Revista MVZ Córdoba 20(Supl):2015 by Revista MVZ Córdoba

Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):4861-4863, 2015. ISSN: 0122-0268

EDITORIAL

Mayaro and Chikungunya; two alphaviruses with clinical and epidemiological similarities Mayaro y Chikungunya; dos alfavirus con similitudes clínicas y epidemiológicas In 1780, Philadelphia suffered an unusual outbreak of hemorrhagic fever, which years later was identified as dengue (1). One hundred years later, in Memphis, 1500 people died from yellow fever, which caused residents to abandoned the city (2). Even though these stories may seem anecdotes, they show how dramatic hemorrhagic arbovirus outbreaks can be.

En Filadelfia, en 1.780 hubo una extraña epidemia de fiebre hemorrágica que los investigadores años después demostraron que fue dengue (1). Un siglo más tarde, en Memphis, murieron 1500 personas de fiebre amarilla, lo que causó el abandono del pueblo (2). Aunque estos relatos parecen anecdóticos, ellos demuestran lo dramático que pueden llegar a ser las epidemias de los arbovirus hemorrágicos.

The tropic host arboviruses such as Chikungunya (CHIKV), Dengue, and Zika (ZIKV); but there are others, such as Mayaro, Oropuche, and Bussuquara, among others, which have still not been studied in depth by the public health systems of our countries.

En el trópico están presentes algunos arbovirus como el Chikungunya (CHIKV), Dengue y Zika (ZIKV); pero existen otros como Mayaro, Oropuche y Bussuquara entre otros, que todavía los sistemas de salud pública de nuestros países no los han estudiado profundamente.

Mayaro fever is a febrile illness caused by the Mayaro (MAYV) virus, a RNA alphavirus of the Togaviridae family. There are 29 species of alphaviruses, including relevant arboviruses that cause human and animal health problems, like the Venezuelan encephalitis virus, East encephalitis virus, West encephalitis virus, and CHIKV, new to the Latin American and the Caribbean epidemiology since 2014.

La fiebre Mayaro es una enfermedad febril causada por el virus Mayaro (MAYV), un ARN alfavirus de la familia Togaviridae. Los alfavirus tienen 29 especies e incluyen importantes arbovirus que causan problemas de salud humana y animal, como los virus de las encefalitis venezolana, del Este, Oeste y el CHIKV; nuevo en la epidemiología de Latino América y del Caribe desde 2014.

MAYV was first isolated in Trinidad in 1954, from blood samples obtained from farmers who lived in an area called Mayaro, after which it was named (1). MAYV has been detected in Mexico, Costa Rica, Panama, Peru, Colombia, Surinam, Guyana, Venezuela, Ecuador, Bolivia, and Brazil. Two genotypes of MAYV have been described in the Americas: genotype D, found in Trinidad, Peru, Venezuela, Colombia, Argentina, Guyana, Surinam, Bolivia, and Brazil, and genotype L, found in the amazon region of Brazil (4). MAYV outbreaks have occurred in rural and urban regions in Brazil, MAYV and the Oropuche viruses are, aside from Dengue, common causes of febrile syndromes in Brazil. Thus, since 2011 it was included as a notifiable disease (2,3). MAYV is transmitted onto humans by infected mosquitoes of the Haemagogus genus, especially Haemagogus janthinomys. Other vectors include

El MAYV fue aislado por primera vez en Trinidad en 1954 de muestras de sangre de campesinos habitantes de una área llamada Mayaro de donde tomó su nombre (1). El MAYV se ha detectado en México, Costa Rica, Panamá, Perú, Colombia, Surinam, Guyana, Venezuela, Ecuador, Bolivia y Brasil. Dos genotipos de MAYV se han descrito en las Américas: el genotipo D, observado en Trinidad, Perú, Venezuela, Colombia, Argentina, Guyana, Surinam, Bolivia y Brasil y el genotipo L, observado en la región amazónica de Brasil (4). Los brotes de MAYV han ocurrido en áreas rurales y urbanas de la región amazónica de Brasil, el MAYV y el virus de Oropuche después de dengue son causas frecuentes de síndromes febriles en Brasil. Por esta razón, desde 2011 fue incluida como enfermedad de notificación (2,3). El MAYV se transmite a los humanos por picaduras de mosquitos infectados pertenecientes al género Haemagogus, principalmente Haemagogus janthinomys. Otros vectores son mosquitos del

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the Culex and Psophors sabethes genera. Primates and birds act as primary amplifying hosts. Evidence of MAYV infection has been found in primates (Callithix argentata, Callithix sp, Alouatta seniculus, Pithecia pithecia, Saimiri sciureus), marsupials (Philander oposum, Caluromyis philander), rodents (Agutíes sp., Oryzomys sp., Proechimys sp., Nectomys) and birds. MAYV produces an acute febrile illness, with signs and symptoms similar to CHIKV, yellow fever, and dengue. Incubation period is 3-5 days; signs include fever, chills, myalgia, arthralgia, and maculopapular exanthema. Rash appears by the fifth day of illness, and lasts three days. Most of the symptoms disappear in 3-10 days; unlike CHIKV, it does not show recurrence. However, arthralgia can persist between two and twelve months. Unusual symptoms such as hemorrhage, thrombocytopenia, jaundice, and encephalitis have been described in patients with MAYV in Mexico, and one of them died of encephalitis (2,3). There are no vaccines or specific treatment against MAYV. Those infected must remain resting, and they are treated for their symptoms with acetaminophen and nonsteroid anti-inflammatories (5). A study carried out between 2010 and 2013 in the Peruvian amazon showed that arthralgia produced by MAYV were present in over 50% of the patients. The virus mainly affected joints in hands, wrists, elbows, feet, and knees, and in rare occasions, hips (6). Like CHIKV, articular pain in MAYV patients causes temporary disability, but patients with CHIKV have shown arthralgia for up to 3 years after the acute disease. Joints that are mainly affected include fingers, wrists, knees, and ankles (9). The economic and social impact of Mayaro fever has been less than those caused by Chikungunya and Dengue.

género Culex y Psophors sabethes. Los primates y las aves actúan como hospederos primarios amplificadores. Se ha encontrado evidencia de infección con MAYV en primates (Callithix argentata, Callithix sp, Alouatta seniculus, Pithecia pithecia, Saimiri sciureus), marsupiales (Philander oposum, Caluromyis philander), roedores (Agutíes sp., Oryzomys sp., Proechimys sp., Nectomys) y aves. El MAYV produce una enfermedad febril aguda con signos y síntomas similares al CHIKV, fiebre amarilla y dengue. El periodo de incubación es de 3-5 días; se presenta fiebre, escalofríos, mialgias, artralgias y exantema maculopapular. La erupción aparece alrededor del quinto día de la enfermedad y persiste por tres días. La mayoría de los síntomas desaparecen entre 3-10 días; a diferencia del CHIKV, no presenta recurrencias. Sin embargo, las artralgias pueden durar entre dos y doce meses. Síntomas inusuales como hemorragias, trombocitopenia, ictericia y encefalitis se han descrito en pacientes con MAYV en México, uno de ellos falleció a causa de la encefalitis (2, 3). No hay vacunas ni drogas específicas contra MAYV. Las personas afectadas deben permanecer en reposo y son tratadas sintomáticamente con acetaminofén y antiinflamatorios no esteroideos (5). En un estudio realizado entre 2010 y 2013 en la Amazonía peruana, se observó que las artralgias producidas por MAYV estuvieron presentes en más del 50% de los pacientes. El virus afectó principalmente las articulaciones de las manos, muñecas, codos, pies y rodillas y en raras ocasiones la cadera (6). Los dolores articulares de pacientes con MAYV, al igual que en CHIKV producen incapacidad temporal, pero pacientes con CHIKV han presentado artralgias hasta 3 años después de haber padecido la enfermedad aguda. Las principales articulaciones afectadas son la de los dedos, muñecas, rodillas y tobillos (9). El impacto económico y social de la fiebre Mayaro ha sido menor que el del Chikungunya y del Dengue.

The jungle distribution of vectors and hosts of Mayaro fever has limited human outbreaks to rural areas close to tropical forests. However, MAYV can be introduced to other regions in the Americas by sick travelers or migratory birds, and it may adapt to compatible urban vectors such as Aedes aegypti and albopictus (10).

La distribución selvática de los vectores y hospederos de la fiebre Mayaro ha restringido la mayoría de los brotes en humanos a las áreas rurales cercanas a bosques tropicales. No obstante, el MAYV puede ser introducido a otras regiones de las Américas por viajeros enfermos o aves migratorias y puede adaptarse a vectores urbanos compatibles como el Aedes aegypti y albopictus (10).

Many of the vectors and hosts for MAYV are found in Colombia, but it is unclear if the virus is silently circulating among other arbovirosis with similar symptoms like dengue and Chikungunya. There are no publications in Colombia about the MAYV isolation by culture. However, in 1964, seroprevalence of MAYV or an antigenically similar virus was studied in the Gulf of Uraba, the Eastern plains, and the valleys of the high

Muchos de los vectores y hospederos de MAYV se encuentran en Colombia, pero no se conoce con certeza si el virus está circulando de forma silenciosa entre otras arbovirosis con sintomatología similar, como dengue y Chikungunya. En Colombia no se conocen publicaciones científicas que notifiquen la presencia de MAYV por aislamiento viral. No obstante, en 1964 la seroprevalencia de MAYV o un virus antigénicamente similar, fue estudiada en el

4863 and middle Magdalena. In humans and primates Alouatta, Cebus y Saimiri sera were positive by neutralization and hemagglutination tests (11). As described in previous editorials, emerging vi rus es i n Lat i n Ameri c a suc h as Zika, Chikungunya, Oropuche, and Heartland require a more serious study, because not all tropical fevers are dengue.

Salim Mattar V. Ph.D.

golfo de Urabá, Llanos orientales y valles del alto y medio Magdalena. Los resultados por neutralización y hemaglutinación fueron positivos para sueros humanos y de primates del género Alouatta, Cebus y Saimiri (11). Como se describió en editoriales anteriores, los virus emergentes en Latinoamérica como Zika, Chikungunya, Oropuche y Heartland merecen un estudio más serio porque no todas las fiebres tropicales son dengue.

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):4864-4873, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Influence of gastrointestinal parasitism on biochemical variables in blood of laying hens Influencia del parasitismo gastrointestinal en las variables bioquímicas en la sangre de las gallinas ponedoras Josué P Topázio,1 M.Sc, Gabriela Campigotto,1 M.Sc, Marcel M Boiago,1 Ph.D, Gustavo Machado,2 M.Sc, Diovani Paiano,1 Ph.D, Alexandre A Tonin,3 Ph.D, Aleksandro S da Silva,1* Ph.D. Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC), Departamento de Zootecnia, Rua Beloni Trombita Zanini, 680E – Santo Antônio, Chapecó - SC, 89815-630, Brasil. 2Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Laboratório de Epidemiologia Veterinária, Porto Alegre - RS, 91540-000, Brasil. 3Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Avenida Roraima, 1000 - Camobi, Santa Maria - RS, 97105-900, Brasil. *Correspondence: aleksandro_ss@yahoo.com.br 1

Received: October 2014; Acepted: February 2015.

ABSTRACT Objective. This study describes the influence of endoparasites and diet on biochemical variables in sera of brown laying hens. Materials and methods. Biochemical parameters (seric levels of cholesterol, triglycerides, total protein, uric acid, albumin, and alanine aminotransferase activity) were assessed in blood samples of poultry. Three populations of laying hens of different properties (n=20 each) represented our experimental design, from which blood (serum) and feces were collected for biochemical and parasitological analyzes, respectively. Results. From 60 feces samples evaluated 49 were positive for the presence of parasites and 11 were negative. Among the positive samples, 23 had infection with Eimeria spp and the other 26 samples had mixed parasitism with Eimeria spp and Heterakis gallinarum, which influenced (increasing) the levels of total protein and globulin. However, when parasites were analyzed separately, it was observed that the infection by Eimeria spp affected parameters such as cholesterol (which increased, p=0.001) and triglycerides, showing lower results than when the hen was parasitized by Eimeria spp. (p=0.01). Significant (p<0.05) difference was observed in all biochemical variables when the three diets were compared. Conclusions. Our results allowed concluding that the parasitic infection and diet in laying hens influenced the results of serum biochemical parameters evaluated. The main conclusion we found that parasitism caused an increase in total protein and globulin (ie immune response), and there was a negative correlation between parasite load and albumin, uric acid and ALT. Key words: Biochemical variables, Eimeria, Heterakis gallinarum, poultry (Source: CAB, MeSH).

RESUMEN Objetivo. Este estudio describe la influencia de la dieta sobre los endoparásitos y variables bioquímicas en el suero de las gallinas ponedoras marrones. Materiales y métodos. Los parámetros bioquímicos (niveles séricos de colesterol, triglicéridos, proteínas totales, ácido úrico, albúmina, y la actividad de la alanina aminotransferasa) se evaluaron en muestras de sangre de las aves de corral. Tres 4864

Topázio - Influence of parasites on biochemical variables in hens

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poblaciones de gallinas ponedoras de distintas propiedades (n=20 cada uno) representan nuestro diseño experimental, de la que se recogieron la sangre (suero) y las heces de bioquímica y análisis parasitológico, respectivamente. Resultados. De 60 muestras de heces evaluadas, 49 fueron positivos para la presencia de parásitos y 11 fueron negativos. Entre las muestras positivas, 23 tenían infección con Eimeria spp y las otras 26 muestras tenían parasitismo mezclado con Eimeria spp y Heterakis gallinarum, que influyó (aumentando) los niveles de proteína total y globulina. Sin embargo, cuando se analizaron por separado los parásitos, se observó que la infección por Eimeria spp afectó parámetros tales como el colesterol (el cual se incrementó p=0.001) y los triglicéridos, que mostraron resultados más bajos que cuando las gallinas fueron parasitadas por Eimeria spp. (p=0.01). Se observó diferencia (p<0.05) en todas las variables bioquímicas, cuando se compararon las tres dietas. Conclusiones. Nuestros resultados permitieron concluir que la infección parasitaria y la dieta de las gallinas ponedoras influyeron en los resultados de los parámetros bioquímicos séricos evaluados. La principal conclusión que se encontró es que el parasitismo causó un aumento de la proteína total y la globulina (es decir, la respuesta inmune), y hubo una correlación negativa entre la carga de parásitos y albúmina, ácido úrico y ALT. Palabras clave: Aves de corral, variables bioquímicas, Eimeria, Heterakis gallinarum. (Fuente: CAB, MeSH).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Sanity and nutrition are essential factors for the proper animal development, especially in production systems. Improper handling may be responsible for the occurrence of various diseases, including those caused by parasites, such as coccidiosis (1). Coccidiosis is caused by several species of the genus Eimeria, a protozoan. These intracellular parasites usually infect the cells of the digestive tract, causing cell disruption and tissue injury due to the parasite multiplication, causing, consequently occurs bleeding, leading to malabsorption of nutrients and being a gateway to other pathogens (1,2). Broilers, layers and breeders in general are subjected to contamination with Eimeria spp., mainly because in different breeding systems the animals are infected by ingesting sporulated oocysts in water and laying bed. Several species of Eimeria can infect chickens, but the most commonly found are E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox and E. tenella (3). Ascaris galli and Heterakis gallinarum are also endoparasites commonly observed infecting chickens. These nematodes normally infect the large intestine of these animals, causing weight loss, diarrhea and intestinal mucosal lesion (2,4). This infection usually leads to irreparable intestine damage, affecting the absorption of nutrients (2).

La higiene y la nutrición son factores esenciales para el desarrollo adecuado del animal, especialmente en los sistemas de producción. El manejo inadecuado puede ser el responsable de la aparición de algunas enfermedades, incluyendo aquellas causadas por parásitos, como es el caso de la coccidiosis (1). La coccidiosis es causada por varias especies del género Eimeria, un protozoario. Estos parásitos intracelulares generalmente infectan las células del tracto digestivo, causando trastornos celulares y lesiones en los tejidos debido a la multiplicación de los parásitos, presentándose como consecuencia hemorragia, lo que conduce a la mala absorción de nutrientes y se convierte en una puerta de entrada para otros patógenos (1,2). Los pollos de engorde, las ponedoras y las reproductoras, están sometidos en general a la contaminación con Eimeria spp., principalmente porque en los diferentes sistemas de cría los animales se infectan por la ingestión de ooquistes esporulados presentes en el agua y en los nidos. Algunas especies de Eimeria pueden infectar a las gallinas, pero las que se encontraron más comúnmente fueron E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox y E. tenella (3). El Ascaris galli y el Heterakis gallinarum son también endoparásitos que comúnmente infectan a las gallinas. Estos nematodos normalmente infectan el intestino grueso de estos animales, causando pérdida de peso, diarrea y lesión de la mucosa intestinal (2,4). Esta infección por lo general conduce a un daño irreparable del intestino, lo que afecta la absorción de nutrientes (2).

The analysis of biochemical variables can assist in a rapid diagnosis. Among these variables, the most relevant to chickens is alanine aminotransferase (ALT), a catalytic enzyme that has the function of transaminase and acts in the catabolism of amino acids and transport of nitrogen among organs (5). In this sense, ALT activity is an indicator of liver and muscle injuries,

El análisis de las variables bioquímicas puede ayudar a un diagnóstico rápido. Entre estas variables, la más relevante para las gallinas es la alanina aminotransferasa (ALT), una enzima catalítica que tiene la función de la transaminasa y actúa en el

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especially when it is significantly increased (6). Other relevant metabolites that can be assessed are the levels of total protein, albumin and globulin, proteins that can be influenced by the type of diet and creation system, as well as by the different infectious diseases due to the involvement of globulins in the inflammatory response (2,7). Yet, the levels of cholesterol and triglycerides may reflect eating disorders, often derived from the diet (8). Considering that the levels of some blood biochemical variables are linked to the physiological condition and nutritional profile of the animal, as well as it is known that eimeriosis may influence directly the functional animal homeostasis (4,9), this study aimed to evaluate the effects of parasitic diseases and diet on blood biochemical parameters of laying hens.

MATERIAIL AND METHODS Ethical aspects. The project was approved by the ethics committee on animal research at the Universidade do Estado de Santa Catarina, protocol number, 01.24.14. Study sites. Samples were collected from three commercial poultry farms located in different towns of western Santa Catarina State, southern Brazil. The hens were housed collectively in a shed, and the animals were laying eggs in nests. Animals and collection of samples. Our experimental design used 60 laying hens of Hy Line lineage, aging between 17 and 23 weeks. From each property it was collected a total of 20 blood and faeces samples. For collect the samples the laying hens were manually contained. By brachial vein route, using a 5.0 mL syringe and needle 25x7, it was collected an average of 2.5 mL of blood, from which sera samples were obtained through blood centrifugation at 3500 rpm for 10 minutes. Serum samples were identified and stored at -20°C until the biochemical analyzes. Samples of feces were collected immediately after collection of blood through the direct collect of cloacal feces (2 to 4 g). They were stored in plastic containers and kept under refrigeration (10ºC) until laboratorial processing. Biochemical variables. Seric levels of cholesterol, triglycerides, total protein, uric acid, albumin and alanine aminotransferase (ALT) activity were assessed using a semi-automated analyzer (Bioplus 2000®), and used specific kits

catabolismo de los aminoácidos y en el transporte de nitrógeno entre los órganos (5). En este sentido, la actividad de la ALT es un indicador de lesiones hepáticas y musculares, en especial cuando aumenta significativamente (6). Otros metabolitos relevantes que se pueden evaluar son los niveles de proteína total, albúmina y globulina, proteínas que pueden ser influenciadas por el tipo de dieta y el sistema de creación, así como por las diferentes enfermedades infecciosas debido a la participación de las globulinas en la respuesta inflamatoria (2,7). Sin embargo los niveles de colesterol y triglicéridos pueden reflejar trastornos en la alimentación, a menudo derivados de la dieta (8). Considerando que los niveles de algunas variables bioquímicas de la sangre están relacionados con las condiciones fisiológicas y el perfil nutricional del animal, se sabe que la eimeriosis puede influir directamente en la homeostasis funcional de los animales (4,9); este estudio tuvo como objetivo evaluar los efectos de las enfermedades parasitarias y de la dieta sobre los parámetros bioquímicos de la sangre de las gallinas ponedoras

MATERIALES Y MÉTODOS Aspectos éticos. El Proyecto fue aprobado por el comité de ética para la investigación con animales de la Universidade do Estado de Santa Catarina, protocolo número 01.24.14. Sitios de estudio. Las muestras se tomaron en tres granjas comerciales de aves de corral localizadas en diferentes pueblos del oeste del estado Santa Catarina, en el sur de Brasil. Las gallinas se ubicaron colectivamente en un cobertizo y estas ponían sus huevos en nidos. Animales y toma de muestras. En nuestro diseño experimental se utilizaron 60 gallinas del linaje Hy Line, con edades entre 17 y 23 semanas. En cada granja se recogieron un total de 20 muestras de sangre y de heces. Para la recolección de las muestras las gallinas ponedoras fueron sostenidas manualmente. Por la vena braquial, mediante una jeringa de 5.0 ml y una aguja 25x7, se recogió una media de 2.5 ml de sangre y se obtuvieron muestras de suero mediante centrifugación de la sangre a 3500 rpm durante 10 minutos. Las muestras de suero se identificaron y se almacenaron a -20ºC hasta la realización del análisis bioquímico. Las muestras de la materia fecal se tomaron inmediatamente después de la recolección de la sangre mediante toma directa de las heces cloacales (de 2 a 4 g). Estas se almacenaron en recipientes

Topázio - Influence of parasites on biochemical variables in hens

for each test (Gold Analisa Diagnóstica® Ltda). Globulin levels were calculated as the difference between total protein and albumin (10). Parasitological of faeces. Fecal samples (1 g) were processed by the flotation method (centrifugal flotation technique), using sucrose supersaturated solution (15 mL). The samples were centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes. The microscopic evaluation aimed to visualize eggs, cysts and oocysts of parasites in 100 and 400x, as well as quantified the number of oocysts per gram of feces (OOPG) of coccidian in glass slide each. The helminth eggs were only identified, and not quantified. Diet. In each farm, two samples (500 g) of ration were collected and identified. These samples were kept under refrigeration condition throughout the transport from the site of analysis, where they were stored frozen until analysis. The samples were ground in a hammer mill type using sieves of 1 mm, and then conducted analysis of dry matter, crude protein, gross energy, ether extract and mineral matter (11), of the agreement with the methodology (12). Statistical analysis. T h e data from biochemical analysis: albumin, uric acid, ALT, cholesterol, triglycerides, total protein and globulin, as well as the OOPG count were first analyzed by descriptive statistics for contingency of the information and for further assumptions and what is presented as descriptive is the mean and standard deviation. All above parameters were tested for normality of variance by ShapiroWilk test, skewness, kurtosis and homogeneity by Levene’s test previously to ANOVA analysis. The OOPG, alt, cholesterol, triglycerides, total protein and globulin were transformed by {Log10(x+1)} before linear and variance analysis. All biochemical parameters were also analyses for correlation with OOPG count by Kendall rank correlation. For parametric analysis first type of diet was analyzed by compering its influence on biochemical parameter using one-way ANOVA as well as linear regression model for correlation, where necessary (statistic difference were found), Bonferroni´s test (13). Finally, it was also analyzed the influence of parasite infection type on the biochemical parameters by compering its influence on biochemical parameter using one-way ANOVA as well as linear regression model for correlation, where necessary (statistic difference were found), Bonferroni´s test (13). It was considered significantly different when p<0.05. The whole statistical process was carried out with R-language, v.2.15.2 (R Development Core Team, 2012).

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plásticos y se mantuvieron refrigeradas (10°C) hasta cuando se procesaron en el laboratorio. Variables bioquímicas. Los niveles séricos de colesterol, triglicéridos, proteína total, ácido úrico, albúmina y de actividad de la alanina aminotransferasa (ALT) se evaluaron utilizando un analizador semiautomático (Bioplus 2000®); se utilizaron kits específicos para cada prueba (Gold Analisa Diagnóstica® Ltda.). Los niveles de globulina se calcularon como la diferencia entre proteína total y albúmina (10). Parasitológico de las heces. Las muestras fecales (1g) se procesaron por el método de flotación (técnica de flotación centrífuga) utilizando una solución supersaturada de sacarosa (15 mL). Las muestras se centrifugaron a 2500 rpm durante 10 minutos. La evaluación microscópica permitió visualizar huevos, quistes y ooquistes de parásitos a 100x y 400x, e igualmente se cuantificó el número de ooquistes de coccidios por gramo de heces (OOPG) en cada portaobjetos de vidrio. Los huevos de los helmintos solamente se identificaron mas no se cuantificaron. Dieta. En cada granja se recogieron y se identificaron dos muestras (500 g) de la ración. Estas muestras se guardaron bajo condiciones de refrigeración durante todo su transporte desde el lugar del análisis, donde se almacenaron congeladas hasta el momento del análisis. Las muestras se molieron en un molino de martillos, se utilizaron tamices de 1 mm y luego se realizaron análisis de materia seca, proteína cruda, energía bruta, extracto de éter y contenido de minerales (11), del acuerdo con la metodología (12). Análisis estadístico. Los siguientes son los datos del análisis bioquímico: albúmina, ácido úrico, ALT, colesterol, triglicéridos, proteína total y globulina, así como el recuento OOPG, se analizaron primero por estadística descriptiva para la contingencia de la información y para las nuevas hipótesis; lo que se presenta como descriptiva corresponde a las desviaciones media y estándar. A todos los parámetros anteriores se les realizaron pruebas de normalidad de varianza mediante el test de ShapiroWilk, asimetría, curtosis y homogeneidad mediante la prueba de Levene previo al análisis ANOVA. El OOPG, ALT, colesterol, triglicéridos, proteína total y globulina se transformaron por {Log10 (x + 1)} antes del análisis lineal y de la varianza. A todos los parámetros bioquímicos también se les hizo el análisis de correlación con el recuento OOPG por rango de correlación según Kendall. Para el análisis paramétrico, se analizó el primer tipo de dieta comparando su influencia sobre los parámetros bioquímicos, utilizando ANOVA de una vía, (Análisis de Varianza, por sus siglas en inglés), así como

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RESULTS Parasites and infection type. Among the samples tested, 11 were negative and 49 were positives for Eimeria spp. (oocysts) and/or Heterakis gallinarum (eggs). The OOPG showed a mean value of 596.46 (ranging between 0-9696) in the three properties under evaluation. Diet. The data of diet analyzes are presented in table 1. Numerically, the diet 1 had lower levels of crude protein, gross energy, ether extract, and mineral matter when compared with diets 2 and 3. Table 1. Composition of diets fed to laying hens on the three properties studied. Composition

Diet1

Diet2

Diet3

Dry matter (%)

88.26

88.48

88.87

Crude protein (%)

16.62

17.05

18.49

2.60

2.80

2.85

12.45

13.2

13.04

4.3

4.7

4.8

Gross energy (Mcal/Kg) Ash (%) Crude fat (%)

Relationship between biochemical variables and OOPG. Negative correlation between OOPG (Eimeria spp) and albumin (r= -0.28), uric acid (r= -0.28), and ALT (r= -0.19) in the serum of the laying hens was observed (Table 2). It was not observed correlation between OOPG and cholesterol, triglycerides, total protein and globulin (Table 2). Relationship between biochemical variables and diet. The results of biochemical variables in layers serum at three farms with different diets were shown in table 3. There was statistical significance between diets and albumin levels (F=7.62, df=2, p<0.001) being higher on diets 2 and 3, respectively (B=0.50±0.13, t=3.74, Table 2. Correlation between the number of oocysts per gram of faeces (OOPG) of Eimeria spp. and serum biochemical variables (albumin, uric acid, alanine aminotransferase (ALT), cholesterol, triglycerides, total protein and globulin) in laying hens. Correlation of Kendall

Rho

P-value

OOPG

-0.28

0.002

Albumin (g/dL) OOPG

-0.28

0.001

-0.19

0.03

0.13

0.14

0.07

0.39

-0.03

0.37

0.18

0.08

Uric acid (mg/dL) OOPG ALT (U/L) OOPG Cholesterol (mg/dL) OOPG Triglycerides (mg/dL) OOPG Total protein (g/dL) OOPG Globulin (g/dL)

el modelo de regresión lineal para la correlación; debido a que se encontró una diferencia estadística se hizo necesaria la prueba de Bonferroni (13). Por último, también se analizó la influencia del tipo de infección parasitaria sobre los parámetros bioquímicos comparando su influencia sobre estos utilizando el método ANOVA de una vía, al igual que el modelo de regresión lineal para correlación; debido a que se encontró una diferencia estadística se hizo necesaria la prueba de Bonferroni (13). Se consideró significativamente diferente cuando p<0.05. Todo el proceso estadístico general se llevó a cabo utilizando el Lenguaje-R, v.2.15.2 (R Development Core Team, 2012).

RESULTADOS Parásitos y tipo de infección. De las muestras examinadas, 11 dieron resultados negativos y 49 positivos para Eimeria spp. (ooquistes) y/o Heterakis gallinarum (huevos). Los OOPG mostraron un valor medio de 596.46 (con rango entre 0-9696) en las tres granjas que se evaluaron. Dieta. La información de los análisis de las dietas se presenta en la tabla 1. Numéricamente la dieta 1 tiene los niveles más bajos de proteína cruda, energía bruta, extracto de éter y contenido de minerales en comparación con las dietas 2 y 3. Relación entre las variables bioquímicas y OOPG. Se observó una correlación negativa entre OOPG (Eimeria spp) y albúmina (r= -0.28), ácido úrico (r= -0.28), and ALT (r= -0.19) en el suero de las gallinas ponedoras (Tabla 2). No se observó correlación entre OOPG y colesterol, triglicéridos, proteína total y globulina (Tabla 2).

Table 3. Influence of diet (three properties) on blood biochemical variables (albumin, uric acid, alanine aminotransferase (ALT), cholesterol, triglycerides, total protein and globulin) in laying hens. Variables

Mean and standard deviation* Diet1

Diet2

Diet3

Albumin (g/dL)

1.69 ± 0.40b

2.19 ± 0.46a

2.07 ± 0.41a

Uric acid (mg/dL)

3.57 ± 1.49b

7.00 ± 2.18a

7.44 ± 2.070a

ALT (U/L)

15.00 ± 5.01b 30.10 ± 15.58a 30.28 ± 18.00a

Cholesterol (mg/dL)

207.4 ± 66.4a

149.6 ± 51.2b 103.25 ± 47.2b

Triglycerides (mg/dL) 486.4 ± 180.5b 443.1 ± 107.2b 714.9 ± 169.5a Total protein (g/dL)

4.74 ± 1.06b

4.11 ± 0.72b

7.04 ± 1.46a

Globulin (g/dL)

3.05 ± 0.90b

1.92 ± 0.70c

4.97 ± 1.52a

*Means followed by equal letter in the same line are not significantly different by Bonferroni’s test (p<0.05).

Topázio - Influence of parasites on biochemical variables in hens

p<0.01 and B=0.38±0.13, t=2.84, p<0.001). Also was observed a statistical significance between diets and uric acid levels (F=23.9, df=2, p<0.001) being higher on diet 2 and 3, respectively (B=3.42±0.61, t=5.60, p<0.01 and B=3.87±0.61, t=6.32, p<0.001). Other analysis with statistical significance was between diets and ALT levels (F=10, df=2, p<0.001) being higher on diet 2 and 3, respectively (B=0.60±0.15, t=3.90, p<0.01 and B=0.59±0.15, t=3.85, p<0.001). The lipid metabolism also changed with the different diets, there was statistical significance between diets and cholesterol levels (F=4.63, df=2, p<0.001) being lower on diet 2 and 3, respectively (B=-0.24±0.17, t=-1.37, p=0.17 and B=-0.54±0.17, t=-3.04, p<0.001), and triglycerides levels (F=16.4, df=2, p<0.001) being lower on diet 3, respectively (B=0.45±0.15, t=-2.93, p=0.001). Moreover, it was verified a statistical significance effect between diets on total protein levels (F=37.9, df=2, p<0.001) being higher on diet 3 (B=0.40±0.06, t=6.27, p<0.001). Likewise, was observed a statistical significance between diets and globulin levels (F=40.6, df=2, p<0.001) being lower on diet 3 (B=-0.47±0.10, t=-4.39, p<0.001) and higher on diet 2 (B=0.50±0.10, t=4.62, p<0.001). Relationship between biochemical variables and parasites. The effects of type (simple or mixed) infection on serum biochemical variables are presented in table 4. There was no statistical significance between the type of infection and parasites with albumin levels (F=0.43, gl=2, p=0.64), uric acid levels (F=1.35, gl=2, p=0.26) and ALT activity (F=1.47, df=2, p=0.23). However, a statistically significant difference between the type of infection and parasites with cholesterol levels was observed (F=7.08, gl=2, p=0.001), being higher in chickens parasitized only by Eimeria spp. (B=0.67±0.19, t=3.42, p=0.001) and did not differ for mixed infection by Eimeria spp. and H. galinarum (B=0.20±0.20, t=0.21, p=0.19), when compared to the uninfected chickens. A statistically significant difference between infection and parasite with triglyceride levels was observed (F=8.69, gl=2, p=0.001), being lower in the serum of chickens only parasitized by Eimeria spp. (B=-0.50±0.19, t=-2.57, p=0.01), but without statistical significance for the mixed infection (B=0.10±0.20, t=0.50, p=0.61). Statistically significant difference between types of infections and parasites with the total protein levels was verified (F=13.28, gl=2, p=0.001) and globulin (F=14.65, gl=2, p=0.001). The

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Relación entre las variables bioquímicas y la dieta. Los resultados de las variables bioquímicas en el suero de las gallinas ponedoras de las tres granjas con dietas diferentes se muestran en la Tabla 3. Hay significancia estadística entre las dietas y los niveles de albúmina (F=7.62, df=2, p<0.001) siendo mayores en las dietas 2 y 3, respectivamente (B=0.50±0.13, t=3.74, p<0.01 y B=0.38±0.13, t=2.84, p<0.001). También se observó una significancia estadística entre las dietas y los niveles de ácido úrico (F=23.9, df=2, p<0.001) siendo mayores en las dietas 2 y 3, respectivamente (B=3.42±0.61, t=5.60, p<0.01 y B=3.87±0.61, t=6.32, p<0.001). Otro análisis con significancia estadística se encontró entre las dietas y los niveles ALT (F=10, df=2, p<0.001) siendo mayores en las dietas 2 y 3, respectivamente (B=0.60±0.15, t=3.90, p<0.01 y B=0.59±0.15, t=3.85, p<0.001). El metabolismo de los lípidos también cambió con las diferentes dietas; hubo significancia estadística entre las dietas y los niveles de colesterol (F=4.63, df=2, p<0.001) siendo más bajo en las dietas 2 y 3, respectivamente (B=-0.24±0.17, t=-1.37, p=0.17 y B=-0.54±0.17, t=-3.04, p<0.001) y los niveles de triglicéridos (F=16.4, df=2, p<0.001) siendo más bajo en la dieta 3, respectivamente (B=-0.45±0.15, t=-2.93, p=0.001). Por otro lado, se verificó un efecto de la significancia estadística entre las dietas sobre los niveles de proteína total (F=37.9, df=2, p<0.001) siendo mayores en la dieta 3 (B=0.40±0.06, t=6.27, p<0.001). Además, se observó una significancia estadística entre las dietas y los niveles de globulina (F=40.6, df=2, p<0.001) siendo menores en la dieta 3 (B=-0.47±0.10, t=-4.39, p<0.001) y mayores en la dieta 2 (B=0.50±0.10, t=4.62, p<0.001). Relación entre las variables bioquímicas y los parásitos. Los efectos del tipo de infección (simple o mixta) en las variables bioquímicas del suero se presentan en la tabla 4. No hay significancia estadística entre el tipo de infección y de parásitos con los niveles de albúmina (F=0.43, gl=2, p=0.64), niveles de ácido úrico (F=1.35, gl=2, p=0.26) y actividad ALT (F=1.47, df=2, p=0.23). Sin embargo se observó una diferencia estadísticamente significativa entre el tipo de infección y de parásitos con los niveles de colesterol (F=7.08, gl=2, p=0.001), siendo más alto en las gallinas que tenían únicamente el parásito Eimeria spp. (B=0.67±0.19, t=3.42, p=0.001) y no fue diferente para las infecciones mixtas con Eimeria spp. y H. gallinarum (B=0.20±0.20, t=0.1, p=0.19), en comparación con las gallinas no infectadas.

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Table 4. Effect of single infection by Eimeria spp., and mixed infection by genus Eimeria and Heterakis gallinarum on biochemical variables (albumin, uric acid, alanine amiotransferase (ALT), cholesterol, triglycerides, total protein and globulin) in laying hens compared uninfected by gastrointestinal parasites. Mean and standard deviation* Variables

Single infection: Eimeria spp.

Mixed infection: Eimeria spp. and H. gallinarum

Control: Uninfected

Albumin (g/dL)

2.00 ± 0.40a

1.91 ± 0.51a

2.07 ± 0.59a

Uric acid (mg/dL)

5.57 ± 2.50a

6.11 ± 2.85a

7.09 ± 2.07a

ALT (U/L) Cholesterol (mg/dL)

22.21 ± 12.39a 26.53 ± 17.96a 31.08 ± 18.53a 183.4 ± 62.3a

140.3 ± 43.5a

89.7 ± 39.9b

Triglycerides (mg/dL) 397.5 ± 117.1b 651.0 ± 138.1a 594.3 ± 114.7a Total protein (g/dL)

4.39 ± 1.00b

6.41 ± 1.81a

4.77 ± 1.62b

Globulin (g/dL)

2.39 ± 0.96b

4.50 ± 1.57a

2.70 ± 1.96b

*Means followed by equal letter in the same line are not significantly different by Bonferroni’s test (p<0.05).

levels of total protein and globulin were higher in chickens infected with mixed infection by parasites (B=0.26±0.09, t=2.81, p=0.006; B=0.37±0.15, t=2.32, p=0.02, respectively), but no significant difference in single infection by Eimeria spp. (B=0.10±0.09, t=0.09, p=0.29; B=0.30±0.16, t=1.78, p=0.08) when compared to the uninfected chickens.

DISCUSSION It was found that the laying hens naturally infected with parasites (Eimeria spp and Heterakis gallinarum) presented a change in the levels of blood biochemical variables. Chickens experimentally infected with Ascaridia galli presented decreased seric levels of glucose, total protein, albumin and magnesium (14). Additionally, biochemical studies in an experimental Eimeria necatrix infection in chickens caused a reduction in the levels total protein, albumin and globulin, as well as an elevation in cholesterol concentration in serum (14). Similarly, in our study it was observed a negative correlation between albumin levels and degree of infection by Eimeria (OOPG), i.e., the observation of higher OOPG and lower albumin levels. Also, it was observed an increase of cholesterol in the single infection by Eimeria spp, a similar finding observed by Basith et al (15). The number of oocysts negatively influenced the serum levels of albumin. It may is explained by the fact that parasitic infections cause

Se observó una diferencia estadísticamente significativa entre el tipo de infección y de parásitos con los niveles de triglicéridos (F=8.69, gl=2, p=0.001), siendo menor en el suero de las gallinas infectadas solo con Eimeria spp. (B=-0.50±0.19, t=-2.57, p=0.01), pero sin significancia estadística para las infecciones mixtas (B=0.10±0.20, t=0.50, p=0.61). Se verificó la diferencia estadísticamente significativa entre los tipos de infección y de parásitos con los niveles de proteína total (F=13.28, gl=2, p=0.001) y globulina (F=14.65, gl=2, p=0.001). Los niveles de proteína total y globulina fueron más altos en las gallinas infectadas con infección mixta de parásitos (B=0.26±0.09 t=2.81, p=0.006; B=0.37±0.15, t=2.32, p=0.02, respectivamente), pero no hubo diferencia significativa en infección simple con Eimeria spp. (B=0.10±0.09, t=0.09, p=0.29; B=0.30±0.16, t=1.78, p=0.08) cuando se comparó con las gallinas no infectadas.

DISCUSIÓN Se encontró que las gallinas ponedoras infectadas naturalmente con parásitos (Eimeria spp y Heterakis gallinarum) presentaron un cambio en los niveles de las variables bioquímicas de la sangre. Las gallinas infectadas experimentalmente con Ascaridia galli presentaron una disminución de los niveles séricos de glucosa, proteína total, albúmina y magnesio (14). Adicionalmente, los estudios bioquímicos en una infección experimental con Eimeria necatrix en las gallinas causaron una reducción en los niveles de proteína total, albúmina y globulina, así como una elevación de la concentración de colesterol en el suero (14). Igualmente, en nuestro estudio se observó una correlación negativa entre los niveles de albúmina y el grado de infección con Eimeria (OOPG), es decir, la observación de mayores OOPG e inferiores niveles de albúmina. Además, se observó un aumento de colesterol en la infección simple por Eimeria spp, un hallazgo similar al observado por Basith et al (15). El número de ooquistes influenció negativamente los niveles séricos de la albúmina. Esto se puede explicar por el hecho de que las infecciones parasitarias causan enteritis y hemorragia intestinal en las aves, dando lugar a un síndrome de mala absorción que puede poner en peligro el metabolismo de las proteínas (4,16). Los niveles de proteína total y globulina no muestran correlación significativa con el número de ooquistes de Eimeria spp., aun cuando hubo una tendencia (p=0.08) hacia una correlación positiva con globulina. Los niveles de ácido úrico también se influenciaron negativamente por el grado de parasitismo (OOPG). Esto representa la forma principal de excreción variable de los compuestos nitrogenados en las gallinas. Considerando que generalmente la diarrea

Topázio - Influence of parasites on biochemical variables in hens

intestine enteritis and bleeding in birds, leading to a malabsorption syndrome that can impair the protein metabolism (4,16). Total protein and globulin levels did not show significant correlation with the number of Eimeria spp. oocysts, although there was a tendency (p=0.08) to a positive correlation with globulin. Levels of uric acid were also negatively influenced by the degree of parasitism (OOPG). It represents the main form of variable excretion of nitrogenous compounds in chickens. Considering that diarrhea is usually caused by these parasites, it may cause an accelerated elimination of nitrogenous compounds (precursors of uric acid), decreasing its synthesis and, consequently, its blood concentration (5,17). In this study, the ALT activity was lower in hens with larger numbers of oocysts of Eimeria spp. A possible damage to enterocytes caused by this parasite may have impaired the absorption of amino acids and phosphorus, which are important elements in the process of liver ALT biosynthesis (18), this hypothesis can be confirmed starting from analyzes of serum levels of phosphorus, generating a new correlation study. Moreover, changes in serum ALT activity may be related to liver lesion (6), usually increasing its activity. However, we observed an opposite situation where its levels were reduced. Thus, we suggest that the change on ALT activity was not related to tissue damage. There was no relation between cholesterol and triglyceride (lipid metabolism) with the degree of parasitism (OOPG), but it was observed a reduction in the concentration of triglycerides in animals with single infection by Eimeria. It was already expected since this parasite usually causes intestine lesions (4,16), and therefore, it may lead to malabsorption of fatty acids present in the diet. Additionally, it was observer higher cholesterol levels in laying hens infected with parasites; however, it remained without a plausible explanation. High levels of total protein and globulin in chickens with mixed infection by Eimeria spp. and H. gallinarum may be was related to the immune response against the parasitism (7) It is known that host subjected to parasitic diseases usually activates the humoral and cellular immune responses in order to produce protection against the parasites (19). Our findings in this study suggest that the increase in total protein and globulin were mainly related to H. gallinarum infection, since the single infection by Eimeria spp did not change these variables.

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es causada por estos parásitos, se puede originar una eliminación acelerada de los compuestos nitrogenados (precursores del ácido úrico), disminución de su síntesis y, en consecuencia, de su concentración en la sangre (5,17). En este estudio, la actividad de la ALT es menor en las gallinas con mayor número de ooquistes de Eimeria spp. Un posible daño a los enterocitos causado por este parásito puede deteriorar la absorción de aminoácidos y fósforo, que son elementos importantes en el proceso de biosíntesis de ALT en el hígado (18); esta hipótesis se puede confirmar a partir del análisis de los niveles séricos de fósforo, generando un nuevo estudio de correlación. Además, cambios en la actividad ALT en el suero pueden estar relacionados con lesiones hepáticas (6), aumentando por lo general su actividad. Observamos, sin embargo, una situación opuesta donde se redujeron sus niveles. Por lo tanto, se sugiere que el cambio en la actividad de la ALT no estaba relacionado con el daño tisular. No hubo relación entre el colesterol y los triglicéridos (metabolismo de los lípidos) con el grado de parasitismo (OOPG), pero se observó una reducción en la concentración de triglicéridos en los animales con infección simple por Eimeria. Ya se esperaba que este parásito pudiera causar lesiones intestinales (4,16) y, por lo tanto, esto puede conducir a la mala absorción de los ácidos grasos presentes en la dieta. Adicionalmente se observaron altos niveles de colesterol en las gallinas ponedoras infectadas por parásitos; sin embargo, para esto no hay una explicación razonable. Los altos niveles de proteína total y globulina en las gallinas con infecciones mixtas por Eimeria spp. y H. gallinarum pueden estar relacionados con una respuesta inmune contra los parásitos (7). Se sabe que un anfitrión sometido a enfermedades parasitarias normalmente activa las respuestas inmunes humorales y celulares con el fin de producir protección contra los parásitos (19). Nuestros hallazgos en este estudio sugieren que el aumento en la proteína y la globulina total estaba principalmente relacionado con la infección por H. gallinarum, ya que la infección simple por Eimeria spp no alteró estas variables. Se encontró que las gallinas que recibieron las dietas 2 y 3, con altos niveles de proteína, tuvieron significativamente un contenido de proteína total sérica más alto. Esto se explica ya que existe una estrecha relación entre los niveles nutricionales y la proteína total y la albúmina (20). Del mismo modo, los niveles de ácido úrico fueron también más bajos en las gallinas alimentadas con dietas que contenían cantidades menores de proteína. Este es otro resultado esperado ya que este compuesto se

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It was found that the chickens that received diets 2 and 3, with higher levels of protein had significantly higher seric total protein. It is explained since there is a close relation between nutritional levels, total protein and albumin (20). Similarly, the uric acid levels were also lower in chickens fed with diets with lower protein amounts. It is another expected result, since this compound is synthesized from the amino acid portion of nitrogen, being in the form of nitrogen excretion from birds (5, 18). Data of ALT activity showed that diet with lower crude protein resulted in a lower ALT activity. It occurred possibly due to the lower intake of amino acid provided by the diet, as found in broilers at 21 days (21). The higher levels of blood cholesterol were found in hens under the diet 1, or with lower levels of energy and crude protein. Our hypothesis is that chickens receiving this diet synthesized cholesterol more intensely, especially because the three diets evaluated were prepared from ingredients of vegetable origin, and therefore, cholesterol free. Another possible explanation is the use of oils rich in unsaturated fatty acids and polyunsaturated fatty acids in the diets 2 and 3, which were more energetic. According of Murray et al. (17) these fatty acids act reducing cholesterol (LDL) by increasing the catabolism of LDL, the major atherogenic lipoprotein protein. Additionally, triglyceride levels were higher in the diet with greater energy levels. However, the levels of this variable were closely related to the time of blood collection, because the lipid metabolism in laying hens is very unstable, since the yolk is composed mainly of fats. Based on the results it can be concluded that infection with parasites influence on serum biochemical variables in laying hens. The reduction of some biochemical variables may be related to intestinal damage due to the parasitism by Eimeria spp, a well-known factor described in the literature, and therefore, contributing to a less absorption of nutrients. The increase of total protein and globulin were suggestive of immune response activation against H. gallinarum. Finally, this study also confirmed that the diet has a direct effect on biochemical variables. Therefore, to avoid losses in production emphasize the importance of the use of coccidiosis control programs (22).

sintetiza a partir de la proporción de nitrógeno en los aminoácidos, en forma de excreción de nitrógeno por parte de las aves (5,18). Los datos de actividad de la ALT mostraron que la dieta con baja proteína cruda dio como resultado una menor actividad de la ALT. Esto ocurrió posiblemente debido a la menor ingesta de aminoácidos proporcionada por la dieta, como se observó en los pollos de engorde a los 21 días (21). Se encontraron altos niveles de colesterol en la sangre en las gallinas sometidas a la dieta 1 o menores niveles de energía y proteína cruda. Nuestra hipótesis es que las gallinas que recibieron esta dieta sintetizaron el colesterol más intensamente, especialmente porque las tres dietas evaluadas se prepararon con ingredientes de origen vegetal y, por lo tanto, libre de colesterol. Otra posible explicación es el uso de aceites ricos en ácidos grasos insaturados y polinsaturados en las dietas 2 y 3, que fueron más energéticos. De acuerdo con Murray et al (17), estos ácidos grasos actúan reduciendo el colesterol (LDL) mediante el aumento del catabolismo del LDL, la principal proteína de las lipoproteínas aterogénicas. Además, los niveles de los triglicéridos fueron más altos en las dietas con mayores niveles de energía. Sin embargo, los niveles de esta variable estaban estrechamente relacionados con el momento de la toma de sangre, debido a que el metabolismo de los lípidos en las gallinas ponedoras es muy inestable, ya que la yema de huevo se compone principalmente de grasas. Con base en los resultados se puede concluir que la infección con parásitos influye en las variables bioquímicas en el suero de las gallinas ponedoras. La reducción de algunas variables bioquímicas puede estar relacionado con daños intestinales debido al parasitismo por Eimeria spp, un factor bien conocido y descrito en la literatura, y que además contribuye a una menor absorción de los nutrientes. El incremento de la proteína total y la globulina sugieren la activación de la respuesta inmune contra la H. gallinarum. Por último, este estudio también confirmó que la dieta tiene un efecto directo en las variables bioquímicas. Por lo tanto, para evitar pérdidas en la producción se hace énfasis en la importancia de implementar programas de control de la coccidiosis (22).

Topázio - Influence of parasites on biochemical variables in hens

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):4874-4883, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Clinical safety of dichlorvos (45%), cypermethrin (5%) and piperonyl butoxide (25%) administered by spray on the skin of cattle Seguridad clínica del diclorvos (45%), cipermetrina (5%) y butóxido de piperonilo (25%) administrado por aspersión sobre la piel de bovinos Alessandra C Moraes,1 M.Sc, Ed JR Prado,2 M.Sc, Vanessa P Faria,1 MV, Thais MS Gírio,3 Ph.D, Wilson G Manrique,2 Ph.D, Marco AA Belo,1,4* Ph.D. São Paulo State University – UNESP, Department of Preventive Veterinary Medicine, Via de acesso Prof. Paulo Donato Castellane s/n CEP 14884-900, Jaboticabal/SP - Brazil. São Paulo State University – UNESP, 2Department of Veterinary Pathology, Via de acesso Prof. Paulo Donato Castellane s/n CEP 14884-900, Jaboticabal/SP - Brazil. 3Uzinas Chimicas Brasileiras S.A. Deparment of Research and Technical Development, Praça Dr. Joaquim Batista, 150, Centro 14870-090, Jaboticabal/SP – Brazil. 4 Camilo Castelo Branco University, Laboratory of Animal Pharmacology and Toxicology. Av. Hilário da Silva Passos, 950. Parque Universitário CEP. 13690-000, Descalvado/SP - Brazil. *Correspondence: maabelo@hotmail.com 1

Received: October 2014; Acepted: March 2015.

ABSTRACT Objective. Due to the importance of controlling ectoparasites, associated with the necessity of technical knowledge on the safety of topical treatment with organophosphates, pyrethroids and piperonyl butoxide to the animal organism, this bioassay was carried out to evaluate the clinical safety of the association of dichlorvos (45%) + cypermethrin (5%) + piperonyl butoxide (25%) administered by spray on the skin of cattle, through the study of clinical parameters, biochemical, haematological and behavioral changes. Materials and methods. Sixteen crossbred animals with a mean age of 18 months, males and females grouped into two treatments with eight animals each: T1 (1:800 v/v) and T2 (1:200 v/v). Were collected blood samples at six different times: before treatment (BT), 24, 48, 72, 96 and 192 hours post treatment (HPT). Results. The antiparasitic association administered by spray on the skin did not result in changes in the enzymatic activity of ALT, AST, GGT and ALP, as well as in serum albumin, triglycerides, cholesterol, urea and creatinine, demonstrating the safety of this antiparasitic compound for maintaining hepatic and renal functionality. The erythrocyte, leukocyte and platelet studies showed no changes caused by treatments, and no clinical signs and behavioral changes were observed after treatment. Conclusions. These findings demonstrated good safety margin for spray treatment on the skin with this antiparasitic compound, even when administered at a dilution of 1:200 v/v, which is four times the dose recommended for ectoparasite control. Key words: Clinical safety, bovine, organophosphates, piperonyl butoxide, pyrethroids, spray (Source: DeCS, USDA).

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Moraes - Dichlorvos, cypermethrin and piperonyl butoxide in cattle

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RESUMEN Objetivo. Debido a la importancia del control de ectoparásitos en bovinos, asociado a la necesidad de conocimientos técnicos sobre la seguridad del tratamiento tópico con organofosforados, piretroides y butóxido de piperonilo, se realizó este bioensayo para la evaluación de la seguridad clínica de la asociación de diclorvos (45%) + cipermetrina (5%) + butóxido de piperonilo (25%), administrado por aspersión en la piel del ganado bovino, a través del estudio de los parámetros clínicos, bioquímicos, hematológicos y comportamentales. Materiales y métodos. Dieciséis animales entre machos y hembras cruzados con edad media de 18 meses, agrupados en dos tratamientos de ocho animales cada uno: T1 (1:800 v/v) y T2 (1:200 v/v). Fueron colectadas muestras de sangre en seis momentos diferentes: antes del tratamiento (BT), 24, 48, 72, 96 y 192 horas post tratamiento (HPT). Resultados. La asociación antiparasitaria administrada por aspersión en la piel no alteró la actividad enzimática de ALT, AST, GGT y FA, así como la albúmina, triglicéridos, colesterol, urea y creatinina, que demuestra la seguridad de este compuesto antiparasitario en la función renal y hepática. El análisis de eritrocitos, leucocitos y plaquetas no mostraron cambios en los tratamientos, tampoco fueron observados signos clínicos y de comportamiento post tratamiento. Conclusiones. Estos resultados demostraron buen margen de seguridad en el tratamiento por aspersión en la piel con este compuesto antiparasitario, incluso cuando se administra en una dilución de 1:200 v/v, que es cuatro veces la dosis recomendada para el control de ectoparásitos. Palabras clave: Aspersión, bovino, butóxido de piperonilo, organofosfatos, piretroides, seguridad clínica (Fuentes: DeCS, USDA).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The South America assumes an important position as a world producer of beef, contributing to economic and social development, responsible for thousands of direct and indirect jobs (1). According to Soares et al (2), the development of the cattle industry depends on the health herd management, and the control of parasitic diseases is revealed as an essential factor to make this activity more effective and competitive.

Suramérica asume una posición importante como productor mundial de carne de res, contribuyendo al desarrollo social y económico, siendo responsable por miles de trabajos directos e indirectos (1). De acuerdo con Soares et al (2), el desarrollo de la industria ganadera depende de la gestión sanitaria del rebaño, y el factor principal para hacer esta actividad más efectiva y competitiva es el control de enfermedades parasitarias.

The ectoparsitoses are responsible for high economic losses to the cattle industry in regions with tropical and subtropical climates (3). However, there are a number of active principles that participate in chemotherapy formulations used for parasite control, and the administration of them without epidemiological criteria and incorrect doses, may compromise the therapeutic efficacy and the health of cattle (4).

La ectoparasitósis es la responsable de las altas pérdidas económicas de la industria ganadera en regiones con climas tropicales y subtropicales (3). Sin embargo, existe una cantidad de principios activos que hacen parte de formulaciones de quimioterapia y que son utilizados para el control parasitario sin criterio epidemiológico y en dosis incorrectas, lo que puede comprometer su efecto terapéutico y la salud del ganado (4).

The animals are constantly exposed to many potentially toxic substances, such as pesticides, spoiled food, industrial waste, toxic plants, among others (5). Most of these chemical compounds induce lipid peroxidative processes mediated by the action of free radicals, resulting in damage to biomembranes, consequently promoting cellular and tissue dysfunction (6).

Los animales se exponen constantemente a muchas sustancias potencialmente tóxicas, tales como pesticidas, alimentos en mal estado, desechos industriales, plantas tóxicas, entre otros (5). La mayoría de estos compuestos químicos provocan procesos de peroxidación lipídica mediante la acción de radicales libres, produciendo daños a las biomembranas, y por consiguiente promoviendo la disfunción celular y de los tejidos (6).

In cases of poisoning is high the occurrence of hepato-renal syndromes. According to Varga and Puschner (7) and Belo et al (8), severe damage to liver by different etiologies can cause changes in renal function, aggravating the clinical condition

En casos de intoxicación, la aparición de síndromes hepatorrenales es alta. De acuerdo con Varga y Puschner (7) y Belo et al (8), daños severos al hígado por diferentes etiologías pueden causar cambios de

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of the animal. In this context, haematological and serum biochemical analysis provide important information in the diagnosis and prognosis of morbid conditions in animal populations (9). Another extremely important aspect is related to the safety of exogenous administration of pharmacological compounds. In addition to their therapeutic activity, these formulations should provide clinical safety to animals, considering that every substance is potentially harmful to the organism, the right dose differentiates the medicine from the toxicant (10). Considering the great importance of controlling ectoparasites in cattle, associated with lack of technical information on the safety of topical treatments with organophosphates, pyrethroids and piperonyl butoxide to the animal organism, this study aimed to evaluate the clinical safety of dichlorvos (45%)+ cypermethrin (5%) + piperonyl butoxide (25%) after topical administration by spray, through the study of evolution of the clinical and toxicological changes.

MATERIALS AND METHODS Animals. Sixteen crossbred animals with a mean age of 18 months, males and females, were divided into two treatments with eight animals each: T1 (treated with the dose recommended by parasite control at a dilution of 1:800) and T2 (treated with four times the recommended dose, dilution of 1:200). After treatment, both groups were kept in different pastures in Estância Modelo Farm, City of Descalvado, São Paulo State, Brazil, during the period of analysis. The experimental design is in accordance with the Guideline for Good Clinical Practice described by McGroth et al (11), and was approved by the UNICASTELO Institutional Ethics Committee with the process number 25172737/09. Experimental Design. The 16 bovines were sampled at six different times: before treatment (BT) to obtain the basal values (standard physiology), 24, 48, 72, 96 and 192 hours post treatment (HPT). This experimental model allows the evaluation of the toxicological and clinical evolution of animals after treatment. Antiparasitic treatment. The treatments were performed in covered paddock, being sprayed five liters of antiparasitic (Colpo 75®, Cypermethrin 5% + 45% Dichlorvos + 25% butoxide Piperolina - Uzinas Chimicas Brasileiras Company) per animal, in two treatments with eight animals each: T1 (dilution of 1:800) and T2 (dilution of 1: 200).

la función renal, agravando la condición clínica del animal. Respecto a esto, análisis hematológicos y bioquímicos del suero proporcionan información importante para el diagnóstico y pronóstico de condiciones mórbidas en poblaciones de animales (9). Otro aspecto sumamente importante se relaciona con la seguridad de la administración exógena de compuestos farmacológicos. Además de su actividad terapéutica, estas formulaciones deben proveer seguridad clínica a los animales, considerando que cada sustancia es potencialmente perjudicial para el organismo, la dosis correcta diferencia la medicina del tóxico (10). Teniendo en cuenta la gran importancia de controlar los ectoparásitos en el ganado, junto con la ausencia de información técnica sobre la seguridad de tratamientos tópicos con organofosforados, piretroides y butóxido de piperonilo en el organismo del animal, se realizó este estudio orientado a evaluar la seguridad clínica de diclorvos (45%) + cipermetrina (5%) + butóxido de piperonilo (25%) después de su administración tópica por aspersión, mediante la observación de la evolución de los cambios clínicos y toxicológicos.

MATERIALES Y MÉTODOS Animales. Dieciséis animales, entre machos y hembras, con una edad promedio de 18 meses, se dividieron en dos grupos con ocho animales en cada uno: T1 (tratado con la dosis recomendada para el control parasitario con una dilución de 1:800) y T2 (tratado con cuatro veces la dosis recomendada, dilución 1:200). Después del tratamiento, durante el período de análisis, ambos grupos se mantuvieron en pasturas diferentes en la finca “Estância Modelo”, en la ciudad de Descalvado, estado de Sao Paulo, Brasil. El diseño experimental está de acuerdo con la Guía de las Mejores Prácticas Clínicas descrita por McGrot et al (11) y aprobada por el Comité Ético Institucional UNICASTELO con número de proceso 2517-2737 / 09. Diseño experimental. Los 16 bovinos fueron sometidos a muestreo en seis momentos diferentes: antes del tratamiento (BT) para obtener los valores basales (fisiología estándar), 24, 48, 72, 96 y 192 horas después del tratamiento (HPT). Este modelo experimental permite la evaluación de la evolución clínica y toxicológica de los animales después del tratamiento. Tratamiento antiparasitario. Los tratamientos se llevaron a cabo en potreros cubiertos, rociando cinco litros de antiparasitario (Colpo 75®, 5% cipermetrina + 45% diclorvos + 25% butóxido de piperolino - Uzinas Chimicas Brasileiras Company) por animal, en dos tratamientos con ocho animales cada uno: T1 (dilución de 1:800) y T2 (dilución de 1:200).

Moraes - Dichlorvos, cypermethrin and piperonyl butoxide in cattle

Haematological study. Sampling of blood for clinical and haematological evaluation were performed by jugular vein puncture, and aliquoted two sets of syringes of 5 mL (40x16 needles), and the first “set” was used 50 µL of EDTA anticoagulant for collection of the plasma and the second without anticoagulant to obtain serum. For determination of erythrocyte was used automatic blood cell counter (Model CC510, Celm). The counting of leukocytes and platelets was performed manually in a Neubauer chamber. The percentage of packed cell volume was determined by micro-capillary hematocrit tubes, centrifuged 5 minutes 600 x g. At the time of blood collection, small samples were aimed at making blood extensions for differential leukocyte counts. After staining with MayGrünwald-Giemsa-Wright, was performed by counting 200 cells, establishing the percentage of each cell type (12). Serum biochemical. Blood samples without anticoagulant were centrifuged at 500 x g/10 minutes, the serum was separated for determining levels of aspartate aminotrasnferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), gamma glutamyl transferase (GGT), alkaline phosphatase (ALP), albumin , urea, creatinine, total and direct bilirubin, triglycerides and cholesterol, performed enzymatic and colorimetrically in a semiautomatic biochemical analyzer, model LabQuest. Clinical and behavioral evaluation. During the experimental period, the possible occurrences of clinical and behavioral changes in animals subjected to treatment with the antiparasitic compound were observed. Physiological parameters such as heart frequency, respiratory frequency, body temperature and capillary perfusion time were measured at the time of blood collection. Statistical analysis. The data was subjected to analysis of variance using completely randomized split plot design, the main treatments of the experimental groups (two treatments) and the subplot experimental periods (six periods), using the PROC MIXED procedure in the SAS program, version 8.2 (13). Multiple comparisons were assessed by the Tukey test at 95% confidence level according to Snedecor and Cochran (14).

RESULTS In serum-biochemical study of the cattle treated with antiparasitic association, no significant changes (p>0.05) in serum enzyme activity of ALT, AST, GGT and ALP were observed in bovines treated with a dilution of 1:800 (T1) when compared to animals subjected to a dilution of

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Examen hematológico. El muestreo de sangre para la evaluación clínica y hematológica se efectuó por punción de la vena yugular, y se dividió en alícuotas de dos grupos de jeringas de 5 mL (agujas 40x16). En el primer grupo se usó 50 µL de anticoagulante EDTA para recolectar el plasma y en el segundo no se usó anticoagulante para obtener el suero. Para determinar el eritrocito se usó el contador automático de células de sangre (Modelo CC510, Celm). El conteo de leucocitos y plaquetas se realizó manualmente en una cámara Neubauer. El porcentaje de volumen celular aglomerado se determinó por tubos microcapilares de hematocrito, centrifugados 5 minutos a 600 x g. En el momento de la recolección de sangre, se destinaron muestras pequeñas con el fin de hacer extensiones de sangre para el recuento diferencial de leucocitos. Después de la tinción con May-Grünwald-GiemsaWright, se realizó mediante el conteo de 200 células, estableciendo el porcentaje de cada tipo de célula (12). Serología. Las muestras de sangre sin anticoagulante se centrifugaron a 500 x g/10 minutos; el suero se separó por niveles determinados de aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), gama glutamil transferasa (GGT), fosfatasa alcalina (FA), albúmina, urea, creatinina, bilirrubina total y directa, triglicéridos y colesterol. Se llevó a cabo enzimática y colorimétricamente en un analizador bioquímico semi-automático, modelo LabQuest. Evaluación clínica y comportamental. Durante el período experimental, se observaron posibles eventos de cambios clínicos y de comportamiento en animales sometidos a tratamientos con compuestos antiparasitarios. En el momento de la colecta de la sangre se midieron parámetros fisiológicos tales como la frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, temperatura corporal y tiempo de perfusión capilar. Análisis estadístico. Los datos se sometieron a análisis de varianza utilizando un diseño completamente aleatorio en parcelas divididas; los principales tratamientos de los grupos experimentales (dos tratamientos) y los períodos experimentales de la subparcela (seis períodos), utilizando el procedimiento PROC MIXED en el programa SAS, versión 8.2 (13). Se evaluaron múltiples comparaciones mediante la prueba de Tukey, con un intervalo de confianza del 95% de acuerdo con Snedecor y Cochran (14).

