG, Gadbois tM, Reaven GM. A new rat model of type 2 diabetes: the fat-fed, streptozotocin-treated rat. Met Clin and Exp 2000; 49(11):1390-1394.

7

Andrés S, Fleitas EAS, Simón CR, Almeida G, Quintela PAM, Alfonso M. Modelo experimental de diabetes en conejos. Rev Cubana Angiol y Cir Vasc 2000; 1(1):10-15.

17 Petersen KF, Dufour S, Befroy D, Garcia R, Shulman GI. Impaired mitochondrial activity in the insulin-resistant offspring of patients with type 2 diabetes. N Engl J Med 2004; 350(7):664-671.

8

Fernández SG, Jardón DA, Figueroa HJL. Modelos experimentales utilizados para el estudio e investigación de la diabetes mellitus. 2º Congreso Nacional de Química Médica. Querétaro, México; 2006.

9

González E. Diabetes mellitius experimental: etiología de las malformaciones congénitas en descendentes de ratas diabéticas. Rev Cubana Endocrinol 2002; 13(1):3-63.

10 Szkudelski T. The Mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of rat páncreas. Physiol Res 2001; 50:536-544.

11 Meszaros K, Reaven GM. A new rat model of type 2 diabetes: the fat-fed, streptozotocintreated rat. Met Clin and Exp 2000; 49(11):1390-1394.

12 Hugues HB, Rodríguez GJC. Animales de laboratorio en la endocrinología: biomodelos de la diabetes mellitus tipo 1. Rev Cubana Endocrinol 2001; 12(3):168-177.

13 N O M - 0 6 2 -Z O O - 1 9 9 9 . D i a r i o O f i c i a l .

Especificaciones técnicas para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio. México: Norma Oficial Mexicana; 2001.

14 JMP. Statistical Discovery Software. V. 7.0.

Cary, USA: SAS Institute Inc; 2007.

15 Fanelli C, Pampanelli S, Porcellati F, Bartocci L, Scionti L, Rossetti P, Bolli G. Rate of fall of blood glucose and physiological responses of counterregulatory hormones, clinical symptoms and cognitive function to hypoglycaemia in Type I diabetes mellitus in the postprandial state. Diabetologia 2003; 46(Issue 1):53-64.

18 Zhang Y, Li X, Zou D, Liu W, Yang J, Zhu N, Huo L, Wang M, Hong J, Wu P, Ren G, Ning G. Treatment of type 2 diabetes and dyslipidemia with the natural plant alkaloid berberine. JCEM 2008; 93(7):2559-2565.

19 Orozco-Tapia RI. Efecto de los ácidos grasos omega-3 (FA ω-3) y linoleico conjugado (CLA) en la diabetes mellitus 2 (DM2) en ratas wistar. [Tesis]. México. UNAM. Facultad de Estudios Superiores Iztacala. 2008.

20 Aronoff SL, Berkowitz K, Shreiner B, Want L. Glucose metabolism and regulation: Beyond insulin and glucagon. Diabetes Spectrum 2004; 17(3):183-190.

21 Druker DJ. The role of gut hormones in glucose homeostasis. J Clin Invest 2007; 117(1):24–32.

22 Kadowaki T, Yamauchi T, Kubota N, Hara K, Ueki K, Tobe K. Adiponectin and adiponectin receptors in insulin resistance, diabetes, and the metabolic syndrome. J Clin Invest 2006; 116(7):1784–1792.

23 Rorsman P. Review: Insulin secretion: function and therapy of pancreatic beta cells in diabetes. The British Journal of Diabetes & Vascular Disease 2005; 5:187-191.

24 Bhandari U, Jain N, Pillai KK. Further studies on antioxidant potential and protection of pancreatic β-Cells by embelia ribes in experimental diabetes. Experimental Diabetes Research. Indian J Pharmacol 2008; 40(5):215-220.

25 Fernandez-Twinn, Wayman A, Ekizoglou S, Martin MS, Hales CN, Ozanne SE. Maternal protein restriction leads to hyperinsulinemia and reduced insulin-signaling protein expression in 21-mo-old female rat offspring.

Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005; 288:R368–R373.

Figueroa - Caracterización de un modelo de diabetes en ratas wistar

3707

26 Redd MG, Meszaros K, Roche E. Type 2 diabetes: gluco-lipo-toxicity and B-cell dysfunction. Ars Pharmaceutica 2003; 44(4):313-332.

28 Parra GL, Reyes Téllez GJ, Briones BC. La desnutrición y sus consecuencias sobre el metabolismo intermedio. Rev Fac Med UNAM. 2003; 46(1):32-36.

27 Strader AD, Clausen TR, Goodin SZ, Wendt D. Ileal interposition improves glucose Tolerance in low dose streptozotocin-treated diabetic and euglycemic rats. Obes Surg 2009; 19(1):96-104.

29 Maureen I. Harris. “Definición y clasificación de la diabetes mellitus y criterios actuales para el diagnóstico”. En LeRoith D, Taylor, S, Olefsky, J. “Diabetes Mellitus, Texto Básico y Clínico”. México: Ed. McGraw-Hill Interamericana; 2003.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3708-3714, 2013.

ORIGINAL

Identificación de un polimorfismo del gen Est9 relacionado con resistencia a piretroides en Rhipicephalus (Boophilus) microplus Identification of a gene polymorphism Est9 associated with resistance to pyrethroids in Rhipicephalus (Boophilus) microplus Edgar Diaz R,1* M.Sc., Gustavo Vallejo,2 Ph.D. Universidad del Tolima, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Laboratorio de Parasitología Veterinaria, Ibagué, Colombia. 2Universidad del Tolima, Facultad de Ciencias, Laboratorio de Investigaciones en Parasitología Tropical, Ibagué, Colombia. *Correspondencia: ediazr@ut.edu.co.

1

Recibido: Septiembre de 2012; Aceptado: Octubre de 2013.

RESUMEN Objetivo. Mediante procedimientos de PCR-RFLP, detectar un polimorfismo en el gen Est9 de garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus resistentes a piretroides en Ibagué, Colombia, determinando el grado de asociación entre los fenotipos y los genotipos resultantes. Materiales y métodos. El ADN de 30 teleoginas R. (Boophilus) microplus fenotípicamente susceptibles, resistentes o medianamente resistentes a piretroides en una prueba de Drummond modificada, fue amplificado por PCR con cebadores específicos para obtener un fragmento de 372 pb del gen Est9, que fue sometido a digestión con la enzima EcoRI para estudiar los RFLPs generados y poder diferenciar los respectivos genotipos. El grado de asociación entre los fenotipos y los genotipos resultantes se determinó mediante la prueba exacta de Fisher. Resultados. Luego de digerir el fragmento con la endonucleasa, se generaron dos segmentos en teleoginas con algún nivel de resistencia, mientras en las teleoginas susceptibles no hubo división del fragmento de 372 pb, demostrándose así la presencia de una mutación puntual y los genotipos homocigoto natural, homocigoto mutante y heterocigoto. Las diferencias altamente significativas (p<0.01) entre teleoginas susceptibles y aquellas con algún nivel de resistencia, mostraron una relación directa entre el genotipo y el fenotipo con un nivel de confianza de p=0.0009852. Conclusiones. Se comprobó, por primera vez en Colombia, la presencia de una mutación puntual en el gen Est9 de garrapatas R. (Boophilus) microplus resistentes a piretroides, sugiriendo la necesidad de realizar estudios para detectar alteraciones moleculares en otros genes relacionados con quimioresistencia.

Palabras clave: Carboxilesterasa, garrapata, mutaciones, reacción de cadena de polimerasa, resistencia a acaricidas (Fuente: CAB).

ABSTRACT Objective. Using PCR-RFLP procedures, to detect a polymorphism of the Est9 gene in Rhipicephalus (Boophilus) microplus ticks resistant to pyrethroids in Ibague, Colombia, determining the degree of association between phenotypes and resulting genotypes. Materials and methods. The DNA of 30 engorged R. (Boohilus) microplus phenotypically susceptible females, resistant or moderately resistant

3708

Diaz - Identificación polimorfismo del gen Est9 en Rhipicephalus (Boophilus) microplus

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to pyrethroids in a modified Drummond test was amplified by PCR with specific primers. We obtained a 372 bp fragment of the Est9 gene which was digested with the EcoRI enzyme to study RFLPs generated in order to differentiate the respective genotypes. The degree of association between phenotypes and resulting genotypes was determined by Fisher’s exact test. Results. After digesting the fragment with the endonuclease, two segments were generated in engorged females with some level of resistance, while, in those susceptible, there was no fragment division. The presence of a mutation of 372 pb was demonstrated, as well as the natural homozygous genotypes, mutant homozygous and heterozygous.

The highly significant differences (p<0.01) between engorged susceptible females and those with some level of resistance, revealed a direct relationship between genotype and phenotype with a confidence level of p = 0.0009852. Conclusions. For the first time in Colombia, the presence of a mutation in the Est9 gene of R. (B.) microplus tick resistant to pyrethroids was found, suggesting the need for studies to detect molecular alterations in other genes associated with chemical resistance.

Key words: Acaricide resistance, carboxylesterase, mutations, tick, polymerase chain reaction (Source: CAB).

INTRODUCCIÓN En agroecosistemas tropicales del mundo, la garrapata común del ganado, Rhipicephalus (Boophilus) microplus (1) es considerada como el principal problema parasitario que afecta las explotaciones bovinas debido a su capacidad de transmitir microorganismos altamente patógenos como los protozoarios Babesia bigemina, causante de la piroplasmosis o ranilla roja, Babesia bovis y la rickettsia Anaplasma marginale, causante de la anaplasmosis o ranilla blanca, lo cual junto al frecuente desarrollo de resistencia a plaguicidas y a su alta capacidad reproductiva, afecta negativamente la rentabilidad de la producción ganadera (2-4).

Para controlar las altas poblaciones de R. (B.) microplus sobre los bovinos se emplean principalmente acaricidas formulados a base de compuestos organofosforados, piretroides, amidinas o carbamatos entre otros, aplicados a intervalos específicos mediante baños de aspersión sobre el cuerpo del animal (5,6). Sin embargo el uso inadecuado de esta estrategia, con altas frecuencias de aplicación, preparación de soluciones sub o sobre dosificadas, aplicación incorrecta a los animales o uso de mezclas inapropiadas de plaguicidas, ha llevado al desarrollo de cepas de campo resistentes al efecto de estos compuestos químicos, configurando un fenómeno presente y creciente a escala mundial (6,7).

Un estudio realizado por la Organización Mundial de Sanidad Animal, oficina adscrita a la FAO, revela como entre 151 países incluidos en el trabajo, el 50% presenta diagnóstico de quimioresistencia en garrapatas, con lo que la resistencia se convierte en uno de los mayores problemas debido a que la disponibilidad de nuevos antiparasitarios es cada vez más escasa (7,8). En Colombia, diversos autores

reportan variados niveles de resistencia a organofosforados, piretroides y carbamatos, encontrando en el departamento del Tolima que el 30% de ganaderos incluidos en una encuesta sobre uso de antiparasitarios, manifestó problemas de baja efectividad de acaricidas para control de R. (B.) microplus (9).

Tratando de entender los mecanismos de resistencia y de configurar el mapa genético responsable de la situación en esta especie de garrapata, muchas investigaciones han apuntado a identificar cambios moleculares en genes relacionados con resistencia acaricida. De igual manera, se trabaja en la determinación de marcadores de ADN con los cuales se puedan desarrollar pruebas rápidas y precisas que detecten tempranamente la resistencia a través de las frecuencias alélicas y genotípicas de los genes comprometidos (3,10-14). De esta forma, estudios desarrollados en EEUU, Brasil y México han demostrado que el fenómeno puede originarse en esta garrapata a partir de mutaciones puntuales en genes codificantes de enzimas, las cuales se traducen en un aumento del metabolismo de degradación de acaricidas organofosforados y piretroides principalmente (3,6,15-17).

Es así como a través de técnicas moleculares de PCR-RFLP y secuenciamiento, se encontró que en el gen codificador de la carboxilesterasa Est9, metabolizante de piretroides y organofosforados en R. (B.) microplus, existen dos alelos que difieren entre sí por la sustitución de un nucleótido, guanina por adenina, en un punto específico de su ADN, configurando individuos con algún nivel de resistencia a los acaricidas cuando se presenta el alelo con adenina o individuos susceptibles cuando presentan el alelo con guanina (13, 18,19).

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El objetivo principal de la presente investigación se enfocó en la detección de un polimorfismo en el gen Est9 de una carboxilesterasa de garrapatas R. (B.) microplus presentes en una explotación ganadera con historial de resistencia hacia piretroides en el municipio de Ibagué, mediante procedimientos de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) y RFLP (Polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción), determinando el grado de asociación entre los fenotipos y los genotipos resultantes.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio y toma de muestras. Se emplearon teleoginas (hembras repletas de sangre) de R. (B.) microplus colectadas al azar de bovinos mestizos pertenecientes a una finca lechera con historial de resistencia a acaricidas, ubicada en el municipio de Ibagué, Tolima, a una altura de 1250 msnm, con temperatura promedio de 26°C y humedad relativa del 70%. Los productos químicos empleados en la finca para controlar las poblaciones de estos ácaros correspondían a organofosforados, piretroides y formamidinas, reportándose muy poca efectividad y una frecuencia en la aplicación de baños de aspersión de entre 10 y 15 días.

Los especímenes se colectaron en forma manual, desprendiéndolos cuidadosamente de la piel para evitar la separación de sus piezas bucales, colocándolos en un recipiente con trozos de papel absorbente en el fondo. Luego, fueron transportados al Laboratorio de Investigaciones en Parasitología Tropical de la Universidad del Tolima, Colombia.

Prueba biológica para detección de quimioresistencia. El mismo día de la captura, las teleoginas fueron sometidas a la prueba in vitro de inmersión de hembras repletas o prueba de Drummond modificada, para detección de resistencia (13,20). Se empleó un acaricida piretroide comercial bastante usado en la región, cipermetrina, en concentración de 150 g/L, diluyéndolo en 200 ml de agua destilada según la dosis recomendada por el fabricante para uso en campo, sumergiendo un grupo de las garrapatas durante tres minutos en la solución, empleando como control otro grupo de teleoginas que fueron sumergidas en agua destilada.

Posteriormente, las garrapatas se depositaron en una caja de petri, fijando cada individuo por el dorso con cinta doble faz, y se colocaron en una estufa de incubación a 27°C y 80% de humedad relativa, procediendo a observarlas diariamente para verificar el grado de oviposición o la muerte

de la teleogina. Así, se formaron grupos de garrapatas sensibles (garrapatas que murieron las primeras 24 horas post-inmersión), resistentes (garrapatas con oviposición completa a los 14 días) y moderadamente resistentes (garrapatas que sobrevivieron pero no ovipositaron o con oviposición incompleta a los 14 días) (13). Al termino de la prueba, a los especímenes se les practicó una incisión a lo largo del cuerpo a fin de lavar el exceso de sangre bovina con agua desionizada, depositando cada muestra en tubos Eppendorf con etanol al 70%, almacenando a -20°C hasta su procesamiento.

Obtención de ADN y selección de cebadores.

El ADN se aisló siguiendo el protocolo descrito por Diaz (21), mediante el método de fenolcloroformo-alcohol isoamílico (FCAI). Para amplificar un fragmento del gen Est9, se emplearon los cebadores descritos por Baffi et al (13), para el derecho 5’-AGC ATC GAC CTC TCG TCC AAC-3’ y para el izquierdo 5’-GTC GGC ATA CTT GTC TTC GAT G-3’, con los cuales se pudo reconocer el segmento de 372 pb.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Las reacciones se procesaron en un termociclador PTC-100 usando una mezcla de 4 pmol de cada cebador, 200 µM de cada dNTP, 1.5 mM de MgCl2, 1 unidad de Taq DNA polimerasa, 1X de buffer PCR, 100 ng de ADN y agua ultrapura para un volumen final de 20 µl por reacción. Se incluyó además un control de reacción, consistente en una mezcla sin ADN. El perfil térmico consistió de una desnaturación previa a 95°C por 5 minutos, seguida de 38 ciclos con periodos de desnaturación a 95°C por 1 minuto, anillamiento a 60°C por 1 minuto y extensión a 72°C por 1 minuto, con una extensión final a 72°C por 5 min (13). La detección de los amplicones generados se hizo por electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, durante una hora y media a 80 voltios en TBE 0.5X, tiñendo luego con bromuro de etídio.

Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción. El fragmento de 372 pb obtenido por el procedimiento de PCR, se sometió a corte con la enzima de restricción EcoRI, que tiene como sitio de reconocimiento la secuencia GAATTC. Para digerir la muestra, se adicionaron 10 µl del producto de PCR a una mezcla compuesta por buffer de reacción 1X, 5 unidades de la enzima EcoRI y agua desionizada suficiente para completar un volumen de 10 µl. La digestión se realizó durante tres horas a una temperatura de 37°C. Los fragmentos resultantes, se visualizaron en geles de agarosa al 2.5%, corriendo la electroforesis durante una hora y cuarenta y

Diaz - Identificación polimorfismo del gen Est9 en Rhipicephalus (Boophilus) microplus cinco minutos en TBE 0.5X a 80 voltios, tiñendo con bromuro de etidio y visualizando con luz ultravioleta.

Análisis estadístico. En el análisis de los resultados obtenidos se utilizó la prueba exacta de Fischer para comparación de proporciones independientes, tomando como nivel de significancia para el análisis un error alfa inferior al 1% (p<0.01).

3711

resultado de la electroforesis, correspondiendo a un genotipo homocigoto mutante (RR); e individuos moderadamente resistentes, donde se forman tres bandas de 372, 300 y 72 pb, debido a la presencia de los dos alelos del gen, uno correspondiente al genotipo natural que no es digerido por la enzima y otro al genotipo mutante que genera dos fragmentos luego de la digestión con la enzima EcoRI, configurando el genotipo heterocigoto (RS), como se muestra en la figura 2.

RESULTADOS Bioensayo para detección de quimiorresistencia. Se sometieron a la prueba de inmersión en el acaricida piretroide (cipermetrina) 38 teleoginas, de las cuales ocho (21.1%) fueron resistentes, 27 (71%) fueron moderadamente resistentes y solamente tres (7.9%) fueron sensibles al acaricida, con lo que se determinó un nivel de resistencia hacia piretroides del 92.1% en la finca objeto de estudio.

Amplificación por PCR. Luego de los procedimientos de extracción, se aisló suficiente ADN de 31 muestras, verificando en ellas la amplificación del fragmento de 372 pb del gen Est9, como se observa en la figura 1.

Figura 2. Gel de agarosa al 2.5% teñido con bromuro de etidio, mostrando los fragmentos de restricción del amplicón de 372 pb del gen Est9 con la enzima EcoRI.

De acuerdo con los resultados obtenidos en la prueba de RFLP, se calcularon las frecuencias genotípicas y alélicas para los 30 individuos tratados con el acaricida piretroide que fueron analizados por esta técnica (Tabla 1). El genotipo homocigoto natural (SS) presenta alta frecuencia dentro de las teleoginas susceptibles y muy baja en las teleoginas medianamente resistentes. El genotipo heterocigoto (SR) es el de mayor frecuencia en individuos medianamente resistentes, mientras que el genotipo homocigoto Figura 1. Gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio donde se observan los fragmentos de 372 pb del gen Est9 obtenidos por PCR.

Digestión para RFLP. La utilización de la enzima de restricción EcoRI permitió determinar polimorfismos de longitud en 30 de las muestras, identificando claramente los genotipos correspondientes a individuos susceptibles, donde no hubo división del fragmento de 372 pb y se observa solamente una banda luego de la electroforesis, correspondiendo a un genotipo homocigoto natural (SS); individuos resistentes, donde se formaron dos fragmentos, uno de 300 pb y otro de 72 pb, indicando la presencia de una mutación que permite a la enzima reconocer un sitio para su corte formando dos bandas como

Tabla 1. Frecuencia genotípica y alélica de teleoginas sometidas a la prueba de Drummond para detección de resistencia, luego del proceso de RFLP. Tratamiento acaricida 1 Piretroide 2 3 Total

RFLP - Genotipos

Alelos

SS(%)

SR(%)

RR(%)

S

R

3/3=100

-

-

1

-

1/21=4.76

18/21=85.7

2/21=9.54

-

-

6/6=100

4/30=13.3

18/30=60

8/30=26.7

0.476 0.524 -

1

0.433 0.567

Prueba Drummond: 1:Susceptibles; 2:Medianamente resistentes; 3: Resistentes.

SS= Homocigoto natural; SR= Heterocigoto; RR= Homocigoto mutante S= Alelo natural; R= Alelo mutante

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mutante (RR) se encontró en todas las garrapatas resistentes; en las teleoginas medianamente resistentes su frecuencia es superior a la observada en el genotipo susceptible.

La alta tasa del alelo natural (S) que se encontró en los individuos susceptibles (100%) y la alta tasa del alelo mutante (R) encontrada en las garrapatas resistentes (100%), indican una posible asociación entre el alelo mutante y el fenotipo de resistencia. La información analizada mostró un desequilibrio en las frecuencias genotípicas y alélicas, denotando una selección de los individuos que portan el alelo mutante (R), conduciendo al aumento de la población de garrapatas resistentes y moderadamente resistentes al compuesto piretroide (cipermetrina).

Al analizar la asociación entre fenotipo y genotipo, se observa como de 27 muestras pertenecientes a teleoginas con algún nivel de resistencia solo una no fue digerida por la endonucleasa, en tanto que las tres muestras de individuos susceptibles correspondieron a lo esperado al no ser digeridas por la enzima, mostrando diferencias altamente significativas (p<0.01) entre individuos con algún nivel de resistencia y susceptibles, así como una relación directa entre el genotipo y el fenotipo con un nivel de confianza de p=0.0009852 mediante la prueba exacta de Fisher (Tabla 2).

Tabla 2. Tabla de contingencia empleada en la prueba exacta de Fisher.

Fenotipo

RFLP corto

no corto

total

Susceptibles

0

3

3

Resistentes + medianamente resistentes

26

1

27

TOTAL

26

4

30

DISCUSIÓN La presente investigación, utilizando las herramientas moleculares de PCR y RFLP, informa por primera vez en Colombia acerca de la presencia de un polimorfismo en el gen Est9 codificante de una carboxilesterasa en la garrapata Rhipicephalus (B.) microplus y sus alelos relacionados con resistencia a piretroides en individuos colectados en campo.

La identificación del gen Est9 a través de PCR fue posible en el 81.6% de las muestras procesadas para extracción de ADN. El fracaso en la amplificación de las muestras restantes podría deberse a inhibidores de la polimerasa

que no se removieron durante la extracción con fenol-cloroformo o a la baja concentración de ADN obtenida. Al respecto, diversos autores mencionan que las garrapatas poseen un exoesqueleto quitinoso, bastante duro, que debe ser roto apropiadamente antes de la extracción, asimismo que el ADN extraído es altamente susceptible de degradación por razones aun no establecidas y que estos ácaros posiblemente presentan inhibidores de la Taq-polimerasa, como ciertos polisacáridos co-purificados con el ADN, que disminuyen la eficiencia y sensibilidad del proceso de amplificación (22-24).

La técnica de PCR reveló la presencia de un fragmento de ADN de 372 pb, similar al obtenido en cepas de R. (B.) microplus mexicanas, texanas y brasileras (13,19,25), asimilado en dichos trabajos a una esterasa altamente conservada en esta especie de garrapatas, así como al grupo de las acetilcolinesterasas y que fue identificado como perteneciente al gen Est9 codificador de una carboxilesterasa en R. microplus (18).

El análisis de los RFLP del fragmento digerido con EcoRI, reveló unos patrones de bandeo para cada genotipo similares a los mostrados por Baffi et al (13) en trabajos con poblaciones de garrapatas en Brasil, siendo claramente diferenciables los genotipos natural, mutante y heterocigoto a través del número de bandas generadas en la digestión con la enzima. Mediante esta técnica, en el presente estudio se encontró una asociación altamente significativa entre el genotipo natural y el fenotipo susceptible, con 100% de los individuos susceptibles a piretroides presentando el genotipo SS (susceptible), lo mismo que en los individuos resistentes al acaricida, donde el 100% presentó el genotipo RR (mutante). Con relación a los individuos medianamente resistentes también hubo asociación altamente significativa, observando que el 85.7% presentó el genotipo SR (heterocigoto). Baffi et al (13) y Hernández et al (19) encontraron también, usando la técnica de RFLP, asociaciones significativas entre el genotipo y el fenotipo en cepas brasileras y mexicanas respectivamente.

De igual manera, de acuerdo con los resultados mostrados en la tabla 1, el bajo porcentaje (13.3%) de individuos portadores del genotipo natural (SS) de resistencia a acaricidas piretroides y el alto porcentaje (86.7%) de individuos portadores del genotipo asociado con resistencia en garrapatas resistentes y moderadamente resistentes, es un indicativo del intenso proceso de selección que se está dando en la población de R. (B.) microplus de la finca estudiada, hacia garrapatas portadoras del alelo mutante (R) relacionado con resistencia a piretroides

Diaz - Identificación polimorfismo del gen Est9 en Rhipicephalus (Boophilus) microplus mediante un mecanismo de detoxificación enzimática aumentada por esterasas.

Los resultados permiten concluir que en poblaciones de la garrapata R. (B.) microplus en Ibagué y seguramente en el resto de Colombia, se dan procesos de selección hacia individuos portadores del alelo mutante del gen Est9, lo que contribuye a generar resistencia hacia acaricidas piretroides. Sin embargo, dada la presencia de alteraciones moleculares en otros genes relacionados con el fenómeno de quimiorresistencia, es necesario continuar

3713

con su evaluación para tener una visión más cercana de la extensión del problema y poder establecer programas de control que respondan a la situación presente.

Agradecimientos Al Comité Central de Investigaciones de la Universidad del Tolima por financiar la presente investigación. Al Dr. Julio Cesar Carranza Martínez, investigador del LIPT, por sus aportes al diseño del estudio.

REFERENCIAS 1.

Murrell A, Barker S. Synonymy of Boophilus Curtice, 1891 with Rhipicephalus Koch, 1844 (Acari: Ixodidae). Syst Parasitol 2003; 56(3):169-172.

2.

Wang M, Guerrero F, Pertea G, Nene V. Global comparative analysis of EST’s from the southern cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus. BMC Genomics 2007; 8:368.

3.

Chevillon CH, Basile B, Barré N, Durand P, Aranthau C, Meeus T. Direct and indirect inferences on parasite mating and gene transmission patterns Pangamy in the cattle tick Rhipicephalus microplus. Infect Genet Evol 2007; 7:298-304.

4.

5.

Foil L, Coleman P, Eisler M, Fragoso H, García Z, Guerrero F et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet Parasitol 2004; 125:163-181.

Peter R, Van den Bossche P, Penzhorn B, Sharp B. Tick, fly and mosquito control – lessons from the past, solutions for the future. Vet Parasitol 2005; 132:205-215.

6.

CONACYT – SAGARPA. Resistencia de la garrapata Boophilus microplus a los ixodicidas en el sureste de México. Folleto técnico No. 1. Mérida, México: Conacyt; 2005.

7.

Nari A. Towards sustainable parasite control practices in livestock production with emphasis in Latin America. Vet Parasitol 2011; 180:2-11.

8.

FAO. Guidelines resistance management and integrated parasite control in ruminants.

Roma: FAO; 2004. URL disponible en: ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/010/ag014e/ ag014e00.pdf

9.

Diaz E, Benavides E, Parra M, Arcos J, Riveros E, Jaramillo F et al. Investigación epidemiológica de las principales limitantes parasitarias en explotaciones ganaderas del Tolima, Huila y sur occidente de Cundinamarca. Informe final de proyecto.

Ibagué: CORPOICA - PRONATTA; 2000.

10. Rodriguez R, Hodgkinson J, Rosado J, Villegas S, Trees A. The prevalence of pyrethroid resistance phenotype and genotype in Rhipicephalus (Boophilus) microplus in Yucatan, Mexico. Vet Parasitol 2012; 184:221-229.

11. Baffi M, Donizete C, Lino G, Boneti A, Ceron C, Gourlart L. Esterase profile in a pyrethroid-resistant Brazilian strain of the cattle tick Boophilus microplus. Int J Genet Mol Biol 2005; 28(4):749-753.

12. Jabbar A, Iqbal Z, Muhammad G, Nisar M, Zahid R, Sandhu Z et al. The interplay of molecular biology and veterinary parasitology: A need of the time. Int J Agric Biol 2005; 7(5):845-852.

13. Baffi M, Rocha G, Ueira C, Soares C, Ricardo L. Bonetti A. Identification of point mutations in a putative carboxylesterase and their association with acaricide resistance in Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Vet Parasitol 2007; 148:301-309.

3714

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

14. Chen A, He H, Davey R. Mutations in a putative octopamine receptor gene in amitraz-resistant cattle ticks. Vet Parasitol 2007; 148:379-383.

20. FAO. Curso – Taller sobre diagnóstico de resistencia a ixodicidas en garrapatas Boophilus microplus. Jiutepec, México: Inifap; 2000.

15. Rodriguez R, Trees A, Rosado J, Villegas S, Hodgkinson J. Evolution of acaricide resistance: Phenotypic and genotypic changes in field populations of Rhipicephalus (B.) microplus in response to pyrethroid selection pressure. Int J Parasitol 2011; 41:895-903.

21. Diaz E. Estudio molecular del gen de una carboxilesterasa relacionada con q u i m i o r r e s i s t e n c i a e n l a g a r ra p a t a Rhipicephalus (Boophilus) microplus. [Tesis de Maestría]. Ibagué, Colombia: Universidad del Tolima, Facultad de Ciencias; 2012.

16. Dominguez D, Rosario R, Almazan C, Saltijeral J, De la Fuente J. Boophilus microplus: Biological and molecular aspects of acaricide resistance and their impact on animal health. Trop Subtrop Agroecosyt 2010; 12:181-192.

17. Baffi M, Rocha G, Ueira C, Soares C, Ceron C, Bonetti A. Esterase enzymes involved in pyrethroid and organophospate resistance in a Brazilian population of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Mol Biochem Parasitol 2008; 160:70-73.

18. Guerrero F, Nene V. Gene structure and expresión of a pyrethroid-metabolizing esterase, CzEst9, from a pyrethroid resistant Mexican population of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. J Med Entomol 2008; 45(4):677-685.

19. Hernandez R, Guerrero F, George J, Wagner G. Allele frequency and gene expression of a putative carboxylesterase-encoding gene in a pyrethroid resistant strain of the tick Boophilus microplus. Insect Biochem Mol Biol 2002; 32:1009-1016.

22. Halos L, Jamal T, Vial L, Maillars R, Suau A, Le Menach A et al. Determination of an efficient and reliable method for DNA extraction from ticks. Vet Res 2004; 35:709-713.

23. Hunt P. Molecular diagnosis of infections and resistance in veterinary and human parasites. Vet Parasitol 2011; 180:12-46.

24. Rodríguez I, Gern L, Rais O, Fuentes O, González R, Fernández C. Detección molecular de patógenos emergentes de importancia médica y veterinaria en garrapatas capturadas sobre caballos domésticos. Rev Cubana Med Trop 2009; 61(1):57-62.

25. Chen A, He H, Temeyer K, Jones S, Green P, Barker S. A survey of Rhipicephalus microplus populations for mutations associated with pyrethroid resistance. J Econ Entomol 2009; 102(1):373-380.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3715-3721, 2013.

ORIGINAL

Evaluación de la nisina como sustancia inactivadora de Bacillus licheniformis en el extracto líquido de café Evaluation of the nisin as inactivator substance of Bacillus licheniformis to coffee liquid extract Leidy Sierra L,1* M.Sc, Olga Montoya C,2 M.Sc, Héctor J. Ciro-V,3 Ph.D. Universidad Nacional de Colombia. Sede Medellín. 2Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias. Sede Medellín. 3Universidad Nacional de Colombia. Departamento de Ingeniería Agrícola y de Alimentos. Sede Medellín. *Correspondencia: lmsierr0@gmail.com 1

Recibido: Julio de 2012; Aceptado: Marzo de 2013.

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto de la nisina en la inactivación de Bacillus licheniformis en el extracto líquido de café. Materiales y métodos. Se evaluó la acción de la nisina sobre Bacillus licheniformis en extractos líquidos de café variando su concentración, tiempo de incubación, concentración de solidos solubles (grados Brix) y la concentración bacteriana contaminante. Resultados. Se observó que la concentración de nisina, para obtener un efecto inhibitorio del 55%, sin alterar las propiedades fisicoquímicas y sensoriales del producto, es 500 UI/ml que corresponden a 12.5 mg/L. Además, se determinó que la concentración de nisina 1000 UI/ml puede actuar satisfactoriamente en poblaciones bacterianas menores de 5x104 UFC/ml en un período de 48 horas. Con relación al efecto de concentración de sólidos solubles en la inactivación del microorganismo, no se encontraron diferencias significativas para un rango entre 15 y 45°Brix. Conclusiones. A partir de este estudio se puede concluir que la nisina puede ser usada como preservante del extracto de líquido de café sin afectar sensorialmente el producto, teniendo en cuenta la concentración bacteriana contaminante y el tiempo de incubación.

Palabras clave: Bacillus, café, inactivación, nisina (Fuente: CAB).

ABSTRACT Objetive. To evaluate the effect of nisin on the inactivation of Bacillus licheniformis to coffee liquid extract. Materials and methods. The action of nisin on Bacillus licheniformis into liquid coffee extracts was evaluated by varying its concentration, incubation time, concentration of soluble solids (°Brix) and bacterial contaminant concentration. Results. The results indicated that the concentration of nisin to achieve the inhibitory effect without affecting the physicochemical and sensory properties of the product is 500 IU/ml corresponding to 12.5 mg/L. Additionally, High levels of nisin 1000 IU/ ml can act successfully in bacterial populations lower than 5x104 CFU/ml over a period of 48 hours.

Furthermore, the concentration of soluble solids did not show a statistically significant effect for values from 15 to 45 °Brix. Conclusions. From this study it can be concluded that nisin may be used as a preservative in liquid coffee extract without sensorially affecting the product, taking into account the bacterial contaminant concentration and incubation time.

Key words: Bacillus, coffee, inactivation, nisin (Source: CAB).

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

INTRODUCCIÓN En el sector de los alimentos, el crecimiento económico y la globalización de los mercados han propiciado un ambiente más exigente y competitivo. Lo anterior, se traduce en un mayor compromiso de las industrias alimentarias modernas para garantizar la permanencia de sus productos en el mercado, dado que frecuentemente surgen nuevos productos y mejores tecnologías para su desarrollo.

Así, los entes reguladores de la inocuidad alimentaria establecen una normatividad más exigente para garantizar que estas nuevas alternativas no terminen afectando de manera directa o indirecta la salud humana. Por lo tanto, en el mundo actual de la industria de alimentos uno de los retos más importantes es poder garantizar la inocuidad de los productos asegurando su estabilidad (1).

Los microorganismos del género Bacillus están ampliamente distribuidos en el medio ambiente, y en diversos productos agroalimentarios actúan como agentes patógenos de alimentos (B. cereus) o generadores de putrefacción (B. coagulans, B. licheniformis, B. subtilis) y formando endosporas resistentes a agentes físicos o químicos utilizados para la conservación de alimentos (2-7).

La nisina es la única bacteriocina que ha sido aprobado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), para ser utilizada como conservante en la industria alimentaria; molecularmente es un péptido de 34 aminoácidos con un peso molecular inferior a 5 kDa (8), producida por algunas cepas de Lactococcus lactis, siendo efectiva en el control del crecimiento de los microorganismos formadores de esporas como Bacillus y Clostridium; aunque, también actúa sobre Listeria monocytogenes, Staphylococcus y muchas especies de bacterias ácido lácticas (9). Una amplia descripción de la acción a nivel molecular es referenciada (10).

El extracto líquido de café es el producto resultante del proceso en el cual se hace pasar agua caliente sobre un lecho fijo de café tostado y molido (generalmente a presión y alta temperatura), con el fin de extraer los sólidos y los componentes aromáticos del grano; el licor es utilizado como ingrediente para obtener preparaciones de diferentes alimentos como helados, yogurt, pasteles, bebidas de café entre otros, por lo que no deben contener esporas después de la producción (11,12). Las esporas podrían germinar en los productos elaborados con concentrado de café y al no ser sometidos a un tratamiento posterior de desinfección

durante el almacenamiento, el producto se podría recontaminar (12).

Dado que el péptido (nisina) es aceptado como un bioconservante de los alimentos debido a sus propiedades antibacterianas, a su impacto mínimo con relación a los cambios a las propiedades organolépticas de los alimentos (13,14) y a que desde el punto de vista del consumo humano las enzimas digestivas pueden degradarla, el objetivo de esta investigación fue determinar las condiciones óptimas del uso de la nisina en el extracto de café líquido, garantizando la calidad microbiológica y sensorial del producto, con fines de su comercialización internacional.

MATERIALES Y MÉTODOS Localización. El trabajo de investigación fue realizado en los laboratorios de Microbiología Industrial y Bioconversiones de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín.

Preparación de la muestra. La nisina (1000 UI/ ml a 100 UI/ml ) se adicionó al extracto líquido de café disuelta en una solución HCl (0.02 M) y 0.75% (p/v) de NaCl (15). Se procedió a inocular el microorganismo Bacillus licheniformis en tubos conteniendo extracto de café con la bacteriocina, se incubó a 37°C y 180 rpm por 24 horas. Cada dos horas, se realizó el recuento de colonias en medio sólido (agar nutritivo).

Actividad antibacteriana. Por medio del antibiograma en medio líquido se evaluó la concentración de nisina (16). Además, se determinó el efecto inhibitorio de la nisina en extractos de café con diferente concentración de solidos solubles (medidos en °Brix) e inóculo inicial. Los tiempos de incubación fueron 2, 24 y 48 horas para diferentes concentraciones de inóculo.

En un alimento la concentración máxima admitida de nisina es 125 mg/kg, lo cual corresponde a 5000 UI/ml (17); por lo tanto, se evaluaron las concentraciones del péptido a 1000, 500, 400, 300, 200 y 100 UI/ml.

Obtenidas las condiciones en las cuales se observa el efecto inhibitorio se verificó el efecto de la nisina en las propiedades sensoriales del extracto líquido de café usando la prueba triangular, para la cual se tenían 10 jueces a los que se les solicitó identificar la bebida con sabor diferente de las 3 suministradas (18). Adicionalmente, se determinaron las características fisicoquímicas

Sierra - Evaluación de la nisina como sustancia inactivadora de Bacillus licheniformis 3717 del extracto tales como el pH y la acidez, luego de adicionar la bacteriocina.

RESULTADOS Acción de la nisina sobre Bacillus licheniformis inoculando en extractos de café con diferente concentración de sólidos solubles (°Brix).

Se evaluaron dos concentraciones (15 y 45 °Brix) del extracto de café, valores que fueron seleccionados porque a 45 °Brix es el valor promedio del producto final y 15 °Brix debido a que gran parte del proceso de producción el extracto contiene esta concentración.

La figura 1 muestra los resultados del uso de nisina a 1000 UI/ml sobre Bacillus licheniformis inoculado a la concentración inicial 6x106 UFC/ml en los extractos de café a 15 y 45 °Brix. Después de un período de 24 horas a 37°C, se determinó que no hubo diferencias significativas, en los recuentos de Bacillus licheniformis, entre las dos concentraciones (p>0.05).

Figura 2. Cinética de Bacillus licheniformis creciendo en un extracto de café a 15 °Brix conteniendo nisina a concentraciones de 0 (control) y 1000 UI/ml durante 24 horas.