RESULTADOS En el análisis bioquímico serológico del ganado, tratado con la mezcla antiparasitaria, no se observaron cambios significativos (p>0.05) en la actividad enzimática de ALT, AST, GGT y FA de bovinos tratados con una dilución de 1:800 (T1) en comparación con animales sometidos a una dilución de 1:200 (T2), así como en la comparación de los resultados clínicos de

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1:200 (T2), as well as the comparison of clinical outcome of animals in each treatment (Table 1). In the study of liver function, bovines treated with both doses presented no significant changes (p<0.05) in serum determination of triglycerides, cholesterol, albumin, total and direct bilirubin (Table 1). Likewise, there were no significant changes in serum levels of these biochemical parameters when comparing the controls values measured before treatment related to different times after treatment. Only total and direct bilirubin were significantly increased (p<0.05) 48 h after treatment in both concentrations (Table 1). Other relevant data shown in table 1 refers to normal values in blood urea and creatinine, in all analyzed periods. In erythrocyte study (Table 2), bovines treated with both dilutions showed no significant changes (p>0.05) in the number of erythrocytes, percentage of hematocrit, mean corpuscular volume (MCV), hemoglobin levels and mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), as well as the comparison of the clinical evolution of animals in each treatment. Similarly, platelet and leukocyte study (Table 2) presented no significant changes (p> 0.05) between the animals throughout the experimental period, including differential leukocyte count

los animales con cada tratamiento (Tabla 1). En el examen de la función hepática, los bovinos tratados con ambas dosis no presentaron cambios significativos (p<0.05) en la determinación del suero, de parámetros como triglicéridos, colesterol, albúmina, bilirrubina directa y total (Tabla 1). De igual forma, no hubo cambios considerables en los niveles de suero de estos parámetros bioquímicos cuando se compararon los valores de control, medidos antes del tratamiento con relación a los medidos en diferentes momentos después del tratamiento. Solamente hubo un incremento significativo (p<0.05) de la bilirrubina directa y total 48 horas después del tratamiento con ambas concentraciones (Tabla 1). Otros datos relevantes mostrados en la tabla 1 hacen referencia a valores normales de creatinina y urea en la sangre, en todos los períodos analizados. En el análisis de eritrocitos (Tabla 2), los bovinos tratados con ambas diluciones no mostraron cambios significativos (p>0.05) en el número de eritrocitos, porcentaje de hematocrito, volumen corpuscular medio (VCM), niveles de hemoglobina y concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM), así como en la comparación de la evolución clínica de animales con cada tratamiento. De manera similar, el análisis de leucocitos y plaquetas (Tabla 2) no presentó cambios considerables (p>0.05) entre los animales a través del período experimental, incluyendo el reconteo

Treatment

Table 1. Mean values1 (respective standard deviations) and ANOVA2 of biochemical parameters in cattle submitted to topical administration by spray with the association of dichlorvos 45% + cypermethrin 5% + piperonyl butoxide 25%. Period3 (HPT)

Dilution 1:800

BT 24 48 72 96 192

Dilution 1:200

BT 24 48 72 96 192

Biochemical parameters4 ALT

AST

ALP

GGT

26.7 ±10.7 Aa 27.7 ±13.9 Aa 29.0 ±10.9 Aa 27.0 ±8.7Aa 25.0 ±9.1Aa 26.2 ±7.7Aa 24.3 ±4.9Aa 23.5 ±6.4Aa 25.6 ±5.7Aa 26.4 ±5.2Aa 25.7 ±4.9Aa 23.7 ±7.4Aa

59.1 ±13.1Aa 68.2 ±22.2Aa 68.8 ±15.4Aa 61.8 ±9.0Aa 60.6 ±11.1Aa 53.7 ±6.7Aa 65.1 ±12.0Aa 74.1 ±12.1Aa 73.5 ±8.8Aa 72.8 ±10.5Aa 72.8 ±11.9Aa 66.2 ±16.8Aa

179.8 ±66.9 Aa 155.1 ±57.8Aa 180.0 ±53.1Aa 174.7 ±54.4Aa 197.7 ±45.5Aa 196.3 ±33.7Aa 194.2 ±77.6Aa 191.5 ±81.1Aa 180.0 ±87.0Aa 193.5 ±72.6Aa 208.0 ±64.5Aa 194.5 ±57.1Aa

19.1 ±3.3Aa 19.3 ±2.9Aa 17.4 ±3.6Aa 17.8 ±2.8Aa 18.4 ±1.9Aa 22.8 ±3.5Aa 16.5 ±3.1Aa 15.6 ±2.3Aa 14.7 ±1.6Aa 14.8 ±4.3Aa 16.2 ±3.2Aa 16.9 ±3.6Aa

Cholesterol Triglycerides Albumin 273.0 ±107.1Aa 278.7 ±105.7Aa 287.1 ±106.2Aa 262.5 ±78.1Aa 293.7 ±105.8Aa 376.0 ±131.1Aa 252.6 ±48.2Aa 269.6 ±64.4Aa 271.7 ±90.9Aa 284.3 ±62.8Aa 292.5 ±49.4Aa 355.4 ±90.9Aa

18.3 ±14.9Aa 20.1 ±6.6Aa 30.0 ±26.7Aa 49.7 ±30.3Aa 53.2 ±37.0Aa 30.7 ±13.7Aa 16.3 ±8.1Aa 44.1 ±33.0Aa 15.5 ±5.7Aa 29.7 ±19.9Aa 22.1 ±8.3Aa 18.1 ±6.8Aa

2.1 ±0.2Aa 2.1 ±0.3Aa 2.3 ±0.1Aa 2.1 ±0.1Aa 2.4 ±0.3Aa 2.6 ±0.4Aa 1.9 ±0.2Aa 2.0 ±0.3Aa 1.9 ±0.3Aa 2.3 ±0.6Aa 2.1 ±0.3Aa 2.5 ±0.5Aa

Total Direct Bilirrubin Bilirrubin 0.2 ±0.1Ac 0.2 ±0.1Ac 0.5 ±0.1Aa 0.2 ±0.1Ac 0.1 ±0.1Ac 0.3 ±0.1Ab 0.2 ±0.1Ab 0.2 ±0.1Ab 0.6 ±0.1Aa 0.2 ±0.1Ab 0.3 ±0.1Ab 0.3 ±0.9Ab

0.1 ±0.0Aa 0.1 ±0.0Aa 0.1 ±0.0Aa 0.1 ±0.0Aa 0.1 ±0.0Aa 0.1 ±0.1Aa 0.0 ±0.0Ab 0.1 ±0.0Aab 0.1 ±0.0Aab 0.1 ±0.0Aab 0.1 ±0.0Aab 0.1 ±0.0Aa

Urea

Creatinine

32.5 ±14.9Aa 17.1 ±5.7Aa 15.2 ±5.8Aa 15.3 ±6.4Aa 13.6 ±6.4Aa 13.8 ±8.1Aa 42.3 ±14.5Aa 23.3 ±9.4Aa 28.7 ±7.6Aa 27.4 ±11.6Aa 27.5 ±9.1Aa 18.4 ±9.2Aa

1.3 ±0.3Aa 1.2 ±0.3Aa 1.2 ±0.3Aa 1.2 ±0.3Aa 1.1 ±0.3Aa 1.2 ±0.2Aa 1.2 ±0.3Aa 1.3 ±0.2Aa 1.2 ±0.2Aa 1.1 ±0.3Aa 1.2 ±0.3Aa 1.1 ±0.2Aa

Reference 14 a 38 78 a 132 90 a 170 11 a 24 80 a 180 . 2.8 a 3.8 0.0 a 0.50 0.0 a 0.40 12 a 65 0.8 a 1.4 values 1 Means (n = 8) followed by the same letter do not differ by Tukey test (p<0.05). 2 The statistical analysis of variance is represented by uppercase letters that compare different treatments within each experimental day, lowercase letters compare the evolution of each treatment in different experimental days. 3 BT = Before treatment; HPT= hours post-treatment. 4 ALT = alanine aminotransferase; AST = aspartate aminotransferase; ALP = alkaline phosphatase; GGT = Gamma glutamyl transferase

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Moraes - Dichlorvos, cypermethrin and piperonyl butoxide in cattle

Table 2. Mean values1 (respective standard deviations) and ANOVA2 of haematological parameters in cattle

submitted to topical administration by spray with the association of dichlorvos 45% + cypermethrin 5% + piperonyl butoxide 25%. Period3

Treatment

(HPT) BT

Dilution 1:800

24 48 72 96 192 BT

Dilution 1:200

24 48 72 96 192

Reference values

Haematological parameters4 Erithrocytes (106/µL)

Hematocrit (%)

Hemoglobin (g/dL)

MCV (fL)

MCHC (g/dL)

Leukocytes (µL)

Platelets (µL)

7.2 ±1.1Aa 6.9 ±1.1Aa 7.1 ±1.4Aa 6.8 ±1.3Aa 6.9 ±1.2Aa 7.5 ±1.4Aa 6.9 ±0.9Aa 6.7 ±0.8Aa 6.4 ±0.8Aa 6.5 ±1.0Aa 6.5 ±1.2Aa 6.8 ±1.6Aa

33.8 ±5.6Aa 32.2 ±4.8Aa 33.5 ±6.0Aa 32.6 ±5.8Aa 33.7 ±6.1Aa 35.0 ±6.5Aa 32.4 ±4.4Aa 31.5 ±4.8Aa 30.6 ±3.2Aa 31.7 ±4.2Aa 31.5 ±5.4Aa 31.1 ±6.8Aa

9.5 ±1.4Aa 9.2 ±1.4Aa 9.4 ±1.8Aa 9.0 ±1.6Aa 9.2 ±1.7Aa 9.8 ±1.8Aa 9.3 ±0.9Aa 9.2 ±0.9Aa 9.1 ±0.8Aa 9.4 ±0.8Aa 8.9 ±1.5Aa 8.8 ±2.1Aa

46.9 ±1.7Aa 46.5 ±2.1Aa 47.4 ±1.9Aa 47.9 ±2.5Aa 48.9 ±1.2Aa 46.5 ±1.3Aa 46.7 ±3.7Aa 46.8 ±2.1Aa 47.8 ±1.8Aa 49.9 ±3.7Aa 48.1 ±1.9Aa 45.8 ±2.2Aa

28.3 ±4.2Aa 28.6 ±3.4Aa 28.1 ±4.2Aa 27.6 ±4.2Aa 27.6 ±4.4Aa 28.2 ±4.6Aa 28.7 ±3.5Aa 29.2 ±3.8Aa 29.6 ±2.3Aa 28.4 ±3.4Aa 28.2 ±4.2Aa 28.1 ±4.7Aa

14375.0 ±2213.4Aa 13862.5 ±2194.1Aa 13162.5 ±1966.8Aa 13100.0 ±2608.7Aa 14887.5 ±7128.5Aa 12762.5 ±2207.1Aa 12362.5 ±4219.3Aa 11350.0 ±2703.4Aa 10475.0 ±2638.0Aa 11087.5 ±2306.1Aa 11550.0 ±2894.8Aa 11350.0 ±1759.0Aa

5 a 10

24 a 48

8 a 14

40 a 60

26 a 34

4000 a 12000

304250.0 ±106762.4Aa 342000.0 ±119826.0Aa 481000.0 ±168607.7Aa 465250.0 ±167550.2Aa 482375.0 ±177344.6Aa 451875.0 ±188781.4Aa 431000.0 ±138559.9Aa 442250.0 ±166691.9Aa 471500.0 ±131028.8Aa 443500.0 ±120705.1Aa 432250.0 ±125226.4Aa 388625.0 ±119541.9Aa 200000 a 600000

Means (n = 8) followed by the same letter do not differ by Tukey test (p<0.05). The statistical analysis of variance is represented by uppercase letters that compare different treatments within each experimental day, lowercase letters compare the evolution of each treatment in different experimental days. 3 BT = Before treatment; HPT= hours post-treatment. 4 MCV = mean corpuscular volume; MCHC = mean corpuscular hemoglobin concentration. 1 2

Dilution 1:800

Treatment

Table 3. Mean values1 (respective standard deviations) and ANOVA2 of leukocyte counts in cattle submitted to topical administration by spray with the association of dichlorvos 45% + cypermethrin 5% + piperonyl butoxide 25%. Period3 (HPT)

Relative (%)

Absolute (µL)

Lymphocytes Relative (%)

Absolute (µL)

Monocytes Relative (%)

Absolute (µL)

Eosinophils Relative (%)

Absolute (µL)

Basophils Relative (%)

Absolute (µL)

24.2 ±11.9Aa

3578.6 ±2022.1Aa

69.0 ±9.1Aa

9879.0 ±1858.0Aa

3.3 ±1.3Aa

483.6 ±187.7Aa

2.7 ±3.1Aa

353.6 ±401.7Aa

0.6 ±0.7Aa

80.1 ±97.5Aa

26.3 ±7.3Aa

3579.6 ±907.1Aa

67.1 ±4.9Aa

9355.8 ±1889.7Aa

2.2 ±1.0Aa

314.2 ±166.9Aa

4.1 ±4.3Aa

596.1 ±642.4Aa

0.1 ±0.3Aa

16.6 ±47.0Aa

27.7 ±9.6Aa

3674.2 ±1440.8Aa

67.8 ±10.7Aa

8903.6 ±1674.9Aa

1.1 ±1.5Aa

160.6 ±220.7Aa

2.1 ±2.3Aa

271.2 ±307.9Aa

1.1 ±0.8Aa

152.7 ±113.8Aa

24.0 ±7.3Aa

3220.5 ±1356.9Aa

69.8 ±7.7Aa

9047.6 ±1493.8Aa

2.8 ±1.3Aa

375.2 ±208.4Aa

2.3 ±3.6Aa

337.3 ±557.1Aa

0.8 ±0.9Aa

119.2 ±135.8Aa

29.0 ±15.6Aa

5160.8 ±6054.1Aa

63.0 ±15.7Aa

8524.3 ±1598.8Aa

3.7 ±2.1Aa

390.6 ±268.4Aa

3.8 ±5.2Aa

522.3 ±723.8Aa

0.3 ±0.7Aa

41.1 ±82.1Aa

20.1± 10.1Aa

2719.1 ±1853.9Aa

72.5 ±10.8Aa

9099.1 ±1093.9Aa

3.8 ±2.2Aa

467.7 ±244.4Aa

2.5 ±4.0Aa

345.1 ±613.3Aa

1.0 ±0.7Aa

131.3 ±106.0Aa

34.7 ±16.1Aa

4459.3 ±2920.2Aa

57.3 ±15.4Aa

6966.5 ±2511.1Aa

3.0 ±2.2Aa

363.5 ±248.9Aa

3.6 ±4.7Aa

402.0 ±455.8Aa

1.2 ±1.1Aa

171.1 ±168.1Aa

40.7 ±16.2Aa

4663.1 ±2390.8Aa

53.0 ±14.6Aa

6022.5 ±2228.3Aa

2.4 ±1.6Aa

265.2 ±174.7Aa

3.6 ±3.5Aa

372.0 ±291.0Aa

0.2 ±0.4Aa

27.1 ±52.2Aa

36.5 ±10.4Aa

3785.5 ±1468.3Aa

58.1 ±9.6Aa

6136.4 ±1904.5Aa

1.8 ±1.2Aa

176.7 ±103.5Aa

2.8 ±3.5Aa

307.5 ±384.3Aa

0.6 ±0.7Aa

68.8 ±82.3Aa

35.0 ±9.4Aa

3904.7 ±1553.1Aa

59.8 ±10.4Aa

6612.6 ±1579.5Aa

2.2 ±0.8Aa

260.1 ±166.2Aa

2.2 ±2.3Aa

247.8 ±246.6Aa

0.6 ±0.9Aa

62.1 ±88.4Aa

37.7 ±6.4Aa

4382.3 ±1409.8Aa

55.7 ±4.3Aa

6430.8 ±1658.5Aa

3.3 ±1.5Aa

383.6 ±202.6Aa

2.6 ±1.8Aa

290.5 ±178.2Aa

0.5 ±0.5Aa

62.6 ±70.7Aa

32.5 ±10.4Aa

3750.5 ±1525.7Aa

60.0 ±10.1Aa

6783.6 ±1479.0Aa

3.7 ±3.0Aa

397.7 ±276.3Aa

3.0 ±2.6Aa

325.1 ±255.4Aa

0.7 ±0.8Aa

93.0 ±110.6Aa

192

Dilution 1:200

Neutrophils

192

4880

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(Supl) Diciembre 2015

(Table 3) that showed no significant changes (p>0.05) in the absolute and relative number of circulating neutrophils, lymphocytes, monocytes, eosinophils and basophils in cattle treated with both concentrations of 1:800 v/v and 1:200 v/v. The behavioral evaluation and clinical signs of the cattle treated (Table 4) showed no changes that could suggest the occurrence of toxic effects resulting from the use of this antiparasitic compound when sprayed at concentrations of 1:800 v/v and 1:200 v/v. However, it was found transitory and no significant increase (p>0.05) in body temperature, cardiac frequency and respiratory frequency 24 hours after treatment.

deferencial de leucocitos (Tabla 3), el cual no mostró cambios significativos (p>0.05) entre los valores absolutos y relativos de los neutrófilos circulantes, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos en el ganado tratado con ambas concentraciones de 1:800 v/v y 1:200 v/v. La evaluación de comportamiento y signos clínicos del ganado tratado (Tabla 4) no mostró cambios que pudieran sugerir la aparición de efectos tóxicos producidos por el uso de este compuesto antiparasitario, cuando se roció en concentraciones de 1:800 v/v y 1:200 v/v. Sin embargo, se encontró un aumento significativo y temporal (p>0.05) en la temperatura corporal, frecuencia cardiaca y frecuencia respiratoria, 24 horas después del tratamiento.

Table 4. Mean values1 (respective standard deviations) and ANOVA2 of clinical parameters in cattle submitted to topical administration by spray with the association of dichlorvos 45% + cypermethrin 5% + piperonyl butoxide 25%.

Dilution 1:200

Dilution 1:800

Treatment

Period3

Clinical parameters4

(HPT)

CFM

RFM

CPT

98.8±18.8Aa

33.2 ± 4.9Aa

38.8±0.3Aa

2.6±0.7Aa

109.5±26.6Aa

41.5±6.8Aa

39.7±0.2Aa

2.7±0.7Aa

112.0±30.8Aa

33.5±8.3Aa

39.2±0.3Aa

3.1±0.8Aa

95.0±27.7Aa

26.8±10.2Aa

38.9±0.4Aa

3.0±0.5Aa

89.0±18.6Aa

35.0±8.2Aa

38.4±0.5Aa

2.5±0.5Aa

192

91.5±17.0Aa

32.0±5.4Aa

37.6±0.6Aa

3.1±0.6Aa

93.8±15.3Aa

36.4±6.0Aa

38.9±0.6Aa

2.8±0.8Aa

97.7±19.2Aa

47.7±12.1Aa

39.5±0.5Aa

3.2±0.7Aa

98.5±20.7Aa

37.5±6.0Aa

39.4±0.6Aa

3.2±0.8Aa

93.0±22.6Aa

33.4±7.1Aa

39.1±0.6Aa

2.6±0.7Aa

90.0±24.2Aa

34.0±8.8Aa

38.7±0.8Aa

3.2±0.7Aa

192

92.0±18.8Aa

30.5±6.8Aa

37.8±0.7Aa

3.2±0.7Aa

Means (n = 8) followed by the same letter do not differ by Tukey test (p<0.05).

The statistical analysis of variance is represented by uppercase letters that compare different treatments within each experimental day, lowercase letters compare the evolution of each treatment the evolution of each treatment in different experimental days. 2

BT = Before treatment; HPT= hours post-treatment.

CFM = Cardiac frequency per minute; RFM= Respiratory frequency per minute; RT = Rectal temperature; CPT= Capillary perfusion time (seconds).

DISCUSSION

DISCUSIÓN

The results of serum-biochemical study demonstrated the clinical safety of this compound which did not cause significant changes in permeability of the cell membrane of hepatocytes, or even lysis these cells. Tests for serum enzyme activity of ALT, AST, LDH, ALP and GGT are indicative of hepatocellular injury and cholestatic changes, while the functional tests determine the concentration of substances synthesized in the liver or belonging to metabolic processes, such as albumin, urea, glucose, cholesterol, triglycerides, among other (15, 16).

Los resultados del examen serólogico demostraron la seguridad clínica de este compuesto, el cual no causó cambios significativos en la permeabilidad de la membrana celular de los hepatocitos, o incluso la lisis de estas células. Los ensayos para la actividad enzimática de ALT, AST, LDH, FA y GGT, son indicativos de lesión hepatocelular y cambios colestásicos, mientras que los ensayos funcionales determinaron la concentración de sustancias sintetizadas en el hígado o relacionados con los procesos metabólicos, tales como albúmina, urea, glucosa, colesterol, triglicéridos, entre otros (15, 16).

Bovines treated with both doses presented no significant changes in serum determination

Los bovinos tratados con ambas dosis no presentaron cambios significativos en la determinación sérica de triglicéridos, colesterol y albúmina. Estos resultados

Moraes - Dichlorvos, cypermethrin and piperonyl butoxide in cattle

of triglycerides, cholesterol and albumin. These results suggest the maintenance of liver functions. Changes in energy metabolism are generally present in acute liver failure (17). Moreover, the high concentration of glucocorticoids due to handling stress and treatment could promote energy metabolism by stimulating gluconeogenesis, increasing the bioavailability of free fatty acids resulting from the breakdown of triglycerides (15). Only total and direct bilirubin increased 48h after treatment in both concentrations. However, the current mean values of 0.57 and 0.62 mg/dL observed in animals treated with dilutions of 1: 800 and 1: 200, respectively, are close to the reference values for the species. According to Ohgi et al (18), serum total bilirubin up to 50 mg/dL is considered normal for cattle. Bilirubin is a byproduct of the breakdown of heme molecule present in red blood cells, and hyperbilirubinemia can be primarily resulting from the destruction of red blood cells or liver dysfunctions. The transitory increase in serum bilirubin levels observed 48 hours after treatment showed no positive correlation with haematological parameters that showed complete normal in relation to the number of circulating erythrocytes. Likewise, hyperbilirubinemia induces jaundice, and this clinical sign was not observed in the examination of the animals. On the other hand, normal values i n blood urea and creatinine was observed in all analyzed periods, indirectly demonstrating the clinical safety of the treatments on the process of excretion of these substances by the kidneys, as well as in protein catabolism in hepatic tissues, responsible for producing large part of the circulating urea (7). In cattle treated with both concentrations of 1:800 v/v and 1:200 v/v no significant changes were observed in erythrocyte, platelet and leukocyte studies, at the same time, the mean values o bserved were within of the normal range described for bovines according to Grunwaldt et al (19). Therefore, these results demonstrated the clinical safety of this antiparasitic formulation, even when applied at a concentration four times greater the dose recommended for parasite control. Other studies demonstrated the clinical safety and efficacy of antiparasitic treatment administered through skin route, White et al (20) demonstrated the persistent efficacy of spinosad administered by spray on the skin in natural infestations of chewing and sucking lice on cattle and Davey et al (21) observed the efficacy of a single wholy-body treatment of spinosad against ticks (Rhipicephalus Boophilus microplus) on cattle, in both studies were not reported the occurrence of side effects of drug therapy.

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sugieren el mantenimiento de funciones hepáticas. Los cambios en el metabolismo energético están generalmente presentes en la insuficiencia hepática aguda (17). Por otra parte, la alta concentración de glucocorticoides debido al estrés causado por la manipulación y el tratamiento, podrían promover el metabolismo energético por estimulación gluconeogénica, aumentando la biodisponibilidad de ácidos grasos libres resultantes de la descomposición de triglicéridos (15). Únicamente la bilirrubina directa y total aumentó 48 horas después del tratamiento con ambas concentraciones. Sin embargo, los valores promedio actuales de 0.57 y 0.62 mg/dL observados en animales tratados con diluciones de 1:800 y 1:200, respectivamente, están cercanos a los valores de referencia para las especies. De acuerdo con Ohgi et al (18), la bilirrubina total por encima de 50 mg/ dL se considera normal para el ganado bovino. La bilirrubina es un subproducto de la descomposición de la hemo molécula presente en los glóbulos rojos, y la hiperbilirrubinemia puede ser principalmente resultado de la destrucción de los glóbulos rojos o por disfunciones hepáticas. El aumento temporal de los niveles de bilirrubina en el suero, observado 48 horas después del tratamiento no mostró una correlación positiva con los parámetros hematológicos, los cuales presentaron completa normalidad respecto al número de eritrocitos circulantes. Asimismo, la hiperbilirrubinemia ocasiona ictericia, y no se observó este síntoma clínico en el examen de los animales. Por otra parte, se observaron valores normales de creatinina y urea en la sangre en todos los períodos analizados, demostrando indirectamente la seguridad clínica de los tratamientos en los procesos de eliminación de estas sustancias por los riñones, así como en el catabolismo de proteínas en los tejidos hepáticos, responsable de la producción de gran parte de urea circulante (7). No se observaron cambios significativos en los análisis de eritrocitos, plaquetas y leucocitos en el ganado tratado con ambas concentraciones, de 1:800 v/v y 1:200 v/v; al mismo tiempo, de acuerdo con Grunwaldt et al (19), los valores promedio observados estaban dentro del rango normal descrito para bovinos. Por consiguiente, estos resultados demostraron la seguridad clínica de esta formulación antiparasitaria incluso cuando se aplicó en una concentración cuatro veces mayor a la dosis recomendada para el control parasitario. Otros estudios demostraron la seguridad clínica y la efectividad del tratamiento antiparasitario administrado vía cutánea; White et al (20) demostraron la eficacia persistente del spinosad administrado por aspersión sobre la piel, en el caso de infestaciones naturales de piojos chupadores y masticadores en el ganado; Davey et al (21) observó la eficacia de un tratamiento con spinosad en una sola aplicación sobre todo el cuerpo del ganado, contra garrapatas (Rhipicephalus Boophilus microplus), y en

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Despite the lipophilic characteristic of many active principles, little is known about the absorption, systemic toxicity and side effects of drugs administered by spray on the skin to control ectoparasites (22). The treatment with this antiparasitic compound when sprayed on the skin at concentrations of 1:800 v/v and 1:200 v/v do not result in behavioral and clinical changes. However, it was found transitory increase in body temperature, cardiac frequency and respiratory frequency 24 hours after treatment. A hypothesis which explains these findings relates to the occurrence of stress, resulting from the containment and treatment. The organic response to stress conditions is complex, involving neuro-endocrine mechanisms with the release of cortisol and catecholamines (23) that act by increasing the metabolic activity and therefore heat production, as well as cardiac and respiratory function (24). Bovines treated with both dilutions did not present ataxia, salivation, jaundice, inappetence, among others, which could characterize intoxication throughout the experimental period, demonstrating the safety of the treatments, even when administered at a dilution of 1:200 v/v. Therefore, the results in the studies of clinical parameters, biochemical, haematological and behavioral evaluation demonstrated good safety margin for spray treatment on the skin with this antiparasitic compound (dichlorvos 45%+cypermethrin 5% + piperonyl butoxide 25%) in cattle. Conflict of interests The authors declare that there is no conflict of interests regarding the publication of this article.

ambos estudios no se reportó la aparición de efectos secundarios del tratamiento con medicamentos. A pesar de la característica lipofílica de muchos principios activos, poco se sabe sobre la absorción, toxicidad sistémica y efectos secundarios de medicamentos, administrados por aspersión sobre la piel, para el control ectoparasitario (22). El tratamiento con estos compuestos antiparasitarios cuando se rociaron sobre la piel en concentraciones de 1:800 v/v y 1:200 v/v no produjo cambios clínicos ni comportamentales. Sin embargo, se encontró un incremento temporal de la temperatura del cuerpo, frecuencia cardiaca y respiratoria, 24 horas después del tratamiento. Este resultado se explicaría mediante la hipótesis que lo relaciona con la aparición de estrés, resultante del confinamiento y del tratamiento. La respuesta orgánica a las condiciones de estrés es compleja, ya que involucra mecanismos neuro-endocrinos con la liberación de cortisol y catecolaminas (23), las cuales actúan aumentando la actividad metabólica y por tanto la producción de calor, así como las funciones respiratoria y cardiaca (24). Los bovinos tratados con ambas diluciones no presentaron ataxia, salivación, ictericia o inapetencia, entre otros, lo que caracterizaría su intoxicación a través del periodo experimental, demostrando la seguridad de los tratamientos, incluso cuando se administraron en una dilución de 1:200 v/v. Por consiguiente, los resultados de los análisis de parámetros clínicos, bioquímicos, hematológicos y evaluación de comportamiento demostraron un buen margen de seguridad para tratamientos por aspersión sobre la piel del ganado, con compuestos antiparasitarios (diclorvos 45%+cypermetrina 5%+butóxido de piperonilo 25%). Conflicto de intereses Los autores declaran que no hay ningún conflicto de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):4884-4894, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Efficacy of essence oil supplementation to feeds on volatile fatty acid production La eficacia de los suplementos de aceite de esencia en la de producción de ácidos grasos volátiles es a los feeds Ahmet Tekeli,1* Ph.D, Gültekin Yıldız,2 Ph.D, Winfried Drochner,3 Ph.D, Herbert Steingass,3 Ph.D. Yuzuncu Yıl University, Faculty of Agriculture, Department of Animal Science, 65080, Van/Turkey. Ankara University, Faculty of Veterinary, Department of Animal Nutrition and Nutritional Diseases, 06110 Ankara/Turkey. 3Hohenheim University, Department of Animal Nutrition, 70599 Stuttgart/ Germany. Corresponding: atekeli@yyu.edu.tr 1 2

Received: October 2014; Acepted: March 2015.

ABSTRACT Objective. Determine the effect of some plant extract supplementation to Total Mixed Ration (TMR), concentrate and hay on volatile fatty acid (VFA) production at 8 and 24 hours (h) using in vitro gas production technique in cattle. Material and methods. Three fistulated Holstein dairy cows were used for rumen fluid collection for application of in vitro gas production technique. Four essence oils (T. vulgaris, O. vulgare, S. aromaticum, Z. officinale) were used as plant extracts. Results. Essence oil supplementations to the examined feed groups had significant effect only on C2/C3 VFA level at 8 h in all feed groups (p<0.05). C2/C3 VFA level at 8 h significantly increased in the groups with Oregano 25 ppm supplementation for TMR and concentrate and in the groups with Thymol 25 ppm supplementation for hay. C3 VFA level at 8 h significantly increased in the group that received Syzygium 200 ppm supplementation for hay. Different plant extracts supplemented to TMR, concentrate and hay significantly affected C2, C3, IC4, IC5, C5 and C2/C3 VFA levels at 24 h (p<0.05). Conclusions. The findings of the study indicate that moderate doses of plant extracts result in increased VFA levels in ruminants while higher doses demonstrate the opposite effect. Key words: Aromatic plants, in vitro, plant extract, ruminant nutrition, volatile fatty acid (Source: USDA).

RESUMEN Objetive. Determinar el efecto de los suplementos de algunos extractos de plantas a Ración Total Mezclada (TMR), concentrado y heno sobre los ácidos grasos volátiles (AGV) a las 8 y 24 horas (h) utilizando la técnica de producción de gas in vitro en el ganado bovino. Material y métodos. Tres vacas lecheras Holstein fistuladas se utilizaron para la recogida de fluido ruminal y aplicar la técnica in vitro de producción de gas. Cuatro aceites esenciales (T. vulgaris, O. vulgare, S. aromaticum, Z. officinale) fueron utilizadas como extractos de plantas. Resultados. La suplementación de aceite esenciales a los grupos de alimentos estudiados tuvieron efecto significativo sólo en C2 / nivel C3 VFA a las 8 h en todos los grupos de alimentos (p<0.05). El C2 / nivel C3 VFA a las 8 h aumentó significativamente en los grupos con suplementación de orégano 25 ppm de la RTM y concentrado y en los grupos con suplementación de Timol a 25 ppm para el heno. El C3 nivel de VFA en 8 h aumentó significativamente 4884

Tekeli - Efficacy of essence oil supplementation

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en el grupo que recibió suplementación de Syzygium a razón de 200 ppm para el heno. Los diferentes extractos de plantas suplementadas con RTM, concentrado y heno afectó significativamente los niveles de C2, C3, IC4, IC5, C5 y C2/C3 VFA a las 24 h (p<0.05). Conclusiones. Los hallasgos del estudio indican que las dosis moderadas de extractos de plantas incrementan los niveles de AGV en rumiantes, mientras que dosis más altas producen el efecto contrario. Palabras clave: Ácidos grasos volátiles, in vitro, extracto de la planta, nutrición de rumiantes, plantas aromáticas (Fuente: USDA).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Energy and protein losses in rumen fermentation reduce the efficiency of nutrient utilization and cause environmental pollution. Ionophore antibiotics have been successfully used in rumens for many years to reduce energy and protein losses (1). While ionophore antibiotics have been widely used in conventional production systems for the control of rumen fermentation, the European Commission (EC) decided to phase out, and ultimately ban the use of antibiotics (January 1st 2006) (2). After the ban on antibiotic growth promoters, studies have increased on exploring alternatives to antibiotics. One of these possible alternatives are the plant extracts, which are also called as essence oils. Essence oils are plant secondary metabolites responsible for odour and colour of plants (3).

Las pérdidas de proteína y energía en la fermentación ruménica reducen el eficaz aprovechamiento de nutrientes y causan contaminación ambiental. Los antibióticos ionóforos se han utilizado en el rumen por muchos años para reducir estas pérdidas (1). Mientras que los antibióticos ionóferos se han utilizado ampliamente en los sistemas de producción convencional para el control de la fermentación ruménica, la Comisión Europea (CE) decidió eliminar gradualmente y en última instancia prohibir el uso de estos antibióticos (Enero 1° 2006) (2). Después de la prohibición de los antibióticos promotores de crecimiento, han aumentado los estudios para buscar alternativas a éstos. Una de estas alternativas son los extractos vegetales, llamados también aceites esenciales. Estos aceites son metabolitos vegetales secundarios responsables del color y olor de las plantas (3).

The concentrations of essence oil within plants vary according to stage of growth, stress, plant health and environmental factors such as light, temperature and moisture etc. (4). Essence oils are found throughout the plants, including roots, the bark, flowers, petals, leaves, fruit bodies and stems. Essence oils are the volatile components responsible for the characteristic aroma of spices. As active components in many spices and preservatives, essence oils have historically been used to inhibit bacterial growth (5). All essence oils have aromatic properties. They have also shown biological activities, such as antioxidative (6), antifungal (7) and antimicrobial activities (8), Furthermore they have been found to have psychological and physical effects, which is why they have found their application in aromatherapy. One of the alternative to antibiotic feed supplements are plant extracts. In this study, Oreganum vulgare, Thymus vulgaris, Zingiber officinale, Syszygium aromaticum essence oils were supplemented to TMR, concentrate and hay to explore their effects on the levels of volatile fatty acid (VFA) concentrations at 8 and 24 h in in vitro conditions.

La concentración de los aceites esenciales en las plantas varía de acuerdo con la etapa de crecimiento, estrés, salud de la planta y factores ambientales tales como la luz, temperatura, y humedad, etc. (4). Los aceites se encuentran en toda la planta, incluyendo raíces, corteza, flores, pétalos, hojas, frutos y tallos; y son los componentes volátiles responsables del aroma característico de las especias. Históricamente estos aceites se han utilizado para inhibir el crecimiento bacterial, como componentes activos de muchas especias y conservantes (5). Todos los aceites esenciales tienen propiedades aromáticas. Presentan también actividades biológicas, como antioxidantes (6), antifúngicos (7) y antimicrobianos. Así mismo, se observó que tienen efectos físicos y sicológicos, por lo cual han encontrado aplicación en aromaterapia. Una de las alternativas a los suplementos del forraje basados en antibióticos, son los extractos vegetales. En este estudio, se agregaron aceites esenciales de Oreganum vulgare, Thymus vulgaris, Zingiber officinale, Syszygium aromaticum a la RMT, concentrado y heno para explorar sus efectos sobre las concentraciones de los niveles de ácidos grasos volátiles (AGV) a las 8 y 24 horas en condiciones in vitro.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(Supl) Diciembre 2015

MATERIAL AND METHODS

MATERIALES Y MÉTODOS

Animals and feeds. Three fistulated Holstain dairy cows were used for rumen fluid collection for application of in vitro gas production technique. For each feed (TMR, Concentrate and Hay), ruminal fluid samples were collected twice daily on different days. Four essence oils (T. vulgaris, O. vulgare, S. aromaticum, Z. officinale) were used as plant extracts. T. vulgaris, S. aromaticum, and Z. officinale essence oils were obtained from Manisa Province (Turkey) and O. vulgare essence oil from Mersin Province (Turkey). All plant extracts were extracted with distilated water. For each extract, different doses were tested to determine harmful and usable doses. Incubation was run for each regulation in 8 and 24 h time periods. Total mixed ration (TMR), concentrate and hay were used as substrates. In the first phase of the experiment, gasification quantity was measured. This step was iterated for the effects of each plant extract and each dose on substrates (TMR, concentrate, hay). After gasification measurements, harmful extract doses and critical time periods were identified. In the second phase of the experiment, VFA levels were measured.

Animales y forrajes. Para la recolección del fluido ruménico y la aplicación de la técnica de producción de gas in vitro, se utilizaron tres vacas lecheras Holstein fistuladas. Para cada forraje (RMT, concentrado y heno) se colectaron las muestras de fluido ruminal dos veces por día en diferentes días. Se utilizaron como extractos vegetales cuatro aceites esenciales (T. vulgaris, O. vulgare, S. aromaticum, Z. officinale). Los aceites esenciales de T. vulgaris, S. aromaticum, y Z. officinale se obtuvieron de la Provincia Manisa (Turquía) y el aceite esencial de O. vulgare de la Provincia Mersin (Turquía). Todos los extractos vegetales se extrajeron con agua destilada. Para cada extracto, se ensayaron diferentes dosis para determinar las útiles y las perjudiciales. La incubación se ejecutó para cada regulación en períodos de tiempo de 8 y 24 horas. Se utilizaron como sustratos la ración mixta total (RMT), concentrado y heno. En la primera fase del experimento, se midió la cantidad gasificada. Esta etapa se repitió para conocer los efectos de cada extracto vegetal y cada dosis sobre los sustratos (RMT, concentrado, heno). Después de medir la gasificación, se identificaron las dosis perjudiciales del extracto y los períodos críticos de tiempo. En la segunda fase del experimento se midieron los niveles de AGV.

The group with only rumen liquor was assigned as the negative control group and the group with rumen fluid and feed samples was assigned as the positive control group. The groups with rumen fluid, feed samples and thymol, oregano, zingiber and syzygium essence oils were the treatment groups. The compositions of TMR, concentrate and hay used in the experiment are presented respectively in table 1. The effects of Syzygim aromaticum, Zingiber officinale, Thymus vulgaris, Oreganum vulagare supplementation to TMR, concentrate and hay on VFA production were assessed in the present experiment by incubation of in buffered rumen fluid using an in vitro gas production technique (HFT). Sample preparation for VFA. Subsequent to the preparation of samples on experiment day, 1:11 with an internal Standard (4-Methylvalerianic Table 1. Composition of TMR, Concentrate and Alfalfa hay. Dry matter

Crude protein

MJNEL/kg DM

TMR*

43.00

15.25

6.9

Concentrate **

98.50

20.30

8.7

Alfalfa Hay

95.31

14.46

8.0

*TMR composition: Maize silage 28.9%, Grass silage 31.2%, Hay 4.8%, Haylage 2.3%, Molassed sugar beet pulp 1.3%, Josera-betavit 0.09%, Salt 0.09%, Monosodium phosphate 0.09%, Ca-carbonate 0.35%, Bergophor GM13 0.45%, Bergophor LM07 0.45%, MgO 0.02%, Concentrate-TMR-silage-2, 17.4%, Soybean meals 0.7%, chelates 0.3%, Water 12.1%, Yeast mixture 100g. Mineral g/kg DM: Ca 7.62, P 4.53, Mg 2.52, Na 2.82, K 16.04, Zn 62, Mn 58 and Se 0.1. **Concentrate composition: Maize 20%, sunflower 7.5%, pea 8%, barley 16%, soyabean meal 15%, wheat 30.5%, crib bean 3%.

Se asignó el grupo con líquido ruminal al grupo de control negativo y el grupo con fluido ruminal y muestras de forraje al grupo de control positivo. Los grupos de tratamiento fueron los que contenían fluido ruminal, muestras de forraje y timol, orégano, aceites esenciales de zingiber y syzygium. Las composiciones de RMT, concentrado y heno utilizadas en el experimento se presentaron respectivamente en la tabla 1. En este experimento se evaluaron los efectos de la suplementación de Syzygim aromaticum, Zingiber officinale, Thymus vulgaris, Oreganum vulagarea a la RMT, concentrado y heno sobre la producción de AGV por incubación de fluido ruminal buffer (tampón), utilizando la técnica de producción de gas in vitro (HFT). Preparación de muestras para AGV. Con el fin de medir los ácidos acético, propiónico, i-butírico y n-butírico, así como los ácidos i-valeriánico y n-valeriánico, en un día de experimento, posterior a la preparación de muestras, se preparó en una hora, 1:11 con un Estándar interno (ácido 4-Metilvaleriánico y ácido fórmico 1:101). Las muestras se congelaron a -20°C. Antes de la determinación de los ácidos grasos, estas muestras se descongelaron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 400g por 10 minutos y después se tomaron las partes claras para realizar las mediciones.

Tekeli - Efficacy of essence oil supplementation

acid and formic acid 1:101) was prepared in an hour for measurement of acetic, propionic, i-butiric and n-butiric acid as well as i-valerianic and n-valerianic acid. The samples were frozen at -20°C. Before determination of the fatty acids, the samples were thawed at room temperature and centrifuged in 400 g for ten minutes and afterwards, bright parts were taken for measurements. Analysis. Concentrations of VFAs were analysed in pooled samples of each replicate, using a gas chromatograph (GC 14B, Shimadzu, Japan) equipped with a flame ionisation detector, and samples were treated with an Internal Standard (4-Methylvalerianic acid and formic acid 1:101) according to Geissler et al (9). A total of 6 parallel analyses were performed for each sample. Statistical analysis. The descriptive statistics for the examined parameters were expressed in terms of average and standard errors. Factorial Analysis of Variance (Factorial ANOVA) was conducted to determine any differences between the means of supplements and feed types with respect to the examined parameters. Additionally, Repeated Measures ANOVA was performed to determine any differences with respect to feeds and durations (hours). Following analyses of variance, Tukey test was conducted to determine varying means (10). Statistical significance level was set at 5% and calculations were performed by SPSS (11) statistical software package.

RESULTS The descriptive statistics of some VFAs at 8 and 24 h according to supplement and feed groups and their comparative results according to supplement groups are given in tables 2 and 3. As seen in table 2, compared to negative control groups, essence oil supplementations had significant effect on C2, C3, IC4, C4 IC5, C5 and C2/C3 VFA level at 8 h (p<0.05). For TMR, Concentrate and hay group, C2, C3, and C4 VFA levels increased at 8 h in the treatment groups with essence oil supplementations compared to negative control group (p<0.05). On the contrary, for TMR, C4 VFA level decreased in the group with Syzygium 200 supplementation with respect to positive control group (p<0.05). For concentrate group, C4 VFA level decreased at 8 h in the group with Syzygium 200 supplementation compared to positive control groups (p<0.05). For hay group, C4 VFA level increased at 8 h in the other treatment groups with respect to negative control group (p<0.05).

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Análisis. Se analizaron las concentraciones de AGV en muestras combinadas de cada réplica, utilizando cromatógrafo de gases (GC 14B, Shimadzu, Japón) equipado con un detector de ionización de llama y las muestras se trataron con un Estándar interno (ácido 4-Metilvaleriánico y ácido fórmico 1:101) de acuerdo con Geissler et al (9). Se llevaron a cabo un total de 6 análisis paralelos para cada muestra. Análisis Estadístico. Las estadísticas descriptivas para los parámetros examinados se expresaron en términos de errores estándar y promedio. Se realizó el Análisis Factorial de Varianza (ANOVA Factorial) para determinar algunas diferencias entre el promedio de suplementos y los tipos de forraje, con respecto a los parámetros examinados. Adicionalmente, se llevó a cabo el ANOVA de Medidas Repetidas para determinar algunas diferencias con respecto a los forrajes y duraciones (horas). Tras el análisis de varianza, se efectuó el ensayo Tukey para determinar los medios de varianza (10), Se estableció un nivel estadísticamente significante en 5% y los cálculos se realizaron mediante el paquete de programas estadísticos SPSS (11).

RESULTADOS En las tablas 2 y 3 se presentan las estadísticas descriptivas de algunos AGV a 8 y 24 horas, de acuerdo con el grupo de forraje y suplemento y sus resultados comparativos según los grupos de suplemento. Como se ve en la tabla 2, las suplementaciones con aceite esencial tuvieron un efecto significativo sobre los niveles AGV C2, C3, IC4, C4 IC5, C5 y C2/C3 a las 8 horas (p<0.05) comparado con los grupos de control negativo. Para el grupo RMT, concentrado y ceno, se incrementaron los niveles AGV C2, C3 y C4 a las 8 horas en los grupos de tratamiento con suplementaciones de aceite esencial comparado con el grupo de control negativo (p<0.05). Por el contrario, para RMT, el nivel AGV C4 disminuyó en el grupo con suplementación de syzygium 200 con respecto al grupo de control positivo (p<0.05). Para el grupo concentrado, el nivel AGV C4 disminuyó a las 8 horas en el grupo con suplementación de syzygium 200 comparado con los grupos de control positivo (p<0.05). Para el grupo heno, el nivel AGV C4 aumentó a las 8 horas en los otros grupos de tratamiento con respecto al grupo de control negativo (p<0.05). La tabla 3 indica que las suplementaciones con aceite esencial tuvieron un efecto significativo sobre los niveles AGV C2, C3, IC4, IC5, C5 y C2/ C3 a las 24 horas (p<0.05). La concentración de ácido graso volátil C3 aumentó significativamente en los grupos RMT y heno con suplementaciones

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(Supl) Diciembre 2015

Table 2. Descriptive statistics of some VFAs at 8 h according to supplement and feed groups and their comparative results according to supplement groups. Volatile Fatty Acids, mmol/l Feed

TMR

Concentrate

Supplements

C3 IC4 (Propionic A) (Isobutyric A)

X ± Sx

C4 (Butyric A)

IC5 (Isovaleric A)

C5 (Valeric A)

C2/C3

Negative control

39.30±0.47c

8.77±0.05c

0.91±0.01abc

9.56±0.15d

1.47±0.02a

0.82±0.01b

4.48±0.02c

Positive control

51.47±0.45a

12.96±0.11a

0.95±0.01abc

12.59±0.01ab

1.44±0.00a

1.05±0.00ab

3.97±0.00d

Thymol 12.5

50.63±1.07a

12.64±0.22ab

1.04±0.03a

12.77±0.15ab

1.84±0.07a

1.13±0.03a

4.01±0.01d

Thymol 25

45.14±2.33b

9.51±0.42c

0.75±0.04c

11.71±0.50bc

1.48±0.11a

0.94±0.04ab

4.75±0.02b

Oregano 12.5

50.66±1.24a

12.50±0.03ab

1.01±0.03ab

12.86±0.21ab

1.72±0.17a

1.10±0.04a

4.05±0.08d

Oregano 25

50.81±0.70a

10.35±0.15bc

0.82±0.01bc

12.78±0.03ab

1.70±0.01a

1.02±0.01ab

4.91±0.00a

Zingiber 200

53.60±0.45a

13.74±0.01a

0.98±0.01ab

13.42±0.06a

1.50±0.01a

1.13±0.00a

3.90±0.03d

Syzygium 200

45.19±0.40b

14.70±0.48a

0.76±0.02c

10.84±0.30c

1.49±0.06a

1.05±0.09ab

3.08±0.10e

Negative control

39.30±0.47d

8.77±0.05b

0.91±0.01ab

9.56±0.15d

1.47±0.02abc

0.82±0.01c

4.48±0.02bc

Positive control

55.74±2.33ab

12.83±0.55a

0.87±0.02abc

13.39±0.51ab

1.16±0.01c

1.09±0.04abc

4.35±0.00bc

Thymol 12.5

56.59±0.81ab

13.32±0.01a

0.88±0.01abc

13.67±0.28ab

1.33±0.01bc

1.11±0.01ab

4.24±0.02bc

Thymol 25

56.83±6.05ab

12.75±4.42a

0.94±0.30a

13.35±0.93ab

1.84±0.60a

1.26±0.46a

4.66±0.81b

Oregano 12.5

58.12±1.21a

14.61±1.57a

1.02±0.15a

13.86±0.28a

1.78±0.57ab

1.31±0.23a

4.00±0.25bc

Oregano 25

52.48±3.61bc

9.65±0.64b

0.72±0.04bc

12.62±1.70b

1.39±0.11abc

0.91±0.07bc

5.44±0.01a

Zingiber 200

58.88±0.43a

13.86±0.10a

0.91±0.01ab

14.46±0.06a

1.21±0.00c

1.19±0.01a

4.25±0.00bc

Syzygium 200

48.95±3.26c

13.52±0.95a

0.69±0.04c

10.10±0.77c

1.33±0.08bc

0.88±0.06bc

3.62±0.01c

Negative control

36.85±0.26c

8.84±0.39c

0.88±0.01ab

8.62±0.05b

1.39±0.01abc

0.79±0.01a

4.17±0.11bc

Positive control

45.60±0.60ab

11.16±0.20bc

0.85±0.01ab

10.02±0.11a

1.26±0.00c

0.89±0.01a

4.09±0.01bc

47.26±0.00a

11.78±0.00ab

0.99±0.00a

10.60±0.00a

1.74±0.00ab

0.97±0.00a

4.01±0.00c

Thymol 25

43.15±2.05ab

9.36±0.41bc

0.78±0.04b

9.93±0.14a

1.44±0.14abc

0.89±0.04a

4.61±0.01a

Oregano 12.5

46.12±0.00ab

11.56±0.00b

1.00±0.00a

10.40±0.09a

1.81±0.02a

0.99±0.01a

3.99±0.00c

Oregano 25

42.93±5.39ab

9.91±1.92bc

0.89±0.25ab

9.84±0.83a

1.65±0.58ab

0.98±0.28a

4.36±0.21b

Zingiber 200

45.94±0.03ab

11.66±0.04ab

0.86±0.00ab

10.39±0.01a

1.29±0.01bc

0.95±0.01a

3.94±0.01c

42.24±0.37b

14.01±0.12a

0.78±0.01b

10.04±0.21a

1.52±0.05abc

0.98±0.03a

3.02±0.00d

Thymol 12.5 Hay

C2 (Acetic A)

Syzygium 200

*: Supplement averages (within each feed group) with different letters denote statistically significant differences (p<0.05).

Table 3. Descriptive statistics of some VFAs at 24 h according to supplement and feed groups and their comparative results according to supplement groups. Volatile Fatty Acids, mmol/l Feed

TMR

Supplements

C4 (Butyric A)

IC5 (Isovaleric A)

C5 (Valeric A)

C2/C3

48.61±0.42e

11.23±0.08d

1.55±0.00a

12.89±0.11c

3.07±0.01a

1.42±0.01de

4.33±0.00c

Positive control

71.15±1.23a

17.03±0.36bc

1.69±0.01a

18.27±0.04ab

3.07±0.03a

1.81±0.01ab

4.18±0.01d

Thymol 12.5

71.32±2.60a

17.27±0.76b

1.72±0.05a

18.53±0.64ab

3.13±0.09a

1.84±0.07ab

4.13±0.02d

Thymol 25

57.09±5.55cd

9.93±0.91e

0.81±0.09c

19.13±0.18a

1.86±030b

1.19±0.04f

5.75±0.02a

Oregano 12.5

67.24±0.31ab

16.03±0.11c

1.59±0.01a

18.21±0.04ab

3.15±0.02a

1.66±0.02bc

4.20±0.03d

Oregano 25

62.16±1.06bc

11.28±0.27d

1.27±0.06b

17.91±0.32ab

3.00±0.08a

1.34±0.05ef

5.51±0.03b

Zingiber 200

70.06±0.90a

19.43±0.10a

1.65±0.03a

19.06±0.11a

3.02±0.03a

1.95±0.01a

3.61±0.05e

52.85±0.45de

20.33±0.82a

0.81±0.05c

16.03±0.08b

1.78±0.13b

1.60±0.07cd

2.61±0.06f

Negative control

45.08±0.16c

10.54±0.04d

1.42±0.00a

11.78±0.04c

2.66±0.00a

1.26±0.00b

4.28±0.00b

Positive control

69.99±0.28a

16.18±0.04b

1.54±0.01a

17.89±0.08ab

2.53±0.01a

1.77±0.00a

4.33±0.00b

Thymol 12.5

67.12±1.30a

16.21±0.12b

1.43±0.08a

17.18±0.28ab

2.59±0.05a

1.67±0.11a

4.14±0.08b

Thymol 25

57.83±2.54b

9.89±0.54d

0.90±0.06b

18.64±0.20a

1.96±0.21bc

1.33±0.05b

5.85±0.04a

Oregano 12.5

67.92±1.19a

16.18±0.19b

1.46±0.06a

17.29±0.62ab

2.59±0.03a

1.69±0.10a

4.20±0.09b

Oregano 25

57.64±8.67b

10.21±1.90d

1.08±0.41b

15.39±4.33b

2.19±1.05ab

1.21±0.40b

5.67±0.15a

Zingiber 200

67.85±1.16a

18.47±0.14a

1.48±0.04a

17.99±0.44a

2.50±0.06a

1.85±0.05a

3.67±0.02c

Syzygium 200

50.26±0.21c

14.94±0.06c

0.77±0.03c

11.18±0.04c

1.55±0.03c

0.96±0.00c

3.37±0.00d

Negative control

44.96±2.37c

10.87±0.17d

1.51±0.05a

11.39±1.24bcd

2.96±0.15a

1.33±0.04b

4.14±0.09c

Positive control

64.14±2.46a

16.85±0.28b

1.57±0.01a

14.82±1.61a

2.90±0.04a

1.61±0.02a

3.81±0.10c

58.89±1.80ab

14.92±0.45c

1.40±0.07ab

13.42±0.86ab

2.67±0.13a

1.37±0.10b

3.95±0.08c

Thymol 25

45.46±6.84c

9.02±0.84e

0.75±0.10c

10.62±1.75cd

1.54±0.35b

0.91±0.13d

5.02±0.17a

Oregano 12.5

55.01±1.16b

14.28±0.14c

1.31±0.00b

12.12±0.23bcd

2.52±0.00a

1.27±0.03bc

3.85±0.03c

Oregano 25

44.30±0.41c

9.54±0.08e

0.76±0.05c

9.96±0.03b

1.40±0.00b

0.95±0.01d

4.65±0.00b

Zingiber 200

56.97±0.35b

18.29±0.42a

1.48±0.01ab

12.73±0.07abc

2.69±0.01a

1.59±0.01a

3.12±0.04d

Syzygium 200

43.32±0.33c

18.80±0.43a

0.74±0.02c

9.65±0.06b

1.54±0.01b

1.11±0.02cd

2.31±0.03e

Thymol 12.5 Hay

C3 IC4 (Propionic A) (Isobutyric A)

Negative control

Syzygium 200

Concentrate

C2 (Acetic A)

X ± Sx

*: Supplement averages (within each feed group) with different letters denote statistically significant differences (p<0.05).

Tekeli - Efficacy of essence oil supplementation

Ta b l e 3 i n d i c a t e s t h a t e s s e n c e o i l supplementations had significant effect on C2, C3, IC4, IC5, C5 and C2/C3 VFA levels at 24 h (p<0.05). C3 volatile fatty acid concentration significantly increased in TMR and hay groups with 200 ppm of Zingiber and Syzygium supplementations (p<0.05). 200 ppm of Syzygium supplementation significantly decreased propionic acid concentration for concentrate (p<0.05). In all feed groups, IC4 VFA levels significantly decreased with Thymol 25, Oregano 25 and Syzygium 200 essence oil supplementations compared to positive and negative control groups (p<0.05). IC5 VFA levels also significantly decreased in all feed groups with Thymol 25 and Syzygium 200 essence oil supplementations compared to positive and negative control groups (p<0.05). C5 VFA level significantly decreased in TMR group supplemented with Thymol 25, in concentrate group supplemented with Syzygium 200 and in hay groups supplemented with Thymol 25, Oregano 25 and Syzygium 200 essence oils (p<0.05). C2/C3 VFA level at 24 h significantly increased with 25 ppm dose of Thymol and Oregano extracts and significantly decreased with 200 ppm dose of Zingiber and Syzygium for all feed groups (TMR, concentrate and hay).

DISCUSSION Effects of essence oils on VFA. As a result of the microbial activity in the rumen of ruminants, carbohydrates such as cellulose are broken down and converted to VFAs, carbon dioxide, methane, ammonia and microbial cells (12). VFAs are the main energy source of ruminants. About 70% of the metabolizable energy in ruminants is generated by the VFAs produced in the rumen (13). If reduction of VFA concentrations in rumen at in vitro conditions occurs also at in vivo conditions, this situation may adversely affect nutrition efficiency (14). In this study, the effects of thymol, oregano, zingiber and syzygium supplementations to TMR, concentrate and hay at 8 and 24 h were examined in in vitro conditions. As seen in table 2, compared to positive and negative control groups, essence oil supplementations did not have any statistically significant effect at 8 h on isobutyric acid, isovaleric acid and valaric acid concentrations in the examined feed groups. Beauchemin and McGinn (15) reported no effects of 750 mg/d essence oil on total VFA production 4 h post feeding in cattle. Benchaar et al. (16) demonstrated no effects of thymol, eugenol,

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de 200 ppm de zingiber y syzygium (p<0.05). Para el concentrado, la suplementación de 200 ppm de syzygium disminuyó significativamente la concentración de ácido propiónico (p<0.05). En todos los grupos de forraje, los niveles AGV IC4 disminuyeron significativamente con suplementaciones de aceite esencial de timol 25, orégano 25 y syzygium 200, comparado con los grupos de control positivo y negativo (p<0.05). En todos los grupos de forraje el nivel AGV IC5 también disminuyó significativamente con suplementaciones de aceites esenciales timol 25 y syzygium 200 comparado con los grupos de control positivo y negativo (p<0.05). En el grupo RMT suplementado con timol 25, el grupo concentrado suplementado con syzygium 200 y el grupo heno suplementado con los aceites esenciales de timol 25, orégano 25 y syzygium 200, el nivel AGV IC5 disminuyó significativamente (p<0.05). En todos los grupos de forraje (RMT, concentrado y heno), el nivel AGV C2/ C3 a las 24 horas aumentó significativamente con dosis de 25 ppm de timol y extractos de orégano y disminuyó significativamente con dosis de 200 ppm de zingiber y syzygium.

DISCUSIÓN Efectos de los aceites esenciales sobre los AGV. Como resultado de la actividad microbiana en el rumen de los rumiantes, los carbohidratos tales como celulosa se rompen y se convierten en AGV, dióxido de carbono, metano, amoniaco y células microbianas (12). Los AGV son la principal fuente de energía de los rumiantes. Cerca del 70% de la energía metabolizada por éstos se genera por la producción de AGV en el rumen (13). Si la reducción de las concentraciones de AGV en el rumen en condiciones in vitro ocurre también en condiciones in vivo, esta situación puede afectar negativamente la eficiencia de la nutrición (14). En este estudio, se analizaron los efectos de las suplementaciones con timol, orégano, zingiber y syzygium a la RMT, concentrado y heno a las 8 y 24 horas en condiciones in vitro. Como se observa en la tabla 2, en los grupos de forraje examinados, las suplementaciones con aceite esencial, en comparación con los grupos de control positivo y negativo, no tuvieron ningún efecto significativo a las 8 horas, sobre las concentraciones de los ácidos isobutírico e isovalérico. Beauchemin y McGinn (15) reportaron que 750 mg/d de aceite esencial no tiene efectos sobre la producción de AGV total, a las 4 horas posteriores a la alimentación del ganado. Benchaar et al (16) demostraron que no hay efectos en las vacas, de la combinación de aceites esenciales de timol, eugenol, vainilla y limoneno (2g/día) sobre las concentraciones de AGV total e individual, a

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vanilin and limonen essence oil combination (2g/ day) on total VFA and individual VFA concentrations in cows at 8 h. In the study of Chaves et al (17) on Holstein cows, carvacrol and cinnamaldeyhde supplementation at cattle ration did not have any effect on total VFA and individual VFA concentrations at 6 h. Kamalak et al (18) suggested that thymol has no effect on molar proportions of acetate, propionate, butyrate, isobutyrate, valerate and isovalerate. The findings of these researchers support the findings of this study which showed that essence oils have no significant effect on isobutyric, isovaleric and valeric acid VFAs at 8h.

las 8 horas. En el estudio de Chaves et al (17) sobre las vacas Holstein, la suplementación con carvacrol y cinamaldehído en la ración del ganado, no tuvo ningún efecto sobre las concentraciones de AGV total e individual a las 6 horas. Kamalak et al (18) sugirieron que el timol no tiene efecto sobre las proporciones molares de acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato e isovalerato. Los resultados de estos investigadores apoyan los hallazgos de este estudio, los cuales mostraron que a las 8 horas, los aceites esenciales no tienen efecto significativo sobre los AGV, ácidos isobutírico, isovalérico y valérico.

As seen in table 2, essence oil supplementations had statistically significant effect at 8 h on butyric acid concentration (p<0.05) according to feed. Compared to positive control groups, Syzygium 200 ppm supplementation resulted a significant decrease in butyric acid levels for TMR and concentrate (p<0.05). Öztürk et al (19) revealed that 150 mg of olive leaf extract reduced butyrate production. The findings of these researchers are in agreement with the findings obtained in this study. Contrary to the findings of this study, Castillejos et al (20) reported that 500 mg/l of thymol and eugenol supplementation to 60:40 roughage:concentrate ration significantly increased butyric acid concentration. Bencharr et al (14) demonstrated that carvacrol and eugenol increased butyrate proportions. García et al (21) collected rumen liquors in in vitro conditions from goats fed on 70:30 barley:alfalfa ration and found that 250mg/l of carvacrol sup pl ementati on i ncreased butyrate proportions after 48 h incubation. Chaves et al (22) observed that carvacrol or cinnamaldehyde supplementation to barley or corn grain-based lamb rations did not have any significant effect on butyrate proportions compared to negative control group. Sirohi et al (23) observed no effect of Myristica fragrans extract on butyrate proportions. As indicated by the literature, while some essence oils increase butyric acid concentrations, some essence oils decrease these concentrations and some essence oils have no effect on these concentrations. The varying results obtained from studies can be attributed to the ration compositions and types of plant extracts used in the studies as well as their extraction methods and doses.

En la tabla 2 se observa que de acuerdo con el forraje, las suplementación con aceite esencial tuvo efecto significativo a las 8 horas, sobre la concentración de ácido butírico (p<0.05). La suplementación al RMT y concentrado con 200 ppm de syzygium produjo una disminución significativa en los niveles de ácido butírico (p<0.05), en comparación con los grupos de control positivo. Öztürk et al (19) revelaron que 150 mg de extracto de hoja de olivo redujeron la producción de butirato. Los resultados de estos investigadores están de acuerdo con los obtenidos en este estudio. En contra de las conclusiones de este estudio, Castillejos et al (20) reportaron que la suplementación con 500 mg/l de timol y eugenol en forraje: concentrado en una relación 60:40 aumentó significativamente la concentración de ácido butírico. Bencharr et al (14) demostraron que el carvacrol y el eugenol incrementaron las proporciones de butirato. Garcia et al (21) colectaron licor ruminal en condiciones in vitro de cabras alimentadas con cebada:alfalfa en proporción 70:30 y encontró que 250 mg/l de la suplementación con carvacrol incrementó las proporciones de butirato, después de 48 horas de incubación. Chaves et al (22) observaron que la suplementación con carvacrol y cinamaldehido de las raciones del cordero a base de cebada o maíz en grano, no tuvieron ningún efecto significativo sobre las proporciones de butirato en comparación con los grupos de control negativo. Sirohi et al (23) no observaron efecto del extracto de Myristica fragrans sobre las proporciones de butirato. Como se señala en la bibliografía, mientras algunos aceites esenciales aumentan las concentraciones de ácido butírico, algunos las disminuyen y algunos no tienen ningún efecto sobre estas concentraciones. Los resultados variables obtenidos de estos estudios, se pueden atribuir a las proporciones de las composiciones y a los tipos de extractos vegetales utilizados en dichos estudios, así como también a los métodos de extracción y dosis usados.

Cardozo et al (24) reported that high doses (300 mg/l) of garlic, cinnamon, yucca, anise, oregano, capsicum essence oils and cinnamaldehyde, anethole, eugenol plant

Cardozo et al (24) reportaron que altas dosis (300 mg/l) de aceites esenciales de ajo, canela, yuca, anís, orégano, pimiento y metabolitos secundarios vegetales de cinamaldehído, anetol,

Tekeli - Efficacy of essence oil supplementation

secondary metabolites used in their study significantly decreased total VFA concentrations at 24 h. In the study of Busquet et al (25), 3.000 mg/l doses of carvacrol, clove bud, eugenol and oregano oil supplementation t o 5 0 : 5 0 r o u g h a g e : c o n c e n t ra t e ra t i o n s significantly decreased total VFA concentrations at 24 h. Castillejos et al (20) demonstrated that 5.000 mg/l doses of thymol and eugenol supplementation to 60:40 roughage:concentrate rations significantly decreased total VFA concentrations at 24 h. Petersen et al (26) observed that Larrea plant extract significantly decreased total VFA concentrations in 100% timothy and 50:50 alfalfa-corn rations at 48 h. Canpolat et al. (27) reported that varying d o s e s o f c a r va c r o l , p e p p e r m i n t o i l a n d orange oil supplementations to rumen liquors collected from rams fed on 60:40 alfalfa grassconcentrate ration significantly decreased total VFA, butyric acid and acetic acid/propionic acid concentrations. In our studies, for all feed groups, Thymol 25, Oregano 25, Syzygium 200 ppm supplementations significantly reduced isobuytric acid concentration at 24 h. Further, Thymol 25 and Syzygium 200 ppm supplementations significantly reduced isovaleric VFA concentration at 24 h compared to positive and negative control groups (p<0.05). Castillejos et al (20) observed that 500 mg/l of thymol and eugenol supplementations significantly decreased isovalerate and isobutytrate concentrations at 24 h. The findings of these researchers support the findings of this study. Similarly, at 24 h, propionic acid concentration significantly decreased in the TMR, concentrate and hay groups with 25 ppm of Thymol s up p l em e n t a t i o n s c o m p a r e d t o p osi ti ve a n d n e g a t i ve c o n t r o l g r o u p s ( p < 0 . 0 5 ) . Isovaleric concentration significantly decreased particularly in Thymol 25 and Syzygium 200 ppm supplemented in TMR, concentrate and hay group compared to positive and negative control groups (p<0.05). Acetic acid/propionic acid concentrations decreased significantly in Zingiber 200 ppm and Syzygium 200 supplemented TMR, concentrate and hay groups compared to positive and negative control groups. The study findings on VFA concentrations for feed groups at 24 h are in agreement with the findings of the researchers mentioned above. Decreased VFA concentrations in rumen liquor can be attributed to reduced activities of ruminal microorganisms due to the antimicrobial effect of essence oils.

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eugenol utilizados en su estudio, disminuyeron significativamente las concentraciones de AGV a las 24 horas. En el estudio de Busquet et al (25), la suplementación con dosis de 3.000 mg/l de carvacrol, brote de clavo, eugenol y aceite de orégano en forraje:concentrado en relación 50:50, disminuyó significativamente las concentraciones de AGV a las 24 horas. Castillejos et al (20) demostraron que la suplementación con dosis de 5.000 mg/l de tymol y eugenol en forraje:concentrado en relación 60:40, disminuyó significativamente las concentraciones de AGV total a las 24 horas. Petersen et al (26) observaron que el extracto vegetal Larrea disminuyó significativamente las concentraciones de AGV total en 100% heno Timothy y alfalfa:maíz en relación 50:50 a las 48 horas. Canpolat et al (27) reportaron que las suplementaciones con dosis variables de carvacrol, aceite de menta y aceite de naranja a licores ruminales colectados de carneros alimentados con hierba alfalfa:concentrado en una relación 60:40, disminuyó significativamente las concentraciones de AGV total, de ácido butírico y de ácido acético/ácido propiónico. En nuestros estudios, para todos los grupos de forraje, las suplementaciones con Timol 25, orégano 25, syzygium 200 ppm redujeron significativamente la concentración de AGV isovalérico en 24 horas, al compararlo con grupos de control positivo y negativo (p<0.05). Castillejos et al (20) observaron que suplementaciones con 500 mg/l de timol y eugenol disminuyeron significativamente las concentraciones de isovalerato e isobutirato a las 24 horas. Los hallazgos de estos investigadores apoyan los de este estudio. De igual manera, a las 24 horas, la concentración de ácido propiónico disminuyó en grupos RMT, concentrado y heno con suplementaciones de 25 ppm de timol, al compararlo con los grupos de control positivo y negativo (p<0.05). La concentración isovalérica disminuyó significativamente, especialmente con timol 25 y 200 ppm de syzygium, suplementados al grupo RMT, concentrado y heno, al compararlo con los grupos de control positivo y negativo (p<0.05). Las concentraciones de ácido acético/ácido propiónico disminuyeron significativamente con 200 ppm de zingiber y syzygium 200 suplementados a grupos RMT, concentrado y heno, al compararlo con grupos de control positivo y negativo. Los resultados del estudio sobre las concentraciones AGV para grupos de forraje a las 24 horas, están de acuerdo con los encontrados por los investigadores mencionados anteriormente. La disminución de la concentración de AGV en el licor ruminal se puede atribuir a actividad reducida de microorganismos ruminales, debido al efecto antimicrobiano de los aceites esenciales.

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In the present study, Syzygium 200 ppm supplementation increased propionic acid production at 8 h for hay. Propionic acid production at 24 h increased with Zingiber 200 ppm and Syzgium 200 ppm supplementations for TMR and hay, and with Zingiber 200 ppm supplementation for concentrate. Acetate:propionate proportions at 8 h significantly increased with Oregano 25 ppm supplementation for TMR and concentrate and with Thymol 25 ppm supplementation for hay. The same proportion at 24 h significantly increased with Thymol 25 and Oregano 25 ppm supplementations for all feed groups. Busquet et al (25) reported that different doses of anethol, anise oil, carvone and tea tree oil decreased the proportion of acetate and propionate, which suggests that these compounds may not be nutritionally beneficial to dairy cattle. Demirtaş et al (28) reported that 250 mg of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) and sage (Salvia officinalis L.) supplementations t o 5 0 : 5 0 r o u g h a g e : c o n c e n t ra t e ra t i o n s did not have any significant effect on propionate production. However, rosemary and sage extracts were found to decrease acetate:propionate proportions compared to control fermenters without supplementations. Similarly, acetate:propionate proportions tended to decrease with increased doses of essence oils. Bodas et al. (29) demonstrated that among the essence oils tested, only Rheum nobile was found to increase propionate:acetate proportion. In conclusion essence oils can be used as alternatives to chemical supplements used for rumen regulators. Being natural, these substances are environment-friendly. The essence oils of Thymol, Oregano, Zingiber and Syzygium used in the present study have the potential of improving rumen efficiency. Acknowledgements The authors are grateful to Hohenheim University (Germany) for its financial and technical support.

En el presente estudio, en el caso del heno, la suplementación con 200 ppm de syzygium incrementó la producción de ácido propiónico a las 8 horas. La producción de ácido propiónico a las 24 horas se incrementó con suplementaciones de 200 ppm de zingiber y 200 ppm de syzygium para RMT y heno, y con 200 ppm de zingiber para el concentrado. Las proporciones de acetato:propionato a la 8 horas se incrementaron significativamente con suplementaciones de 25 ppm de orégano para RMT y concentrado y con suplementación de 25 ppm de Timol para el heno. La misma proporción a las 24 horas se incrementó significativamente con suplementaciones de 25 ppm de Timol y 25 ppm de orégano para todos los grupos de forraje. Busquet et al (25) reportaron que diferentes dosis de anetol, aceite de anís, carvone y aceite de árbol de te, disminuyeron la proporción de acetato y propionato, lo cual sugiere que estos compuestos pueden no ser nutricionalmente beneficiosos para el ganado lechero. Demirtas et al (28) reportaron que suplementaciones con 250 mg de romero (Rosmarinus officinalis L.) y salvia (Salvia officinalis L.) en forraje: concentrado en una relación de 50:50, no tienen ningún efecto significativo sobre la producción de propionato. Sin embargo, se encontró que al comparar en fermentadores de control, sin el uso de suplementaciones, los extractos de romero y salvia disminuyeron las proporciones de acetato/propionato. De igual manera, estas proporciones tienden a disminuir con dosis aumentadas de aceites esenciales. Bodas et al (29) demostraron que de ambos aceites esenciales ensayados, se encontró que solamente el Rheum nobile incrementó la proporción acetato/propionato. En conclusión los aceites esenciales se pueden utilizar como alternativa a los suplementos químicos utilizados para regular el rumen. Estas sustancias, por ser naturales, son amigables con el medio ambiente. Los aceites esenciales de timol, orégano, zingiber y syzygium utilizados en el presente estudio tienen el potencial para la eficiencia del rumen. Agradecimientos Los autores agradecen a la Universidad de Hohenheim (Alemania) por su apoyo financiero y técnico.

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):4895-4906, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Conservation and chemical composition of Leucaena Leucocephala plus fresh or wilted Pennisetum purpureum mixed silages Conservación y composición de ensilajes mixtos de Leucaena leucocephala con Pennisetum purpureum fresco o presecado Ángel Santana P,1* Ph.D, Mario Cisneros L,2 Ph.D, Yordan Martínez A,1 Ph.D, Yoandris Pascual S,1 M.Sc. Universidad de Granma, Facultad de Medicina Veterinaria, Centro de Estudios de Producción Animal, Cuba. 2Instituto de Investigaciones Agropecuarias Jorge Dimitrov, Granma, Cuba. *Correspondencia: santana@udg.co.cu 1

Received: July 2014; Acepted: February 2015.

ABSTRACT Objective. Quantify the effects of mixing Leucaena (L) with King grass forage, fresh (K) or wilted (Kp), on the fermentation process and chemical composition of mixed silages. Materials and methods. Silos were produced mixing several proportions (kg:kg) K:L and Kp:L (100:0; 75:25; 60:40; 50:50; 40:60 and 0:100) of both types of plants, under a completely randomized design of four replications. The quantity of organic acids (butyric, acetic, lactic), pH, ammonia nitrogen percent and some of the typical bromatologic nutrients of the forage before and after ensiling were measured. The treatment effects were evaluated through variance and regression analysis. Results. The results clearly proved the differences (p<0.05) between King grass and Leucaena which promote its mixing and wilting: better legume contents of crude protein (24 vs. 7%), dry matter (33.77 vs. 22.05%) and crude fiber (26.53 vs. 32.5%). Clear benefits on the conservation process of mixed silages were also measured: higher lactic productions and less butyric, acceptable pH (4.02-4.8) and protein degradation (<8%). In addition, a positive effect on the chemical composition of the aforementioned silages was quantified (crude protein, dry matter and crude fiber progressive improvement). Conclusions. Mixed K+L silages are better than pure K if L is included below 25% in KL and up to 40% when K has been wilted. Higher inclusions of L will worsen the conservation process and will limit its elaboration. Key words: Ammonia, fermentation, lactic acid, nutrients, ph (Source: DeCS).

RESUMEN Objetivo. Cuantificar los efectos de la adición de forraje de Leucaena leucocephala (L) en el proceso fermentativo y la composición química de ensilajes mixtos con King grass fresco (K) o presecado (Kp). Materiales y métodos. Se ensilaron en condiciones de laboratorio diferentes proporciones (kg:kg) K:L y Kp:L (100:0; 75:25; 60:40; 50:50; 40:60 y 0:100), bajo un diseño totalmente al azar de cuatro repeticiones por cada una. Se midió la cantidad de ácidos orgánicos (butírico, acético, láctico), pH, porcentaje de nitrógeno amoniacal y los nutrientes típicos de la bromatología en el forraje antes de ensilar y en los ensilados resultantes. Los efectos de los tratamientos se midieron mediante análisis de varianza y regresión. Resultados. Los resultados demostraron las diferencias (p<0.05) de la composición química entre el King grass y la Leucaena que animan a su deshidratación previa 4895

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y mezclado: mejores tenores de proteína cruda (24 vs. 7%), de materia seca (33.77 vs. 22.05%) y fibra cruda (26.53 vs. 32.5%) en la leguminosa; así como los beneficios en la preservación del ensilaje mixto (mejores producciones de ácido láctico y menores del butírico, aceptable pH (4.02-4.8) y degradación de la proteína(<8%) y en la bromatología de estos (avance progresivo en la concentración de proteína, materia seca y fibra). Conclusiones. Los ensilajes mixtos K+L son mejores que los de K siempre que L se adicione hasta 25% con K y hasta 40% con K presecado. Con inclusiones mayores de Leucaena se empeora la conservación, lo que limita su elaboración. Palabras clave: Ácido láctico, amoníaco, fermentación, nutrientes, ph (Fuente: DeCS).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

It has been shown that for typical small farmers in the tropics, conservation of surplus forage as silage can be important because this way they can thus avoid the influence of climatic conditions that are adverse to developing hay and because various technological variants can be applied according to changing economic conditions, infrastructure and levels of knowledge (1).

Se ha demostrado que para los pequeños ganaderos típicos del trópico la conservación de los excedentes de forrajes en forma de ensilaje puede ser también de gran interés, porque es una técnica que esquiva en gran medida la influencia de las condiciones climáticas que resultan adversas para la elaboración de heno y porque se pueden aplicar variantes tecnológicas ajustables a diversas condiciones económicas, de infraestructura y niveles de conocimientos acerca de la misma (1).

Historically, producers have different species and varieties of grasses to feed their animals which, at the same time, are the basic materials to be preserved for scarcity periods. However, today it is more common to use other forage families to combine with the classic grass-based diets (2). On the other hand, silage fermentation as warranty of conservation, is a complex process involving relationship between characteristics of the original feed, applied technology, epiphytic microflora of the environment and prevailing weather conditions. (3) It is known that the grasses are better preserved than legumes due to a higher content of soluble carbohydrates and because they are lower in protein and minerals; but they have lower nutritional value and animal productions are consequently lower. In contrast, leguminous plants produce less desirable fermentations, as they have less fermentable carbohydrates and because they have greater protein and mineral content; however, its use stimulates consumption of silage, digestibility of nutrients, and production aspects such as weight gain and milk yield (2,4,5).

Históricamente los productores han tenido disponibles diferentes especies y variedades de gramíneas forrajeras para alimentar a sus animales que han sido, al mismo tiempo, el material básico a conservar para periodos de escasez. Sin embargo, en la actualidad es más común el cultivo de especies de otras familias forrajeras de alto valor nutricional, con el objetivo de combinar con las dietas clásicas basadas en estas gramíneas (2). Por otra parte, la fermentación de los ensilajes, entendida como garantía de la conservación, es un proceso complejo que involucra interrelaciones entre las características del forraje original, la tecnología aplicada, la microflora epifítica del ambiente y las condiciones climáticas imperantes (3).

Contrary to this, some research has not reported significant improvements, but rather reductions in some percentage parameters, such as nutrient digestibility coefficients that are included in the nutritional evaluation of silage. Using silage that has the progressive addition of legumes, however, close dependencies with mixed forage species (1) are indicated.

Es conocido que las gramíneas se conservan mejor que las leguminosas por sus mayores contenidos de carbohidratos solubles, y más bajos de proteínas y minerales; pero a su vez tienen menor valor nutritivo y las producciones de los animales son en consecuencia bajas. En cambio las leguminosas producen fermentaciones menos deseables por ser menos ricas en carbohidratos fermentables y por poseer tenores más altos de proteínas y minerales; sin embargo su uso estimula el consumo del ensilaje, la digestibilidad de los nutrientes, y aspectos productivos como la ganancia de peso y la producción de leche (2,4,5).

The objective of this research was to quantify the effects of adding Leucaena leucocephala

Contrario a lo anterior algunas investigaciones no han reportado mejoras significativas, más

Santana - Quality of Pennisetum purpureum+Leucaena mixed silages

forage in the fermentation process and chemical composition of silage mixed with fresh or wilted King grass (Pennisetum purpureum cv. King grass).