Figura 3. Cinética de Bacillus licheniformis creciendo en el extracto de café a 15 °Brix con 500 y 750 UI/ml de nisina durante 24 horas.

Figura 1. Evaluación de la acción de la nisina (1000 UI/ ml) sobre Bacillus licheniformis inoculado en extractos de café con diferentes grados Brix.

Efecto de la concentración de la nisina sobre la inactivación de Bacillus licheniformis.

En la figura 2 se observa el crecimiento del microorganismo con nisina para concentraciones de 0 (control) y 1000 UI/ml.

Con los resultados dados en las figuras 4 y 5, donde están evaluados los efectos de la nisina a las concentraciones de 400 UI/ml hasta 100 UI/ ml, se puede deducir que no hay efecto inhibitorio significativo.

La figura 2 muestra un efecto acelerado de decrecimiento de la carga microbiana en el cual se logra obtener una reducción de dos unidades logarítmicas para un tiempo de 2 horas y luego se observa un efecto bacteriostático.

La figura 3 muestra el efecto de la nisina sobre Bacillus licheniformis cuando la concentración de la bacteriocina disminuye a 500 y 750 UI/ml, donde se observa para estas dos concentraciones de nisina que el efecto predominante es bacteriostático.

Figura 4. Cinética de Bacillus licheniformis creciendo en el extracto de café a 15 °Brix con 400 y 300 UI/ml de nisina durante 24 horas.

3718

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013 horas. Los resultados mostraron que para una concentración inicial microbiana de 107 UFC/ml, el efecto de la nisina se da principalmente a las 2 horas y posteriormente permanece constante (Figura 7a).

Figura 5. Cinética de Bacillus licheniformis creciendo en el extracto de café a 15 °Brix con 100 y 200 UI/ml de nisina durante 24 horas.

Acción de la nisina sobre el crecimiento de Bacillus licheniformis inoculado a diferentes niveles de concentración inicial. Para encontrar la concentración de inóculo en la cual se reduce al máximo la carga microbiana por el efecto de la nisina a 1000 UI/ml, se utilizó el extracto de café a 15 °Brix y se evaluaron varios niveles de concentración inicial de inóculo. Los resultados se presentan en la figura 6.

De la figura 6 se puede inferir que tanto el café con nisina como el café sin ella, tienen un efecto inhibitorio, obteniendo porcentajes de disminución de la población microbiana del 95 y 90% respectivamente para cuando la concentración inicial de inóculo fue de 4x103 UFC/ml.

En la figura 7b se observa que cuando la concentración bacteriana inicial es de (5x104 UFC/ ml), la acción de la nisina es más contundente, porque se logra disminuir la población de Bacillus licheniformis hasta 3 UFC/ml a las 48 horas, mientras que en el medio con sólo café el recuento es en promedio 30 UFC/ml.

a

b

Figura 7. Acción bactericida de la nisina sobre la concentración de inóculo a 2, 24 y 48 horas de incubación: 1x107 UFC/ml (a) y 5x104 UFC/ml (b).

Figura 6. Conteo microbiano luego de 24 horas de incubación, en un extracto de café de 15 °Brix conteniendo nisina (0 y 1000 UI/ml) e inoculando con Bacillus licheniformis a diferentes niveles de concentración.

Acción de la nisina sobre el crecimiento de Bacillus licheniformis evaluado a diferentes tiempos de incubación. En los experimentos realizados a diferentes concentraciones del inóculo, usando 1000 UI/ml de nisina y como medio de cultivo el extracto de café a 15 °Brix, se evaluó el efecto antimicrobial de la bacteriocina en un tiempo de incubación de 2, 24 y 48

Prueba sensorial y los análisis fisicoquímico.

De acuerdo con los resultados anteriores, las concentraciones de nisina con las que se obtuvo inhibición fueron 500 y 1000 UI/ml.

Así, se evaluaron los efectos de la adición de la nisina en las propiedades sensoriales y fisicoquímicas del extracto de café (pH y acidez) con concentraciones de nisina de 0, 1000 y 500 UI/ml. Los resultados se presentan en la figura 8.

De la figura 8, se observa que el tratamiento con nisina no afecta las propiedades fisicoquímicas del extracto de café (pH y acidez) ya que es estadísticamente igual al control (p>0.05).

Sierra - Evaluación de la nisina como sustancia inactivadora de Bacillus licheniformis 3719 El criterio microbiológico para mesófilos en el extracto de café debe ser menor a 100 UFC/ml (22).

Así, con respecto a la concentración de inóculo inicial que es sometida al tratamiento con nisina, se encontró que para obtener valores de UFC/ml menores a 100, la concentración inicial de inóculo debe ser menor de 4x103 UFC/ml, ya que con los valores superiores no se logra que la población bacteriana sea menor de 100 UFC/ml, por lo cual debería agregarse nisina para obtener una inactivación mayor de la bacteria.

Figura 8. Efecto de la adición de nisina en el pH y el porcentaje de acidez del extracto de café a las concentraciones de 0, 500 y 1000 UI/ ml.

A partir de un análisis de varianza de la prueba triangular se observó que hay diferencias significativas (p<0.05) entre el control y el tratamiento (1000 UI/ml), mientras que para concentración de nisina (500 UI/ml) no hay diferencias significativas (p>0.05).

DISCUSIÓN La acción de la nisina no depende de la concentración de sólidos solubles, ya que si la viscosidad se incrementa debido al aumento de fracción másica del café (19), esto se convierte en un factor limitante para la acción de la nisina, aunque se esperaba que a medida que aumentara la concentración de solidos solubles del café la inhibición fuera mayor.

Por otro lado, el pH es fundamental para la acción de la nisina siendo mejor a pH bajos (20). Para las concentraciones de 45 y 15º Brix los valores de pH fueron respectivamente de 5.06±0.03 y 5.00±0.03, con lo cual se podria inferir que este factor no es determinante para la acción inhibitoria de la nisina y por lo tanto, no se observa una diferencia significativa en la inhibición de la bacteria de interes.

La concentración de nisina está relacionada con el efecto inhibitorio ya que para concentraciones de 1000 UI/ml, se observa que la población bacteriana disminuye, mientras que para valores entre 750 y 500 UI/ml el efecto que se observó es bacteriostatico y en la medida en que se disminuye la concentración de nisina, el efecto inhibitorio desaparece. Los resultados obtenidos coinciden con Chatterjee et al (21), ya que se logró demostrar que la acción de la nisina frente a las células vegetativas de Bacillus puede ser bactericida o bacteriostática dependiendo de la concentración de la misma.

El café tiene propiedades antimicrobiales sobre algunos microorganismos tanto Gram negativos como Gram positivos, aunque, la sensibilidad disminuye con este último grupo (10). El peróxido presente en el café es el principal responsable de tal inhibición (23). Adicionalmente, la disminución de bacterias se debe a compuestos como ácido 5-cafeoilquinico, trigonelina y ácido cafeico (24).

Por otro lado, si se mezcla el extracto de café 15°Brix con nisina a la concentración de 1000 UI/ml se observa el efecto inhibitorio. La figura 6 muestra que la acción de la nisina es dependiente de la concentración de bacterias, ya que entre mayor sea la población microbiana se requiere más concentración de nisina para obtener valores finales menores a 100 UFC/ml (3).

El tiempo de incubación también mostró ser crítico para la eficiencia de la bacteriocina, ya que cuando se tienen concentraciones iniciales de inóculo del orden de 10 6 y 10 7 UFC/ml, aumentar el tiempo de incubación no hace que la disminución de la carga bacteriana sea mayor, así, podría considerarse que en estos niveles no es justificado el uso de la nisina. Sin embargo, en la figura 7, se puede apreciar que el tiempo de incubación resulta importante para alcanzar los valores bajos (3 UFC/ml).

Con relación al nivel de concentración, se observó que cuando la concentración bacteriana inicial es de 5x104 UFC/ml, la acción de la nisina es más contundente, porque se logran disminuir la población de Bacillus licheniformis hasta 3 UFC/ ml a las 48 horas, mientras que en el medio con sólo extracto de café, el recuento es 30 UFC/ ml. Esto demuestra la efectividad de la nisina en la disminución del crecimiento de Bacillus licheniformis. De la misma manera, se muestra que para un período de 24 horas, el recuento de bacterias con sólo extracto de café es de 2x102 UFC/ml, mientras que con la adición de la nisina se obtienen 60 UFC/ml, con lo cual se cumpliría la norma de calidad de COLCAFÉ S.A.S., (<100 UFC/ml) para este producto que al ser tipo exportación tiene requerimientos más altos.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

Dado que las pruebas sensoriales y fisicoquímicas no mostraron diferencias significativas con el control, cuando se usó la concentración de 500 UI/ml, se concluye que esta concentración es la indicada ya que su efecto es bacteriostático y protege las propiedades sensoriales del café, que es una de las características de mayor interés en la comercialización de este producto.

Las condiciones en las cuales debe ser usada la nisina en el extracto líquido de café es a la concentración de 500 UI/ml y tiempo de incubación 48 horas cuando la concentración inicial de Bacillus licheniformis es 5x104 UFC/ ml, valor cercano a los encontrados en el extracto de café contaminado luego de su comercialización, para obtener una reducción de 4 ciclos logarítmicos.

A partir de este estudio se puede inferir que la nisina podría ser usada como preservante del extracto de líquido de café, ya que contribuye a disminuir o mantener constante la población microbiana del microorganismo de mayor termo-resistencia presente en el producto.

La adición de la nisina como preservante en el extracto líquido de café depende de la concentración inicial de bacterias, y la concentración de la nisina, más no de la concentración de sólidos solubles (expresados en grados ºBrix del producto).

El extracto líquido de café tiene propiedades antimicrobiales contra Bacillus licheniformis, permitiendo disminuir la población inicial de bacterias por cierto tiempo y posteriormente genera la esporulación del microorganismo de interés Agradecimientos A los Laboratorios de Microbiología industrial y Bioconversiones de la Universidad Nacional de Colombia y a la empresa Colcafé S.A.S.

REFERENCIAS

1. Galvez A, Lopez R, Abriouel H, Valdivia E, Omar N. Application of bacteriocins in the control of foodborne pathogenic and spoilage bacteria. Crit Rev Biotechnol 2008; 28(2):125-152.

2. Carlin F, Guinebretiere MH, Choma C, Pasqualini R, Braconnier A, Nguyen-The C. Spore forming Bacteria in commercial cooked, pasteurized and chilled vegetable purees. Food Microbiol 2000; 17(2):153-165.

3. Delves-Broughton J. Nisin as a food p r e s e r va t i v e . Fo o d A u s t ra l i a 2 0 0 5 ; 57(12):527-525.

4. Faustino A, Juncioni de Arauz L, Gava P, Vessoni T. Nisin biotechnological production and application: a review. Tren in Food Sci Technol 2009; 20:146-154.

5. Jeevaratnam K, Jamuna M, Bawa A. Biological preservation of foods- Bacteriocins of lactic acid bacteria. Indian J Biotechnol. 2005; 4:446-454.

6. Mansour M, Millière J-B. An inhibitory synergistic effect of a nisin–monolaurin combination on Bacillus sp. vegetative cells in milk. Food Microbiol 2001; 18(1):87-94.

7. Scurrah J, Robertson E, Craven M, Pearce E, Szabo A. Inactivation of Bacillus spores in reconstituted skim milk by combined high pressure and heat treatment. J Appl Microbiol 2006; 10:172-180.

8. McAuliffe O, Ross R, Hill C. Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action.

FEMS Microbiol Rev 2001; 25(3):285-308.

9. Bouttefroy A, Mansour M, Linder M, Milliere J. Inhibitory combinations of nisin, sodUIm chloride, and pH on Listeria monocytogenes ATCC 15313 in broth by an experimental design approach. Int J Food Microbiol 2000; 54:109-115.

10. Murthy PS, Manonmani HK. Physico-chemical antioxidant and antimicrobial properties of Indian monsooned coffee. Eur Food Res Technol 2009; 229(4):645-650.

Sierra - Evaluación de la nisina como sustancia inactivadora de Bacillus licheniformis 3721 11. Giraldo C. Diseño de un equipo que evite el arrastre de extracto liquido de café para acoplarlo a un evaporador de placas.

[Tesis]. Bogotá: Tesis Universidad Pontificia Bolivariana; 2002.

12. Manzano M, GUIsto C, Iacumin L, Cantoni C, Comi G. A molecular method to detect Bacillus cereus from a coffee concentrate sample used in industrial preparations. J Appl Microbiol 2003; 95(6):1361-1366.

13. Guerra N, Torrado A, Lopez C, Fajardo P, Pastrana L. Dynamic mathematical models to describe the growth and nisin production

by Lactococcus lactis subsp. lactis CECT 539 in both batch and re-alkalized fed-batch cultures. J Food Eng 2007; 82(2):103–113.

14. Tiwari BK, Valdramidis VP, O’Donnell CP, Muthukumarappan K, Bourke P, Cullen PJ. Application of natural antimicrobials for food preservation. J Agric Food Chem 2009; 57(14):5987-6000.

15. Yoon J, Bajpai V, Kang S, Synergistic effect of nisin and cone essential oil of Metasequoia glyptostroboides Miki ex Hu against Listeria monocytogenes in milk samples. Food Chem Toxicol 2011; 49(1):109-140.

16. Reller LB, Weinstein MP, Editors S, Jorgensen JH, Ferraro MJ. Antimicrobial susceptibility testing: A Review of general principles and contemporary practices. Clin Infect Dis 2009; 7750:1749-1755.

17. Ministerio de Salud. Resolución 4125 anexo 4.61. Conservantes usados en alimentos.

Bogotá, Colombia: Ministerio de Salud; 1991.

18. Instituto Colombiano de Normas Técnicas (ICONTEC). Norma Técnica Colombiana NTC 2681: Análisis sensorial, metodología prueba triangular. Bogotá, Colombia: ICONTEC; 2006.

19. Sobolik V, Zitný R, Tovcigreeko V, Delgado M, Allaf K. Viscosity and electrical conductivity of concentrated solutions of soluble coffee.

J Food Eng 2002; 51(2):93-98.

20. Herman C, Maguna F, Garro O, Castro E. Effect of temperature, pH and NaCl on nisin activity against Lactobacillus fructivorans. J Argentine Chem Soc 2009; 97(2): 11-18.

21. Chatterjee C, Paul M, Xie L, Van der Donk W. Review biosynthesis and mode of action of lantibiotics. Chem Rev 2005; 105 (2): 633–684.

22. Instituto Colombiano de Normas Técnicas (ICONTEC). Norma Técnica Colombiana NTC 4675: Extractos solubles de café. Bogotá, Colombia: ICONTEC; 1999.

23. Mueller U, Sauer T, Weigel I, Pichner R, Pischetsrieder M. Identification of H2O2 as a major antimicrobial component in coffee.

Food Funct 2011; 2:265-272.

24. Antonio G, Moraes RS, Perrone D, Maia LC, Santos RN, Farah A. Species, roasting degree and decaffeination influence the antibacterial activity of coffee against Streptococcus mutans. Food Chem 2010; 118:782-788.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3722-3730, 2013.

ORIGINAL

Clarificación combinada y evaluación sensorial de jugo de marañón (Anacardium occidentale L.) Combined clarification and sensory evaluation of cashew juice (Anacardium occidentale L.) Guillermo Arrázola P,1* Ph.D, Armando Alvis B,1 Ph.D, Jorge Osorio M,1 M.Sc. Universidad de Córdoba, Facultad de Ingenieria, Departamento de Ingenieria de Alimentos. Grupo de Investigación Procesos y Agroindustria de Vegetales, Montería, Colombia. *Correspondencia: guillermo.arrazola@ua.es 1

Recibido: Julio de 2012; Aceptado: Junio de 2013.

RESUMEN Objetivo. Obtener jugo clarificado de marañón, evaluar sensorialmente jugos clarificados optimizados y establecer diferencias químicas entre el jugo integral y el clarificado. Materiales y métodos. Los pseudofrutos se separaron manualmente de la nuez, fueron seleccionados y lavados, luego se realizó escaldado y extracción del jugo. El jugo integral y el de mayor aceptación fueron caracterizados químicamente. Los jugos se evaluaron sensorialmente (aceptación) con una escala hedónica de 9 puntos y una prueba de ordenamiento por 30 catadores. Se empleó un diseño factorial de tres niveles combinado con la metodología de superficie de respuesta; las características químicas de los jugos se analizaron por prueba de homogeneidad de varianzas de Levene y la prueba T-Student de comparación de medias para muestras independientes. Resultados. Los jugos evaluados sensorialmente no presentaron diferencias estadísticas significativas entre sí (p≤0.05, p≤0.01); sin embargo el mayor porcentaje de aceptación fue del tratamiento 0.20% p/v Rapidasa® CX y 14.27 horas a 30ºC, se presentaron diferencias estadísticas significativas para las variables pH, °Brix, azúcares reductores y ácido ascórbico (p≤0.05); además, el contenido de ácido ascórbico se redujo notablemente en un 41.01% con respecto al jugo inicial. Conclusiones. El jugo clarificado con alto contenido de vitamina C, obtenido por tratamiento enzimático, constituye una forma de aprovechamiento agroindustrial del pseudofruto, teniendo aceptación para su consumo y sin presentar astringencia, con buen sabor, aroma, mediante tratamiento 0.20% p/v Rapidasa® CX y 14.27 horas a 30ºC. Palabras clave: Composición química, evaluación, extracción de jugo (Fuente: CAB).

3722

Arrázola - Clarificación combinada y evaluación sensorial de jugo de marañon

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ABSTRACT Objective. Obtain clarified cashew juice, in order to sensorially evaluate clarified and optimized juice and establish chemical differences between the integral and the clarified juice. Materials and methods.

The pseudo fruits were manually separated from the nut and were selected and washed, then scalded and the juice was extracted. The natural juice and the most accepted one were chemically characterized.

Juices submitted to sensory evaluation (acceptance) with a 9-point hedonic scale and a test system for 30 tasters. A three-level factorial design combined with response surface methodology was used. The chemical characteristics of juices were analyzed by Levene´s test for homogeneity of variances and T-Student test for comparison of means for independent samples. Results. The evaluated juices displayed no statistically significant differences (p≤0.05, p≤0.01), but the highest percentage of acceptance was for the juice treated with 0.20% w/v Rapidase® CX and 14.27 hours at 30ºC, differences were statistically significant for pH, °Brix, reducing sugars and ascorbic acid (p≤0.05), furthermore, the content of ascorbic acid was significantly reduced by 41.01% compared to the initial juice. Conclusions. The clarified juice with high vitamin C content, obtained by enzymatic treatment, is a way of agro-industrial use of the pseudo fruit, having been accepted for consumption, and non-astringent, with good flavor, aroma, by treatment with 0.20% w/v Rapidase® CX and 14.27 hours at 30°C. Key words: Chemical composition, evaluation, juice extraction, (Source: CAB).

INTRODUCCIÓN El marañón (Anacardium occidentale L) es una fruta que se encuentra bien establecida en todo el mundo tropical, encontrándose desde los Estados Unidos hasta África del sur. Entre los países de mayor concentración del cultivo además de Brasil, se tiene a la India, Kenia, Mozambique y Tanzania (1,2). En Colombia, el objetivo central del cultivo de marañón es la nuez, con una producción aproximada de 5000 toneladas (3).

Mientras que la nuez del marañón es de un alto valor en la industria de alimentos, la manzana (pseudofruto) se considera a menudo como un subproducto con una producción estimada en el año 2006 de 30 millones de toneladas métricas, más allá de la piña y del mango (4). Parte de la producción de pseudofruto se desperdicia, pudriéndose al lado de los arboles después de la cosecha de nuez, sin embargo, otra parte se transforma en jugo, dulces etc.

(5). A pesar del potencial de pseudofruto como materia prima para diversos productos, alrededor del 90% de su producción se desecha cada año, debido a que son muy perecederos y el negocio principal es la comercialización de las almendras (6). Sin embargo, es rica en vitamina C y compuestos fenólicos, sustancias con alto potencial antioxidante, que han atraído el interés de diferentes grupos de investigación (7).

El bajo consumo en el mercado internacional de jugo de marañón es atribuible al uso de preservantes químicos, a la falta de mejora de procesos tecnológicos, a la astringencia por los taninos presentes (8) y presencia de sólidos en suspensión (9). Durante la obtención de jugo del pseudofruto de marañón con la finalidad de remover los fenoles, taninos y eliminar la pectina

se ha empleando enzimas como pectinasas y tanasa asociadas a la microfiltración (8).

Además, se han evaluado agentes clarificantes como almidón comercial y gelatina (9,10).

Por otra parte, se debe tener en cuenta que durante el procesamiento industrial, ocurren modificaciones en los componentes de los frutos que afectan sus propiedades sensoriales, tales como textura, sabor, aroma y valor nutritivo; por lo tanto, un proceso adecuado de las frutas ocasiona pequeñas pérdidas de estas cualidades.

Por lo tanto es necesario que las técnicas de procesamiento y conservación de los jugos sean eficaces de mantener en los productos procesados, las características originales de las frutas (11).

En esta investigación se planteó como objetivo la obtención de jugo clarificado a partir del pseudofruto del marañón empleando agente floculante y enzima comercial, evaluando sensorialmente el jugo obtenido y estableciendo diferencias fisicoquímicas entre el jugo integral y el clarificado; contribuyendo así a crear nuevas alternativas para el uso de la pseudofruto y por lo tanto, para reducir las pérdidas.

MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal. La investigación se realizó en el Laboratorio de Nutrición y el Laboratorio de Microbiología y Biotecnología de Alimentos de la Universidad de Córdoba, sede Berástegui, municipio de Ciénaga de Oro, localizada geográficamente en las coordenadas 8º40’26’’

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latitud Norte y 75º46’44’’ longitud Oeste con respecto al meridiano de Greenwich.

Los pseudofrutos de marañón de los cultivares Martinica, Antillana y Amazónico, se cosecharon en el corregimiento de Pisa Bonito (Chinú, Córdoba), libres de daños mecánicos y en estado de madurez adecuado. La nuez se separó del pseudofruto (manzana) manualmente. La recolección de los pseudofrutos se realizó en las horas de la mañana y fueron transportados hasta el laboratorio, donde se seleccionaron y lavaron.

Obtención del jugo. El jugo integral se consiguió mediante prensado empleando un extractor manual. Después se tamizó a través de un filtro prensa Corel 234 Modelo 2009, equipado con malla de polipropileno con multifilamento, utilizando además una precapa con tierra diatomeas (Hy flow y carbón activo en polvo tipo Darko 50). Para el proceso de clarificación de jugo, los pseudofrutos fueron inicialmente escaldados en agua a 100ºC por 3 min; enfriadas a temperatura de laboratorio y luego prensadas (12).

Caracterización química del jugo de marañón. Para determinar las características fisicoquímicas del jugo integral y clarificado de marañón se realizaron los siguientes análisis: pH, según el método 981.12 (adaptado), usando un potenciómetro Oakton Ion 510 Series; Acidez titulable, según el método 942.15 (adaptado), empleando una solución de NaOH 0.1N, el resultado se expresó como porcentaje de ácido cítrico; Sólidos solubles (°Brix), según el método 932.12 (adaptado) (13), utilizando el refractómetro Bertucci modelo A36P. Determinación de azúcares reductores, método DNS (Ácido 3,5–dinitrosalicílico) de la Universidad Nacional de Colombia (adaptado); taninos, método 952.03 (Folin – Denis) (adaptado) (13) y ácido ascórbico, método fotométrico con 2,4-dinitrofenilhidrazina (14).

Los resultados fueron expresados como mg de azúcares reductores, de ácido ascórbico y de ácido tánico en 100 mL de jugo, respectivamente.

Se empleó un espectrofotómetro GENESIS 20 UV-Vis, realizando nueve repeticiones por análisis y tres replicas analíticas a cada muestra.

Clarificación del jugo de marañón. Para controlar la astringencia del jugo primero se adicionó solución de gelatina® al 1% p/v, se agitó y dejó en reposo por 10 minutos a temperatura de laboratorio (30±1°C), se agitó nuevamente, dejándose en reposo por 30 minutos y se filtró a través de una tela tipo malla (9,15). Luego, al filtrado se le adicionó la enzima comercial

Rapidasa® CX (0,1; 0,15 y 0,2% p/v), a tres tiempos de acción (6, 12 y 18 h), a diferentes temperaturas de acción (20; 25 y 30°C) y un pH ajustado de 4.02.

Una vez concluido el tiempo de acción enzimática, los jugos clarificados se filtraron a vacío usando papel filtro Whatman No 1 (16). El jugo filtrado se embotelló en recipientes plásticos (200 mL), fueron pasteurizados (72°C/30 s) y luego refrigerados (4°C), tomando las muestras para los respectivos análisis.

Evaluación de la actividad enzimática.

Mediante espectrofotometría se determinó la concentración de azucares reductores (método DNS) y grado de clarificación (16,17) de los jugos tratados enzimáticamente. A los resultados se les realizó análisis de regresión y optimización.

Análisis sensorial. Se seleccionaron tres tratamientos del proceso de optimización y se evaluaron una escala hedónica (18), aplicando una prueba descriptiva con una escala estructurada de nueve (9) puntos (donde 1 = disgusta muchísimo, 5 = indiferente y 9 = gusta muchísimo) y una prueba de ordenamiento, los resultados fueron analizados por Anova y presentados en forma gráfica para obtener una idea cualitativa y cuantitativa del espectro o configuración del nivel de agrado de los jugos clarificados.

Diseño Experimental. Se utilizó un diseño factorial a tres niveles para el ajuste de un modelo cuadrático, combinado con la metodología de superficie de respuesta. La variables independientes fueron concentración enzimática (x1), temperatura de acción (x 2) y tiempo de acción (x3), cada una con tres niveles. Un total de 32 diferentes combinaciones (incluyendo seis replicas del punto central) fueron seleccionados en orden aleatorio. Las variables dependientes (y) fueron concentración de azúcares reductores y grado de clarificación (absorbancia). El software estadístico comercial Desing Expert Versión 6.0.1 (Stat-Ease, Minneapolis, USA) fue empleado para generar el diseño experimental, los análisis estadísticos y modelo de regresión.

Las características fisicoquímicas de los jugos integral y clarificado de mayor aceptación se analizaron por prueba de homogeneidad de varianzas de Levene y la prueba T-Student de comparación de medias para muestras independientes.

Arrázola - Clarificación combinada y evaluación sensorial de jugo de marañon RESULTADOS Fisicoquímicas del jugo de marañón. En la tabla 1, se muestran los resultados promedios de los análisis fisicoquímicos obtenidos en el jugo integral de marañón.

Tabla 1. Análisis fisicoquímicos del jugo integral y clarificado de marañón.

Jugo Integral de marañón

Jugo Clarificado de marañón

pH

4.03±0.04a

4.15±0.00 b

Acidez

0.32±0.03 a

0.39±0.01 a

°Brix (Sólidos solubles)

14.11±0.78 a

8.33±0.58 b

Azucares reductores (mg/100 mL)

60.31±7.80

242.67±4.62

Análisis Fisicoquímicos

Ácido tánico (mg/100 mL) Ácido ascórbico (mg/100 mL)

0.71±0.56

a

a

210.08±20.04 a

0.27±0.01

b

a

123.93±1.42 b

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Tabla 2. Información estadística para las variables de respuesta azúcares reductores y grado de clarificación.

Factor

Azúcares reductores (mg/100 mL jugo)

Grado de clarificación (Abs.)

costante

220.76

0.030

E

3.36 NS

-1.056x10-3***

T

13.81***

-1.611x10-3***

t

24.90***

-2.944x10-3***

E2

-1.40 NS

7.258x10-4 NS

T

-2.46 NS

3.925x10-4 NS

C2

-24.28***

2.392x10-3***

Tt

-1.57**

1.667x10-4**

ET

-5.09 NS

1.000x10-3 NS

Et

-1.06 NS

-3.333x10-4 NS

R2

0.9364

0.8677

2

a, b

Promedios con la misma letra son estadísticamente iguales para la prueba de homogeneidad de varianzas de Levene y la prueba T-Student de comparación de medias para muestras independientes.

E: concentración enzima (% p/v); T: temperatura de acción (°C); t: tiempo de acción (h). **α=5%; ***α=1%; NS: No significativo, R2= coeficiente de determinación.

Obtención de jugo clarificado de marañón.

Los pseudofrutos que fueron seleccionados para el proceso de obtención de jugo clarificado, se sometieron a escaldado como método para la estabilización de la materia prima. Se extrajo el jugo por prensado mecánico obteniendo un rendimiento del 60% y generándose un bagazo.

El jugo fresco obtenido de los pseudofrutos escaldados fue envasado en recipientes plásticos y mantenidos congelación (-18°C) para los posteriores análisis.

el contenido de azúcares reductores, mientras que para el grado de clarificación esta variable fue significativa (p≤0.01). Por otra parte, el coeficiente cuadrático del tiempo de acción fue altamente significativo (p≤0.01), mientras que el coeficiente cuadrático de la temperatura de acción y la concentración de la enzima no fueron significativas para azucares reductores y grado de clarificación (p>0.01).

Más adelante, el jugo integral fue descongelado hasta llevarlo a temperatura de laboratorio, donde se les realizó el tratamiento con la solución de gelatina, observándose la formación de flóculos que se retiraron por filtración. Luego los jugos fueron expuestos a los diferentes tratamientos enzimáticos. Seguidamente, se evaluó la actividad enzimática mediante la obtención de los jugos clarificados y pasteurizados para la determinación de azucares reductores y el grado de clarificación de los jugos.

Evaluación de la actividad enzimática.

En la tabla 2, se muestran los coeficientes de las ecuaciones de regresión ajustadas para el contenido de azucares reductores y grado de clarificación, utilizados para establecer la influencia de la concentración de la enzima, la temperatura y tiempo de acción sobre la obtención de jugo clarificado de marañón.

Como puede observarse las variables tiempo y temperatura de acción son altamente significativos para el contenido de azúcares reductores y grado de clarificación (p≤0.01). La concentración enzimática no fue significativa para

Los análisis estadísticos mostraron que la interacción temperatura y tiempo de acción fue significativa para el contenido de azucares reductores y grado de clarificación (p≤0.05), mientras que las demás interacciones no fueron significativas (p>0.05).

Las ecuaciones de regresión ajustadas se utilizaron para obtener los gráficos de las superficies de respuesta y visualizar los efectos de la concentración enzimática, temperatura y tiempo de acción sobre las variables analizadas.

Azúcares reductores = -155.570 + 25.365t + 10.351T - 0.674t2 - 0.169tT En la figura 1a, se aprecia que la concentración de azúcares reductores incrementa con el aumento del tiempo y la temperatura de la acción.

Asimismo, en la figura 1b, se observa aumento de los azúcares reductores con el incremento de la concentración enzimática; sin embargo estadisticamente esto no fue significativo (p>0.01). La máxima cantidad de azúcares reductores en el jugo clarificado se obtiene al combinar 0.15% de Rapidasa® CX, temperatura

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a

224.462 mg/100 mL azúcares reductores

236.152

214.669

mg/100 mL azúcares reductores

b

233.059

193.186

171.703

150.219

215.866

207.269 198.672

30.00 27.50 18.00

25.00

15.00 12.00

30.00 27.50

B: temp. °C

22.50

25.00

B: temp. °C

9.00

22.50 20.00 0.10

6.00 20.00

C: tiempo (H)

0.13

0.18

0.15

0.20

A: [% enzima]

Figura 1. Superficie de respuesta para el contenido de azúcares reductores de jugo clarificado como una función (a) temperatura y tiempo (concentracion enzimatica 0.15% p/v); (b) concentración enzima y temperatura (12 horas)

de acción de 30°C y un tiempo de 12 horas, con un promedio de 249.091 mg/100 mL. La acción de la enzima Rapidasa® CX fue demostrada en cada uno de los tratamientos al compararse con el contenido de azúcares del jugo patrón (63.177 mg/100 mL).

Grado de clarificación = 0.078 - 3.002x10 3 t - 0.081E - 1.307x10-3T + 6.645x10-5t2 + 3.333x10-5tT

grado de clarificación se observó al emplear 0.15% p/v de enzima, temperatura de 25°C y un tiempo de 12 horas. En la figura también se evidencia que los valores de absorbancia decrecen con el incremento del tiempo. El grado de clarificación presentó la más baja absorbancia al tiempo de acción más alto. También, se aprecia que los valores de absorbancia disminuyeron con el aumento de la temperatura de acción a una concentración enzimatica fija. La acción de la enzima Rapidasa® CX fue constatada en cada uno de los tratamientos teniendo como referencia la absorbancia del jugo patrón (0.128).

El jugo clarificado es un jugo natural que tiene menos solidos no solubles en suspención, por lo cual no presenta turbidez. En la figura 2, se representa la variación del grado de clarificación de los jugos de marañón en función del tiempo y la temperatura de acción a las diferentes concentraciones de la enzima pectinasa. El mayor

La absorbancia al medir el grado de clarificación de los jugos es inversamente proporcional a la concentración de la enzima. Asimismo, la absorbancia de los jugos clarificados disminuye con el aumento del tiempo y temperatura de acción, con respecto al aumento de la concentración enzimática.

La ecuación del modelo ajustado para el grado de clarificación de los jugos obtenidos fue la siguiente:

a

0.0356584

0.0305914

0.0331699

0.0292581 0.0279247

0.0306814 0.0281928

0.10

20.00

0.13

A: [% enzima]

b

0.038147

0.0319247

Absorbancia a 660 nm

Absorbancia a 660 nm

0.0332581

22.50

0.15 0.18 0.20 20.00

22.50

25.00

27.50

30.00

B: temp. °C

25.00 27.50 30.00 6.00

B: temp. °C

9.00

12.00

15.00

18.00

C: tiempo (H)

Figura 2. Superficie de respuesta para el grado de clarificación de jugo clarificado como una función (a) concentración enzima y temperatura (12 horas); (b) temperatura y tiempo (concentracion enzimatica 0.15% p/v).

Arrázola - Clarificación combinada y evaluación sensorial de jugo de marañon Optimización del proceso de Clarificación. Se determinaron las condiciones óptimas para los resultados deseados como contenido de azúcares reductores (máximo) y grado de clarificación (mínima absorbancia). Dado que la respuesta óptima para cada variable dependiente no caen exactamente en la misma región, se realizó la intercepción de las superficies de respuestas.

En la tabla 3, se registran las soluciones numéricas del proceso de optimización arrojado por el software estadístico teniendo en cuenta el criterio de selección antes mencionado. En ella se observa cinco soluciones con la respuesta calculada para azúcares reductores entre 236.646 a 236.568 mg/100 mL y absorbancia de 0.027; con un porcentaje de conveniencia del 91.9 al 92%. A partir de estos resultados se escogieron tres tratamientos optimizados teniendo en cuenta la concentración enzimática y el tiempo de acción. A las soluciones con igual concentración enzimática se les determinó un tiempo medio de acción. Los tratamientos para evaluar el nivel de agrado de los jugos clarificados correspondieron a: 0.18% p/v Rapidasa® CX por 14.37 horas (referencia: J_030); 0.19% p/v Rapidasa® CX por 14.25 horas (referencia: J_205) y 0.20% p/v Rapidasa® y 14.27 horas (referencia: J_711).

Tabla 3. Soluciones numéricas del proceso de optimización para la obtención de jugo clarificado de marañón.

No Tiempo

Azúcares Grado de Concentración Reductores clarificación enzimática Conveniencia (mg/ (Abs 660 (%p/v) 100 mL) nm)

1

14.27

0.19

236.568

0.027

0.920

2

14.24

0.19

236.558

0.027

0.920

3

14.30

0.20

236.498

0.027

0.920

4

14.25

0.20

236.479

0.027

0.920

5

14.37

0.18

236.646

0.027

0.919

Evaluación sensorial de los jugos clarificados de marañón. El análisis sensorial en la escala estructurada mostró que el 63.33% de los catadores al menos referenció gustarle ligeramente el jugo rotulado como J_711, el 60.00% el jugo J_030 y 56.67% el jugo J_025. En la prueba de ordenamiento el 60.00% de los panelistas expresaron sentir mayor agrado con el jugo J_711, seguido del jugo J_025 y por último el J_030 con el 26.67 y 13.33%, respectivamente.

El análisis de varianza realizado a los resultados de la evaluación sensorial mediante la escala estructurada (F calculado = 1.330) y la prueba de ordenamiento (F calculado = 1.243) de los tres jugos escogidos del proceso optimización no mostraron diferencias estadísticas significativas, para una significancia del 5%. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la prueba de

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aceptación se escogió como mejor tratamiento al jugo J_711 que se obtuvo por el tratamiento de 0.20% p/v Rapidasa®, 14.27 h a 30°C. Características fisicoquímicas del jugo clarificado de marañón. La prueba de homogeneidad de varianzas de Levene y la prueba T-Student de comparación de medias para muestras independientes entre el jugo integral y clarificado de marañón que presentó mayor aceptación en la evaluación sensorial, mostraron que solo las variables pH, °Brix, azúcares reductores y ácido ascórbico presentan diferencias estadísticas significativas (Tabla 1).

El pH del jugo clarificado de marañón aumentó con respecto al jugo integral. También se observa que la acidez titulable se incrementó, lo que está relacionado con el aumento de azucares reductores, sin embargo esta variación no es significativa estadísticamente (p≤0.05). El contenido de azucares reductores incrementó significativamente debido a la acción enzimática sobre la pectina presente en el jugo integral, esta actividad conduce a la liberación de moléculas de ácido galacturónico.

Por otra parte, se aprecia una disminución en los sólidos solubles en el jugo clarificado con respecto al jugo integral. En el mismo sentido, el contenido de ácido tánico disminuyó de 0.707 mg/100 mL en el jugo integral a 0.268 mg/100 mL en el jugo clarificado; con lo cual se reduce la astringencia del jugo, aumenta su grado de clarificación y nivel de agrado. El contenido de ácido ascórbico se redujo notablemente en un 41.01% respecto al jugo inicial (Tabla 1).

DISCUSIÓN Fisicoquímicas del jugo de marañón. El pH del jugo integral de marañón presentó valores dentro del rango de pH reportados por otros autores para pulpa pseudofruto de marañón comercial (3.77-4.23) (8,11,19) y en jugo integral de pseudofruto de marañón clon CCP-76 (3.16-4.59) (9,20,21).

Los valores de acidez son menores a datos reportados entre 1.17-1.42% (20) y están dentro del rango reportado de 0.19-0.37% (21).

Los ºBrix presentaron resultados mayores a los reportados de 7.4-12.5 ºBrix (8,9,11) y menores a los publicados entre 16.46-17 ºBrix (20).

El contenido de azúcares reductores (60.312 mg/100 mL equivalente a 6.03%) fue menor a las concentraciones reportadas para pulpa de marañón comercial con 9.85% azúcares

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reductores (19) y mayores a los datos obtenidos para pseudofruto de marañón con porcentajes entre 1.45-1.46% de azúcares reductores (21).

El contenido de ácido ascórbico del jugo es mayor a los determinados en pulpa de manzana de marañón comercial con valores de 135 - 203.5 mg/100 mL (5,8,11,22); se encuentran dentro del rango de 206.20-252.40 mg/100 mL (21) y son menores a 335 mg/100 mL (9), reportados en jugo de marañón clon CCP-76.

El contenido de ácido tánico fue menor a los reportados para pulpa de marañón comercial (0.71-4.35 mg/100 mL) (8,11,21) y jugo de marañón clon CCP-76 (9).

Obtención de jugo clarificado de marañón.