MATERIALS AND METHODS Site and type of experiment. The experiment was carried at laboratory level in the research facilities of the Centro de Estudios de Producción Animal, Faculty of Veterinary Medicine, Universidad de Granma; eastern region of Cuba (Coordinates: 20º, 16’,52.596” North latitude, 76º, 43’, 36.192” East longitude, and altitude of 112.5 m asl), tropical brown soil free of carbonates, 3.3% of organic matter, and pH from neutral to slightly acid (6). Procedure. Several Cullison type of microsilos (1.2 L of capacity), with Bunsen copper valves to avoid air entering, were used to ensile different mixtures of fresh King grass (K) or sun predehydrated (Kp) during 4 hours having 80 days of regrowth (pre-bloom stage) plus Leucaena (L). Both type of forages were chopped (1–1.5 cm long) and mixed in proportions (kg:kg) of 100:20; 75:25; 60:40; 50:50; 40:60 and 0:100 of King grass:Leucaena. Forage was established in dry areas for a period of 14 months and Leucaena foliage consisted of leaves and tender stems considered to be edible. Laboratory analysis. 75 days after ensiling the silos were opened to measure pH using a potentiometer, organic acids (lactic, acetic and butyric acids) by volume (Lepper-Flieg method), NH3 to N Total by micro diffusion and bromatologic components using AOAC methods (7): dry matter (MS), crude protein (PB), crude fiber (FB), nitrogen free extract (ELN), ether extract (EE), organic matter (MO) and total ash (CZ). The samples were dried and ground before doing bromatological analysis and fresh silages were diluted in deionized water for organic acids quantification. Experiment design and statistical analysis. The research was conducted under a 2x6 factorial design (factor 1, level of dryness of King grass: fresh K or pre-dried for 4 hours Kp; factor 2, six ratios described) with four replications per treatment (N=48). One-Way analysis of variance for bromatology was conducted on mixed fodder (K, Kp and L) as sources of variation and Two-Ways analysis of variance for pH and NH3 (the two factors described and their

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bien hasta disminuciones de algunos parámetros porcentuales, como en los coeficientes de digestibilidad de los nutrientes que se incluyen en la valoración nutritiva de ensilados al utilizar ensilajes con adición progresiva de leguminosas, no obstante, se indican estrechas dependencias con las especies de forrajes mezcladas (1). El objetivo de la presente investigación fue cuantificar los efectos de la adición de forraje de Leucaena leucocephala en el proceso fermentativo y la composición química de ensilajes mixtos con King grass (Pennisetum purpureum vc. King grass) fresco o presecado.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio y tipo de experimento. El experimento en condiciones de laboratorio se desarrolló en las áreas investigativas del Centro de Estudios de Producción Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Granma, en la región oriental de Cuba (Coordenadas: 20º,16’,52.596” latitud Norte y 76º,43’,36.192” longitud Oeste, a una Altitud de 112.5 msnm), con un régimen de precipitaciones anuales de 1,600 mm (60% ocurren en la época lluviosa), suelo de tipo pardo tropical sin carbonato, con contenido de materia orgánica de 3.3% y pH de neutro a ligeramente ácido (6). Procedimiento. Se utilizaron microsilos tipo Cullinson de 1.2 L de capacidad, con válvulas Bunsen de cobre para permitir la salida de los gases y evitar la entrada de aire, donde se ensilaron mediante compactación manual diferentes mezclas de King grass fresco (K) de 80 días de rebrote, sin señales de floración; o Presecado (Kp) previamente durante 4 horas al sol y Leucaena (L), troceados a 1-1.5 cm de largo y misturados en proporciones en base a peso fresco (kg:kg) de 100:0; 75:25; 60:40; 50:50; 40:60 y 0:100 de King grass:Leucaena. Los forrajes estaban establecidos en áreas de secano por un periodo de 14 meses y el follaje de Leucaena consistió en hojas y tallos tiernos considerados como comestibles por los animales. Análisis de laboratorio. A los 75 días de elaborados los silos, fueron abiertos para realizar las mediciones del pH por potenciometría, los ácidos orgánicos (láctico, acético y butírico) por volumetría (método Lepper-Flieg), el NH3 respecto al N Total por microdifusión y también los componentes bromatológicos por los métodos de la AOAC (7): materia seca (MS), proteína cruda (PB), fibra cruda (FB), extracto

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interaction as fixed effects). Correlation and regression analysis were done too. In al cases values of p<0.05 were considered significant. Also, variation adjustment (Y) in bromatology and synthesis of organic acids was tried with three types of regression equations (linear, quadratic and cubic), where the independent variable (X) was the percentage of Leucaena in silage. The best equation was selected according to the highest value of R2 (for more accuracy), as long as it was higher by at least 0.05 units compared to less complex ones (for ease of calculations). The standard error of Y estimates was included and it was also considered that residuals were normally distributed. The values of “X” where “Y” has its maximum and minimum points in quadratic equations were determined as equaling zero with the first derivatives. All statistical analysis were performed using the Statistica de StatSoft program (8).

RESULTS Table 1 shows some important differences between the three forages used before ensiling. It should be noted that MS significantly increased in dehydrated King grass forage in comparison with fresh grass, and it was also higher than the quantified value in Leucaena. PB contents found in this legume are greater than the grass in both forms. Similarly, Leucaena is also favored in its FB and EE content, which may improve the chemical composition of silage when mixed with grass. Tabla 1. Bromatologic composition (Dry Matter Basis, %) of forage before silage. K

22.05c ±2.88

42.31a ±3.85

33.77b ±4.61

88.67 ±10.0

85.11 ±9.12

90.05 ±11.2

11.33 ±2.19

14.89 ±3.00

9.95 ±3.05

7.14b ±0.99

6.00b ±0.55

24.00a ±1.87

32.60a ±4.11

39.70a ±4.93

26.53b ±2.22

1.05b ±0.05

0.71b ±0.04

2.50a ±0.19

ELN

47.88a ±3.66

38.70b ±4.00

37.02b ±3.08

Different letters in the same row indicate significant differences in the Duncan test. Average±DS

libre de nitrógeno (ELN), extracto etéreo (EE), materia orgánica (MO) y cenizas totales (CZ). Las muestras fueron secadas y molidas antes de los análisis bromatológicos y para la cuantificación de los ácidos orgánicos el ensilaje fresco se usó una dilución en agua desionizada. Diseño experimental y análisis estadísticos. La investigación se llevó a cabo bajo un diseño factorial 2x6 (factor 1, nivel de sequedad del King grass: fresco K o presecado por 4 horas Kp; factor 2, las seis proporciones descritas) con cuatro repeticiones por tratamiento (N=48). Se realizaron análisis de varianza simple para la bromatología, con los forrajes mezclados (K, Kp y L) como fuentes de variación y doble para pH y NH3 (los dos factores descritos y su interacción, como efectos fijos), de correlación y de regresión. En todos los casos se consideró significativo todo valor de p<0.05. También se probó el ajuste de la variación (Y) de la bromatología y de la síntesis de ácidos orgánicos a tres tipos de ecuaciones de regresión (lineal, cuadrática y cúbica), donde la variable independiente (X) fue el porcentaje de Leucaena en el ensilado. Se seleccionó la mejor ecuación según el valor más alto de R 2 (para garantizar precisión) siempre que este sea superior al menos 0.05 unidades en comparación con los de menor complejidad (para facilitar los cálculos), se incluyó el Error Estándar de la Y estimada (EEY) y además se tuvo en cuenta que los residuales se mantuvieran normalmente distribuidos. Los valores de “X” donde “Y” tiene sus puntos máximos y mínimos en las ecuaciones cuadráticas se determinaron igualando a cero sus primeras derivadas. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo mediante el programa Statistica de StatSoft (8).

RESULTADOS En la tabla 1 se aprecian algunas diferencias importantes entre los tres forrajes utilizados antes de ser ensilados, es preciso destacar que la MS aumentó significativamente en el forraje de King grass deshidratado con respecto a su estado fresco, además fue superior al valor cuantificado en la Leucaena. En cambio los tenores de PB encontrados en esta leguminosa son mayores que el de la gramínea en sus dos formas.

a,b

Asimismo, la Leucaena es igualmente favorecida por sus contenidos de FB y EE, lo que podrá

Santana - Quality of Pennisetum purpureum+Leucaena mixed silages

On the other hand, the fractions MO and ash showed no important differences between the two forages studied. The variation in synthesis of lactic, acetic and butyric acids with the progressive addition of Leucaena to ensiled mixture is shown in figure 1. Importantly, butyric acid production, both KL and KPL, increased from 50% inclusion of the legume in comparison with the control (0% of Leucaena), with greater emphasis on KL treatment. In this sense, when making calculations with equations, it was found that KPL has a minimum production of this acid with inclusions of up to 27% of the legume and equal to 100 King grass (0 Leucaena), with a rate of 47K:53L.

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mejorar la composición química del ensilaje al ser mezclada con la gramínea. De otro lado, las fracciones de MO y cenizas no mostraron diferencias significativas entre los tres forrajes estudiados. La variación en la síntesis de los ácidos láctico, acético y butírico con adición progresiva de follaje de Leucaena a la mezcla ensilada se muestra en la figura 1. Es importante notar que la producción de ácido butírico, tanto en KL como en KpL, aumentó a partir del 50% de inclusión de la leguminosa en comparación con el tratamiento control (0% de Leucaena), con mayor énfasis en el KL. En este sentido al realizar los cálculos con las ecuaciones, se encontró que el KpL tiene una producción mínima de este ácido con inclusiones de hasta 27% de la leguminosa e igual al 100 de King grass (0 de Leucaena), con una proporción de 47K:53L. Para el ácido láctico, la variación graficada indicó que este se sintetiza en cantidades iguales, o ligeramente superiores a la gramínea sola cuando se incluye poca cantidad de Leucaena. Las estimaciones permiten afirmar que la adición de hasta 7% de Leucaena en la mezcla con Kl y hasta 11% con KpL mejora la síntesis de los lactatos.

Figure 1. Effects of adding increasing Leucaena forage on the production of butyric, lactic and acetic acid in silages with fresh King grass (KL) or pre-dried King grass (KPL).

For lactic acid, the plotted variation indicated that this is synthesized in the same, or slightly higher, quantities than grass alone when small amounts of Leucaena are included. The estimates indicate that adding up to 7% of Leucaena in the mix with KL and up 11% KPL improves lactate synthesis. It is also seen in figure 1 that with KL it was possible to produce lactic acid in a similar concentration with that of control KL with 0% Leucaena, in a mixture with 69.5:30.5 (Kp: L) according to the equation for this acid. In the case of acetic acid in KL, there was no trend that would fit the evaluated equations. However, in K P L a gradual increase was observed, but with less variation, as more Leucaena was added to the mixture, which also showed the beneficial effect of wilting the grass.

Se aprecia también en la figura 1 que con KpL se logró producir el ácido láctico en una concentración similar a la del testigo KL con 0% de Leucaena, con una mezcla 69.5:30.5 (Kp:L), según la ecuación de ajuste para este ácido. Para el caso del ácido acético en KL no se encontró una tendencia que se ajustara a las ecuaciones evaluadas. Sin embargo, en KpL se observó un incremento paulatino, pero de menor variación, en la medida que se adicionó más Leucaena a la mistura, lo que comprobó también un efecto benéfico del presecado previo de la gramínea. La tabla 2 muestra el pH de las mezclas y el porcentaje de N amoniacal en relación al total cuantificado que se relaciona clásicamente con el nivel del deterioro de las proteínas. La comparación de los valores medios de pH entre los tratamientos tiene una importancia menor que la observancia de su variación conforme aumenta el porcentaje de Leucaena en la mixtura, para poder evaluar con sentido práctico los efectos de este último. Nótese que se observa un aumento para ambos tipos de ensilados, aunque en KL la inclusión de 25% de Leucaena provocó un ascenso significativo del pH desde 4.02 que es un valor cercano al ideal de 4.

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Table 2 shows the pH of the mixtures and the percentage of ammonium nitrogen relative to the quantified total that is classically related to the level of protein deterioration. Comparing the mean pH values between treatments is less important that observing its variation as the percentage of Leucaena increases in the mixture, in order to assess the practical effects of the latter. An increase for both types of silage is observed, although in KL inclusion at 25% Leucaena caused a significant rise in pH from 4.02 to a value close to the ideal 4. Table 2. pH and NH3 -N of silages. Forage (1)

%L (2) 0 25

40 50 60 100 0 25

40 50 60 100

pH ±DS 4.02a ±0.02 4.42bc ±0.22 4.37c ±0.20 4.75bd ±0.24 4.64bce ±0.08 ND 4.19abcd ±0.07 4.16abc ±0.11 4.88def ±0.06 5.20g ±0.23 5.05fg ±0.23 ND

NH3 ±DS 5.21b ±0.57 5.54bc ±0.71 4.95b ±1.19 7.80d ±1.19 8.56d ±2.36 ND 2.52a ±0.54 4.88b ±1.13 7.25cd ±1.01 8.81d ±1.70 9.03d ±1.40 ND

INTERACTION 1 X 2 p = 0.0008 p = 0.0903 ND: Undetermined a.b Equeal letters in the same row indicate no-significant differences by the Duncan’s test

With the previously wilted grass in the control treatment (100% Kp), the pH begins to progressively increase starting at 4.19, which is statistically equal to its similar percentage of Leucaena in Kl, which is the initial cause so that the recorded measurements with successive additions of Leucaena exceed 5 in 50:50 proportion. In KL the pH increased highly adjusted (R 2 =0.78) to the equation pH=4.09+0.01 (% L), the same as in the KPL mixtures was adjusted (R 2 =0.87) pH=4.12+0.02 (% L), which indicates an intercept, or initial pH with pure grass, higher in this latter mixture and also a greater slope that signals the greater effect that Leucaena has when King grass was dehydrated beforehand. The effects caused by the progressive addition of Leucaena to the bromatology of the mixed silage is shown in figure 2. The contribution of each forage silage mix is perceived. Thus, it was found that the concentrations of PB increased almost linearly with the proportion of Leucaena.

Con la gramínea previamente deshidratada, en el tratamiento testigo (100%Kp) el pH comienza un aumento progresivo que inicia de 4.19, que estadísticamente es igual a su similar por ciento de Leucaena en Kl, siendo la causa inicial de que las mediciones registradas con las adiciones sucesivas de Leucaena lleguen a sobrepasar el valor 5 en las proporciones 50:50. En KL el pH aumentó altamente ajustado (R2=0.78) a la ecuación pH=4.09+0.01(%L), igual que en las mezclas KpL se ajustó (R2=0.87) pH=4.12+0.02(%L), lo que indica un intercepto, o pH inicial con la gramínea pura, más alto en esta última mezcla y también una mayor pendiente como muestra del efecto mayor de la Leucaena cuando el King grass fue deshidratado previamente. Los efectos provocados por la adición progresiva de Leucaena en la bromatología de los ensilajes mixtos se muestran en la figura 2. Se percibe la contribución de cada forraje al ensilaje de la mezcla. Así, se encontró que el tenor de PB incrementó prácticamente de forma lineal con la proporción de Leucaena. El contenido de MS está también influenciado por los forrajes originales, teniendo en cuenta que el forraje de King grass fresco contiene alrededor de 22% y la Leucaena casi 34, por lo que sus diferentes mezclas KL estuvieron en ese intervalo. Igual efecto se puede apreciar para KpL y en la FB de KpL; sin embargo, la variación observada en la FB de KL no se ajustó a los modelos evaluados.

Figure 2. Variation of the MS, PB and FB in silages according to the proportion of Leucaena in the mix.

DISCUSIÓN Las diferencias significativas entre los tenores de PB de la Leucaena y la gramínea, en sus dos formas, resulta ser uno de los atractivos más importantes para efectuar la operación de

Santana - Quality of Pennisetum purpureum+Leucaena mixed silages

The MS content is also influenced by the original forages, considering that fresh King grass forage contains about 22% and Leucaena nearly 34, so different KL mixtures were in that range. The same effect can be seen for KPL and the FB of KPL; however, the observed variation in the FB of KL did not conform to the models tested.

DISCUSSION Significant differences between PB contents of Leucaena and grass, in its two forms, is one of the most important encouraging elements in mixing these two, with the aim of improving the nutritional quality of the resulting mixed silage. Other research (9,10) has confirmed the differences of these concentrations between grasses and legumes. This principle is also reflected in the composition of the mixtures used, as evidenced by higher values than single grasses that are reported in combinations with several tropical legume species (11,12) which are logically determined by the proportions of the two types of plants found in the mixture (13,14). From the point of view of fermentation, if the silage does not have more than 0.5% of butyric acid in the MS, the nutritional quality and fermentation (15) is not affected, but above this is proof that Clostridia has dominated the conservation and therefore the response in animals is not positive. The results show that the percentage of butyric acid reaches about 0.5% only when L represents more than 60% of the KL mixture and more than 80 in KPL. All this happens in grasses-legumes mixtures where a new substrate is created and there are, in addition to the sugars needed for fermentation, greater sources of nitrogen and vitamins than when pure grasses are ensiled. However, the “best” would be to leave it to the point where the sugars do not limit and/or the buffering effects do not impose (1.3). It has been known for a long time that wilting tropical forages is one of the best ways to lead fermentation to a lactic pattern (16), which is the most desirable in fermentation because it is stronger than others, causes greater decreases in pH, reduces MS loss and stimulates silage consumption by ruminants. It is advisable to avoid Pennisetum silage when it has not been dried previously or any kind of additive is used (17).

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mezclado de estas, con el objetivo de mejorar la calidad nutritiva del ensilado mixto resultante. Otras investigaciones (9,10) han confirmado las diferencias de estas concentraciones entre gramíneas y leguminosas. Este principio se ve reflejado también en la composición de las mezclas de las especies en cuestión, como lo demuestran los valores superiores a los de las gramíneas solas reportados en combinaciones con varias especies leguminosas tropicales (11,12), lógicamente estarán determinados por las proporciones en que se encuentran los dos tipos de plantas en la mezcla (13,14). Desde el punto de vista fermentativo se considera que si el ensilado no posee más de 0.5% de ácido butírico en la MS no se afecta su calidad nutricional, ni su fermentación (15), pero por encima de este es muestra de que los Clostridios han dominado la conservación de la masa y por ende la respuesta en los animales no es positiva. Los resultados muestran que el porcentaje de ácido butírico llegan cerca de 0.5% únicamente cuando L representa más del 60% en la mezcla KL y más de 80 en KpL. Todo lo anterior se debe a que al mezclar gramíneas y leguminosas se crea un medio que posee, además de los azúcares necesarios para la fermentación, mayores fuentes de nitrógeno y vitaminas que cuando se ensilan las gramíneas solamente; no obstante, el “mejor” será hasta el punto donde los azúcares no sean limitantes y/o los efectos buferantes no sean demasiado imponentes (1,3). También se reconoce desde hace mucho tiempo que el presecado previo de los forrajes tropicales es una de las mejores formas de conducir las fermentaciones hacia el patrón láctico (16), que es el más deseable en la fermentación porque es más fuerte que los demás, provoca descensos mayores en el pH, reduce las pérdidas de MS y estimula el consumo del ensilaje por los rumiantes. Es recomendable evitar el ensilado de los Pennisetum cuando este no ha recibido un marchitamiento previo o se usa algún tipo de aditivo (17). Indudablemente en el presente experimento esto queda demostrado pues la síntesis de ácido láctico aumenta inicialmente más en KpL que en KL. En ensilajes de Rye grass+Trébol se obtuvo una síntesis de ácido láctico superior al 5% y de ácido butírico por debajo de 0.04 en la MS, en cambio el pH de la masa fue de 4.5; pero se consideró aceptable pues la materia seca superó el 43%, también se coincidió con investigaciones hechas con misturas de titricale+veza que poseen valores de pH por encima de 4.5 y materia seca superior a 40 (17,18).

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Certainly in this experiment this was demonstrated, since the lactic acid synthesis initially increases more in KPL than in KL. In Rye grass+Clover silage, a lactic acid synthesis above 5% and butyric acid below 0.04 in the MS was obtained, and the pH of the mass was 4.5. However, it was considered acceptable because the dry matter exceeded 43%, and it also coincided with investigations with triticale+vetch mixtures that possess pH values above 4.5 and dry matter greater than 40 (17,18). The theory of the various origins of acetic acid in silage explains the irregularities seen in this and similar experiments, including studies using corn to try to reach a better fermentation (1920). When this acid is produced in concentrations higher than 3% based on dry matter, it can reduce consumption of silage, although such a statement is still inconsistent. In a study of corn silage mixed with a legume (50:50), the pH was 4.66, even though it has good fermentation, nutritional quality and NH3-N accounted for only 6% (14). In Sorghum almum mixtures with Arachys hipogea and Centrosema pascorum ensiled without additives, pH values above 5 (21) were recorded, and the main cause is attributed to the lack of soluble carbohydrates. The opposite effect was found when mixtures of corn stubble with legume Lupinus exaltatus and L. rotundiflorus, adding molasses as a carbohydrate source, and it was possible to lower the pH to values close to 4, although there is a tendency to be higher with greater proportions of the legumes (20). The strength of synthesized acids in silage can be summarized with pH measurement and the values of this variable decrease to intervals of 3.6-4.5 ideally, so that the values obtained in the present investigation are considered acceptable for preserving mixtures with less than 50% Leucaena, whether or not the King grass was predried, even though pre-drying and the presence of legumes are valid reasons so that the pH reaches above normal values; for this reason, two samples of silage can have the same pH, but different concentrations of acid and vice versa. Moreover, the values of the interaction between the form of King grass forage (fresh or predried) vs. the percentage of Leucaena in the mixture denote that it is not possible to isolate the influence of both factors in the pH. This means that, regarding the acidity of the silage, it is necessary to consider each one as separate material when the grass is combined independently (fresh or pre-dried) and percent of legume; while regarding the NH3 it is feasible to say that a lower relative protein degradation

La teoría de los diversos orígenes del ácido acético en los ensilados explica las irregularidades apreciadas en la presente investigación y en otras similares, lo que incluye estudios con granos de maíz para tratar de conducir mejor la fermentación (19,20). Cuando este ácido se produce en concentraciones superiores al 3% en base a la materia seca, puede deprimir el consumo del ensilado, aunque tal afirmación es hoy aún inconsistente. En un estudio con ensilado mixto de maíz con una leguminosa (en proporción 50:50) el pH fue de 4.66, a pesar de poseer buena calidad nutricional, fermentativa y que el NH3-N representó sólo el 6% (14). En mezclas de Sorghum almun con Arachys hipogea y con Centrosema pascorum ensiladas sin aditivos se registraron valores de pH superiores a 5 (21) y la causa principal se le atribuye a la falta de carbohidratos solubles. El efecto contrario se comprobó cuando se ensilaron mezclas de rastrojos de maíz con las leguminosas Lupinus exaltatus y L. rotundiflorus, pero con la adición de melaza como fuente de carbohidratos, donde se logró descender el pH hasta valores cercanos a 4, aunque hay una tendencia a ser más elevado en las proporciones más altas de las leguminosas (20). La fortaleza de los ácidos sintetizados en el ensilado puede ser resumida con la medición del pH y los valores de esta variable disminuyen hasta intervalos entre 3.6-4.5 idealmente, por lo que los obtenidos en la presente pesquisa están considerados como aceptables para la preservación de las mezclas que poseen menos de 50% de Leucaena, independientemente de si ha sido presecado o no el King grass, a pesar de que el presecado y la presencia de leguminosas son razones válidas para que el pH alcance valores encima de lo normal; es por esos que dos muestras de ensilaje pueden tener el mismo pH, pero diferentes concentraciones de ácidos y viceversa. Por otra parte, los valores de la interacción entre la forma del forraje de King grass (fresco o presecado) vs. el porcentaje de Leucaena en la mezcla denotan que no es posible aislar la influencia de ambos factores en el pH. Esto significa que, cuando se trata de la acidez del ensilaje, es necesario considerar cada una como un material independiente donde se combinan de independientemente la forma de la gramínea (fresca o presecada) y el porcentaje de la leguminosa; mientras que en lo referente al NH3 sí es factible afirmar que se obtiene una menor degradación relativa de las proteínas cuando se preseca el King grass antes de ensilar, puesto que el valor de la interacción no es significativo. En general, los resultados en la fermentación de diferentes mezclas están muy ligados a factores específicos de los forrajes originales. Pero estos

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is obtained when the King grass is wilted before silage, since the value of the interaction is not significant. Overall, the results in fermentation of different mixtures are closely linked to specific factors depending on the original forages. But those values also show that the local environmental could influence the spontaneous development of various microorganisms, since adding bacterial cultures to induce fermentation showed specific and precise effects, regardless of the forage characteristics, which can be pure legumes and other types of forage (21.22). The influence of Leucaena has been well established, since this forage has MS high tenors (about 30%) and experiments done on their ensilability conclude that it is good for mixed silage, but does not cause significant decreases in the pH of the preserved mass (3). The proteolytic potential of the silage depends on the protein content and the affinity of the proteinase in the forage; additionally, the solubilization process of the proteins depends on a decrease in the pH and the content of MS in the material as an indicator of the osmotic pressure in the environment, although the proteolysis is inhibited more by the rapid drop in pH that by osmolarity due to limitations it imposes on the proteolytic bacteria and Clostridia (23). In addition, other factors of the composition of the original feed, such as the presence of polyphenols, also affect the preservation of legume proteins (24). This interdependence is valid for all kinds of ensiled materials. In research with silages made from orange peels it was considered very good at 8.3% NH3, which shows a low process of deamination and protein degradation, even when the pH dropped to 3.7 and produced acidity that ensured the stability of the preserved mass (25). Furthermore, deterioration of the protein did not go above 11 and 15% of the total N (Table 2), which are accepted as limitations since at proportions higher than NH3 it is released very rapidly in the rumen of animals and causes significant urinary losses of this fraction (26). It is important to highlight that when fermentation is done by adding organic acids, and not naturally as in this investigation, lower percentages of NH3-N are obtained (26,27). N ammonia ratios found are in accordance with these principles, although this increases when a greater proportion of Leucaena is in the mixture. Regardless of this, the increased PB achieved

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valores comprueban también las influencias que podrían tener las condiciones ambientales locales para el desarrollo espontáneo de diferentes microorganismos, ya que la adición de cultivos de bacterias para conducir la fermentación ha mostrado efectos determinantes y precisos, independientemente de las características de los forrajes que pueden ser leguminosas puras y otros tipos de forrajes (21,22). La influencia de la Leucaena ha quedado bien demostrada pues este forraje se caracteriza por poseer tenores de MS elevados (alrededor de 30%) y los experimentos hechos sobre su ensilabilidad concluyen que es buena para ensilar misturada, pero no provoca descensos notables en el pH de la masa conservada (3). El potencial proteolítico de los ensilados depende del contenido de proteínas y de la afinidad de las proteinasas endógenas de los forrajes; además que el proceso de solubilización de las proteínas está en dependencia del descenso del pH y del contenido de MS del material, como indicador de la presión osmótica del medio, aunque la proteólisis se inhibe más fuertemente por la rápida caída del pH que por la osmolaridad, debido a las limitaciones que impone este al crecimiento de bacterias proteolíticas y a los Clostridios (23). Además, otros factores de la composición de los forrajes originales, como la presencia de polifenoles, también influyen en la preservación de las proteínas de las leguminosas (24). Esta interdependencia es válida para todo tipo de material ensilado, en una investigación con ensilaje hollejos de naranja fue considerado muy bueno el 8.3% de NH3, muestra de un bajo proceso de deaminación y de degradación de las proteínas, aun cuando el pH descendió hasta 3.7 y produjo una acidez que garantizó la estabilidad de la masa conservada (25). Además, no se alcanzó deterioro de la proteína por encima de 11 y 15% del N total (Tabla 2), aceptados como limitantes puesto que con proporciones superiores de NH3, este es liberado muy rápidamente en el rumen de los animales y provoca significativas pérdidas urinarias de esta fracción (26). Es importante destacar que cuando la fermentación se conduce con la adición de ácidos orgánicos, y no de forma natural como en la presente investigación, se obtienen porcentajes más bajos de NH3-N (26,27). Las proporciones de N amoniacal encontradas están acorde con estos principios, a pesar de que este aumenta por una mayor proporción de Leucaena en la mezcla. Independientemente de esto el aumento de la PB que se logra es una de las principales motivaciones para ensilar gramíneas

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is one of the main motivations for using mixed silage of grasses with legumes or species of other families that are richer in this nutrient (9,10,13,20). The results that were quantified in the MS, PB and FB show the expected benefit of mixing, especially with respect to PB, and confirm that if the chemical composition of forages is known, it could certify a MS content in silage that also ensures good preservation and high nutritional value. Under this principle, a very wet forage mixed with another drier one will improve the parameters of conservation and nutritional quality, whenever the used proportions are controlled. Hence the recommendation to combine cereal high in MS with wet forage to solve the disadvantages of both extreme situations (16). In a similar investigation with a legume and cereal (berseem+triticale), it was found that the chemical composition in the mix is better than with just cereal, but not when compared with the legume, while fermentation favors the mixture in silage in relation to the legume alone (28), so it was preferred over the two pure silages. From the results in fermentation measurements, bromatology, pH and N ammonia, it can be concluded that the mixed silage of fresh King grass with Leucaena is well preserved when up to 25% of the latter is included, while the previously dehydrated King grass (KPL) has best results when 45% legume was added. With this option the nutritional quality of silage is improved, there are benefits in conserving the ensiled mass, chemical composition and the protein content, whose solubility is not affected. Increasing proportions of Leucaena above the previous limits leads to undesirable fermentation that do not guarantee the preservation of the silage mass.

con leguminosas o especies de otras familias más contenedoras de este nutriente (9,10,13,20). Los resultados que se cuantificaron en la MS, FB y PB permiten demostrar el beneficio previsto con la operación de mezclado, principalmente respecto a la PB, y afirmar que si se conoce la composición química de los forrajes; se pudiera garantizar un contenido de MS en el ensilaje que asegure también una buena conservación y elevado valor nutricional. Bajo este principio si se dispone de forrajes muy húmedos su mezcla con otro más seco permitirá mejorar los parámetros de la conservación y de calidad nutritiva, siempre que se controle las proporciones empleadas. De aquí la recomendación de combinar también pajas de cereales de alto contenido de MS con forrajes húmedos para resolver las desventajas de ambas situaciones extremas (16). En una investigación similar con una leguminosa y un cereal (berseem+titricale) se obtuvo que la composición química es mejor en la mezcla que en el cereal solo, pero no así en comparación con la leguminosa, mientras que la fermentación favorece a la mistura ensilada en relación a la leguminosa sola (28), por lo que fue preferida sobre los dos ensilajes puros. A partir de los resultados en las mediciones de la fermentación, bromatología, pH y N amoniacal, es factible concluir que los ensilajes mixtos de King grass fresco con Leucaena se conservaron bien cuando se incluye hasta 25% de esta última, mientras que con el King grass deshidratado previamente (KpL) se observaron los mejores resultados con la adición de la leguminosa hasta 45%. Con esta opción se mejora la calidad nutricional de los ensilajes, por los beneficios en la conservación de la masa ensilada, en la composición química y principalmente en el tenor de proteína, cuya solubilidad no se afecta. El aumento de las proporciones de Leucaena por encima de los límites anteriores conduce a fermentaciones indeseables que no garantizan la preservación de la masa ensilada.

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):4907-4916, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Fribrinolytic activity and gas production by Pleurotus ostreatus-IE8 and Fomes fomentarius - EUM1 in bagasse cane Actividad fibrolítica y producción de gas por Pleurotus ostreatusIE8 y Fomes fomentarius-EUM1 en bagazo de caña Paulino Sánchez-Santillán,1,5 Ph.D, Marcos Meneses-Mayo,2* Ph.D, Luis Miranda-Romero,3 Ph.D, Eduardo Santellano-Estrada,4 Ph.D, Baldomero Alarcón-Zúñiga,3 Ph.D. Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo. Carretera México-Texcoco, Km 36.5, Montecillo, Estado de México, México, C.P. 56230. 2Universidad Anáhuac México-Norte, Facultad de Ciencias de la Salud (Nutrición), Av. Universidad Anáhuac No 46, Colonia Lomas Anáhuac Huixquilucan, Estado de México, México, C.P. 52786. 3Universidad Autónoma Chapingo, Departamento de Zootecnia. Carretera México-Texcoco, Km 38.5, Chapingo, Estado de México, México, C.P. 56230. 4Universidad Autónoma de Chihuahua, Facultad de Zootecnia. Periférico Francisco R. Aldama, km 1, Chihuahua, Chihuahua, C.P. 31543. 5Universidad Autónoma de Guerrero, Unidad Académica de Medicina Veterinaria y Zootecnia N°2, Carretera Acapulco Pinotepa Nacional Kilómetro 197, Cuajinicuilapa, Guerrero, México, C.P. 41940 *Correspondence: marcos.meneses@anahuac.mx 1

Received: February 2015; Acepted: May 2015.

ABSTRACT Objective. To characterize the fibrolytic enzymatic activity of Pleurotus ostreatus-IE8 and Fomes fomentarius-EUM1 in sugarcane bagasse (BCA); to evaluation of the kinetics of in vitro production of BCA treated by solid fermentation (FS), crude enzyme extract (ECE) of P. ostreatus-IE8 and Fibrozyme®. Materials and methods. In fungi measured radial growth rate ( Vcr ) and biomass production in two culture media (with or without nitrogen source); activity of xylanases, cellulases and FS on BCA at 0, 7 and 15 d. The chemical analysis and kinetic analysis of in vitro gas production in 4 treatments (ECE adding enzymes obtained from the direct addition FS or FS ), witness (Fibrozyme®) and a control without addition and analyzed by a was completely randomized design. Results. Xylanases (7 d ) showed 6.32 and 5.50 UI g-1 initial substrate dry weight (SSi) for fungi P. ostreatus-IE8 and F. fomentarius-EUM1 , respectively ; P. ostreatus-IE8 scored higher activity of laccases (10.65 g -1 UI SSi) and F. fomentarius-EUM1 (1.90 UI g-1 SSi) cellulases. The ECE of P. ostreatus-IE8 and commercial enzyme did not differences (p>0.05). In the chemical composition or the gas production kinetics. The 4 treatments evaluated decreased values of the variables measured in the kinetics of gas production compared to the control (p≤0.05). Conclusions. The ECE of P. ostreatus-IE8 was similar to commercial enzyme degradation in vitro, so it is feasible to use pre-digest high fiber products. Key words: Fibrolytic enzymes, in vitro digestibility, solid fermentation, sugarcane bagasse (Source: DeCS).

RESUMEN Objetivos. Caracterizar la actividad enzimática fibrolítica de Pleurotus ostreatus-IE8 y Fomes fomentarius-EUM1 en bagazo de caña de azúcar (BCA) y evaluar la cinética de producción de gas in vitro del BCA por fermentación sólida (FS) o con extractos crudos enzimáticos (ECE) de P. ostreatus-IE8 4907

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o Fibrozyme®. Materiales y métodos. En los hongos de estudio se evaluó la velocidad de crecimiento radial (Vcr) y producción de biomasa en dos medios de cultivo (con o sin fuente de nitrógeno); actividad de xilanasas, celulasas y lacasas de la FS sobre BCA a 0, 7 y 15 d. El análisis químico y cinética de producción de gas in vitro en 4 tratamientos (proceso de FS o adición de enzimas obtenidas de ECE de la FS), un testigo (Fibrozyme®) y un control sin adición de enzimas, todo ello se analizó en un diseño completamente al azar. Resultados. Las xilanasas (7 d) mostraron 6.32 y 5.50 UI g-1 sustrato seco inicial (SSi) en P. ostreatus-IE8 y F. fomentarius-EUM1, respectivamente. P. ostreatus-IE8 mostró mayor actividad lacasa (10.65 UI g-1 SSi) y F. fomentarius-EUM1 (1.90 UI g-1 SSi) de celulasas. El ECE de P. ostreatus-IE8 y Fibrozyme® no presentaron diferencias (p>0.05) en la composición química ni en la cinética de producción de gas. Los 4 tratamientos evaluados disminuyeron los valores de las variables medidas en la cinética de producción de gas in vitro respecto al testigo (p≤0.05). Conclusiones. El ECE de P. ostreatus-IE8 fue similar a Fibrozyme® en la degradación in vitro, indicando su viabilidad y uso para pre-digerir subproductos altos en fibra. Palabras clave: Bagazo de caña de azúcar, digestibilidad in vitro, enzimas fibrolíticas, fermentación sólida (Fuente: DeCS).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The cell wall composition of sugarcane bagasse (SCB) has repercussions in ruminal digestion, considered to be relatively slow and incomplete. The nutritional value of SCB is low, and adding it as an ingredient to feed increases production costs. Biotechnological studies have shown that a combination of physical, chemical and biological treatments increase digestibility and nutritional quality of agro industrial byproducts (including SCB). Results are vary though (1). Okano et al (2) indicates that an option to increase the chemical availability of nutrients and the assimilation of byproducts of lignocellulosic fungi is solid fermentation (SF) and the use of fibrolytic exogenous enzymes, natural to these microorganisms and that are produced through liquid fermentation or in solid state (3).

La composición de la pared celular del bagazo de caña de azúcar (BCA) está implicada directamente en la digestión ruminal, por considerarse relativamente lenta e incompleta. El valor nutritivo del BCA es bajo y su inclusión como ingrediente en dietas aumenta los costos de producción. Estudios biotecnológicos demuestran que una mezcla de tratamientos físicos, químicos y biológicos mejora la digestibilidad y calidad nutritiva de los subproductos agroindustriales (incluido el BCA), pero los resultados son variables (1). Okano et al (2) indican que una alternativa para mejorar la disponibilidad química de sus nutrientes y la asimilación de los subproductos por hongos lignocelulósicos es la fermentación sólida (FS) y el uso de enzimas fibrolíticas exógenas propias de estos microorganismos que producen mediante fermentaciones líquidas o en estado sólido (3).

The physiological and morphological characteristics of filamentous fungi allow for a good production of fibrolytic extracellular enzymes through SSF. Cellulase are enzymes that hydrolyze glyosidic bonds β-1,4 found in polysaccharides of cellulose. Xylanase acts in synergy and in sequence on the xylan structure to degrade it into constitutive sugar (4), and laccase, are polyphenol oxidase enzymes that oxidize phenolic compounds, the main element in lignin (5). The objective of this research is to characterize the fibrolytic enzymatic activity of a P. ostreatus-IE8 and F. fomentarius-EUM1culture in sugarcane bagasse; characterize the chemical composition and in vitro fermentation of SCB treated by SF, resulting in CEE of P. ostreatusIE8 and to compare it with a commercial extract.

Las características fisiológicas y morfológicas de los hongos filamentosos permiten una buena producción de enzimas extracelulares fibrolíticas obtenidas por FS. Las celulasas son enzimas que hidrolizan enlaces glucosídicos β-1,4 en los polisacáridos de la celulosa; las xilanasas actúan de manera sinérgica y secuencial en la estructura del xilano para degradarlo en azúcares constitutivos (4) y las lacasas son enzimas polifenol-oxidasas que oxidan compuestos fenólicos, constituyentes principales de la lignina (5). El objetivo de este estudio fue caracterizar la actividad enzimática fibrolítica del cultivo de los hongos P. ostreatus-IE8 y F. fomentariusEUM1 en bagazo de caña de azúcar, así como su composición química y fermentación in vitro del BCA tratado por FS, obtención de ECE de P. ostreatus-IE8 y su comparativo con un extracto comercial.

Sánchez-Santillán - Fribrinolytic activity and in vitro fermentation of baggase cane

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MATERIALS AND METHODS

MATERIALES Y MÉTODOS

Research Site. The investigation was conducted in the Microbiology Laboratory of the Zootechnic Department at the Universidad Autonoma Chapingo, and the Colegio de Posgraduados, both in the State of Mexico.

Sitio de estudio. El trabajo fue realizado en los laboratorios de Microbiología del Departamento de Zootecnia de la Universidad Autónoma Chapingo, y en el Colegio de Postgraduados, ambos del Estado de México.

Inoculation. Two strains of Pleurotus ostreatus-IE8 and Fomes fomentarius-EUM1were used, both with the capacity to produce lignocellulosic enzymes. The EUM1 strain was taken from cultures available at the Universidad Autonoma Metropolitana and strain IE8 from the Colegio de Posgraduados.

Inóculos. Se utilizaron dos cepas de los hongos Pleurotus ostreatus-IE8 y Fomes fomentariusEUM1, ambas con potencial para producir enzimas lignocelulósicas. La cepa EUM1 fue obtenida de la colección de cultivos de la Universidad Autónoma Metropolitana y la cepa IE8 del Colegio de postgraduados.

Culture Medium. The strains were reactivated in an agar-malt extract and propagated in an initiating substrate using a mixture of sorghum grain and SCB in a ratio of 80:20, to be used later in the SF with SCB. Experiments. Two experiments were conducted: The first one evaluated the enzymatic activity, radial speed growth (rsg), and biomass of the P. ostreatus-IE8 and F. fomentarius-EUM1 fungi strain. The second one determined the kinetics of in vitro fermentation using the gas production technique (6) of the SCB treated for 7 d with SF with the P. ostreatus-IE8 strain - evaluation of the CEE for 7 d with P. ostreatus-IE8-. These were compared with a commercial enzyme (Fibrozyme®, Alltech Inc., Nicholasville, KY) and a control, as well as the chemical composition of the treatments, controls and study control. Determining the radial speed growth (rsg) and the dry matter of biomass. The rsg for both strains was measured for 7d in two culture mediums using the Trinci method (7): Medium 1 (M1) with sugarcane bagasse extract (BE) obtained by boiling 100 g of SCB in 1 L of distilled water for 30 min. Agar-agar (1.5%) and caseine peptone (0.5%) were added. Medium 2 (M2) had BE and agar-agar (1.5%) without caseine peptone. The P. Ostreatus strain was incubated at 25°C and the F. fomentarius-EUM1 strain at 36°C. The dry mass of the biomass that grew after 7 days of incubation in mediums M1 and M2 were separated from the agar boiling it in distilled water and drying it for 24 hours at 60°C. The effect of mycelial growth on the culture methods evaluated (M1 and M2) was analyzed in a completely randomized experimental design with a 22 factorial arrangement. Data was analyzed with the GLM procedure of SAS® and means were compared with Tukey test (p≤0.05) to differentiate groups. Solid medium fermentation. SF with each strain was done by placing 40 g of SCB (0.5 cm Ø and 85% moisture) in an Erlenmeyer flask. It was then

Medio de cultivo: Las cepas fueron reactivadas inicialmente en agar-extracto de malta y se propagaron en un sustrato de inicio empleando una mezcla de grano de sorgo-BCA en una relación 80:20, para su posterior uso en la FS con BCA. Experimentos. Se realizaron dos experimentos: en el primero se evaluó la actividad enzimática, velocidad de crecimiento radial (Vcr) y biomasa de las cepas de los hongos P. ostreatus-IE8 y F. fomentarius-EUM1. En el segundo se determinó la cinética de fermentación in vitro por la técnica de producción de gas (6) del BCA tratado 7 d por FS con las cepas de hongos P. ostreatus-IE8, evaluación del ECE de 7 d con P. ostreatus-IE8, y fueron comparados con una enzima comercial (Fibrozyme®, Alltech Inc., Nicholasville, KY) y un testigo, además de evaluar la composición química de los tratamientos, control y testigo de estudio. Determinación de la velocidad de crecimiento radial (Vcr) y de la MS de la biomasa. La Vcr para ambas cepas se midió durante 7d en dos medios de cultivo usando el método de Trinci (7): Medio 1 (M1) con extracto de bagazo de caña de azúcar (EB) obtenido al hervir 100 g de BCA en 1 L de agua destilada por 30 min más agar-agar (1.5%) y peptona de caseína (0.5%); y Medio 2 (M2) con EB y agar-agar (1.5%) sin peptona de caseína. La cepa P. ostreatus se incubó a 25°C y 36°C para F. fomentarius-EUM1. La MS de la biomasa que creció a los 7 d de incubación en los medios M1 y M2 se separó del agar hirviéndolos en agua destilada y secando por 24 h a 60°C. El efecto del crecimiento micelial en los medios de cultivo evaluados (M1 y M2) se analizó en un diseño experimental completamente al azar con un arreglo factorial 22. Los datos se analizaron con el procedimiento GLM de SAS® (8) y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05) para diferenciar entre grupos.

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sterilized for 15 min at 15 PSI and 121°C. The inoculation was done with 10 agar-malt extract cylinders with mycelium (1 cm Ø) of P. ostreatusIE8 incubated at 25°C and 36°C for F. fomentariusEUM1. In both cases the SF was evaluated at 0.7 and 15 d. Determining enzymatic activity. In both strains the crude enzymatic extracts (CEE) obtained from SF at 0.7 and 15 days of fermentation were evaluated (four independent samples were gathered per day). The CEE was obtained by macerating the solid ferment of each strain for 20 min in distilled water at a ratio of 1:1.5. This was filtered and pressed by centrifugation for 20 min at 12.000 rpm at 4°C. Xylanase and cellulose activities were determined with the Miller method (9), laccase with ABTS according to Klis et al (10) and extracellular protein following the Bradford method (11). The experimental design used separate areas, divided in time, and was distributed randomly. Data was analyzed with the SAS® GLM procedure (8), and means was compared with the Tukey test (p≤0.05) to differentiate days of FS and experimental strains. The extracellular protein and laccase variables were transformed at logarithmic scale (y+1) to ensure data normality. Enzymatic activity was expressed in international units (IU) per gram of initial dry substrate (IDS) in which one IU was defined as the quantity of enzymes released by 1 µmol xylose or glucose per min under the reaction conditions indicated. Evaluation of in vitro kinetic fermentation of SCB. Four treatments were evaluated, one control, each in a Erlenmeyer flask with 100 g SCB as substrate (0.5 cm Ø and 85% moisture), sterilized for 20 min at 15 PSI and 121°C. A determined amount of freshly collected microbial inoculum, SCB fermented for 7 d, CEE from the 7th day SF, commercial cellulase (Fibrozyme®) as control and a control without enzymes. Treatments were classified as: FSi: 5 g of freshly collected inoculum from strain P. ostreatus-IE8; FSc: 5 g of SF (7d) in SCB with strain P.ostreatus-IE8; FS-ECE: 5 g of freshly collected inoculum from strain P. ostreatusIE8 and 1.9 mL of CEE from SF (7d) from the same strain. CEE: 1.9 mL of CEE from FS (7d) of strain P. ostreatus-IE8; Control: 0.2 mL of commercial enzyme (Fibrozyme®); control: SCB without inoculum. The inoculum P. ostreatus-IE8 was obtained by spreading the strain on sorghum grainSCB substrate in a proportion of 80:20, respectively. The SF and CEE were obtained at 7 d fermentation with P. ostreatus-IE8. The 7d Solid Fermented CEE and the commercial xylanase both showed the same results of 8.5 IU of xylanase; corresponding to diluting 1 g of commercial xylanase in 10 mL of distilled water (1 g kg-1 MS). The CEE treatments

Fermentación en medio sólido. La FS con cada cepa se realizó colocando 40 g de BCA (0.5 cm Ø y 85% de humedad) en un matraz Erlenmeyer y se esterilizó por 15 min a 15 PSI y 121°C. La inoculación se realizó con 10 cilindros de agarextracto de malta con micelio (1 cm Ø) de P. ostreatus-IE8 que se incubó a 25°C y 36°C para F. fomentarius-EUM1; en ambos casos la FS se evaluó durante 0, 7 y 15 d. Determinación de actividad enzimática. Para ambas cepas se evaluaron los extractos crudos enzimáticos (ECE) obtenidos de la FS a 0, 7 y 15 d de fermentación (se obtuvieron cuatro muestras independientes por tiempo). Los ECE se obtuvieron macerando el fermentado sólido de cada cepa durante 20 min con agua destilada en una relación 1:1.5, se filtraron y se prensaron para posteriormente centrifugar por 20 min a 12.000 rpm y 4°C. La actividad de xilanasas y celulasas se determinó por el método de Miller (9), lacasas con ABTS según Klis et al (10) y proteína extracelular según Bradford (11). El diseño experimental fue de parcelas divididas en el tiempo distribuido completamente al azar. Los datos se analizaron con el procedimiento GLM de SAS® (8) y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05) para diferenciar entre días de FS y cepas experimentales. Las variables proteína extracelular y lacasas se transformaron a escala logarítmica (y+1) para cumplir con la normalidad de los datos. La actividad enzimática se expresó en unidades internacionales (UI) por gramo de sustrato seco inicial (SSi), donde una UI se definió como la cantidad de enzima que libera 1 µmol de xilosa o glucosa por min en las condiciones de reacción indicadas. Evaluación de la cinética de fermentación in vitro del BCA. Se evaluaron 4 tratamientos, un control y un testigo cada uno en matraces Erlenmeyer con 100 g BCA como sustrato (0.5 cm Ø y 85% de humedad) esterilizados 20 min a 15 PSI y 121°C; posteriormente a estos se les añadió una cantidad conocida de inóculo microbiano fresco, BCA fermentado durante 7d, ECE del día siete de FS, celulasa comercial (Fibrozyme®) como testigo y un control sin enzima. Los tratamientos se clasificaron como: FSi: 5 g de inóculo fresco de la cepa P. ostreatusIE8; FSc: 5 g de FS (7d) en BCA con cepa P.ostreatus-IE8; FS-ECE: 5 g de inóculo fresco de la cepa P. ostreatus-IE8 y 1.9 mL de ECE del FS (7d) de la misma cepa; ECE: 1.9 mL de ECE del FS (7d) de la cepa P. ostreatus-IE8; Testigo: 0.2 mL de enzima comercial (Fibrozyme®); Control: BCA sin inóculo. El inóculo de P. ostreatusIE8 se obtuvo al propagar la cepa en sustrato

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(1.9 Ml) had: 1.7 IU of xylanase and 0.01 cellulase. All samples were fermented for 7 d at 25°C, they were dried for 96 h at 60°C for nutrient analysis. An analysis was made on: dried matter (DM), ash, organic matter (OM), crude protein (CP), hemicellulose, cellulose, lignin acid detergent (LAD) according to AOAC (12), neutral detergent fiber (NDF) and acid detergent fiber (ADF) according to Van Soest, et al (13). The kinetics of gas production was done with the Menke and Steigass method (6). A 0.5 g sample of a treatment and 90 mL of standardized ruminant inoculum were placed in ambar glasses with a flow of CO2. The glasses were placed on a double boiler at 39°C. Gas pressure was measured at 0, 2,4,10, 14, 18, 24, 30, 36, 48, 60 and 72 h of incubation. The transformation from pressure to gas volume was adjusted with a lineal regression model. The gas production scale (S), maximum volume of produced gas (Vm) and lag time (L) were obtained through the logistic model Va=Vm/ (1+ exp(2-4*S*(T-L))) (14). The final residues were filtered in ANKOM bags and dried for 24 h at 60°C. DM degradation (DEGMS) and real degradation (DEGV) (15) were calculated. The experimental design was a random element. Data was analyzed using the GLM procedure of SAS® (8). Means were compared with the Tukey test (p≤0.05). Correlation was calculated using the CORR (8) procedure. Variables L, DEGMS and DEGV were made into square root, while %OM, %AFD and % hemicellulose were transformed using a logarithmic scale (y+1) to fulfill data normality requirements.

RESULTS The RGR of P. ostreatus-IE8 in culture medium without peptone (M2) was superior (p≤0.05) to culture medium with peptone (M1), while fomentarius-EUM1did not show any difference between the culture mediums evaluated (p>0.05). Strains comparison did not show significant differences either (p>0.05). The biomass content was higher for F. fomentarius-EUM1 (p≤0.05) in both culture mediums (Table 1). Table 1. Radial growth velocity (Rgv) and biomass produced by P.ostreatus -IE 8 and F. fomentarius-EUM1 fungi in culture medium with and without casein peptone (0.5%). Strain F. Fomentarius-EUM1 P. Ostreatus IE8

Medium

Rgv (mm h-1)

Biomass (mg)

0.618

53.0a

0.613

48.0ab

0.406b

33.8b

0.616a

37.5ab

a a

Means in row with different text are different (p≤0.05) * Formulated with sugarcane bagasse and agar-agar (1.5%); M1, with caseine peptone (0.5%) as nitrogen source; M2 without caseine peptone.

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grano de sorgo-BCA en una proporción 80:20, respectivamente. El FS y ECE se obtuvieron de 7 d de fermentación con P. ostreatus-IE8. El ECE de los 7d de FS y xilanasa comercial se igualaron a 8.5 UI de xilanasas, correspondientes a la dilución de 1 g xilanasa comercial en 10 mL de agua destilada (1 g kg-1 MS). Los tratamientos con ECE (1.9 mL) contenía: 1.7 UI de xilanasas, 0.1 UI de celulasas y 6.4 UI de lacasas, mientras la enzima comercial (0.2 mL) contenía: 1.7 UI de xilanasas y 0.01 UI de celulasas. Todas las muestras se fermentaron 7 d a 25°C, se secaron 96 h a 60°C para el análisis nutrimental. Se realizó un análisis de materia seca (MS), cenizas, materia orgánica (MO), proteína cruda (PC), hemicelulosa, celulosa, lignina detergente ácido (LDA) según AOAC (12), fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácido (FDA) según Van Soest, et al (13). La cinética de producción de gas se realizó por el método de Menke y Steigass (6). En frascos de vidrio color ámbar, con flujo de CO2 se colocaron 0.5 g de muestra de un tratamiento y 90 mL de inóculo ruminal estandarizado. Los frascos se incubaron en baño maría a 39°C. La presión de gas se midió a 0, 2, 4, 10, 14, 18, 24, 30, 36, 48, 60 y 72 h de incubación. La transformación de presión a volumen de gas se ajustó con un modelo de regresión lineal. La tasa de producción de gas (S), volumen máximo de gas producido (Vm) y tiempo Lag (L) se obtuvieron con el modelo logístico Va= Vm/ (1+exp(2-4*S*(T-L))) (14). El residuo final se filtró en bolsas ANKOM y se secaron 24 h a 60°C. Se calculó la degradación de la MS (DEGMS) y degradación verdadera (DEGV; 15). El diseño experimental fue un completamente al azar, los datos se analizaron con el procedimiento GLM de SAS® (8). Las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05). La correlación se calculó con el procedimiento CORR (8). Las variables L, DEGMS y DEGV se transformaron a raíz cuadrada, mientras %MO, %FDA y %Hemicelulosa se transformaron a una escala logarítmica (y+1) para cumplir con la normalidad de los datos.

RESULTADOS La Vcr de P. ostreatus-IE8 en medio de cultivo sin peptona (M2) fue superior (p≤0.05) al medio de cultivo con peptona (M1), mientras que F. fomentarius-EUM1 no mostró diferencias entre medios de cultivo evaluados (p>0.05), y la comparación entre cepas tampoco mostraron diferencias significativas (p>0.05). El contenido de biomasa fue mayor para F. fomentarius-EUM1 (p≤0.05) en ambos medios de cultivo (Tabla 1).

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Table 2 shows that both fungi strains at 7d had increased enzyme activity, xylanase concentration did not vary (p>0.05) between strains on the 7d of SF. The P. ostreatus-IE8 strain had a greater laccase activity (10.65 UI g-1 SSi) at 7d, while F. fomentarius-EUM1 had greater cellulase activity (1.90 UI g-1 SSi) at 7d of SF. The P. ostreatus-IE8 strain produced a higher concentration of extracellular protein coinciding with the 7d of SF (0.52 mg g-1 SSi; Table 2). Table 2. Enzymatic activities and extracellular protein concentration of crude enzyme extract of P. ostreatus-IE8 and F. fomentarius-EUM1 at different solid fermentation days (SF). Strain

F. FomentariusEUM1

P. Ostreatus IE8

Day SF

Xylanase Laccase Cellulase (UI g SSi)

(UI g SSi)

4.24

0.70

0.43

0.18

5.50

0.96

1.90

0.39

4.85

4.52

1.33

0.38

4.05

0.00

0.39

0.23

6.32

10.65

0.55

0.52

3.53

0.17

0.30

0.11

-1

(UI g SSi)

Extracellular protein

-1

(mg g-1 SSi)

Means in row with different letter are different (p≤ 0.05).

Table 3 shows the results of the evolution of maximum gas production volume (Vm), dried matter degradation (DEGMS), and real degradation (DEGV). FSi, FSc and SF-CEE methods had the lowest Vm, DEGM and DEGV values, with no difference among them (p>0.05). CEE treatments and control methods produced values higher than 100 mL g MS-1, with control showing the highest Vm (123.80) mL g MS-1). The CEE and control method did not increase DEGMS and DEGV when compared to the control method. The fractions of NDF, ADF and ash from all methods decreased when compared to the control method (p≤0.05). In contrast, the fractions of LAD, CP and OM increased in comparison to the control method. The methods with added SF of 7d had higher values of LAD, CP and ash (p≤0.05) in relation to those with added enzymes (CEE and control) (Table 4). Table 3. Variables of in vitro gas production from sugarcane bagasse treated with commercial enzymes, solid fermentation or crude enzymatic extract of P. ostreatus-IE8.

En la tabla 2, se muestra que ambas cepas de hongos a los 7d presentaron la mayor actividad de enzimas. La concentración de xilanasas no mostró diferencias (p>0.05) entre cepas en el 7d de FS. La cepa P. ostreatus-IE8 mostró mayor actividad de lacasas (10.65 UI g-1 SSi) al 7d, mientras que F. fomentarius-EUM1 mostró mayor actividad de celulasas (1.90 UI g-1 SSi) para 7d de FS. La cepa P. ostreatusIE8 produjo la mayor concentración de proteína extracelular coincidiendo el 7 d de FS (0.52 mg g-1 SSi; Tabla 2). En la tabla 3, se muestran los resultados de la evolución del volumen máximo de producción de gas (Vm), degradación de la materia seca (DEGMS) y degradación verdadera (DEGV). Los tratamientos FSi, FSc y FS-ECE mostraron los valores más bajos de Vm, DEGMS y DEGV, sin diferencias entre ellos (p>0.05). Los tratamientos ECE, testigo y control produjeron valores mayores a 100 mL g MS -1 , donde control mostró el mayor Vm (123.80 mL g MS1 ). El tratamiento ECE y el testigo no mejoraron DEGMS y DEGV comparados con el control. La fracción de FDN, FDA y cenizas de todos los tratamientos disminuyeron respecto al control (p≤0.05); en contraste, aumentaron la fracción de LDA, PC y MO en comparación al control. Los tratamientos donde se adicionó FS de 7d mostraron valores altos de LDA, PC y cenizas (p≤0.05) en relación aquellos donde se adicionaron enzimas (ECE y testigo) (Tabla 4).

DISCUSIÓN Los hongos basidiomicetos P. ostreatus y F. fomentarius tienen la capacidad de producir simultáneamente enzimas hidrolíticas y Table 4. Nutrient composition of sugarcane bagasse treated with commercial enzyme, solid fermentation and crude enzymatic extract of P. ostreatus-IE8 fungi. Variable

FSi

FSc

SF-CEE

FND (%)

69.25d 71.68bcd 70.25cd

ADF (%)

42.75

LAD (%)

19.38a

20.08a

17.23b

Witness Control

Hemicellulose (%)

26.50

27.68

Vm (mL g MS-1)

47.57e 51.44de 53.03d 113.60b 104.03c 123.80a

Cellulose (%)

23.38c

S (h-1)

0.019c 0.021bc 0.021b

0.028a

0.027a

0.028a

L (h)

12.22b

17.29a

05.37c

12.88b

13.98ab

10.82b

CP (%)

DEGMS (%)

19.85c

20.33c

20.84c

39.25ab

36.25b

42.68a

DEGV (%)

27.41c

28.67c

27.03c

44.59b

44.23b

50.38a

Variable

FSi

FSc

FS-ECE

ECE

Means in row with different letter are different (p≤0.05). FSi: 5 g of de P. ostreatus-IE8; FSc inoculum: 5 g of solid fermentation of SCB with strain P. ostreatus-IE8 (7d); SF-CEE: 5 g of P. ostreatus-IE8 inoculum and CEE from the same strain fermented for 7d; CEE: 1.9 mL of P. ostreatus-IE8 CEE fermented for 7 d; Control: 0.2 mL of commercial enzyme (Fibrozyme®); Control: BCA without inoculum .

CEE

Witness Control 73.48bc

81.20a

44.78

52.17c

15.68c

16.25bc

11.63d

29.20

31.40

28.73

29.03b

23.93c

23.88c

25.95c

28.55b

40.53a

4.28a

3.18b

4.48a

2.68c

2.64c

1.63d

Ash (%)

14.25

14.46

14.05

14.35

13.58

5.30b

OM (%)

85.75a

85.54a

85.95a

85.65a

86.42a

94.70a

44.00

41.08

74.53b 41.65

abc

Means in row with different letter are different (p≤0.05). FSi: 5 g of P. ostreatus-IE8 inoculum; FSc: 5 g of solid fermented SCB with P. ostreatus-IE8 strain (7d); SF-CEE: 5 g of P. ostreatus-IE8 inoculum and CEE from the same strain fermented for 7d; CEE: 1.9 mL of 7 d fermented CEE from P. ostreatus-IE8; Control: 0.2 mL of commercial enzyme (Fibrozyme®); Control: SCB without inoculum.

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DISCUSION Basidiomycete fungi P. ostreatus and F. fomentarius have the capacity to simultaneously produce hydrolytic and lignolitic enzymes by SF (16). Marquez et al (17) conducted an FS test for 14 d at an incubation temperature of 34°C with F. fomentarius-EUM1 on SCB and 80% moisture. Xilanase (147.27 UI g-1 SSi) and cellulase (8.51 UI g-1 SSi) activity was reported, but lower on laccase (3.45 UI g-1 SSi). Membrillo et al (18) used P. ostreatus-IE8 in a SF for 8 d on SCB with a particle size of 2.9 mm and 80% moisture. The xylanase activity was reduced (5.79 U g-1 SSi) as well as laccase (0.021 U g-1 SSi). The SF process has important considerations: particle size, type of substrate, microorganisms, nature of inoculum, temperature and duration (3,4). For those reasons, and based on the results of this research, it is important to consider the enzyme-substrate affinity for this type of biotechnological developments because of the great variations that exist. The chemical characteristics of SCB make it possible for the P. ostreatus-IE8 strain to have great potential to produce laccase enzymes and act specifically on the lignin, while F. fometarius has a greater cellulase production capacity, acting directly on the cellulose on the cell wall of fibrous forages used to feed ruminants (1) It is unknown if adding complex organic nitrogen sources like casein peptone can have an inhibiting effect on radial growth speed and biomass production, given that existing literature only includes mineral nitrogen. Membrillo et al (18) used urea and ammonia sulfate as a source of organic nitrogen in a malt extract medium to grow P. ostreatus-IE8, resulting in inferior rsg (0.234 y 0.308 mm h-1). Levin et al (19) tried using different nitrogen sources for the production of laccase by three basidiomycetes fungi, without finding any differences in the laccase production patterns given the medium composition. Therefore, the addition of nitrogenized sources to culture mediums for the growth of basidiomycete fungi does not increase the fungal rsg or enzyme production (18, 19). The kinetics of in vitro gas production results from the anaerobic fermentation of soluble carbohydrates or cellular wall with microorganisms from the rumen. The FSi, FS-CEE treatments presented less values in the production kinetics of in vitro gas (Table 3) because they result from a fermentation process where P. ostreatus-IE8 consumes soluble carbohydrates and hemicellulose as primary

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lignolíticas por FS (16). Márquez et al (17) realizaron una FS durante 14 d a 34°C de incubación con F. fomentarius-EUM1 sobre BCA con 80% de humedad, reportando una actividad de xilanasas (147.27 UI g-1 SSi) y celulasas (8.51 UI g -1 SSi), pero menor en lacasas (3.45 UI g-1 SSi). Membrillo et al (18) usaron P. ostreatus-IE8 en una FS de 8 d sobre BCA con un tamaño de partícula de 2.9 mm y 80% de humedad, donde obtuvieron menor actividad de xilanasas (5.79 U g-1 SSi) y lacasas (0.021 U g -1SSi). El proceso de FS tiene importantes consideraciones que involucran tamaño de partícula, tipo de sustrato, microorganismo, naturaleza del inóculo, temperatura y duración de la propia FS (3,4). Por lo anterior, y con base en los resultados de esta investigación es importante considerar la afinidad enzimas u s t ra t o p a ra e s t e t i p o d e d e s a r r o l l o s biotecnológicos, ya que existe gran variación en los mismos. Las características químicas del bagazo de caña de azúcar permiten a la cepa del hongo P. ostreatus-IE8 tener un alto potencial para producir enzimas lacasas y actuar específicamente sobre la lignina, mientras que F. fometarius tiene mayor producción de celulasas que actúa directamente sobre la celulosa de la pared celular de forrajes altos en fibra usados comúnmente en la alimentación de rumiantes (1). Se desconoce si la adición de fuentes complejas de nitrógeno orgánico como la peptona de caseína puede tener un efecto inhibitorio en la velocidad de crecimiento radial y producción de biomasa, ya que la literatura sólo indica el uso de nitrógeno mineral. Membrillo et al (18) utilizaron urea y sulfato de amonio como fuente de nitrógeno inorgánico en medios de extracto de malta para el crecimiento de P. ostreatus-IE8, obteniendo valores inferiores de Vcr (0.234 y 0.308 mm h-1). Levin et al (19) probaron el uso de diferentes fuentes de nitrógeno en la producción de lacasas por tres hongos basidiomicetos sin hallar diferencias en los patrones de producción de lacasas por la composición del medio. Por lo anterior, la adición de fuentes nitrogenadas en medios de cultivo para el crecimiento de hongos basidiomicetos, no incrementa la Vcr fúngica o producción enzimática (18, 19). La cinética de producción de gas in vitro se obtiene de una fermentación anaerobia de los carbohidratos solubles o pared celular con microorganismos del rumen. Los tratamientos FSi, FSc y FS-ECE presentaron menores valores en la cinética de producción de gas

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sources of energy for growth (2,20). CEE and the control treatment had a larger amount of carbohydrates available because they were not predigested. The CEE and control treatment showed different behaviors in the gas production kinetics when compared with the control treatment, even when the enzymes produced by SF promotes greater availability of structural and soluble carbohydrates on the cell wall as a result of the degradation of the substrate, producing more gas in in vitro studies (20). The increase of LAD and ash fraction, as well as the decrease of the NDF, ADF, cellulose and OM fraction in the FSi, FSc and SF-CEE treatments are attributed to the fact that the P. ostreatus-IE8 fungi consumes a large amount of carbohydrates, (2) necessary for its development. The increase of CP in the FSi, FSc and SF-CEE treatments is the result of the increase of microbial protein produced directly in the development of the P. ostreatus-IE8 fungi on SCB in the SF process (21). The relation between chemical composition and variables in the kinetics of in vitro gas production are used to estimate the digestibility of a substrate by a ruminant (22). The Vm of gas was positively correlated with NDF, hemicellulose and cellulose, but negatively with LAD (Table 5). Andres et al (23) reported similar findings. His correlations indicate the same tendencies as this study. The negative correlation of CP with the kinetic variable of gas production is explained because the protein is used in the biosynthesis of microbial protein, and in case microorganisms increase their immediate demand for energy, it catabolizes into an energy source. The positive correlation between DEGMS and DEGV with NDF, cellulose and hemicellulose, but negative with LAD and CP are due to the double fermentation process (solid and anaerobic) that the SCB underwent. Bindelle et al (22) reported negative correlations with NDF and positive with CP because they did not apply to the substrates any sort of fermentation previous to the in vitro gas production, allowing for a larger amount of carbohydrates. Table 5. Correlation coefficient in the chemical bromatologic composition and the in vitro sugarcane bagasse gas production. Variables

DEGMS

DEGV

EM 0.486

DMO

FDN

0.789

0.693

0.717

0.712

LAD

-0.867a

-0.837a

-0.850a

-0.809a -0.967a

-0.957a

Hemicellulose

0.654a

0.647a

0.629a

0.610a

0.704a

0.688a

Cellulose

0.787a

0.680a

0.753a

0.711a

0.526a

0.568a

-0.769a

-0.785a

-0.787a

-0.790a -0.298 b -0.226 b

0.507a

Probabilidad significativa (p≤ 0.05); b no significativa (p≥ 0.05).

in vitro (Tabla 3) porque provienen de un proceso fermentativo donde P. ostreatus-IE8 consume carbohidratos solubles y hemicelulosa como primera fuente de energía para su crecimiento (2,20). El tratamiento ECE, control y testigo dispusieron de mayor cantidad de carbohidratos porque no fueron predigeridos. El tratamiento ECE y testigo mostraron diferente comportamiento en la cinética de producción de gas comparada con el control aun cuando las enzimas producidas por FS promueven mayor disponibilidad de carbohidratos estructurales y solubles de la pared celular derivados de la degradación del sustrato, produciendo mayor producción de gas en estudios in vitro (20) El incremento de la fracción LDA y cenizas, además de la disminución de la fracción FDN, FDA, celulosa y MO en los tratamientos FSi, FSc y FS-ECE se atribuyen a que el hongo P. ostreatus-IE8 durante la FS consume un alto contenido de carbohidratos (2) para su desarrollo. El incremento de PC en los tratamientos FSi, FSc y FS-ECE es consecuencia del incremento de proteína microbiana que proviene directamente del desarrollo del hongo P. ostreatus-IE8 sobre el BCA durante el proceso de FS (21). La relación entre composición química y variables de la cinética de producción de gas in vitro se emplean para estimar la digestibilidad de un sustrato por el animal rumiante (22). El Vm de gas se correlacionó positivamente con FDN, hemicelulosa y celulosa, pero negativamente con LDA (Tabla 5); situación similar a lo reportado por Andrés et al (23) ya que sus correlaciones indican las mismas tendencias que en el presente estudio. La correlación negativa de PC con las variables de la cinética de producción de gas, se explica porque la proteína se usa para biosíntesis de proteína microbiana y en caso que los microorganismos incrementen sus requerimientos inmediatos de energía, se cataboliza como fuente de energía. La correlación es positiva en DEGMS y DEGV con FDN, celulosa y hemicelulosa, pero negativa con LDA y PC se deben al doble proceso de fermentación (sólida y anaerobia) al que fue sometido el bagazo de caña de azúcar. Bindelle et al (22) reportaron correlaciones negativas con FDN y positivas con PC porque no aplicaron a los sustratos ningún tipo de fermentación previa a la producción de gas in vitro lo que propicio una mayor disponibilidad de carbohidratos. Esta investigación demuestra que el crecimiento micelial de los hongos Pleurotus ostreatus-IE8

Sánchez-Santillán - Fribrinolytic activity and in vitro fermentation of baggase cane

This research shows that the mycelial growth of the Pleurotus ostreatus-IE8 and Fomes fomentarius-EUM1fungi increases when SCB is added to a conventional culture medium. F. fomentarius-EUM1 and P. ostreatus-IE8 strains have higher enzymatic activity at 7 d of fermentation on SCB. The crude enzymatic extract (7 d) of P. ostreatus-IE8 on SCB showed similar effects on the kinetics of in vitro gas production (72 h incubation) as the commercial enzymatic product (Fibrozyme®). The application of lignocellulolytic or a solid fermentation on SCB reduces the production of in vitro gas and the real degradation of substrate.

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y Fomes fomentarius-EUM1 se incrementa al adicionar extracto de bagazo de caña de azúcar a un medio de cultivo convencional. Las cepas F. fomentarius-EUM1 y P. ostreatusIE8 tienen mayor actividad enzimática a los 7 d de fermentación sobre BCA. El extracto crudo enzimático (7 d) de P. ostreatus-IE8 sobre BCA mostró efectos similares en la cinética de producción de gas in vitro (72 h de incubación) al producto enzimático comercial (Fibrozyme ® ). La aplicación de enzimas lignocelulolíticas o una fermentación sólida en BCA reduce la producción de gas in vitro y la degradación verdadera del sustrato.

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):4917-4928, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Effect of the diet traditional and non-traditional on the respiration and excretion in larvae of white shrimp Litopenaeus vannamei Efecto de la dieta tradicional y no tradicional en la respiración y excreción de larvas de camarón blanco Litopenaeus vannamei María Alejandra Medina-Jasso,1 M.Sc, Juan Francisco Arzola-González,2 Ph.D, Pablo Piña-Valdez,1,2,* Ph.D, Mario Nieves-Soto,1,2 Ph.D. Universidad Autónoma de Sinaloa, Programa Regional para el Doctorado en Biotecnología. Facultad de Ciencias Químico-Biológicas. Av. de Las Américas y Blvd. Universitarios s/n. Ap. Postal 1354. Culiacán, Sinaloa, México. 2Universidad Autónoma de Sinaloa, Facultad de Ciencias del Mar. Av. Paseo Claussen s/n. Ap. Postal 610. Mazatlán, Sinaloa, México. *Correspondencia: pablopina@live.com.mx 1

Received: August 2014; Acepted: February 2015.

ABSTRACT Objetive. It was studied the respiration and ammoniacal excretion of zoeas and mysis of Litopenaeus vannamei fed with the diet used traditionally (of microalgae and nauplios of artemia) and another alternative (not traditional) of microalgae with rotifers. Materials and methods. After four hours the oxygen consumption and ammonia excretion in BOD bottles with 60 larvae (closed respirometers) was estimated. The concentrations of O2 and NH4+ were measured with an electrode polarográfico in the first case and with the indophenol blue technique for the second. Results. In zoea, oxygen consumption increased with development and showed statistical differences (p=0.023). In mysis, the oxygen consumption were significance in the traditional diet, whereas no differences were alternative (p=0.003). In both stages for the ammoniacal excretion increased development stage and there were detected statistical difference (p<0.001), although to the diets were not noticed significant differences. Conclusions. A higher energy absorption for zoea (I, II y III) what mysis (I, II y III) larvae was obtained, this is likely an interaction between rates of respiration and excretion caused by variations in the efficiency of absorption by the larvae. The weights obtained in both larvae were not supplied with differences between diets. Key words: Ammonia, brachionus plicatilis, oxygen, white shrimp (Fuente: MeSH).

RESUMEN Objetivo. Se analizó la respiración (O2) y excreción amoniacal (NH4+) en larvas zoea y mysis de camarón blanco Litopenaeus vannamei, alimentadas con las dietas tradicionales (microalgas y nauplios de artemia) y no tradicionales (microalgas y rotíferos). Materiales y métodos. A las cuatro horas de experimentación se estimó el consumo de oxígeno y la excreción de amonio en botellas BOD con 60 larvas (respirómetros cerrados). La concentración de O2 se midió con un electrodo polarográfico y la NH4+ se determinó con la técnica de azul de Indofenol. Resultados. En zoea, el consumo de oxígeno incrementó con el desarrollo y se presentaron diferencias estadísticas (p=0.023). En mysis, los 4917

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consumos de oxígeno presentaron una significancia entre la dieta tradicional, mientras en la alternativa no se obtuvieron diferencias (p=0.003). La excreción en ambos estadios larvales aumentó con la fase y se detectaron diferencias estadísticas (p<0.001), aunque no se registraron diferencias significativas en las larvas respecto a las dietas suministradas. Conclusiones. Se obtuvo una absorción de energía superior para las zoea (I, II y III) que mysis (I, II y III), esto probablemente a una interacción entre las tasas de respiración y de excreción provocada por variaciones en la eficiencia de absorción de las larvas. Los pesos obtenidos en ambas larvas no resultaron con diferencias entre las dietas suministradas. Palabras clave: Amonio, brachionus plicatilis, oxígeno, camarón blanco (Fuente: MeSH).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

In Mexico, shrimp culture has been based solely on post larvae of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei produced under commercial laboratory conditions. Penaeid shrimp in laboratory conditions are adequately fed during larvae development both in quality and quantity in order to keep the larvae alive and ensure morphologic changes in larvae substrates from nauplius to post larvae (1).

En México, el cultivo del camarón se ha basado únicamente en la utilización de postlarvas de camarón blanco del Pacífico Litopenaeus vannamei producidas en condiciones de laboratorio comercial. En los camarones peneidos bajo condiciones de laboratorio, su alimentación durante el desarrollo de las larvas están relacionados con una adecuada alimentación en calidad y cantidad suficiente para mantener la supervivencia de las larvas y asegurar los cambios morfológicos entre los subestadios larvales desde nauplio hasta postlarva (1).

Presently, commercial diets are available that constitute alternatives to live diet based on microalgae (2,3) where these diets play a fundamental role as feeding complements for zoea larvae of L. vannamei. However, due to characteristics such as nutritional composition, digestibility, presentation, floatability and above all ease of ingestion, they have not yet been optimized for the constant demand created by larva cultivators (4). Additionally, satisfactory results have not been obtained and therefore the producers continue to require live feed (micro algae) at least during the first stages of larvae development of L. vannamei white shrimp (5). Due to the above and the uncertain market in the demand of artemia cysts to obtain nauplius feed for mysis larvae, production laboratories could eventually not be able to meet the demand for post larvae penaeid shrimp, which could lead to a serious problem for the shrimp sector as it strives to provide larvae feed. An urgent and necessary alternative is to use diets for shrimp larvae based on microorganisms that can substitute artemia nauplius such as copepods and (6) rotifers (7,8). Rotifers are an important feeding source for shrimp larvae since they have high dietary value (9). Production techniques for mass cultivation of Brachionus plicatilis and Brachionus rotundiformis rotifers has been described, which makes these microorganisms probable alternatives to feeding for the first stages of the life cycle of penaeid shrimp, in particular during the mysis stage (8,9), as well as fish alevin (10). However, for rotifers, larvae or microscopic water species there are

Hoy en día, existen dietas comerciales disponibles como alternativas del alimento vivo a base de microalgas (2,3), donde estas dietas juegan un papel fundamental como complementos del alimento para las larvas zoea de L. vannamei; sin embargo, por sus características en su composición nutritiva, digestibilidad, presentación, flotabilidad y sobre todo su facilidad de ingestión, no han sido todavía optimizados por la constante demanda de los larvicultores (4), además, tampoco se han obtenido resultados satisfactorios y con ello continúan los productores requiriendo del alimento vivo (microalgas), al menos durante las primeras etapas del desarrollo larval del camarón blanco L. vannamei (5). Por lo anterior y debido a la incertidumbre en el mercado por la demanda de quistes de artemia para la obtención de nauplios como alimento para las larvas mysis, podría en un determinado tiempo no abastecer la demanda por los laboratorios de producción de postlarvas de camarones peneidos, resultando posiblemente la alimentación en las larvas en un grave problema para el sector camaronícola. Una alternativa urgente y necesaria es utilizar posibles dietas para larvas de camarón a base de microrganismos que puedan sustituir a los nauplios de artemia como son los copépodos (6) y rotíferos (7,8). Los rotíferos constituyen una importante fuente de alimentación para larvas de camarón por presentar un alto valor dietético (9), incluso se

Medina-Jasso - Respiración y excreción en larvas

hydrologic factors that are of interest, such as temperature, pH, salinity and dissolved oxygen, among others, that can alter physiological processes such as respiration and ammoniacal excretion (11) in those aquatic organisms. However, it is not only necessary to propose new alternative diets that can substitute at some point the artemia nauplius for rotifer, but also what implications this has in larvae and how this affects these microorganisms in physiological processes such as, among others, respiration and ammoniacal excretion in L. vannamei Larvae. Studies exist that analyzed the oxygen consumption and ammoniacal excretion in white shrimp post larvae using feed that is not alive (11,12). However, in L. vannamei larvae investigations have not been done on the effect that traditional feed (microalgae and artemia nauplius) and non-traditional feed (microalgae and B. plicatilis rotifer) have on respiration and excretion of zoea and mysis larvae in white shrimp. Therefore, the objective was to analyze the consumption of oxygen and ammonia excretion in zoea and mysis larvae of L. vannamei white shrimp fed with different diets (microalgae and artemia nauplius and microalgae and rotifer) under laboratory conditions.

MATERIALS AND METHODS Support cultures. The species used as support cultures, such as microalgae, rotifer and artemia, were Chaetoceros muelleri, Brachionus plicatilis y Artemia franciscana, respectively. The strains of microalgae were provided by the collection from the Centro de Investigaciones Científicas y de Estudios Superiores de Ensenada (CICESE), rotifer was provided by the Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR) and artemia cysts were acquired from a commercial business. The techniques used to cultivate the microalgae (13), rotifer (8) and to decapsulate the artemia cysts and obtain nauplius (14) followed what was proposed by those authors. The larvae correspond to one lot of L. vannamei in nauplius III and were provided by a commercial laboratory in the south of Sinaloa, Mexico. The larvae were transported for a period of 2 h in a container in plastic bags with seawater (35ups) filtered, oxygenated to saturation, and between 26 and 27°C. Experiment design. In the laboratory larvae were acclimatized (1°C/h) to the experiment temperature and salinity (29±0.2°C and 35ups) and were placed in a 250 L recipient with filtered seawater to 1 µm and treated with activated

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han descrito técnicas de producción para el cultivo de los rotíferos Brachionus plicatilis y Brachionus rotundiformis en condiciones masivas, lo que ubica a estas especies de microorganismos como probables alternativas de alimentación para las primeras etapas del ciclo de vida de los camarones peneidos, en particular al estadio de mysis (8,9), así como alevines de peces (10). Sin embargo, para los rotíferos, larvas o especies acuáticas microscópicas, existen algunos factores hidrológicos de interés como temperatura, pH, salinidad y oxígeno disuelto, entre otros, que pueden alterar sus procesos fisiológicos como son la respiración y excreción amoniacal (11) en dichos organismos acuáticos mencionados. Aunque, no solamente es necesario proponer nuevas dietas alternativas que puedan sustituir en un determinado momento a los nauplios de artemia por los rotíferos, sino que implicaciones tienen en las larvas y como afectan estos microorganismos en algunos de sus procesos fisiológicos como son entre otros, la respiración y la excreción amoniacal en larvas de L. vannamei. Existen algunos estudios donde se analizó el consumo de oxígeno y la excreción amoniacal en postlarvas de camarón blanco utilizando alimento no vivo (11,12). Sin embargo, en larvas de L. vannamei no se han realizado investigaciones sobre el efecto de la alimentación tradicional (microalgas y nauplios de artemia) y no tradicional (microalgas y rotíferos B. plicatilis) sobre la respiración y excreción en larvas zoea y mysis de camarón blanco. Por lo tanto, como objetivo se analizó el consumo de oxígeno y la excreción amoniacal en larvas zoea y mysis de camarón blanco L. vannamei alimentadas con diferentes dietas (microalgas y nauplios de artemia y microalgas y rotíferos) bajo condiciones de laboratorio.

MATERIALES Y MÉTODOS Cultivos de apoyo. Las especies utilizadas para los cultivos de apoyo como microalgas, rotíferos y artemias, correspondieron a Chaetoceros muelleri, Brachionus plicatilis y Artemia franciscana, respectivamente. Las cepas de microalgas fueron proporcionadas por la colección del Centro de Investigaciones Científicas y de Estudios Superiores de Ensenada (CICESE), los rotíferos por el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR) y los quistes de artemia fueron adquiridos de una empresa comercial. Las técnicas utilizadas para el cultivo de microalgas (13), rotíferos (8) y la descapsulación de quistes de artemia y su obtención de nauplios (14), fue de acuerdo con lo propuesto por estos autores. Las larvas correspondieron a un mismo lote de L. vannamei en fase de nauplio III y fueron

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carbon. They were constantly aerated with bubbles and the air was filtered to 1 µm. The larvae was maintained with daily water changes of 25 to 30% and bio deposits were eliminated by a syphon protected with a Nytex screen of 200 µm.

proporcionadas por un laboratorio comercial ubicado al sur de Sinaloa, México. Las larvas fueron transportadas por un período de 2 h en un contenedor en bolsas de plástico con agua de mar (35ups) filtrada, oxígeno a saturación y temperatura de 26 a 27°C.

When the larvae were in zoea I to mysis III stages they were concentrated in a submerged sieve and were later placed in four recipients of 15 L (aquarium) to a density of 100 larvae/L (1500 larvae/aquarium). Afterwards the concentration of the feed was verified. Initially, 50 larvae were obtained per phase and the dry unit weight (PSU) and the organic unit weight (POU) of the larvae were estimated. Additionally, the PSU and PSO per individual was estimated for the microalgae, rotifer and artemia nauplius; these groups were concentrated separately in 25 mm Whatman GF/C fiberglass filters, previously calibrated. The PSU and PSO of the microalgae was expressed in pg/cel-1 (pg=picograms). In the aquariums, the elimination of the excess feed and feces were extracted by a syphon protected by a 250 µm nylon NITEX meshing to impede the exit of zoea larvae and 600-700 µm for mysis.

Diseño experimental. En el laboratorio, se aclimataron las larvas (1°C/h) a la temperatura y salinidad experimental (29±0.2°C y 35ups) y se colocaron en un recipiente de 250 L con agua de mar filtrada a 1 µm y tratada con carbón activado, se le adicionó constantemente aireación por burbujeo y el aire fue filtrado a 1µm, las larvas fueron mantenidas con recambios de agua diarios del 25 al 30% y la eliminación de los biodepósitos se obtuvieron con un sifón protegido por una malla nytex de 200 µm.

The estimation of oxygen consumption and ammonium excretion was determined separately in zoea and mysis larvae. In zoea, a total of 102 300 ml BOD bottles were used, of which, 32 bottles corresponded to each sub phase (Zoea I, II y III) with 60 larvae (closed respirometers), whose sole feed was microalgae (C. muelleri), and six bottles were considered control (no larvae). In mysis, a total of 204 300 ml BOD bottles were used, corresponding to 64 bottles for each sub phase (mysis I, II and III) with 60 larvae (closed respirometers), and four bottles were considered control. Of these 64 bottles, 32 were fed with microalgae –C. muelleri- and artemia nauplius (ma+nau) and 32 bottles with microalgae diet –C. muelleri- and rotifer (ma+rot). All the bottles with both larvae phases were kept in a rectangular fiberglass recipient (124x60x19 cm) with water recirculated with a LITTLE GIANT pump submerged to 1/16 Hp and a constant temperature of 29°C with a heater and FINNER HC-0800 thermoregulator. Determining the oxygen consumption and ammoniacal excretion for each bottle of the zoea and mysis larvae was recorded four hours after beginning the experimental phase. The concentration of oxygen was directly measured in each bottle with an oximeter and an ORION polarographic electrode. To estimate the consumption of oxygen for each control, the

Cuando las larvas fueron presentando los estadios desde zoea I a mysis III, se concentraron en un tamiz sumergido, después fueron colocadas en cuatro recipientes de 15 L (acuarios) a una densidad de 100 larvas/L (1500 larvas/acuario), después se verificó la concentración del alimento. Inicialmente se obtuvieron 50 larvas por estadio y se estimó el peso seco unitario (PSU) y el peso orgánico unitario (POU) de las larvas. Además, se realizó la estimación del PSU y PSO por individuo para las microalgas, rotíferos y nauplios de artemia; para estos grupos, se concentraron por separado en filtros de fibra de vidrio Whatman GF/C de 25 mm de diámetro previamente calibrados. El PSU y PSO de las microalgas fue expresado en pg/cel -1 (pg=picogramos). En los acuarios la eliminación del excedente del alimento y las heces, fueron extraídas por un sifón protegido por una malla naylon NITEX de 250 µm para impedir la salida de las larvas zoea y de 600-700 µm para mysis. La estimación del consumo de oxígeno y de la excreción de amonio, se determinó por separado en las larvas zoea y mysis. En zoea, se utilizaron en total 102 botellas BOD de 300 ml, de las cuales, 32 botellas correspondieron a cada subestadio (zoea I, II y III) con 60 larvas (respirómetros cerrados), su alimentación fue únicamente microalgas (C. muelleri), más seis botellas que fueron consideradas como testigos (sin larvas). En mysis, se utilizaron en total 204 botellas BOD de 300 ml, correspondiendo a 64 botellas por cada subestadio (mysis I, II y III) con 60 larvas (respirómetros cerrados), más cuatro botellas como testigos. De estas 64 botellas, 32 fueron alimentadas con microalgas –C. muelleri- y nauplios de artemia (ma+nau) y 32 botellas con la dieta de microalgas –C.

Medina-Jasso - Respiración y excreción en larvas

differences in the average of oxygen in the control bottle (without larvae) was subtracted from the average amount of oxygen in the bottles with larvae, thus obtaining the average amount of oxygen consumed by the larvae. To estimate the consumption per larva, the amount of oxygen consumed in each bottle was divided among the number of larva (60 larvae) contained in each bottle, thus obtaining the oxygen consumption per larva (12,15,16), the oxygen consumed was expressed as µg O2/larva-1/h-1. Later, the oxygen consumption per larva was converted into units of energy under the supposition that 1 mg of O2 consumed is equivalent to 14.06 J (17), the consumption of oxygen in energy per larva was expressed as mJ/larva-1/h-1. Simultaneously with the oxygen readings for each bottle, ammonium was determined using the indophenol blue method (18), which consisted of obtaining 10 ml of water in each bottle (with and without larvae) which were deposited in duly labeled test tubes. To each was added 0.4 ml of phenol alcohol solution, 0.4 ml of nitroprusside and 1 ml of oxidizing solution (sodium citrate and sodium hypochlorite), after which the tubes were shaken and left to rest for two hours to develop the color of the chromophore mix, after which absorbency readings were taken in a HACH 4000UV-VIS spectrophotometer with a wave length of 640 nm. To estimate the excretion per larva, it was calculated the same way as oxygen consumption. The ammonium excretion was expressed as µg N-NH4+/lar-1/h-1. The amount of ammonium excreted by larva was converted into energy units with the idea that 1 mg of nitrogen ammonium (N-NH3) is equivalent to 24.87 J (19), the excretion of ammonium in energy was expressed as mJ/lar-1/h-1. The O:N index (rate of oxygen consumption and ammonium excretion) was estimated based on the values of oxygen consumption and ammonium excretion of the larvae kept in respirometers during the experimental phase. The physiological rates (consumption and excretion) of the larvae for both components were transformed into atoms/grams to estimate the O:N using the supposition of respiratory thermochemistry (17). This index was used to estimate the energy component of proteins, lipids and carbohydrates for L. vannamei larvae. It was considered that values between 3 and 16 obtained from this index indicated protein oxidation, from 50 to 60 indicated catabolism of proteins and lipids, and values above 61 corresponded to carbohydrates (20).

4921

muelleri- y rotíferos (ma+rot). Todas las botellas de ambos estadios larvales, se mantuvieron en un recipiente rectangular (124x60x19 cm) de fibra de vidrio con agua recirculando con una bomba LITTLE GIANT sumergida de 1/16 de Hp y una temperatura constante de 29°C con un calentador y un termorregulador FINNER, HC-0800. La determinación en cada botella del consumo de oxígeno y de la excreción amoniacal por las larvas zoea y mysis, se registraron a las cuatro horas de iniciada la fase experimental. La concentración de oxígeno se midió directamente en cada botella con un oxímetro y un electrodo polarográfico ORION. Para estimar el consumo de oxígeno por cada tratamiento, se obtuvo por las diferencias en los promedios de la cantidad de oxígeno en las botellas testigo (sin larvas), menos la cantidad media de oxígeno en las botellas con las larvas, obteniendo así, la cantidad promedio del consumo de oxígeno por las larvas. Para estimar el consumo por larva, la cantidad de oxígeno consumido en cada botella se dividió entre el número de larvas (60 larvas) contenidas en cada botella, obteniendo así el consumo de oxígeno por larva (12,15,16), el consumo de oxígeno fue expresado en µg O2/larva-1/h-1. Posteriormente el consumo de oxígeno por larva se convirtió a unidades de energía bajo el supuesto que 1 mg de O2 consumido es equivalente a 14.06 J (17), el consumo de oxígeno en energía por larva fue expresado en mJ/larva-1/h-1. De forma simultánea a las lecturas del oxígeno por cada botella, se realizó la determinación del amonio a través del método de azul de indofenol (18), el cual consistió en obtener 10 ml de agua de cada botella (con y sin larvas) y se depositaron en tubos de ensayo debidamente etiquetados. A estos se les adicionaron 0.4 ml de solución alcohólica de fenol, 0.4 ml de nitroprusiato y 1 ml de solución oxidante (citrato de sodio e hipoclorito de sodio), después se agitaron los tubos y se dejaron reposar durante dos horas para su desarrollo del color de la mezcla cromofórica, transcurrido el tiempo se realizaron las lecturas de absorbancia en un espectrofotómetro HACH, 4000UV-VIS a una longitud de onda de 640 nm. Para la estimación de la excreción por larva, se calculó de la misma forma que el consumo de oxígeno. La excreción de amonio fue expresada en µg N-NH4+/lar-1/h-1. La cantidad de amonio excretado por larva, fue convertido a unidades de energía bajo el supuesto que 1 mg de nitrógeno de amonio (N-NH3) es equivalente a 24.87 J (19), la excreción de amonio en energía fue expresada en mJ/larva-1/h-1.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(Supl) Diciembre 2015

Statistical analysis. Using the data of oxygen consumption and ammonium excretion in zoea and mysis substages, normality (Lillieford) and homoscedasticity (Bartlett) tests were performed, and depending on the results, in zoea a one way ANAVA was applied, while mysis corresponded to a two factor ANAVA (substage and diet). In cases where the results were significant, multiple comparison tests were performed (Tukey – parametric- or Tukey Type -non parametric). In all cases, a level of significance of 0.05 (21) was used, and measurement adjustments were calculated using the Statistica V7.0 packet (22).

RESULTS Total and organic dry weight. The total and organic dry weight of larvae increased from zoea I by 11.3 (PSU) and 8.7 µg (POU) to 92.1 (PSU) and 71.7 µg (POU) for the PL1 phase. Weight increase for the organisms between the substages showed different growth rates. In mysis I the increase in total dry weight fluctuated from 47 to 74%. However, the inorganic material of the larvae did not behave according to larva development, with percentages between 17.4 and 25% (Table 1). Table 1. Average values and standard deviation (±) of the unit (PSU) and organic (POU) dry weight. PSU

POU

PSU

POU

pg/cel-1

µg/lar-1

78.7 ±19.1

44.7 ±9.9

Rotifer

0.37 ±0.09

0.29 ±0.05

Nauplius

2.52 ±0.57

2.23 ±0.53

Zoea I

11.31 ±2.68

8.67 ±1.78

Zoea II

16.66 ±3.30

12.54 ±2.63

Zoea III

28.95 ±4.56

21.67 ±3.64

Mysis I

48.23 ±6.91

36.57 ±5.37

Mysis II

61.93 ±7.67

47.15 ±5.84

Mysis III

84.17 ±6.39

69.47 ±4.85

Microalgae

Respiration. The oxygen consumption rates in Zoea increased progressively from 1.47 in Zoea I to 2.15 µg O2/larva-1/h-1 in Zoea III. The equivalent energy use per hour in the larvae varied from 20.6 to 30.2 mJ/lar-1/h-1. When the oxygen consumption data were analyzed statistically, these showed significant differences between Zoea I and II, but not between II and III (Table 2). In mysis fed with microalgae and Artemia nauplius, oxygen consumption was different in the substages, with a minimum and maximum

El índice de O:N (tasa de consumo de oxígeno y tasa de excreción amonio), se estimó con los valores del consumo de oxígeno y de la excreción de amonio de las larvas mantenidas en los respirométros durante la fase experimental. Las tasas fisiológicas (consumo y excreción) de las larvas para ambos componentes, fueron transformados a átomos/gramo para la estimación de la razón O:N, bajo los supuestos de la termoquímica respiratoria (17). Este índice fue utilizado para la estimación del componente energético de las proteínas, lípidos y carbohidratos para las larvas de L. vannamei. Se consideró que valores obtenidos de este índice entre 3 y 16, indicaron oxidación de proteínas, de 50 a 60 indicaron catabolismo en proporción de proteínas y lípidos, y valores superiores a 61 correspondieron a carbohidratos (20). Análisis estadístico. A los datos del consumo de oxígeno y de excreción de amonio en los subestadios de zoea y mysis, se les realizaron pruebas de normalidad (Lillieford) y homoscedasticidad (Bartlett) y dependiendo de los resultados, en zoea se aplicó un ANAVA de una vía, mientras en mysis correspondió a un ANAVA de dos factores (subestadio y dieta), en los casos donde resultó significativo se aplicaron pruebas de comparaciones múltiples (Tukey – paramétrica- o Tipo Tukey -no paramétrica-), en todos los casos se utilizó un nivel de significancia de 0.05 (21) y el ajuste de medias se calculó por el paquete Statistica, V7.0 (22).

RESULTADOS Peso seco total y orgánico. El peso seco total y orgánico de las larvas, aumentaron desde zoea I en 11.3 (PSU) y 8.7 µg (POU) hasta 92.1 (PSU) y 71.7 µg (POU) para el estadio de PL1. Los incrementos del peso en los organismos entre los subestadios registraron diversas tasas de crecimiento, en mysis I los aumentos en peso seco total fluctuaron del 47 al 74%. Sin embargo, la materia inorgánica en las larvas, no presentaron un comportamiento de acuerdo al desarrollo larval, resultando los porcentajes entre 17.4 y 25% (Tabla 1). Respiración. La tasa de consumo de oxígeno en zoea incrementó progresivamente de 1.47 en zoea I a 2.15 µg O2/larva-1/h-1 en zoea III. Su equivalente en gasto energético por hora en las larvas varió de 20.6 a 30.2 mJ/lar-1/h-1, al analizar estadísticamente los datos de consumo de oxígeno, estos presentaron diferencias significativas entre zoea I y II, pero no entre zoea II y III (Tabla 2). En mysis alimentadas con microalgas y nauplios de Artemia, el consumo de oxígeno resultó con

4923

Medina-Jasso - Respiración y excreción en larvas

diferencias entre los subestadios presentando una variación mínima y máxima de 1.9 y 2.4 µgO2/lar-1/h-1, los cuales correspondieron en gasto de energía a 27.9 y 34.8 mJ/lar-1/h-1, respectivamente. Mientras que las larvas mysis alimentadas con la dieta alternativa (microalgas y rotíferos), no presentaron diferencias entre los tres subestadios, registrando consumos entre 2.2 y 2.4 µg/O2/lar-1/h-1, y su equivalente en gasto energético varió de 32.0 a 33.8 mJ/lar-1/h-1. Además, estadísticamente no se observaron diferencias significativas entre las medias del consumo de oxígeno en los subestadios de mysis (Tabla 3).

Table 2. Average consumption of oxygen and standard deviation (±) in µg O2/lar-1/h-1 and mJ/lar-1/h-1 (A) and mg O2/g-1/h-1 and KJ/h-1/g-1 for total dry weight B) in zoea larvae. p=probability. ZOEA I

ZOEA II

ZOEA III

µg/lar-1/h-1

1.47 ± 0.39

1.91 ± 0.81

2.15 ± 0.51

p=0.023

mJ/lar-1/h-1

20.60a ± 5.42

26.80b ± 11.45

30.20b ± 7.19

p=0.023

mg/g-1/h-1

129.54b ± 34.05

114.39ab ± 48.05

74.21a ± 17.67

p=0.009

KJ/g-1/h-1

1.82b ± 0.48

1.61ab ± 0.69

1.04a ± 0.25

p=0.009

Different letters indicate significant differences (for a non-parametric one-way ANOVA).

El menor gasto energético resultó en mysis I alimentadas con nauplios de Artemia, debido a que consumieron posiblemente una menor cantidad de alimento; a partir de mysis II no se presentaron diferencias entre los subestadios (2.3 a 2.4 µg/O2/ lar-1/h-1), al igual que en dietas (33.5 a 34.8 mJ/ lar-1/h-1), aunque los valores resultaron intermedios durante mysis I alimentadas con microalgas y rotíferos B. plicatilis. De igual forma que el consumo de oxígeno en la mysis, el gasto metabólico no resultó con diferencias estadísticas entre las dietas proporcionadas a dichas larvas (Tabla 3).

variation of 1.9 and 2.4 µg/O2/lar-1/h-1, which corresponded to an energy output of 27.9 and 34.8 mJ/lar-1/h-1, respectively. While the mysis larvae that were fed with the alternative diet (microalgae and rotifers) did not show differences between the three substages, with consumption between 2.2 and 2.4 µg/O2/lar-1/h-1, its equivalent in energy consumption varied from 32.0 to 33.8 mJ/lar-1/h-1. Additionally, statistically there were no significant differences observed in oxygen consumption measurement in mysis substages (Table 3).

Excreción amoniacal. En zoea, la excreción de NH4+ en unidades energéticas, fueron inferiores a los estimados por la actividad respiratoria, además no presentaron un gradiente relacionado con el peso y el tiempo de desarrollo de las larvas. La tasa de excreción individual se mantuvo alrededor de 0.06 µg N-NH4+/lar-1/h-1, correspondiendo entre 5 y 7.5% del costo metabólico registrado durante la respiración. La tasa de producción de NH4+ normalizada por unidad de peso disminuyó progresivamente, presentando diferencias significativas en los subestadios de zoea, donde el costo metabólico en la respiración de zoea I fue 7% y entre zoea II y III del 5%. Los valores de la excreción en zoea, resultaron estadísticamente significativos con el desarrollo larval, además, los valores de la excreción incrementaron con el subestadio, aunque no se detectaron diferencias estadísticas entre las dietas suministradas en dichas larvas (Tabla 4).

Lower energetic use was seen in mysis I fed with Artemia nauplius, since they possibly consumed less feed; from mysis II no differences were seen between the substages (2.3 to 2.4 µg/O2/lar-1/h-1), and diets (33.5 to 34.8 mJ/lar-1/h-1), although the values were intermediate during mysis I fed with microalgae and B. plicatilis rotifers. As was seen with the oxygen consumption in mysis, metabolic output showed no statistical differences between the diets given to those larvae (Table 3). Ammonium excretion. In zoea, the excretion of NH4+ in energy units was inferior to those estimated for respiratory activity, and did not present a gradient related to the weight and development time of larvae. The individual excretion rate was around 0.06 µg N-NH4+/lar-1/h-1, corresponding to 5 and 7.5% of the metabolic use recorded during respiration. The normalized production rate of

Table 3. Average oxygen consumption and standard deviation (±) in µg/O2/lar-1/h-1 and in mJ/lar-1/h-1 (A) and in mg O2/g-1/h-1 and KJ/g-1/h-1 for total dry weight (B) in mysis larvae. ma+nau=microalgae and Artemia nauplius; ma+rot=microalgae and rotifers; p=probability. MYSIS I ma+nau A B

MYSIS II ma+rot

ma+nau

ma+rot

MYSIS III ma+nau

ma+rot

µg/lar-1/h-1

1.99a ±0.47

2.28ab ±0.47

2.39b ±0.60

2.41b ±0.42

2.48b ±0.44

2.40b ±0.50

p=0.003

mJ/lar-1/h-1

27.95a ±6.67

32.06ab ±6.63

33.55b ±8.42

33.86b ±5.94

34.80b ±6.20

33.76b ±6.97

p=0.003

mg/g-1/h-1

41.21bc ±9.84

47.28c ±9.78

38.53b ±9.68

38.89b ±6.83

29.40a ±5.24

28.53a ±5.89

KJ/g-1/h-1

0.58bc ±0.14

0.67c ±0.14

0.54b ±0.14

0.55b ±0.10

0.41a ±0.07

0.40a ±0.08

p<0.01 p<0.01

Different letters indicate significant differences (two-way ANOVA).

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(Supl) Diciembre 2015

NH4+ per unit of weight diminished progressively, presenting significant differences in the zoea substages where the metabolic cost in zoea I respiration was 7% and between zoea II and III was 5%. The values of zoea excretion resulted statistically significant in larvae development, and the excretion values increased with the substage, although no statistical differences were detected between the diets fed in such larvae (Table 4).

En mysis, la tasa de excreción no registró diferencias entre las dietas suministradas a las larvas, asimismo en el peso individual y con respecto a la fase de desarrollo. En promedio, se obtuvieron valores de 0.10 a 0.11 µg N-NH4+/ lar-1/h-1, y de 2.5 a 2.6 mJ/lar-1/h-1, los cuales correspondieron entre 8 y 10% del costo metabólico calculado a partir de la tasa de respiración por larva (Tabla 5).

Table 4. Average values and standard deviation (±) of ammonium excretion rate in µg of N-NH4+/lar-1/h-1 and in mJ/lar-1/h-1 (A) and in mg of N-NH4+ y KJ/h-1/g-1 for total dry weight (B) for zoea larvae. p=probability.

Costos metabólicos y razón O:N. Los promedios en conjunto de las tasas de respiración y de la excreción amoniacal, los cuales fueron producidos principalmente por el catabolismo de las proteínas; permitieron estimar el costo metabólico por subestadio, resultando entre 22 (zoea I) y 31.7 mJ/lar-1/h-1 (zoea III), lo cual correspondió a un gasto energético por día de 0.53 y 0.76 mJ/lar-1/día-1, respectivamente.

ZOEA I

0.06a ± 0.01

0.06a ± 0.02

p=0.134

mJ/lar1 /h-1

1.43a ± 0.32

1.58a ± 0.41

1.53a ± 0.38

p=0.128

mg/g /h

5.09 ± 1.15

3.81 ± 0.98

2.12 ± 0.52

p<0.001

KJ/g /h

0.13c ± 0.03

0.09b ± 0.02

0.05a ± 0.01

p<0.001

-1

ZOEA II ZOEA III

µg/lar1 /h-1

-1

Los valores del costo metabólico normalizado por unidad de peso seco total disminuyeron p r o g r e s i va m e n t e , o b t e n i é n d o s e c o s t o s energéticos totales diarios de 46.8 (zoea I), 40.8 (zoea II) y 26.4 kJ/día-1/g-1 (zoea III) de peso seco de las larvas, lo cual indicó una disminución mínima entre zoea I y II, con respecto a zoea III. Aunque, el costo metabólico diario total para el estadio de zoea III, representó aproximadamente el 56% respecto al gasto metabólico de zoea I.

Different letters indicate significant differences (one-way ANOVA).

In mysis, the excretion rate did not show differences between the diets fed to the larvae, and the same can be said for individual weight and in regard to the developmental phase. On average, values from 0.10 to 0.11 µg N-NH4+/lar-1/h-1, and from 2.5 to 2.6 mJ/lar-1/h-1 were obtained, which correspond to 8 and 10% of the metabolic use calculated from the respiration rate for larvae (Table 5).

En mysis, el gasto metabólico individual alimentado con microalgas y nauplios de Artemia, registró un mínimo de 30.5 mJ/lar-1/h-1 y un máximo de 37.2 mJ/lar-1/h-1, mientras a base de microalgas y rotíferos, la variación fue 34.7 y 36.6 mJ/lar-1/h-1. Sin embargo, los valores del costo energético fueron muy similares entre los subestadios independientemente de la dieta suministrada a las larvas. En cambio, los gastos energéticos por unidad de peso disminuyeron aproximadamente 60%, entre zoea III y mysis I, registrando valores mínimos en forma progresiva de acuerdo al desarrollo larval y sin una relación con el tipo de alimento suministrado a las larvas. La razón O:N en larvas zoea aumentó en paralelo con el desarrollo larvario, registrando valores a partir de 22.3 hasta 30.6. Mientras en mysis, la razón O:N resultó con valores menores que

Metabolic expense and O:N ratio. The average respiration rates and ammonium excretion, which were mainly produced by catabolism of the protein, aided in estimating the metabolic expense per substage, which was between 22 (zoea I) and 31.7 mJ/lar-1/h-1 (zoea III), which corresponded to a daily energetic expense of 0.53 and 0.76 mJ/lar-1/day-1, respectively. The values of metabolic expense normalized per unit of total dry weight progressively diminished, obtaining total daily energetic expenses of 46.8 (zoea I), 40.8 (zoea II) and 26.4 kJ/día-

Table 5. Average values and standard deviation (±)of ammonium excretion in µg of N-NH4+/lar-1/h-1 and in mJ/lar-1/h-1 (A) and in mg of N-NH4+/g-1/h-1 and KJ/h-1/g-1 for total dry weight (B) of mysis larvae. ma+nau=microalgae and Artemia nauplius; ma+rot=microalgae and rotifers; p=probability. MYSIS I

MYSIS III

ma+rot

ma+nau

ma+rot

ma+nau

ma+rot

-1

µg/lar /h

0.10 ±0.01

0.11 ±0.01

0.10 ±0.02

0.11 ±0.01

0.10 ±0.02

0.10 ±0.01

p=0.187

mJ/lar-1/h-1

2.51a ±0.36

2.68a ±0.35

2.54a ±0.39

2.69a ±0.35

2.45a ±0.37

2.51a ±0.30

p=0.193

mg/g-1/h-1

2.09c ±0.30

2.24c ±0.29

1.65b ±0.25

1.75b ±0.23

1.17a ±0.18

1.20a ±0.14

p<0.001

KJ/g-1/h-1

0.05c ± 0.01

0.06c ± 0.01

0.04b ± 0.01

0.03a ± 0.004

p<0.001

-1

MYSIS II

ma+nau a

Different letters indicate significant differences (two-way ANOVA).

4925

Medina-Jasso - Respiración y excreción en larvas

1/g-1 (zoea III) of dry weight of larvae, which indicated a minimum reduction between zoea I and II with respect to zoea III. Although the total daily metabolic expense for the zoea III stage represented approximately 56% with regards to the metabolic expense of zoea I. In mysis, the individual metabolic expense with microalgae and Artemia nauplius feedings showed a minimum of 30.5 mJ/lar-1/h-1 and a maximum of 37.2 mJ/lar-1/h-1, while when based on microalgae and rotifers, the variation was 34.7 and 36.6 mJ/lar-1/h-1. However, energetic expense values were very similar between substages, independently of the diet fed to the larvae. Conversely, energetic expense per unit of weight diminished by approximately 60% between zoea III and mysis I, with minimum values progressing according to larval development and unrelated to the type of feed given to the larvae. The O:N ratio in zoea larvae increased parallel to larval development, with values from 22.3 to 30.6. Mysis had lesser O:N ratio values than zoea, between 17.2 and 22, which determined that the proteins in both stages were used as metabolic substrate during larval development of L vannamei (Table 6).

DISCUSSION The final weights reached in the postlarva stage (PL1) obtained in development were considerably superior in the same species and age than those obtained by other authors in laboratory conditions (8). The probable difference in weights obtained could be related to environmental characteristics in which the larvae developed between nauplius I and II. Although they were part of the same production lot, the weight of the larvae could have been influenced by a genetic variability in the nauplius used. It we take into account that larval development is directly related to water conditions and feed, then the results of this study with respect to average weights between the diets could be considered as indicators of adequate conditions in which the laboratory tests were performed. Also, the same water conditions were maintained among all the bottles, and only the type of feed given to the larvae was changed, so that weight variations obtained could be attributed to different nutritional components in diets based on microalgae and artemia nauplius or microalgae and rotifers, in order to achieve morphologic changes between mysis and postlarva stages, which is necessary so that larvae can reach said phase according to changes in the feeding habits during development. In general, satisfactory

Table 6. Total energetic expense per respiration (mJ/ lar-1/h-1) and ammonia excretion (KJ/h-1/g-1) for dry weight and O:N ratio per diet applied. ma = microalgae, ma + nau = microalgae and Artemia nauplius, ma + rot = microalgae and rotifers. STATE ZOEA

MYSIS

LARVAE

DIET

mJ/lar-1/h-1 KJ/g-1/h-1

I II

ma ma

22.03 28.37

1.95 1.70

22.26 26.30

O:N

III

31.73

1.10

30.59

ma + nau

30.45

0.63

17.22

ma + nau

36.09

0.58

20.41

III

ma + nau

37.24

0.44

22.01

ma + rot

34.74

0.72

18.50

ma + rot

36.56

0.59

19.44

III

ma + rot

36.27

0.43

20.81

zoea entre 17.2 y 22, lo cual determinó que las proteínas en ambos estadios fueron utilizadas como sustrato metabólico durante el desarrollo larval de L vannamei (Tabla 6).

DISCUSIÓN Los pesos finales alcanzados en las postlarvas (PL1) obtenidas en el desarrollo fueron considerablemente superiores para la misma especie y edad que los obtenidos por otros autores en condiciones de laboratorio (8). Las probables diferencias en los pesos obtenidos podrían estar relacionadas con características ambientales en las cuales fueron desarrolladas las larvas entre nauplio I y II; aunque correspondieron a un mismo lote de producción, el peso en las larvas pudo estar influenciado por la variabilidad genética de los nauplios utilizados. Si se considera que el desarrollo larval está relacionado directamente con las condiciones hidrológicas y el suministro del alimento, entonces los resultados del presente estudio con respecto a los pesos promedios entre las dietas, pudieran ser considerados como indicadores de condiciones adecuadas en las cuales se mantuvieron los ensayos en el laboratorio. También, se procuró mantener las mismas condiciones hidrológicas entre las botellas, y solamente varió el tipo de la alimentación suministrada a las larvas, por lo tanto las respuestas obtenidas entre los pesos podrían ser atribuidas a los diferentes componentes nutricionales en las dietas a base de microalgas y nauplios de artemia o microalgas y rotíferos, para lograr así el cambio morfológico entre mysis y postlarva, los cuales las larvas requieren para alcanzar dicho estadio de acuerdo a sus cambios en los hábitos alimenticios durante su desarrollo. En general, se han reportado resultados satisfactorios en cuanto a la supervivencia y metamorfosis cuando se han utilizado

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results have been reported regarding survival and metamorphosis when diatom microalgae have been used as feed for white shrimp larvae (2,3). The respiration rate in crustaceans and in particular L. stylirostris and L. vannamei larvae can be modified by external factors such as salinity, light intensity, dissolved oxygen and temperature, as some authors have mentioned (23), although in this study those factors were controlled. Oxygen consumption values obtained in mysis larvae fed with microalgae and artemia nauplius or with the alternative diet (microalgae and rotifers) coincide with oxygen consumption of larvae fed Litopenaeus setiferus (24), who indicated that oxygen consumption varies according to the type of feed. These authors, as in this study, determined greater oxygen consumption when the larvae were fed with a concentration of one or two artemia nauplius/ mL-1. Additionally, oxygen consumption in mysis II and III were similar when 0.5 nauplius/mL-1 were provided, but when the larvae were fed a concentration of 0.1 nauplius/mL-1, oxygen consumption was minimum. The results obtained in oxygen consumption did not coincide with that reported in L. vannamei larvae (25), who showed that oxygen consumption diminished with larval development, that is, as morphological changes in the larvae from zoea to mysis took place, respiration decreased. However, those authors indicated that the consumption of oxygen did not show significant differences between the stages. In this study, larvae fed with microalgae and artemia nauplius increased oxygen consumption in developing between the three mysis phases (I, II and III), but when they were statistically analyzed, no differences in oxygen consumption were detected between mysis larvae II and III. Metabolic expenses in this study of Farfantepenaeus paulensis larvae (26) were superior to the amount of energy used in respiration when compared with energy used in growth, with the exception of the zoea III stage. For example, those authors indicated that the larvae assimilated 3.59 J, of which approximately 42% was used in growth and 52% of the energy was used for respiration, which coincides with that reported on larvae for Pacific white shrimp L. vannamei (6) and Penaeus setiferus from the Gulf of Mexico (24). Higher energy absorption was seen in zoea larvae (I, II, and III) than in mysis (I, II, and III), probably due to an interaction between respiration and excretion rates from variations in absorption efficiency as a consequence of

microalgas diatomeas como fuente de alimento para larvas de camarón blanco (2,3). La tasa de respiración en crustáceos y en particular en larvas de L. stylirostris y L. vannamei, con frecuencia pueden ser modificadas por algunos factores externos como son la salinidad, intensidad luminosa, oxígeno disuelto y temperatura, como lo han señalado algunos autores (23), aunque en el presente estudio, dichos factores se mantuvieron controlados. Los valores obtenidos en el consumo de oxígeno en las larvas mysis alimentadas con microalgas y nauplios de artemia, o con la dieta alternativa (microalgas y rotíferos), coincidieron con el consumo de oxígeno en larvas alimentadas de Litopenaeus setiferus (24), quienes indicaron que el consumo de oxígeno varía de acuerdo con el tipo de alimento suministrado. Estos autores al igual que en el presente estudio, se determinaron un mayor consumo de oxígeno cuando las larvas fueron alimentadas con una concentración de uno a dos nauplios de artemia/mL-1. Además, los consumos de oxígeno en mysis II y III fueron similares cuando se les suministró 0.5 nauplios/mL-1, en cambio cuando las larvas fueron alimentadas a una concentración de 0.1 nauplios/mL-1, los consumos de oxígeno fueron mínimos. Los resultados obtenidos en el consumo de oxígeno, no coincidieron con lo reportado en larvas de L. vannamei (25), quienes determinaron que el consumo de oxígeno disminuyó con el desarrollo larval, es decir, conforme se presentaron los cambios morfológicos de las larvas desde zoea a mysis, la respiración fue menor, sin embargo, dichos autores indicaron que los consumos de oxígeno no presentaron diferencias significativas entre los estadios. En el presente estudio las larvas alimentadas con microalgas y nauplios de artemia, los consumos de oxígeno incrementaron con el desarrollo entre los tres estadios de mysis (I, II y III), pero cuando fueron analizados estadísticamente, no se detectaron diferencias en el consumo de oxígeno entre las larvas mysis II y III. Los costos metabólicos del presente estudio respecto a larvas de Farfantepenaeus paulensis (26), fueron superiores a la cantidad de energía utilizada en la respiración en comparación a la destinada al crecimiento, con excepción del estadio de zoea III. Por ejemplo, estos autores indicaron que las larvas asimilaron 3.59 J, de los cuales aproximadamente 42% fue invertido en crecimiento y 52% de la energía fue utilizado para la respiración, lo cual coincidió con lo reportado en larvas para los camarones blanco del Pacífico L. vannamei (6) y del Golfo de México Penaeus setiferus (24). Se obtuvo una absorción de energía superior para las larvas zoea (I, II y III) que mysis (I, II y III), esto probablemente a una interacción entre las tasas de respiración y de excreción provocada por variaciones

Medina-Jasso - Respiración y excreción en larvas

variations in feed availability and the delay in the digestive tract of the larvae. However, differences observed in the present study in evaluating the metabolic expense measured as respiration and excretion are due to the fact that the larvae were previously fed, which included three main components of respiration and excretion (routine, standard and post-feeding), where the last one could alter the physiologic variation according to the type and amount of feed ingested by the larvae. In conclusion, the zoea larvae required greater energy absorption than mysis as a consequence of the interaction between respiration and excretion. Also, the mysis larvae fed with rotifers instead of artemia nauplius could be less efficient, since B. plicatilis is not considered to be adequate feed during the mysis II and III phase, mainly due to size, making it difficult for larvae to capture, and therefore requires greater energetic expense. However, the weight obtained for zoea and mysis larvae for L. vannamei shrimp showed no differences according to the diets provided. Acknowledgements To the CONACYT 38232-B project for the resources granted. To the staff at Cuerpo Académico Consolidado UAS-CA-162. To the Programa de Posgrado Regional para el Doctorado en Biotecnología of the Universidad Autónoma de Sinaloa.

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en la eficiencia de absorción, como consecuencia con las variaciones de disponibilidad de alimento y con el tiempo de permanencia en el tracto digestivo de las larvas. Sin embargo, probablemente las diferencias observadas en el presente estudio en la evaluación de los costos metabólicos medidos como respiración y excreción sean debido a que las larvas fueron alimentadas previamente, lo cual incluyó los tres principales componentes de la respiración y excreción (rutina, estándar y post-alimentaria), donde ésta última puede alterar su variación fisiológica de acuerdo al tipo y cantidad de alimento ingerido por las larvas. Como conclusiones, las larvas zoea requirieron una mayor absorción de energía que mysis como consecuencia de la interacción entre la respiración y la excreción. Además, las larvas mysis alimentadas con rotíferos en lugar de nauplios de artemia podría no resultar con una mayor eficiencia, esto debido a que B. plicatilis no es considerado como un alimento adecuado durante la fase de mysis II y III, debido principalmente a sus tallas, las cuales dificultan su captura por las larvas y por lo tanto requiere un mayor costo energético. Sin embargo, los pesos obtenidos en las larvas zoea y mysis de camarón L. vannamei no resultaron con diferencias entre las dietas suministradas. Agradecimientos Al proyecto CONACYT 38232-B por los recursos otorgados. Al personal del Cuerpo Académico Consolidado UAS-CA-162. Al Programa de Posgrado Regional para el Doctorado en Biotecnología de la Universidad Autónoma de Sinaloa.

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):4929-4936, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Molecular detection and antimicrobial resistance of Aeromonas from houseflies (Musca domestica) in Iran Detección molecular y resistencia antimicrobiana de Aeromonas desde moscas domésticas (Musca domestica) en Irán Davood Ommi,1 MD, Seyed Mohammadreza Hashemian,2 MD, Elahe Tajbakhsh,3 Ph.D, Faham Khamesipour,4* DVM. Functional Neurosurgery Research Center, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran. 2Chronic Respiratory Disease Research Center, National Research Institute of Tuberculosis and Lung Diseases (NRITLD), Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran. 3Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran. 4Young Researchers and Elite Club, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran, P.O. Box 166. *Correspondence: dr_faham@yahoo.com; f.khamesipour@iaushk.ac.ir 1

Received: February 2015; Acepted: June 2015.

ABSTRACT Objective. This study aimed to report the molecular detection and antimicrobial resistance of Aeromonas among houseflies (Musca domestica) in Shahrekord and Isfahan provinces of Iran. Materials and methods. Flies were caught from household kitchens, cattle farms, animal hospitals, human hospitals, slaughter house and poultry farms and put in collection separate sterile tubes. Isolation was accomplished by culture of flies in alkaline peptone water followed by identification with Aeromonas-specific Polymerase Chain Reaction (PCR). Results. Out of 600 houseflies 73 (12.2%) were infected with Aeromonas spp. Significantly higher frequencies of Aeromonas were isolated in Shahrekord province (13.0%; 39/300) than in Isfahan province (11.3%; 34/300). The recovery frequencies of the organisms were significantly lower in kitchens as compared to those in cattle farms and hospital wards which were similar. Higher proportions of infected flies were obtained during summer whereas low proportions were obtained during winter. Conclusions. It is concluded that houseflies do harbor diarrheagenic pathogens, including Aeromonas especially during summer. The carried organisms are resistant to a number of antimicrobials at different levels. Thus, future plans aimed at stemming infections caused by these organisms should take flies into account. Control efforts of infections caused by this particular bacterium should therefore take into account Musca domestica. Key words: Pathogens, locations, Polymerase chain reaction, resistant, seasons (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. Este estudio tuvo como objetivo informar de la detección molecular y resistencia antimicrobiana de Aeromonas entre moscas domésticas (Musca domestica) en las provincias de Shahrekord y Isfahan de Irán. Materiales y métodos. Las moscas fueron capturadas en las cocinas domésticas, granjas de ganado, hospitales de animales, hospitales humanos, mataderos y granjas avícolas y pusieron en tubos separados estériles de recolección. El aislamiento se llevó a cabo por cultivo de moscas en agua de peptona alcalina seguida por la identificación con la reacción en cadena de polimerasa Aeromonas-específica (PCR). Resultados. De 600 moscas domésticas 73 (12.2%) estaban infectadas con Aeromonas spp. Se aislaron significativamente mayores frecuencias de Aeromonas 4929

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en la provincia Shahrekord (13.0%; 39/300) que en la provincia de Isfahan (11.3%; 34/300). Las frecuencias de recuperación de los organismos fueron significativamente más bajos en las cocinas, en comparación con las granjas de ganado y salas de hospitales que fueron similares. Mayores proporciones de moscas infectadas se obtuvieron durante el verano mientras que bajas proporciones se obtuvieron durante el invierno. Conclusiones. Se concluye que las moscas domésticas no albergan patógenos diarreogénicos, incluyendo Aeromonas especialmente durante el verano. Los organismos llevadas a son resistentes a un número de antimicrobianos en diferentes niveles. Este modo, los planes futuros dirigidos a limitar las infecciones causadas por estos organismos deberían tomar en cuenta las moscas. Los esfuerzos de control de infecciones causadas por esta bacteria en particular, por lo tanto debería tener en cuenta Musca doméstica. Palabras clave: Patógenos, ubicaciones, reacción en cadena de la polimerasa, resistente, temporadas (Fuente: CAB).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Aeromonas is a diarrheagenic bacterium responsible for a number of zoonotic infections in humans. It is commonly found in aquatic environment in temperate and subtropical countries causing opportunistic infections in both aquatic and terrestrial animals. Some species of Aeromonas are known to be associated with human diseases affect the gastrointestinal tract such as gastroenteritis and extraintestinal infections (1,2). Extra-intestinal infections caused by Aeromonas include empyema, urinary and biliary tract infections, bacteriaemia, peritonitis; and skin and soft-tissue infections (3-5).

La aeromonas es una bacteria diarreogénica responsable de un gran número de infecciones zoonóticas en los seres humanos. Se encuentra comúnmente en ambientes acuáticos de los países templados y subtropicales y causan infecciones oportunistas en animales acuáticos y terrestres. Se conocen algunas especies de Aeromonas por estar asociadas con enfermedades humanas que afectan el tracto gastrointestinal tales como la gastroenteritis y las infecciones extra-intestinales (1,2). Las infecciones extra-intestinales causadas por Aeromonas incluyen la empiema, las infecciones urinarias y de las vías biliares, la bacteriemia, la peritonitis y las infecciones de la piel y los tejidos blandos (3,5).

House flies (Musca domestica) are known to be involved in the transmission of important bacterial agents causing human and animal infections (6,7). The flies, having close association with different forms of excreta and decaying organic matters (7), represent a substantial public health risk whenever they have access to human food. Their body anatomy, secretions they make and their feeding habits enable the flies to pick up and disseminate several pathogens (6,8). To that effect, a number of authors have detected bacterial pathogens, including Helicobacter pylori, Salmonella and Campylobacter from houseflies (8,9). Consequently this study was conducted with the aim of prevalence of Aeromonas in the houseflies as determined by both culture and PCR method caught from Shahrekord and Isfahan provinces of Iran.

MATERIALS AND METHODS Study area and design. This study was conducted in Isfahan (32.6333° N, 51.6500° E) and Shahrekord (32.3256° N, 50.8644° E) provinces located in central and Southwestern Iran respectively. Houseflies (Musca domestica) were captured from household kitchens (n=4), cattle farms (n=4), animal hospitals (n=2), human hospitals (n=4), slaughter houses (n=2) and poultry farms (n=2).

Las moscas domésticas (Musca domestica) se conocen por estar involucradas en la transmisión de agentes bacterianos importantes que causan infecciones en humanos y animales (6,7). Las moscas, que tienen estrecha relación con diferentes formas de las excretas y materias orgánicas en descomposición (7), representan un riesgo de salud pública importante cuando tienen acceso a la alimentación humana. Las partes de su cuerpo, sus secreciones y sus hábitos alimenticios les permiten recoger y difundir varios patógenos (6,8). En este sentido, algunos autores han detectado patógenos bacteriales, incluyendo la helicobacter pylori, la salmonella y la Campylobacter en las moscas domésticas (8,9). En consecuencia, este estudio se realizó con el objetivo de determinar la prevalencia de Aeromonas en las moscas domésticas, según se encontró en los cultivos y en el método de PCR, capturadas en Shahrekord y Isfahan, provincias de Irán.

MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio y diseño. El estudio se realizó en Isfahan (32.6333° N, 51.6500° E) y en Shahrekord (32.3256° N, 50.8644° E), provincias localizadas en el centro y suroeste de Irán respectivamente.

Ommi - Aeromonas in houseflies (Musca domestica)

Sample collection. This study was conducted on 600 houseflies collected from important sites in Isfahan and Shahrekord provinces such as household kitchens, cattle farms, animal hospitals, human hospitals, slaughter houses and poultry farms. The flies were collected either by manual capture or by using sticky traps. At the animal hospitals, flies were captured from the around animals, around yard hospitals and near a dumpster in the parking lot. At the farms (cattle farms and poultry farms), flies were trapped on or around animals, their faeces and their feed. At the human hospitals, flies were captured from the around yard hospitals and near a dumpster in the parking lot and near public room. At the household kitchens, flies were captured from the kitchen, the public dining room, and near a dumpster in the parking lot. At the slaughter houses, flies were captured from the slaughter houses and near a dumpster in the parking lot. Following capture the fly samples were transported to the laboratory of Biotechnology Research Center at Islamic Azad University using separate sterile tubes to prevent any contamination due to mixing of the samples. In the laboratory, flies were identified and killed by refrigeration in -20oC cold chamber. They were then placed in 5 ml peptone water and left at room temperature for 5 hr before being processed. Isolation of bacteria from samples. Bacteria were isolated from both the peptone water solutions that contained fly samples and from the fly guts by the method described by Nayduch et al (10). DNA extraction. Genomic DNA was extracted from all isolates using CinnaGen DNA extraction kit (Cinnagen, Tehran, Iran) according to the manufacturer’s instructions. The extracted DNA was quantified by spectrophotometric measurement at a wavelength of 260 nm according to the method described by Sambrook and Russell (11). Extracted DNA samples were stored frozen at -20°C until used for molecular analysis using Polymerase Chain Reaction (PCR) at the Biotechnology Research Center. PCR assay. In order to confirm the presence of Aeromonas spp. PCR test was performed. Primers F: 5′-TAGCTTGCTACTTTTGCCGG-3′ and R: 5′ GACACAGGAACTCTGCACCG-3′ were used to amplicons were the expected size of 800 bp (10). Amplification reaction was carried out in a total volume of 25 μl, consisting of 1 μM of each set of primers, 2 mM Mgcl2, 200 μM dNTP, 5 μl of 10X PCR buffer, 1 U of Taq DNA polymerase (Fermentas, Germany) and 1 μg of template DNA. Each PCR was run in a thermal cycler (Mastercycler

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Las moscas domésticas (Musca domestica) fueron capturadas en cocinas caseras (n=4), fincas ganaderas (n=4), clínicas veterinarias (n=2), hospitales (n=4), mataderos (n=2) y granjas avícolas (n=2). Recolección de las muestras. Este estudio se realizó sobre 600 moscas domésticas recogidas en las provincias de Isfahan y Shahrekord, en sitios esenciales tales como cocinas domésticas, fincas ganaderas, clínicas veterinarias, hospitales, mataderos y granjas avícolas. Las moscas se recolectaron bien por captura manual o mediante el uso de trampas con adhesivos. En las clínicas veterinarias las moscas se capturaron cerca de los animales, alrededor de los patios y cerca de un contenedor de basura ubicado en el estacionamiento. En las granjas (fincas ganaderas y granjas avícolas) las moscas fueron atrapadas cerca de los animales, de sus heces y de su comida. En los hospitales las moscas fueron capturadas alrededor de los patios, cerca de un contenedor de basura ubicado en el estacionamiento y cerca de las salas públicas. En zona de las cocinas domésticas, las moscas fueron capturadas en la cocina, el comedor y cerca de un contenedor de basura ubicado en el estacionamiento. En los mataderos las moscas fueron capturadas en las zonas de sacrificio y cerca de un contenedor de basura ubicado en el estacionamiento. Luego de la captura las moscas tomadas como muestra se transportaron al Laboratorio de Biotecnología del Centro de Investigación Biotecnológica de la Universidad Islámica de Azad, utilizando tubos estériles separados para prevenir alguna contaminación debido a la mezcla de las muestras. En el laboratorio las moscas se identificaron y se mataron por medio de refrigeración en una cámara de frío a -20ºC. Luego se colocaron en 5 ml de agua de peptona y se dejaron a temperatura ambiente durante 5 horas antes de ser procesadas. Aislamiento de las bacterias de las muestras. Las bacterias se aislaron de las soluciones de agua de peptona que contenían estas muestras y de sus intestinos según el método descrito por Nayduch y colaboradores (1910). Extracción del ADN. El ADN genómico se extrajo de todos los aislados utilizando el kit de extracción de ADN CinnaGen (CinnaGen, Teherán, Irán) según las instrucciones del fabricante. El ADN extraído se cuantificó mediante medición espectrofotométrica a una longitud de onda de 260 nm, de acuerdo con el método descrito por Sambrook y Russell (11). Las muestras de ADN extraídas se almacenaron congeladas a -20ºC hasta cuando se realizó el análisis molecular utilizando la Cadena de Reacción Polymerasa (PCR por sus siglas en inglés) en el Centro de Investigación Biotecnológica.

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Gradient, Eppendorf, Germany) under the following conditions: 2 min of initial denaturation at 94°C, followed by 35 cycles of denaturation at 94°C for 15 seconds, annealing at 56°C for 15 seconds and extension at 72° for 20 seconds. This was followed by final extension at 72°C for 2 min and then the products maintained at 4°C until processed (10). The amplified products were analyzed in 1.5% agarose gel. Electrode buffer was TBE (Tris-base 10.8 g 89 mM, Boric acid 5.5 g 2 mM, EDTA (pH 8.0) 4 ml of 0.5 M EDTA (pH8.0) combined all components in sufficient H2O and stirred to dissolve). Gels were stained with ethidium bromide. Aliquots of 10 μl of PCR products were applied to the gel. Constant voltage of 80 for 20 min was used for products separation. After electrophoresis images were obtained in UVItec documentation systems (UK). Antimicrobial resistance testing. Antimicrobial resistance testing was performed by Kirby-Bauer disc diffusion method on Mueller Hinton agar based on recommendations of CLSI (formerly the National Committee for Clinical Laboratory Standards) (12). The following Antimicrobial were used in this study: Ampicillin, Cefalothin, Chloramphenicol, Gentamicin, Kanamycin, Nalidixic acid, Tetracycline, Trimethoprim- Sulfamethoxazole, Amikacin, Carbenicillin, Neomycin, Ofloxacin, Rifampin, Tobramycin. Statistical analysis. Statistical analysis was carried out using SPSS statistical software version 17.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). Descriptive statistics were computed to determine frequencies of fly samples positive for Aeromonas and frequencies of resistance to different antibimicrobials. Chi square test was used to determine significance of the observed differences in proportions.

RESULTS Detection of the organisms among the flies. The overall recovery frequency of Aeromonas spp. from the captured houseflies (n=600) was 12.2%. The recovery frequencies of the organism in the specific provinces were 13.0% (39/300) for Shahrekord and 11.3% (34/300) for Isfahan. The observed difference in these proportions was not statistically significant. Table 1 shows the percentages of Aeromonas recovery from flies sampled in each of the six locations. The recovery frequencies were significantly higher in houseflies captured in animal hospitals and slaughter houses. The seasonal recovery frequencies of the organisms are shown in table 2. The frequencies were significantly higher in summer and low during autumn (p≤0.05).

Ensayo PCR. Para confirmar la presencia de Aeromonas spp. se realizó la prueba de PCR. Se utilizaron Partidores F: 5′-TAGCTTGCTACTTTTGCCGG-3′ y R: 5′-GACACAGGAACTCTGCACCG-3′ para amplicones que fueron del tamaño esperado de 800 bp (10). La reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen total de 25 μl, consta de 1 μM de cada set de partidores, 2 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 5 μl de solución reguladora 10X PCR, 1 U de Taq ADN polimerasa (Fermentas, Alemania) y 1 μg de patrón de ADN. Cada PCR se corrió en un termociclador (Mastercycler Gradient, Eppendorf, Alemania) bajo las siguientes condiciones: 2 minutos de desnaturalización inicial a 94ºC, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 15 segundos, recocido a 56°C durante 15 segundos y extensión a 72°C durante 20 segundos. A esto siguió la extensión final a 72°C durante 2 min y luego los productos se mantuvieron a 4°C hasta su procesamiento (10). Los productos amplificados se analizaron en 1.5% gel de agarosa. El búfer de electrodo esta conforado por TBE (Tris-base 89 mM 10.8 g, 5.5 g de ácido bórico 2 mM y 4 ml de EDTA (pH 8.0) 0.5 M; se combinaron todos los componentes en suficiente H2O y se agitó para disolver). Los geles se tiñeron con bromuro de etidio. Se aplicaron alícuotas de 10 μl de productos de PCR al gel. Se aplicó un voltaje constante de 80 V durante 20 minutos para la separación de los productos. Después se obtuvieron imágenes de electroforesis en los sistemas de documentación UVItec (Reino Unido). Prueba de resistencia antimicrobiana. La prueba de resistencia antimicrobiana se realizó mediante el método de difusión en disco Kirby-Bauer en agar Mueller Hinton basado en las recomendaciones del CLSI (antes Comité Nacional de Normas para Laboratorio Clínico) (12). Se utilizaron los siguientes antimicrobianos en este estudio: ampicilina, cefalotina, cloranfenicol, gentamicina, kanamicina, ácido nalidíxico, tetraciclina, trimetoprima sulfametoxazol, amikacina, carbenicilina, neomicina, ofloxacina, rifampicina y tobramicina. Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó utilizando el software estadístico SPSS versión 17.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, EE.UU.). Se calculó la estadística descriptiva para determinar las frecuencias de las muestras positivas de moscas para Aeromonas y las frecuencias de resistencia a diferentes antimicrobianos. Se utilizó la prueba de Chi cuadrado para determinar la significancia de las diferencias observadas en las proporciones.

RESULTADOS Detección de los organismos en las moscas. La frecuencia de recuperación global de Aeromonas spp. en las moscas domésticas capturadas (n = 600) fue 12.2%. Las frecuencias de recuperación del organismo

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Ommi - Aeromonas in houseflies (Musca domestica) Table 1. Recovery frequencies of Aeromonas spp. from houseflies captured at different locations in Shahrekord and Isfahan provinces of Iran. Location

Proportion of Aeromonas in % (Number)

Kitchens Cattle farms Poultry farms Slaughter houses Animal hospitals Human hospitals

6.0 (100) 15.0 (100) 10.0 (100) 18.0 (100) 17.0 (100) 7.0 (100)

Antimicrobial resistance. Different proportions of Aeromonas spp. were found to be resistant to each of the antimicrobials tested (Table 3). Higher frequencies of resistance were observed for cefalothin, ampicillin, tetracycline and nalidixic acid. Table 3. Antimicrobial resistance profiles of 73 housefly derived Aeromonas isolates against 14 antimicrobial agents. Antimicrobial agent

Proportion of resistant isolates in % (n=73)

Ampicillin Amikacin Carbenicillin Cefalothin Chloramphenicol Gentamycin Kanamycin Nalidixic acid Neomycin Ofloxacin Rifampin Tetracycline Tobramycin

68.5 30.1 31.5 74.0 31.5 30.1 41.1 67.1 31.5 31.5 32.9 68.5 31.5

TrimethoprimSulfamethoxazole

39.7

DISCUSSION The present study demonstrates occurrence of Aeromonas (12.2%) in houseflies in the different locations involved in fly sampling. It is likely that the flies picked the organisms from the surrounding environments which could be contaminated by either sick animals, insects, food, water and even human beings as a result of unhygienic practices. It was noted in this study that houseflies derived from slaughter houses, cattle farms, poultry farms and animal hospitals were more frequently positive for Aeromonas spp. than those derived from household kitchens and human hospital wards; some of these differences being statistically significant. This could bring us to a suggestion that these different locations do differ in the extent of contamination with the bacterium. Household

Table 2. Recovery frequencies of Aeromonas spp. from houseflies captured during different seasons in Shahrekord and Isfahan provinces of Iran. Season

Proportion of Aeromonas in % (n)

Spring Summer Autumn Winter

12.7 (150) 26.7 (150) 2.7 (150) 6.7 (150)

en las provincias específicas fueron 13.0% (39/300) para Shahrekord y el 11.3% (34/300) para Isfahán. La diferencia observada en estas proporciones no fue estadísticamente significativa. La Tabla 1 muestra los porcentajes de recuperación de Aeromonas en las moscas muestreadas en cada una de las seis localidades. Las frecuencias de recuperación fueron significativamente mayores en las moscas domésticas capturadas en las clínicas veterinarias y mataderos. Las frecuencias de recuperación estacionales de los organismos se muestran en la Tabla 2. Las frecuencias fueron significativamente más altas en verano y bajas durante el otoño (p ≤ 0.05). Resistencia antimicrobiana. Se encontró que diferentes proporciones de Aeromonas spp. eran resistentes a cada uno de los antimicrobianos analizados (Tabla 3). Se observaron frecuencias más altas de resistencia para la cefalotina, ampicilina, tetraciclina y ácido nalidíxico.

DISCUSIÓN El presente estudio demuestra la presencia de Aeromonas (12.2%) en las moscas domésticas de las diferentes localidades donde se hizo el muestreo de la mosca. Es probable que estas recogieran los organismos de los ambientes circundantes que podrían estar contaminados por animales enfermos, insectos, alimentos, agua e incluso por seres humanos, como resultado de prácticas antihigiénicas. Se observó en este estudio que las moscas domésticas derivadas de mataderos, fincas ganaderas, granjas avícolas y clínicas veterinarias fueron más frecuentemente positivas para Aeromonas spp. que las derivadas de las cocinas domésticas y las salas de hospitales; algunas de estas diferencias fueron estadísticamente significativas. Lo anterior nos podría llevar a sugerir que estos diferentes lugares tienen distinto grado de contaminación con la bacteria. Las cocinas de los hogares y las salas de los hospitales podrían estar menos contaminadas, ya que reciben mucha atención en términos de higiene debido a la naturaleza de los servicios que prestan. Por otro lado los mataderos, fincas ganaderas y granjas avícolas están siempre sometidos a la contaminación con materia fecal, que es un portador conocido de muchos patógenos bacterianos.

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kitchens and human hospital wards could be less contaminated as they receive much attention in terms of hygiene due to the nature of the services they provide. On the other hand slaughter houses, cattle farms and poultry farms are always subjected to contamination with fecal matter which is a well known carrier of many bacterial pathogens. Our study investigated and revealed carriage of bacterial pathogens on both the external body parts and in the guts of houseflies. Some other studies which also involved investigations on both the external and internal body parts of the flies found that all these parts carried the organisms. These findings indicate that the flies may act as both mechanical and biological vectors of bacterial pathogens (13). Hospital acquired infections are among the challenges that the medical professionals face. Their frequencies remain unacceptably high and are associated with excess morbidity, mortality and increased healthcare costs (14). Aeromonas spp. are among the responsible bacterial organisms for such infections, the common manifestation being bacteriaemia; more so in immunocompromised individuals (15). Our results, which show occurrence of Aeromonas in houseflies in hospital environments, are suggestive of the possibility that the flies play role in perpetuation of some of these infections. The flies are likely to disseminate the bacteria they carry to patients and/or workers through contaminating food and/or water. Houseflies (Musca domestica) are of common occurrence in livestock farms with varying numbers depending on season. Their contamination with potential human and animal pathogens has been reported earlier (6,8). In the current study the flies collected from cattle and poultry farms were found infected with Aeromonas. Our results and those obtained by other researchers elsewhere reveal exposure of the flies, in farm environments, to these and possibly other microorganisms. Many infectious diseases in temperate countries di spl ay seasonality, exhibiting patterns associated with weather conditions (16-19). Such diseases display seasonal peaks in summer and alternating with low background levels of infection during winter (20-22). Understanding these seasonal trends in infectious diseases is important for improving disease surveillance and analysis of the seasonal differences in the risks for contracting those diseases. In the present study the

Nuestro estudio investigó y reveló el transporte de bacterias patógenas tanto en las partes externas del cuerpo, como en los intestinos de las moscas domésticas. Algunos otros estudios que también incluyeron investigaciones de las partes externas e internas del cuerpo de las moscas, encontraron que todas estas portan los organismos. Estos hallazgos indican que las moscas pueden actuar como vectores de transmisión mecánica y biológica de los patógenos bacterianos (13). Las infecciones adquiridas en los hospitales son algunos de los desafíos que enfrentan los profesionales de la medicina. Sus frecuencias siguen siendo inaceptablemente altas y están relacionadas con el exceso de morbilidad, mortalidad y aumento de los costos de salud (14). Las Aeromonas spp. son algunos de los organismos bacterianos responsables de este tipo de infecciones, siendo la manifestación más común la bacteriemia, más aún en individuos inmunocomprometidos (15). Nuestros resultados, que muestran la ocurrencia de Aeromonas en las moscas domésticas en entornos hospitalarios, indican la posibilidad de que las moscas juegan un papel en la perpetuación de algunas de estas infecciones. Las moscas son propensas a transmitir las bacterias que portan a los pacientes y/o trabajadores a través de la contaminación de los alimentos y/o agua. La cantidad de moscas domésticas (Musca domestica) que están presentes normalmente en las explotaciones ganaderas, depende de la temporada. Anteriormente se ha informado de su contaminación con potenciales patógenos humanos y animales (6,8). En el presente estudio se encontraron infectadas con Aeromonas las moscas recogidas en las fincas ganaderas y las granjas avícolas. Nuestros resultados y los obtenidos por otros investigadores en otras partes revelan la exposición de las moscas, en ambientes agrícolas, a estos y posiblemente otros microorganismos. Muchas de las enfermedades infecciosas en los países de clima templado presentan estacionalidad y exhiben patrones asociados con las condiciones climáticas (16-19). Estas enfermedades presentan picos estacionales en el verano y se alternan con bajos niveles de infección durante el invierno (20-22). La comprensión de estas tendencias de temporada en las enfermedades infecciosas es importante para mejorar la vigilancia de las enfermedades y el análisis de las diferencias estacionales en los riesgos de contraer esas enfermedades. En el presente estudio las frecuencias de detección de Aeromonas en las moscas fueron altas durante el verano y bajas durante el otoño. Estos hallazgos y los de trabajos anteriores sugieren que las condiciones climáticas pueden estar influyendo en las infecciones con estos organismos. Publicaciones recientes han informado la aparición de resistencia antimicrobiana entre las especies de

Ommi - Aeromonas in houseflies (Musca domestica)

frequencies of detection of Aeromonas from flies were high during summer and low during autumn. These findings and those of earlier works suggest that climatic conditions may be influencing infections with these organisms. Recent publications have reported occurrence of antimicrobials resistance among Aeromonas species isolated from different hosts (1,15). This was also evident in the present study in which isolates of were resistant to a number of antimicrobials though at varying levels. Unlike observations by authors of the two studies (1,15) who reported more than 90% susceptibility to cephalosporins, aminoglycosides, fluoroquinolones; in the present study susceptibility to these antibiotics stood at <70%. Although on the basis of in vitro studies fluoroquinolones as well as third and fourth generation cephalosporins are suggested to be the drugs of choice for treatment of severe Aeromonas bacteriaemia (15), medical practitioners still need to take into account the existing complexity of in vitroin vivo correlation in antimicrobial susceptibility profiles displayed by Aeromonas spp. With the findings of this and other researches, houseflies may be considered as important vectors of bacteria causing gastrointestinal diseases including Aeromonas in the study area and possibly other parts of Iran. Control efforts of infections caused by this particular bacterium should therefore take into account Musca domestica. The carried organisms are resistant to a number of antimicrobials at different levels. Thus, future plans aimed at stemming infections caused by these organisms should take flies into account.

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Aeromonas aisladas de diferentes anfitriones (1,15). Esto también se evidenció en el presente estudio en donde los aislados presentaron resistencia a un número de antimicrobianos aunque a diferentes niveles. A diferencia de las observaciones de los autores de los dos estudios (1,15) quienes informaron más de 90% de susceptibilidad a cefalosporinas, aminoglucósidos y fluoroquinolonas; en el presente estudio la susceptibilidad a estos antibióticos se situó en <70%. Aunque con base en los estudios in vitro de las fluoroquinolonas así como de las cefalosporinas de tercera y cuarta generación, se sugieren los fármacos a elegir para el tratamiento de la bacteriemia Aeromonas severa (15), los médicos todavía tienen que tener en cuenta la complejidad existente en la correlación in vitro – in vivo de los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana mostradas por las Aeromonas spp. Con los resultados de esta y otras investigaciones, las moscas domésticas se pueden considerarse como importantes vectores de las bacterias causantes de enfermedades gastrointestinales, incluyendo las Aeromonas en las áreas de estudio y posiblemente en otras partes de Irán. Los esfuerzos para el control de las infecciones causadas por esta bacteria particular deben, por lo tanto, tener en cuenta a la Musca domestica. Los organismos transmitidos son resistentes a diversos antimicrobianos a diferentes niveles. Por lo tanto, los planes que en el futuro se orienten para detener las infecciones causadas por estos organismos deberán tomar en cuenta a las moscas.

Conflicto de intereses Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Competing interests Authors declare that they have no competing interests.

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):4937-4946, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Pseudomonas aeruginosa: an emerging nosocomial trouble in veterinary Pseudomonas aeruginosa: un problema nosocomial emergente en veterinaria Yuly Bernal-Rosas,1 M.Sc, Karen Osorio-Muñoz,1 M.V, Orlando Torres-García,1* Ph.D.

Universidad Antonio Nariño, Facultad de Medicina Veterinaria, Carrera 3 este # 47A-15, Bogotá, D.C., Colombia. *Correspondence: ortorres@uan.edu.co. 1

Received: August 2014; Acepted: February 2015.

ABSTRACT Objective. The goal of this study was to evaluate the susceptibility pattern of isolates P. aeruginosa from veterinary clinical centers in Bogotá, D.C., to some commonly used antibiotics in clinical. Materials and methods. Bacteriological standard protocols were used for the isolation and identification of bacterial strains. To evaluate the antimicrobial susceptibility of the isolates, to commonly used antibiotics, was performed the Kirby-Bauer agar-disk diffusion method on Mueller-Hinton agar. Results. A total of 160 samples was taken from clinical specimens and the environment in different veterinary clinics. Out of these samples, 89 (55.6%) were gram-negative strains, of which ten strains of P. aeruginosa were isolated (11.2%). All strains were resistant to Cefazolin, Lincomycin, Cephalothin, Ampicillin, Clindamycin, Sulfamethoxazole-Trimethoprim and Chloramphenicol while some isolates exhibited either resistance or an intermediate response to Amikacin (30%), Gentamicin (30%), Tobramycin (10%), Ciprofloxacin (20%), Ceftazidime (30%), Erythromycin (100%), Tetracycline (100%), Imipenem (10%), Meropenem (90%) and Bacitracin (90%). Conclusions. The results demonstrate that the acquired antimicrobial resistances of P. aeruginosa strains depend on antibiotic protocols applied. As observed in human hospitals, Pseudomonas aeruginosa is acting as one of the multidrug-resistant microorganisms of veterinary clinical relevance. Key words: Antibiotic resistance, Bacteria, Dog, Multidrug-resistant, Nosocomial infections. (Source: NLM).