Durante la extracción de jugo integral a partir de los pseudofrutos escaldados se generó un bagazo que representa aproximadamente el 40% del peso de la manzana de marañón. Para el aprovechamiento de este subproducto se ha empleado como sustrato para alimentos de animales (23) o para la obtención de productos de valor agregado (24).

La gelatina en solución acuosa, que se empleó para el control de la astringencia del jugo, se comporta como un coloide hidrófilo con carga eléctrica negativa, transformándose en otro coloide también hidrófilo con carga negativa cuando se le añade a jugo, con un valor de pH inferior a 4.7 donde se encuentra su punto isoeléctrico. La interacción gelatina y taninos, con ayuda de la presencia de cationes del jugo (calcio, potasio, hierro, etc.), producen la descarga del coloide y su consiguiente floculación (25). De este modo se favoreció la reducción de la astringencia de los jugos. La gelatina sin sabor presenta una mejor clarificación porque no muestra cambios significativos en las propiedades sensoriales del jugo (9).

Uno de los principales problemas encontrados en la obtención de jugo de marañón es la turbidez dedido principalmente a la presencia de pectinas. La turbidez en estos casos es dificil de eliminar excepto por despectinación enzimática.

La pectinasa hidrolisa la pectina y provoca que complejos pectina-proteina floculen (17). El jugo resultante del tratamiento con la pectinasa puede tener una baja cantidad de pectina y una menor viscosidad, lo cual es ventajoso para facilitar los subsecuentes procesos (26). La hidrolisis de sustancias pecticas (pectina, protopectina, ácidos pécticos, acidos pectinícos) esta influenciada por varios factores del tratamiento enzimatico tales como tiempo, temperatura de acción y concentración de la enzima (27).

La influencia de los factores concentración de la enzima, tiempo y temperatura de acción en esta investigacion, fueron similares a los reportados para la optimización de la clarificacion de jugo de carambola (Averrhoa carambola L) (16) y para la clarificacion de jugo de nispero (Achras sapota) (17).

Características fisicoquímicas del jugo clarificado de marañón. El pH del jugo clarificado de marañón aumentó con respecto al jugo integral; así mismo se ha reportado un incremento en el pH del jugo clarificado de marañón por microfiltración en relación al jugo integral (8).

La disminución en el contenido de los sólidos solubles en el jugo clarificado con respecto al jugo integral es debido a degradación de pectina y precipitación de protopectina por acción enzimática; reduciendo así las sustancias que se encuentran en suspensión en el jugo clarificado final (26,27).

El contenido de ácido tánico disminuyó en el jugo clarificado; la explicación para este comportamiento puede ser debido a la atracción que ejerce el agente coagulante sobre los compuestos fenólicos, propiciando la formación de coágulos y por consiguiente su precipitación (9).

La perdida de vitamina C se presenta por una reacción de oxidación la cual ocurre en el jugo de fruta durante el almacenamiento, y es altamente dependiente de la cantidad de oxígeno en el espacio de cabeza o disuelto en el jugo y la temperatura de procesamiento (28). El porcentaje de pérdida en el contenido de ácido ascórbico en esta investigación es mayor al reportado en la obtención de jugo clarificado por microfiltración, donde se obtuvo una reducción del 22.96% (8) y del 14.28% (11) en relación a la fruta fresca. La reducción en el contenido de vitamina C en esta investigación se atribuye al método de conservación, por someter el jugo a un tratamiento térmico como la pasterización. La pasteurización tiene como objetivo producir un alimento seguro, de alta calidad, a bajo costo, prolongar la vida de anaquel del alimento, mantener las características deseables (26) como el pH del producto y sus propiedades organolépticas. Durante el proceso de pasterización realizado, se logra conseguir la estabilidad (desoxigenación) y calidad del producto inactivando microorganismos termolábiles y enzimas deteriorantes (26, 27); sin embargo, puede afectar el contenido nutricional de los alimentos como las vitaminas.

Arrázola - Clarificación combinada y evaluación sensorial de jugo de marañon En conclusión las variables independientes temperatura y tiempo de acción afectaron notablemente el contenido de azúcares reductores, mientras que la variable concentración enzimática, junto con las anteriores, ejercieron influencia significativa sobre la variable respuesta grado de clarificación de los jugos clarificados.

El contenido de vitamina C del jugo de marañón se vio reducido por oxidación durante el procesamiento para la obtención de un jugo clarificado. Sin embargo, puede considerarse como una fuente de ácido ascórbico. Teniendo en

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cuenta los resultados obtenidos en la prueba de aceptación se escogió como mejor tratamiento al jugo J_711 que se obtuvo por el tratamiento de 0.20% p/v Rapidasa®, 14.27 horas a 30°C. Agradecimientos A la Asociación de Productores de Marañón de la Sabana (Chinú-Colombia) y a la Comisión Departamental de Ciencia y tecnología CODECYT (Gobernación de Córdoba, Colombia).

REFERENCIAS

1.

2.

3.

4.

Galdámez A. Guía Técnica del Cultivo del Marañón. Programa Nacional de Frutas de El Salvador. Ministerio de Agricultura Y Ganadería. Gallardo (México): Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura IICA; 2004.

Sousa de Brito E, Pessanha de Araújo M, Lin L, Harnly J. Determination of the flavonoid components of cashew apple (Anacardium occidentale) by LC-DAD-ESI/MS. Analytical, Nutritional and Clinical Methods. Food Chem 2007; 105:1112–1118.

Rodríguez L. Marañón un Recurso Valioso para el Aprovechamiento Industrial en Colombia. Aliméntica 2007; 5:2-5.

Statistical databases, FAO (FAOSTAT).

[Internet]. Roma, Italy: FAO. 2007 [Actualizado 8 de enero del 2007; citado 18 de septiembre de 2010].Disponible: http://faostat.fao.org/site/567/default. aspx#ancor.

5.

Akinwale T. Cashew apple juice: its use in fortifying the nutritional quality of some tropical fruits. Eur Food Res Technol 2000; 211(3):205-207.

6.

Paiva FA, Garruti DS, Silva Neto RM. A p r ove i t a m e n t o i n d u s t r i a l d o c a j u .

Fortaleza: Embrapa Agroindústria Tropical/ SEBRAE; 2000.

7.

Jiao B, Cassano A, Drioli E. Recent advances on membrane processes for the concentration of fruit juices: a review. J Food Eng 2004; 63:303-324.

8.

Pereira D, Sabino A, Blumenberg D, Martins V, Corrêa L, Couri S. Cashew apple juice stabilization by microfiltration. Desalination 2002; 148:61-65.

9.

Sindoni M, Caldera E, Pérez A, Marcano L, Parra R, Marín C. Evaluation of coagulating agents for the formulation of juice from pseudofruits of merey. Agronomía Tropical 2007; 57(1):61-65.

10. Jayalekshmy V, John P. ‘Sago’ - a natural product for cashew apple juice clarification.

Short communication. J Trop Agric 2004; 42(1-2):67-68.

11. Cianci F, Silva L, Cabral K, Matta V. Clarification and concentration of cashew apple juice by membrane processes. Cienc Tecnol Aliment 2005; 25(3):579-583.

12. Arrázola G, Villalba M. Frutas, hortalizas y t ub e rc ul o s . Pe rs p e c t i vas d e ag ro industrialización. Montería, Colombia: Universidad de Córdoba; 2009.

13. Association of Official Analytical Chemists (A.O.A.C.). Official methods of analysis of the Association of Official Analytical C h e m i s t s . Wa s h i n g t o n , D C : T h e Association; 1990.

14. Linhares L, Donizete C, Patto C, Duarte A. Chemical, physical and enzymatic transformations of guavas treated at postharvest with calcium chlorite and 1-methylciclopropone and stored under refrigeration. Ciênc Agrotec Lavras 2007; 31(3):829-841.

3730

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

15. Ashurst PR. Producción y Envasado de Zumos y Bebidas de Frutas sin gas. 2a edición.

Zaragosa, España: Acribia, S.A.; 1995.

22. Janick J, Paull R. The encyclopedia of fruits and nuts. Cambridge, UK: Cambridge University Press; 2006.

16. Liew A, Sulaiman N, Aroua M, Megat M. Response surface optimization of conditions for clarification of carambola fruit juice using a commercial enzyme. J Food Eng 2007; 81:65-71.

23. Santos R, Santiago A, Gadelha C, Cajazeiras J, Cavada B, Martins J, Oliveira T, Bezerra G, Santos R, Freire V. Production and characterization of the cashew (Anacardium occidentale L.) peduncle bagasse ashes. J Food Eng 2007; 79(20):1432-1437.

17. Sin H, Yusof S, Sheikh H, Rahman R. Optimization of clarification of sapodilla juice using Response surface methodology.

J Food Eng 2006; 73:313-319.

18. Anzaldúa, A. Evaluación Sensorial de los Alimentos en la Teoría y en la Práctica.

Zaragoza, España: Acribia, S.A.; 1998.

19. Azoubel P, Cipriani D, El-Aouar A, Antonio G, Xidieh E. Effect of concentration on the physical properties of cashew juice. J Food Eng 2005; 66:413-417.

20. Guerrero R, Lugo L, Marín M, Beltrán O, León de Pinto G, Rincón F. Physicalchemical characterization of the fruit and pseudofruit of Anacardium occidentale L. (cashew) under unirrigated land conditions.

Rev Fac Agron (LUZ) 2008; 25:81-94.

21. Lowor S, Agyente-Badu C. Mineral and Proximate Composition of Cashew Apple (Anacardium occidentale L.) Juice from Northern Savannah, Forest and Coastal Savannah Regions in Ghana. Am J Food Technol 2009; 4(4):154-161.

24. Lopes T, Rabelo M, Barros L, Saavedra G, Rodrigues S. Fermentation of cashew Apple juice to produce high added value products. World J Microbiol Biotechnol 2007; 23:1409-1415.

25. Molina R. Teoría de la Clarificación de mostos y vinos y sus aplicaciones prácticas. Madrid: AMV Ediciones, Mundi Prensa; 2000.

26. Rai P, Majumdar GC, DasGupta S, De S. Optimizing pectinase usage in pretreatment of mosambi juice for clarification by response surface methodology. J Food Eng 2004; 64:397-403.

27. Lee WC, Yusof S, Hamid NSA, Baharin BS. Optimizing conditions for enzymatic clarification of banana juice using response surface methodology (RSM). J Food Eng 2006, 73:55–63.

28. Oliveira M, Arraes G, Wilane R, Moreira de Souza M, Montenegro I. Storage stability of cashew Apple juice preserved by hot fill and aseptic processes. Cienc Tecnol Aliment 2003; 23:106-109.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3731-3737, 2013.

ORIGINAL

Actividad mutagénica y genotóxica del material particulado PM2.5 en Cúcuta, Colombia Mutagenic and genotoxic activity of particulate matter PM2.5 from Cucuta, Colombia Ricardo Beleño H,1 Qco, Alfonso Quijano P,1 Ph.D, Iván Meléndez G,2* M.Sc. Universidad de Pamplona. Facultad de Ciencias Básicas. Pamplona, Colombia, 1Grupo de Investigación en Química. 2Grupo de Investigación en Biología Molecular. *Correspondencia: imgelvez@unipamplona. edu.co.

Recibido: Marzo de 2012; Aceptado: Febrero de 2013.

RESUMEN Objetivo. Determinar la actividad mutagénica y genotóxica del material particulado PM2.5, captado cerca de una vía de alto flujo vehicular en Cúcuta, Colombia. Materiales y métodos. Entre Enero-Julio de 2011, el PM2.5 fue monitoreado con un equipo Partisol 2025 Plus usando filtros de cuarzo Palmflex. La actividad mutagénica y genotóxica de los extractos del PM2.5 fue determinada usando dos ensayos: el test de Ames y el ensayo cometa.

En el ensayo mutagénico se utilizó la cepa TA 100 de Salmonella Typhimurium. Para determinar el daño genotóxico se utilizaron linfocitos de sangre periférica. Resultados. Por primera vez en la región fronteriza de Colombia y Venezuela, se reporta la actividad mutagénica y genotóxica asociada con el PM2.5 de Cúcuta. Los resultados muestran actividad mutagénica en la cepa de Salmonella Typhimurium TA-100 y genotoxicidad en linfocitos humanos de sangre periférica. Conclusiones. En las muestras del material particulado PM2.5 de la ciudad de Cúcuta se encuentran compuestos que inducen mutaciones, así como compuestos que pueden penetrar hasta la célula e inducir daño en su ADN, lo que puede representar un riesgo en la manifestación de enfermedades tales como el cáncer en la población expuesta.

Palabras clave: Ensayo cometa, Salmonella typhimurium, Test de mutagenicidad (Fuente: MeSH).

ABSTRACT Objective. To determine mutagenic and genotoxic activity of particulate matter PM2.5 collected in high vehicular traffic way of Cucuta, Colombia. Materials and methods: Between January to July of 2011, PM2.5 was monitored by a Partisol 2025 sequential air sampler by using Plus Palmflex quartz filters. The mutagenic and genotoxic activity from extract of PM2.5 was determinate by using two assays: the Ames test and comet assay. In the mutagenic assay we used the Salmonella Typhimurium strain TA-100. To determine the genotoxic damage peripheral blood lymphocytes were used. Results: This is the first study that has been conducted in border region of Colombia and Venezuela that reports the mutagenic and genotoxic activity associated with particulate matter PM2.5 from Cucuta. The result show mutagenic activity in the Salmonella Typhimurium strain TA-100 and genotoxicity in peripheral blood human lymphocytes. Conclusions: Samples of particulate matter PM2.5 from Cucuta city were found, compounds that induced mutation by base substitution were found, also compounds that can reach the cell nucleus and induced genotoxic damage in their ADN were found. This can represent a risk in the population exposed for manifestation for diseases such as cancer. key words: Comet assay, mutagenicity test, Salmonella typhimurium (Source: MeSH).

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INTRODUCCIÓN Un requisito básico para la salud y el bienestar humano es respirar un aire limpio, la contaminación atmosférica es una amenaza significativa para la salud por la presencia en el aire de materias o formas de energía que implican riesgo, daño o molestia grave para las personas (1).

Los contaminantes del aire generalmente se clasifican en partículas en suspensión-material particulado (PM), contaminantes gaseosos y olores. La contaminación ambiental del aire se debe a las actividades industriales y al tráfico vehicular. Diferentes estudios epidemiológicos sugieren que la contaminación ambiental del aire puede ser la responsable del incremento del cáncer pulmonar (2).

El material particulado (PM) está compuesto por una mezcla heterogénea de partículas de diferentes tamaños y composición química, algunas de los cuales se emiten directamente mientras que otras son productos de la oxidación de estas emisiones directas (3).

La principal fuente de PM en nuestras ciudades son los procesos de combustión, en los cuales se incluyen fundamentalmente las emisiones vehiculares (4). La exposición al material particulado (PM) ha sido asociado con numerosos efectos adversos a la salud (5) y varios estudios específicos relacionan la exposición del PM proveniente de los vehículos con muertes prematuras (6,7) De acuerdo con su proceso de formación las partículas se pueden dividir en dos grupos: finas y gruesas. Las partículas finas son las de diámetro aerodinámico comprendido entre 10 μm (PM 10), 2.5 μm (PM2.5) y 1 μm (PM 1), son de mayor peligrosidad al ser totalmente respirables y tienen la capacidad de penetrar y depositarse en la región traqueo bronquial y alveolar del tracto respiratorio (8), Estas partículas absorben sustancias orgánicas de alta toxicidad (9), que están implicadas en la aparición de enfermedades, incluyendo problemas respiratorios, cáncer, artritis reumatoide, ataque al corazón y el envejecimiento (10). Por lo tanto, las partículas finas en el aire se consideran más tóxicas que las partículas gruesas (PST mayores de 10 μm), ya que estas se depositan principalmente en las cavidades nasal y oral (11).

Varios estudios que evalúan la actividad mutagénica del PM atmosférico, concluyen que los componentes mutagénicos están localizados en la fracción de partículas de menor tamaño, entre 2.0-3.3 μm de diámetro (12), lo que constituye efectivamente un riesgo para la

salud. El impacto del PM en la salud, se debe a que las partículas finas (PM10 y PM2.5) tienen la capacidad de inducir estrés oxidativo en las células a través de la producción de especies reactivas de oxígeno (13,14), de igual manera el material particulado podría inducir mutación a través de compuestos orgánicos tales como hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), que son carcinógenos humanos reconocidos (15) o por la presencia de compuestos inorgánicos tales como sulfatos, nitratos y metales (16).

El PM proveniente del diesel ha sido clasificado como un contaminante atmosférico tóxico, debido a sus propiedades carcinogénicas y mutagénicas (17). Potencialmente puede causar problemas respiratorios, cardiovasculares e inducir a reacciones alérgicas (18-20). Además, está implicado en el incremento de la morbimortalidad según el grado de exposición ambiental (21). El PM proveniente de la gasolina es considerado un posible carcinógeno humano, ya que contiene componentes tóxicos como el benceno, 1,3 butadieno, y metil-ter-butiléter (MTBE) (22). Es conocido que las fuentes móviles contribuyen significativamente al nivel de mutágenos en el aire (23). La presencia de mutágenos en el aire atribuida a las fuentes móviles es debida a la correlación positiva entre mutagenicidad indirecta y benzo [g, h, i] perileno, que es un indicador de HAP emitidos por los escapes de motores diesel y gasolina (22).

Las concentraciones de Pb, Zn, V, Cd en el aire, (24) están relacionadas con la mutagenicidad de acción directa de la materia orgánica particulada; estos metales son emitidos desde distintas fuentes como los automóviles, los calentadores de agua de las casas y otras fuentes de combustión.

El objetivo del presente estudio fue determinar la actividad mutagénica y genotóxica del material particulado PM2.5, captado cerca de una vía de alto flujo vehicular en la ciudad de Cúcuta, Colombia.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de muestreo del PM2.5. El monitoreo del PM fracción respirable PM2.5 se realizó en la localidad de Cúcuta, Colombia en el período de enero-Julio del año 2011, con el equipo Partisol- 2025 Plus de la Ruprecht-Patashnik, que se ubica en la azotea del edificio del CREAD de la Universidad de Pamplona en la Diagonal Santander que es una zona céntrica, donde predomina un mayor flujo de vehículos de transporte público y particular, que utilizan como combustible el diesel y la

Beleño - Actividad mutagénica y genotóxica del material particulado PM2.5 gasolina. Las muestras ambientales de PM2.5, se recolectaron en un filtro Palmflex de microquarzo de 47 mm, en muestreos de 24 horas, con una frecuencia de tres días.

Tratamiento químico de los filtros. Extracción Soxhlet. La materia orgánica particulada presente en los filtros de PM2.5 fue extraída con una mezcla de Diclorometano (DM) (Mallinckrodt Chemicals) y Acetona al 99.8% (v/v), (RA Chemicals) (1:1, la extracción se realizó por 48 horas en ciclos de 13 minutos.

Extracción por ultrasonido. Se utilizó un baño ultrasónico (Branson 1510, modelo 1510R-MT).

Los filtros provenientes del monitoreo del PM2.5 se colocaron en un vaso de precipitado con 20 ml de DM/Acetona 1:1 durante 10 minutos a temperatura de 23ºC-24ºC; seguidamente se hicieron dos repeticiones utilizando 15 ml por 10 minutos a 23ºC-24ºC. Concentración de material orgánico. Una vez obtenido el extracto, se concentró en un evaporador rotatorio de vacío, marca Heidolph modelo Laborota 400-1, a una temperatura de 30ºC a 150 rpm; hasta alcanzar un volumen aproximado de 2 ml. Posteriormente el extracto se transfirió a viales, se sellaron y se mantuvieron en refrigeración y en la oscuridad hasta su análisis.