RESUMEN Objetivo. Evaluar el comportamiento a algunos antibióticos de uso común en clínica de cepas de Pseudomonas aeruginosa aisladas de centros clínicos veterinarios en Bogotá, D.C. Materiales y métodos. Un protocolo bacteriológico estándar se utilizó para el aislamiento e identificación de cepas bacterianas. Para evaluar la sensibilidad de los aislamientos bacterianos a diferentes antimicrobianos de uso clínico común, se empleó el método de difusión sobre agar Mueller-Hinton de Kirby-Bauer. Resultados. Un total de 160 muestras fueron tomadas a partir de muestras clínicas y del ambiente de diferentes clínicas veterinarias de la ciudad de Bogotá. De estas muestras, 89 (55.6%) fueron cepas bacterianas gram-negativas, de las que se aislaron 10 cepas de P. aeruginosa (11.2%). Todas las cepas de P. aeruginosa mostraron resistencia a la Cefazolina, Lincomicina, Cefalotina, Ampicilina, Clindamicina, Trimetoprim- Sulfametoxazol y Cloranfenicol; mientras que algunas de éstas, mostraron resistencia o una respuesta intermedia a Amikacina (30%), Gentamicina (30%), Tobramicina (10%), 4937

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Ciprofloxacina (20%), Ceftazidima (30%), Eritromicina (100%), Tetraciclina (100%), Imipinem (10%), Meropenem (90%) y Bacitracina (90%). Conclusiones. Los resultados demuestran que la resistencia adquirida a los antimicrobianos en las cepas de P. aeruginosa aisladas de estos centros clínicos depende de los protocolos antibióticos aplicados. Al igual que sucede en los nosocomios Humanos, Pseudomonas aeruginasa se está comportando como uno de los microorganismos multirresistetes de relevancia clínica causante de infecciones nosocomiales veterinarias. Palabras clave: Bacterias, infecciones nosocomiales, multiresistencia, perros, resistencia a antibioticos. (Fuente: NLM).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Resistance to antibiotics is a growing problem worldwide, especially among nosocomial pathogens, and the spread of resistant bacteria is favored by the inappropriate use of antibiotics (1), leading to longer hospital stays and higher treatment costs (2). Several studies suggest that the antibiotic resistance is increasing from nosocomial isolates (3). The nutritional versatility and the ubiquity of Pseudomonas aeruginosa have made it becomes one of the most-common causes of Gram-negative nosocomial infections (4).

La resistencia a los antibióticos es un problema creciente en todo el mundo, especialmente entre los patógenos nosocomiales; la propagación de las bacterias resistentes se ve favorecida por el uso inadecuado de los antibióticos (1) que dá lugar a estancias hospitalarias más largas y mayores costos de tratamiento (2). Varios estudios sugieren que la resistencia a los antibióticos está aumentando a partir de los aislados nosocomiales (3). La versatilidad nutricional y la ubicuidad de la Pseudomonas aeruginosa la convierten en una de las causas más comunes de infecciones nosocomiales gram-negativas (4).

Pseudomonas aeruginosa is a motile, gramnegative rod that belongs to the family Pseudomonadaceae. P. aeruginosa is widely distributed in nature, and it has been isolated from various biological samples and different inorganic surfaces (5,6). P. aeruginosa is increasingly recognized as an emerging opportunistic pathogen of clinical relevance that causes of chronic and recurrent infections in both humans and animals, particularly, in dogs and cats the most-frequent diseases include otitis external/media, urinary tract infection and pyoderma (7-9). In Latin America, bacterial resistance in hospitals presents a high variety with small differences among countries, including Colombia. Epidemiological studies conducted in Bogotá in early 2000 showed a prevalence of 37% for P. aeruginosa, this being one of clinically relevant bacteria that most commonly cause nosocomial infections reviewed by Cabrera et al (10). However, no studies have analyzed the impact of this problem in veterinary clinical centers, in Bogotá. P. aeruginosa isolates are naturally resistant to a large number of antibiotics; however, mechanisms of antimicrobial resistance, such as efflux pumps and porins, has allowed to these strains extend the range of antibiotic resistance (11). Multiple antibiotic resistances have created significant problems in the treatment of infected wounds. On the other hand, treatment failure and cross-resistance between strains and the spread of strains from patient to patient can result in multidrug resistance (MDR) P. aeruginosa. (12).

La Pseudomonas aeruginosa es un vacilo móvil gram-negativo que pertenece a la familia de las Pseudomonadaceae. La P. aeruginosa está ampliamente distribuida en la naturaleza y se ha aislado a partir de diversas muestras biológicas y diferentes superficies inorgánicas (5,6). La P. aeruginosa es cada vez más reconocida como un patógeno oportunista emergente de relevancia clínica que causa infecciones crónicas y recurrentes en los seres humanos y los animales, particularmente en los perros y los gatos donde las enfermedades más frecuentes son otitis externa/media, infección del tracto urinario y pioderma (7-9). En América Latina, la resistencia bacteriana en los hospitales presenta una alta variedad con pequeñas diferencias entre los países, entre ellos Colombia. Estudios epidemiológicos llevados a cabo en Bogotá a principios de 2000 mostraron una prevalencia del 37% para la P. aeruginosa, siendo esta una de las bacterias clínicamente relevantes que causan con mayor frecuencia las infecciones nosocomiales revisado por Cabrera et al (10). Sin embargo, ningún estudio ha analizado el impacto de este problema en las clínicas veterinarias de Bogotá. Las P. aeruginosa aisladas son naturalmente resistentes a un gran número de antibióticos; sin embargo, los mecanismos de resistencia a los antibióticos, tales como bombas de eflujo y porinas, le han permitido a estas cepas ampliar la gama de resistencia a los antibióticos (11). La multi-resistencia a los antibióticos ha creado problemas significativos en el tratamiento de heridas infectadas. Por otro lado,

Bernal-Rosas - Antimicrobial resistance of Pseudomonas aeruginosa

Taking into account the above considerations, the aim of this survey was to assess the susceptibility pattern of P. aeruginosa isolates from veterinary clinical centers in Bogotá, D.C., to some commonly used antibiotics in clinical.

MATERIALS AND METHODS Study design. This prospective observational study was carried out at the Veterinary Faculty of Antonio Nariño University from Bogotá, D.C., Colombia, between June 2013 and May 2014. Dog patients that were considered to be at high risk of developing nosocomial events were eligible for enrollment in the study (Most hospitalized patients presented primarily infections of viral or bacterial type). The study was restricted to patients (canines) that were hospitalized for at least one day in the respective critical care units (88.9% of patients were hospitalized for more than 4 days). Bacterial isolates. 135 samples from a variety of clinical specimens of dogs (stool (n =91), urine (n =14), nasal discharge (n =6), wound swab (n =8), surgical site infections (n =3), swab from skin (n =8) and ear (n =5)) and 25 environmental samples (surgical instruments, dressings, baths, surgical rooms, devices, floors, walls, beds, sinks, examination tables and wastewater) were examined. Cotton swabs were used to collect samples. The samples were placed into Brain Heart Infusion (BHI) broth (Oxoid, UK) and were sent immediately to the microbiology laboratory. Sample processing. Samples were inoculated onto 5% of sheep blood agar plates (Oxoid, UK) and incubated at 37°C for 24 h. The identification of Pseudomonas was on the basis of colony morphology and Gram Staining; any suspicious colony was subcultured on cetrimide agar plates (CM0579 Oxoid, UK), and purified. The isolate were identified as a P. aeruginosa based on biochemical test. Such as oxidase test, motility, aerobic fermentation of glucose, lactose, maltose and mannitol, arginine and lysine utilization, nitrate reduction, production of urease and DNAse, ONPG (orthonitrophenylbeta-D-galactopyranoside) test, acetamide and esculin hydrolysis, and susceptibility to polymyxin, was performing according to (13).  Isolates were stored at -80°C in Mueller-Hinton Broth (Merck, Germany) supplemented with 40 per cent glycerol (v/v). Antibiotic sensitivity assay. Antimicrobial susceptibility to a panel of 18 antimicrobial agents most commonly used in veterinary

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el fracaso del tratamiento, la resistencia cruzada entre las cepas y la propagación de estas de paciente a paciente, pueden dar lugar a multi-resistencia a los medicamentos (MDR por sus siglas en inglés) de la P. aeruginosa. (12). En vista de las consideraciones anteriores, este estudio tuvo por objeto evaluar el patrón de susceptibilidad de las P. aeruginosa aisladas, procedentes de clínicas veterinarias de Bogotá, D.C., a algunos antibióticos de uso común en los tratamientos.

MATERIALES Y MÉTODOS Diseño del estudio.Este estudio observacional prospectivo se llevó a cabo en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Antonio Nariño de Bogotá, D.C., Colombia, entre junio de 2013 y mayo de 2014. Los pacientes caninos que se consideraron en alto riesgo de desarrollar eventos nosocomiales eran elegibles para ser incluidos en el estudio (la mayoría de los pacientes hospitalizados presentaban principalmente infecciones de tipo viral o bacteriana). El estudio se limitó a los pacientes (caninos) que fueron hospitalizados por lo menos durante un día en las respectivas unidades de cuidados intensivos (el 88,9% de los pacientes fueron hospitalizados durante más de 4 días). Aislados bacterianos. Se examinaron 135 muestras procedentes de una variedad de ejemplares de perros (excrementos (n=91), orina (n=14), secreción nasal (n=6), frotis de heridas (n=8), infecciones en heridas de cirugía (n=3), frotis de piel (n=8) y oído (n=5) y 25 muestras ambientales (instrumental quirúrgico, vendajes, baños, salas quirúrgicas, equipos, pisos, paredes, camas, lavabos, mesas de examen y aguas residuales). Se utilizaron hisopos de algodón para recoger las muestras. Las muestras se colocaron en un medio de cultivo BHI (Brain Heart Infusion) (Oxoid, Reino Unido) y se enviaron inmediatamente al laboratorio de microbiología. Procesamiento de las muestras. Las muestras se inocularon en placas de agar con sangre de oveja al 5% (Oxoid, Reino Unido) y se incubaron a 37°C durante 24 h. La identificación de la Pseudomonas se hizo con base en la morfología de la colonia y la técnica de tinción de Gram; todas las colonias presuntivas se subcultivaron sobre placas de agar cetrimide (CM0579 Oxoid, Reino Unido) y se depuraron. Los aislados se identificaron como P. aeruginosa con base en pruebas bioquímicas. Pruebas tales como las de oxidasa, motilidad, fermentación aerobia de la glucosa, la lactosa, la maltosa y el manitol, utilización de la arginina y la lisina, reducción de nitrato, producción de ureasa, DNasa, ONPG (ortonitrofenilbeta-D-galactopiranósido), hidrólisis de la acetamida y de la esculina y susceptibilidad a la polimixina,

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clinical centers in Bogota was carried out on Muller-Hinton agar by using Kirby Bauer disc diffusion technique reformation by the Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests (CLSI) suggestions (14). The following antimicrobials for P. aeruginosa were used: Aminoglycosides: Amikacin (AMI 30 μg), Gentamicin (GM 10 μg) and Tobramycin (TOB 10 μg). Fluoroquinolones: Ciprofloxacin (CIP 5 μg) and Norfloxacin (NOR 10 μg). Cephalosporins: First generation: Cefazolin (CZ 30 μg) and Cephalothin (CF 30 μg); Third generation: Ceftazidime (CAZ 30 μg). Macrolides: Erythromycin (E 15 μg). Penicillins: Ampicillin (AMP 10 μg). Tetracyclines: Tetracycline (TE 30 μg). Lincosamides: Lincomycin (L 2 μg) and Clindamycin (DA 2 μg). Carbepenems: Imipinem (IPM 10 μg) and Meropenem (MEM 10 μg). Polypeptides: Bacitracin (B 10 μg). Sulfonamides: Trimethoprim-Sulfamethoxazole (SXT 1.25/23.75 μg). Chloramphenicol: Chloramphenicol (C 30 μg). The inhibition zone diameter around each disk was measured and was interpreted as described by the NCCLS, which classifies the organism into three categories: sensitive (S), intermediate sensitive (I) and resistant (R) (14). Multiple antibiotic resistance index. The multiple antibiotic resistance (MAR) index was determined for each isolate by dividing the numb er o f ant i b i o t i c s t o w hi c h the isolate is resistant by the total number of antibiotics tested (15). Multidrug resistance was defined as resistance to two or more antimicrobial classes. Any sign of inhibition or sensitivity was considered to be indicative of nonresistance. Quality Control of antimicrobial susceptibility tests. Quality control was performed utilizing strains from the American type culture collection (ATCC), P. aeruginosa ATCC 27853. Ethical approval. Regarding ethical considerations, these studies adhered to the Article 11 from Resolution No. 008430 on October 4, 1993 by the Colombian Ministry of Health according to whose classification, these are minimum-risk studies.

RESULTS Between February 2013 and June 2013, 160 bacterial strains were collected from a variety of clinical specimens and environment samples of several veterinary clinics. Out of these samples, 89 (55.6%) were gram-negative strains, of

se realizaron de acuerdo con (13). Los aislados se almacenaron a -80°C en un medio de Mueller-Hinton (Merck, Alemania) con una adición de glicerol al 40 por ciento (v/v). Ensayo de sensibilidad a los antibióticos. La susceptibilidad antimicrobiana a un panel con los 18 agentes antimicrobianos más utilizados en las clínicas veterinarias en Bogotá, se llevó a cabo en agar Muller-Hinton utilizando la técnica Kirby-Bauer de difusión por discos reformulada por sugerencia de los Estándares de Desempeño para Ensayos de Sensibilidad Antimicrobianas por Discos (CLSI) (14). Se utilizaron los siguientes antimicrobianos para P. aeruginosa: aminoglucósidos: amikacina (IAM 30 μg), gentamicina (GM 10 μg) y tobramicina (TOB 10 μg). Para las fluoroquinolonas: ciprofloxacina (CIP 5 μg) y norfloxacina (NOR 10 μg). Para las cefalosporinas: Primera generación: Cefazolina (CZ 30 μg) y cefalotina (CF 30 μg); tercera generación: ceftazidima (CAZ 30 μg). Para los macrólidos: eritromicina (E 15 μg). Las penicilinas: ampicilina (AMP 10 mg). Tetraciclinas: La tetraciclina (TE 30 mg). Lincosamidas: lincomicina (L 2 μg) y clindamicina (DA 2 μg). Carbepenemas: Imipenem (IPM 10 μg) y meropenem (MEM 10 μg). Para los polipéptidos: Bacitracin (B 10 μg). Para las sulfonamidas: trimetoprim-sulfametoxazol (SXT 1.25 / 23.75 μg). Cloranfenicol: cloranfenicol (C 30 μg). El diámetro de la zona de inhibición alrededor de cada disco se midió y se interpretó como lo describe el NCCLS, que clasifica el organismo en tres categorías: sensible (S), sensible intermedio (I) y resistente (R) (14). Índice de multi-resistencia a los antibióticos. El índice de multi-resistencia a los antibióticos (RAM) se determinó para cada aislado dividiendo el número de antibióticos a los que el aislado es resistente por el número total de antibióticos ensayados (15). La multi-resistencia se definió como la resistencia a dos o más clases de antimicrobianos. Cualquier signo de inhibición o sensibilidad se consideró como indicativo de no resistencia. Control de calidad de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. El control de calidad se llevó a cabo utilizando cepas de la American Type Culture Collection (ATCC), P. aeruginosa ATCC 27853. Aprobación ética. De acuerdo con consideraciones éticas, estos estudios se adhirieron al artículo 11 de la Resolución No 008430 del 4 de octubre de 1993 del Ministerio de Salud de Colombia; de acuerdo con su clasificación se trata de estudios de riesgo mínimo.

RESULTADOS Entre febrero de 2013 y junio de 2013, se recogieron 160 cepas bacterianas a partir de una variedad de

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which 10 (11.2%) strains of P. aeruginosa were isolated. 3 (30%) were isolated from environmental samples, and 7 (70%) were isolated from clinical specimens. In this study, P. aeruginosa was most commonly isolated from surgical sites (57.1%). The percentage of strains susceptible, intermediate, or resistant to each antibiotic is presented in table 1. All 10 (100%) strains tested were susceptible to Norfloxacin, followed by Tobramycin (90%), Imipinem (90%), Ciprofloxacin (80%), Amikacin (70%), Gentamicin (70%), Ceftazidime (70%). Of the remaining antibiotics tested, Meropenem and Bacitracin exhibited the least activity against P. aeruginosa with 90% of the resistant strains each one. Notably, 100% of the isolates exhibited resistance to Cefazolin, Lincomycin, Cephalothin, Ampicillin, Clindamycin, SulfamethoxazoleTrimethoprim and Chloramphenicol while some isolates exhibited either resistance or an intermediate response to Amikacin (30%), Gentamicin (30%), Tobramycin (10%), Ciprofloxacin (20%), Ceftazidime (30%), Erythromycin (100%), Tetracycline (100%), Imipinem (10%), Meropenem (90%) and Bacitracin (90%). Multiple antibiotic resistances were seen in all Pseudomonas aeruginosa isolated strains.

muestras clínicas y ambientales tomadas en varias clínicas veterinarias. De estas muestras, 89 (el 55.6%) correspondieron a cepas gram-negativas, de las que se aislaron 10 (el 11.2%) cepas de P. aeruginosa. De estas, 3 (el 30%) se aislaron de muestras tomadas en el ambiente y 7 (el 70%) de muestras clínicas. En este estudio, la P. aeruginosa fue la que se aisló más comúnmente en las heridas quirúrgicas (57.1%). En la Tabla 1 se presenta el porcentaje de cepas sensibles, intermedias o resistentes a cada antibiótico. Todas las 10 (100%) cepas examinadas eran susceptibles a la norfloxacina, seguida de la tobramicina (90%), el imipenem (90%), la ciprofloxacina (80%), la amikacina (70%), la gentamicina (70%) y la ceftazidima (70%). De los restantes antibióticos ensayados, el meropenem y la bacitracina mostraron la menor actividad contra P. aeruginosa con 90% de las cepas resistentes a cada uno de ellos. Cabe destacar que el 100% de los aislados mostró resistencia a la cefazolina, lincomicina, cefalotina, ampicilina, clindamicina, sulfametoxazoltrimetoprima y cloranfenicol, mientras que algunos aislados mostraron resistencia o una respuesta intermedia a amikacina (30%), gentamicina (30%), tobramicina (10%), ciprofloxacina (20%), ceftazidima (30%), eritromicina (100%), tetraciclina (100%), Imipenem (10%), Meropenem (90%) y bacitracina (90%).

Table 1. Antibiotic susceptibility patterns of P. aeruginosa. Antibiotic Aminoglycosides AMK GM TOB* Fluoroquinolones CIP* NOR* Cephalosporins CZ CF CAZ* Macrolides E Penicillins AMP Tetracyclines TE Lincosamides L DA Carbepenems IPM MEM Polypeptides B* Sulfonamides SXT Chloramphenicol C

Disk Content (μg)

P. aeruginosa (n =10) I% R%

Zone Diameter (mm) S

30 10 10

≥ 17 ≥ 15 ≥ 15

15 -16 13 -14 13 -14

≤ 14 ≤ 12 ≤ 12

70 70 90

20 10 -

10 20 10

5 10

≥ 21 ≥ 17

16 -20 13 -16

≤ 15 ≤ 12

80 100

10 -

30 30 30

≥ 18 ≥ 18 ≥ 18

15 -17 15 -17 15-17

≤ 14 ≤ 14 ≤ 14

100 100 30

≥ 23

14 -22

≤ 13

≥ 17

14 -16

≤ 13

100

≥ 19

15 -18

≤ 14

2 2

≥ 21 ≥ 21

15 -20 15 -20

≤ 14 ≤ 14

100 100

10 10

≥ 19 ≥ 19

16-18 16 -18

≤ 15 ≤ 15

90 10

10 30

≥ 13

9 -12

≤

1.25/23.75

≥ 16

11 -15

≤ 10

100

≥ 18

13 -17

≤ 12

100

Amikacin (AMI), Gentamicin (GM), Tobramycin (TOB), Ciprofloxacin (CIP), Norfloxacin (NOR), Cefazolin (CZ), Cephalothin (CF), Ceftazidime (CAZ), Erythromycin (E), Ampicillin (AMP), Tetracycline (TE), Lincomycin (L), Clindamycin (DA), Imipinem (IPM), Meropenem (MEM), Bacitracin (B), TrimethoprimSulfamethoxazole (SXT), Chloramphenicol (C). Susceptible (S), intermediate (I) and resistant (R).*No NCCLS breakpoint.

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However, one of these clinic samples, showed the highest MDR 16/18 antibiotics tested (MAR 0.9). Table 2 shows multiple antibiotic resistance (MAR) index of P. aeruginosa isolates, which shows that, 80% had MAR index of 0.5 and above.

Se observaron múltiples resistencias a antibióticos en todas las cepas aisladas de Pseudomonas aeruginosa. Sin embargo, una de estas muestras clínicas mostró la mayor MDR 16/18 a los antibióticos ensayados (RAM=0.9). En la tabla 2 se muestra el índice de multi-resistencia a los antibióticos (RAM) de las cepas de P. aeruginosa, lo que demuestra que el 80% tenía un índice RAM de 0.5 y superior.

Table 2. Multiple antibiotic resistance (MAR) index of P. aeruginosa isolates.

DISCUSIÓN

No. of P. aeruginosa isolates

Percentage (%)

M.A.R.

0.5

0.6

0.9

DISCUSSION Pseudomonas aeruginosa is a major cause of nosocomial infections in immunocompromised patients, especially in hospitalized burn patients (16). P. aeruginosa is intrinsically resistant to several antibiotics because of the low permeability of its outer-membrane, the constitutive expression of various efflux pumps, and the production of antibiotic-inactivating enzymes (11). Infections caused by resistant strains are a true concern in many hospitals worldwide since they are associated with a high mortality, secondary bacteremia, an increase in the length of hospital stay, and a considerable increase in healthcare costs (17). Has been reported that about 5 to 10% of hospitalized human patients acquire an infection of hospital origin (18), not very dissimilar from the observed percentages in veterinary practice in small animal species, where prevalence reported is between 0.8 and 18.1%, according to the established surgical procedure (19). So the present study was conducted to determine the antibiotic resistance pattern of Pseudomonas aeruginosa isolated from clinical and environmental samples in various veterinary clinical centers in Bogotá, D.C. In the present study, the highest rate (51.7%) of Pseudomonas aeruginosa infections was observed in the examination room and surgical ward, followed by isolating strains of environment, in clinical floors, surgical rooms and exam table (30%). These results are in line with studies of Rakesh on 2012 (20).

La Pseudomonas aeruginosa es una causa importante de las infecciones nosocomiales en pacientes inmunodeprimidos, especialmente en aquellos hospitalizados por quemaduras (16). La P. aeruginosa es intrínsecamente resistente a varios antibióticos debido a la baja permeabilidad de su membrana externa, la expresión constitutiva de varias bombas de eflujo y la producción de enzimas que inactivan a los antibióticos (11). Las infecciones causadas por las cepas resistentes son una verdadera preocupación en muchos hospitales de todo el mundo ya que se asocian con una alta mortalidad, bacteriemia secundaria, aumento en la duración de la estancia hospitalaria y aumento considerable en los costos de salud (17). Se ha informado que alrededor del 5 al 10% de pacientes humanos hospitalizados adquieren una infección de origen hospitalario (18) y no es muy diferente a los porcentajes observados en la práctica veterinaria en especies animales pequeñas, donde la prevalencia reportada está entre el 0.8 y el 18.1%, de acuerdo con el procedimiento quirúrgico establecido (19). En consecuencia el presente estudio se realizó para determinar el patrón de resistencia a los antibióticos de las Pseudomonas aeruginosa aisladas de muestras clínicas y ambientales en diversas clínicas veterinarias de Bogotá, D.C. En el presente estudio se observó la tasa más alta (51.7%) de infecciones por Pseudomonas aeruginosa en la salas de toma de muestras y salas de cirugía, seguida por las cepas aisladas en el medio ambiente, pisos, salas quirúrgicas y mesas de examen (30%). Estos resultados son consistentes con los estudios de Rakesh en 2012 (20). Los aminoglucósidos matan a las bacterias mediante la inhibición de la síntesis de proteínas adhiriéndose al 16S rANR y mediante la interrupción de la integridad de la membrana celular bacteriana (21). En este estudio, el diez por ciento de las P. aeruginosa son intermedia o marginalmente sensibles a la gentamicina con una resistencia del 20%; esta información revela que su resistencia está aumentando. Estos resultados son similares a los reportados en estudios previos (15). Sin embargo, los aminoglucósidos más nuevos con un espectro más amplio de actividad antibacteriana,

Bernal-Rosas - Antimicrobial resistance of Pseudomonas aeruginosa

Aminoglycosides kill bacteria by inhibiting protein synthesis via binding to the 16S rRNA and by disrupting the bacterial cell membrane integrity (21). In this study, ten percent P. aeruginosa is intermediate or marginally sensitive to gentamicin with 20% resistant these data reveal that the gentamicin resistance is increasing. These results are similar to those reported in previous studies (15). However, the newer aminoglycosides with a broader spectrum of antibacterial activity, such as Amikacin, Gentamicin and Tobramycin, which in this study, showed relatively high activity of 70%, 70% and 90% against P. aeruginosa strains, respectively. Similarly, Harada and Lin, reported on 2012, a low percentage of resistance to Amikacin and Gentamicin (22, 23). Suggesting that these could still be the gold standard for treatment in cases of more resistant bacteria. Fluoroquinolones, particularly Ciprofloxacin, are commonly used in the treatment of P. aeruginosa infections. Ciprofloxacin is the one antibiotic with antipseudomonal coverage. P. aeruginosa is most susceptible to Ciprofloxacin and Imipenem (16, 24). In contrast, this study shows that these isolates have started developing resistance or marginally sensitive (20%) against Ciprofloxacin, probably due to its irrational and inappropriate use. These results are consistent with those reported in other studies (22, 25, 26). Was found that strains of P. aeruginosa isolates are resistant to multiple drugs, suggesting that selective pressure created by the persistent and possibly inappropriate use of these antimicrobials in veterinary clinic practice is one of the determining factors for the emergence of resistance; reason that justifies the MIR greater than 0.5 in 80% of P. aeruginosa strains isolated in the study; these results are consistent with those reported by Kyung-Mee on 2013 (27). β-Lactam antibiotics, including antipseudomonal Penicillins, Cephalosporins, Monobactams, and Carbapenems, remain essential components for the treatment of nosocomial infections by Pseudomonas aeruginosa (28). Nevertheless, in this study, with the exception of Ceftazidime and Imipinem, all P. aeruginosa strains, were resistant to Cefazolin, Cephalothin, Ampicillin and Meropenem. In the same way, other antibiotics probed in this study such as, Macrolides, Tetracyclines, Lincosamides, Polypeptides, Sulfonamides and Chloramphenicol, exhibited the least activity against P. aeruginosa; resistance to these ﬁrst-line antibiotics is increasing and frequently associated with multidrug resistance (MDR) phenotypes (29, 30). These results could suggest the possible extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) production in these

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tales como la amikacina, la gentamicina y la tobramicina, mostraron en este estudio una actividad relativamente alta del 70%, 70% y 90% frente a cepas de P. aeruginosa, respectivamente. Del mismo modo, Harada y Lin reportaron, en el año 2012, un bajo porcentaje de resistencia a la amikacina y a la gentamicina (22, 23). Ello sugiere que estas podrían seguir siendo la regla de oro para el tratamiento en los casos de las bacterias más resistentes. Las fluoroquinolonas, especialmente la ciprofloxacina, se utilizan comúnmente en el tratamiento de las infecciones por P. aeruginosa. La ciprofloxacina es un antibiótico con cobertura antipseudomónica. La P. aeruginosa es más susceptible a la ciprofloxacina y al Imipenem (16,24). Por el contrario, este estudio muestra que estos aislados comenzaron a desarrollar resistencia o sensibilidad marginal (20%) frente a la ciprofloxacina, posiblemente por su uso irracional e inapropiado. Estos resultados son consistentes con los reportados en otros estudios (22, 25, 26). Se encontró que las cepas de P. aeruginosa aisladas son resistentes a múltiples fármacos, lo que sugiere que la presión selectiva creada por el uso persistente y posiblemente inadecuado de estos antimicrobianos en la práctica clínica veterinaria, es uno de los factores determinantes para la aparición de la resistencia; por esta razón se justifica un MIR superior al 0,5 en el 80% de las cepas de P. aeruginosa aisladas en el estudio; estos resultados son consistentes con los reportados por Kyung-Mee en 2013 (27). Los antibióticos β-lactámicos, incluyendo aquellos antipseudomonales tales como penicilinas, cefalosporinas, monobactámicos y carbapenemes, siguen siendo componentes esenciales en el tratamiento de las infecciones nosocomiales por Pseudomonas aeruginosa (28). Sin embargo, en este estudio, con excepción de la ceftazidima y el imipenem, todas las cepas de P. aeruginosa, fueron resistentes a la cefazolina, la cefalotina, la ampicilina y el meropenem. De la misma manera otros antibióticos probados en el estudio, tales como los macrólidos, tetraciclinas, lincosamidas, polipéptidos, sulfonamidas y cloranfenicol, exhibieron la menor actividad contra la P. aeruginosa; la resistencia a estos antibióticos de primera línea está aumentando y se asocia frecuentemente con fenotipos de multi-resistencia a fármacos (MDR) (29, 30). Estos resultados podrían sugerir la posible producción de beta-lactamasas de espectro extendido (ESBL por sus siglas en inglés) en estas cepas MDR de P. aeruginosa; sin embargo, se requieren estudios de confirmación. Se pueden señalar numerosas causas para el desarrollo de cepas resistentes a los antibióticos. En los países en desarrollo la automedicación, la venta libre y la prescripción de antibióticos de amplio espectro que actúan contra un amplio rango de diferentes

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MDR strains of P. aeruginosa; nonetheless, confirmation studies are required.

microbios, son las principales fuentes de inducción a la resistencia a los antimicrobianos.

Numerous reasons can be assigned to the development of antibiotic resistant strains. In developing countries due to self-medication, free sale of antibiotics and antibiotic prescribing broad-spectrum that are activity against a wide range of different microbes, are the main sources of induction of antimicrobial resistance.

En conclusión las infecciones nosocomiales en la medicina veterinaria son un problema emergente.

In conclusion the nosocomial infections in veterinary medicine are an emerging trouble. Multidrug resistance was observed in all strains of P. aeruginosa isolated in this work, possibly is due to antibiotic protocols applied in veterinary clinical. Like to in human hospitals, Pseudomonas aeruginosa today, is one of the microorganisms of veterinary clinical relevance in Bogota. These results highlight the need to implement microbiological monitoring programs for multidrug resistant organisms and infection control procedures at veterinary clinical centers. Additionally, the mandatory incorporation of antibiograms as a guide in selecting empiric antibiotic therapy. Finally, the possibility of bacterial spread from animals to humans or vice versa requires particular attention.

La multi-resistencia se observó en todas las cepas de P. aeruginosa aisladas en este trabajo y posiblemente se debe a los protocolos antibióticos aplicados en las prácticas clínicas veterinarias. Al igual que en los hospitales, la Pseudomonas aeruginosa es hoy en día uno de los microorganismos de mayor relevancia clínica veterinaria en Bogotá. Estos resultados ponen de manifiesto la necesidad de implementar programas de monitoreo microbiológico de los organismos multi-resistentes a fármacos y procedimientos para el control de infecciones en las clínicas veterinarias. Además, la incorporación obligatoria de antibiogramas como guía en la selección de la terapia antibiótica empírica. Por último, requiere especial atención a la posibilidad de propagación de bacterias de los animales a los seres humanos o viceversa. Declaración de conflicto de intereses Los autores no tienen asociaciones financieras o de otro tipo que puedan suponer un conflicto de intereses.

Conflict of interest statement

Agradecimientos

The authors do not have any financial or other associations that might pose a conflict of interest.

Este trabajo fue apoyado financieramente por una subvención de la Universidad Antonio Nariño.

Acknowledgements This work was financially supported by a grant from the University Antonio Nariño.

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):4947-4961, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Cellulolytic and Butyrivibrio fibrisolvens bacteria population density, after supplementing fodder diets (Pennisetum clandestinum) Densidad poblacional de bacterias celulolíticas y de Butyrivibrio fibrisolvens al suplementar dietas forrajeras (Pennisetum clandestinum) Licet Molina G,1 M.Sc, Luis Giraldo V, 2 P.hD, Diana Polanco E, 1 M.Sc, Lina Gutiérrez B, 1,3* Ph.D. Universidad de Antioquia, Escuela de Microbiología, Grupo de Investigación en Microbiología Veterinaria, Calle 67 # 53-108, AA 1226. Medellín, Colombia. 2Universidad Nacional de 1

Colombia, Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Producción Animal, Grupo Biotecnología Ruminal y Silvopastoreo “BIORUM”, Calle 59A No 63-20. Medellín, Colombia. 3Escuela de Ciencias de la salud, Facultad de Medicina; Universidad Pontificia Bolivariana; Sede Central Medellín; Calle 78B N°72A-109, Medellín, Colombia. *Correspondence: liangutibui@gmail.com Received: April 2014; Acepted: February 2015.

ABSTRACT Objective. Determine the population density of cellulolytic bacteria, Butyrivibrio fibrisolvens and the concentration of vaccenic acid, by supplementing diets consisting of kikuyu grass (Pennisetum clandestinum Hoechst. Ex Chiov.) as base ingredient, together with cassava flour and biomass (effluent from ethanol production) in rumen simulator-Rusitec. Materials and methods. Four treatments (T) were evaluated, these were composed as: T1/Control 1: 100% kikuyu grass with a total protein intake of 23.9%, T2: a mixture of 70% kikuyu grass, 20% biomass and 10% cassava flour with a total protein intake of 19.4%; T3/Control 2: 100% kikuyu grass, with a 17.8% protein intake and T4: 70% kikuyu grass, 20% biomass and 10% cassava flour with a 15.3% protein intake. One and two-way variance analysis was made and the Pearson correlation coefficient was determined. Results. An increase was observed in the population density of viable cellulolytic bacteria (CFU/ml) and B. fibrisolvens statistically significant (p<0.005) with treatment T2, in contrast to T1, T3 and T4 treatments. In addition, there was a significant increase in the concentration of vaccenic acid (mg/L) in the ruminal content in Rusitec with the same treatment (T2). Conclusions. Results obtained in this ruminal simulation study are evidence to the benefits of kikuyu grass together with cassava flour and biomass diet implementation on the growth of ruminal cellulolytic and B. fibrisolvens bacteria, as well as on the production of vaccenic acid. The study also suggests the nutritional potential that such supplements could provide to grazing bovine feeding. Key words: Dietary supplements, fermentation, ruminal fermentation, Rumen (Source: MeSH).

RESUMEN Objetivo. Determinar la densidad poblacional de bacterias celulolíticas, Butyrivibrio fibrisolvens y la concentración de ácido vaccénico, al suplementar dietas forrajeras de pasto kikuyo con harina de yuca y biomasa (resultante de la producción de etanol), en el simulador de rumen- Rusitec. Materiales 4947

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y métodos. Se evaluaron cuatro tratamientos (T): T1/Control 1: 100% pasto kikuyo con un aporte total de 23.9% de proteína, T2: 70% pasto kikuyo, 20% biomasa y 10% harina de yuca con un aporte total de 19.4% proteína, T3/Control 2: 100% pasto kikuyo con un aporte total de 17.8% de proteína y T4: 70% pasto kikuyo, 20% biomasa y 10% harina de yuca con un aporte total de 15.3% de proteína. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una y dos vías y se determinó el coeficiente de correlación de Pearson. Resultados. Se observó un incremento en la densidad poblacional de bacterias celulolíticas viables (UFC/ml) y de B. fibrisolvens estadísticamente significativas (p<0.005) con el tratamiento T2, en comparación con los tratamientos T1, T3 y T4. Adicionalmente, se detectó un aumento significativo en la concentración de ácido vaccénico (mg/L) en el contenido ruminal del Rusitec con el mismo tratamiento (T2). Conclusiones. Los resultados obtenidos en este estudio de simulación ruminal indican que la suplementación del pasto kikuyo con harina de yuca y biomasa favorecen el crecimiento de las bacterias celulolíticas ruminales y de B. fibrisolvens, así como la producción de ácido vaccénico, y sugieren el potencial nutricional que podría tener este tipo de suplementación en la alimentación de bovinos en pastoreo. Palabras clave: Fermentación, fermentación ruminal, Rumen, Suplementos dietéticos (Fuente: MeSH).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Cattle production in tropical areas like Colombia depends mainly on fodder supply from the pastures. Degradation of lignocellulosic matter contained in fodder is carried out by rumen microbial consortia, specifically by cellulolytic bacteria that take parton the degradation of structural carbohydrates to volatile fatty acids assimilated by the ruminant (1-3).

La producción ganadera en las zonas tropicales tales como Colombia, depende principalmente del suplemento forrajero procedente de los pastizales. La degradación de la materia lignocelulósica contenida en el forraje es realizada por los consorcios microbianos del rumen, específicamente las bacterias celulolíticas participan en la degradación de los carbohidratos estructurales a ácidos grasos volátiles, los cuales son asimilados por los rumiantes (1-3).

Butyrivibrio fibrisolvens is a strict ruminal anaerobe, with high cellulolytic, hemicellulolytic, proteolytic and uricolytic activity. It may represents significant portion (10-30%) of culture ruminal bacteria (4). This bacteria plays a major role in fiber degradation and it has been identified as the main bacterial species that participates in the process of biohydrogenation on unsaturated fatty acids present in diets based on fodder, grains and oils (5), which is a process that could lead to an increase in the concentration of fatty acids in milk and meat from ruminants (6,7). Some pastures available in different regions in Colombia lack adequate nutritional quality, and its production are seasonal, which reduces quality and return in the industry of milk and meat cattle (8). Previous research has suggested that supplementation of diets different industry subderivados (maize, cassava, fish oil, sunflower oil, etc.) improves use of high-fiber content and low digestibility fodder, enhance biodiversity of ruminal microorganisms and ruminal fermentation processes and, consequently, animal productivity (5,7). In the search of food supplements that improve digestion and degradation processes of fodders by bovines, diverse alternatives to pastures supplementation, mainly with fermentable and additive carbohydrates such as oils, concentrated food and grains, have been proposed.

Butyrivibrio fibrisolvens es una bacteria anaerobia estricta, con alta actividad celulolítica, hemicelulolítica, proteolítica y uricolítica. Representa una parte significativa (10-30%) del cultivo bacteriano ruminal (4). Desempeña un papel importante en la degradación de la fibra y se identifica como la principal especie bacteriana participante en el proceso de biohidrogenación de los ácidos grasos insaturados presentes en las dietas a base de forraje, granos y aceites (5). Este proceso podría llevar a un aumento de la concentración de los ácidos grasos en la leche y la carne, procedente de los rumiantes (6,7). Algunos pastizales de diferentes regiones de Colombia carecen de una adecuada calidad nutricional y su producción es estacional, reduciendo por tanto la calidad y el rendimiento de la leche y de la carne en la industria ganadera (8). Anteriores investigaciones sugieren que al suplementar diferentes dietas con subderivados de la industria (maíz, yuca, aceite de pescado, aceite de girasol, etc.) aumenta el consumo de forraje de alto contenido de fibra y baja digestibilidad, mejorando la biodiversidad de los microorganismos ruminales, y los procesos de fermentación ruminal y por consiguiente la productividad animal (5,7). En la búsqueda de suplementos alimenticios para los bovinos, con el fin de mejorar los procesos de digestión y degradación de forrajes,

Molina - Cellulolytic rumen bacteria after supplementing fodder diets

In 2008, and with the support of the Ministry of Agriculture and Rural Development of Colombia, the National Fuel Alcohol Program was created. One of the purposes of the program was to evaluate the production of ethanol from sugar cane and other agricultural sources such as banana, cassava and sorghum, with the objective of improving quality of fuels by biologic oxygenation and substitution of compounds such as methyl-tert-butyl ether, due to soil and underground water contamination originated in its use (9-11). Cassava (Manihot esculenta Crantz) has been considered one of the viable alternatives for ethanol production in the country, that together with corn, sugar cane and rice, are considered the most important energy sources in tropical regions worldwide, as it becomes one of the alternative crops with highest potential for ethanol production (12,13). Cassava has been widely considered a basic energetic food item in the industry of balanced food for animals, because of its protein and starch content. In another strategy, the use of cassava flour together with the biomass originated in ethanol production might constitute a promising supplementation practice for pastures in which yields are insufficient to achieve acceptable levels of production. It might also be considered an additional source of protein and energy for bovines (13). Kikuyu grass (Pennisetum clandestinum Hoechst. Ex Chiov.) is considered a basic feeding element by specialized dairy production systems in Colombia (14). Considering that fodder quality decreases as the plant grow solder, fibrous portion increases and decreases the protein content, digestibility and availability of energy for the animal lowered, which makes the evaluation of different alternatives of energetic supplementation to be included in the diet of the animal (13), it is possible that supplementing fodder such as kikuyu, could modify the ruminal biohydrogenation process, together with the subsequent formation of the principal components of CLA: rumenic acid (cis-9,trans-11) and vaccenic acid (trans-11C18:1). This study takes into consideration the participation of ruminal cellulolytic bacteria in fiber degradation and the participation of B. fibrisolvens in the process of biohydrogenation for CLA production as important indicators of ruminal fermentation. In this regard, the objective of this study was to determine the population density of the cellulolytic bacteria, B. fibrisolvens and the concentration of vaccenic acid, in response to the use of cassava flour and effluent biomass from ethanol production as supplements to Kikuyu grass with different concentration of protein in an artificial rumen (Rusitec).

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se han propuesto diversas alternativas para la suplementación de los pastizales, principalmente con carbohidratos fermentables y aditivos tales como aceites, concentrados y granos. En 2008, se creó el Programa Nacional de Alcohol Carburante, con el apoyo del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia. Uno de los propósitos de este programa era evaluar la producción de etanol obtenido de la caña de azúcar y de otras fuentes agrícolas tales como banano, yuca y sorgo, con el fin de mejorar la calidad de los combustibles mediante oxigenación biológica. Esta se logra sustituyendo compuestos como el éter metilterbutílico, cuyo uso produce contaminación de los suelos y de las aguas subterráneas (9-11). Se considera que la yuca (Manihot esculenta Crantz) es una de las alternativas viables para la producción de etanol en el país; y junto con el maíz, la caña de azúcar y el arroz, son las fuentes de energía más importantes en las regiones tropicales del mundo, convirtiéndose así en uno de los cultivos alternativos con mayor potencial para la producción de etanol (12,13). En la industria de alimentos balanceados para animales, la yuca ha sido ampliamente utilizada como un producto básico de la alimentación energética, debido a su contenido de proteína y almidón. Por otra parte, el uso de la harina de yuca junto con la biomasa obtenida de la producción de etanol, podría constituir una práctica promisoria de suplementación de pastizales, ya que el cultivo de éstos es insuficiente para lograr niveles de producción aceptables. También se considera fuente adicional de proteína y de energía para los bovinos (13). El pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum Hoechst. Ex Chiov.) se considera un alimento esencial para los sistemas especializados de producción lechera (14). Teniendo en cuenta que la calidad del forraje baja a medida que la planta crece, su parte fibrosa aumenta reduciendo el contenido proteínico, y por tanto disminuyen la digestibilidad y disponibilidad energética para el ganado, lo que hace que se evalúen las diferentes alternativas de suplementos energéticos en la dieta del animal (13). Es posible que la suplementación de dietas forrajeras como el kikuyo, podría modificar el proceso de biohidrogenación ruminal, junto con la subsecuente formación de los principales componentes del CLA (ácido linoleico conjugado): ácido ruménico (cis-9, trans-11) y ácido vaccénico (trans-11C18:1). Este estudio tiene en cuenta como indicadores importantes de la fermentación ruminal, la participación de las bacterias celulolíticas ruminales en la degradación fibrosa y de B. fibrisolvens en el proceso de biohidrogenación para la producción del CLA. En este sentido, el objetivo de este estudio fue determinar la densidad poblacional de las bacterias

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MATERIALS AND METHODS Ethical aspects of the study. This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experimentation from the National University of Colombia, Medellín site, in accordance to Deed CEMED-027, issued on December 2nd, 2008. Type of study. Comparative experimental design with four treatments. Ruminal microorganisms’s inoculum used in Rusitec Fermenters. To start the ruminal fermentation simulation (Rusitec), ruminal content from four female Holstein cows (700±25 kg live weight) was used as initial inoculum. The cows were rumen-fistulated and kept under a basal diet of kikuyu grass in the Paysandú farm, owned by the National University of Colombia, Medellín site, and located in the town of Santa Elena, at 2500 m.a.s.l, with an average temperature of 14°C (15). Rusitec is composed of eight sequential vessels (fermentation units) with a maximum capacity of 700 ml (16). In accordance to the protocols proposed by Czerkawski and Breckenridge (17), the simulated ruminal fermentation experiments were performed in the laboratory of Ruminal Biotechnology at the National University. The experiment was started by placing, in each vessel, 200 ml of artificial saliva (pH= 8.4; 9.8g of NaHCO3; 3.72g of Na2HPO4; 0.47g of NaCl; 0.57g of KCl; 0.053g of CaCl22H2O and 0.128g of MgCl26H2O, of each component, per liter), 500 ml of ruminal fluid and a solid portion of ruminal content (80g). Such fractions were obtained separately after filtration through four layers of muslin, to ensure the inclusion of present microorganisms in both the liquid and solid fractions of ruminal content. The experiment was carried out at 39°C constant temperature. The simulated fermentation procedure was performed in two periods of seven days corresponding to a four-day adaptation period and a three-day measurement period (5th -7th day of simulation). Treatments to be assessed through Rusitec. Kikuyu grass was the forage species selected to assess the effect of supplementation with cassava flour and biomass resulting from ethanol production, on cellulolytic and B. fibrisolvens bacteria, in Rusitec. Kikuyu grass was gathered in the municipality of San Pedro de los Milagros, with a 35-day regrowth age, while using nitrogen fertilization with urea (N:50-70, P2O5:45.8, K2O:18, MgO:24.75, SO4:44.85). Two types of kikuyu grass good and bad quality with contrasting nutritional quality in terms of protein content, the result of replacing both forages

celulolíticas, de B. fibrisolvens y la concentración de ácido vaccénico, en respuesta a la utilización de harina de yuca y biomasa efluente de la producción de etanol, como suplementos para el pasto kikuyo con diferente concentración de proteína en un rumen artificial (Rusitec).

MATERIALES Y MÉTODOS Aspectos éticos del estudio. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Experimentación Animal de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, de acuerdo con el Acta CEMED-027, emitida en diciembre 2 del 2008. Tipo de estudio. Di s e ñ o e x p e r i m e n t al comparativo con cuatro tratamientos. Inoculo de microorganismos ruminales utilizada en Fermentadores Rusitec. Para iniciar la simulación de la fermentación ruminal (Rusitec), se utilizó como inoculo inicial el contenido ruminal de cuatro vacas de raza Holstein (700±25 kg peso vivo). Las vacas fueron sometidas a fistulización ruminal con una dieta normal de pasto kikuyo en la finca Paysandú, propiedad de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, y localizada en el corregimiento de Santa Elena, a 2500 m sobre el nivel del mar, con una temperatura promedio de 14ºC (15). El Rusitec se compone de ocho recipientes consecutivos (unidades de fermentación) con una capacidad máxima de 700 ml (16). De acuerdo con los protocolos propuestos por Czerkawski y Breckenridge (17), los experimentos simulados de fermentación ruminal se llevaron a cabo en el laboratorio de Biotecnología Ruminal en la Universidad Nacional. El experimento se inició colocando en cada recipiente 200 ml de saliva artificial (pH=8.4; 9.8g de NaHCO3; 3.72g de Na2HPO4; 0.47g de NaCl; 0.57g de KCl; 0.053g de CaCl22H2O y 0.128g of MgCl26H2O, de cada componente, por litro), 500 ml de fluido ruminal y una porción sólida de contenido ruminal (80g). Tales fracciones se obtuvieron separadamente por filtración a través de cuatro capas de muselina, para garantizar la inclusión de los microorganismos presentes tanto en la fracción liquida como sólida del contenido ruminal. El experimento se llevó a cabo a una temperatura constante de 39°C. El procedimiento de simulación de la fermentación ruminal se realizó en dos períodos de siete días que corresponden a un período de adaptación de cuatro días y un período de valoración de tres días (5°-7° día de simulación).

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protein, protein by foreseeing biomass, were included to evaluate the response to biomass and cassava flour as dietary supplements. The amount of kikuyu grass, plus the addition of substrate evaluated in each vessel, was 18g (10.3-15.5g of dry matter). The grass, with a particle size of 1.5 mm, was stored in nylon bags with a pore size of 45 µm. To avoid dilution of the products resulting from the fermentation system, a dilution rate of 3.5% per hour was established. The assessment of treatments through Rusitec was carried out as follows: On day zero, the experiment started with a test performed in the Rusitec fermenter in eight fermenting pots (2 crocks per treatment). Once the ruminal liquid and artificial saliva were poured into each crock, two nylon bags, containing 18g of the treatment to be assessed and 80g of ruminal content respectively, were introduced in the containers. This last bag was removed 48 hours after incubation initiated. During the following days (1st-7th), each bag in each fermenter was replaced by a new substrate bag every 24 hours. During the 5th, 6th and 7th days, the ruminal liquid was collected from each fermenting crock, before replacing the bag containing the substrate, in order to perform the quantification of ruminal microorganisms, the determination of vaccenic acid and the immediate pH measurement. Two duplicates of the simulation experiment were carried out in two different moments, with a 15day interval between them, but under the same conditions. This was aimed at estimating more accurately the effect of the supplements to kikuyu on the microbial population to be evaluated. The assessed treatments (T) were: T1/Control 1: 100% kikuyu grass with a total protein intake of 23.9%; T2: a mixture of 70% kikuyu grass, 20% biomass and 10% cassava flour with a total protein intake of 19.4%; T3/Control 2: 100% kikuyu grass, with a 17.8% protein intake; and T4: 70% kikuyu grass, 20% biomass and 10% cassava flour with a 15.3% protein intake (Tables 1 and 2). Table 1. Chemical composition of the treatments evaluated in Rusitec. Treatments

NDF

ADF

ADL

Tratamientos evaluados a través de Rusitec. El pasto kikuyo fue la especie forrajera seleccionada para evaluar el efecto de suplementar con harina de yuca y biomasa resultante de la producción de etanol, sobre las bacterias celulolíticas y B. fibrisolvens en el Rusitec. El pasto se recogió en el municipio de San Pedro de los Milagros, con una edad de rebrote de 35 días, utilizando fertilización nitrogenada con urea (N:50-70, P2O5:45.8, K2O:18, MgO:24.75, SO4:44.85). Con el fin de evaluar el resultado de la suplementación en la dieta, con la biomasa y la harina de yuca se incluyeron dos tipos de pasto kikuyo, de buena y mala calidad, con características nutricionales contrastantes en términos de contenido proteico, como resultado de reemplazar la proteína de ambos forrajes por biomasa residual. La cantidad de pasto kikuyo, más la adición del sustrato evaluado en cada recipiente, fue 18g (10.3-15.5g de materia seca). El pasto, con un tamaño de partícula de 1.5 mm, se almacenó en bolsas de nylon de 45 mm de poro. Para evitar la dilución de los productos resultantes del sistema de fermentación, se estableció una tasa de dilución de 3.5% por hora. La evaluación de los tratamientos mediante Rusitec, se llevó a cabo del modo siguiente: El día cero, se inició el experimento con un ensayo en Rusitec en ocho fermentadores (2 fermentadores por tratamiento). Inmediatamente después de verter el líquido ruminal y la saliva artificial en cada fermentador, se introdujeron en los recipientes dos bolsas de nylon que contenían 18g del tratamiento a evaluar y 80 g de contenido ruminal, respectivamente. Esta última bolsa se removió 48 horas después de iniciada la incubación. Durante los siguientes días (1°-7°), se reemplazó, cada 24 horas, la bolsa en cada uno de los fermentadores por una con nuevo sustrato. Durante el 5°, 6° y 7° días, el líquido ruminal de cada fermentador se recogió, antes de reemplazar la bolsa con el sustrato, con el fin de efectuar la cuantificación de los microorganismos ruminales, la determinación de ácido vaccénico y la medición inmediata del pH. Table 2. Chemical composition of cassava flour and biomass product of the production ethanol. CP

NDF

ADF

ADL

BE DIVDM

(%) DM 11.08 2.03 50.87 42.43 16.59 11.12 88.88 4.359 74.58

(%) DM *kikuyu high quality

23.9

3.06

57.5

25.0

2.3

12.9

87.1

19.4

2.94

52.0

24.1

4.2

11.0

89.0

Biomass*

*kikuyu low quality

17.8

2.75

66.6

29.3

3.2

9.8

90.2

15.3

2.38

58.3

28.0

5.5

9.2

90.8

CP: Crude protein, EE: Ether extract, NDF: Neutral detergent fiber; ADF: Acid detergent fiber, ADL: Acid detergent lignin, A: Ashes, OM: Organic matter. *Nutritional quality in terms of protein content,the result of replacing both forages protein, protein by foreseeing biomass.

Cassava flour*

CHO

C.F

(%) DM 3.17

0.39 10.35 2.12 84.00 72.03 1.66

0.51

CP: Crude protein, EE: Ether extract, NDF: Neutral detergent fiber, ADF: Acid detergent fiber, ADL: Acid detergent lignin, A: Ashes, S: Starch, OM: Organic matter, BE: Gross energy (kcal/kg dry matter), DIVDM: Digestibility “in vitro” dry matter (DM), H: Humidity, CHO: Carbohydrate, S: Starch, CF: Crude fiber, N: Nitrogen. *These data are from random samples obtained by Grupo de Biotransformación, Universidad de Antioquia for the grant MADR code-2008D31067-3724. The biomass used in the experiment is the product of fermentation of cassava flour plus the inclusion of kikuyu grass.

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Sampling procedure. Thirty five milliliters of the ruminal content mixture collected from the four Holsteins were extracted to perform the isolation of native strains of B. fibrisolvens and determine the initial quantity of cellulolytic and B. fibrisolvens bacteria and the initial concentration of vaccenic acid, contained in the initial inoculum. After the adaptation period to the system, during the three days of sampling, 2 aliquots of ruminal content were extracted from each fermenter, every 24 hours: 15 ml were employed to measure the pH and complete the procedures of cellulolytic bacteria quantification; 20 ml, which were stored at -20°C, were later used for DNA extraction and B. fibrisolvens real-time qPCR quantification. In addition, to measure vaccenic fatty acid through gas chromatography, for this process were took between 0.15 to 0.20 g sample, 4.0 ml of 0.5 N NaOH was added in methanol and placed in a water bath at 90°C, the system was allowed to reflux for 7 minutes elapsed time reflux, 5 ml of buffer F3 was added to 12% methanol by the top of the condenser and allowed to reflux for 2 minutes. Subsequently 4.0 ml of N-heptane was added to the top of the condenser and was refluxed for 1 minute, cooled and 100 ml of saturated NaCl to ensure the extraction of the compounds separated in two phases solution is added. The organic phase was removed with a Pasteur pipette into a test tube and added anhydrous sodium sulfate to remove moisture was used, in a column: DB–23, capillary of 50.0 m, inside diameter 0.25 mm, film thickness of 1.4 µm, detector temperature of 280°C and injector temperature of 250°C, hydrogen injection (carrier gas): 40 m/seg, H2 = 45 ml/min flow detector and 450 ml/min airflow (Agilent 6890 Series Gas Chromatograph, Wilmington, DE). Viable cellulolytic bacteria (VCB) quantification. Serial dilutions (until 10 -6) in triplicate, using solvent (phosphate and mineral salts, resazurin, calcium carbonate and L-cysteine-HCL) were carried out using 1ml of the sample extracted from the initial inoculum and each fermenter, during sample period. One milliliter from dilutions 10-3 to 10-6 was extracted and added to solid pre-reduced media prepared by means of Roll-tube technique (18). These culture media contained rumen fluid clarified at 40%, cellobiose at 0.1% and yeast extract at 0.25%, together with other components recommended by Grubb and Dehoroty (19). In order to prepare the solid medium film in culture tubes, agar was added to a final concentration of 1.5% and the culture was grown in anaerobic conditions, by inoculating the hermetically closed sample, through the rubber lid of the tube and

El experimento de simulación se llevó a cabo por duplicado en dos momentos diferentes, con un intervalo de 15 días entre ellos, pero bajo las mismas condiciones. Esto tuvo como objetivo estimar con más exactitud el efecto de los suplementos del kikuyo sobre la población microbiana a evaluar. Los tratamientos evaluados (T) fueron: T1/Control 1: 100% pasto kikuyo con un aporte proteico total de 23.9%; T2: una mezcla de 70% pasto kikuyo, 20% biomasa y 10% harina de yuca con un aporte proteico total de 19.4%; T3/Control 2: 100% pasto kikuyo, con un 17.8% de aporte proteico; y T4: 70% pasto kikuyo, 20% biomasa y 10% harina de yuca con un 15.3% de aporte proteico (Tablas 1 y 2). Procedimiento de muestreo. Se extrajeron treinta y cinco mililitros de la mezcla de contenido ruminal obtenido de las cuatro vacas Holstein, para efectuar el aislamiento de cepas nativas de B. fibrisolvens y determinar la cantidad inicial de bacterias celulolíticas y B. fibrisolvens y la concentración inicial de ácido vaccénico, contenidos en el inocuo inicial. Después del período de adaptación al sistema, durante los tres días de muestreo se extrajeron de cada fermentador 2 alícuotas de contenido ruminal, cada 24 horas: 15 ml se emplearon para medir el pH y completar los procedimientos de cuantificación de bacterias celulolíticas; 20 ml, que se almacenaron a -20°C, se utilizaron más tarde para la cuantificación de B. fibrisolvens mediante PCR en tiempo real. Además, para el proceso de medir el ácido graso vaccénico, por medio de cromatografía de gases, se tomó una muestra entre 0.15 y 0.20g, se añadieron 4.0 ml de NaOH 0.5N en metanol y se colocó en un baño de agua a 90°C. El sistema permite el reflujo por 7 minutos de tiempo transcurrido; se agregaron 5 ml de solución tampón F3 a metanol al 12% por la parte superior del condensador y se sometió a reflujo por dos minutos y luego por el mismo punto se agregaron 4.0 ml de N-heptano sometiéndolo a reflujo por un minuto, se refrigeró y se añadieron 100 ml de NaCl saturado para asegurar la extracción de los compuestos separados en la solución de dos fases. La fase orgánica se removió con una pipeta Pasteur en un tubo de ensayo y para remover la humedad se le agregó sulfato anhídrido sódico, en una columna: DB-23, capilaridad de 50.0 m, diámetro interno 0.25 mm, espesor de película 1.4 mm, detector de temperatura de 280°C e inyector de temperatura de 250°C; inyección de hidrógeno (gas de arrastre): 40 m/seg, detector de flujo H2=45ml/ min y flujo de aire 450 ml/min (Agilent 6890 Series Gas Chromatograph, Wilmington, DE).

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using a syringe containing N2. The colony count was performed after 72 hours of incubation at 39°C and the results were given in terms of Colony Forming Units (CFU/ml) (18). qPCR of B. fibrisolvens. The standard curve for the quantification of B. fibrisolvens through qPCR was performed with the reference strain ATCC #19171, stored in axenic culture (108cells/ ml). The number of cells in the culture after 24 hours was calculated at a wavelength of 640 nm. One milliliter was extracted from the culture for centrifugation and DNA extraction with DNeasy® Blood & Tissue commercial kit (QIAGEN, MD, USA). The serial dilution (10-1-10-6) was performed for the DNA extracted from the reference strain. Such dilutions were used to perform the specific standard curve for the qPCR of B. fibrisolvens in the samples of rumen obtained from the Rusitec. The curve was generated by considering the values of the cycle threshold (Ct), observed in 35 cycles, versus the logarithm of the number of cells/ml, starting with the six dilutions of pure culture DNA of well-known concentration. The qPCR protocol followed in this study was validated by the analysis of two internal controls, genomic DNA from the reference strain ATCC #19171 and DNA from the reference strain ATCC #19171 added to 1 ml of ruminal content and subjected to extraction protocol. The amplification of both controls was compared in separate and multiple reactions, to determine the efficiency and specificity of the method and to discard the presence of inhibitors in the ruminal content samples. Genomic DNA extraction was performed from the samples stored at -20°C, collected from the initial inoculum and from each fermenter in the Rusitec during the sampling period. Quality and concentration of the extracted DNA was assessed using NanoDrop ND1000 Spectrophotomer (Thermo Scientific, Wilmington, DE) and 80 ng from the DNA extracted from each sample were analyzed. The qPCR was performed in Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, CA, USA). The amplification reactions were carried out in a final volume of 25µl that contained 12.5 µl of SYBR® Green (QIAGEN, MD, USA) and 0.5 µM of each primer for the ARNr 16S gene amplification. After a 15 minute denaturation at 95°C, the amplification and quantification program was repeated 35 times (30s at 94°C; 30s at 55ºC and 30s at 72°C), followed by the fusion curve analysis (46°C-95ºC, with temperature increase of 3°C per minute and continuous measurement of fluorescence). The Ct value was calculated automatically by the equipment and the amplification of

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Cuantificación de Bacterias celulolíticas viables (VBC). Se llevaron a cabo diluciones en serie (hasta 10-6) en triplicado, usando solvente (fosfato y sales minerales, resazurina, carbonato de calcio y L-cisteína-HCL) y utilizando 1 ml de la muestra extraída de la inoculación inicial en cada fermentador, durante el período de muestreo. Se extrajo 1 ml de las diluciones 10-3 a 10-6 y se agregó al medio sólido pre-reducido, preparado por medio de la técnica de tubo rodado (rolltube) (18). Estos medios de cultivo contenían fluido ruminal clarificado al 40%, celobiosa al 0.1% y extracto de levadura al 0.25%, junto con otros componentes recomendados por Grubb y Dehoroty (19). Con el fin de preparar la película del medio sólido en tubos de cultivo, se agregó agar a una concentración final de 1.5% y el cultivo se hizo crecer en condiciones anaeróbicas, inoculando la muestra, herméticamente cerrada, a través de la tapa de caucho del tubo, utilizando una jeringa con N2. El recuento bacteriano se efectuó después de 72 horas de incubación a 39°C y los resultados se dieron en términos de Unidades Formadoras de Colonias (UFC/ml) (18). Cuantificación de B. fibrisolvens mediante PCR. La curva estándar para la cuantificación de B. fibrisolvens mediante PCR se realizó con la cepa de referencia ATCC #19171, conservada en cultivo puro o axénico (108 células/ml). El número de células en el cultivo después de 24 horas se calculó con una longitud de onda de 640 nm. Se extrajo un mililitro del cultivo para centrifugación y extracción de ADN con el kit comercial DNeasy® Blood y Tissue (QIAGEN, MD, USA). La dilución en serie (10-1-10-6) se efectuó para el ADN extraído de la cepa de referencia. Tales diluciones se utilizaron para realizar la curva estándar específica por la PCR de B. fibrisolvens en las muestras de rumen obtenido en el Rusitec. La curva se generó considerando los valores del ciclo umbral (Ct: cycle threshold), observado en 35 ciclos, contra el logaritmo del número de células por mililitro, iniciando con las seis diluciones del ADN extraído de un cultivo puro de concentración conocida. El protocolo de PCR seguido en este estudio se validó con el análisis de dos controles internos, ADN genómico de la cepa de referencia ATCC #19171 y ADN de la cepa de referencia ATCC #19171 agregado a 1 ml de contenido ruminal y sometido al protocolo de extracción. La amplificación de ambos controles se comparó en reacciones separadas y múltiples para determinar la eficiencia y especificidad del método y descartar la presencia de inhibidores en la muestras de contenido ruminal. La extracción del ADN genómico se llevó a cabo empleando las muestras conservadas a -20°C, recogidas del inoculo inicial y de cada fermentador en el Rusitec, durante el período de muestreo.

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sample was considered negative when the Ct value was lower than 8 and higher than 35, or when an amplification curve was not obtained. The amplification reaction was repeated for all samples with Ct values higher to 35. Each amplification protocol included a negative control (without template DNA), six positive controls in triplicate corresponding to the know concentration DNA (from the standard curve) and the DNA from the internal controls. The results were reported considering the number of cells/ml. Q-PCR Efficiency (E) was calculated from the slope during the exponential phase, in each cycle according to the equation E=10(- 1/slope). The products of the resulting qPCR amplification were verified by agarose gel electrophoresis to 1%, and dyed with EZvision™Dye (AMRESCO, OH, USA). Statistical analysis. The data the population density of cellulolytic (CFU/ml) and B. fibrisolvens bacteria (cells/ml) during the sampling period, in response to cassava flour and biomass effluent from ethanol product being added as supplements to kikuyu grass in Rusitec, were examined in a one and two-way variance analysis (ANOVA), having complied with the conditions of bivariate normality and homoscedasticity. In addition, an analysis of repeated measures in time was carried out following the Friedman and Wilcoxon tests. Also the Pearson correlation coefficient was determined between the vaccenic acid concentration and the population density of B. fibrisolvens, by means of the Statistical Package for the Social Sciences for Windows software SPSS version 21 (IBM SPSS, Armonk, NY: IBM Corp.).

RESULTS Population density of viable cellulolytic bacteria and pH in the in Rusitec. The amount of CFU/ml obtained from the initial inoculum, used to start the ruminal fermentation simulator was 7.5x105 CFU/ml. The analysis the CFU/ml amount of cellulolytic bacteria, among the different treatments, showed statistically significant differences (p=0.03). The growth of microbial population during the 5th and the 6th day of the sampling period in treatments T1, T2 and T4 on average were of 19.23x105CFU/ ml, in contrast to the population of cellulolytic bacteria in T3, whose recount mean was lower in relation to the other treatments (1.5x105CFU/m lon average) on the 6th day of measurement. When the evaluation of the population growth during the 7th day of the sampling period was made, a higher (p=0.0001) population of viable

La calidad y concentración del ADN extraído de cada muestra se evaluaron utilizando el Espectrofotómetro NanoDrop ND1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE) y para el análisis de cada muestra se utilizaron 80 ng del ADN extraído. La PCR cuantitativa se efectuó en el sistema PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500 Fast (Applied Biosystems, CA, EE.UU). Las reacciones de amplificación del gen 16S rRNA se llevaron a cabo en un volumen final de 25 µl que contenían 12.5 µl de SYBR® Green (QIAGEN, MD, EE.UU) y 0.5µM de cada base o partidor. Después de 15 minutos de desnaturalización a 95°C, el programa de amplificación y cuantificación se repitió 35 veces (30 seg a 94°C; 30 seg a 55°C y 30 seg a 72°C), seguido por el análisis de la curva de fusión (46°C-95°C, con aumentos de temperatura de 3°C por minuto y medición continua de fluorescencia). El valor Ct fue calculado automáticamente por el equipo y la amplificación de la muestra se consideró negativa cuando el valor Ct estuvo por debajo de 8 y por encima de 35, o cuando no se obtuvo una curva de amplificación. La reacción de amplificación se repitió para todas las muestras con valores de Ct por encima de 35. Cada protocolo de amplificación incluyó un control negativo (sin plantilla de ADN), seis controles positivos en triplicado, correspondientes a la concentración conocida de ADN (de la curva estándar) y el ADN de los controles internos. Los resultados se presentaron considerando el número de células/ml. La Eficiencia (E) PCR se calculó de la pendiente durante la fase exponencial, en cada ciclo, de acuerdo con la ecuación E=10(- 1/pendiente). Los productos de la amplificación obtenidos mediante PCR se verificaron mediante electroforesis con gel de agarosa al 1% y se tiñeron con EZvision™Dye (AMRESCO, OH, EE.UU). Análisis estadístico. Los datos de la densidad poblacional de las bacterias celulolíticas (UFC/ ml) y B. fibrisolvens (células/ml) durante el período de muestreo, como resultado de la suplementación del pasto kikuyo con harina de yuca y biomasa residual de la producción de etanol, en un simulador Rusitec, se examinaron con un análisis de varianza (ANOVA) de una y dos vías, tras haber cumplido con las condiciones de normalidad bivariable y homocedasticidad. Adicionalmente, se realizó un análisis de mediciones repetidas en el tiempo usando el estadístico de Friedman y Wilcoxon. Se determinó también el coeficiente de correlación de Pearson entre la concentración de ácido vaccénico y la

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cellulolytic bacteria was found in T2, in contrast to T1 (good-quality grass content) and T4 (mixture of low quality grass, biomass and cassava flour). Considering cellulolytic bacteria population in T3, growth in the population was evident, but there were not statistically significant differences in comparison with the other treatments. A statistically significant decrease (p=0.003) in the population was evident, in contrast to treatments T1 and T4 on the 7th day of measurement (Figure 1). Statistically significant differences on the days of population density measurement were evident when the paired comparison, between the collective average recounts of both viable cellulolytic and B. fibrisolvens bacteria, was made. Statistically significant differences were evident in the population density of both viable cellulolytic and B. fibrisolvens from the 7th day, in contrast to the 5th and 6th days of measurement, when the average recount was lower than the one found on the 7th day. The pH of the ruminal content in the different Rusitec fermenters did not change significatively (p=0.165) during the three sampling days, however, a statistically significant decrease in the pH observed in the Rusitec was evident (~pH 6.8), in relation to the pH value that the ruminal flow initial inoculum presented.

Figure 1. Population density of viable cellulolytic bacteria (VCB) according to diet and sampling time (one measurement per fermenter). Results are given as means ± standard deviation of the determinations obtained over the sampling period in the Rusitec. A P-value of <0.05 was considered statistically significant. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001.

qPCR of B. fibrisolvens. The specificity of the qPCR amplification for the ARNr 16S gene partial sequence was assessed by agarose gel electrophoresis at 1%, where a single 246 pb long band was observed, in accordance to the expected size for the reference strain ATCC #19171. In addition, the fusion curve analysis obtained showed a specific and defined curve for each PCR product, without the dimer formation of

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densidad poblacional de B. fibrisolvens, por medio del Paquete Estadístico para las Ciencias Sociales versión 21 para Windows software SPSS (IBM SPSS, Armonk, NY: IBM Corp.).

RESULTADOS Densidad poblacional de bacterias celulolíticas viables y pH en el Rusitec. La cantidad de Unidades Formadoras de Colonias/ml obtenida del inoculo inicial, utilizada para iniciar el simulador de fermentación ruminal, fue 7.5x105UFC/ml. El análisis de la cantidad UFC/ml de bacterias celulolíticas, entre los diferentes tratamientos, mostró diferencias estadísticamente significativas (p=0.03). El crecimiento de la población microbiana durante el 5° y 6° día del período de muestreo en los tratamientos T1, T2 y T4 en promedio fue de 19.23x105 UFC/ml, en contraste con la población de bacterias celulolíticas en T3, cuyo recuento medio fue inferior en relación a los otros tratamientos (1.5x105 UFC/ml en promedio) en el 6° día de medición. Cuando se hizo la evaluación del crecimiento poblacional durante el 7° día del período de muestreo, se encontró en T2 una población mayor (p=0.0001) de bacterias celulolíticas viable, en contraste con T1 (contenido de pasto de buena calidad) y T4 (mezcla de pasto de baja calidad, biomasa y harina de yuca). Considerando la población de bacterias celulolíticas en T3, el crecimiento poblacional fue evidente, pero no hubo diferencias estadísticamente significativas en comparación con los otros tratamientos. En el 7° día de medición, se encontró una disminución estadísticamente significativa (p=0.003) en la población, en contraste con los tratamientos T1 y T4 (Figura 1). En los días de medición de densidad poblacional, cuando se hizo la comparación por pares, las diferencias estadísticamente significativas fueron evidentes, entre los recuentos promedio colectivos de ambas bacterias celulolíticas viables y B. fibrisolvens. Estas diferencias también se vieron en la densidad poblacional tanto de la bacterias celulolíticas viables como de B. fibrisolvens del día 7°, en contraste con los días 5° y 6° de medición, cuyo recuento promedio fue inferior. Durante los tres días de muestreo el pH del contenido ruminal, en los diferentes fermentadores Rusitec, no cambió significativamente (p=0.165), sin embargo, se encontró una disminución estadísticamente significativa del pH observado en el Rusitec (~pH 6,8), en relación al valor del pH que presentó el inoculo inicial del fluido ruminal.

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the primers. High efficiency was observed in the PCR amplification of the analyzed samples, from 80 ng of genomic DNA, with efficiency values within the range of 1.76 to 2, and high linearity between the results obtained in the slope of each sample (Pearson correlation coefficient, r>0.9). Real-time qPCR intra-assay accuracy reached a high level, with a 4% variation coefficient estimated from the Ct data average in each three-repetition cycle, in all samples from the curve under the same experiment. Likewise, real-time qPCR reproducibility of the assessed samples in three experiments performed on different occasions, showed a 12%variation coefficient. The standard curve generated for the quantification of B. fibrisolvens through real-time qPCR presented a linear relation (98% relation coefficient) with an efficiency of 1.84 for the six points included in the standard curve. The population density of B. fibrisolvens obtained from qPCR initial inoculum was 4.94x106 cells/ ml. The density of B. fibrisolvens, during the three sampling days was 9.19x10 6 cells/ml (media±ESM). Statistically significant differences were not found in the population density of B. fibrisolvens on the fifth and sixth days of sampling with T1 and T4, where population remained constant, whereas a decrease in the population without statistically significant differences was observed in T2. In T3, the population density increased significantly (p=0.045) within a range of 5.2x104 a 1.25x106 cells/ml. However, when the analysis of the population density of B. fibrisolvens during the 7th day was carried out, a statistically significant increase was observable (p=0.001) in T2 (1.18x10 6 cells/ml). The supplementation of kikuyu grass (19.4% protein) with 20% biomass and 10% cassava flour caused a significant surge in the population of B. fibrisolvens in contrast to the other treatments (Figure 2). The concentration of vaccenic acid obtained from the initial inoculum was 15 mg/L. Statistically significant differences in the concentration of vaccenic acid in the ruminal content from the Rusitec, during the sampling period, for treatments T1, T3 and T4, were not found. However, in T2, there was a statistically significant increase (p=0.001) in the concentration of this acid. Also, a positive correlation between the amount of cells/ml of B. fibrisolvens and the concentration of vaccenic acid, was evident (r=86%, p=0.0038). In other words, the vaccenic acid concentration was directly proportional to the population density of B. fibrisolvens in the ruminal content during the Rusitec simulation.

PCR de B. fibrisolvens. Se evaluó la especificidad de la amplificación mediante PCR para la secuencia parcial del gen 16S rRNA, mediante electroforesis con gel de agarosa al 1%, observándose única banda con un tamaño de 246 pb, de acuerdo con el tamaño esperado para la cepa de referencia ATCC #19171. Además, el análisis de la curva de fusión obtenida mostró una curva definida y específica para cada producto de PCR, sin la formación de dímeros de cebadores. Se observó alta eficiencia en la amplificación PCR de las muestras analizadas, de 80 ng de ADN genómico, con valores de rendimiento dentro del rango de 1.76 a 2, y una alta linealidad entre los resultados obtenidos en la pendiente de cada muestra (coeficiente de correlación de Pearson, r>0.9). La precisión intraensayo de la PCR en tiempo real, alcanzó un alto nivel, con un coeficiente estimado de variación del 4% de los datos promedio Ct en cada ciclo de tres repeticiones, en todas las muestras de la curva según el mismo experimento. Igualmente, la reproducibilidad de la PCR en tiempo real de las muestras evaluadas en tres experimentos realizados en diferentes ocasiones, mostró un coeficiente de variación del 12%. La curva estándar generada por la cuantificación del B. fibrisolvens a través de la PCR en tiempo real, presentó una relación lineal (98% coeficiente de relación) con una eficiencia de 1.84 para los seis puntos incluidos en la curva estándar. La densidad poblacional de B. fibrisolvens obtenida en el inoculo mediante la cuantificación por PCR fue de 4.94x106 células/ml. La densidad de B. fibrisolvens, durante los tres días de muestreo fue de 9.19x106 células/ml (media±ESM). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la densidad poblacional de B. fibrisolvens en los días 5° y 6° de muestreo con T1 y T4, manteniéndose la población constante, mientras que se observó en T2 una disminución en la población sin diferencias estadísticamente importantes. En T3, la densidad poblacional se incrementó significativamente (p=0.045) dentro de un rango de 5.2x104 a 1.25x106 células/ml. Sin embargo, cuando se llevó a cabo el análisis de la densidad poblacional de B. fibrisolvens durante el 7° día, se observó un incremento estadísticamente significativo (p=0.001) en T2 (1.18x106 células/ ml). La suplementación del pasto kikuyo (19.4% de proteína) con 20% de biomasa y 10% de harina de yuca causó un aumento considerable en la población de B. fibrisolvens en contraste con los otros tratamientos (Figura 2). La concentración de ácido vaccénico obtenido del inoculo inicial fue de 15 mg/L. Durante el período de muestreo, para los tratamientos T1, T3 y T4 no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la concentración del ácido en

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el contenido ruminal del Rusitec. Sin embargo, en T2, hubo un incremento estadísticamente significativo (p=0.001) en la concentración del ácido. También fue evidente una correlación positiva entre la cantidad de células/ml de B. fibrisolvens y la concentración de ácido vaccénico (r=86%, p=0.0038). En otras palabras, durante la simulación en el Rusitec, la concentración de ácido vaccénico fue directamente proporcional a la densidad poblacional de B. fibrisolvens en el contenido ruminal. Figure 2. Population density of B. fibrisolvens according to diet and sampling time (one measurement per fermenter).Results are given as means ± standard deviation of the determinations obtained over the sampling period in the Rusitec. A P-value of <0.05 was considered statistically significant. * p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001.

DISCUSSION In this study, it was observed that population density of cellulolytic bacteria and specifically B. fibrisolvens, increased significantly in response to the supplementation of kikuyu grass (19.4% protein) with cassava flour and biomass effluent from ethanol production. It may be due to the starch and protein input in this treatment, contrary to other treatment where the percentage of starch and protein were lower (13) which may have stimulated the amilolytic and proteolytic activity of this type of bacteria (4,11). Likewise, research carried out by Wanapat et al (13) reports that cassava chip and other forms of cassava root can be successfully fermented with yeast (Saccharomyces cereviceae) to obtain a final product with high Crude protein and a relatively high profile of amino acids. It was found that cassava could replace soybean meal completely and was beneficial to cattle in terms of the efficiency of rumen fermentation, microbial protein synthesis, nitrogen retention and nutrient digestibility. Nevertheless, the results from this study in treatments T3 and T4 were completely opposite to results in T2, which may suggest that the positive response to supplementation in T2, relies on the nutritional quality of kikuyu grass. Studies carried out by Garcia et al (20) assessed the effect of supplementation with biomass obtained as a byproduct from ethanol production by replacing different percentages of protein, of contrasting nutritional quality (high, mid, low) in three kikuyu grass fodders, with protein from biomass. After the evaluation of the fractions (dry matter, neutral detergent fiber and acid detergent fiber) researchers observed that supplementation had a significant positive effect (p<0.01) on the fermentation parameters evaluated with the

DISCUSIÓN En este estudio, se observó que la densidad poblacional de las bacterias celulolíticas y específicamente B. fibrisolvens, se incrementó significativamente, en respuesta a la suplementación del pasto kikuyo (19.4% de proteína) con harina de yuca y biomasa residual de la producción de etanol. Posiblemente se deba al ingreso de almidón y proteína a este tratamiento, al contrario de otro donde el porcentaje de almidón y proteína fue inferior (13). Esto puede haber estimulado las actividades amilolítica y proteolítica de este tipo de bacteria (4,11). De igual manera, la investigación llevada a cabo por Wanapat y colaboradores (13) reporta que la yuca, ya sea como chips o de otra forma se puede fermentar exitosamente con levadura (Saccharomyces cereviceae) para obtener un producto final con alta proteína bruta y alto perfil de aminoácidos. Se encontró que la yuca podría reemplazar completamente la harina de soya y era benéfica para el ganado en términos de eficiencia en la fermentación ruminal, síntesis proteínica microbiana, retención de nitrógeno y digestibilidad nutricional. No obstante, los resultados de este estudio en los tratamientos T3 y T4 fueron completamente opuestos a los de T2, lo cual puede sugerir que la respuesta positiva a la suplementación en T2, depende de la calidad nutricional del pasto kikuyo. En estudios realizados por García y colaboradores (20) se evaluó el efecto de la suplementación con biomasa, obtenida como un subproducto del etanol, reemplazando diferentes porcentajes de proteína en tres forrajes de pasto kikuyo, de calidad nutritiva contrastante (alta, media, baja) por proteína procedente de la biomasa. Después de la evaluación de las fracciones (materia seca, fibra detergente neutra y fibra detergente ácida), los investigadores observaron que la suplementación había tenido un efecto positivo (p<0.01) sobre los parámetros de fermentación evaluados con el pasto de alta calidad, en contraste con los resultados obtenidos con la suplementación del pasto de media y baja calidad. Esto sugiere que la respuesta positiva a la suplementación con biomasa se relaciona con la calidad del pasto kikuyo, lo cual puede también

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high-quality grass, in contrast to the results obtained with the supplementation of mid and low-quality kikuyu grass. This suggests that the positive response to supplementation with biomass is related with the nutritional quality of kikuyu grass, which may also influence the population of cellulolytic and B. fibrisolvens bacteria observed in this study in T2, which included the supplementation of high-quality grass with biomass and cassava flour. The genus Butirivibrio may be divided in several groups corresponding to three different biotypes, in accordance to its capacity to produce some fatty acids. Such fact classifies them as lactic and succinic acid producers, instead of acetate and butyrate producers (6, 21, 22). Mrazek et al (23), identified that the Pseudobutyrivibrio ruminis and Butyrivibrio proteoclasticum isolations found in bovine rumen, produce succinate and propanoate, but they do not produce butyric and acetate, in contrast to the type strain for B. fibrisolvens, which produces butyric and lactic acids and formic and succinic acids at a lower quantity. The species of this genus belong to the cluster XIVa of the Subphylum Clostridium and take part in important functions of the ruminal ecosystem, including proteolysis process for fiber degradation and fatty acids biohydrogenation (13,21,24). They also have the ability to hydrogenate linoleic to vaccenic acid, through enzymatic activity, linoleic acid isomerase and linoleic acid reductase, conferring specificity to the use of linoleic acid for conjugated linoleic acid formation (6). Previous research has showed that the synthesis and concentration of CLA in milk and meat from bovines may be enhanced or inhibited by factors such as the microbial composition of the rumen, animal breed, bromatologic composition of pastures and supplementation with other food rich in protein, lipids and fiber and even with some geographical conditions, such as altitude (3,12,13). In this study, a significant increase in the vaccenic acid concentration was detected in T2 in Rusitec, this is a monounsaturated acid trans that predominates in the fat fraction of the products of ruminal origin and it originates as intermediate product, during the microbial biohydrogenation of unsaturated fatty acids (22). Its concentration is directly related with the diet supplied to animals, which is rich in linoleic, alphalinoleic acid, protein and fiber and requires active participation of the ruminal microorganisms in charge of such process, as it is the case for ruminal bacteria B. fibrisolvens (6,7,13,24). Although during this study a direct quantification of CLA production was not carried out, due to the use of a ruminal simulation system in vitro, instead of meat and

influenciar la población de bacterias celulolíticas y B. fibrisolvens observada en este estudio en T2, incluyendo la suplementación de pasto de alta calidad con biomasa y harina de yuca. El género Butirivibrio se puede dividir en varios grupos, correspondientes a tres biotipos diferentes, de acuerdo con su capacidad para producir algunos ácidos grasos. Tal hecho los clasifica como productores de ácido succínico y láctico, en vez de productores de butirato y acetato (6,21,22). Mrazek et al (23), identificó que los aislamientos de Pseudobutyrivibrio ruminis y Butyrivibrio proteoclasticum encontrados en el rumen bovino, producen succinato y propanoato, pero no producen butirato y acetato, en contraste a la cepa tipo de B. fibrisolvens, el cual produce ácidos láctico y butírico y más baja cantidad de ácidos fórmico y succínico. Las especies de este género pertenecen al grupo XIVa de la Subphylum Clostridium y toman parte en funciones importantes del ecosistema ruminal, incluyendo el proceso de proteólisis para la degradación de la fibra y en la biohidrogenación de ácidos grasos (13,21,24). Estos también tienen la habilidad para hidrogenar los ácidos vaccénico y linoleico, mediante la actividad enzimática; el ácido linoleico isomerasa y el ácido linoleico reductasa confieren especificidad al uso del ácido linoleico en la formación del ácido linoleico conjugado (CLA) (6). Investigaciones anteriores demostraron que la síntesis y la concentración del CLA en la leche y en la carne de los bovinos se pueden mejorar o inhibir por factores tales como la composición microbiológica del rumen, la raza animal, la composición bromatológica de los pastizales y la suplementación con otros alimentos ricos en proteína, lípidos y fibra e incluso con algunas condiciones geográficas, como la altitud (3,12,13). En este estudio, en Rusitec, se detectó en T2, un incremento considerable de la concentración del ácido vaccénico; éste es un ácido monoinsaturado trans que predomina en la fracción grasosa de los productos de origen ruminal y origina un producto intermedio durante la biohidrogenación microbiana de ácidos grasos insaturados (22). Su concentración se relaciona directamente con la dieta suministrada a los animales, la cual es rica en ácidos linoleicos y alfalinoléico, proteína y fibra y requiere activa participación de los microorganismos ruminales encargados de dicho proceso, como es el caso de la bacteria ruminal B. fibrisolvens (6,7,13,24). Aunque durante este estudio no se realizó una cuantificación directa de la producción del CLA (debido a la utilización del sistema de simulación ruminal in vitro) en carne y productos lácteos, fue posible observar que la concentración de ácido vaccénico en Rusitec, fue directamente proporcional a la densidad poblacional de B. fibrisolvens conforme a la suplementación del pasto kikuyo con harina

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dairy products, it was possible to observe that the vaccenic acid concentration in Rusitec was directly proportional to the population density of B. fibrisolvens under the supplementation of kikuyu grass with cassava flour and biomass. These results suggest that the application of this type of supplementation in the field may cause a significant increase in the CLA concentration in milk and meat from bovines, if the role of vaccenic acid as one of its main originators is considered (6,24). In a parallel study to this research, it was observed that the supplementation of kikuyu grass with cassava flour and biomass (T2) had an statistically significant effect on some digestibility indicators, such as the degradation of dry and organic matter and the production of ammonia and did not have any significant effect on the degradation of the cell wall, raw protein and gas production (13,20). The results from this study, regarding the significant increase of viable cellulolytic and B. fibrisolvens bacteria population density, as well as the vaccenic acid concentration in response to the supplementation of kikuyu grass with cassava flour and biomass, together with the results obtained by García et al (20), in regard of the ruminal digestibility indicators, suggest that this type of diet could enhance significatively the metabolic capacity of ruminal microorganisms and, consequently improve the energetic balance of bovines, which would result in an increase of the nutritional quality of products derived from cattle, as it is the case of milk and meat (6). It has been reported that cassava is a basic energetic food in the industry of balanced food for animals without any relevance to it being flour, flake or granular type (13). Cassava is a highly energetic compound, due to its content of dry matter, cellulose, hemicellulose, protein, starch and other polysaccharides easily fermentable (9,13). Likewise, biomass (protein-rich yeast) effluent from ethanol production, also presents high content of dry matter, protein, lignin, cellulose and hemicelluloses (9, 13). In conlusions the results from this study, although gathered from an in vitro system, suggest the nutritional potential of cassava flour and biomass effluent from ethanol production, as supplements in grazing bovines feeding. However, additional field research is required to assess the effect of supplementation with cassava flour and biomass in the diet for bovines, and to analyze important indicators such as diet palatability, weight gain, milk production, as well as the in situ effect on the population of ruminal microorganisms, including the characterization of cellulolytic and B. fibrisolvens bacteria, that together, may be useful to determine whether these additives can be used in the formulation of diets for cattle.

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de yuca y biomasa. Estos resultados sugieren que la aplicación de este tipo de suplementación en el campo puede causar un aumento considerable en la concentración de CLA de la leche y carne de los bovinos, si se tiene en cuenta la función del ácido vaccénico como una de las principales precursores (6,24). En un estudio paralelo a esta investigación, se observó que la suplementación del pasto kikuyo con harina de yuca y biomasa (T2) tuvo un efecto estadísticamente significante sobre algunos indicadores de digestibilidad, tales como la degradación de la materia orgánica y seca y en la producción de amoniaco y no tuvo efecto importante sobre la degradación de la pared celular, la proteína bruta y la producción de gas (13,20). Los resultados de este estudio, respecto al incremento significativo de la densidad poblacional de las bacterias celulolíticas viables y B. fibrisolvens, también como de la concentración de ácido vaccénico, en respuesta a la suplementación del pasto kikuyo con harina de yuca y biomasa y junto con los resultados obtenidos por García et al (20), en cuanto a los indicadores de digestibilidad ruminal, sugieren que este tipo de dieta podría aumentar considerablemente la capacidad metabólica de los microorganismos y, por consiguiente mejorar el balance energético de los bovinos, lo que daría lugar a un aumento de la calidad nutricional de los productos derivados del ganado, como es el caso de la leche y la carne (6). Se ha reportado que la yuca es un alimento energético básico en la industria de los alimentos balanceados para animales, sin importar si es de tipo granular, hojuela o harina (13). La yuca es un compuesto altamente energético, debido a su contenido de materia seca, celulosa, hemicelulosa, proteína, almidón y otros polisacáridos fácilmente fermentables (9,13). De igual forma, la biomasa (levadura rica en proteína) residual de la producción de etanol, también presenta un alto contenido de materia seca, proteína, lignina, celulosa y hemicelulosa (9,13). Para concluir, los resultados de este estudio, aunque recogidos de un sistema in vitro, indican el potencial nutricional de la harina de yuca y de la biomasa residual de la producción del etanol, como suplementos en la alimentación de bovinos de pastoreo. Sin embargo, para evaluar el efecto de la suplementación con harina de yuca y biomasa en la dieta del ganado, se requiere una investigación de campo adicional para analizar los indicadores importantes, tales como la apetencia de la dieta, aumento de peso, producción de leche, así como el efecto in situ sobre la población de microorganismos ruminales, incluyendo la caracterización de las bacterias celulolíticas y B. fibrisolvens, que en conjunto, puede ser útil para determinar si estos aditivos se pueden utilizar en la formulación de dietas para el ganado.

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Competing interests

Conflicto de intereses

The authors declare that they have no competing interests.

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Acknowledgements

Agradecimientos

We thank funding from Ministerio de Agricultura y Desarrollo rural de Colombia (MADR-code2008D31067-3724) and CODI-Menor cuantía 2010 of Universidad de Antioquia (UdeA). CEAGRO of Universidad Nacional de Colombia sede Medellin (UNALMED), Departamento de Formación Académica de Haciendas-UdeA and the administrative and technical staff from La Montaña farm-UdeA and Paysandú farmUNALMED.

Agradecemos la financiación del Ministerio de Agricultura y Desarrollo rural de Colombia (MADRcode-2008D31067-3724) y CODI-Menor cuantía 2010 de Universidad de Antioquia (UdeA). CEAGRO de Universidad Nacional de Colombia sede Medellín (UNALMED), Departamento de Formación Académica de Haciendas de la UdeA y el personal administrativo y técnico de La Montaña, finca de la UdeA y finca Paysandú UNALMED.

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):4962-4973, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Estimation of genetic and phenotypic parameters for production traits in Holstein and Jersey from Colombia Estimación de parámetros genéticos y fenotípicos para características de producción en ganado Holstein y Jersey Colombiano Juan Rincón F,1,2* Ph.D, Juan Zambrano A,1 Ph.D, Julián Echeverri,1 Ph.D. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de producción Animal, Grupo BIOGEM: Biodiversidad y genética molecular. Calle 59 A Nº 63-20 B50, Medellín, Colombia. 2Universidad Tecnológica de Pereira, Facultad de Ciencias de la Salud, profesor del programa de Medicina Veterinaria y zootecnia, Carrera 27 Nº 10-02. *Correspondence: jcrincon@unal.edu.co 1

Received: September 2014; Acepted: March 2015.

ABSTRACT Objective. Determine the genetic and phenotypic parameters for milk yield, fat percentage, protein percentage and somatic cell score. Materials and methods. 18134 lactation records were used to Holstein and 1377 lactations for Jersey in different herds. The (co) variance components and genetic parameters were estimated using the software Multiple Trait Derivative-Free Restricted Maximum Likelihood MTDFREML. Results. The Holstein and Jersey heritability’s (and standard error) for milk yield were: 0.16 (0.082) and 0.15 (0.306), 0.30 (0.079) and 0.37 (0.319) for protein percentage, 0.32 (0.076) and 0.46 (0.313) for fat percentage and for somatic cell score were: 0.01 (0.054) and 0.01 (0.233), respectively. The largest genetic correlations were found between the percentage of fat and percentage of protein, with values of 0.82 (0.126) and 0.98 (0.852) for Holstein and Jersey respectively. The lowest correlations were between fat percentage and somatic cell score with -0.01 (1.147) and -0.01 (1. 734). Phenotypic correlations were generally found low and repeatability showed a significant effect of permanent environment on milk production per lactation. Conclusions. It is important to emphasize the development of research to help guide breeding programs in the tropics, using selection indices of multi-traits. Key words: Dairy cattle, genetic correlations, heritability, phenotype (Source: AIMS).

RESUMEN Objetivo. Determinar los parámetros genéticos y fenotípicos para producción de leche, porcentaje de grasa, porcentaje de proteína y puntaje de células somáticas. Materiales y métodos. Se utilizó información de 18134 lactancias para Holstein y 1377 para Jersey de diferentes hatos del departamento de Antioquia (Colombia). La determinación de los componentes de varianza, covarianza y los parámetros genéticos se realizó mediante el método de máxima verosimilitud restricta libre de derivadas usando el programa MTDFREML. Resultados. La heredabilidad y el error estándar en Holstein y Jersey para producción de leche fueron 0.16 (0.082) y 0.15 (0.306), para porcentaje de proteína 0.30 (0.079) y 0.37 (0.319), para el porcentaje de grasa de 0.32 (0.076) y 0.46 (0.313) y para el puntaje de células 4962

Rincón - Estimation of genetic for production traits in Holstein

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somáticas fue de 0.01 (0.054) y 0.01 (0.233), respectivamente. Las mayores correlaciones genéticas encontradas fueron entre porcentaje de grasa y porcentaje de proteína, con valores de 0.82 (0.126) y 0.98 (0.852) para Holstein y Jersey, respectivamente. La menores correlaciones fueron obtenidas entre porcentaje de grasa y puntaje de células somáticas con valores de -0.01 (1.147) y -0.01 (1.734), respectivamente. Las correlaciones fenotípicas encontradas por lo general fueron bajas y la repetibilidad evidenció un efecto importante del ambiente permanente sobre la producción de leche por lactancia. Conclusiones. El presente trabajo encuentra algunas diferencias con los reportes de parámetros genéticos en otros países, lo que resalta la importancia del desarrollo de trabajos de investigación que permitan orientar los programas de mejoramiento genético en el trópico. Palabras clave: Correlaciones genéticas, Fenotipo, Ganado lechero, Heredabilidad (Fuente: AIMS).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The increase in the human population has increased the need for more food derived from animal products, which creates a need to seek more efficient and productive animals from different perspectives. Some important variables in dairy milk yield can be improved by using adequate selection programs according to the specific conditions where they are performed, and precise knowledge of genetic and phenotypic parameters is critical in planning and developing adequate selection strategies (1).

El incremento en la población humana ha generado un aumento en las necesidades de alimentos de origen animal y cada vez se hace necesario la búsqueda de animales más eficientes y productivos desde diferentes perspectivas. El mejoramiento de algunas variables importantes en producción de leche se puede lograr con el uso de programas de selección adecuados, de acuerdo a las condiciones específicas donde se realicen, por lo que el conocimiento preciso de los parámetros genéticos y fenotípicos es crítico en el planeamiento y desarrollo de estrategias adecuadas de selección (1).

Estimating genetic and phenotypic parameters is necessary to determine the degree of variation due to genetics and environment, and also to predict genetic associations between two or more variables. These parameters are commonly required to construct selection indexes and predict correlated responses and to perform more efficient genetic evaluations (2). Animal production in Holstein and Jersey cattle requires one of the highest technical levels and they are the specialized breeds most used for milk production in the high Colombian tropics. However, estimating genetic and phenotypic parameters, and consequently genetic evaluations, have presented serious difficulties, principally due to the limited amount of periodic and trustworthy production records for characters of economic importance (3). As a consequence, selection decisions according to the needs and conditions specific to the tropics have faced great uncertainty, especially in young cows and bulls (1). While selection of dairy cattle in Colombia has been oriented towards milk production, the variables associated with its compositional quality play a very important role in genetic selection programs due to traits that have important economic impacts for the cattle industry (4). Additionally, the somatic cell score (SCS) is

La estimación de parámetros genéticos y fenotípicos son necesarios para determinar el grado de variación de un caracter que es debido a la genética y al ambiente y también para predecir asociaciones genéticas entre dos o más variables. Estos parámetros son comúnmente requeridos para construir índices de selección y predecir respuestas correlacionadas y principalmente para realizar evaluaciones genéticas más eficientes (2). La producción animal en ganado Holstein y Jersey presenta uno de los niveles más altos de tecnificación y son las razas especializadas más utilizadas para producción de leche en el trópico alto Colombiano. Sin embargo, la estimación de parámetros genéticos y fenotípicos y consecuentemente las evaluaciones genéticas han presentado serias dificultades, principalmente por la limitada cantidad de registros productivos periódicos y confiables para caracteres de importancia económica (3). Como consecuencia, las decisiones de selección acordes a las necesidades y condiciones propias del trópico han involucrado gran incertidumbre, especialmente en vacas y toros jóvenes (1). Si bien la selección en ganado lechero en Colombia, ha sido dirigida a producción de leche, las variables asociadas a su calidad composicional, juegan un papel muy importante en los programas de selección genética, debido a que estas características

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considered to be a variable of milk quality, and is also associated with susceptibility that can be present in cows with subclinical mastitis (5), a disease that causes huge economic loss around the world (6). Having genetic and phenotypic parameters available that are based on precise information that is more representative of conditions specific to the high Colombian tropics, which involves not just milk production but is also related to the compositional quality of milk and udder health, is greatly important for genetic improvement programs for Holstein and Jersey cattle. The objective of this study was to determine the genetic and phenotypic parameters for milk production, fat percentage, protein percentage, and somatic cell score (SCS) in Holstein and Jersey cattle in Antioquia, Colombia.

MATERIALS AND METHODS Location. This investigation was based on information obtained from 156 Holstein farms and 36 Jersey farms from 18 municipalities in the department of Antioquia, at 2000 and 2600 m.a.s.l. and average temperatures between 13 and 17°C. The conditions of handling, feeding and health were variable in different production systems, as well as topography and geographic location; however, all the animals were pastured and fed with balanced commercial feed. Using information supplied by these farms in the milk control program at the Medellin headquarters of the Universidad Nacional de Colombia, productive data for fat percentage (PG), protein percentage (PP), milk yield in lactation (PL) and somatic cell count (RCS) were used to estimate genetic and phenotypic parameters, after confirming their veracity. All the information from the herds was organized and saved in Control 1 software version 1.0 (7). The information collected was reviewed in order to determine reliability, and records that were considered suspect were removed from the definitive analysis. Additionally, all totally atypical and physiologically abnormal data was removed, which was determined while processing and storing the information. The RCS values were transformed into somatic cell score (SCS) by means of the mathematical equation: SCS=[LOG2 (RCS/100000) + 3] in order to improve normalcy in the data (5). The information was edited in order to obtain a record base that would be the most reliable and appropriate to the local situations.

presentan un gran impacto económico en las empresas ganaderas (4). Adicionalmente, el recuento de células somáticas (RCS) que ha sido valorado como una variable de calidad de la leche, también se encuentra asociado con la susceptibilidad que puedan presentar las vacas a mastitis subclínica (5), enfermedad que genera grandes pérdidas económicas a nivel mundial (6). Disponer de parámetros genéticos y fenotípicos usando información precisa y más representativa de las condiciones propias del trópico alto colombiano que involucre además de la producción de leche, caracteres asociadas a la calidad composicional de la leche y de salud de la ubre, serán de gran importancia para los programas de mejoramiento genético del ganado Holstein y Jersey. El objetivo del presente estudio fue determinar los parámetros genéticos y fenotípicos para producción de leche, porcentaje de grasa, porcentaje de proteína y puntaje de células somáticas (SCS) en ganado Holstein y Jersey de Antioquia, Colombia.

MATERIALES Y MÉTODOS Localización. La presente investigación se desarrolló con base en la información obtenida de 156 hatos Holstein y 36 hatos Jersey, de 18 municipios del departamento de Antioquia, con alturas entre 2000 a 2600 m.s.n.m. y con temperaturas promedio entre 13 y 17°C. Las condiciones de manejo, alimentación y sanidad fueron cambiantes en los diferentes sistemas de producción, así como su topografía y ubicación geográfica; sin embargo, todos los animales se encontraban en pastoreo y suplementados con alimento balanceado comercial. Teniendo en cuenta la información suministrada por estos hatos en el programa de control lechero de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, se obtuvieron datos productivos para porcentaje de grasa (PG), porcentaje de proteína (PP), producción de leche por lactancia (PL) y recuento de células somáticas (RCS), los cuales se utilizaron en la estimación de los parámetros genéticos y fenotípicos, previa confirmación de la veracidad de los mismos. Toda la información de los hatos fue organizada y almacenada en el software Control 1, versión 1.0 (7). La información recolectada fue revisada con el fin de determinar su confiabilidad, de tal manera que los registros sobre los que se encontró sospecha de su validez fueron retirados de los análisis definitivos. Adicionalmente, se retiraron todos los datos totalmente atípicos y fisiológicamente anormales, los cuales se pudieron generar en el procesamiento y almacenamiento de la información.

Rincón - Estimation of genetic for production traits in Holstein

Sample size. Once the information was edited, 18134 animal records remained; 7723 animals with PL records, 5709 with PG records, 5866 with PP and 5769 with RCS. In the case of Jersey cattle, 1.377 animal records were used: 820 with PL records, 455 with PG, 475 with PP and 471 with RCS. The number of animals in the kinship matrix for the Holstein breed was 9099 and for the Jersey breed was 801. Statistical analysis. A descriptive analysis was performed in which the measurements, standard deviation, and variation coefficients were estimated for each variable in the two breeds. Also, normality suppositions were validated, as well as independence and homoscedasticity, using different procedures of the SAS/STAT program (8). Components of variance, heritability and repeatability. Preliminary analysis was used to test models that included different fixed effects and covariables in order to determine the statistical models that best fit the estimates of genetic parameters of the different productive traits evaluated. The components of variance and genetic parameters were estimated based on an independent univariate animal model for each trait. This was done by means of the restricted maximum likelihood method (REML) using the SAS statistical package (8) and MTDFREML (9) that determine solutions based on the equations of mixed models (MME) described by Henderson (10). The univariate animal model used included the following fixed effects: the herd, number of births and contemporary group (with municipality, year of birth and season of birth). As a covariable, it included the duration of lactation (only for PL) and milk yield in the case of PP and PG variables. Finally, as random effects, the permanent environment and direct additive genetic effect of the animal was included. The model used was the following: Y=Xβ + Zα + Wπ + e Where: Y = vector of observations for PL, PP, PG and SCS; β = unknown vector of fixed effects (the herd, number of births and contemporary group and as covariables the duration of lactation for PL and milk yield for PG and PP); α = unknown vector of random animal effects; πi = unknown vector of permanent random environmental effects; e = unknown vector of random residual effects; X = Incidence matrix of fixed effects,

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Los valores de RCS fueron trasformados a puntaje de células somáticas (SCS) mediante la ecuación matemática: SCS = [LOG2 (RCS/100000) + 3], para mejorar la normalidad de los datos (5). La edición de la información se hizo básicamente buscando obtener una base de registros lo más confiable y acordes a las situaciones locales. Tamaño muestral. Una vez realizada la edición de la información, se contó con 18134 registros de animales, de los cuales se utilizó la información definitiva de 7723 animales que poseían registros de PL, 5709 que tenían registros para PG, 5866 para PP y 5769 para RCS. Para el caso de Jersey se utilizaron 1.377 registros de animales, de los cuales se contó con 820 registros para PL, 455 para PG, 475 para PP y 471 para RCS. El número de animales en la matriz de parentesco para la raza Holstein fue de 9099 y para la raza Jersey de 801 animales. Análisis estadístico. Se llevó a cabo un análisis descriptivo en el cual se estimaron las medias, las desviaciones estándar y los coeficientes de variación para cada variable en las dos razas. Además, se validaron los supuestos de normalidad, de independencia y de homocedasticidad usando diferentes procedimientos del programa SAS/STAT (8). Componentes de varianza, heredabilidad y repetibilidad. Mediante un análisis preliminar se probaron modelos que incluyeron diferentes efectos fijos y covariables, con el fin de determinar los modelos estadísticos que mejor se ajustaban para la estimación de los parámetros genéticos de las diferentes características productivas evaluadas. Los componentes de varianza y los parámetros genéticos se estimaron basados en un modelo animal univariado independiente para cada una de las características. Se realizó mediante el método de máxima verosimilitud restricta (REML), utilizando el paquete estadístico SAS (8) y MTDFREML (9) que determinan las soluciones basados en las ecuaciones de modelos mixtos (MME) descritas por Henderson (10). El modelo animal univariado utilizado incluyó como efectos fijos: el hato, número de parto y grupo contemporáneo (conformado por municipio, año de parto y época de parto). Como covariable se incluyó la duración de la lactancia (sólo para PL) y la producción de leche en el caso de las variables PP y PG. Finalmente, como efectos aleatorios se incluyó el ambiente permanente y el efecto genético aditivo directo del animal. El modelo utilizado fue el siguiente: Y=Xβ + Zα + Wπ + e

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Z= Incidence matrix of random animal effects and W = incidence matrix of random permanent environmental effects. The above model assumes that the random effects of the animal, permanent environment and residual effects are independently distributed with zero mean and variances , y , respectively. Using the above model, a narrow sense of heritability was determined, which was estimated as: and repeatability was estimated using the equation: (11). The heritability and repeatability parameters with their respective standard errors were obtained using MTDFREML software (9). It is important to keep in mind that the univariate model makes it possible to break down the variability of the character without taking into account the effect of other secondary numeric variables. For this reason, a unicaracteristic model was made to compare and define just one estimate, since the bicharacteristic model generates different estimates according to the paired set of variables that are evaluated in the model. It is also important to mention that the estimates for the bicharacteristic model depend on evaluating individuals that present information for both traits, so that the size can change with each set of variables evaluated in the model. Components of (co)variance and genetic and phenotypic correlations. The (co) variance components were estimated using a derivative free restricted maximum likelihood method (10) using MTDFREML software (9) and a bicharacteristic model that includes fixed effects for both variables: herd, birth number and contemporary group (with municipality, year of birth and season of birth). Random effects that were included were the permanent environmental effect and the additive effect of the animal. The matrix model used was:

Where: Yi = vector of n observations for each i trait (PL, PP, PG y SCS); βi = solution vector for fixed effects (herd, birth number and contemporary group, and as covariables lactation duration for PL and milk yield for PG and PP); αi = solution vector for random animal effects; πi = solution vector for random permanent environmental effects; e = vector for residual wastes; Xi = Matrix of incidence of fixed effects, Zi = matrix of incidence for random animal effects and Wi = Matrix of incidence of random permanent environmental effects.

Donde: Y = vector de observaciones para PL, PP, PG y SCS; β=vector desconocido de efectos fijos (hato, número de parto y grupo contemporáneo y las covariables duración de la lactancia para PL y producción de leche para PG y PP); α = vector desconocido de efectos aleatorios del animal; π i=vector desconocido de efectos aleatorios del ambiente permanente; e = vector desconocido de efectos aleatorios residuales; X=Matriz de incidencia de los efectos fijos, Z=matriz de incidencia los efectos aleatorios del animal y W=matrices de incidencia de los efectos aleatorios del ambiente permanente. El modelo anterior asume que los efectos aleatorios del animal, del ambiente permanente y el residual, se distribuyen independientemente con media cero y varianzas , y , respectivamente. Mediante el modelo anterior se determinó la heredabilidad en el sentido estrecho, la cual se estimó como: y la repetibilidad que se estimó mediante la ecuación: (11). Los parámetros de heredabilidad y repetibilidad con sus respectivos errores estándar fueron obtenidos mediante el software MTDFREML (9). Es importante tener en cuenta que el modelo univariado permite descomponer la variabilidad del caracter sin tener en cuenta el efecto de las otras variables numéricas secundarias. Por este motivo, se realizó un modelo unicaracterístico para comparar y definir una sola estimación, ya que el modelo bicaracterístico genera diferentes estimaciones de acuerdo al conjunto de variables pareadas que se evalúan en el modelo. Por otra parte es importante mencionar que las estimaciones por el modelo bicaracterístico tienen dependencia a evaluar los individuos que presentan información para ambas características, por lo que el tamaño empleado puede cambiar con cada par de variables diferentes evaluadas en el modelo. Componentes de (co)varianza, correlaciones genéticas y fenotípicas. Los componentes (co)varianza se estimaron mediante máxima verosimilitud restricta libre de derivada (10), mediante el software MTDFREML (9) usando un modelo bicaracterístico incluyendo para ambas variables los efectos fijos: hato, número de parto y grupo contemporáneo (compuesto por municipio, año de parto y época de parto). Como efectos aleatorios se incluyeron el efecto del ambiente permanente y el efecto aditivo del animal. El modelo matricial utilizado fue:

Rincón - Estimation of genetic for production traits in Holstein

The above model assumes that the random effects (random animal effects, random permanent environmental effects and residual random effect) are independently distributed with zero mean and variances,

and

respectively.

The genetic (rg) and phenotypic (rp) correlations among the different traits evaluated were determined using the following equations:

Where:

= genetic covariance for traits i and

4967

Dónde: Yi = vector de n observaciones para cada i característica (PL, PP, PG y SCS); βi = vector de solución para los efectos fijos (hato, número de parto y grupo contemporáneo y las covariables duración de la lactancia para PL y producción de leche para PG y PP); αi = vector de solución para los efectos aleatorios del animal; πi = vector de solución para los efectos aleatorios del ambiente permanente; e = vector de efectos residuales; Xi = Matriz de incidencia de los efectos fijos, Zi = matriz de incidencia los efectos aleatorios del animal y Wi = matrices de incidencia de los efectos aleatorios del ambiente permanente.

j; =genetic variance for trait i; =genetic variance for trait j; = phenotypic covariance for traits i and j; = phenotypic variance for

El modelo anterior asume que los efectos aleatorios (efecto aleatorio del animal, efecto aleatorio del ambiente permanente y efecto aleatorio residual) se distribuyen independientemente con media

traits i and

cero y varianzas

= phenotypic variance for trait j.

RESULTS Descriptive analysis. With the descriptive evaluation it was possible to determine that the mean for PL was 5524±2156 and 4234±1869 liters/lactation for Holstein and Jersey breeds, respectively, with a coefficient of variation of 39.0% for Holstein and 44.2% for Jersey, which was the trait that most varied between the two breeds (Table 1). On the other hand, the trait that varied the least was PP, with variation coefficients of 9.2% and 8.8% for Holstein and Jersey, respectively. All the traits presented variation coefficients according to what was expected for the production systems in which the investigation was done. In general, the estimates obtained make it possible to observe a greater PL in the Holstein breed. However, milk produced in the Jersey breed presents greater percentages of fat and protein. Table 1. Descriptive analysis for milk yield per lactation (PL), fat percentage (PG), protein percentage (PP) and somatic cell score (SCS) in Holstein and Jersey cows in Antioquia (Colombia). Breed

Holstein

Jersey

Trait

Mean

PL (liters/ lactation)

7723

5524

2156

39.0

PP (%)

5866

3.06

0.28

9.2

PG (%)

5709

3.88

0.46

11.8

SCS

5769

4.67

1.37

29.5

PL (liters/ lactation)

820

4234

1869

44.2

PP (%)

475

3.44

0.30

8.8

PG (%)

455

4.66

0.60

12.9

SCS

471

4.22

1.36

32.2

DE = standard deviation; CV = coefficient of variation; N= number of records.

, respectivamente.

Las correlaciones genéticas (rg) y fenotípicas (rp) entre las diferentes características evaluadas, fueron determinadas mediante las siguientes ecuaciones:

Dónde:

= covarianza genética para las

características i y j;

= varianza genética para

la característica i; la característica j;

= varianza genética para = covarianza fenotípica

para las características i y j; = varianza fenotípica para la característica i y = varianza fenotípica para la característica j.

RESULTADOS Análisis descriptivo. La evaluación descriptiva permitió determinar que la media para PL fue 5524±2156 y 4234±1869 litros/lactancia para las razas Holstein y Jersey, respectivamente, con un coeficiente de variación de 39.0% para Holstein y 44.2% para Jersey, siendo la característica que más varió en las dos razas (Tabla 1). Por otra parte, la característica que menos varió fue PP con coeficientes de variación de 9.2% y 8.8% para Holstein y Jersey, respectivamente. Todas las características presentaron coeficientes de variación acordes con lo esperado para los sistemas de producción en los que se realizó la investigación. En general las estimaciones obtenidas permiten evidenciar una mayor PL en la raza Holstein. Sin embargo, la leche producida en la raza Jersey presenta mayores porcentajes de grasa y proteína.

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Heritability and repeatability. The trait that presented the greatest heritability was PG, with values of 0.32 and 0.46 for Holsteins and Jerseys, respectively; the lesser heritability was SCS with values of 0.01 I both breeds. The results show that heritability for SCS were lower (h2<5%), however the repeatability is much higher with values of 0.26 and 0.41 for Holstein and Jersey, respectively, which shows that the permanent environment had a very important effect on this trait.

Heredabilidad y repetibilidad. La característica que presentó mayor heredabilidad fue PG con valores de 0.32 y 0.46 para las razas Holstein y Jersey respectivamente; la de menor heredabilidad fue SCS con valores de 0.01 en ambas razas. Los resultados muestran que las heredabilidades para SCS fueron muy bajas (h2<5%), sin embargo la repetibilidad es mucho más alta con valores de 0.26 y 0.41 para Holstein y Jersey, respectivamente, lo cual evidencia un efecto muy importante del ambiente permanente para esta característica.

The heritability for PG and PP were average (0.32 and 0.30) for Holstein, however the Jersey breed presented higher heritability (0.46 and 0.47, respectively) for the traits mentioned (Table 2). Regarding milk yield per lactation, the heritability was 0.16 and 0.15 for Holsteins and Jerseys. However, repeatability was much higher, (0.30 and 0.32, respectively), which showed an important effect in the permanent environment on this trait in the two breeds.

Las heredabilidades para PG y PP fueron medias (0.32 y 0.30) para la raza Holstein, sin embargo la raza Jersey presentó heredabilidades más altas (0.46 y 0.47, respectivamente) para las características mencionadas (Tabla 2). Con respecto a la producción de leche por lactancia, la heredabilidad fue de 0.16 y 0.15 para la raza Holstein y Jersey. Sin embargo, la repetibilidad fue mucho mayor (0.30 y 0.32, respectivamente), lo cual evidencia un efecto importante del ambiente permanente sobre esta característica en las dos razas.

Table 2. Heritability and repeatability for milk yield per lactation (PL), fat percentage (PG), protein percentage (PP) somatic cell score (SCS) in Holstein and Jersey cows in Antioquia (Colombia). Breed

Holstein

Jersey

Trait

h2(EE)

R(EE)

0.16(0.082)

0.30(0.082)

0.30(0.079)

0.32(0.076)

0.42(0.077)

SCS

0.01(0.054)

0.26(0.058)

0.15(0.306)

0.32(0.309)

0.37(0.319)

0.48(0.319)

0.46(0.313)

0.57(0.313)

SCS

0.01(0.233)

0.41(0.242)

h2=heritability; R=repeatability; EE=standard error.

Genetic and phenotypic correlations. The highest genetic correlation was found between PG and PP, with values of 0.82 and 0.98 for Holstein (Table 3) and Jersey (Table 4), respectively, which indicates a very strong positive genetic association between the two milk components. On the other hand, the phenotypic correlation between the two traits was lower than the genetic due to environmental factors that affect them.

Correlaciones genéticas y fenotípicas. La correlación genética más alta se encontró entre PG y PP, con valores de 0.82 y 0.98 para Holstein (Tabla 3) y Jersey (Tabla 4), respectivamente, lo cual indica una asociación genética positiva muy fuerte entre los dos componentes de la leche. Por otra parte, la correlación fenotípica entre las dos características fue más baja que la genética, debido a los factores ambientales que las afectan. La correlación genética más baja obtenida fue para PG y SCS (-0.01 para las dos razas). Sin embargo, la correlación fenotípica resultó ser un poco más alta (0.12 y 0.15 para Holstein y Jersey). La correlación genética entre PL y PP y entre PL y PG en ganado Holstein fueron negativas, con valores de -0.40 y -0.28, respectivamente (Tabla 3). En el caso del ganado Jersey las correlaciones fueron de -0.13 y -0.28 respectivamente. En las dos razas Table 3. Genetic correlations (above the diagonal) and phenotypic correlations (below the diagonal) between productive traits in Holstein cows in Antioquia (Colombia). PL (EE)

PP (EE)

PG (EE)

SCS (EE)

-0.40 (0.137)

-0.28 (0.190)

0.08 (1.200)

Protein percentage (PP)

-0.22 (0.013)

0.82 (0.126)

0.28 (0.940)

Fat percentage (PG)

-0.11 (0.014)

0.48 (0.010)

-0.01 (1.147)

Somatic cell score (SCS)

-0.01 (0.014)

0.17 (0.013)

0.12 (0.013)

Trait

The lowest genetic correlation obtained was for PG and SCS (-0.01 for the two breeds). However, the phenotypic correlation was a little higher (0.12 and 0.15 for Holstein and Jersey). The genetic correlation between PL and PP and between PL and PG in Holstein cattle was negative, with values at -0.40 and -0.28, respectively (Table 3). In the two breeds, the

Milk yield (PL)

EE=standard error

Rincón - Estimation of genetic for production traits in Holstein

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phenotypic correlations between PL and PG were negative, however the phenotypic correlation between PL and PP were positive but very low in Jersey cattle, although it should be kept in mind that they presented a high standard error (Table 4). In general, all the phenotypic correlations were lower than the genetic ones.

las correlaciones fenotípicas entre PL y PG fueron negativas, sin embargo la correlación fenotípica entre PL y PP fueron positivas pero muy bajas en el ganado Jersey, aunque se debe tener en cuenta que presentaron un alto error estándar (Tabla 4). En general todas las correlaciones fenotípicas fueron más bajas que las genéticas.

Table 4. Matrix of genetic correlations (above the diagonal) and phenotypic correlations (below the diagonal) between productive traits in Jersey cows in Antioquia (Colombia).

DISCUSIÓN

PL (EE)

PP (EE)

PG (EE)

SCS (EE)

-0.13 (0.884)

-0.28 (0.982)

0.10 (1.947)

Protein production (PP)

0.07 (0.049)

0.98 (0.852)

0.19 (1.904)

Fat percentage (PG)

-0.45 (0.040)

0.25 (0.044)

-0.01 (1.734)

Somatic cell score (SCS)

0.09 (0.049)

0.11 (0.046)

0.15 (0.046)

Trait Milk yield (PL)

EE= standard error

DISCUSSION The standard error of heritability in the different variables evaluated in Jersey cattle was very high, which suggests implications concerning the reliability of the estimates. In Holstein cattle, a lower standard error was obtained in the estimates mainly due to a greater sampling size and reliability of the records. The milk quality traits (PP and PG) presented mean heritability values (greater than 20%) and a low permanent environmental effect in the two breeds. However, the Jersey breed presented greater heritability values than Holstein, both for PG and for PP, although with a greater standard error. Additionally, heritability for PG was greater than for PP, which is in agreement with some authors (12), although not with others (13). However, both traits were highly correlated. Milk yield per lactation (PL) presented heritability lower than 20% in the two evaluated breeds, showing an important influence from the permanent environment on this trait, which made possible a greater repeatability. Additionally, it is important to make clear that PL was the trait that had the greatest number of repeated records per animal, with an average of 1.9, even with cows that had 7 lactations, and more than 68% of the animals had production records for more than one lactation. For SCS, the low heritability for this trait was confirmed (0.01) both in the Holstein and Jersey breeds, suggesting the high influence

El error estándar de la heredabilidad en las diferentes variables evaluadas en el ganado Jersey fue muy alto, lo que sugiere implicaciones acerca de la confiabilidad de las estimaciones. En ganado Holstein se obtuvo menor error estándar en las estimaciones debido principalmente al mayor tamaño de muestra y a la confiabilidad de los registros. Las características de calidad de la leche (PP y PG) presentaron valores medios de heredabilidad (mayores al 20%) y un bajo efecto del ambiente permanente en las dos razas. Sin embargo, la raza Jersey presentó mayores valores de heredabilidad que Holstein, tanto para el PG como para PP, aunque con un mayo error estándar. Adicionalmente, la heredabilidad para PG fue mayor que para PP, lo cual se encuentra acorde con algunos autores (12), aunque discordó con otros (13). Sin embargo, ambas características se encontraron altamente correlacionadas. La producción de leche por lactancia (PL) presentó heredabilidades más baja que el 20% en las dos razas evaluadas, evidenciando una influencia importante del ambiente permanente para esta característica, lo que permitió obtener una mayor repetibilidad. Adicionalmente, es importante aclarar que PL fue la característica que presentó el mayor número de registros repetidos por animal, con un promedio de 1.9, incluso con vacas que presentaban hasta 7 lactancias y donde más del 68% de los animales presentaban registros de producción para más de una lactancia. Para SCS, se confirmó la baja heredabilidad que presenta esta característica (0.01) tanto en la raza Holstein como Jersey, sugiriendo una alta influencia de los factores ambientales sobre esta variable (14). Sin embargo, la repetibilidad fue mayor en las dos razas, dejando ver el efecto importante del ambiente permanente. Estos resultados concuerdan con lo encontrado en otros estudios (14,15). Los valores medios obtenidos para las características de calidad de la leche (PP y PG), se encuentran acordes con los valores encontrados en la literatura que permite catalogarlas como de heredabilidad media a alta (16,13). Sin embargo, son menores que algunas reportados en Colombia (2) y mayores

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of environmental factors on this variable 814). However, repeatability was greater in the two breeds, showing the important effect that the permanent environment has. These results agree with those found in other studies (14,15). The mean values obtained for milk quality traits (PP and PG) are in agreement with the values found in literature that catalogues them as medium to high heritability (16,13). However, they are less than some reported in Colombia (2) and greater than other reports in other parts of the world (12,17). The estimated repeatability for these characteristics is also found in concordance with different reports presented for dairy cattle, showing that the permanent environment has a lesser importance on solids present in the milk (18). Milk yield per lactation showed heritability of 0.16 and 0.15 for Holstein and Jersey respectively, but with a greater standard error than for Jersey cattle, values which were lower than cases found in literature (12,19,20) that show values above 0.2 and that indicate that milk yield is a trait with medium heritability. However, some authors have found similar values to those obtained in this study, confirming a lower heritability in PL when compared with PG and PP and cataloguing the trait as medium or low heritability (21). On the other hand, the repeatability for this trait is double in magnitude when compared with heritability, which shows the huge effect that the permanent environment has. Similar results have been reported in other studies (22). The somatic cell score (SCS) presented low heritability (0.01) and the highest standard error in both breeds, which is according to what is found in literature (15,21). These results suggest that the traits association with udder health are not highly inheritable, which constitutes a problem for genetic improvement programs. However, the majority of reports suggest a slightly higher heritability than that found in this study (14,16). Most research has encountered difficulties in improving this trait and in many cases suggests the need to reinforce genetic improvement programs with other methods in order to obtain a more accelerated genetic progress, such as assisted selection using molecular markers and genomic selection. On the other hand, higher values for repeatability were found, suggesting the important effect the permanent environment has, which agrees with some reports (14,15). However, genetic progress in these traits is greatly affected by the environment, so good herd management can greatly improve this situation.

que otros reportes en otras partes del mundo (12,17). Las repetibilidades estimadas para éstas características también se encuentran en concordancia con diferentes reportes presentados para ganado lechero, evidenciando una menor importancia del ambiente permanente sobre los sólidos presentes en la leche (18). La producción de leche por lactancia presentó heredabilidades de 0.16 y 0.15 para Holstein y Jersey respectivamente, pero con mayor error estándar para el ganado Jersey, valores que se encuentran en algunos casos por debajo de lo encontrado en la literatura (12,19,20), que plantean valores mayores de 0.2 y que permiten catalogar la producción de leche como una característica de mediana heredabilidad. Sin embargo, algunos autores han encontrado valores semejantes a los obtenidos en el presente trabajo corroborando una menor heredabilidad en PL con respecto al PG y PP y catalogando la característica como de heredabilidad media a baja (21). Por otra parte, la repetibilidad para esta característica es del doble en magnitud que la heredabilidad, lo que evidencia un gran efecto del ambiente permanente. Resultados similares han sido reportados en otros trabajos (22). El puntaje de células somáticas (SCS) presentó una heredabilidad baja (0.01) y el mayor error estándar en las dos razas, lo cual está acorde con lo encontrado en la literatura (15,21). Estos resultados sugieren que las características asociadas a la salud de la ubre son poco heredables, lo que constituye un problema para los programas de mejoramiento genético. Sin embargo, la mayoría de reportes sugieren heredabilidades un poco más altas a las encontrados en el presente trabajo (14,16). La mayor parte de las investigaciones encuentran dificultades para mejorar esta característica y se plantea en muchos casos la necesidad de reforzar los programas de mejoramiento genético con otras metodologías que permitan obtener un progreso genético más acelerado como la selección asistida por marcadores moleculares y la selección genómica. Por otra parte, la repetibilidad presentó valores más altos, sugiriendo un efecto importante del ambiente permanente, lo que concuerda con algunos reportes de la literatura (14,15). Sin embargo, el progreso genético para estas características tiene gran influencia ambiental, por lo que el buen manejo al interior de los hatos puede contribuir en gran medida a su mejora. La correlación genética, entendida como la probabilidad de que dos características diferentes sean influenciadas por los mismos genes, se evidencia como la asociación de los valores

Rincón - Estimation of genetic for production traits in Holstein

The genetic correlation, understood as the probability that two different characteristics are influenced by the same genes, is seen as the association of genetic values of one trait on those of another (11). Keeping this in mind, this study determined the existing correlations between productive traits (PL, PP, PG and SCS) in Holstein and Jersey breeds, finding a high correlation between traits associated with milk quality (PP and PG) but a medium to low correlation in the rest. Genetic correlations between PG and PP were 0.82 and 0.98 for Holstein and Jersey, respectively, which agrees with the results obtained by other authors that have reported high genetic correlations between these two traits (greater than 70%) in different milk breeds (17,22), although in Colombia lower correlations have been estimated (23). The magnitude and direction found in this genetic correlation means that when one of this traits is selected, the other is also selected, resulting in a joint genetic progress. However, it is important to remember that the size of the sample used and the standard error obtained in the Jersey breed is very high, and should therefore be used with caution due to reliability problems. The genetic correlation between PP and PL was negative in both breeds; however, the importance of the association was much greater in Holstein than Jersey cattle. The above results agree with what has been found in literature, where negative associations for these two traits are well known (17,23). However, the Jersey breed has lower values than those reported in the majority of work done on dairy cattle, although it should be kept in mind that the standard error in all estimates is very high, which implies that the results obtained in this breed should be taken with precaution due to reliability problems attributed mainly to the small sample size and the reliability of the data. Genetic association between PL and PG was also negative for both breeds, agreeing with that found in literature (24) and showing difficulty to improve the quality of milk and quantity at the same time, although estimations for the Jersey breed show the same problem associated with standard error that was mentioned previously. Genetic correlation between PP and SCS was 0.28 and 0.19 for Holstein and Jersey, respectively, which, although still low, agree with what was reported by VanRaden et al (19). However, it is important to keep in mind that the standard error for the correlation between the two breeds is high, and that in general the estimates for SCS were more reliable when compared with other traits.

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genéticos de una característica sobre los de la otra (11). Teniendo en cuenta lo anterior, en el presente trabajo se determinaron las correlaciones existentes entre características productivas (PL, PP, PG y SCS) en las razas Holstein y Jersey, encontrándose altas correlaciones entre las características asociadas a calidad de la leche (PP y PG), pero una correlación media a baja entre las demás. La correlaciones genéticas entre PG y PP fueron de 0.82 y 0.98 para Holstein y Jersey, respectivamente, lo cual concuerda con los resultados obtenidos por diferentes autores que han reportado altas correlaciones genéticas entre estas dos características (mayores al 70%) en diferentes razas lecheras (17,22), aunque en Colombia se han estimado correlaciones menores (23). La magnitud y dirección encontrada en esta correlación genética permite que cuando se seleccione para una de estas características indirectamente la otra también se seleccione y se obtiene un progreso genético conjunto. Sin embargo, es importante tener en cuenta el tamaño de la muestra utilizado y el error estándar obtenido en la raza Jersey es muy alto y por lo tanto debe ser tomado con cautela, debido a los problemas de confiabilidad que presenta. La correlación genética entre PP y PL fue negativa en ambas razas, sin embargo, la magnitud de la asociación fue mucho mayor en la raza Holstein que en la Jersey. Los resultados anteriores concuerdan con lo encontrado en la literatura donde las asociaciones negativas para estas dos características son muy conocidas (17,23). Sin embargo, para la raza Jersey los valores son más bajos que los que se encuentran reportados en la mayoría de trabajos realizados con ganado de leche, aunque se debe tener en cuenta que el error estándar de todas las estimaciones es muy grande, lo que implica que los resultados obtenido en esta raza deben ser tomados con precaución debido a problemas de confiabilidad atribuidos principalmente al pequeño tamaño muestral y a la confiabilidad de los datos. La asociación genética entre PL y PG también fue negativa para ambas razas, concordando con lo encontrado en la literatura (24) y evidenciando una dificultad para mejorar la calidad de la leche y la cantidad al mismo tiempo, aunque para la raza Jersey las estimaciones presentan el mismo problema asociado al error estándar que se mencionó anteriormente. La correlación genética entre PP y SCS fue de 0.28 y 0.19 para Holstein y Jersey, respectivamente, que siendo aún baja, concuerda con lo reportado por VanRaden et al (19). Sin embargo, es importante tener en cuenta que el error estándar para la correlación en las dos razas es alto y que en general las estimaciones para SCS tuvieron la menor confiabilidad comparado con las otras características.

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Other genetic correlations were lower (less than 0.1) and with a higher standard error, which coincides with the majority of the results presented in literature (24,25). However, it is important to mention that genetic correlations are estimated parameters for a specific population under particular environmental and genetic conditions, and can therefore present variations between populations (18).

Las demás correlaciones genéticas fueron muy bajas (menores de 0.1) y con alto error estándar, lo que coincide con la mayoría de resultados presentes en la literatura (24,25). Sin embargo, es importante mencionar que las correlaciones genéticas son parámetros estimados de una población específica bajo condiciones ambientales y genéticas particulares, y por tanto puede presentar variaciones entre poblaciones (18).

Milk yield (PL) was weakly associated with SCS, contradicting the hypotheses that indicate improving milk yield increases the somatic cell score and susceptibility to mastitis. Additionally, some studies have found correlations similar to those reported in this work, reinforcing the idea that highly productive animals that are resistant to mastitis can be achieved through genetic improvement (19,25).

La producción de leche (PL) se encontró asociada de manera débil con SCS, contradiciendo los postulados que indican que el mejoramiento en la producción de leche conlleva al aumento en el conteo de células somáticas y la susceptibilidad a mastitis. Adicionalmente, algunos estudios han encontrado correlaciones similares a las reportadas en este trabajo, fortaleciendo la idea que se pueden obtener animales altamente productivos y resistentes a mastitis por medio de mejoramiento genético (19,25).

Finally, the estimated phenotypic correlations were generally weak, which coincides with some reports in literature (22,25). However, the values of these correlations are very variable, according to the environment where they were estimated, so that it is common to find higher values in highly controlled production conditions (17). Greater values were obtained for association among the fat percentage (PG) and protein percentage (PP) (0.48 and 0.25) for Holstein and Jersey, respectively, which reflects the environmental important on the phenotypic expression of a trait, due to the genetic correlation being high, is diluted by the environment. The results obtained in this investigation agree with those found by other authors for dairy cattle (19,25). It is important to highlight that the phenotypic correlations are generally low, due to the influence of multiple environmental factors and in the majority of the cases the genetic correlations are superior to phenotypic correlations. To conclude, we highlight the importance of developing research studies that can orient genetic improvement programs under tropical conditions in order to obtain selection indexes that include more than one trait.

Finalmente, las correlaciones fenotípicas estimadas entre las diferentes características evaluadas por lo general fueron débiles, lo cual coincide con algunos reportes de la literatura (22,25). Sin embargo, los valores de éstas correlaciones son muy variables de acuerdo al ambiente donde son estimadas, por lo que es común obtener valores más altos en condiciones de producción altamente controladas (17). Los mayores valores fueron obtenidos para la asociación entre el porcentaje de grasa (PG) y el porcentaje de proteína (PP) (0.48 y 0.25) para Holstein y Jersey, respectivamente, lo cual refleja la importancia ambiental sobre la expresión fenotípica de una característica, debido a que la correlación genética siendo alta, es diluida por el ambiente. Los resultados obtenidos en esta investigación concuerdan con los reportes encontrados por otros autores en ganado lechero (19,25). Es importante resaltar que las correlaciones fenotípicas por lo general son bajas, debido a la influencia de múltiples factores ambientales y en la mayoría de los casos las correlaciones genéticas son superiores a las correlaciones fenotípicas. Para concluir, cabe resaltar la importancia de desarrollar trabajos de investigación que permitan orientar los programas de mejoramiento genético en condiciones tropicales con el fin de obtener índices de selección que incluyan más de una característica.

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Rincón - Estimation of genetic for production traits in Holstein

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):4974-4988, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Genetic structure of Antioquia Holstein from two SNPs and association with dairy traits Estructura genética del Holstein Antioqueño a partir de dos SNP y asociación con características lecheras Stephania Madrid G,1* M.Sc, Albeiro López H,1 Ph.D, Julián Echeverri Z,1 Ph.D. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Producción Animal, Grupo de Investigación BIOGEM, Calle 59 A No. 63 – 20, Medellín, Colombia. *Correspondence: smadridg@unal.edu.co. 1

Received: November 2014; Acepted: March 2015.

ABSTRACT Objective. Analyze the structure and genetic differentiation of a population of Antioquia Holstein cows from the polymorphisms A192G of INHA and A-320T of FSHR, and explore the association of the genotypic combinations with milk traits. Materials and methods. 1240 lactations of 356 animals from 9 herds in 6 municipalities of Antioquia were analyzed. Genotyping was performed by PCR-RFLP. Structure and genetic diversity parameters were determined using GenAlex software. The association of genotypes combinations with productive and reproductive traits was explored through a linear mixed model. Results. SNP A192G showed a frequency of 0.534 and 0.466 for A and G alleles respectively and SNP A-320T had a frequency of 0.660 far A allele and 0.339 for T allele, this way the population is in HWE. The FST, FIS and FIT values were 0.059, 0.285 and 0.328 respectively indicating a moderate genetic differentiation between subpopulations. The A-320T SNP showed significant effect on milk yield. Fat and protein percentage, calving interval and services per conception were not affected by these polymorphisms or their interaction. Conclusions. Phenotypic selection made on this population has not been strong enough to generate noticeable changes in allele frequencies of these polymorphisms or deviations from Hardy-Weinberg equilibrium. The interaction of these polymorphisms has no significant effect on the characteristics of zootechnical interest, so its use in programs of molecular marker assisted selection is not recommended. Key words: Dairy cattle, polymorphism, population genetic, SNP-RFLP (Source: AGROVOC).

RESUMEN Objetivo. Analizar la estructura y diferenciación genética de una población de vacas Holstein de Antioquia a partir de los polimorfismos A192G de INHA y A-320T de FSHR, y explorar la asociación de las combinaciones genotípicas con características de importancia económica en lecherías especializadas. Materiales y métodos. Se analizaron 1240 lactancias, de 356 animales de 9 hatos en 6 municipios de Antioquia. La genotipificación se realizó mediante PCR-RFLP. Se determinaron parámetros de estructura y diversidad genética utilizando el software GenAlex. La asociación de las combinaciones de genotipos con características productivas y reproductivas se exploró mediante un modelo linear mixto. Resultados. El SNP A192G presentó una frecuencia de 0.534 y 0.466 para el alelo A y G respectivamente y el SNP A-320T tuvo una frecuencia de 0.660 para el alelo A y 0.339 para el alelo T, encontrándose la población en HWE. Los valores FST, FIS y FIT fueron 0.059, 0.285 y 0.328 respectivamente indicando una moderada diferenciación genética entre subpoblaciones. El SNP A-320T presentó efecto 4974

Madrid - SNP A192G and A-320T; association with dairy traits

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significativo sobre la producción de leche. El porcentaje de grasa, proteína, intervalo entre partos y servicios por concepción no se vieron afectados por los polimorfismos o su interacción. Conclusiones. La selección fenotípica realizada sobre esta población no ha sido lo suficientemente fuerte para generar cambios notorios en las frecuencias alélicas de estos polimorfismos ni desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg. La interacción de estos polimorfismos no presenta un efecto significativo sobre las características de interés zootécnico por lo cual no se recomienda su uso en programas de selección asistida por marcadores moleculares. Palabras clave: Ganado lechero, genética poblacional, polimorfismo, SNP-RFLP (Fuente: AGROVOC).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The genetic variability of a population is influenced by the number of founding individuals, genetic drift, strategy and selection intensity (1), while the population structure can be affected by the interchange of genetic material among populations, the reduction of population size, and the decrease in the number of male reproducers, among other factors (2).

La variabilidad genética de una población se ve influenciada por el número de individuos fundadores, la deriva genética, la estrategia y la intensidad de selección (1), mientras que la estructura poblacional puede ser afectada por el intercambio de material genético entre poblaciones, la reducción en el tamaño de la población, la disminución en el número de machos reproductores entre otros factores (2).

The breeding programs implement in developing countries based on importation of genetic material, but the majority of this comes from populations with low genetic variability and high levels of endogamy due to using the few genetically superior individuals that are used for mating, putting at risk the sustainability of the improvement programs (2). In the dairy herds in Antioquia, artificial insemination is implemented as the principal tool for genetic improvement. Techniques such as multiple ovulation and embryo transfer and producing embryos in vitro are implemented with lesser proportion in order to obtain individuals with high genetic merit that improve the productive levels of those systems. Among the existing methodologies to select superior individuals we find marker assisted selection (MAS), which are sites in the genome where differences exist in the nucleotide sequence between individuals of the same species, generating single nucleotides polymorphism (SNP) that can be identified by the PCR-RFLP (3). These polymorphisms can also be used to know the structure and diversity of a population (4). The SNP A192G is found in the exon 1 of the inhibin alpha gene (INHA), and since it is a synonymous mutation it does not change the protein amino acid sequence, but rather generates an additional restriction site for the MspI endonuclease (5,6). The SNPA-320T is found upstream from the follicle stimulating hormone receptor gene (FSHR) and although it is not found in any codifying region, it can modulate gene expression and also change the restriction pattern obtained in the Taq1 enzyme (7,8).

Los programas de mejoramiento genético implementados en los países en desarrollo se basan en la importación de material genético, pero la mayoría de este proviene de poblaciones con baja variabilidad genética y altos niveles de endogamia debido al uso de pocos individuos genéticamente superiores que por lo general están emparentados, poniendo en riesgo la sostenibilidad de los programas de mejoramiento (2). En los sistemas de producción lecheros de Antioquia, se implementa la inseminación artificial como principal herramienta para el mejoramiento genético. Técnicas como la ovulación múltiple y transferencia de embriones y la producción de embriones in vitro son implementadas en menor proporción con el fin de obtener individuos de alto mérito genético que permitan mejorar los niveles productivos en estos sistemas. Entre las metodologías existentes para seleccionar individuos superiores se encuentra la selección asistida por marcadores moleculares (SAM), son sitios en el genoma donde existen diferencias en la secuencia nucleotídica entre individuos de la misma especie, generando polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) que se pueden identificar mediante la PCR-RFLP (3). Estos polimorfismos también pueden ser usados para conocer la estructura y diversidad poblacional (4). El SNP A192G se encuentra en el exón 1 de la inhibina alfa (INHA), al ser una mutación sinónima no cambia la secuencia de aminoácidos de la proteína pero genera un sitio de restricción adicional para la endonucleasa MspI (5,6). El SNPA-320T está localizado corriente arriba del gen del receptor de la hormona folículo estimulante (FSHR) y aunque

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The stimulating follicle hormone (FSH) has an essential role in oogenesis, allowing recruitment and follicular development, and acts exclusively through its receptor (FSHR) which is found on the surface of granulosa cells (7,9). Inhibin regulates FSH levels affecting folliculogenesis (5). These polymorphisms have been associated with the response to superovulation and seminal quality, and it has been found that the INHA G allele exercises a positive effect on both traits, while the FSHR A allele improves seminal traits (5,7,9). However, there are no studies on the effect of the principal parameters evaluated in the specialized dairy systems. The objective of this research was to analyze the structure and genetic diversity of a population of Holstein cattle based on A192G and A-320T polymorphisms of INHA and FSHR genes, and to determine the association of its interaction with the main productive and reproductive parameters estimated in the specialized dairy systems.

MATERIALS AND METHODS Population study. The phenotypic information and the DNA samples were obtained from 356 Holstein cows (1240 lactation periods) from nine herds in seven municipalities of Antioquia (Table 1).

Table 1. Distribution of the animals studied by municipality and herd (N), and number of lactations analyzed by herd (N Lac). N

Herd

N Lac

Bello

Municipality

H-1

121

Belmira

H-2

145

H-3

184

H-4

H-5

118

H-6

H-7

Entrerrios

San Pedro de los Milagros

La Unión

H-8

105

Medellín

116

H-9

116

394

Analysis of structure and population differentiation. The genomic DNA was obtained from blood samples using the modified Salting out method (10). To genotype the SNP A192G (GenBank number: rs41257116), a fragment of 249 bp of exon 1 was amplified using the primer F: 5’-GCCCTGTTTCTGGATGCC-3’ and R: 5’-ATTCAACCCAACCTGCCTA-3’ (5). The final reaction volume was 30 µl, and 3.8 µl was used as buffer reaction 10X (200 nM (NH4)2SO4, 750 mM Tris-HCl pH 8.8 a 25°C), 2.5 mM of MgCl 2, 15 pmol of primer, 0.4 mM of dNTP

no se encuentra en una región codificante puede modular la expresión del gen y además cambia el patrón de restricción obtenido con la enzima Taq1 (7,8). La hormona folículo estimulante (FSH) posee un rol esencial en la oogénesis, permitiendo el reclutamiento y el desarrollo folicular, esta hormona actúa exclusivamente a través de su receptor (FSHR) el cual se encuentra en la superficie de las células de la granulosa (7,9). La inhibina se encarga de regular los niveles de FSH afectando la foliculogénesis (5). Estos polimorfismos han sido asociados con respuesta a la superovulación y características de calidad seminal, y se ha encontrado que el alelo G de INHA ejerce un efecto positivo en ambas características, mientras que el alelo A de FSHR mejora las características seminales (5,7,9). Sin embargo no se encuentran estudios sobre su efecto en los principales parámetros evaluados en las lecherías especializadas. El objetivo de esta investigación fue analizar la estructura y diversidad genética de una población de bovinos Holstein a partir de los polimorfismos A192G y A-320T de los genes de INHA y FSHR, y determinar la asociación de su interacción con los principales parámetros productivos y reproductivos estimados en los sistemas de producción lechera especializados.