Detección de la actividad mutagénica. El efecto mutagénico de los extractos del PM2.5 del aire de Cúcuta, se determinó por medio del test de Ames, usando el protocolo descrito por Maron y Ames (25). En esta prueba el indicativo de la mutación está dado por la reversión his - a his +, las revertantes se identifican porque crecen en medio mínimo sin histidina. Se trabajó con una cepa de Salmonella Typhimurium cepa TA 100 en la cual se produce la reversión por sustitución de un par de bases. Con cada muestra se trataron 107 UFC, se utilizaron controles positivos y negativos. Para el control positivo se utilizó 4-nitroquinolina óxido (4-NQO). Como control negativo se usó DMSO al 12%. Se catalogó como respuesta positiva, los resultados que presentaron un incremento significativo de revertantes con relación al control negativo y este resultado fue reproducible. Para realizar los análisis mutagénicos y genotóxicos se evaluaron tres concentraciones de material particulado (50 µg, 100 µg y 150 µg). Para verificar la reproducibilidad de los resultados se realizaron tres experimentos independientes, cada uno por duplicado.

Detección del daño en el ADN. Para detectar ruptura del ADN se utilizó el Ensayo “COMETA” en microgel de una célula. Se siguió la metodología

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propuesta por Singh et al en 1988 (26). Esta metodología consta de los siguientes pasos: Se tomaron 200 ml de suspensión de células (1x106 UFC) se incubaron con 50 ml de la concentración de PM a ensayar. Luego se extraen 10 ml y se mezclan con 75 ml de agarosa de bajo punto de fusión (LMA) al 0.5 % (p/v), esta suspensión se pipetea sobre portaobjetos previamente impregnados con agarosa de punto de fusión normal y se cubre con cubreobjetos. Los portaobjetos se conservan a 3ºC por 6 min para favorecer la polimerización de (LMA), se retira la laminilla y se agregan 100 ml más de (LMA), se vuelve a conservar otros 6 minutos. Luego los portaobjetos se sumergen en solución de lisis fresca (2.5 M NaCl, 100 mM Na EDTA, 10 mM Tris, 10% (p/v) DMSO, 1% (p/v) Sarcocinato de Na, 1% (v/v) Tritón X-100) a pH 10. Se deja en nevera a 3ºC mínimo durante 1 hora. Después de la lisis, los portaobjetos son lavados y colocados en una cámara de electroforesis horizontal con tampón alcalino de electroforesis (pH 13) durante 30 minutos, luego se realizó la electroforesis a 25 V, 300 mA durante 30 min.

Los portaobjetos se tiñen con Bromuro de Etidio y se observan en Microscopio de Fluorescencia con un aumento de 400X. Se cuentan 50 células por placa. La ocurrencia de daño en el ADN se basó en la longitud de la cola del cometa, inducida por la ruptura del ADN. Se determinó que el daño basal fue de 41 mm que es la longitud total producida por otros factores diferentes al tratamiento. Se establecieron categorías de daño para mostrar que el daño no se distribuye uniformemente en todas las células, lo cual puede ser una ventaja, debido a que la exposición no necesariamente afecta a todas las células, disminuyendo así el riesgo. Los rangos establecidos fueron los siguientes: de 0 a 41 µm, tipo de daño 0= no daño; de 42 a 83 µm, tipo de daño 1= daño bajo; de 84 a 125 µm, tipo de daño 2= daño medio y mayor a 126 µm, tipo de daño 3 = daño alto.

Las células usadas fueron linfocitos humanos de sangre periférica, que fueron obtenidas de un voluntario joven (25 años), a saber saludable, no fumador, sin ningún tipo de tratamiento clínico, no deportista de alto rendimiento. Para medir reproducibilidad de los resultados se hicieron cuatro experimentos por cada tratamiento y en cada uno se contaron 100 células. Como control positivo se utilizó el peróxido de hidrógeno 25mM y como control negativo dimetil sulfósido (DMSO 1% (p/v)), que es el disolvente de las muestras.

A nál i s i s es t adí s t i c o . S e d e t e r m i n ó l a homogeneidad de varianzas usando la prueba de Levene. Si el comportamiento de los datos era paramétrico, se aplicaba el Análisis de varianza (ANOVA). Si los datos no eran paramétricos

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se utilizaron las pruebas de Mann-Whitney y Wilcoxon. Se utilizó la prueba de Dunnett para determinar el nivel de significancia entre el tratamiento y control, así como la prueba de Tukey para comparaciones múltiples. Los valores se expresaron como la media, la desviación estándar (X±DS) y las pruebas se consideraron significativas (p≤0.05).

RESULTADOS Rendimiento de las extracciones de los filtros de PM2.5 obtenido por ultrasonido y Soxhlet respectivamente. Los valores de los porcentajes de rendimiento de los extractos de material particulado PM2.5, fueron establecidos de acuerdo al peso en gramos que contenía cada uno de los filtros antes y después de la extracción.

La extracción por medio de destilación Soxhlet produjo un porcentaje de 61%. Al trabajar por ultrasonido, los rangos de extracción oscilaron entre 96 y 98%.

A partir de los datos registrados en la tabla 1, se halló la Razón de Mutagenecidad (RM) que es igual a RI/RE, donde RI = revertantes inducidos por el tratamiento y RE = revertantes espontáneos. La razón de mutagenicidad es el número de veces que la respuesta del tratamiento supera el control negativo.

La tabla 1 y la figura 1, muestran que las dosis de 50, 100 y 150 µg inducen una actividad mutagénica dependiente de la concentración, siendo altamente significativo con respecto al control negativo (p≤0.05) para las dosis de 100 y 150 µg.

Esta respuesta se origina por mutágenos que causan mutación por sustitución de bases, dentro de los cuales se encuentran los HPA Tabla 1. Mutagenicidad y razón de mutagenicidad (RM) de diferentes dosis del PM 2.5 del aire de Cúcuta, analizados con la cepa TA-100 de Salmonella Typhimurium.

Dosis µg/ caja

Promedio de revertantes / tratamiento

Control negativo

112 ± 10

0

50

120 ± 13

1.1

100

179 ± 8

1.6

150

299 ± 16

2.7

Control positivo

384 ± 20

3.4

RM

Cada valor corresponde al promedio de tres experimentos independientes.

Como control negativo se uso DMSO 12% (p/v) y como control positivo se usó 4-NQO. La razón de mutagenicidad.

RM: es el número de veces que la respuesta del tratamiento supera el control negativo.

Se utilizaron las pruebas de Mann-Whitney y Wilcoxon. Los valores se expresan como la media ± la desviación estándar (X±DS) y las pruebas se consideraron significativas con una p≤0.05.

Figura 1. Mutagenecidad en Salmonella Typhimurium (cepa TA-100) en ausencia de S-9 del extracto de material particulado PM2.5 obtenido en la ciudad de Cucuta Norte de Santander. Las dosis se calcularon de acuerdo al peso del material particulado recuperado del filtro.

nitrogenados, derivados nitroso aromáticos y varios agentes carcinógenos amino, que son considerados la fuente principal de la actividad mutagénica directa (7,15,27). De acuerdo con las razones de mutagenicidad en las dosis de 100 y 150 µg ensayadas en la cepa TA-100, se aprecia que la razón de mutagenicidad fue moderada y alta superando 1.6 y 2.7 veces a la mostrada por el control negativo, por lo que se consideró una respuesta mutagénica positiva, e indica con base en las condiciones de la prueba, que las muestras del material particulado de PM2.5 del aire de Cúcuta inducen reversión de la mutación por sustitución de bases.

Mediante el ensayo cometa se analizó el daño inducido en el ADN por extractos del material particulado PM2.5 de la ciudad de Cúcuta a un total de 200 células por tratamiento en tres experimentos independientes. El indicativo del daño genotóxico en cada célula es la ruptura de su ADN, la cual se manifiesta como un cometa, de tal manera que a mayor daño, la longitud de la cola del cometa será mayor. Para mostrar que el daño en el ADN en las células, es debido al tratamiento y no a factores que conducen a la muerte celular, se determinó la viabilidad celular después del tratamiento y se encontró que siempre ésta se mantenía por encima del 90%. Como se puede observar en la tabla 2 y en la figura 2, las células que muestran daño espontáneo, no superan una longitud de cola de 41 µm y la mayoría de células (97.5%) están en el rango 0, mostrando que la mayoría de células no tiene daño o muestran algo de daño, pero muy bajo, solamente el 2.5% de las células mostraron

Beleño - Actividad mutagénica y genotóxica del material particulado PM2.5 daño tipo 1 y ninguna de las células mostraron daño 2 ó 3. De igual manera con la dosis de 50 µg de PM 2.5 se pudo observar que el 72.5% de las células tienen daño tipo 1, 13% daño tipo 2 y 5.5% daño tipo 3.

Tabla 2. Genotoxicidad (expresada en longitud de cola, µm) de tres experimentos independientes, en linfocitos humanos, expuestos a diferentes dosis material particulado fracción respirable PM2.5 de la ciudad de Cúcuta.

Tratamiento

2

3

% de células dañadas

% de Viabilidad

0

0

15

95

95

90

89

93

56 113 16

92.5

92

10

100

94

Tipo de daño

Promedio ± DS

0

1

DMSO 1%

41 ± 12

195

5

H2O2 25mM

164 ± 21

10

60

50 µg

90 ± 11

22 145 26

100 µg

110 ± 17

15

150 µg

157 ± 21

0

80 105 11

24 166

Todos los valores provienen de 200 datos, obtenidos de tres experimentos independientes. Se utilizó la prueba de Dunnett para determinar el nivel de significancia entre el tratamiento y control, así como la prueba de Tukey para comparaciones múltiples. Los valores se expresan como la media ± la desviación estándar (X±DS) y las pruebas se consideraron significativas con una p≤0.05.

Figura 2. Genotoxicidad en linfocitos humanos inducida por extractos de material particulado (PM2.5) de la ciudad de Cúcuta.

DISCUSIÓN Resultados similares fueron encontrados cuando se analizaron muestras de aire de la ciudad de Pamplona Norte de Santander (22). La modificación química de nucleótidos, los apareamientos cruzados entre las bases, así como el daño oxidativo de los nucleótidos inducido por especies reactivas de oxígeno o radicales en general, son comúnmente considerados vías a través de las cuales se genera la mutagenicidad. Según la organización mundial de la salud varios hidrocarburos policíclicos aromáticos nitrogenados (nitro-HPA) son mutágenos de acción directa presentes en la

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atmosfera. En otros estudios, se ha encontrado que el 1-8 dinitropireno es uno de los compuestos que más contribuyen en la actividad mutagénica directa en muestras de aire, cuando fueron analizados con las cepas TA-98 y YG1024 (15).

Posiblemente parte de la respuesta mutagénica observada en estos resultados sea debida a este tipo de compuestos, dado que son compuestos que no requieren de activación metabólica y el mecanismo por el cual inducen mutaciones es por perdida o ganancia de bases. Otra posible explicación a los resultados podría ser la presencia de metales pesados, dado que en los análisis realizados a las muestras del material particulado (PM 2.5) de la ciudad, se encontraron los metales Cd, Cr, Fe, K, Mn, Ni, Pb y Zn (28).

Hasta el momento no existe un mecanismo unificado para explicar la mutagenicidad de los metales, porque hay múltiples vías que conducen a ella, tales como daño oxidativo, interferencia con iones metálicos esenciales para los procesos de replicación y transcripción, alteración de los sistemas de reparación, completar, ligamientos cruzados y alteración de la molécula de ADN. Es de anotar que varios metales pesados se han sido relacionados con el incremento de la actividad mutagénica a través de diversos test de mutagenicidad (29).

Como se observa en la tabla 2, a medida que se incrementa la concentración de extracto, el tipo de daño se va incrementando hasta llegar a un daño alto como es el caso de la dosis de 150 µg, en la cual el 83% de las células muestran daño alto, el 12% daño medio y el 5% daño bajo. También se observa en la tabla 2 y en la figura 2 que las concentraciones que indujeron mayor frecuencia de células con daño en el ADN, también mostraron mayor longitud de migración del ADN (cola). Esto podría indicar que los genotóxicos que producen más daño en el ADN, también afectan más número de células. En la tabla 2 y en figura 2 se observa que todas las dosis de PM2.5 analizadas producen daño significativo en el ADN de linfocitos humanos p≤0.05. Esto indica que la mayoría de los mutágenos que llegan a la población en las partículas del aire pueden penetrar hasta el núcleo de células humanas y dañar su ADN. A pesar del uso de células humanas en ensayos in vitro, no se puede dar una respuesta definitiva sobre la carcinogenicidad del PM2.5 para humanos.

La extrapolación de los resultados puede conducir a la hipótesis sobre el riesgo de la exposición a la contaminación del aire, dado que en el presente estudio se mostró que el PM2.5 causa mutagenicidad y genotoxicidad. Estos resultados concuerdan con estudios hechos por otros autores (22,23,30).

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Teniendo en cuenta que se observó relación entre mutagenicidad en Salmonella Typhymurium y daño genotóxico en linfocitos humanos, se puede concluir que el material particulado fracción respirable PM2.5 en una zona de alto flujo vehicular de Cúcuta puede ser uno de los factores de riesgo que contribuyen al aumento del índice de cáncer en la población expuesta, debido a que pueden inducir mutaciones en el genoma de las células expuestas y además pueden penetrar

hasta el núcleo de linfocitos humanos y causar daño genotóxico en su ADN. Agradecimientos A los profesores Freddy Solano O, Reynaldo Gutiérrez, los laboratorios de Control de Calidad y Diagnostico, Biomédicas y Química de la Universidad de Pamplona.

REFERENCIAS 1. Monks PS, Granier C, Fuzzi S, Stohl A, Williams ML, Akimoto H, et al. Atmospheric composition change-global and regional air quality. Atmos Environ 2009; 43(33):5268-5350.

2. Goldberg MS, Burnett RT, Bailar JC, Brook J, Bonvalot Y, Tamblyn R, et al. The association between daily mortality and ambient air particle pollution in Montreal, Quebec. Environ Res 2001; 86:26-36.

3. Abbas I, Saint-Georges F, Billet S, Verdin A, Mulliez P, Shirali P, et al. Air pollution particulate matter (PM2.5)-induced gene expression of volatile organic compound and/or polycyclic aromatic hydrocarbon-metabolizing enzymes in an in vitro coculture lung model. Toxicol in Vitro 2009; 23:37-46.

4. Sioutas C, Delfino RJ, Singh M. Exposure assessment for atmospheric ultrafine particles (UFPs) and implications in epidemiologic research. Environ Health Perspect 2005; 113 (8):947–955.

5. Westerdahl D, Fruin S, Sax T, Fine PM, Sioutas C. Mobile platform measurements of ultrafine particles and associated pollutant concentrations on freeways and residential streets in Los Angeles. Atmos Environ 2005; 39(20):3597–3610.

6. Pope CA, Dockery DW. Health effects of fine particulate air pollution: Lines that connect. J Air Waste Manage Assoc 2006; 56(6):709–742.

7. Tsai FC, Apte MG, Daisey JM. An exploratory analysis of the relationship between mortality and the chemical composition of airborne particulate matter. Inhal Toxicol 2000; 12:121–135.

8. Hoek G, Brunekreef B, Goldbohm S, Fischer P, Van den Brandt PA. Association between mortality and indicators of traffic-related air pollution in the Netherlands: a cohort study.

Lancet 2002; 360 (9341):1203–1209.

9. Vinitketkumnuen U, Kalayanamitra K, Chewonarin T, Kamens R. Particulate matter, PM10 & PM2.5 levels, and airborne mutagenicity in Chiang Mai, Thailand. Mutat Res 2002; 519:121–131.

10. Samara C, Voutsa D. Size distribution of airborne particulate matter and associated heavy metals in the roadside environment.

Chemosphere 2005; 59:1197-1206.

11. Luyi CD, Fu K, Wang D KW, Dann T, Austin CC. A new direct thermal desorption-GC/MS method: Organic speciation of ambient particulate matter collected in Golden, BC. Atmos Environ 2009; 43(32):4894–4902.

12. Claxton LD, Warren S, Zweidinger R, Creason J. A comparative assessment of Boise, Idaho, ambient air fine particle samples using the plate and microsuspension Salmonella mutagenicity assays. Sci Total Environ 2001; 275:95–108.

13. Senlin L, Zhenkun Y, Xiaohui Ch, Minghong W, Guoying S, Jiamo F, et al. The relationship between physicochemical characterization and the potential toxicity of fine particulates (PM2.5) in Shanghai atmosphere. Atmos Environ 2008; 42:7205–7214.

14. Li N, Sioutas C, Cho A, Schmitz D, Misra C, Sempf J, et al. Ultrafine particulate pollutants induce oxidative stress and mitochondrial damage. Environ Health Perspect 2003; 111(4):455–460.

Beleño - Actividad mutagénica y genotóxica del material particulado PM2.5 15. Kawanaka Y, Matsumoto E, Wang N, Yun S.J, Sakamoto K. Contribution of nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons to the mutagenicity of ultrafine particles in the roadside atmosphere. Atmospheric Environment 2008; 42(32):7423–7428.

16. Machado A, Garcia N, Garcia C, Acosta L, Cordova A, Linares M, et al. Contaminación por metales (Pb, Zn, Ni, Cr) en el aire, sedimentos viales y suelo en una zona de alto flujo vehicular. Rev Int Cont Amb 2008; 24(4):171-82.

17. WHO. Health aspects of air pollution with particulate matter, ozone and nitrogen dioxide.

Ginebra: World Health Organization; 2003.

18. Singh P, DeMarini DM, Dick CAJ, Tabor DG, Ryan JV, Linak WP, et al. Sample characterization of automobile and forklift diesel exhaust particles and comparative pulmonary toxicity in mice.

Environ Health Perspect 2004; 112: 820–825.

19. Mills NL, Tonrqvist H, Robinson SD, Darnley K, Gonzales M, Boon NA, et al. Diesel exhaust inhalation causes vascular dysfunction and impaired endogenous fibrinolysis: An explanation for the increased cardiovascular mortality associated with air pollution. J Am Coll Cardiol 2005; 45(3):390a–390a.

20. Kleinman MT, Hamade A, Meacher D, Oldham M, Sioutas C, Chakrabarti L, et al. Inhalation of concentrated ambient particulate matter near a heavily trafficked road stimulates antigeninduced airway responses in mice. J Air Waste Manage Assoc 2005; 55(9):1277–1288.

21. Pope III CA, Burnett RT, Thun MJ, Calle EE, Krewsi D, Ito K, et al. Lung cancer, cardiopulmonary mortality and long-term exposure to fine particulate air pollution. J Am Med 2002; 287(9):1132–41.

22. Melendez I, Quijano A, Martínez M. Actividad mutagénica y genotoxica en el material particulado fracción respirable PM 2.5 en Pamplona-Norte de Santander-Colombia.

IATREIA 2012; 25(4):347-356.

3737

23. DeMarini DM, Brooks LR, Warren SH, Kobayashi T, Gilmour MI, Singh P. Bioassay-directed fractionation and Salmonella mutagenicity of automobile and forklift diesel exhaust particles.

Environ Health Perspect 2004; 112:814–19.

24. Nguyen TH, Byeong-Kyu L. Characteristics of particulate matter and metals in the ambient air from a residential area in the largest industrial city in Korea. Atmos Res 2010; 98(24):526–537.

25. Mortelmans K, Zeiger E. The Ames Salmonella/ microsome mutagenicity assay. Mutat Res 2000; 455(1-2):29–60.

26. Lia W, McNutt MA, Wei-Gou, Z. The comet assay; a sensitive method for detecting ADN damage in individuals cells. Methods 2009; 48:46-53.

27. Cassoni F, Bocchi C, Martino A, Pinto G, Fontana F, Buschini A. The Salmonella mutagenicity of urban airborne particulate matter (PM2.5) from eight sites of the Emilia-Romagna regional monitoring network (Italy). Sci Total Environ 2004; 324:79-90.

28. Quijano A, Quijano M, Henao MJ. Caracterización fisicoquímica del Material particulado fracción respirable PM 2.5 en Pamplona Norte de Santander Bistua 2010; 8(1):53-66.

29. Mari M, Nadal M, Domingo JL. Exposure to heavy metals and PCDD/Fs by the population living in the vicinity of a hazardous waste landfill in Catalonia, Spain: Health risk assessment. Environ Int 2009; 35:1034-1039.

30. US Environmental Protection Agency (EPA).

Health assessment document for diesel engine exhaust. Washington (DC): National Centre for Environmental Assessment; 2002.

Rev.MVZ Córdoba 18(Supl):3738-3742, 2013.

COMUNICACIÓN BREVE

Identificación de ectoparásitos en Oso melero (Tamandua tetradactyla), Estado Lara, Venezuela Identification of ectoparasites from an Lesser anteater (Tamandua tetradactyla), Lara State, Venezuela María Forlano R,1* Ph.D, Franklin Mujica L,1 Ph.D, Johanmary Gallardo Y,2 M.Sc, José Rodríguez L,2 M.Sc. Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”, Decanato de Ciencias Veterinarias, Unidad de Investigación en Parasitología Veterinaria, Barquisimeto. Estado Lara, Venezuela. 2Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”, Decanato de Ciencias Veterinarias, Área de Anatomía Macroscópica Veterinaria, Barquisimeto. Estado Lara, Venezuela. *Correspondencia: mforlano@ucla. edu.ve 1

Recibido: Noviembre de 2012; Aceptado: Marzo de 2013.

RESUMEN Objetivo. Identificar especies de ectoparásitos encontrados parasitando naturalmente un Oso melero, el cual fue encontrado muriendo en una vía cercana al pueblo de Bobare, estado Lara, Venezuela.

Materiales y métodos. Al ingresar el animal a la sala de anatomía del DCV-UCLA para ser sometido a la técnica de taxidermia, se procedió a revisar a través de la palpación toda la superficie corporal del Oso, con la finalidad de tomar muestras de ectoparásitos presentes en el hospedador; los especímenes encontrados fueron colocados en un envase de vidrio conservados en alcohol isopropílico y posteriormente fueron llevados al Laboratorio de Parasitología Veterinaria del DCV-UCLA para su identificación taxonómica. Los ectoparásitos fueron observados en lupa estereoscópica y clasificados con ayuda de claves taxonómicas. Resultados. Se identificaron dos especies de artrópodos infestando naturalmente el Oso Melero, de las cuales se encuentra una garrapata macho clasificada como Amblyomma nodosum; y una pulga hembra identificada como Pulex irritans. Conclusiones. Estos artrópodos se han reportado parasitando naturalmente algunas especies de mamíferos, dentro de los cuales el Oso Melero se ha visto afectado por la acción de estos ectoparásitos; en Venezuela es el primer reporte de Pulex irritans afectando esta especie animal.

Palabras clave: Ectoparásitos, garrapatas, pulgas, Oso Melero, Tamandua tetradactyla (Fuente: DeCS, CAB).

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Forlano - Identificación de ectoparásitos en Oso melero Tamandua tetradactyla

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ABSTRACT Objective. Identify species of ectoparasites found naturally parasitizing an anteater, which was found dying on the roadside close to Bobare Village, State of Lara, Venezuela. Materials and methods.

A dead anteater was brought to the anatomy Lab of the Decanato de Ciencias Veterinarias (DCV), Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” (UCLA) for taxidermic purposes. First, all the skin and hairy areas of the animal were manually checked looking for ectoparasites; secondly, all detected specimens were collected, and placed in vials containing a solution of isopropilic alcohol 70º.

Following this procedure, the vials were taken to the Veterinary Parasitology Laboratory at DCV-UCLA to accomplish the taxonomic identification under a stereoscopic microscope, and with taxonomic keys. Results. Two specimens of arthropods were found, the first one was a male tick identified as Amblyomma nodosum, and the other one was a female flea of the genera Pulex irritans Conclusions.

These ectoparasites have been reported as natural parasites of other mammals, and among them the anteaters have been often found parasitized by these arthropods. In Venezuela this is the first case of a Pulex irritans infecting Tamandua tetradactyla.

Key words: ticks, fleas, anteater, ectoparasites, Tamandua tetradactyla. (Sources: DeCS, CAB)

INTRODUCCIÓN El Oso Melero común, Tamandua tetradactyla es un mamífero sudamericano que puede ser observado desde Venezuela hasta el noreste de Argentina, sur de Brasil y Norte de Uruguay (1). En Venezuela se ubica en una gran cantidad de ambientes; desde sabanas arboladas en los llanos entre arbustos, zonas bajas áridas y calurosas, montañosas y húmedas, altas y frías, hasta bosques enanos sobre los Tepuyes del escudo guayanés. También se conoce como oso colmenero y tamanduá (en Colombia, Ecuador y Perú); tamanduá-colete, y tamandua-mirim (en Brasil) (1) Los Osos Meleros pertenecen a la familia Myrmecophagidae, dentro del orden Xenarthra; su nombre científico es T. tetradactyla. Vive en selvas y bordes de sabanas de climas medios y cálidos hasta los 2.000 m de altura (1,2). A pesar de ser una especie tolerante a una gran cantidad de ambientes y con una amplia distribución en el país, su condición de supervivencia es vulnerable debido a la reducción de sus poblaciones; los cazadores los eliminan porque matan o hieren a sus perros y frecuentemente son atropellados por vehículos en las carreteras (2). El Oso melero está incluido en el Apéndice II del CITES (Convención Internacional del Tráfico de Especies en Peligro, por sus siglas en inglés), el cual se encuentra reservado para las especies que aún en peligro, su población no está al borde de la extinción (3).

Como cualquier especie de hábitats abiertos, estos hospedadores resultan susceptibles a diversos agentes patógenos, entre ellos ectoparásitos como los insectos y las garrapatas,

que son reconocidos por parasitar vertebrados domésticos, silvestres y al hombre, lo cual puede resultar en problemas sanitarios para sus hospedadores (4,5). Las garrapatas son ectoparásitos que están adaptados a vivir en una gran variedad de hospederos vertebrados tales como: anfibios, reptiles, aves y mamíferos (5).

En diversos países han reportado especies de garrapatas duras infestando a T. tetradactyla, como las diagnosticadas en Perú donde se identificaron especies de Amblyomma calcaratum, estos autores mencionan las relaciones filogenéticas de esta especie con A. nodosum y de su importancia médica (6). En Brasil se han identificado especies de Amblyomma sp. A. cajennense, A. parvum y A. nodosum haciendo énfasis que esta última especie es un parásito específico de Tamandúa (7,8). En México se han diagnosticado en Tamandua mexicana la especie de Amblyomma calcaratum (9). En Colombia se identificó Amblyomma sp. en T. tetradactyla (10).

A. nodosum se ha diagnosticando parasitando Oso Melero en localidades de Chaco y Formosa de Argentina (11), así como en Bolivia, Guatemala, Costa Rica, Nicaragua, Panamá, Trinidad y Tobago parasitando T. tetradactyla (12). En Venezuela A. nodosum fue reportada en especies de Xenarthra, existiendo un vacío de reportes desde la fecha, aunque algunos autores han observado que A. calcaratum es una garrapata común en estos mamíferos (Tamandua, Myrmecophaga), reportan que frecuentemente se les puede encontrar junto con adultos de A. nodosum y que el diagnostico diferencial de ambas especies es

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difícil de realizar, lo que conlleva muchas veces a inferir en diagnósticos incorrectos (11).

En relación a la presencia de Siphonaptera parasitando esta especie animal se han reportado pocos hallazgos, en Venezuela no se tienen reportes que indiquen la infestación de estos insectos en Oso Melero; sin embargo, se ha reportado en Brasil Pulex irritans parasitando naturalmente a tamandúa (4), así como en el centro de los Estados Unidos las infestaciones fuertes en Myrmecophaga tridactyla con una especie de pulgas la cual diagnosticaron como Pulex simulans. Este insecto se encuentra comúnmente parasitando otras especies como Didelphis virginiana y los Procyon lotor (13). El objetivo de este estudio fue identificar morfológica y taxonómicamente los ectoparásitos encontrados infestando naturalmente a un Oso Melero encontrado muriendo en una localidad del estado Lara, Venezuela.

MATERIALES Y MÉTODOS

Proc es amiento d e las mues tras . L o s e c t o p a r á s i t o s f u e r o n l ava d o s c o n a g u a destilada y secados con papel absorbente, posteriormente con la ayuda de la lupa e s t e r e o s c ó p i c a s e o b s e r va r o n p a ra s e r clasificados utilizando claves taxonómicas de ixodideos (14) y para la clasificación de la pulga se utilizó la clave de sifonápteros de Brasil (4). Los resultados de esta investigación se analizaron con estadísticas descriptivas.

RESULTADOS Se identificaron dos ectoparásitos infestando naturalmente el Oso Melero (Tamandua tetradactyla); se identificó una especie de insecto por sus características morfológicas y taxonómicas que pertenece a la familia Pulicidae, género Pulex irritans (Figura 1) es una pulga hembra que presenta tres cerdas: pre-ocular, genal y una tercera cerda larga en la región post-antenal, morfológicamente la espermateca presenta cuerpo arredondeado y el apéndice curvo.

Sitio de estudio. Esta investigación fue realizada en la unidad de investigación de Parasitología Veterinaria del Decanato de Ciencias Veterinarias de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” (UCLA) en el estado Lara-Venezuela.

Recolección de la muestra. Las muestras fueron extraídas manualmente de un Oso Melero común (Tamandua tetradactyla) que fue encontrado muriendo en una carretera que conduce a la población de Bobare (10º15’55,86’’LN, 69º28’24,50’’LO), estado Lara, y que murió al poco tiempo de haber sido auxiliado; razón por la cual fue donado al Área de Anatomía de los Animales Domésticos del Decanato de Ciencias Veterinarias de la UCLA, donde se decidió someterlo a la técnica de taxidermia.

Toma de las muestras. Se procedió a la realización de un examen minucioso de todo el cuerpo del animal, por medio de palpación utilizando guantes. Se encontraron artrópodos aun fijados a la piel del animal como una garrapata y en movimiento sobre la superficie del cuerpo una pulga parasitando al Oso, las cuales fueron extraídas manualmente y conservadas en alcohol isoproplico para su posterior identificación taxonómica y morfológica.

Figura 1. Hembra adulta de Pulex irritans.

Otro ectoparásito encontrado parasitando naturalmente el Oso fue un especime macho de Ixodidae identificado como A. nodosum (Figura 2); por presentar caracteres morfológicos como palpos cortos y nudosos, ornamentaciones en el escudo que se presentan en forma de letra “J” en borde lateral anterior del idiosoma de un color amarillo claro, en la vista ventral se observa en la coxa I la presencia de dos espinas gruesas, siendo la externa ligeramente de menor tamaño que la espina interna.

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comúnmente a esta y otras especies silvestres como D. virginiana y los P. lotor (13), esta especie sólo se ha reportado en centro de los EEUU y México, la única especie encontrada se diagnosticó morfológicamente a Pulex irritans, que se ha diagnosticado en América del Sur parasitando a T. tetradactyla, así como, los animales domésticos y al hombre, este hallazgo puede estar dado por un parasitismo accidental ya que fue observado una única pulga, en un solo animal moribundo (4).

A. nodosum fue reportada parasitando animales silvestres, en Venezuela fue reportada a finales de los años noventa y ahora se reporta afectando al Oso Melero. Similares reportes se han realizado en diferentes países de América Latina con una prevalencia alta del género Amblyomma como principal garrapata encontrada parasitando a T. tetradactyla con una gran variedad de especies, donde A. nodosum se ha caracterizado como especie específica de Tamandúa y con una gran importancia médica (6,7,8,12).

DISCUSIÓN

Una de las preocupaciones con la identificación y registros de algunas especies de garrapatas en animales silvestres está relacionada con el potencial riesgo de estos artrópodos de transmitir patógenos a otros animales silvestres y domésticos, bien como a los humanos (8); en Venezuela conviven diversas especies de animales silvestres y en los últimos años, se ha observado incremento de poblaciones humanas hacia las regiones donde habitan los animales silvestres.

Los insectos diagnosticados parasitando Tamandua tetradactyla en su hábitat natural son escasos, en Brasil se han reportado Pulex irritans (4) y en el centro de los Estados Unidos se reportó la infestación alta por Pulex simulans en M. tridactyla, en donde los autores reportan que esta especie de insecto se encuentra parasitando

En conclusión se puede observar que aunque A. nodosum se ha diagnosticado con frecuencia en T. tetradactyla en otros países; en Venezuela se tienen pocos reportes de este ectoparásito en especies de vida silvestre. En cuanto al sifonáptero Pulex irritans es el primer reporte de esta especie en T. tetradactyla en esta región.

Figura 2. Vista dorsal y ventral de macho Amblyomma nodosum.

REFERENCIAS 1

Oliveira EV, Vilella FS. Xenarthros. In Livro Vermelho da fauna ameaçada de extinção no Rio Grande do Sul. Porto Alegre, Brasil: EDIPUCRS; 2003.

2. Alves CA, Hobus Q, Bager A. Mammalia, Pilosa, Myrmecophagidae, Tamandua tetradactyla (Linnaeus, 1758): Distribution extension. Check Lists 2010; 6:52-53. URL Disponible en: http://www.researchgate. net/publication/236610723_Mammalia_ Pilosa_Myrmecophagidae_Tamandua_ tetradactyla(Linnaeus_1758)_Distribution_ extension.

3742

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

3. Sánchez F, Sánchez-Palomino P, Cadena A. Inventario de mamíferos en un bosque de Los Andes Centrales de Colombia. Mammal survey in a central Andes forest in Colombia.

Caldasia 2004; 26:291-309.

9. Guglielmone A, Pérez T, Cornejo CS. First records of the ticks Amblyomma calcaratum and A. pacae (Acari: Ixodidae) parasitizing mammals of México. Rev Mex Biodivers 2006; 77:123-127.

4. Linardi P, Guimarães L. Siphonapteros do Brasil. São Paulo FAPESP Brasil: Editorial Winnergraph; 2000.

10. Torres-Mejia A, Fuente J. Risks associated with ectoparasites of wild mammals in the Departamento of Quindio, Colombia. Int J Appl Res Vet Med 2006; 4:187-192.

5. Guglielmone A, Nava A. Las garrapatas Argentinas del género Amblyomma (Acari: Ixodidae), distribución y hospedadores.

Revista de Investigaciones Agropecuarias (RIA). Argentina: Ediciones Inst Nac Tec Agrop (INTA) 2006; 35(3):133-153.

6. Càceres A, Beati L, Keirans J. First evidence of the occurrence of Amblyomma calcaratum Neumann, 1899 in Peru. Rev Peru Biol 2002; 9:116-117.

7. Labruna M, Paula C, Lima T, Sana D. Ticks (Acari: Ixodidae) of wild animals from the Porto-Primavera Hydroeletric Power Station area, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2002; 97:1133-1136.

8. Martins J, Medri M, Oliveira C, Guglielmone A. Ocorrência de carrapatos em tamanduábandeira (Myrmecophaga tridactyla) e tamanduá-mirim (Tamandua tetradactyla) na região do Pantanal Sul Mato-Grossense, Brasil. Cienc Rural 2004; 34:293-295.

11. Guglielmone A, Estada A, Keirans J, Robbins R. Las Garrapatas (Acari: Ixodida) de la región zoogeográfica neotropical. Buenos Aires.

Ediciones Inst Nac Tec Agrop (INTA), 2004.

12 Marinho R, Benedet, R, Mazzolli M, Marques S. Amblyomma nodosum (Acari: Ixodidae) infesting collared anteater (Tamandua tetradactyla, Linnaeus, 1758) in Urupema, Santa Catarina, Brazil. Biocienc 2009; 17:109-110.

13. Mutlow A, Dryden M, Payne P. Flea (Pulex simulans) infestation in captive Giant Anteaters (Myrmecophaga tridactyla). J Zoo Wildl Med 2006; 37:427-429.

14. Barros-Battesti DM, Arzua M, Bechara G.H. Carrapatos de Importância Médico-Veteriária da Região Neotropical: Um guía ilustrado para identificação de espécies. Instituto de Butantan. São Paulo: ICTTD-3; 2006.

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Revista MVZ Córdoba INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES La revista MVZ Córdoba es el órgano oficial de difusión de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba con periodicidad de publicación cuatrimestral y circula en el ámbito internacional. La revista publica (secciones) artículos originales de investigación, artículos técnicos, revisiones de literatura, revisiones de tema, comunicaciones breves, informes de casos y, otros que a juicio del Comité Editorial sean de interés general.

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1.2. Nombre, apellido del autor o autores: Para el segundo apellido solo se colocará la inicial en mayúscula seguida de coma y el grado académico más alto o el título profesional. Se deberá incluir la filiación institucional de los autores (institución, dirección, ciudad, país). Se deberá indicar además, el responsable de la correspondencia del manuscrito suministrando su correo electrónico.

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1. Presentación: Debe contener la siguiente información: 1.1. Título del artículo: deberá ir en español e inglés. Este último deberá ir debajo del primero dejando doble espacio y en tamaño de letra menor que el principal. El título deberá ser preciso pero informativo y en lo posible no debe superar las 15 palabras.

1.3. Resumen: Deber ser estructurado y será máximo de 250 palabras. Deberá ofrecer una idea clara del contenido del artículo incluyendo: Objetivo, materiales y métodos, resultados y conclusiones.

Estas secciones deberán ir con negrilla y luego punto seguido en donde se inicia el texto de cada sección.

1.4 Palabras clave: Son términos cortos que ayudan a la clasificación del artículo. Se sugiere emplear 6 como máximo. Utilice los términos de la lista “Medical subject headings” (MeSH) u otro descriptor acorde con el tema de su investigación.

(DeCS, BIREME, NLM, etc.).

1.5 Abstract: (resumen traducido al inglés) debe poseer una estructura y contenido igual al de español.

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1.6 Key Words: Palabras clave, deben ser iguales a las de español, pero en idioma ingles.

2. Introducción: Debe indicar claramente e l p r o p ó s i t o d e l a i nv e s t i g a c i ó n , relacionando igualmente en forma selectiva la literatura pertinente. No incluya datos ni conclusiones del trabajo que está dando a conocer. Al finalizar esta sección deberá hacerse con el objetivo general.

3. Materiales y métodos: Se debe describir claramente los procedimientos empleados en la investigación, incluyendo diseño estadístico y análisis de datos.

Esta sección deberá ser estructurada indicando tipo de estudio, sitio, condiciones geo-climáticas, coordenadas del sitio de estudio, pacientes o animales de estudio, métodos de laboratorio, aspectos éticos, análisis de resultados, etc. Estas secciones deberán ir con negrilla y luego punto seguido en donde se inicia el texto de cada sección.

4. Resultados: Corresponde a la información de los hallazgos pero sin incluir comentarios ni referencias a otros trabajos. Se sugiere utilizar tablas y figuras, las cuales no deberán ser más de seis en lo posible.

5. Discusión: Es la interpretación de los resultados obtenidos y la contrastación de los mismos con otros estudios. Se debe destacar las limitaciones del estudio e igualmente evitar especulaciones.

Resaltar las conclusiones del estudio, así como las recomendaciones para futuras investigaciones.

6. Agradecimientos: Mencionar las personas o instituciones que han colaborado con la investigación (financiera, logística, intelectual, entre otras.).

7. Correspondencia: Nombre completo del autor responsable, dirección laboral y residencial, correo electrónico, teléfono celular y teléfono fijo. Esta información puede ser suministrada en la carta remisoria o en una hoja al final del artículo remitido.

8. R e f e r e n c i a s : D e b e n n u m e r a r s e consecutivamente según el orden en que se mencionen por primera vez en el texto por medio de números arábigos colocados entre paréntesis. La lista de referencias se iniciará en hoja aparte, en estricto orden de aparición en el texto, no será en orden alfabético. Para los artículos originales no se aceptarán más de 30 referencias. Para revisiones de literatura hasta 50 referencias. Para la presentación de casos y comunicaciones breves hasta 12 referencias. Como guía general a continuación se presentan ejemplos de referencias bibliográficas.