MATERIALES Y MÉTODOS Población de estudio. La información fenotípica y las muestras de ADN se obtuvieron de 356 vacas Holstein (1240 lactancias) pertenecientes a nueve hatos en seis municipios de Antioquia (Tabla 1). Análisis de estructura y diferenciación poblacional. El ADN genómico se obtuvo a partir de muestras de sangre con el método de Salting out modificado (10). Para la genotipificación del SNP A192G (GenBank number: rs41257116) se amplificó un fragmento de 249 pb del exón 1 utilizando los primers F: 5’-GCCCTGTTTCTGGATGCC-3’ y R: 5’-ATTCAACCCAACCTGCCTA-3’ (5). El volumen final de reacción fueron 30 µl, se empelaron 3.8 µl de buffer de reacción 10X (200 nM (NH4)2SO4, 750 mM Tris-HCl pH 8.8 a 25°C), 2.5 mM de MgCl2, 15 pmol de primers, 0.4 mM de dNTP (desoxirribonucleótidos trifosfato), 1.5 undidades de Taq-ADN polimerasa y 100 ng de ADN genómico como muestra. Las condiciones de la PCR fueron 5 min a 95°C, 34 ciclos de 94°C por 45 s, 62°C por 45 s para el alineamiento de los primers, 72°C por 45 s y 72°C por 10 min para la extensión final. La digestión se realizó con 15 µl de producto de PCR, 7 U de enzima MspI y

Madrid - SNP A192G and A-320T; association with dairy traits

(triphosphate deoxyribonucleotide), 1.5 units of Taq-DNA polymerase and 100 ng of genomic DNA as a template. The PCR conditions were 5 min at 95°C, 34 cycles of 94°C for 45 s, 62°C for 45s for annealing, 72°C for 45s and 72°C for 10 min for the final extension. Digestion was done with 15 µl of PCR product, 7 U of MspI enzyme and 2.0 µl of buffer in a final volume of 30 µl for 8 hours at 37°C. The amplified fragment contained two common restriction sites and one mutant (GGGAC) for the enzyme in positions 31, 153 and 75, respectively, generating three fragments (123, 95 and 31 bp) for allele A and four fragments (95, 79, 44 and 31 bp) for allele G. The digestion fragments were visualized using electrophoresis in agarose gel at 4%. To genotype the SNP A-320T (GenBank number: rs43676359) a fragment of 970 bp was amplified with the primers F: 5’-AGTTCGACCGCATCCCTG-3’ and R: 5’-AATTCATTTGTGCCAGCATC-3’ (7). The final reaction volume was 25 µl, and 3.1 µl was used as buffer reaction 10X, 2.7 nM of MgCl2, 5 pmol of primers, 0.24 mM of dNTP, 1.5 units of Taq-DNA polymerase and 100 ng of genomic DNA as a template. The conditions of the PCR were 5 min at 95°C, 35 cycles of 94°C for 30 s, 58°C for 30 s for annealing, 72°C for 30 s and 72°C for 8 min for the final extension. Digestion was done with 12 µl of PCR product, 7 U of TaqI and 1.6 µl of buffer in a final volume 25 µl for 16 hours at 65°C. The amplified fragment contained four restriction sites (T´CG_A) for the enzyme, resulting in five fragments (446, 293, 140, 86 and 5 bp) for A allele. Allele T causes the loss of one of the restriction sites, generating four fragments (586, 293, 86 y 5 bp). The digestion fragments were visualized using electrophoresis in agarose gel at 3%. The allelic frequencies were determined using formulas y where N A and Na are the number of A and a alleles, in the population and N is the number of individuals. The genotype frequencies were determined with formulas , y where NAA, NAa and Naa are the number of copies of genotypes AA, Aa and aa (11). Genetic differentiation was determined comparing the observed heterozygosity (Ho) and the expected heterozygosity (He), calculated with GenAlex software (12). The Hardy-Weinberg state of equilibrium (HWE) was determined based on allelic and genotypic frequencies observed and expected using GenAlex software (12). The population structure was determined using Wright’s F statistics: , , where H o and H e are the observed and expected

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2.0 µl de buffer en un volumen final de 30 µl por 8 horas a 37°C. El fragmento amplificado contenía dos sitios de restricción comunes y uno mutante (GGGAC) para la enzima en las posiciones 31, 153 y 75, respectivamente, generando tres fragmentos (123, 95 y 31 pb) para el alelo A y cuatro fragmentos (95, 79, 44 y 31 pb) para el alelo G. Los fragmentos de digestión se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 4%. Para la genotipificación del SNP A-320T (GenBank number: rs43676359) se amplificó un fragmento de 970 pb con los primers 5’-AGTTCGACCGCATCCCTG-3’ y R: 5’-AATTCATTTGTGCCAGCATC-3’ (7). El volumen final de reacción fueron 25 µl, se emplearon 3.1 µl de buffer de reacción 10X, 2.7 nM de MgCl2, 5 pmol de primers, 0.24 mM de dNTP, 1.5 unidades de Taq-ADN polimerasa y 100 ng de ADN genómico como muestra. Las condiciones de la PCR fueron 5 min a 95°C, 35 ciclos de 94°C por 30 s, 58°C por 30 s para el alineamiento de los primers, 72°C por 30 s y 72°C por 8 min para la extensión final. La digestión se llevó a cabo con 12 µl de producto de PCR, 7 U de TaqI y 1.6 µl de buffer en un volumen final de 25 µl por 16 horas a 65°C. El fragmento amplificado contenía cuatro sitios de restricción (T´CG_A) para la enzima, resultando en cinco fragmentos (446,293,140,86 y 5 pb) para el alelo A. El alelo T causa la pérdida de uno de los sitios de restricción, generando cuatro fragmentos (586,293,86 y 5pb). Los fragmentos de digestión se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 3%. Las frecuencias alélicas se determinaron mediante las fórmulas y donde NA y Na son el número de alelos A y a en la población y N es el número de individuos. Las frecuencias genotípicas se determinaron con las fórmulas , y donde NAA, NAa y Naa son el número de copias de los genotipos AA, Aa y aa (11). La diferenciación genética se determinó mediante la comparación de la heterocigosidad observada (Ho) y la heterocigosidad esperada (He), calculadas con el software GenAlex (12). El estado de equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) se determinó con base en las frecuencias alélicas y genotípicas observadas y esperadas utilizando el software GenAlex (12). La estructura poblacional se determinó mediante los estadísticos F de Wright; , , donde Ho y He son la heterocigosidad observada y esperada entre subpoblaciones y HT es la heterocigosidad total esperada. Estos se obtuvieron utilizando el software GenAlex mediante el método de Análisis de Varianza Molecular (AMOVA). El flujo genético

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heterozygosity among subpopulations and HT is the total expected heterozygosity. These were obtained using GenAlex software with the Molecular Variance Analysis (AMOVA) method. The genetic flow expressed as the number of migrants (Nm) was determined with the formula (13). With the FST values paired among subpopulations, the UPGMA tree was built using MEGA 6 software (14). The linkage disequilibrium was evaluated using a linkage disequilibrium coefficient which was calculated with GenAlex software using the formula (11) where fAB is the frequency of the combination of AB alleles and fA and fB is the allelic frequency of A and B respectively; and using the correlation coefficient through sets of loci with the formula (11). Association of interaction of INHA and FSHR genotypes with productive and reproductive efficiency. The analyzed parameters were milk yield adjusted to 305 days (PAJUS), protein percentage (PP) and fat (PG) as quality indicators and somatic cell count (SCC) as a health indicator. The analyzed reproductive parameters were calving interval (IEP) and services per conception (SPC). The SCC was transformed to its logarithmic form with the formula SCS=3+log2(SCC/100) (15). To achieve a better balance in data, the births occurring between 1998 and 2003 were grouped in the year 2003; those in 2004 and 2005 were grouped in 2005; and those that occurred between 2011 and 2014 were grouped in 2014. The sixth to the eleventh lactation were grouped in the sixth lactation. The associations of genotypes with the productive and reproductive efficiency of Holstein cows were determined with a Mixed Linear Model. Tukey test was used to determine significant differences between the measurements obtained for fixed effects included in the model. This statistical analysis was done with SAS software (16). The statistical model used was:

Where Yijklmnopqrst is the dependent variable, which could be PAJUS, PP, PG, SCS, IEP or SPC, µ is the mean for the trait in the population; INHAi is the fixed effect of the INHA genotype [1-3]; FSHRj is the fixed effect of the FSHR genotype [1-3]; Lk is the fixed effect of the lactating number [1-6]; APl is the fixed effect of the birth year[1-8]; MPm is the fixed effect of the birth month [1-12]; Hn is the fixed effect of the herd [1-9];

expresado como el número de migrantes (Nm) se determinó con la formula (13). Con los valores de F ST pareados entre las subpoblaciones se construyó el árbol de UPGMA utilizando el software MEGA 6 (14). El desequilibrio de ligamiento se evaluó a partir del coeficiente desequilibrio de ligamiento el cual se calculó con el software GenAlex mediante la fórmula (11) donde fAB es la frecuencia de la combinación de alelos AB y fA y fB es la frecuencia alélica de A y B respectivamente; y mediante el coeficiente de correlación mediante pares de loci, con la fórmula (11). Asociación de la interacción de genotipos de INHA y FSHR con eficiencia productiva y reproductiva. Los parámetros analizados fueron producción de leche ajustada a 305 días (PAJUS), porcentaje de proteína (PP) y grasa (PG) como indicadores de calidad y conteo de células somáticas (SCC) como indicador de sanidad. Los parámetros reproductivos analizados fueron intervalo entre partos (IEP) y servicios por concepción (SPC). El SCC se transformó a su forma logarítmica con la fórmula SCS=3+log 2(SCC/100)(15). Para lograr un mejor balance en los datos, los nacimientos ocurridos entre 1998 y 2003 se agruparon en el año 2003; los ocurridos entre 2004 y 2005 se agruparon en 2005; y los ocurridos entre 2011 y 2014 se agruparon en 2014. De la sexta a la undécima lactancia se agruparon en la sexta lactancia. Las asociaciones de los genotipos con la eficiencia productiva y reproductiva de vacas Holstein se determinaron con un Modelo Linear Mixto. La prueba de Tukey se usó para determinar diferencias significativas entre las medias obtenidas para los efectos fijos incluidos en el modelo. Este análisis estadístico se realizó con el software SAS (16). El modelo estadístico usado fue:

Donde Yijklmnopqrst es la variable dependiente, que pudo ser PAJUS, PP, PG, SCS, IEP o SPC, µ es la media para la característica en la población; INHAi es el efecto fijo del genotipo de INHA [1-3]; FSHRj es el efecto fijo del genotipo de FSHR [1-3]; Lk es el efecto fijo del número de lactancia [1-6]; APl es el efecto fijo del año de parto [1-8]; MPm es el efecto fijo del mes de parto [1-12]; Hn es el efecto fijo del hato [1-9]; (INHA*FSHR)o es el efecto fijo de la interacción entre ambos genotipos; (H*AP)p es el efecto fijo de la interacción entre hato y año de parto; (H*MP)q es el efecto fijo de la interacción entre

Madrid - SNP A192G and A-320T; association with dairy traits

(INHA*FSHR)o is the fixed effect of the interaction between both genotypes; (H*AP)p is the fixed effect of the interaction between herd and birth year; (H*MP)q is the fixed effect of the interaction between herd and birth month; (AP*MP)r is the fixed effect of the interaction between birth month and year; (H*AP*MP)s is the fixed effect of the interaction between herd, birth year and month; A(INHA*FSHR)t is the random effect of the interaction of the nested genotypes with the animal and eijklmnopqrst is the random error. In addition to these effects, the real production of milk (PREAL) and the length of lactation (DL) were included as covariates in the PP and FT models. For SCS, IEP and SPC, the PAJUS was also included as a covariate, and additionally for SPC the IEP was included, that corresponded to the analyzed lactation as a covariate.

RESULTS Allelic frequencies and genotypes. The PCR product corresponding to a fragment of the exon 1 of INHA gene presented two common restriction sites and a mutating one for the MspI enzyme generating three or four fragments for the A and G allele, respectively (Figure 1). The PCR product corresponded to a fragment of the 5’UTR region of the FSHR gene that contained four restriction sites for the TaqI enzyme when the A allele was present, and three restriction sites when the T allele was present, generating five or four fragments, respectively (Figure 2). For INHA the allelic frequencies were 0.534 and 0.466 for A and G respectively. The genotype frequencies were 0.269, 0.529 and 0.201 for AA, AG and GG respectively. For FSHR, the frequency was 0.660 and 0.339 for the T and A allele respectively. The genotype frequencies found for AA, AT and TT were 0.096, 0.485 and 0.417 respectively (Table 2). Hardy-Weinberg equilibrium. The total population did not present significant differences among observed (Ho=0.504±0.028) and expected (He=0.466±0.013) heterozygosity for both genes (Table 3). The majority of the subpopulations were found in HWE for both genes, except the subpopulations in Entrerrios and La Unión. The subpopulation in Entrerrios showed a significant reduction in the number of heterozygotes expected for the INHA polymorphism, while the subpopulation of La Unión had an excess number of expected heterozygotes for FSHR polymorphism. Genetic structure. The FST statistic for the total population was 0.059 (p=0.001) indicating a low differentiation between the subpopulations. The

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hato y mes de parto; (AP*MP)r es el efecto fijo de la interacción entre mes y año de parto; (H*AP*MP)s es el efecto fijo de la interacción entre hato, año y mes de parto; A(INHA*FSHR) es el efecto aleatorio de la interacción de los t genotipos anidado con el animal y eijklmnopqrst es el error aleatorio. Además de estos efectos, la producción real de leche (PREAL) y la duración de la lactancia (DL) se incluyeron como covariables en los modelos para PP y FT. Para SCS, IEP y SPC también se incluyó la PAJUS como covariable, adicionalmente para SPC se incluyó el IEP, correspondiente a la lactancia analizada como covariable.

RESULTADOS Frecuencias alélicas y genotípicas. El producto de PCR correspondiente a un fragmento del exón 1 del gen de INHA presentó dos sitios de restricción comunes y uno mutante para le enzima MspI generando tres o cuatro fragmentos para los alelos A y G respectivamente (Figura 1). El producto de PCR correspondiente a un fragmento de la región 5’UTR del gen de FSHR contenía cuatro sitios de restricción para la enzima TaqI cuando estaba el alelo A, y tres sitios de restricción cuando estaba el alelo T, generando cinco o cuatro fragmentos respectivamente (Figura 2). Para INHA las frecuencias alélicas fueron 0.534 y 0.466 para A y G respectivamente. Las frecuencias genotípicas fueron 0.269, 0.529 y 0.201 para AA, AG y GG respectivamente. Para FSHR la frecuencia fue de 0.660 y 0.339 para el alelo T y A respectivamente. Las frecuencias genotípicas encontradas para AA, AT y TT fueron 0.096, 0.485 y 0.417 respectivamente (Tabla 2). Equilibrio de Hardy-Weinberg. La población total no presentó diferencias significativas entre la heterocigosidad observada (Ho=0.504±0.028) y la esperada (He=0.466±0.013) para ambos genes (Tabla 3). La mayoría de las subpoblaciones se encontraron en HWE para ambos genes, excepto las subpoblaciones de Entrerrios y La Unión. La subpoblación de Entrerrios presentó una reducción significativa en el número de heterocigotos esperados para el polimorfismo de INHA mientras que la subpoblación de La Unión presentó un exceso en el número de heterocigotos esperados para el polimorfismo de FSHR. Estructura genética. El estadístico FST para la población total fue 0.059 (p=0.001) indicando una baja diferenciación entre las subpoblaciones. El valor obtenido de FIS para la población total fue

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Figure 1. Amplified fragment (249 bp) of the inhibin alpha gene (lines 3 to 5) and the restriction pattern after digesting the MspI enzyme for each genotype (AA lines 7 and 8, GG lines 9 and 10, AG lines 11 and 12); lines 1 and 6 correspond to the molecular weight marker and line 2 corresponds to the negative control (PCR without DNA template).

Figure 2. Amplified fragment (970 bp) of follicle stimulating hormone receptor gene (lines 2 to 4) and restriction pattern after digestion of TaqI for each genotype (TT lines 6 and 7, AT line 8 and AA line 9); line 1 corresponds to the molecular weight marker and line 5 to the negative control (PCR without DNA sample).

Table 2. Allelic and genotypic frequencies for inhibin alpha and follicle stimulating hormone receptor genes in a Holstein population belonging to diverse municipalities in the department of Antioquia. INHA Town

Allelic frequencies

FSHR

Observed genotypic frequencies

Allelic frequencies

Observed genotypic frequencies

Bello

0.500

0.200

0.500

0.300

0.220

0.780

0.038

0.461

0.500

Belmira

0.575

0.425

0.270

0.540

0.189

0.338

0.662

0.100

0.300

0.600

Entrerrios

0.469

0.531

0.288

0.389

0.322

0.386

0.614

0.157

0.605

0.236

San Pedro

0.593

0.407

0.277

0.555

0.166

0.333

0.667

0.036

0.509

0.454

La Unión

0.500

0.370

0.444

0.185

0.382

0.618

0.137

0.392

0.470

Medellín

0.540

0.460

0.216

0.630

0.153

0.329

0.671

0.102

0.500

0.398

Total

0.534

0.466

0.269

0.529

0.201

0.339

0.661

0.096

0.485

0.417

FIS value obtained for the total population was 0.285 (p=0.010), indicating a slight tendency towards endogamy within the subpopulations, in the total population also seen a slight tendency

0.285 (p=0.010) indicando un tendencia baja a la endogamia dentro de las subpoblaciones, en la población total también se observa una leve tendencia a la endogamia, representado

Madrid - SNP A192G and A-320T; association with dairy traits Table 3. Observed heterozygosity (Ho), expected heterozygosity (He) and P value of the Chisquared test for some Holstein populations in the department of Antioquia. Town

Bello

Belmira

Entrerrios

La Unión

Medellín

San Pedro

Valor P

FSHR

0.440

0.343

0.158

INHA

0.474

0.500

0.819

Media

0.457

0.422

FSHR

0.568

0.447

0.102

INHA

0.650

0.489

0.140

Media

0.609

0.468

FSHR

0.455

0.474

0.784 0.045

INHA

0.354

0.498

Media

0.404

0.486

FSHR

0.608

0.472

0.040

INHA

0.623

0.500

0.074

Media

0.615

0.486

FSHR

0.457

0.441

0.763

INHA

0.584

0.497

0.062

Media

0.521

0.469

FSHR

0.392

0.444

0.401

INHA

0.444

0.483

0.559

Media

0.418

0.464

0.504

0.466

Total

towards endogamy, represented in the FIT value obtained, which was 0.328 (p=0.10). The mean flow value of genes represented as the number of migrants (Nm) was 4 individuals per generation; this value represents the movement of individuals or gametes among the subpopulations, promoting a genetic interchange among subpopulations. Genetic differentiation. The paired FST were between 0.006 and 0.174 (Table 4), presenting significant differences indicating degrees of differentiation between the subpopulations from low to medium. The studied subpopulations can be grouped in two branches; the subpopulations of Bello and Belmira are those that are farthest from the genetic tree, while the subpopulations of Entrerrios, La Unión, Medellín and San Pedro de los Milagros show less genetic differentiation (Figure 3). Table 4. Statistic for F ST paired among Holstein populations in the department of Antioquia. Bello Bello

0.000

Belmira

0.013

Belmira EntrerriosLa Unión Medellín

0.000

Entrerrios 0.034**

0.067*** 0.000

La Unión

0.039**

0.094*** 0.020*

Medellín

0.109*** 0.174*** 0.025**

San Pedro 0.040**

San Pedro

0.102*** 0.036**

*p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001

0.000 0.047*** 0.000 0.006

0.049*** 0.000

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por el valor obtenido de FIT, el cual fue de 0.328 (p=0.10). El valor medio de flujo de genes representado como el número de migrantes (Nm) fue de 4 individuos por generación, este valor representa el movimiento de individuos o gametos entre las subpoblaciones promoviendo el intercambio genético entre subpoblaciones. Diferenciación genética. Los FST pareados estuvieron entre 0.006 y 0.174 (Tabla 4) presentando diferencias significativas, indicando grados de diferenciación entre las subpoblaciones desde baja hasta media. Las subpoblaciones estudiadas se pueden agrupar en dos grandes ramas; las subpoblaciones de Bello y Belmira son las más alejadas en el árbol genético, mientras que entre las subpoblaciones de Entrerrios, La Unión, Medellín y San Pedro de los Milagros se presenta menor diferenciación genética (Figura 3). Desequilibrio de ligamiento. Para la población Holstein analizada la combinación de genotipos más frecuente fue el doble heterocigoto AGAT con una frecuencia de 24.45% mientras que la combinación de genotipos menos frecuente fue el doble homocigoto AAAG con una frecuencia de 1.31% (Tabla 5). Los valores de D y r2 por población no fueron significativamente diferentes de cero (datos no mostrados). La población total presentó un D=0.016 y un r2=0.066 pero estos valores no fueron significativos (p>0.05) indicando que presencia de los alelos de un locus es independiente de la presencia de los alelos del otro locus. Asociación de genotipos de INHA-FSHR con características de importancia económica. Análisis descriptivo. La media para PAJUS para la población Holstein de Antioquia fue 5.588±1.492 L/lac, con PP y PG de 3.06 ± 0.26 y 3.89±0.46 respectivamente. Para SCS se encontró una media de 4.19±1.01. La media para el IEP fue 414±85 con 1.67±1.17 SPC (Tabla 6). Asociación de genotipos de INHA-FSHR con características productivas. Producción de leche. Las variables L, H, FSHR las interacciones H*AP, H*MP y H*AP*MP tuvieron un efecto altamente significativo (p<0.01). Las demás variables no mostraron efecto significativo en la característica (p>0.05). Porcentaje de proteína. La PREAL presentó efecto significativo en esta características (p<0.05), las demás variables no presentaron efecto significativo (p>0.05).

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Figure 3. Dendrogram based on the FST paired for six subpopulations of Holstein cows in the department of Antioquia.

Linkage disequilibrium. For the analyzed Holstein population, the most frequent combination of genotypes was the double heterozygote AGAT with a frequency of 24.45%, while the less frequent combination of genotypes was the double homozygote AAAG with a frequency of 1.31% (Table 5).

Porcentaje de grasa. Ninguna de las variables incluidas en el modelo presentó un efecto significativo para la característica (p>0.05). Asociación de genotipos de INHA-FSHR con características sanitarias. Puntaje de células somáticas. Ninguna de las variables incluidas en el modelo presentó un efecto significativo para la característica (p>0.05).

Table 5. Tukey measurements for the production of milk adjusted (PAJUS), protein percentage (PP), fat percentage (PG), somatic cells score (SCS), calving interval (IEP) and services per conception (SPC) according to the combination of genotypes of inhibin alpha and follicle stimulating hormone receptor for Antioquia Holstein cows. GENOTYPE COMBINATIONS INHA/FSHR Evaluated trait

AAAA

AAAT

AATT

AGAA

AGAT

AGTT

GGAA

GGAT

3.93

13.10

10.48

6.11

24.45

21.40

1.31

10.48

8.73

PAJUS (L/lac)

GGTT

6282†§

5721

5278*†

5543

5746

5659

6657*‡

5576

5271‡§

PP (%)

3.01

3.11

3.10

3.09

3.01

3.11

3.07

3.04

3.10

PG (%)

3.80

3.84

3.98

3.91

3.85

4.02

3.65

3.94

3.92

4.96*

4.18

4.34

3.97*

4.17

4.40

3.78

4.21

4.50

IEP (días)

419

404

395*

374†

419

417

463

455*†

389

SPC

2.00

2.07

1.71

1.47

2.38*

2.10

2.20

2.09

1.30*

SCS

Number of individuals (N) and frequency (%) of each genotype combination *†‡§ Significant differences according to the Tukey test

The D and r2 values per population were not significantly different from zero (data not shown). The total population showed D=0.016 and r2=0.066 but these values were not significant (p>0.05), indicating that the presence of alleles in one locus is independent of the presence of alleles in another locus. Association of INHA-FSHR genotypes with economically important traits. Descriptive analysis. The PAJUS mean for the Antioquia Holstein population was 5.588±1.492 L/ lac, with PP and PG at 3.06±0.26 and 3.89±0.46 respectively. For SCS a mean of 4.19±1.01 was found. The mean for IEP was 414±85 with 1.67±1.17 SPC (Table 6).

Tabla 6. Mean, standard deviation (DE), variation coefficient (CV) and number of observations (N) for adjusted milk production (PAJUS), protein percentage (PP), fat percentage (PG), somatic cells score (SCS), calving interval (IEP) and services per conception (SPC) for Antioquia Holstein cows. Evaluated trait

Mean

PAJUS (L/lac)

5588

1492

26.70

811

(%)

3.06

0.26

8.56

421

(%)

3.89

0.46

12.04

421

4.19

1.01

24.13

413

414

20.53

876

1.67

1.17

69.85

1091

SCS IEP SPC

(días)

Madrid - SNP A192G and A-320T; association with dairy traits

Association of INHA-FSHR genotypes with productive traits. Milk production. The L, H, FSHR variables with H*AP, H*MP y H*AP*MP interactions had a highly significant effect (p<0.01). The other variables did not have a significant effect on the trait (p>0.05). Protein percentage. The PREAL had a significant effect on this trait (p<0.05), the other variables did not have a significant effect (p>0.05). Fat percentage. None of the variables included in the model presented a significant effect on the trait (p>0.05). Association of INHA-FSHR genotypes with health traits. Somatic cells scores. None of the variables included in the model presented a significant effect on this trait (p>0.05). Association of INHA-FSHR genotypes with reproductive traits. Calving interval. The AP*MP interaction had a significant effect on the trait (p<0.05). The other variables did not have a significant effect (p>0.05). Services per conception. None of the variables included in the model presented a significant effect on this trait (p>0.05). The mean of each trait for each combination of genotypes is shown in table 6.

DISCUSSION The A192G and A-320T polymorphisms have been studied in other populations, such as the Holstein China population (5,7,9). For cows of the Holstein China population, have reported that the A and G alleles of SNP A192G have a frequency of 0.55 y 0.45 respectively, similar to the frequencies found for the Antioquia Holstein population. In the Holstein cows of both populations, the most frequent genotype was AG, however for the population of Holstein China bulls the most common genotype was the AA (5,7). For the Holstein China bulls a frequency of 0.691 was reported for the A allele and 0.309 for the T allele (5,7). Respecting the A-320T polymorphism, for the Holstein China population a frequency was found for the A and T alleles of 0.301 and 0.699 in females, while in males it was 0.321 and 0.679, respectively. For this population, the most common genotype is TT, in males and females, while in Antioquia is more common the heterozygous (7,9).

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Asociación de genotipos de INHA-FSHR con características reproductivas. Intervalo entre partos. La interacción AP*MP tuvo un efecto significativo sobre la característica (p<0.05). Las demás variables no tuvieron efecto significativo (p>0.05). Servicios por concepción. Ninguna de las variables incluidas en el modelo presentó un efecto significativo para la característica (p>0.05). Las medias de cada característica para cada combinación de genotipos se muestran en la tabla 6.

DISCUSIÓN Los polimorfismos A192G y A-320T han sido estudiados en otras poblaciones, como la población Holstein China (5,7,9). Para las vacas de la población Holstein china se ha reportado que los alelos A y G del SNP A192G tienen una frecuencia de 0.55 y 0.45 respectivamente, similar a las frecuencias encontradas para la población Holstein de Antioquia. En las vacas Holstein de ambas poblaciones el genotipo más frecuente fue el AG, sin embargo para la población de toros Holstein de China el genotipo más común fue el AA (5,7). Para los toros Holstein chinos, se reportó una frecuencia de 0.691 para el alelo A y de 0.309 para el alelo T (5,7). Respecto al polimorfismo A-320T, para la población Holstein China se encontró una frecuencia para los alelos A y T de 0.301 y 0.699 en hembras, mientras que en machos fue de 0.321 y 0.679, respectivamente. Para esa población el genotipo más común es el TT, en machos y hembras, mientras que en Antioquia es más común el heterocigoto (7,9). A pesar que en la población total se observa un mayor número de individuos heterocigotos que el esperado, esta diferencia no es significativa por lo cual la población total se encuentra en HWE. Solamente dos poblaciones, La Unión y Entrerrios, no se encontraron en HWE, la primera por un aumento significativo de los animales heterocigotos indicando una tendencia a la exogamia, y la segunda por una reducción significativa de los mismos mostrando una tendencia a la endogamia. Dentro de las poblaciones existen varias fuerzas que pueden generar desviaciones del HWE, como lo son el apareamiento selectivo, la endogamia, la estructura poblacional y la selección, pero son la endogamia y la estructura poblacional las principales razones que pueden generar

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In spite of the fact that in the total population a greater number of heterozygote individuals was found than was expected, this difference is not significant, since the total population is found in HWE. Only two populations, La Unión and Entrerrios, were not in HWE, the first due to a significant increase of heterozygote animals, indicating a tendency to exogamy, and the second due to a significant reduction of the same, showing a tendency towards endogamy. Within the populations there are several factors that can generate HWE deviations, such as selective pairing, endogamy, population structure and selection, but endogamy and population structure are the main factors that generate HWE deviations due to small differences in the allelic frequencies between subpopulations (11). However, for populations in La Unión and Entrerrios, it is expected that HWE deviations are due to selection processes on traits that can be associated with these polymorphisms, causing an indirect selection and therefore affecting the allelic and genotypic frequencies. The endogamy coefficient of a subdivided population (FIT) can be divided using Wright’s F statistics between the component due to non-random pairing within subpopulations (FIS) and the subdivision between populations (FST) (13). For the analyzed population, the FIT value obtained (0.328) reflects a low tendency to endogamy; in the same way, the FIS value obtained (0.285) indicates a slight tendency to homozygosity due to non-random pairing between individuals in each subpopulation. The FST value for the total population (0.059) indicates that a moderate differentiation between the populations exists, which represents a reduction in the heterozygosity due to population subdivision. The Wright FST statistic measures the subdivision of the population and determines if differences exist in the allelic frequencies among the subpopulations. The populations that showed a greater degree of differentiation were Medellín and Belmira, while the populations in La Unión and San Pedro had less differentiation. This can be explained by the technical level implemented in each of these municipalities, with higher levels in the municipalities of Medellín, San Pedro and La Unión in comparison to Belmira, and therefore among the populations with a higher technical level; in terms of genetic improvement strategies that are implemented, mainly artificial insemination, the FST values are less than 0.05, indicating little or no differentiation. Due to this differentiation, the subpopulations in Antioquia do not act like one population.

desviaciones en el HWE debido a pequeñas diferencias en las frecuencias alélicas entre las subpoblaciones (11). Sin embargo para las poblaciones de La Unión y Entrerrios se espera que estas desviaciones del HWE se deban a procesos de selección sobre las características que puedan estar asociadas a estos polimorfismos, causando una selección indirecta de los mismos, y por tanto afectando sus frecuencias alélicas y genotípicas. Los estadísticos F de Wright permiten dividir el coeficiente de endogamia de una población subdividida (FIT) entre el componente debido al apareamiento no aleatorio dentro de las subpoblaciones (F IS) y la subdivisión entre poblaciones (F ST ) (13). Para la población analizada el valor de FIT obtenido (0.328) refleja una baja tendencia la endogamia; de igual manera el valor de obtenido de FIS (0.285) indica una leve tendencia a la homocigosidad debido al apareamiento no aleatorio entre los individuos de cada subpoblación. El valor de FST para la población total (0.059) indica que existe una moderada diferenciación genética entre las poblaciones, esto representa una reducción en la heterocigosidad debida a la subdivisión poblacional. El estadístico FST de Wright mide la subdivisión de la población y determina si existen diferencias en las frecuencias alélicas entre las subpoblaciones. Las poblaciones que mostraron un mayor grado de diferenciación fueron Medellín y Belmira, mientras que las poblaciones de La Unión y San Pedro presentaron la menor diferenciación. Esto puede explicarse en el nivel de tecnificación implementado en cada uno de estos municipios, siendo más alto en los municipios de Medellín, San Pedro y La Unión en comparación a Belmira, es por esto que entre las poblaciones con mayor nivel de tecnificación; en términos de las estrategias de mejoramiento genético implementadas, principalmente la inseminación artificial, los valores de FST son menores de 0.05, indicando poca o nula diferenciación. Debido a esta diferenciación las subpoblaciones de Antioquia no se comportan como una sola población. La estructura y diferenciación de la población Holstein del departamento de Antioquia también ha sido evaluada a partir de polimorfismos de otros genes como lactoferrina (LTF) y la hormona de crecimiento bovina (bGH). Con base en el gen LTF se encontró que la población de vacas Holstein se encontraba en HWE, y a nivel de subpoblación solo el municipio de San Pedro de los Milagros presentó desviaciones del HWE posiblemente debido a una intensa selección, ya que este es uno de los municipios

Madrid - SNP A192G and A-320T; association with dairy traits

The structure and differentiation of the Holstein population in the department of Antioquia has also been evaluated using polymorphisms of different genes such as lactoferrine (LTF) and the bovine growth hormone (bGH). Based on the LTF gene, the Holstein cow population was found to have HWE, and at the subpopulation level only the municipality of San Pedro de los Milagros presented HWE deviations, possibly due to an intense selection, since this is one of the most important municipalities in the dairy sector in the department (17). This investigation reports for the population a FIS=-0.0717, indicating a tendency to exogamy. Upon evaluating this population based on the bGh gene, it was also found to be in HWE. Although the total population reported a FST=0.0068, a certain degree of differentiation was found among the subpopulations, the municipality of Marinilla being the one that presented the greatest genetic differentiation (4). Nm represents the absolute number of migrant organisms that enter each subpopulation in each generation. This flux of individuals causes a rapid decrease in the fixation index. Thus, migration exercises an important force against genetic divergence between subpopulations (18). For the population analyzed, a total of four migrants per generation was found. Although it is affirmed that if Nm>1 the subpopulations evolve as just one population, it is more correct to affirm that there is no population subdivision if Nm>10 (11). This could explain the genetic differentiation found among subpopulations in the department of Antioquia; although there is genetic flux between them, it has not been sufficient to homogenize the allelic frequencies, although it could be thought that the populations are in a process of homogenization. In other studies (4, 19), the number of migrants that has been reported is much greater than what was found in this investigation. Based on a SNP, the growth hormone gene (bGH) was reported for the Holstein population in Antioquia at Nm=36 (4), while based on the SNP of the lactoferrine gene (LTF), Nm=25 has been reported for the same population (19). This high value could be due to implementing artificial insemination that eliminates geographic barriers and increases the genetic flux between populations (4,19). The polymorphisms analyzed are found in linkage equilibrium, that is, the observed frequency to combine genotypes does not significantly differ from the expected frequency. In this way, it can be asserted that the presence of each allele for each gene analyzed is independent of the presence of any other. Since in bovines the INHA and FSHR genes are found in different

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más importantes para el sector lechero en el departamento (17). Esta investigación reporta para la población un FIS=-0.0717 indicando una tendencia a la exogamia. Al evaluar esta misma población con base en el gen bGH también se encontró en HWE. Aunque para la población total se reportó un FST=0.0068, se encontró cierto grado de diferenciación entre las subpoblaciones, siendo el municipio de Marinilla el que presentaba la mayor diferenciación genética (4). El Nm representa el número absoluto de organismos migrantes que entran a cada subpoblación en cada generación. Este flujo de individuos causa una rápida disminución en el índice de fijación. Así, la migración ejerce una fuerza importante contra la divergencia genética entre subpoblaciones (18). Para la población analizada se encontró un total de cuatro migrantes por generación. Aunque se afirma que si el Nm>1 las subpoblaciones evolucionan como una sola población, es más acertado afirmar que no existe subdivisión poblacional si el Nm>10 (11). Esto podría explicar la diferenciación genética encontrada entre las subpoblaciones del departamento de Antioquia; aunque existe flujo genético entre ellas este no ha sido suficiente para homogenizar las frecuencias alélicas, sin embargo se puede pensar que las poblaciones se encuentran en un proceso homogenización. En otros estudios (4,19) se ha reportado un número de migrantes mucho mayor al encontrado en esta investigación. Con base en un SNP del gen de hormona de crecimiento (bGH) se reportó para la población Holstein de Antioquia un Nm=36 (4), mientras que con base en un SNP del gen de lactoferrina (LTF) se ha reportado un Nm=25 para la misma población (19). Este alto valor puede deberse a la implementación de la inseminación artificial que permite eliminar las barreras geográficas y aumentar el flujo genético entre las poblaciones (4,19). Los polimorfismos analizados se encuentran en equilibrio de ligamiento, es decir que la frecuencia observada para combinación de genotipos no difiere de manera significativa de su frecuencia esperada. De esta manera se puede afirmar que la presencia de cada alelo para cada uno de los genes analizados es independiente de la presencia de cualquier otro de ellos. Como en los bovinos los genes de INHA y FSHR se encuentran en cromosomas diferentes, 2 y 11 respectivamente, estos poseen una tasa de recombinación máxima, es decir 0.5, confirmando su segregación independiente de acuerdo con la segunda ley de Mendel (11). La media para producción de leche fue mayor que el valor reportado en otra investigación (4.482 L/

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chromosomes, 2 and 11 respectively, these have a maximum recombinant rate, that is, 0.5, confirming their independent segregation according to the second law of Mendel (19). The mean milk yield was greater than values reported in other investigations (4.482 L/lac ) for the Holstein Antioquia population (20). However, in other studies a greater value (7.155 L/lac) for milk production has been found for this population (21). The PP found in this investigation was less than that found by other investigators (3.16%), and on the other hand, the mean found for PG was greater than the value reported in literature (3.37%) (20). Regarding reproductive parameters, the SPC and IEP averages were very similar to the average reported in a previous investigation, where a mean of 1.67 and 453 days, respectively, was found (22). The interaction of the studied polymorphisms did not present a significant effect on the majority of the traits that are of Zootechnical interest, however this interaction makes the A-320T polymorphism have a significant effect on the PAJUS, which had not been discovered when analyzing it independently (data not shown). For A-320T polymorphism, the AA individuals evidenced a greater productive level (5.902 L/ lac), with 193 and 381 L/lac more than the AT and TT individuals respectively. The AA individuals also showed a lesser IEP value in comparison with the other genotypes (403 days) (data not shown). Since AA individuals present greater reproductive efficiency, reflected in a lower IEP, it would be expected that these individuals present shorter lactation periods, which when they adjusting to 305 days show improvement and a greater production level is obtained. When analyzing the combination of alleles for these genes, the GGAA and AAAA individuals are those that present the greatest productive levels, confirming that the A allele for FSHR is associated with greater production. Regarding the milk solid content, the AGTT individuals present the greatest percentages of fat and protein. In parallel studies that were done, it was found that the G allele in INHA is associated with greater PG, while the FSHR T allele is related to greater PG and PP, since the FSHR T allele is also related to a greater volume of milk, causing a minor dilution effect on milk solids. A lower IEP value was found in AAAT individuals, while a greater value was found in GGAA, a difference that could be due to INHA alleles, since the A allele is associated with a lesser IEP while GG individuals have greater values for this trait. The lesser SPC number was for GGTT individuals and the greater one for AGAT, but it cannot be

lac ) para la población Holstein de Antioquia (20). Sin embargo en otros estudios han encontraron un valor mayor (7.155 L/lac) de producción de leche para esta población (21). El PP encontrado en esta investigación fue menor que el encontrado por otros investigadores (3.16%), por otro lado, la media encontrada para PG fue mayor que el valor reportado en la literatura (3.37%) (20). En cuanto a los parámetros reproductivos, los promedios de SPC e IEP fueron muy similares al promedio reportado en una investigación previa, donde se encontró una media de 1.67 y 453 días, respectivamente (22). La interacción de los polimorfismos estudiados no presentó un efecto significativo en la mayoría de las características de interés zootécnico, sin embargo, esta interacción causa que el polimorfismo A-320T presente un efecto significativo para la PAJUS, el cual no había sido evidenciado al analizarlo de forma independiente (datos no mostrados). Para el polimorfismo A-320T los individuos AA presentaron el mayor nivel productivo (5.902 L/ lac), con 193 y 381 L/lac más que los individuos AT y TT respectivamente. Los individuos AA también presentaron el menor valor de IEP en comparación con los otros genotipos (403 días) (datos no mostrados). Como los individuos AA presentan una mayor eficiencia reproductiva, reflejada en un menor IEP, se podría esperar que estos individuos presenten lactancias más cortas, que al momento de ajustarlas a 305 días se vean favorecidas y por lo tanto se obtenga un mayor nivel de producción. Al analizar la combinación de alelos para ambos genes, son los individuos GGAA y AAAA los que presentan los mayores niveles productivos, confirmando que el alelo A de FSHR está asociado con mayor producción. Respecto al contenido de sólidos en leche los individuos AGTT presentan los mayores porcentajes grasa y proteína. En estudios realizados de forma paralela se encontró que el alelo G de INHA está asociado con mayor PG, mientras que el alelo T de FSHR está relacionado con mayor PG y PP, debido a que el alelo T de FSHR también se relaciona con menor volumen de leche causando un menor efecto de dilución de los sólidos en la leche. El menor IEP lo tuvieron los individuos AAAT mientras que el mayor fue para los GGAA, esta diferencia puede deberse a los alelos de INHA ya que el alelo A se asocia con un menor IEP mientras que los individuos GG presentan mayores valores para esta característica. El menor número de SPC fue para los individuos GGTT y el mayor para los AGAT, pero no se puede afirmar que alguno de los alelos analizados presente una tendencia a aumentar o disminuir el valor de esta característica.

Madrid - SNP A192G and A-320T; association with dairy traits

stated that one of the analyzed alleles presents a tendency to increase or decrease the value of this trait. Based on this information, we can conclude that selection based on the phenotype in the population of Holstein Antioquia cows has not been sufficiently strong to generate HardyWeinberg equilibrium deviations or diminished in any notable way the frequency of any alleles for the studied polymorphisms, and therefore a great diversity exists among the populations. This genetic diversity greatly important, since individuals can respond adequately to diverse environmental challenges, and additionally it is the starting point to begin genetic improvement programs that seek to increase productive and reproductive efficiency in animal production systems. More studies are needed to determine if these polymorphisms can be useful in molecular marker selection programs and it is recommended that better control over environmental factors be exercised in order to make it easier to detect the effect these polymorphisms could have on the evaluated zootechnical traits.

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Con base en esta información se puede concluir que la selección basada en el fenotipo que se realiza en la población de vacas Holstein de Antioquia no ha sido lo suficientemente fuerte para generar desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg ni ha logrado disminuir de manera notable la frecuencia de ninguno de los alelos de los polimorfismos estudiados, por lo cual existe gran diversidad entre las poblaciones. Esta diversidad genética es de gran importancia ya que permite a los individuos responder de forma más adecuada a diversos retos ambientales, y además es el punto de partida para realizar los programas de mejoramiento genético que buscan aumentar la eficiencia productiva y reproductiva en los sistemas de producción animal. Son necesarios más estudios para determinar si estos polimorfismos pueden ser útiles en los programas de selección asistida por marcadores moleculares y para estos se recomienda realizar un mejor control de los factores ambientales con el fin de evidenciar más fácilmente el efecto que estos polimorfismos puedan tener sobre las características zootécnicas evaluadas.

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):4989-5003, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Reef fish community in presence of the lionfish (Pterois volitans) in Santa Marta, Colombian Caribbean Comunidad de peces arrecifales en presencia del pez león (Pterois volitans) en Santa Marta, Caribe colombiano Rocío García-Urueña,1* Ph.D, Arturo Acero P,2 Ph.D, Víctor Coronado-Carrascal,1 B.Sc. Universidad del Magdalena, Grupo de Investigación Ecología y Diversidad de Algas Marinas y Arrecifes Coralinos. Carrera 32 # 22-08, Santa Marta, Colombia. 2Instituto de Estudios en Ciencias del Mar (CECIMAR). Universidad Nacional de Colombia sede Caribe, El Rodadero, Santa Marta, Colombia. *Correspondencia: garciarociop@yahoo.com 1

Received: October 2014; Acepted: March 2015.

ABSTRACT Objective. Fish species community structure and benthic organisms coverage were studied in five localities in Santa Marta where the lionfish is present. Materials and methods. Abundance of fish species, including lion fish, was established using 30 m random visual censuses and video transects; trophic guilds were established according to available references. On the other hand benthic coverage was evaluated using the software Coral Point Count (CPCe) 4.0. Results. Families with higher species numbers were Serranidae, Labridae, and Pomacentridae. Lionfish abundances were low (2.6±2.1 ind/120 m2), but in any case Pterois volitans was observed as the eleventh more abundant species, surpassing species of commercial value such as Cephalopholis cruentata. Species that were found in larger numbers (>100, Thalassoma bifasciatum, Haemulon aurolineatum, Canthigaster rostrata, Abudefduf saxatilis, Chromis cyanea, and Stegastes partitus) were mainly invertebrate eaters, planctivores, and territorial herbivores. Coral coverage showed higher coral percentages in Chengue (69.9%) and Cinto (27.4%), larger sponge percentages in Morro (32.7%); Isla Aguja and Remanso showed the larger figures for abiotic substrate (41.6 and 37%, respectively); corals, sponges, and gorgonians were the components best explaining fish community, but not for the lion fish, which inhabit all studied reef formations. Conclusions. Lion fish is ranked between the 20 more abundant species, with none commercially important species larger, hence no species may qualify as a natural control. Lion fish has as well become a relatively abundant species in Santa Marta reefs, independent of benthic coverage. Key words: Exotic species, marine ecology, marine fishes (Source: IEDCYT).

RESUMEN Objetivo. Se estudió la estructura de especies de la comunidad íctica y se evaluó la cobertura de organismos bentónicos en cinco localidades en Santa Marta, Colombia con presencia del pez león. Materiales y métodos. Se estimó la abundancia a través de censos visuales y video transectos de 30 m y se estableció el gremio trófico de cada especie según literatura. El sustrato se cuantificó con el software Coral Point Count (CPCe) 4.0. Resultados. Las familias con más especies fueron Serranidae, Labridae y Pomacentridae y, aunque su abundancia promedio fue baja (2.6±2.1 ind/120 m2), Pterois 4989

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volitans fue la undécima especie más abundante, superando a peces comerciales como Cephalopholis cruentata. Las especies más abundantes fueron invertívoros, planctívoros y herbívoros, tales como Thalassoma bifasciatum, Haemulon aurolineatum, Canthigaster rostrata, Abudefduf saxatilis, Chromis cyanea y Stegastes partitus. Se encontró mayor porcentaje de coral en Chengue (69.9%) y Cinto (27.4%) y de esponjas para Morro (32.7%); para Isla Aguja y Remanso predominó el componente abiótico (41.6 y 37%, respectivamente). Corales, esponjas y gorgonias fueron los componentes que mejor explicaron la comunidad íctica, aunque no para el pez león que habita todas las formaciones arrecifales. Conclusiones. El pez león se ubica entre las 20 especies de peces más abundante, con ninguna especie de importancia comercial en los sitios muestreados que lo supere en talla y que pudiera ser un control natural del invasor. Igualmente, se ha convertido en una especie relativamente abundante en los arrecifes samarios sin importar los atributos del fondo. Palabras clave: Ecología marina, especies exóticas, peces marinos (Fuente: IEDCYT).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Since the mid-1970s, Acero y Garzón (1) have gathered information on the biodiversity of marine fish in the Santa Marta area, recording 372 species. Later, Acero (2) listed commercial species present in the Caribbean region of continental Colombia, citing a total of 449 species. These records are greatly relevant since they show the high number of species from the Lutjanidae, Serranidae, Carangidae, Haemulidae and Scaridae families.

Desde mediados de la década de los años 70 del siglo pasado, Acero y Garzón (1) reunieron información sobre la biodiversidad de peces marinos para el área de Santa Marta registrando 372 especies. Luego Acero (2) lista las especies comerciales del Caribe continental colombiano citando un total de 449 especies. Estos registros son de gran relevancia debido a que en ellos se puede ver el alto número de especies de las familias Lutjanidae, Serranidae, Carangidae, Haemulidae y Scaridae conocidas.

To evaluate the deterioration of populations, Grijalba-Bendeck et al (3) analyzed different fishing techniques and disembarking points to determine priority species and conservation areas. Lutjanus analis and Mycteroperca interstialis were catalogued as vulnerable, and Epinephelus striatus as in danger of extinction. The most important factors that led to this condition were overfishing, deterioration, pollution, anthropogenic habitat alterations, and fishing below the minimum size for sexual maturity. In 2013 Álvarez et al (4) mentioned that fishing with increasingly more effective and less selective methods in the reefs of the Caribbean region of Colombia have meant that carnivorous fish have reached very critical levels where species such as Serranidae (groupers Epinephelus spp., Mycteroperca spp. and Cephalopholis spp.), Lutjanidae (snappers Lujtanus spp.) and Centropomidae (snooks Centropomus spp.) have practically disappeared or have been greatly reduced. This problem has worsened with the recent lionfish (Pterois volitans) invasion. This species, native to the Indo-Pacific region, has become established with remarkable success in the western Atlantic Ocean, including the Caribbean Sea (5,6). Presently, a greater biomass and density has been recorded in the invaded area than with the nine lionfish (Pterois volitans) species occurring in their original distribution

Para evaluar el deterioro de las poblaciones, Grijalba-Bendeck et al (3) analizaron diferentes artes de pesca y sitios de desembarque, determinando especies y áreas prioritarias para la conservación. Lutjanus analis y Mycteroperca interstialis fueron especies catalogadas como vulnerables y Epinephelus striatus en peligro de extinción, siendo la presión pesquera, degradación, contaminación, la alteración antropogénica de los hábitats y la captura por debajo de talla mínima de madurez sexual los factores más importantes del estado actual. Para 2013, Álvarez et al (4) mencionan que la pesca con métodos cada día más efectivos y por lo tanto menos selectivos en los arrecifes del Caribe colombiano, ha llevado a los peces carnívoros a niveles muy críticos, donde especies como serránidos (meros-Epinephelus spp., chernas-Mycteroperca spp., mamitasCephalopholis spp.), lutjánidos (pargos-Lujtanus spp.) y centropómidos (róbalos-Centropomus spp.) han prácticamente desaparecido o están enormemente reducidos. A la problemática actual se suma la reciente invasión biológica del pez león (Pterois volitans). Esta especie nativa del Indo-Pacifico logró establecerse con gran éxito en el Atlántico occidental y el mar Caribe (5,6). Actualmente, se ha registrado una densidad y biomasa mayor

García-Urueña - Reef fish community structure in lion fish presence

area (7,8). Apparently, this fish has devastating effects on native communities and could be one of the most harmful marine invasions that has ever been recorded (9). It is considered that in as little as five weeks P. volitans is capable of reducing the recruitment of native fish in small areas (5) by 80%, possibly affecting species that fulfill important ecological roles, such as herbivores (e.g Labridae and Pomacentridae). Similarly, this species could compete for food and space with other species that are economically important, such as snappers (Lutjanidae) and groupers (Serranidae), diminishing quantities and recruitment (5,7,10). Presently, the lionfish is considered worldwide as one of the 10 species that has the greatest ecological and economic impact on invaded sites (11). In the Caribbean region of continental Colombia, González et al (12) were the first to document the presence of lionfish in the Tayrona National Park (Parque Nacional Natural Tayrona, PNNT), and since then the numbers of this fish have increased dramatically. In Colombia, it is considered that the invasion could contribute even further to reducing fish populations in the region, and even more so because a large number of variables make the problem even more complex (3,4). The objective of this study was to evaluate the composition in the fishing community and the availability of substrate both for the invading species as well as the native reef species in order to provide information that can be used as a reference for possible changes in the structure of the fish community, if there are any.

MATERIALS AND METHODS Area of study. Five reef formations were studied: one located in the Santa Marta bay (Morro), another at the limit of Taganga Bay and Tayrona National Park (TNP) (Remanso), and three in the TNP (Isla Aguja, Chengue, and Cinto). Morro is at 11°14Ń and 74º14’W, and its waters are constantly polluted from several sources: Boquerón (sewage water from the city), seaport (port and industry wastes), and Manzanares River (sediment and domestic waste), so that the reef patches only cover 20 to 28% (13). Remanso, located at 11°16Ń and 74°12´W, is at the extreme northeast of Taganga, with a primarily rocky shore and a shallow bordering reef (14). Geological formations on Isla Aguja (11°19Ń, 74°12´W) are rocky-coral substrate, with an average depth of 25 m and a reef that is slightly inclined, of compact rock and stones (14). Chengue is a bay that is located in TNP at

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en el área invadida que la de las nueve especies registradas de pez león (Pterois spp) en su área de distribución (7,8). Al parecer este pez tiene fuertes efectos sobre las comunidades nativas y puede ser una de las invasiones marinas más nocivas de la que se tenga registro (9). Se considera que P. volitans en un tiempo tan corto como cinco semanas es capaz de reducir el reclutamiento de peces nativos en pequeños parches cerca de un 80% (5), pudiendo afectar especies que cumplen funciones ecológicas importantes como la herbivoría (e.g Labridae y Pomacentridae). Asimismo, esta especie podría competir por alimento y espacio, con otras especies de importancia económica como pargos (Lutjanidae) y meros (Serranidae), disminuyendo su abundancia y reclutamiento (5, 7, 10). En la actualidad, el pez león es considerado como una de las 10 especies a nivel mundial con mayor impacto ecológico y económico en los sitios invadidos (11). En el Caribe continental colombiano la presencia del pez león fue documentada por primera vez por González et al (12) en el Parque Nacional Natural Tayrona (PNNT) y actualmente su abundancia ha aumentado dramáticamente. En Colombia se considera que la invasión podría contribuir aún más a la disminución de las poblaciones de peces en la región, más aun como se ha mencionado, existe un gran número de variables que hacen la problemática aún más compleja (3,4). El objetivo de estudio fue evaluar la composición de la comunidad íctica y la disponibilidad de sustrato tanto para la especie invasora como para las nativas de peces arrecifales, con el propósito de aportar información que permita ser un referente de posibles cambios en la estructura de la comunidad íctica, si es que los hay.

MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio. Cinco formaciones arrecifales fueron estudiadas; una correspondiente a la bahía de Santa Marta (Morro), otra al límite entre la bahía de Taganga y el PNNT (Remanso) y tres en el PNNT (Isla Aguja, Chengue y Cinto). Morro se localiza a 11°14‘N y 74º14’O y sus aguas constantemente están influenciadas por fuentes de contaminación provenientes de varios focos como Boquerón (aguas servidas de la ciudad), Terminal Marítimo (desechos portuarios e industriales) y río Manzanares (sedimentos y residuos domésticos), de allí que los parches arrecifales solo presentan una cobertura entre 20 y 28 % (13). Remanso, localizada a 11°16’›N y 74°12’›O, es un área que se encuentra en el extremo nororiental de Taganga, caracterizada por

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11°19’N and 74°08’W, 14 km northeast of Santa Marta. The topography is heterogeneous, with a slight slope where patchy reefs are formed at a certain distance from the shore (13). The bay of Cinto is found at 11°20’N and 74°03’W, and is the central part of the marine sector of TNP. Exposure to waves in this area is similar to Chengue, and both bays have predominantly clear water. Field methods. In each locality, a permanent transect 30 m long and 4 m wide (120 m2) and between 10 and 12 m deep was marked off; between January and December 2012 the number of lionfish was recorded monthly. The fish population was recorded three times during the study period. Using scuba diving equipment, two observers performed visual census for 30 minutes, counting individual fish from all the species found. Relative quantity analysis was considered as the relationship between the number of individuals of a species and the total of all species; in the same way, the relative number of families was determined by comparing its dominance in each locality. For each species, a trophic group was established through bibliographic revisions (carnivore, invertivore, planktivore, and herbivore), (15-17). Benthic coverage of each transect was evaluated by video in each locality, and later 30 images were frozen and assigned 50 numbers at random. The substrate was classified according to the following components (coral, gorgonian, sponges, macroalgae, dead coral, hard substrate, and unidentified). To perform this analysis the software Coral Point Count (CPCe) 4.0. was used. Finally, the species richness and Shannon-Wiever diversity indexes (H’) and equitability (J) were calculated for each locality. Data analysis. The distribution pattern of fish species was determined using the Bray-Curtis classification index (data transformed to square root) and multidimensional scaling using the abundance matrix for each locality. To establish possible associations between the composition of substrate and abundance in the fish community, exploratory analysis of substrate components was performed and the maximum correlation was determined (Bioenv). Later, a DistLM was performed (lineal model based on distance) that included those variables that presented the highest coefficients; this test helps discover models among the fish community using environmental variables of substrate components that describe significant correlations. The analysis was done using the Primer 6 statistics program, version 6.1.13.

presentar primordialmente un litoral rocoso; posee un arrecife franjeante de poca profundidad (14). Las formaciones geológicas de Isla Aguja (11°19’›N, 74°12ºO) son de sustrato rocosocoralino, con una profundidad promedio de 25 m y con un arrecife medianamente inclinado formado por rocas compactas y cantos rodados (14). Chengue es una bahía situada en el PNNT a 11°19›N y 74°08›O, a 14 km al nororiente de Santa Marta. La topografía es heterogénea, con un relieve poco escarpado donde se desarrollan arrecifes de parche a cierta distancia del litoral (13). La bahía de Cinto se encuentra ubicada a 11°20’N y 74°03’O y ocupa la parte central del sector marino del PNNT. La exposición al oleaje dentro de este sector es similar a la de Chengue, y ambas bahías se caracterizan por presentar aguas predominantemente claras. Métodos de campo. En cada localidad, entre 10 y 12 m de profundidad se delimitó un transecto permanente de 30 m de largo por 4 m de ancho (120 m2) y mensualmente entre enero y diciembre de 2012 se registró el número de individuos de pez león. La comunidad íctica fue registrada tres veces durante el periodo de estudio. Mediante el uso de equipo de buceo autónomo dos observadores realizaron censos visuales por 30 minutos contando individuos de todas las especies de peces encontradas. Para el análisis de la abundancia relativa se consideró la relación entre el número de individuos de una especie y el total de todas las especies; igualmente se determinó la abundancia relativa de las familias para comparar la dominancia en cada una de las localidades. Para cada especie se estableció su grupo trófico a través de revisiones bibliográficas (carnívoro, invertívoro, planctívoro y herbívoro), (15-17). La cobertura bentónica se evaluó por medio de video de cada transecto en cada localidad, para posteriormente congelar 30 imágenes y asignar 50 números aleatorios. El sustrato fue clasificado de acuerdo con los siguientes componentes (corales, gorgonias, esponjas, macroalgas, coral muerto, sustrato duro y no identificado). Para este análisis se utilizó el software Coral Point Count (CPCe) 4.0. Finalmente, se calculó la riqueza de especies y los índices de diversidad de Shannon-Wiever (H’) y equitabilidad (J) para cada localidad. Análisis de datos. El patrón de distribución de las especies de peces se determinó a través del índice de clasificación de Bray-Curtis (datos transformados a raíz cuadrada) y por escalamiento multidimensional a partir de la matriz de abundancia por localidad. Para establecer las posibles asociaciones entre la composición de

García-Urueña - Reef fish community structure in lion fish presence

RESULTS A total of 88 fish species corresponding to 32 families were identified (Table 1). Of these, those that presented the greatest number of species were Labridae (14), Serranidae (9), Pomacentridae (8), and Haemulidae and Chaetodontidae (5). Out of all the species, 15 (17%) were found in all five localities, 4 (4.5%) were exclusive from Morro and Remanso, 8 (9.1%) from Isla Aguja, 9 (10.2%) from Chengue and 3 (3.4%) from Cinto. The greatest number of species and the greatest richness, uniformity and diversity were found in Isla Aguja. Although Chengue and Cinto bays had a similar number of species (50 and 49, respectively), there was a greater diversity (H’=3.33) and uniformity (J=0.85) in Chengue. Morro and Remanso showed similar values in the three indexes (Table 1). Of the twenty most abundant species in all five localities (#ind./120 m2), those that showed higher values were Thalassoma bifasciatum and Abudefduf saxatilis with 48 and 47 individuals. They were followed by Chromis cyanea, Clepticus parrae, Stegastes partitus, Haemulon aurolineatum, and Canthigaster rostrata with abundances between 22 and 32 individuals. Pterois volitans was found with an average abundance per transect of 9.8 ind./120 m2 which place it in 11th place (Figure 1). 12 10 8 6 4 2

S. viride

P. maculatus

Chromis sp.

D. holocanthus

C. capistratus

S. taeniopterus

B. rufus

C. crysos

P. volitans

C. cruentata

M. jacobus

A. bahianus

C. rostrata

S. chrysopterum

H. aurolineatum

C. parrae

C. cyanea

T. bifasciatum

Figure 1. Relative abundance (#ind./120 m2) of the 20 most representative species.

According to their feeding habits, invertivore species predominated (45.1%), the most abundant being T. bifasciatum, C. rostrata, and H. aurolineatum. Carnivore species followed in importance (24%); in this case, P. volitans was the most abundant species in this group, along with Cephalopholis cruentata. Herbivores came in third place (18%), S. partitus and Sparisoma chrysopterum were the most abundant. Lastly,

4993

sustrato y la abundancia de la comunidad íctica, se realizó un análisis exploratorio de componentes del sustrato y se determinó la máxima correlación (Bioenv). Posteriormente, se realizó un DistLM (modelo lineal basado en la distancia) con la inclusión de aquellas variables que presentaron los coeficientes más altos; esta prueba permite describir los modelos entre la estructura de la comunidad íctica usando las variables ambientales de componentes del sustrato que describe correlaciones significativas. Los análisis se realizaron con el programa estadístico Primer 6, versión 6.1.13.

RESULTADOS En total se identificaron 88 especies de peces correspondientes a 32 familias (Tabla 1). De éstas, las que presentaron el mayor número de especies fueron: Labridae (14), Serranidae (9), Pomacentridae (8), Haemulidae (5) y Chaetodontidae (5). Del total de especies, 15 (17%) fueron comunes a las cinco localidades, 4 (4.5%) fueron exclusivas para Morro y Remanso, 8 (9.1%) para Isla Aguja, 9 (10.2%) para Chengue y 3 (3.4%) para Cinto. En Isla Aguja se encontró el mayor número de especies y las más altas riqueza, uniformidad y diversidad. A pesar que las bahías de Chengue y Cinto tuvieron un número similar de especies (50 y 49, respectivamente) hubo una mayor diversidad (H’=3.33) y uniformidad (J=0.85) en Chengue. Morro y Remanso presentaron valores similares para los tres índices (Tabla 1). Entre las veinte especies más abundantes para las cinco localidades (#ind./120 m2), las que tuvieron mayores valores fueron Thalassoma bifasciatum y Abudefduf saxatilis con 48 y 47 individuos. Le siguieron Chromis cyanea, Clepticus parrae, Stegastes partitus, Haemulon aurolineatum y Canthigaster rostrata con abundancias entre 22 y 32 individuos. Pterois volitans se encontró con una abundancia promedio por transecto de 9.8 ind./120 m2 ocupando el undécimo lugar (Figura 1). De acuerdo con sus hábitos alimentarios predominaron las especies invertívoras (45.1%), siendo las más abundantes T. bifasciatum, C. rostrata y H. aurolineatum. Las especies carnívoras siguieron en importancia (24%); en este caso P. volitans fue la especie más abundante de este grupo junto con Cephalopholis cruentata. Los herbívoros se ubicaron en tercer lugar (18%), siendo S. partitus y Sparisoma chrysopterum las más abundantes. Por último aparecen las planctívoras (12.1%) con A. saxatilis y C. cyanea. Entre localidades se encontró en

4994

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(Supl) Diciembre 2015 Table 1. Relative abundance of each species, total number of species, richness (d) equitability indexes (J) Shannon-Weaver diversity (H´). M: Morro; R: Remanso; IA: Isla Aguja; CH: Bay of Chengue and C: Bay of Cinto. The most representative families are in bold letters. FAMILIES/SPECIES ACANTHURIDAE

HAB. ALIM

Locality M

1.18

Acanthurus bahianus

Herb

1.96

2.67

3.30

1.87

A. coeruleus

Herb

0.59

1.34

2.20

1.87

A. chirurgus

Herb

0.20

1.34

0.98

2.67

AULOSTOMIDAE Aulostomus maculatus BALISTIDAE Balistes vetula BOTHIDAE Bothus lunatus CARANGIDAE

Carn

0.95

1.10

0.37

Invert

0.22

Carn

0.27

Caranx crysos

Carn

2.37

C. ruber

Carn

1.18

Elagatis bipinnulata

Carn

CHAETODONTIDAE

0.94

5.35

0.75 1.12

Chaetodon striatus

Invert

0.47

0.39

1.32

0.37

C. capistratus

Invert

0.47

4.91

1.07

0.44

1.31

C. sedentarius

Invert

0.47

C. ocellatus

Invert

1.42

1.57

2.14

0.44

0.56

Prognathodes aculeatus

Invert

0.24

0.98

1.34

0.95

1.18

1.60

2.64

0.19

0.20

1.87

0.44

0.19

2.42

1.87

21.98

1.87

DIODONTIDAE Diodon holocanthus CIRRHITIDAE Amblycirrhitus pinos EPHIPPIDAE Chaetodipterus faber FISTULARIDAE Fistularia tabacaria HAEMULIDAE

0.75

Invert Invert

0.24

Invert Carn

0.20

Anisotremus virginicus

Invert

A. surinamensis

Invert

Haemulon aurolineatum

Invert

H. flavolineatum

Invert

1.96

0.27

1.10

H. plumierii

Invert

0.98

0.27

3.30

HOLOCENTRIDAE

0.27

0.19

Myripristis jacobus

Plact

3.93

8.02

0.56

Holocentrus rufus

Plact

0.59

2.67

0.37

LABRIDAE Clepticus parrae

Plact

2.84

4.81

18.73

Bodianus rufus

Invert

1.66

0.59

0.53

2.20

3.75

Halichoeres garnoti

Invert

0.47

0.59

2.67

H. bivittatus

Invert

Thalassoma bifasciatum

Invert

2.37

19.65

5.35

2.20

18.73

1.34

2.20

0.20

Scarus iseri

Herb

S. taeniopterus

Herb

S. guacamaia

Herb

S. vetula

Herb

Sparisoma chrysopterum

Herb

S. aurofrenatum

Herb

S. viride

Herb

1.90

1.96

S. atomarium

Herb

0.24

0.20

S. rubripinne

Herb

LUTJANIDAE

4.74

1.31 0.19

0.44 2.20 11.85

1.96

0.94 0.88 0.27

0.44

1.87

1.96

Lutjanus apodus

Carn

L. cyanopterus

Carn

L. mahogoni

Carn

Ocyurus chrysurus

Carn

MALACANTHIDAE

1.96

0.88 1.76 0.53

4.40

0.56

4.40

0.19

4995

García-Urueña - Reef fish community structure in lion fish presence Malacanthus plumieri

Carn

MONACANTHIDAE

0.27

Aluterus scriptus

Invert

0.24

0.27

Cantherhines macrocerus

Invert

0.24

0.27

C. pullus

Invert

0.47

0.27

MULLIDAE

0.19 0.19

Pseudupeneus maculatus

Invert

Mulloidichthys martinicus

Invert

MURAENIDAE

0.71

1.96

0.53

3.30

1.96

2.67

0.88 0.44

0.37

0.75

Gymnothorax moringa

Carn

0.80

G. miliaris

Carn

0.27

OSTRACIIDAE

Lactophrys triqueter

Invert

L. bicaudalis

Invert

Acanthostracion polygonius

Invert

OPISTOGNATHIDAE

0.24

0.59

1.07

1.10

0.20

0.53

0.66

0.37

Opistognathus aurifrons

Plact

PRIACANTHIDAE

2.67

0.94

0.27

0.19

Heteropriacanthus cruentatus

Plact

OPHICHTHIDAE

1.42

Ophichthus ophis

Carn

POMACANTHIDAE

0.24

0.19

Holacanthus tricolor

Invert

H. ciliaris

Invert

Pomacanthus paru

Invert

0.53

1.10

P. arcuatus

Invert

0.27

0.22

POMACENTRIDAE

0.47

0.98

0.53

0.98

0.27

1.10

0.75

Abudefduf saxatilis

Plact

1.42

19.65

2.67

4.40

Chromis cyanea

Plact

23.70

0.98

5.35

2.20

C. multilineata

Plact

1.18

5.89

0.66

C. insolata

Plact

1.90

6.68

Stegastes partitus

Herb

16.59

5.35

2.20

S. adustus

Herb

5.49

S. planifrons

Herb

1.34

Microspathodon chrysurus

Herb

1.42

0.98

0.80

0.44

SCIAENIDAE

18.73

1.50

Equetus punctatus

Invert

Pareques acuminatus

Invert

SCOMBRIDAE

0.47

0.44

0.19

0.44

Auxis thazard

Carn

SCORPAENIDAE

2.67

2.89 1.69

Pterois volitans

Carn

2.84

0.98

1.87

2.42

Scorpaena plumieri

Carn

0.27

SERRANIDAE

Hypoplectrus nigricans

Carn

H. guttavarius

Carn

H. puella

Carn

2.37

H. unicolor

Carn

0.24

Mycteroperca sp

Carn

Cephalopholis cruentata

Carn

C. fulvus

Carn

Serranus tigrinus

Invert

Rypticus saponaceus

0.24

2.20

0.19 0.27

2.20 0.66

0.94

0.22 2.13

3.93

2.67

0.66

0.27 1.18

2.95

Carn

SPHYRAENIDAE

0.94

0.80

0.19 0.37

0.22

0.94

1.10

0.19

1.76

0.94

0.66

2.25

0.80

Sphyraena barracuda

Carn

SYNGNATHIDAE

Hippocampus reidi

Plact

SYNODONTIDAE

0.20

Synodus intermedius

Carn

TETRAODONTIDAE

0.47

0.20

Invert

3.55

7.86

Invert

0.24

Canthigaster rostrata Sphoeroides spengleri

8.02

Número de especies

0.76

0.78

0.87

0.85

0.72

2.85

2.88

3.49

3.33

2.80

H’

4996

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(Supl) Diciembre 2015

planktivores (12.1%) with A. saxatilis and C. cyanea. As for localities, Remanso presented the greatest percentage of invertivore, herbivore, and planktivore groups (50%, 22.5%, and 15% respectively). Carnivores were the most abundant in Cinto bay (32.7%) (Figure 2).

Figure 2. Percentage breakdown of trophic groups in each locality.

Relating to substrate, a greater percentage of coral coverage was found in Chengue (70%), followed by Cinto (27%), and Isla Aguja (24%). The presence of gorgonias was higher in Remanso (37%) and Morro (32%). In Cinto macroalgae predominated (47%); and the abiotic substrate was greater in Remanso (41%) and Isla Aguja (37%). The rest of the components were variable for each locality with percentages greater than 15% (Figure 3).

Remanso el mayor porcentaje de los grupos de invertívoros, herbívoros y planctívoros (50, 22.5 y 15% respectivamente). Los carnívoros para la bahía de Cinto fueron los más abundantes (32.7%) (Figura 2). Con respecto al sustrato, se encontró el mayor porcentaje de corales en la bahía de Chengue (70%), seguida por la de Cinto (27%) e Isla Aguja (24%). La presencia de gorgonias fue alta en Remanso (37%) y Morro (32%). En Cinto predominaron las macroalgas (47%); y el sustrato abiótico fue mayor en Remanso (41%) e Isla Aguja (37%). El resto de componentes fue variable para cada localidad con porcentajes menores a 15% (Figura 3). La comunidad íctica de la bahía de Chenque se separa del resto de las formaciones arrecifales evaluadas tanto con los análisis exploratorios (Bioenv, DistLM) (Figura 4) como con el dendrograma de similaridad de Bray-Curtis. Donde los grupos que se definieron como cercanos fueron las localidades de Morro e Isla Aguja (55%) y Remanso y Cinto (52%) (Figura 5). La cobertura de corales, gorgonias y esponjas fueron las variables de los componentes de sustrato que mejor se relacionaron con la abundancia de la comunidad íctica, con una correlación de 0.806. El 33% de la variación se explica para la bahía de Chengue con la asociación de corales y esponjas, mientras que en Morro y Remanso con el sustrato abiótico (Figura 4).

Figure 3. Percentage breakdown of the main substrate components in each locality.

The fish community in Chenque bay is distinct from the rest of the reef formations both in the exploratory analysis (Bioenv, DistLM) (Figure 4) as well as in the Bray-Curtis dendrogram of similarity. Groups that were defined as similar were in Morro and Isla Aguja (55%) and Remanso and Cinto (52%) (Figure 5). Corals, gorgonias and sponges were the substrate component variables that best related to the abundance in

Figure 4. Multidimensional scale between fish species per locality and the coverage of benthic organisms.

García-Urueña - Reef fish community structure in lion fish presence

4997

Figure 5. Group analysis (Bray-Curtis) of the relative abundance of fish communities between localities.

the fish community, with a correlation of 0.806. 33% of the variation is explained in Chengue by associating corals and sponges, while in Morro and Remanso with abiotic substrate (Figure 4).

DISCUSSION For Gaira bay (3 km southeast of the Santa Marta bay) Grijalba-Bendeck et al (18) evaluated fish through the technique of stationary visual census and the results showed that families Serranidae, Lutjanidae, Labridae and Scaridae [(presently included in Labridae (19)] were the most abundant. Evaluating fish associated to coral formations in the Caribbean region of Colombia, specifically Chengue, Reyes-Nivia et al (20) showed the importance of families Serranidae, Scaridae [(presently included in Labridae (19)], Labridae, Pomacentridae, Haemulidae, Lutjanidae, and Gobiidae; Olaya-Restrepo et al (21) evaluated the catch of reef fishes in 20 stations near Santa Marta and TNP and showed that families Serranidae, Haemulidae, Gobiidae, Scaridae [(presently included in Labridae (19)] and Pomacentridae as the most dominant. In general terms, and as shown in this study, the abundance of families Serranidae, Haemulidae, and Labridae is constant; however, family Lutjanidae, that was believed important did not appear as such in Olaya-Restrepo et al (21). Nevertheless, family Gobiidae, which is usually well represented, was not recorded; this could be due to the methods and purposes previously used, since, in this case, cracks and rifts were not examined during the census, and large areas and different depth strata were not covered. Regarding species numbers, Acero and Garzón (1) list 372 species from the Santa Marta region, considering it as being biologically rich. This

DISCUSIÓN Para el morro de la bahía de Gaira (3 km al suroccidente de la bahía de Santa Marta) GrijalbaBendeck et al (18) realizaron la evaluación de peces a través de la técnica de censo visual estacionario y sus resultados muestran a las familias Serranidae, Lutjanidae, Labridae y Scaridae [(incluida actualmente en Labridae (19)] como las más abundantes. Al evaluar los peces asociados a formaciones coralinas del Caribe colombiano, específicamente para la bahía de Chengue, Reyes-Nivia et al (20) destacan la importancia de las familias Serranidae, Scaridae [(incluida actualmente en Labridae (19)], Labridae, Pomacentridae, Haemulidae, Lutjanidae y Gobiidae; Olaya-Restrepo et al (21), evaluaron los ensamblajes de peces arrecifales en 20 estaciones del área de Santa Marta y el PNNT y mostraron a las familias Serranidae, Haemulidae, Gobiidae, Scaridae [(incluida actualmente en Labridae (19)] y Pomacentridae como las más dominantes. En términos generales y al igual con lo obtenido en este estudio, persisten en su abundancia familias como Serranidae, Haemulidae y Labridae; sin embargo, se destaca que la familia Lutjanidae, que inicialmente se marcaba como importante, no apareció como tal en el estudio de Olaya-Restrepo et al (21). La familia Gobiidae, por el contrario, aunque usualmente está bien representada, no fue registrada; esto puede ser resultado de los métodos y propósitos previos pues, en este caso, no se examinaron grietas o hendiduras durante los censos y no se cubrieron áreas tan extensas, ni diferentes estratos de profundidad. Con respecto al número de especies, Acero y Garzón (1) listan para la región de Santa Marta 372, enmarcando a la región como de una gran riqueza biológica. Documento que se constituye en un punto de partida para comparaciones con

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(Supl) Diciembre 2015

document is a starting point for comparing the present state of the fish fauna in the region. For example, Grijalba-Bendeck et al (18) mentioned that 30% of the previously mentioned species were recorded in Gaira; additionally, those belonging to the Serranidae family were found in reduced numbers, which the authors attributed possibly to overfishing. Reyes-Nivia et al (20) list 149 species in Chengue, with commercially important fish of the families Serranidae and Lutjanidae, such as Mycteroperca acutirostris, M. bonaci, M. interstitialis, M. tigris, M. venenosa, Lutjanus analis, L. griseus, and L. jocu, none of which were seen in this study.

el estado actual de la ictiofauna en la región. Por ejemplo, Grijalba-Bendeck et al (18) mencionan que para Gaira se registró un 30% de las especies previamente citadas; además, se encontró con abundancias bajas a todas aquellas pertenecientes a la familia Serranidae, atribuida esta disminución por los autores a una posible explotación pesquera. Reyes-Nivia et al (20) listan para Chengue 149 especies, con peces de importancia comercial de las familias Serranidae y Lutjanidae como Mycteroperca acutirostris, M bonaci, M. interstitialis, M. tigris, M. venenosa, Lutjanus analis, L. griseus y L. jocu, ninguna de las cuales fue vista en este estudio.