8.1. Revistas

• Nombre del autor o autores • Título completo del artículo referenciado • Abreviatura internacional del nombre de l a r e vi sta • Año • Vol ume n • Páginas incluidas. Las abreviaturas internacionales pueden consultarse en Journals database de PubMed, C a t a l o g o C 1 7 , DREV, Revistas de biomedicina del IHCD de Valencia.

8.2. Libros y monografías

• Autor o editor • Título del libro, lugar de publicación, editorial, año de publicación y páginas consultadas.

8.3. Ejemplos para las referencias bibliográficas según las normas de Vancouver.

Artículos de Revistas

• Artículos

Autor/es. Título del artículo. Abreviatura internacional de la revista, año; volumen (número): página inicial-final del artículo.

Ejemplos: Díez Jarilla JL, Cienfuegos Vázquez M, Suárez Salvador E. Ruidos adventicios respiratorios: factores de confusión. Rev MVZ Córdoba 1999; 109: 632-634.

• Más de seis autores

Martín Cantera C, Córdoba García R, Jane Julio C, Nebot Adell M, Galán Herrera S, Aliaga M et al. Virus and public health J Vet Sci 1997; 109: 744-748.

3745 • Autor Corporativo Grupo de Trabajo del ICA. Normativa sobre el manejo de las hemoparasitos amenazantes. Rev MVZ Córdoba 1997; 33: 31-40.

• No se indica nombre del autor

Cáncer in South África (editorial). S Afr Vet J 1994; 84: 15-16.

Los artículos deben escribirse en su idioma original si la grafía es latina.

• Suplemento de un volumen

Bonfill X. La medicina veterinaria basada en la evidencia. Arch Vet 1997; 33 Supl 1: 117.

• Suplemento de un número

Leyha SS. The role of Interferon Alfa in the treatment of metastatic melanoma.

Semin Oncol Vet 1997; 24 (1 Supl 4): 524-531.

• Número sin volumen

Pastor Durán. Informática médica y su implantación hospitalaria. Todo Hosp Vet 1997; (131): 7-14.

• Sin número ni volumen

Browell DA, Lennard TW. Inmunologic status of the cancer fish patient and the effects ofblood transfusion on antitumor responses. J Fish Culture 1993; 325-33.

• Paginación en número romanos

Fisher GA, Sikic BL. Drug resistance in clinical oncology and hematology.

Hematol Oncol Clin North Am 1995 Abr; 9(2): XI-XII.

• Indicación del tipo de artículo según corresponda

Enzensberger W, Fischer PA. Metronome in Parkinson‘s disease (letter). Lancet 1996; 347: 1337.

Clement J, De Bock R. Hematological complications of hantavirus nephropathy (HVN)(abstract). Kidney Int 1992; 42: 1285.

• Documentos legales

Leyes: Título de la ley. (Nombre del Boletín Oficial, fecha, año de publicación).

Ley aprobada. Ley 31/1995 de 8 de Noviembre, de Prevención de Riesgos Laborales. (Boletín Oficial del Estado, número 269, de 10-11-95).

• Mapa

Nombre del mapa (tipo de mapa).

Lugar de publicación: Editorial; año.

Sada 21-IV (1 a 8) (mapa topográfico).

Bogotá Instituto Geográfico Agustín Codazzi, Dirección General del Instituto Geográfico; 2003.

Material no publicado

• En prensa

Vega A. Occurance of E.coli 0157:H7 on duch dayri farms Rev MVZ Córdoba in press 2007.

• Artículo de revista en formato electrónico

Autor. Título. Nombre de la revista abreviado (tipo de soporte) año (fecha de acceso); volumen (número): páginas o indicador de extensión. Disponible en: Transmission of Hepatitis C Virus infection associated infusion therapy for hemophilia. MMWR (en línea) 1997 July 4 (fecha de acceso 11 de enero de 2001); 46 (26). URL disponible en: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/ mmwrhtml/00048303.htm

• Monografía en formato electrónico

Título. (Tipo de soporte). Editores o productores. Edición. Versión. Lugar de publicación: Editorial; año. Duane‘s Ophthalmology en CD-ROM User Guide. (monografía en CD-ROM). Tasman W, Jaeger E editor. versión 2.0. Hagenstown: Lippincolt-Raven; 1997.

• Archivo informático

Autor. Título. (Tipo de soporte). Versión.

Lugar: Editorial; año.

• Tesis de Maestría, doctorado y trabajos de grado

Autor(es) título, Facultad, Departamento, año. Arrieta G. Producción de Verotoximas en Shigella. Tesis de Maestría, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia; Departamento de Medicina, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia 2003.

3746

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

9. F o t o g r a f í a s : S e p o d r á n u t i l i z a r fotografías, de excelente calidad, digital.

La identificación, secuencia y títulos deben establecerse claramente para localizar el lugar que le corresponda en el contenido del artículo. Las fotografías deberán llevar el título de figura.

10. Evaluación de artículos: Los artículos recibidos para publicación, después de constatar que cumplen con las normas expresas de la Revista MVZ Córdoba, serán enviados a pares que conforman el Comité Científico para su respectiva evaluación. En caso de recibir algún manuscrito que por su especialidad de contenido no pueda ser evaluado por los miembros del comité, este será remitido a sendos evaluadores pertenecientes a la comunidad científica nacional o internacional.

En la redacción del contenido deberán respetarse las normas internacionales para manuscritos científicos que regulan las abreviaturas, literatura citada, símbolos, n o m e n c l a t u ra s a t ó m i c a s , z o o l ó g i c a s , botánicas, químicas, entre otros. Los valores

deben informarse en unidades del sistema métrico decimal y de acuerdo con el Sistema Internacional de Unidades. La revista MVZ Córdoba y la Universidad de Córdoba no se responsabilizan por opiniones y resultados expresados por los autores, los cuales serán responsabilidad exclusiva de ellos.

Conflicto de intereses. Los autores deben expresar los intereses posibles que posean en el trabajo que realizaron.

Correspondencia: Los artículos, consultas, aclaraciones y correspondencia general se deben dirigir a la dirección abajo señalada, sin embargo, también los trabajos pueden ser remitidos en forma electrónica al editor o al coeditor. http:// www.unicordoba.edu.co Comité Editorial REVISTA MVZ CÓRDOBA Universidad de Córdoba Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Teléfonos (094) 756 90 27 http://revistas.unicordoba.edu.co/revistamvz/ Apartado Aéreo 354 Montería - Colombia Editor Marco González Tous. M.Sc. editormvzcordoba@gmail.com

3747

Journal MVZ Córdoba Instructions to the Authors The Journal MVZ Cordoba is the official organ of diffusion of the Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia of the Universidad de Cordoba, is a triannually publication and circulates in the international environment.

The magazine publishes (sections) original articles of investigation, technical articles, literature reviews, topic revisions, brief communications, inform of cases and, others that to opinion of the Editorial Committee are from general interest. The topics that the Journal MVZ Cordoba publishes are related with the veterinary medicine and zootechny, aquaculture, biology, biotechnology, biomedical basic sciences and other topics of interest in the agricultural sciences.

Spanish or English. Authors should consult general guides described below. The Journal MVZ Cordoba is welcomed to the general requirements of uniformity for biomedical journals (Norms of Vancouver).

“The Journal MVZ Córdoba follows the policies of the World Health Organization (WHO) and of the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) for clinical trial registration, recognizing the importance of those initiatives for international dissemination of information on clinical research, in open access. Accordingly, only articles of trials previously registered in one of the clinical Trial Registries that meet WHO and ICMJE requirements will be accepted for publication, starting in 2007. The list of registries accepted

by WHO and ICMJE is available in ICMJE site. The trail registration number should be published at the end of teh abstract”.

1.2. Name: Last name of author(s). For the second name only be placed the first letter in capital followed by coma and each author´s highest academic degree or professional title. It should include the institution affiliation of authors, (Institution Name, address, city, country). It should also indicate the responsible person for the manuscript correspondence (e-mail included).

Interested in publishing will send to the Editor an introductory letter signed by all the authors declaring expressly that the remitted article has not been published previously and that the authors don’t have conflict of interests. Two printed copies will be sent of the article written on any of the programs for word processing, double space, paper size letter, in ink quarter note for a single face of the leaf, with arial letter, font size 12 and C.D. (these originals will not be returned) or by e-mail. Margin should not be inferior to 3 cm and pages will be numbered consecutively including the whole material. Journal accepts papers in either

1. Presentation: It should contain the following information: 1.1. Title of the article: It should be presented in Spanish and English language. The last one should appear below the first one double spaced and with a minor font size that the main one. The Title should be concisely but informative and be of up to 15 words.

1.3 Abstract: Should be structured and of approximately 250 words, indicating the paper’s objective clearly and including: objective, material and methods, results and conclusions. This section should be in boldface and then point followed by the text of the subsequent section.

1.4 Key words: Are short terms. These will be useful to classify the article. List 6 as maximum. Use the terms of the “Medical subject headings” (MeSH) list or another describer in agreement with the topic of their investigation. (DeCS, BIREME, NLM, etc.).

1.5 Abstract: (summarize translated to English) it should possess a structure and content similar to the one of Spanish.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

1.6 Key Words: Key words, it should be similar to those of Spanish, but in English language.

2. Introduction: should indicate the paper’s objective clearly, relating equally in selective form the pertinent literature.

Do not include data neither conclusions of the work that is giving to know. When concluding this section it will be made with the general objective.

3. Material and Methods: should be described clearly the procedures used in the investigation including statistical design and data analysis. This section should be structured indicating type of study, place, geo-climatic conditions, coordinate of the study place, patients or animals, laboratory methods, ethical aspects, result analysis, etc. These sections should be in boldface then point followed by the text of the subsequent section.

4. Results: Correspond to findings without comments no references to other works.

The use of tables and figures is suggested which should be no more of six.

5. Discussion: is the interpretation of the obtained results followed by a comparison with other studies. It should stand out the limitations of the study and equally to avoid speculation s. Point out conclusions and suggestions for further research.

6. Acknowledgements: Contributions from people or institutions who have collaborated with the investigation (financial, logistics, intellectual, among others) should appear under “Acknowledgements”.

7. Correspondence: Full names of the responsible author, affiliation address, postal address, cellular and telephone number, email addresses. This information should be include in the remission letter or in a single sheet at the end of the article.

8. References: Will be cited with a number correlative to the order in which they

appear in the text and should be numbered consecutively by means of Arabic numbers placed within parenthesis. The list of references will begin in separate sheets, in strict appearance order in the text; they were not in alphabetical order. Original articles should have no more than 30 references. For literature revisions up to 50 references. Presentation of cases and short communications will have only 12 references. As general guide examples of bibliographical references are given below.

8.1. Journals

• Author’s names • Full title of the referenced article • International abbreviation of the journal name • Year • Volume • Included pages. International abbreviation must be search in Journals database of PubMed, Catalogue C17, DREV, Biomedical journals of Valencia IHCD. 8.2. Books and monographs

• Author or editor • Title of book, publication place, editorial, year of publication and consulted pages.

8.3. Examples for the bibliographical references according to the Vancouver norms

Journal articles

• Articles

Author(s). Title of the article. International Abbreviation of the journal, year; volume (number): initial-final page of the article.

Examples: Díez Jarilla J, Cienfuegos Vázquez M, Suárez Salvador E. Ruidos adventicios respiratorios: factores de confusión. Rev MVZ Córdoba 1999; 109: 632-634.

• More than six authors Martín Cantera C, Córdoba García R, Jane Julio C, Nebot Adell M, Galán Herrera S, Aliaga M et al. Virus and public health J Vet Sci 1997; 109: 744-748.

• Corporate author Grupo de Trabajo del ICA. Normativa sobre el manejo de las hemoparasitos amenazantes. Rev MVZ Cordoba 1997; 33: 31-40.

3749 • The author’s name is not indicated Cancer in South Africa (editorial). S Afr Vet J 1994; 84: 15-16.

The articles should be written in their original language if the graph is Latin.

• Supplement of a volume Bonfill X. La medicina veterinaria basada en la evidencia. Arch Vet 1997; 33 Supl 1: 117.

• Supplement of a number Leyha SS. The role of Interferon Alfa in the treatment of metastatic melanoma.

Semin Oncol Vet 1997; 24 (1 Supl 4): 524-531.

• Number without volume

Pastor Durán. Informática médica y su implantación hospitalaria. Todo Hosp Vet 1997; (131): 7-14.

• Without number neither volume Browell DA, Lennard TW. Inmunologic status of the cancer fish patient and the effects of blood transfusion on antitumor responses. J Fish Culture 1993; 325-33.

• Paging in Roman numbers

Fisher GA, Sikic BL. Drug resistance in clinical oncology and hematology.

Hematol Oncol Clin North Am 1995 Abr; 9(2): XI-XII.

Unpublished Material • In press Vega A. Occurance of E.coli 0157:H7 on duch dayri farms Rev MVZ Córdoba in press 2007.

• Journal article in electronic format Author. Title. Name of the journal in abbreviate form (support type) year (access date); volume (number): pages or extension indicator. Available in: Transmission of Hepatitis C Virus infection associated infusion therapy for hemophilia.

MMWR (en línea) 1997 July 4 (fecha de acceso 11 de enero de 2001); 46 (26). URL disponible en: http://www.cdc.gov/mmwr/ preview/mmwrhtml/00048303.htm

• Indication of the article type as it corresponds

Enzensberger W, Fischer PA. Metronome in Parkinson‘s disease (letter). Lancet 1996; 347: 1337.

Clement J, De Bock R. Hematological complications of hantavirus nephropathy (HVN) (abstract). Kidney Int 1992; 42: 1285.

• Legal documents Laws: LawTitle. (Name of the Official Bulletin, date, year of publication).

Ley aprobada. Ley 31/1995 de 8 de Noviembre, de Prevención de Riesgos Laborales. (Boletín Oficial del Estado, número 269, de 10-11-95).

• Map Name of the map (map type). Publication Place: Editorial; year.

Sada 21-IV (1 a 8) (mapa topográfico).

Bogotá Instituto Geográfico Agustín Codazzi, Dirección General del Instituto Geográfico; 2003.

• Monograph in electronic format Title. (Support type). Editors or producers.

Edition. Version. Publication place: Editorial; year.

Duane‘s Ophthalmology en CD-ROM User Guide. (monografía en CD-ROM).

Tasman W, Jaeger E editor. versión 2.0.

Hagenstown: Lippincolt-Raven; 1997.

• Informatics file Author.Title. (support Type). Version. Place: Editorial; year.

• Thesis of Master, Doctorate and under Graduate works Author(s) title, faculty, department, year.

Arrieta G. Producción de Verotoximas en Shigella. Tesis de Maestría, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia; Departamento de Medicina, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia 2003.

9. Photographs: Pictures can be use, of excellent digital quality. The identification, sequence and titles should settle down clearly to locate the place that corresponds in the content of the article. The photographs will take the title of figure.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 18 Suplemento 2013

10. Evaluation of articles: Those manuscripts submitted to the Journal, after verifying that they fulfill the expressed norms of the Journal MVZ Cordoba will be subject to peer reviews of the Scientific Committee for its evaluation. In the event of receiving some manuscript that by its special content cannot be evaluated by the members of the committee it will be remitted to appraisers belonging to the national or international scientific community.

In the writing of the content the international norms will be respected for scientific manuscripts that regulate the abbreviations, mentioned literature, symbols, atomic, zoological, botanical, chemical nomenclatures, among others. The values should be informed in units of the metric decimal system and in accordance with the International System of Units.

The Journal MVZ Cordoba and the Universidad de Córdoba don’t take the responsibility for

opinions and results expressed by the authors, which will be exclusive responsibility of them.

Conflict of interests. The authors should express the possible interests that possess in the work made by them.

Correspondence: Articles, consultations, explanations and general correspondence should be sent to the address below, however, the works can also be remitted in electronic form to the editor or the coeditor. http://www.unicordoba.edu.co Editorial Committee REVISTA MVZ CÓRDOBA Universidad de Córdoba Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Telephones: (094) 756 90 27 http://revistas.unicordoba.edu.co/revistamvz/ Apartado Aéreo 354 Montería - Colombia Editor Marco González Tous. M.Sc. editormvzcordoba@gmail.com

Árbitros Rev.MVZ Córdoba 18(Supl) 2013 Referees Journal MVZ Córdoba 18(Supl) 2013 Acosta L. Mariano Alves Do Egito Andréa Arboleda Z. Elkin Arias S. Sergio Andres Aspilcueta B. Rusbel Raul Bahia L. Marcelo Barbieri Edison Barrios P. María Lila Betancourt E. Jesús Bolívar V. Diana María Botero A. Mónica Carrascal C. Ana Castillo V. Alejandro Correa M. Laura Cortes R. Christian Diarte P. Genaro Díaz G. Jesús Echeverry Z. Jose Galindo Z. Vladimir Gil González Jesús Giraldo G.Jhon Jairo Gomes Pöppl Álan Góngora O. Agustín Guerra M. Cándido Gutierrez V. Edgar Hernández Crisantema Hernández V. Aureliano Hoyos G. Luz Stella Imués F. Marco Antonio Insuasty S. Efren Lareschi Marcela Melendez G. Ivan Mogollón A. Martha Judith Muñetón P. Carlos Mario Nava Santiago Ortiz Isabel Cristina

Ortiz O. Diego Paiva V. Michel Palomar M. Martín Pardo C. Sandra Parra S. Jaime Perez O. Jair Porras A. Oscar Orlando Prieto G. Martha Ramírez M. Juan Antonio Rodriguez F. Adriana Serra Nicolau Maués Torres H. Glafiro Venzal B.Jose Manuel Vergara G. Oscar David Voltonia L. Domenico Wills F. Gustavo

M.Sc. Ph.D. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. M.Sc. Ph.D. Ph.D. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. M.Sc. Ph.D. Ph.D. M.Sc. M.Sc. Ph.D. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc. M.Sc. M.Sc. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. M.Sc.

Inst. Univer. Autónoma de Las Américas, Colombia EMBRAPA, Brasil U. de Antioquia, Colombia U. de La Salle, Colombia U. Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Brasil U. de São Paulo, Brasil Secretaría de Agric. del Estado. de São Paulo, Brasil U. De Antioquia, Colombia CORPOICA, Colombia U. Nacional de Colombia, Colombia U. de Antioquia, Colombia U. Nacional de Colombia, Colombia U. de Buenos Aires, Argentina C. de Cirugía de Mín. Invasión, Jesús Usón, España U. Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, México Inst. Nacional Politécnico, México Inst. Tecnológico de Los Mochis, México U. Nacional de Colombia, Colombia U. del Tolima, Colombia U. Nacional de Colombia, Colombia Corp. Universitaria Lasallista, Colombia U. Federal do Rio Grande do Sul, Brasil U. de Los Llanos, Colombia C. Universitario de la Costa Sur, México U. de la Salle, Colombia C. de Inv. en Alimentación y Desarrollo A.C., México U. Nacional de Colombia, Colombia U. del Cauca, Colombia U. de Nariño, Colombia U. de Nariño, Colombia Consejo Nal. de Inv. Científicas y Técnicas, Argentina U. de Pamplona, Colombia U. de Córdoba, Colombia U. de Antioquia, Colombia Inst. Nal. de Tecnología Agropecuaria, Argentina U. Pontifica Bolivariana, Colombia Corp. Col. de Investigación Agropecuaria, Colombia U. de São Paulo, Brasil U. Nacional Autónoma de México, México U. Nacional De Colombia, Colombia U. Nacional De Colombia, Colombia U. de La Salle, Colombia Inst. Universitario de la Paz, Colombia U. de Córdoba, Colombia U. de los Llanos, Colombia U. del Magdalena, Colombia Instituto Oswaldo Cruz, Brasil Colegio de Postgraduados, México U. de la República Regional Norte Salto, Uruguay U. de Córdoba, Colombia C. de Inv. Biológicas del Noroeste, México U. Nacional de Colombia, Colombia

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NOTA: Cualquier cambio de dirección exige su notificación inmediata a la dirección de la Revista.

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