Chengue bay, where mangrove, marine grass and reef patches are present but were not evaluated because reef formation monitoring was already established in its central area; the species listed (50 species) were less than those found by OlayaRestrepo et al (21) (between 62 and 95 species). However, Lutjanus cyanopterus was recorded, a piscivorous species that could play an important role in the control of lionfish, even more so since, as previously mentioned, no other species that could compete or prey on the invader was seen.

La Bahía de Chengue, una localidad con manglar, pastos marinos y varios parches arrecifales, sitios que no fueron evaluados debido a que la formación arrecifal de seguimiento se estableció en su parte central; de allí que las especies listadas (50 especies) fueran menos que las encontradas por Olaya-Restrepo et al (21) (entre 62 y 95 especies). Sin embargo, sí fue registrada Lutjanus cyanopterus, una especie piscívora que podría estar desempeñando un papel importante en el control del pez león, más aun cuando, como se mencionó anteriormente, no fue vista ninguna otra de las especies mencionadas que pudieran competir o depredar al invasor.

Olaya-Restrepo et al (21) studied 20 stations showing an average diversity index of 1.73 in TNP and 1.68 in unprotected areas; four localities coincide with this study and the results generally show a greater number of species (70 in Morro, 62 in Isla Aguja, 62 and 95 in Chengue and between 70 and 80 in Cinto), although commercially important fish such as Mycteroperca tigris, M. venenosa, M. phenax, Epinephelus guttatus, E. itajara, Lutjanus analis and L. buccanella were not recorded. Additionally lower averages for individuals and much lower densities were found in large snapper and grouper species; only L. mahogoni was abundant in the TNP protected area and Cephalopholis cruentata in unprotected stations. In comparison with that study, L. mahogoni, in spite of being observed in the park, only had a relevant abundance in Chengue, and C. cruentata, which was present in the five localities, was more abundant in those outside of TNP. In spite of being considered a protected area, Isla Aguja is visited daily by tourists and fishermen; it was the reef formation that had the greatest richness and diversity of species (54 species and H’=3.49) and that, along with Chengue and Cinto, presented the highest diversity values. Krajewski and Floeter (17) mentioned the protected marine areas as an important factor that can influence the differences in fish communities. Their study compared protected and uninhabited fishing sites with a marine park that permits local fishing, and

El estudio de Olaya-Restrepo et al (21) para 20 estaciones mostró un índice de diversidad promedio de 1.73 en el PNNT y 1.68 en áreas sin protección; cuatro localidades coinciden con este estudio y sus resultados muestran en general un mayor número de especies (70 en Morro, 62 en Isla Aguja, 62 y 95 para Chengue y entre 70 y 80 para Cinto), aunque peces de importancia comercial como Mycteroperca tigris, M. venenosa, M. phenax, Epinephelus guttatus, E. itajara, Lutjanus analis y L. buccanella no fueron registrados. Además, abundancias promedio menores a un individuo y densidades muy bajas fueron encontradas para especies de pargos y meros de gran tamaño; solamente L. mahogoni fue abundante en el área protegida del PNNT y Cephalopholis cruentata en estaciones sin protección. Lo anterior, en comparación con ese estudio, L. mahogoni, a pesar de que fue observada en las localidades del parque, su abundancia solo fue relevante para Chengue, y C. cruentata, que se presentó en las cinco localidades, fue más abundante para aquellas fuera del PNNT. Isla Aguja a pesar de estar delimitada como área protegida, es visitada diariamente por turistas y pescadores; fue la formación arrecifal con la mayor riqueza y diversidad de especies (54 especies y H’=3.49) y que, junto con las bahías de Chengue y Cinto, presentó los valores de diversidad más altos.

García-Urueña - Reef fish community structure in lion fish presence

it was found that the main species that interest fishermen were the macrocarnivores, so that the great predatory fish in the trophic chain were less abundant. In the Santa Marta region, it has been determined that important carnivore species have been diminishing (18,20,21), which could have had an effect on the proliferation of the invading species. The structure of the fish community is due to biotic variables such as the abundance of potential competitors (22) and prey (15). In this case, with the presence of the invader, Maljkovic et al (23) found that in the Bahamas M. tigris and E. striatus preyed on the lionfish. Mumby et al (24), in the same region, studied a group of groupers, such as E. striatus, M. tigris, M. bonaci, M. venenosa and M. interstitialis, founding a seven fold lineal reduction in the lionfish biomass in relation to groupers; therefore, evidence suggests that predators can play a role as natural control. In this study, the rarity or absence of mid-sized piscivore can impact the proliferation of the invading species, which is the most abundant predatory fish, even above the small carnivores that are not actively sought by fishermen; this hypothesis should be evaluated in future studies. In terms of species composition in reef formations where lionfish is present, Lesser and Slattery (25) studied a reef in the Bahamas between 2003 and 2009 with phase changes in communities at mesophotic depths in which, as herbivore fish diminished due to the presence of lionfish, the areas became dominated by algae. The study shows how, under invader presence and its depredation, 19 species were utilized with the consequent reduction of herbivore, planktivore, and spongivore species as well as those that feed on small crustaceans. This impact is called cascade, whether directly due to the consumption of herbivores or indirectly due to species displacement. The study performed by Morris and Akins (26) mentioned that the lionfish diet is diverse, feeding mainly on small fish that are equally important for many commercially important species such as Serranidae and Lutjanidae. Regarding the analysis of the stomach content of lionfish in North Carolina, Muñoz et al (27) suggested a general carnivore diet made up of 3.8% crustaceans, cephalopods, bivalves and ophiuroids, and the rest composed by 16 fish families, the most abundant being Haemulidae, Labridae, and Serranidae. In the Colombian Caribbean, lionfish diet was initially analyzed by Muñoz-Escobar and Gil-Agudelo (28) and it was likewise identified as a generalist carnivore, with the family Serranidae being the most

4999

Krajewski y Floeter (17) mencionan a las áreas marinas protegidas como un factor importante que puede influir en las diferencias de la comunidad de peces. Su estudio comparó sitios protegidos de la pesca y no habitados, con un parque marino pero con pesca local permitida; se encontró que las principales especies de interés por los pescadores fueron macrocarnivoros, haciendo así que los peces grandes depredadores de la cadena trófica, fueran especies menos abundantes. Para la región de Santa Marta se ha determinado la disminución de especies carnívoras importantes (18,20,21), lo cual puede haber favorecido la proliferación de la especie invasora. La estructura de la comunidad de peces responde a variables bióticas, tales como la abundancia de competidores potenciales (22) y de presas (15). Para el caso actual con la presencia del invasor, luego que Maljkovic et al (23) encontraran en las Bahamas a especies como M. tigris y E. striatus conteniendo como presa al pez león, Mumby et al (24), en la misma región, estudiaron un grupo de meros y chernas tales como E. striatus, M. tigris, M. bonaci, M. venenosa y M. interstitialis, encontrando una reducción lineal de siete veces en la biomasa del pez león en relación con los meros y chernas; por consiguiente, la evidencia sugiere que la depredación por estas especies sí puede cumplir la función de control natural. En el caso de este trabajo, la notoria rareza o ausencia de depredadores piscívoros de mediano tamaño puede incidir sobre la proliferación de la especie invasora, que ya es la más abundante de los peces depredadores, por encima incluso de los pequeños carnívoros que no son buscados activamente por los pescadores; esta hipótesis debe ser evaluada en futuros estudios. En términos de la composición de las especies en las formaciones arrecifales con la presencia del pez león, para un arrecife en las Bahamas entre 2003 y 2009, Lesser y Slattery (25) estudiaron cambios de fase de comunidades a profundidades mesofóticas, donde con la disminución de peces herbívoros con la presencia del pez león, pasaron a estar dominadas por algas. El estudio muestra cómo, con la presencia del invasor y su depredación, se dio una disminución de 19 especies y la consecuente reducción de peces herbívoros, planctívoros, espongívoros y los que se alimentan de pequeños crustáceos. Impacto denominado de cascada, ya sea directamente por el consumo de herbívoros o indirecto por el desplazamiento de especies. El estudio de Morris y Akins (26) menciona que la dieta del pez león es diversa alimentándose principalmente de peces pequeños, que son igualmente importantes para muchas especies de importancia comercial, como serránidos

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predominant. Also, species of the families Gobiidae, Clupeidae, and Pomacentridae that, although have little or no commercial importance, are part of the diet of Lutjanidae and Haemulidae, which are commercial families that have diminished their abundances in recent years. Muñoz et al (27) mentioned that the lionfish diet would be determined according to prey availability. In our study, although the results showed that carnivore, invertivore and herbivore species were predominant, they had low abundances. Thus, in analyzing the 20 most abundant species, planktivores and invertivores were better represented. More than half (70%) of the fish abundance in the Santa Marta region was composed of ten species. Of these, three are invertivores, four are planktivores, and three are herbivores, ingesting plankton and small invertebrate and algae; those ten species are smaller than the lionfish and, due to their abundance, could have become prey too and influenced the proliferation of the invader (28). It is clearly indicative of the overexploitation of fish resources in the Santa Marta region that the invader quickly became one of the most abundant species and the most important fish predators. Whitfield et al (29) compared the abundance of lionfish with groupers between 35-50 m deep and between 50 and 100 m in North Carolina. Lionfish was found with average abundance at 21.1 ind/ha in shallow areas and 5.2 ind/ha in deep waters, and in both depths it was observed second in abundance, after Mycteroperca phenax. Unfortunately, there is no starting point recorded in 2008 and 2009, which is when lionfish appeared in Colombian waters (6, 12). In general, no records show the Scorpaenidae family as significant in abundance or biomass in the Colombian Caribbean. Now, under lionfish presence, it was observed to be even more important than species such as C. cruentata, which was the only one observed among the twenty most abundant species and no grouper of considerable size was observed in the sampled sites that could act as a natural control for the invader. According to Munday et al (30) and Gardiner and Jones (31), some types of sustrate, such as corals and sponges, can be used as feeding sites or refuge, and these can influence fish community structure. For example, strong correlations have been found between substrate composition and reef fish with specialized diets densities (e.g. butterflyfish and angelfish) and with habitat requirements (gobies and some cardinalfish) (15). When analyzing density of fish biomass, Krajewski and Floeter (17) found

y lutjánidos. Sobre el análisis del contenido estomacal del pez león en Carolina del Norte, Muñoz et al (27) sugieren una dieta carnívora generalista conformada en 3.8% por crustáceos, cefalópodos, bivalvos y ofiuros, y el resto por 16 familias de peces, con los haemúlidos, scáridos y serránidos como los más abundantes. Para el Caribe colombiano, la dieta del pez león fue analizada preliminarmente por Muñoz-Escobar y Gil-Agudelo (28) e igualmente se le identificó como un carnívoro generalista, con la familia Serranidae como la más predominante. Además especies de las familias Gobiidae, Clupeidae y Pomacentridae que, aunque de poca o ninguna importancia comercial, son parte de la dieta de lutjánidos y haemúlidos, familias comerciales que han registrado bajas abundancias en los últimos años. Muñoz et al (27) mencionan que la dieta del pez león estaría dada de acuerdo con la disponibilidad de presas. En este estudio, aunque los resultados mostraron la predominancia de especies carnívoras, invertívoras y herbívoras, estas tuvieron bajas abundancias. Es así, como del análisis de las 20 especies más abundantes, fueron las planctívoras e invertívoras las más representativas. Diez especies sumaron más de la mitad (70%) de la abundancia de peces en la región de Santa Marta. De ellas, tres son invertívoras, cuatro son planctívoras y tres son herbívoras, ingiriendo plancton y pequeños invertebrados y algas; esas diez especies son de menor talla que el pez león y podrían haber favorecido con su abundancia la proliferación del invasor, al constituirse en sus presas principales (28). Es claramente indicativo de la situación de sobreexplotación de los recursos ícticos de la región de Santa Marta que el invasor se haya posicionado con relativa rapidez como una de las especies más abundante y la primera de los peces ictiófagos. Whitfield et al (29) compararon la abundancia del pez león con la de meros y chernas entre 35-50 m de profundidad y entre 50 y 100 m en Carolina del Norte. El pez león se encontró con una abundancia promedio de 21.1 ind/ha en las partes someras y de 5.2 ind/ha en las profundas y, a ambas profundidades, fue observado como segundo en abundancia luego de Mycteroperca phenax. Desafortunadamente, no se cuenta con un punto de partida entre 2008 o 2009, cuando se registró la aparición del pez león en aguas colombianas (6,12). En general, para el Caribe colombiano ninguno de los registros marcaba a la familia Scorpaenidae como significativa en términos de abundancia o biomasa. Ahora, con la presencia del pez león, este se observó más importante incluso que especies como C. cruentata, que fue la única observada entre las veinte más abundantes y ninguna especie de mero o cherna de tamaño considerable

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a positive correlation with coral coverage, depth and areas protected from waves, where mobile carnivores and invertivores were more influenced by unconsolidated bottoms and substrates, planktivores and omnivores by wave exposure, and herbivores by algae coverage, with the existence of general habits that suggest that the community is dominated by versatile species. Substrate components such as corals and sponges in Chengue bay, and the abiotic substrate in Morro and Remanso, were the variables that best explained fish composition. Association of lionfish to substrate was only evident in Chengue and Morro, localities where the invader was more abundant. It should be kept in mind that in tropical systems positive relationships between coral coverage and fish density and biomass have been considered as indicators of the complexity of the habitat by offering more shelter for medium-sized fish (between 10 and 40 cm LT) (17); results show that, while lionfish was more abundant in areas with greater coral coverage, sponges, or abiotic substrate, it has also occupied many other habitats. However, detailed studies need to be performed that discriminate the availability of food, fish composition by locality, and different associated substrates and ecosystems to determine the possible effects on the community. Acknowledgements To Luis Manjarrés Martínez for his support with statistical analysis. To the proposal funded by Fonciencias and the Universidad del Magdalena “Invasión del pez león Pterois volitans registro de sus abundancias, estructura de tallas y preferencia al sustrato en Santa Marta, Caribe colombiano,” and to the proposal “Invasión del pez león a los arrecifes del Caribe colombiano: biología, ecología y origen” funded by Colciencias (1361-521-28271).

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se observó para los sitios muestreados y que pudieran estar contribuyendo como un control natural del invasor. Según Munday et al (30) y Gardiner y Jones (31), algunos tipos de sustrato, como corales y esponjas, pueden ser usados como sitios de alimentación o refugio y éstos pueden influenciar la estructura de la comunidad de peces. Por ejemplo, correlaciones fuertes se han encontrado entre la composición del sustrato y la densidad de peces arrecifales con dietas especializadas (ej. mariposas y peces ángel) y con requerimientos de hábitat (gobios y algunos cardenales) (15). Al analizar la densidad y biomasa de peces, Krajewski y Floeter (17) hallaron una correlación positiva con la cobertura de coral y la profundidad y negativa con la exposición al oleaje, donde carnívoros e invertívoros móviles estuvieron más influenciados por la profundidad y el substrato no consolidado; planctívoros y omnívoros por la exposición al oleaje y los herbívoros por la cobertura algal, con la existencia de hábitos generalistas que sugieren que la comunidad es dominada por especies versátiles. Los componentes del sustrato como corales y esponjas para la bahía de Chengue y el sustrato abiótico para Morro y Remanso fueron las variables que mejor explicaron la composición de peces. Para la asociación con el pez león y el sustrato, solo fue evidente para Chengue y Morro, al ser las localidades con mayor abundancia del invasor. Si se tiene en cuenta que en sistemas tropicales, relaciones positivas entre la cobertura de coral y la densidad de peces y la biomasa han sido consideradas como indicadoras de la complejidad del hábitat al ofrecer más refugios a peces de mediano tamaño (entre 10 y 40 cm LT) (17), los resultados mostraron que, si bien el pez león fue más abundante en sitios con mayor cobertura coralina, de esponjas o sustrato abiótico, éste ha ocupado indistintamente cualquier hábitat. Sin embargo, se requieren estudios detallados que discriminen la disponibilidad de alimento, la composición íctica por localidad y los distintos sustratos y ecosistemas asociados para determinar los posibles efectos sobre la comunidad. Agradecimientos A Luis Manjarrés Martínez, por su apoyo en el análisis estadístico. Al proyecto financiado por Fonciencias y la Universidad del Magdalena “Invasión del pez león Pterois volitans registro de sus abundancias, estructura de tallas y preferencia al sustrato en Santa Marta, Caribe colombiano”, y al proyecto “Invasión del pez león a los arrecifes del Caribe colombiano: biología, ecología y origen” financiado por Colciencias (1361-521-28271).

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):5004-5013, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Antibodies against spotted fever group Rickettsia sp., in horses of the colombian Orinoquia Anticuerpos contra Rickettsia sp., del grupo de las fiebres manchadas en equinos de la Orinoquía colombiana Diego A. Riveros-Pinilla,¹* MVZ, Leidy Acevedo G,² Microbióloga, Andrés F. Londoño,2 M.Sc, Agustín Góngora O,3 Dr.Sci. Joven Investigador, Universidad de los Llanos. 2Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias, Grupo de Investigación en Ciencias Veterinarias “Centauro”, Línea de zoonosis emergentes y re-emergentes, Medellín, Colombia. 3Universidad de los Llanos, Escuela de Ciencias Animales, Villavicencio, Colombia. *Correspondence: diegoriverosmvz@ hotmail.com 1

Received: October 2014; Acepted: March 2015.

ABSTRACT Objective. It was determined the presence of antibodies against Rickettsia sp. of the spotted fever group, in horses of 8 municipalities of the Colombian Orinoquia. Matherials and methods. A cross-sectional study was conducted on 246 sera from apparently healthy horses and processed by the indirect immunofluorescence test (IFI). Results. General seropositivity was (2.85%; 7/246), while by municipalities the results were, Arauca (9.1%; 2/22), Saravena (5.6%; 1/18), San José del Guaviare (4.9%; 2/41), San Martín (3.8%; 1/26), Yopal (1.9%; 1/52). It was not identified the presence of antibodies in Puerto López (0/52), Puerto Gaitán (0/15) and Villavicencio (0/20). Four of the positive samples presented titles of 1:64, while the remaining 3 1:128. Conclusions. It shows the circulation of Rickettsia sp. of the Spotted Fever Group in horses in the region of the Colombian Orinoquia, suggesting the need for further studies to understand the ecoepidemiology of municipalities with presence of seropositive. Key words: Horses, rickettsia, serology, zoonoses. (Fuente:DeC).

RESUMEN Objetivo. Determinar la presencia de anticuerpos contra Rickettsia sp. del grupo de las fiebres manchadas, en equinos de 8 municipios de la Orinoquía Colombiana. Materiales y métodos. Se realizó un estudio transversal en 246 sueros equinos provenientes de animales aparentemente sanos y procesados por la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Resultados. La seropositividad general fue (2.85%; 7/246), por municipios la seropositividad fue Arauca (9.1%; 2/22), Saravena (5.6%; 1/18), San José del Guaviare (4.9%; 2/41), San Martín (3.8%; 1/26) y Yopal (1.9%; 1/52). No se identificó la presencia de seropositivos en Puerto López (0/52), Puerto Gaitán (0/15) y Villavicencio (0/20).Cuatro de las muestras positivas presentaron títulos de 1:64, mientras las 3 restantes de 1:128. No se encontró asociación entre los títulos serológicos con la raza, el sexo, edad y actividad zootécnica. Conclusiones. Se demuestra la circulación de Rickettsia sp. del Grupo de las Fiebres Manchadas en equinos de la región de la Orinoquía Colombiana, sugiriendo la necesidad de nuevos estudios para entender la ecoepidemiología de los municipios con presencia de reactores serológicos. Palabras clave: Caballos, rickettsia, serología, zoonosis. (Fuente:DeC). 5004

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Rickettsioses make up a group of bacterial zoonotic diseases unknown to the majority of the Colombian population. The genus Rickettsia has been classified into four groups: the typhus group (TG) which includes the Rickettsia prowazekii species that causes typhus, transmitted by lice, and Rickettsia typhi, which causes typhus or murine typhus, transmitted by fleas; the ancestral group (AG) composed of Rickettsia canadensis and Rickettsia bellii, and the transitional group (TG) which is composed of the Rickettsia australis, Rickettsia felis and Rickettsia akari species. The fourth group is known as the Spotted Fever group (SFG), where about 20 tickborne species are included (1).

Las rickettsiosis comprenden un grupo de enfermedades bacterianas, de tipo zoonótico poco conocidas por la mayoría de la población colombiana. El género Rickettsia se ha clasificado en cuatro grupos; el grupo tifo (GT) que incluye las especies Rickettsia prowazekii que causa el tifo epidémico, transmitido por piojos y Rickettsia typhi que ocasiona el tifo endémico o murino, trasmitido por pulgas; el grupo ancestral (GA) compuesto por Rickettsia canadensis y Rickettsia bellii, el grupo transicional (GTR) que se compone de las especies Rickettsia australis, Rickettsia felis y Rickettsia akari. El cuarto grupo, se conoce como grupo de las fiebres manchadas (GFM), en donde se incluyen alrededor de 20 especies que son trasmitidas por garrapatas (1).

Within the SFG, Rickettsia rickettsii is the most virulent and causes a disease, which, depending on the region, is given the name: Rocky Mountain Spotted Fever (RMSF) in North America, Brazilian Spotted Fever in Brazil, Spotted Fever in Mexico and Tobia Fever in Colombia (2). Bacteria of the Rickettsia spp. genus are intracellular microorganisms that principally infect endothelial cells in humans and cause acute febrile symptoms that can be deadly if not appropriately treated. Clinical signs produced by these bacteria are similar to those of other tropical diseases, principally from the hemorrhagic or icterohemorrhagic fever group, which in many cases inhibits a timely diagnosis (3). Diseases caused by the Rickettsia genus occur worldwide and have been recognized for many years; presently they are considered to be either emergent or re-emergent diseases and, in humans, vary in terms of severity (4). In the majority of reported cases in different countries, a common factor relating to the occurrence of the disease is poverty and environmental transformation (5). In Colombia, the name Tobia Fever comes from the name given to an outbreak that occurred between the years 1934-1936 in the village of Tobia, in the Nimaima municipality (Cundinamarca). In the outbreak, 62 of the 65 people infected (of different ages) died, which represents a 95% mortality rate (6). Following this event, the disease was not known to surface again until the 21st century, where other fatal cases appeared in Villeta, Cundinamarca in 2003 and 2004 (7), Necoclí, Antioquia in 2006 (8), Los Córdobas, Córdoba in 2007 (9) and Turbo, Antioquia in 2008 (10).

Dentro del GFM, Rickettsia rickettsii es la más virulenta y ocasiona una enfermedad que según el lugar de presentación recibe el nombre de Fiebre Manchada de las Montañas Rocosas (FMMR) en América del Norte, Fiebre Manchada Brasilera en Brasil, Fiebres Manchadas en México y Fiebre de Tobia en Colombia (2). Las bacterias del género Rickettsia spp., son microorganismos intracelulares obligados que infectan principalmente células endoteliales en los humanos y ocasionan cuadros febriles agudos que pueden ser letales sino reciben tratamiento adecuado. Los signos clínicos producidos por esta bacteria son compartidos con otras enfermedades tropicales, principalmente del grupo de las fiebres hemorrágicas o ictero-hemorrágicas, lo que en muchas ocasiones no permite realizar un diagnóstico oportuno (3). Las enfermedades ocasionadas por el género Rickettsia se presentan en todo el mundo y han sido reconocidas desde la antigüedad; en la actualidad se consideran como enfermedades emergentes o reemergentes y cursan con un grado variable de severidad en los humanos (4). En la mayoría de los casos reportados en los diferentes países, un factor común para que la enfermedad se presente, son las condiciones de pobreza de la población y la transformación ambiental (5). En Colombia, el nombre de Fiebre de Tobia obedece a la denominación que se dio a un brote ocurrido durante los años 1934-1936 en la localidad de Tobia, municipio de Nimaima (Cundinamarca). En el brote murieron 62 personas (de diferentes edades) de 65 infectadas, lo que representó una letalidad del 95% (6). A partir de este evento, no se volvió a tener conocimiento de la enfermedad hasta inicios del siglo XXI, con la presentación de

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Different epidemiological studies confirm the importance of canines and horses as sentinels to indicate the circulation of Rickettsia sp. (11,12), especially horses, since they are one of the most important hosts for Amblyomma cajennense, (ticks that are the principal vector for RMSF in Central and South America). Horses can be infected and become a serological reactor, for which they become “evidence” of the circulation of the bacteria in the site of origin (13, 14). The national program of epidemiological surveillance of febrile cases and dengue of the Ministry of Health, in samples from humans originating from Guaviare between the years 2001-2004, found the prevalence of antibodies (Ab), using R. rickettsii antigen, of (4.7%) (15). In the small town of Pachaquiaro near the municipality of Puerto López (Meta) the prevalence in humans was (59%), which was associated with the possible transmission of Rickettsia sp. by ectoparasites (16). Previous studies confirm the presence of the etiological agent in the region of Orinoquia, but at the same time show that there are very few prior studies done on this topic with domestic animals, which suggests the need for further studies in this area of knowledge. The objective of this study was to determine the presence of antibodies against SFG Rickettsia sp. in horses from the 8 municipalities of the Orinoquia region of Colombia.

MATERIALS AND METHODS Type of study and samples. A descriptive cross-sectional study was made in 246 equine sera from 8 Orinoquia municipalities. The sera were part of the inventory of a bank of sera from the Laboratory of Breeding and Animal Genetics of the University of Los Llanos. The samples had been obtained from horses that were reportedly healthy between the months of July- August in the year 2013 and were maintained at a temperature of -70°C in a deep freezer (Revco®, Asheville, NC, USA). At the time of collecting the sera, information about age, sex, breed and Zootechnical activity was also gathered. The serums came from the municipalities in Villavicencio (8.2%), Puerto López (21.1%), Puerto Gaitán (6.1%), Yopal (21.1%), San Martín (10.6%), San José del Guaviare (16.7%), Saravena (7.3%) and Arauca (9.1%) figure 1.

nuevos casos fatales en Villeta, Cundinamarca en los años 2003 y 2004 (7), Necoclí, Antioquia en 2006 (8), Los Córdobas, Córdoba en 2007 (9) y Turbo, Antioquia en 2008 (10). Diferentes estudios epidemiológicos han evidenciado la importancia de los caninos y los equinos como centinelas para el monitoreo de circulación de Rickettsia sp. (11,12). Especialmente los equinos, ya que es uno de los hospederos más importantes para Amblyomma cajennense, (garrapata que es el vector principal para FMMR en Centro y Suramérica). Los equinos pueden sufrir la infección y volverse un reactor serológico, por lo cual se convierten en “evidencia” de la circulación de la bacteria en el sitio de procedencia (13,14). El programa nacional de vigilancia epidemiológica de eventos febriles y del dengue del Ministerio de Salud, en muestras de humanos provenientes del Guaviare entre los años 2001-2004, encontró una prevalencia de anticuerpos (Ac), usando antígeno de R. rickettsii, de (4.7%) (15). En el corregimiento de Pachaquiaro cerca del Municipio de Puerto López (Meta) la prevalencia en humanos fue de (59%), la cual fue asociado con la posible transmisión de Rickettsia sp., por ectoparásitos (16). Los anteriores estudios ponen en evidencia la presencia del agente etiológico en la región de la Orinoquía, pero al mismo tiempo muestra que son pocos los estudios previos en animales domésticos que se han hecho en el tema, lo que sugiere la necesidad de realizar nuevas investigaciones en esta área del conocimiento. El objetivo de este estudio fue determinar la presencia de anticuerpos contra Rickettsia sp., del GFM en equinos provenientes de 8 municipios de la Orinoquía Colombiana.

MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio y muestras. Se realizó un estudio descriptivo, de corte transversal, en 246 sueros equinos provenientes de 8 municipios de la Orinoquía. Los sueros hacían parte del inventario del banco de sueros del Laboratorio de Reproducción y Genética Animal de la Universidad de Los Llanos. Las muestras habían sido obtenidas de equinos aparentemente sanos entre los meses de Julio-Agosto del 2013 y mantenidos a -70°C en un ultracongelador (Revco®, Asheville, NC, USA). La recolección de los sueros se acompañó con la toma de información sobre edad, sexo, raza y actividad zootécnica.

Riveros - Rickettsia sp. antibodies in horses in Colombian

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Los sueros provenían de los municipios de Villavicencio (8.2%), Puerto López (21.1%), Puerto Gaitán (6.1%), Yopal (21.1%), San Martín (10.6%), San José del Guaviare (16.7%), Saravena (7.3%) y Arauca (9,1%) figura 1.

Figura 1. M a p o f C o l o m b i a h i g h l i g h t i n g t h e Colombian Orinoquia region (Green) and the municipalities where samples were collected (Triangles).

The Indirect Immunofluorescence Assay (IFA). The IFA technique was used, in which plates of 12 testing holes sensitized with antigen from R. rickettsia Taiaçu strain were used along with positive and negative equine controls, kindly donated by Dr. Marcelo B. Labruna from the University of Sao Paulo, Saõ Paulo, Brasil. The testing holes were blocked with 20 µl of bovine serum albumin (BSA) to 1% in phosphate buffered saline (PBS), for 15 minutes. Subsequently, the BSA was removed and the testing plate was allowed to dry at room temperature. To each testing hole, 20 μl of test serum was added in a dilution of 1:64 in sample diluent (PBS with 1% BSA and 0.1% tween 20). A positive and negative equine control was included in each of the processed test plates. After incubation for 30 minutes at 37°C in a moist chamber, and four, five-minute washes in PBS and 1% Tween 20, 20 μl of conjugate were added (Anti-horse IgG A6917 – Siga, St Louis, USA), marked with fluorescein isothiocyanate (FITC), for each test hole, at a dilution of 1:400 in sample diluent, which was incubated for 30 minutes at 37°C in a moist chamber. Later, the four washes were repeated and they were mounted for reading. The seroreactivity was

Prueba de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI). Se utilizó la técnica de IFI, para lo cual se utilizaron placas de 12 pozos sensibilizadas con antígeno de R. rickettsii cepa Taiaçu y controles positivos y negativos de equinos, gentilmente donadas por el Dr. Marcelo B. Labruna de la Universidad de Sao Paulo, Saõ Paulo, Brasil. Se realizó un bloqueo de los pozos con 20 µl de albumina sérica bovina (ASB) al 1% en buffer fosfato salino (BFS), durante 15 minutos, posteriormente se retiró la ASB y se dejó secar la placa a temperatura ambiente. Se adicionó a cada pozo 20 μl del suero problema en una dilución de 1:64 en diluyente de muestra (BFS con 1% ASB y 0.1% Tween 20), se incluyó un control positivo y negativo de equino en cada una de las placas procesadas. Después de incubar durante 30 minutos a 37°C en cámara húmeda y de cuatro lavados de 5 minutos con BFS más 0.1% Tween 20, se adicionó 20 μl del conjugado (Anti-IgG equino A6917 - Sigma, St Louis, USA), marcado con Isotiocianato de Fluoresceína (FITC), por cada pozo, a una dilución de 1:400 en diluyente de muestra, que se incubó durante 30 minutos a 37°C en cámara húmeda. Posteriormente se realizaron nuevamente los 4 lavados y el montaje para la lectura. La seroreactividad se observó en un microscopio de Fluorescencia (Nikon EFD-3®, Tokio, Japan) a un aumento de 100X y una excitación de 450 a 500 nm de longitud de onda. Las muestras se diagnosticaron como positivas o negativas mediante comparación con los controles. Los sueros positivos a la dilución 1:64, fueron titulados en diluciones dobles hasta que se volvieron negativos (14). Análisis estadístico. Se realizó un análisis descriptivo para las variables de procedencia, sexo, raza, edad, actividad zootécnica y positividad a la IFI. Se exploraron posibles asociaciones entre la reactividad serológica y las variables independientes, utilizando una prueba Chi cuadrado y los resultados obtenidos, se analizaron mediante el software de Análisis Estadístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) Statistics 21.

RESULTADOS La población total de equinos estaba compuesta por 106 machos y 140 hembras. La edad promedio de los animales fue 5.2 años, con una edad mínima de 6 meses y máxima de 12

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observed under a fluorescent microscope (Nikon EFD-3®, Tokio, Japan) at a 100X magnification and a 450-500 nm excitation. The samples were identified as positive or negative by comparing them with the controls. The positive sera at a dilution 1:64 were tittered in double dilutions until they became negative (14). Statistical analysis. A descriptive analysis was made of the variables: origin, sex, breed, age, zootechnical activity and positivity to IFA. Possible associations between serological reactivity and independent variables were explored, using a Chi-square test and the obtained results, and were analyzed using the statistical analysis software SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) Statistics 21.

RESULTS The total equine population was composed of 106 males and 140 females. The average age of the animals was 5.2 years, with a minimum age of 6 months and a maximum age of 12 years. The breeds included were: the Silla Argentina (10.5%), the Cuarto de Milla (7.5%) and the Colombian Crillo (82%). Their zootechnical activity was classified as animals for breeding (12%), field work (80%) and sport (8%). The general seropositivity was (2.85%; 7/246), four of the positive sera showed titers of 1:64 and the remaining 3 titers of 1:128. Of the 7 positive sera, 5 (71.4%) were males and 2 (28.6%) were female. In terms of breed, 6 (85.7%) were Criollo and 1 (14.3%) Silla Argentina. In terms of age, there were 2 (28.6%) in the 0-3 year range, 1 (14.3%) in the 3-6 year range, 3 (42,8%) in the 6-9 year range and 1 (14.3%) in the 9-12 year range. Regarding the livestock, 6 (85.7%) corresponded to working animals and 1 (14.3%) was dedicated to breeding. No association between seropositivity and variables such as breed (p: 0.61), sex (p: 2.36), age (p: 0.87) and zootechnical activity (p: 0.65) were found.

años. Las razas incluidas fueron Silla Argentina (10.5%), Cuarto de milla (7.5%) y Criollo Colombiano (82%), la actividad zootécnica se clasificó como animales para la reproducción (12%), trabajo de campo (80%) y deporte (8%). La seropositividad general fue (2.85%; 7/246), 4 de los sueros positivos presentaron títulos de 1:64 y los 3 restantes títulos de 1:128. De los 7 sueros positivos, 5 (71.4%) correspondieron a machos y 2 (28.6%) a hembras. En cuanto a la raza 6 (85.7%) eran Criollos y 1 (14.3%) Silla Argentina. En la edad 2 (28.6%) estuvieron en el rango de 0 a 3 años, 1 (14.3%) en el rango de 3 a 6 años, 3 (42,8%) en el rango 6 a 9 años y 1 (14.3%) en el rango de 9 a 12 años. Respecto a actividad zootécnica, 6 (85.7%) correspondieron a animales de trabajo y 1 (14.3%) dedicado a la reproducción. No se encontró alguna asociación entre la seropositividad con las variables raza (p: 0.61), sexo (p: 2.36), edad (p: 0.87) y actividad zootécnica (p: 0.65). Una imagen de la prueba positiva a IFI se observa en la figura 2. La seropositividad por municipio (Figura 3) fue mayor para los municipios de Arauca (9.1%), seguido de Saravena (5.6%) y San José del Guaviare (4.9%). A.

A picture of the IFA positive test is found in figure 2. Seropositivity in relation to municipality (Figure3) was greatest in the municipalities of Arauca (9.1%), followed by Saravena (5.6%) and San José del Guaviare (4.9%).

DISCUSSION General seropositivity found in this study on SFG Rickettsia sp. (2.85%; 7/246) is low, nonetheless, it shows that horses have contact with Rickettsia genus bacteria, possibly transmitted through

Figure 2. Indirect immunofluorescence against Rickettsia sp. from the spotted fever group (A) Negative equine serum control and (B) Positive equine serum (case No 107) Dilution of 1:64.

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DISCUSIÓN

Figure 3. Seropositivity by municipality against Rickettsia sp. Of the spotted fever group by means of IIT in equine sera (n:246).

contact with Amblyomma cajennense ticks, which are its principle reservoir. The presence of these antibodies essentially corresponds to IgG, which suggests a longer infection period. It should be highlighted that the principal economic activity in all the municipalities where samples were taken is animal agriculture, which is affected, principally, at the end of the dry season (February-March) when animals have decreased immunity because of nutritional stress during this time period (17). On the other hand, the use of a single equine sample as diagnostic proof impeded ability to determine if the infection was old or new, which suggests the need for further investigations that include the use of paired tests. The absence of statistical association between serological titers and age, sex, breed and zootechnical activity agrees with Anderson (18), which could suggest that these variables do not constitute as risk factors or, the absence of association could be the result of the type of focus group and the low number of positive-testing animals. The results of this study also suggest the need for greater epidemiological surveillance in municipalities where the greatest seropositivity was found, such as Arauca (9.1%), Saravena (5.6%) and San José, Guaviare (4.9%), especially now that favorable epidemiological conditions, namely, high deforestation because of colonization and high levels of poverty, which can cause the disease to appear in humans. The seropositivity results in our study are less than those found in horses in non-endemic areas in Brazil: (the Almirante Tamandaré-Paraná municipality) (8.5%) (19), north of the state of Paraná (5.5%) (20), Londrina-Paraná (38.5%) (21) and the state of Santa Catarina (16.6%) (22). Equally, they contrast with the results obtained in endemic regions of the same country such as: (41%) in Juiz, Fora-Minas Gerais (23),

La seropositividad general encontrada en este estudio contra Rickettsia sp. del GFM (2.85%; 7/246) es baja, sin embargo, evidencia el contacto de los equinos con bacterias del género Rickettsia, mediado posiblemente por el contacto con garrapatas Amblyomma cajennense que es su principal reservorio. La presencia de estos anticuerpos corresponden esencialmente a IgG, como evidencia de una mayor respuesta en función del tiempo de infección. Es necesario resaltar que la principal actividad económica de todos los municipios de donde procedían las muestras, es la actividad pecuaria, la cual se ve afectada principalmente al final del verano (Febrero-Marzo) en donde los animales disminuyen su inmunidad por estrés nutricional durante esta época (17). De otro lado, el uso de una sola muestra en los equinos como prueba diagnóstica, impidió determinar si la infección era antigua o reciente, lo que sugiere la realización de nuevos trabajos que incluyan la utilización de muestras pareadas. La ausencia de asociación estadística de los títulos serológicos con la edad, sexo, raza y actividad zootécnica coincide con Anderson (18), lo que puede sugerir que estas variables no se constituyen en factores de riesgo o que la ausencia de asociación puede ser resultado del tipo de muestreo y el bajo número de animales positivos. Los resultados de este estudio, plantean además la necesidad de una mayor vigilancia epidemiológica en los municipios en donde se encontró la mayor seropositividad como Arauca (9.1%), Saravena (5.6%) y San José del Guaviare (4.9%), ya que presentan condiciones epidemiológicas favorables para que la enfermedad se presente en humanos, entre ellas, alta deforestación por la acción colonizadora y altos niveles de pobreza. Los resultados de la seropositividad en nuestro estudio son menores a los encontrados en equinos en áreas no endémicas en Brasil (municipalidad Almirante Tamandaré-Paraná) (8.5%) (19) Norte del Estado de Paraná (5.5%) (20), Londrina-Paraná (38.5%) (21) y el Estado de Santa Catarina (16.6%) (22). Igualmente, contrastan con los resultados obtenidos en regiones endémicas de ese mismo país como (41%) en Juiz de Fora-Minas Gerais (23), (77.3%) en el municipio de Pedreira-Sao Paulo (14) y 100% en Itabira-Minas Gerais (24). La seropositividad general (2.85%) es menor a la reportada en equinos de Villeta, Cundinamarca que fue de (16.3%) considerada una área

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(77.3%) in the municipality of Pedreira-Sao Paulo (14) and 100% in Itabira-Minas Gerais (24). General seropositivity (2.85%) is less than what was reported in horses in Villeta, Cundinamarca, which was (16.3%) considered an endemic area, where 3 species of ticks, A. cajennense, Rhipicephalus sanguineus and Dermacentor nitens, have been identified as having an impact on the transmission of Rickettsia rickettsii (25). These are the same species that have been identified in the Orinoquia region (26). “Clarifying from a public health perspective that A. cajennense is the species with the greatest potential of transmitting Rickettsia spp. to humans.” Despite the fact that our study did not include other sentinel animals for R. rickettsii such as canines (Canis lupus familiaris) and capybaras (Hydrochaeris hydrochaeris) among others (27,28), the abundant wildlife in the surveyed municipalities suggests their inclusion in future studies. Although it is made evident that horses on their own have value as sentinels, given that they are principal hosts of A. cajennense, one of the principal vectors for R. rickettsii (13), suggests that the detection of antibodies in horses would be a good indicator for determining the circulation of R. rickettsii in areas where humans can be exposed to A. cajennense. In a study in Brazil where, in addition to humans, horses and canines were sampled, a pattern was found of serological response characterized by a high frequency of positive horses, followed by dogs and a low frequency in humans (14). Contrarily, this pattern has not been reported in other studies (8). None the less, a high association between tick infestation among humans and the presence of A. cajennense in horses (29) has been displayed; such seems to be the case of high seropositivity in humans, found by Miranda et al (16). Even without the use of sentinel animals, the high frequency of seropositivity in humans, such as found in the Puerto López vicinity (59%) (16), indicates the circulation of SFG Rickettsia sp., which requires special attention from municipal and departmental health authorities of the entire Orinoquia region. Even though there have been no confirmed fatal cases in the region, possibly due to the fact it manifests similar clinical signs to other tropical diseases, the differential diagnosis of rickettsiosis should be obligatorily included in the case of undiagnosed febrile cases in the population. An additional aspect that could explain the absence

endémica, en donde además se han identificado tres especies de garrapatas A. cajennense, Rhipicephalus sanguineus y Dermacentor nitens que tienen importancia en la transmisión de Rickettsia rickettsii (25). Las mismas especies que han sido identificadas en la región de la Orinoquía (26). “Aclarando desde una perspectiva de salud pública que la A. cajennense es la especie con mayor potencial en la transmisión de Rickettsia spp. a humanos.” A pesar que nuestro estudio no incluyó otros animales centinelas para R. rickettsii como caninos (Canis lupus familiaris) y chigüiros (Hydrochaeris hydrochaeris) entre otros (27, 28), la abundante fauna silvestre en los municipios encuestados, sugiere su inclusión en nuevos estudios. Aunque se hace evidente que los equinos por si solos tienen valor como animales centinelas, dado que son los principales hospederos de A. cajennense uno de los principales vectores de R. rickettsii (13), sugiriendo que la detección de anticuerpos en los equinos serian un buen indicador para determinar la circulación de R. rickettsii en áreas en donde los humanos pueden llegar a estar expuestos a A. cajennense. En un estudio en Brasil en donde se muestrearon además de los humanos, equinos y caninos, se encontró un patrón de respuesta serológica caracterizada por una alta frecuencia de animales positivos en equinos, seguidos de los perros y una baja frecuencia en los humanos (14), contrariamente este patrón no ha sido reportado en otros estudios (8). No obstante, se ha demostrado una alta asociación entre la infestación de humanos por garrapatas, con la presencia de A. cajennense en caballos (29), tal parece ser el caso de la alta seropositividad en humanos encontrada por Miranda et al (16). Aún sin el uso de animales centinelas, la alta frecuencia de seropositividad en humanos, como la encontrada en cercanía a Puerto López, (59%) (16) señala la circulación de Rickettsia sp. del GFM, lo cual requiere una atención especial por parte de las autoridades de salud municipales y departamentales de toda la Orinoquía. Aunque en la región no se han confirmado casos letales, posiblemente por la similitud de los signos clínicos con otras enfermedades tropicales, el diagnóstico diferencial para rickettsiosis debería ser incluido de forma obligatoria ante la presencia de eventos febriles sin diagnóstico en la población. También un aspecto adicional que podría explicar la ausencia de casos letales es la circulación de diversas especies de Rickettsia spp. de menor patogenicidad y que confieren

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of fatal cases is the circulation of diverse species of Rickettsia spp. of lesser virulence and which lend cross protection against the most virulent of the SFG which is R. rickettsii. None the less, since the presence of antibodies against Rickettsia sp. from the SFG in horses were identified in this study, this information should be analyzed with care, given that it is difficult to predict that there will be cases in the near future in these municipalities. Recently, experimental studies showed that A. cajennense is scarcely efficient for maintaining R. rickettsii for successive tick generations over time (30). This possibility explains why there was not a high frequency of sporadic outbreaks over time in endemic zones. In the same way, crossreactivity between other species of Rickettsia causes overestimation of seroprevalence when a single species is studied (8). Finally, this study confirms the circulation of SFG Rickettsia sp. in the municipalities of the Orinoquia region, findings that adhere to those of Miranda et al (16) in the proximity of Puerto López and by the Ministry of Health in samples of the department of Guaviare (15), and suggests the need to maintain surveillance of possible undiagnosed febrile cases with the objective of avoiding fatalities. Without a doubt, the different ecological conditions of each municipality or each region can be a principle factor regulating the presence of bacteria and, consequentially, the presence of disease. Acknowledgements COLCIENCIAS for their financial support to this project. Dr. Juan D. Rodas and members of the emergent and re-emergent zoonoses branch of the UDEA Centauro group and Unillanos GIRGA group. To the UDEA program “201324 sustainability”. Dr. Marcelo Labruna Sao Paulo University, Brasil. Article derived from an interinstitutional cooperation agreement 0873-2012-Young researchers of Colciencias, signed by Universidad de Antioquia and Universidad de los Llanos. Conflict of interests. The authors declare that there is no conflict of interests.

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protección cruzada contra la más patógena del GFM que es R. rickettsii. No obstante, que se identificó la presencia de anticuerpos contra Rickettsia sp., del GFM en equinos en este estudio, esta información deber ser analizada con reserva, puesto que es difícil predecir que en estos municipios se vayan a presentar casos en un futuro cercano. Recientemente, estudios experimentales demostraron que A. cajennense tiene una baja eficiencia para mantener a R. rickettsii por generaciones sucesivas de garrapatas a través del tiempo (30). Esto posiblemente explique porque en zonas endémicas no se presentan con mayor frecuencia brotes esporádicos a través del tiempo. De igual forma la reactividad cruzada con otras especies de Rickettsia, hace que la seroprevalencia puede ser sobreestimada cuando se estudia una sola especie (8). Se evidencia finalmente en este estudio la circulación de Rickettsia sp. del GFM, en municipios de la Orinoquía, hallazgos que se suman a los encontrados por Miranda et al (16) en cercanía a Puerto López y por el Ministerio de Salud en muestras del departamento del Guaviare (15) y plantea la necesidad de mantener la vigilancia ante los posibles eventos febriles sin diagnóstico, con el objeto de evitar casos fatales. Sin duda las diferentes condiciones ecológicas de cada municipio o de cada región puede ser el principal factor que regule la presencia de la bacteria y consecuentemente la presencia de la enfermedad. Agradecimientos COLCIENCIAS por el apoyo financiero a este proyecto. Dr. Juan D. Rodas e integrantes de la línea de zoonosis emergentes y reemergentes del grupo Centauro de la UDEA y grupo GIRGA de Unillanos. Al programa “sostenibilidad 20132014” de la UDEA. Dr. Marcelo Labruna Universidad de Sao Paulo, Brasil. Articulo derivado del convenio de Cooperación 0873-2012-Jóvenes investigadores Colciencias modalidad interistitucional suscrito entre la Universidad de Antioquia y la Universidad de los Llanos. Conflicto de intereses. Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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Presence of gastrointestinal parasites in swine and human of four swine production farms in Cundinamarca- Colombia Presencia de parásitos gastrointestinales en cerdos y humanos de cuatro granjas porcícolas de Cundinamarca– Colombia María F Mendoza-Gómez,1 Bact, Adriana Pulido-Villamarín,1* M.Sc, Angélica Barbosa-Buitrago,2 MV, Moisés Aranda-Silva,3 M.Sc. Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, Departamento de Microbiología, Unidad de Investigaciones Agropecuarias (UNIDIA). Bogotá, Colombia. Carrera 7° N° 43-82 Edificio 52 Oficina 608, Telf 57-1-3208320 ext 4020. 2Universidad El Bosque Maestría en Ciencias Biomédicas, Práctica privada. Bogotá, Colombia. 3Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, Departamento de Matemáticas. Bogotá, Colombia. *Correspondencia: adriana.pulido@javeriana.edu.co 1

Received: February 2015; Acepted: May 2015.

ABSTRACT Objectives. Determine the presence and the type of endoparasites with zoonotic potential in swine and human of two technified and two semi-technified farms in the department of Cundinamarca, Colombia. Materials and methods. Three serial samplings of feces were taken in a pen row within intervals of 15 days, in two technified and two semi-technified farms in different age groups distributed as follows: pregnant-sows, nursing-females, boars, weaners, suckling-piglets, and growing-pig. By means of informed consent thirty-three people agreed to enter the study. Thirty-three samples from men and women of different ages were received. The pool and individual samples of fecal were evaluated by direct analysis, qualitative flotation and sedimentation techniques and modified ZiehlNeelsen stain. Results. For the porcine population, on the average, the results obtained from both technified farms showed that Balantidium coli (42%), Endolimax nana (21.9%) and Iodamoeba bütschlii (7.8%) were the most common parasites. In semi-technified farms they were: Entamoeba coli (40%), Endolimax nana (35%), Iodamoeba bütschlii (25%) and Balantidium coli (5%). By means of the test chi2 it is possible to conclude that there is a significant difference between the parasites species and the type of farm. The results obtained in human showed the presence of parasites as: E. coli (42.2%), Entamoeba hystolitica/dispar (12.1%), E. nana (9.1%), B. coli (9.1%), I. bütschlii (3.0%) and Blastocystis hominis (3.0%). Conclusions. The presence of parasites such as Balantidium coli, Endolimax nana, Iodamoeba bütschlii and Entamoeba coli in swine and human suggests a possible rotation of parasitic species between hosts. Key words: Parasites, swine, zoonoses (Source: DeSC).

RESUMEN Objetivos. Determinar la presencia y el tipo de endoparásitos con potencial zoonótico en porcinos y humanos de dos granjas tecnificadas y dos semi-tecnificadas del departamento de CundinamarcaColombia. Materiales y métodos. Se realizaron tres muestreos seriados de materia fecal con intervalos de 15 días, en dos granjas tecnificadas (92 muestras) y dos semi-tecnificadas (60 muestras) en diferentes grupos etarios distribuidos así: Hembras de cría, hembras de reemplazo, reproductores, lechones, pre-cebo y ceba. Se recibieron 33 muestras de hombres y mujeres de diferentes edades, 5014

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que mediante consentimiento informado asintieron participar en el estudio. Las muestras de materia fecal colectivas e individuales (de humanos y de cerdos) fueron evaluadas mediante: Análisis directo, técnica de flotación cualitativa, técnica de sedimentación cualitativa y tinción de Ziehl-Neelsen modificado. Resultados. En promedio para la población porcina, los resultados obtenidos de las dos granjas tecnificadas mostraron que los parásitos en común son Balantidium coli (42%), Endolimax nana (21.9%) y Iodamoeba bütschlii (7.8%). En las dos granjas semi-tecnificadas: Entamoeba coli (40%), Endolimax nana (35%), Iodamoeba bütschlii (25%) y Balantidium coli (5%). Por medio de la prueba Chi2 se puede concluir que hay una diferencia significativa entre la especie de parásitos y el tipo de granja. Los resultados obtenidos en humanos mostraron la presencia de parásitos como: E. coli (42.2%), Entamoeba hystolitica/dispar (12.1%), E. nana (9.1%), B. coli (9.1%), I. bütschlii (3.0%) y Blastocystis hominis (3.0%). Conclusiones. La presencia de parásitos como Balantidium coli, Endolimax nana, Iodamoeba bütschlii y Entamoeba coli en cerdos y humanos sugiere una posible rotación de especies parásitas entre los hospedadores. Palabras clave: Parásitos, porcinos, zoonosis (Fuente: DeSC).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

In Colombia, during the year 2013 the porcine production was 670.612 animals, to which Cundinamarca contributed 4.98% (1); 1.458.179 pigs were slaughtered for human consumption between January and June of 2013, Cundinamarca contributed 20.1% (650.035 pigs)(1).

En Colombia, durante el año 2013 la producción porcina fue de 670.612 animales, de los cuales Cundinamarca contribuyó con el 4.98% (1); se sacrificaron 1’458.179 cerdos para el consumo humano entre enero y junio de 2013 y Cundinamarca contribuyó con el 20.1% (650.035 cerdos) (1).

This type of animal production is affected by the presence of parasites that limit the productive potential of the animals, thus affecting the average daily weight gain, causing heterogeneous lots as well as facilitating weight decrease during weaning, which seems reflected in the alteration of the food conversion indexes and further represents an increase in the time required before slaughter (2). It is important to note the rate of prevalence and the economic importance of the parasites changes depending on the management system, the housing characteristics, the hygienic-sanitary measures, the geographic location and the age of the pig. Thus, all these variables influence the basic requirements of every stage of the parasitic cycle, in both the mechanisms of transmission and the immune response of the host (3). The parasites that have a major impact on health and porcine production are protozoan parasites such as Eimeria spp., Isospora spp. and Balantidium spp.; worm infections reported were primarily nematodes (such as Trichinella spp., Strongylus spp., Ascaris spp., Trichuris spp., Oesophagostomum spp. and Metastrongylus spp.) secondarily trematodes (such as Fasciola spp. and Dicrocoelium spp.) and finally cestodes (such as Echinococcus spp. and Taenia solium) (4,5). Many of these pathogens affect porcine production and can be transmitted to humans, and are recognized as zoonotic agents (6) among these we can find Balantidium coli, Toxoplasma gondii, Cryptosporidium spp. and Taenia solium (7).

Este tipo de producción animal se ve afectada por la presencia de parásitos que limitan el potencial productivo de los animales, lo que disminuye la ganancia media diaria de peso, provoca lotes heterogéneos y facilita la disminución de peso durante el destete, lo que se refleja en la alteración de los índices de conversión alimentaria; además, representa un aumento en el tiempo necesario antes del sacrificio (2). Es importante resaltar que la tasa de prevalencia y la implicación económica de las parasitosis, varía notablemente y dependen del sistema de manejo, de las características del alojamiento, de las medidas higiénico-sanitarias, la localización geográfica de la explotación y la edad del cerdo; influyendo todas estas variables en los requerimientos básicos de todos los estadios del ciclo parasitario, en los mecanismos de transmisión y en la respuesta inmune del hospedero (3). Los parásitos que tienen mayor impacto sobre la salud y la producción porcícola son protozoos como Eimeria spp., Isospora spp. y Balantidium spp.; en cuanto a los helmintos se reportan principalmente nemátodos (Trichinella spp., Strongylus spp., Ascaris spp., Trichuris spp., Oesophagostomum spp., y Metastrongylus spp.), en segundo lugar tremátodos (Fasciola spp., y Dicrocoelium spp.) y finalmente céstodos (Echinococcus spp., y Taenia solium) (4,5). Muchos de los patógenos que afectan la producción porcina pueden ser transmitidos al ser humano, por lo que son reconocidos como agentes zoonóticos (6) entre los que se

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In Colombia, few epidemiological studies have been made in the matter, which is why not much information is known about the prevalence of porcine parasites. Therefore, it is of vital importance to conduct studies on the topic in order to know which are really parasites of zoonotic importance in this country. Thus the goal of this study was to determine the presence of gastrointestinal parasites (GIP) in swine and human who could be involved with zoonoses at four swine farms in the department of Cundinamarca - Colombia.

MATERIALS AND METHODS Farm’s Location. Two technified swine farms (T) (≥ 200 females) and two semi-technified farms (ST) (≤ 200 females) with a complete cycle of production with an all in/all out system (AI-AO), were chosen in the following locations

encuentra Balantidium coli, Toxoplasma gondii, Cryptosporidium spp. y Taenia solium (7). En Colombia, se han realizado pocos estudios epidemiológicos sobre este tema y debido a esto no se conoce con certeza cuál es la prevalencia de los parásitos porcinos. Por lo tanto, es importante realizar estudios al respecto con el fin de conocer cuáles son los parásitos de importancia zoonótica en este país. De esta manera la meta del presente estudio fue determinar la presencia de parásitos gastrointestinales (PGI) en porcinos y humanos que podrían estar involucrados zoonóticamente en las cuatro granjas porcinas en el departamento de Cundinamarca – Colombia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Farm 1 (T1): Located at a height of 1.728 (m.a.s.l.), with an average temperature of 20°C (8) and a population of 3654 pigs.

Localización de las granjas. Se analizaron dos granjas porcícolas tecnificadas (T) (≥ 200 hembras) y dos granjas semi-tecnificadas (ST) (≤ 200 hembras) con ciclo completo de producción con sistema todo dentro-todo fuera (TD-TF), ubicadas así:

Farm 2 (T2): Located at a height of 2.586 (m.a.s.l.), with an average temperature of 14°C (8) and a population of 2156 pigs.

Granja 1 (T1): Localizada a una altura de 1.728 (m.s.n.m.) con una temperatura promedio de 20°C (8) y una población de 3.654 cerdos.

Farm 3 (ST1): Located at a height of 1.867 (m.a.s.l.), with an average temperature of 20°C (9) and a population of 244 pigs.

Granja 2 (T2): Localizada a una altura de 2.586 (m.s.n.m.) con una temperatura promedio de 14°C (8) y una población de 2.156 cerdos.

Farm 4 (ST2): Located at a height of 1.384 (m.a.s.l.), with an average temperature of 20°C (9) and a population of 125 pigs.

Granja 3 (ST1): Localizada a una altura de 1.867 (m.s.n.m.) con una temperatura promedio de 20°C (9) y una población de 244 cerdos.

Sample size. Bearing in mind that the total population was less than a 100.000 (finite population), the following formula was used to calculate the sampling size (Table 1).

Granja 4 (ST2): Localizada a una altura de 1.384 (m.s.n.m.) con una temperatura promedio de 20°C (9) y una población de 125 cerdos. Tamaño de la muestra. Teniendo en cuenta que la población total era menor de 100.000 (población finita), se utilizó la siguiente fórmula para calcular el tamaño de la muestra (Tabla 1).

Where:

Table1. Amount of samples obtained per age group in the swine farms in Cundinamarca. Age Group Pregnant sows Nursing females Boars Weaners Suckling piglets Growing-pig Total

Technified Farms Semi-technified farms T1 T2 Total ST1 ST2 Total 7 12 19 6 11 17 1 1 2 4 3 7 1 1 2 1 2 3 6 14 20 1 4 5 16 8 24 3 13 16 10 15 25 5 7 12 41 51 92 20 40 60

Donde: Z: Nivel de certeza P: Proporción estimada de acuerdo con la hipótesis a analizar (55% prevalencia promedio reportada) (10-12) q: 1-p N: Número total de individuos E: Error definido para este cálculo (10%)

Mendoza-Gómez - Presence of gastrointestinal parasites in swine and human

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Z: Level of certainty p: Estimator of the proportion according to the hypothesis to be analyzed (55% average prevalence reported) (10-12) q: 1-p N: Total number of individuals or units in the study E: Error component for this calculation (10%).

Recolección de las muestras. Se obtuvieron muestras colectivas e individuales (Figura 1) de acuerdo con las fases del ciclo productivo de la siguiente manera:

Sample collection. Collective and individual samples (Figure 1) were obtained according to the phases of the productive cycle as follows:

Grupo 2 Muestras colectivas: Lechones destetados, lechones lactantes, cerdos de levante.

Group 1 Individual Samples: Pregnant sows, Nursing Females, boars. Group 2 Collective Samples: Suckling Piglets, Growing-pig.

Weaners,

Three samples were taken within an interval of 15 days each. The farm workers and some of their relatives gave us a stool sample; 18 samples were received (12 men, 4 women and 2 children) from the technified farms, and 15 samples (7 men, 5 women and 3 children) from the semitechnified farms. Ethical aspects. The animal management of the and the samples were taken according with Colombian laws (Decree 2257 of 1986, Article 49 and Resolution 8430 of 1993

Grupo 1 Muestras individuales: Hembras gestantes, hembras lactantes y reproductoras.

Se realizaron tres muestreos con un intervalo de 15 días cada uno. Los trabajadores de las granjas y algunos de sus familiares asintieron al respectivo consentimiento informado, proporcionando una muestra de materia fecal cada uno; se recibieron 18 muestras (12 de hombres, 4 de mujeres y 2 de niños) de las granjas tecnificadas, y 15 muestras (7 de hombres, 5 de mujeres y 3 de niños) de las granjas semitecnificadas. Aspectos éticos. El manejo de los animales y la obtención de las muestras fueron realizadas de acuerdo con las leyes colombianas (Decreto 2257 de 1986, artículo 49 y Resolución 8430 de 1993, Título IV: Investigación sobre bioseguridad, Capítulo I Respecto a la investigación con microorganismos patógenos o con material biológico que pueda contenerlos, de conformidad con las actividades relacionadas con la investigación, la prevención y el control de la zoonosis).

Figure 1. A. Individual sample gathering – Manual stimulation of the rectum B. Collective Sample gathering.

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TITLE IV: Regarding Research bio-safety, CHAPTER I Regarding research with pathogenic microorganisms or biological material that may contain them concerning research activities related to investigation, prevention and control of zoonosis). Everyone that entered the study signed an informed consent form as established in Decree 3380 of 1981 Article 10 of Law 23 of 1981 wherein medical ethic laws are established. Sample processing Macroscopic and microscopic approach. Macroscopic aspects such as color, consistency, presence of mucus, blood and/or parasites/ fragments were evaluated. A direct examination was conducted in saline and lugol solution, under 10x and 40x magnification; the report of the results obtained was made using a semi quantitative scale with crosses, as follows: One cross (+) if 1 to 3 parasites per field are present. Two crosses (++) if 4 to 7 parasites per field are present. Three crosses (+++) if 8 to 10 parasites per field are present. Four crosses (++++) if more than 10 parasites per field are present. (13,14) Semi quantitative concentration method based on flotation. 2 g of fecal matter were deposited in a wide flask with a saturated solution of sodium chloride and glucose, the procedure was made according to what is established in the guide RVC/FAO (15). A direct examination was conducted in the microscope, under 10x and 40x magnification; the report of the results obtained was made using a semi quantitative scale with crosses as previous described (13, 14). Semi quantitative concentration method based on sedimentation. 2 g of fecal matter were homogenized in water; the procedure was made according to what is established in the guide RVC/ FAO (15), finally with the aid of a pipette Pasteur the sediment was taken and a drop of it was placed in a microscope slide, using magnification 10x and 40x; the report of the results obtained was made using a semi quantitative scale (13,14). Ziehl-Neelsen modified method. From the sediment taken, a smear study was made on a slide as follows: first by adding carbol fuchsin for 5 min and then washed with abundant water, later acid alcohol was added up to the complete discoloration for not more than 3 minutes, then

Todas las personas que participaron en el estudio firmaron un consentimiento informado según lo establecido en el Decreto 3380 de 1981, artículo 10 y la Ley 23 de 1981, en donde se establecen las leyes de ética médica. Procesamiento de las muestras Evaluación macroscópica y microscópica Se evaluaron aspectos macroscópicos tales como color, consistencia, presencia de mocusidad, sangre o fragmentos de parásitos. Se realizó un examen directo en solución salina y lugol, con aumentos de 10x y 40x; el reporte de los resultados se efectuó utilizando una escala semicuantitativa con cruces, tal como se muestra a continuación: Una cruz (+) si están presentes de 1 a 3 parásitos por campo. Dos cruces (++) si están presentes de 4 a 7 parásitos por campo. Tres cruces (+++) si están presentes de 8 a 10 parásitos por campo. Cuatro cruces (++++) si están presentes más de 10 parásitos por campo. (13,14) Método semi-cuantitativo de concentración por flotación. Se depositaron 2 g de materia fecal en un frasco de boca ancha con una solución saturada de cloruro de sodio y glucosa; el procedimiento se realizó de acuerdo con lo establecido en la guía RVC / FAO (15). Se hizo observación microscópica bajo aumentos de 10x y 40x; el informe de los resultados se realizó utilizando una escala semicuantitativa por cruces tal como se describió anteriormente (13,14). Método de concentración semicuantitativa por sedimentación. Se homogenizaron en agua 2 g de materia fecal; el procedimiento se realizó de acuerdo con lo establecido en la guía RVC/FAO (15); finalmente con la ayuda de una pipeta Pasteur se tomó el sedimento y se colocó una gota en una lámina portaobjetos con solución salina y lugol para observar al microscopio bajo el objetivo de 10X y 40X, el informe de los resultados obtenidos se hizo utilizando una escala semicuantitativa (13,14). Método de Ziehl-Neelsen modificado. A partir del sedimento, se realizó un extendido sobre una lámina portaobjeto, después se adicionó fucsina fenicada por 5 min y se lavó con abundante agua, posteriormente se adicionó alcohol-ácido hasta decoloración completa por un tiempo no superior a 3 minutos, luego se aplicó azul de metileno por 2 min, finalmente se lavó con abundante agua. Las

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methylene blue was applied by 2 min, finally the sample was washed with abundant water. The samples were analyzed under light microscopy using magnifications 40x and 100x (16). Statistical analysis. To determine the relationship between the parasites species Vs. the production system and the age groups, the statistical test Chi2 was applied, additionally the portion of parasites was determined by the test of proportion hypothesis. The data analysis obtained in the human samples was done by the presence or absence of parasites.

preparaciones fueron analizadas bajo microscopía de luz en 40x y 100x (16). Análisis estadístico. Para determinar la relación existente entre especie parásita vs sistema de producción y grupos etarios se realizó la prueba estadística Chi2, adicionalmente se determinó la proporción de parásitos en las granjas tecnificadas y semi- tecnificadas, esto se realizó por medio de la prueba de hipótesis con proporciones. El análisis de los datos obtenidos en las muestras humanas, se realizó por presencia o ausencia de parásitos.

RESULTADOS

RESULTS Porcine population. In the farm T1 a high presence of Balantidium coli 36.6% was found, followed by Ascaris suum 29.2%, Endolimax nana 15.2%, Giardia spp. 12.1% and by a low prevalence of Iodamoeba bütschlii 7.5% and Trichuris suis 4.8%.On the other hand in farm T2 a high presence of B. coli 48.5% and E. nana 26.4% was found, followed by a low presence of I. bütschlii 8.2% and Strongyloides spp. 5.8%. (Table 2) Fort the semi-technified farms, in ST1 a high presence of I. bütschlii 57.1%, B. coli 33.3%, E. nana 14.2% was found, followed by a low presence of Cryptosporidium spp. 5% and E. coli 4.7%. Finally in farm ST2 the parasites with a high presence were: E. coli 40%, E. nana 35%, I. bütschlii 25%, Isospora spp. 25%, Eimeria spp. 20% and a low presence of B. coli 5%. (Table 3)

Población porcina. En la granja T1 se encontró alta presencia de Balantidium coli 36.6%, seguida por Ascaris suum 29.2%, Endolimax nana 15.2%, Giardia spp. 12.1% y baja prevalencia de Iodamoeba bütschlii 7.5% y Trichuris suis 4.8%. Mientras, en la granja T2 se encontró alta presencia de B. coli 48.5% y E. nana 26.4%, seguido por una baja presencia de I. bütschlii 8.2% y Strongyloides spp. 5.8%. (Tabla 2) Para las granjas semi-tecnificadas, en ST1 se encontró alta presencia de I. bütschlii 57.1%, B. coli 33.3%, E. nana 14.2%, seguido por una baja presencia de Cryptosporidium spp. 5% y E. coli 4.7%. Finalmente en la granja ST2 los parásitos con alta presencia fueron E. coli 40%, E. nana 35%, I. bütschlii 25%, Isospora spp. 25%, Eimeria spp. 20% y con baja presencia B. coli 5%. (Tabla 3)

Table 2. Presence of gastrointestinal parasites per age group in technified swine farms by percentage.

Farm T1

Pregnant sows Nursing Females

% n

Weaners Suckling Piglets Growing-pig Boars

Farm T2 % n

Pregnant sows Nursing Females Weaners Suckling Piglets Growing-pig Boars

B. coli

E. nana

I. bütschlii

A. suum

T. suis

Giardia spp.

37.5

3 100

3 0

2 100

4 100

0 0

0 100

1 66.6

0 0

1 0

1 33.3

0 0

1 16.6

4 56.25

0 18.7

0 0

2 31.2

0 12.5

2 12.5

9 0

3 20

0 0

5 0

2 0

1 10

0 0

2 0

0 0

1 0

0 30.8

0 0

0 15.3

0 0

4 100

0 0

2 100

0 0

1 14.2

0 7.1

1 0

0 0

2 50

1 25

0 12.5

0 0

2 40

2 0

1 13.3

0 0

6 100

0 100

2 0

0 0

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Table 3. Presence of gastrointestinal parasites per age group in semi-technified swine farms by percentage. B. coli E. nana I. bütschlii Farm ST1 % n

Pregnant sows Nursing Females Weaners Suckling Piglets Growing-pig Boars

Farm ST2

Pregnant sows

% n

Weaners Suckling Piglets Growing-pig Boars

Isospora spp.

Eimeria spp.

Entamoeba coli

Cryptosporidium spp.

33.3

66.6

2 50

2 0

4 50

0 0

0 25

2 0

0 0

2 100

0 0

1 0

0 33.3

1 33.3

0 0

0 66.6

1 0

1 40

0 0

2 0

0 0

2 0

0 0

36.3

27.2

54.5

1 0

4 33.3

3 33.3

3 0

1 16.6

6 33.3

0 0

0 7.6

2 30.7

2 23

0 30.7

1 23

2 38.4

0 0

1 0

4 25

3 12.5

4 12.5

3 37.5

5 37.5

0 0

2 100

1 50

1 100

3 0

0 0

Human samples. The parasites observed in the workers of both technified farms were: In farm T1 E. coli 25%, B. coli 25% and E. nana 25% was found. In farm T2 a presence of parasites such as E. coli 35.7% and E. nana by a 7.1% were evident.

Muestras humanas. Los parásitos observados en los trabajadores de las dos granjas tecnificadas fueron: En la granja T1 se encontraron E. coli 25%, B. coli 25% and E. nana 25%. En la granja T2 fue evidente la presencia de parásitos como E. coli 35.7% and E. nana en un 7.1%.

In the samples gathered from humans in both semi-technified farms the following parasites were found: E. coli, B. coli, I. bütschlii, Blastocystis hominis y Entamoeba hystolitica/ dispar. In the farm ST1 a presence of E. coli 60%, E. hystolitica/ dispar 40%, B. coli 10% and B. hominis 10% was observed. In the farm ST2 E. coli 40% and I. bütschlii 20%.

En los muestreos realizados a los humanos de las dos granjas semi-tecnificadas, fueron encontrados los siguientes parásitos: En la granja ST1 E. coli 60%, E. hystolitica/dispar 40%, B. coli 10% y B. hominis 10%. En la granja ST2 E. coli 40% e I. bütschlii 20%.

DISCUSSION

Comparativamente, los estudios realizados en Asia (China y Turquía) reportaron una prevalencia promedio de B. coli 24.4%, coccidias 24%, Cryptosporidium spp. 8.82%, Ascaris spp. 3.14%, T. suis 5.2% y Giardia spp. 3.78% (12,17) mientras en Europa (Alemania) la presencia de Oesophagostomum spp., A. suum, T. suis y Eimeria spp., fue del 79%, 7%, 8% y 29% respectivamente (11). En América Latina, países como Cuba (18) y Perú (19) reportaron un porcentaje promedio de Coccidiosis 41.7%, Oesophagostomum spp. 14.9%, T. suis 14.7%, A. suum 6.7% y Strongyloides spp. 5.5%.

Comparatively, studies made in Asia (China and Turkey) report and average prevalence of B. coli 24.4%, coccidian 24%, Cryptosporidium spp. 8.82%, Ascaris spp. 3.14%, T. suis 5.2% y Giardia spp. 3.78% (12, 17) while in Europe (Germany) a presence of Oesophagostomum spp., A. suum, T. suis and Eimeria spp. in 79%, 7%, 8% y 29% each (11). In Latin America, in countries such as Cuba (18) and Perú (19) an average percentage of Coccidiosis 41.7%, Oesophagostomum spp., 14.9%, T. suis 14.7%, A. suum 6.7% and Strongyloides spp., 5.5% were reported. In Colombia only a few epidemiological studies about this topic have been made, thus for this reason the data about the prevalence of swine parasites is yet unknown. The results obtained

DISCUSIÓN

En Colombia, se han realizado pocos estudios epidemiológicos sobre este tema y por esta razón aún se desconocen los datos acerca de la prevalencia de los parásitos porcinos. Los resultados obtenidos en el presente estudio coinciden con lo reportado a nivel internacional respecto a la

Mendoza-Gómez - Presence of gastrointestinal parasites in swine and human.

in this study vs other studies related with to the presence of parasites such as B. coli, A. suum, T. suis, Giardia spp., Strongyloides spp., Eimeria spp. and Cryptosporidium spp., match it; whereas differs in the findings of Oesophagostomum spp., because the last one was not found in the present study.

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presencia de parásitos como B. coli, A. suum, T. suis, Giardia spp., Strongyloides spp., Eimeria spp., y Cryptosporidium spp., sin embargo, estos datos difieren en el hallazgo de Oesophagostomum spp., parásito no detectado en el presente estudio.

Only few studies refer to these type of gastrointestinal parasites found by age group in swine production; nevertheless, a study made in Cuba reported B. coli in weaners 21%, suckling piglets 20%, growing-pig 30%, females 16% and boars 3%; A. suum in Weaners 12%, suckling piglets 6%, growing-pig, females and boars 0%; T. suis suckling piglets 4%, weaners, growingpig, females and boars 0%; Strongyloides spp. in weaners 31%, suckling piglets 0%, growingpig 4%, females 5% and boars 1%; this study determined that the young pigs are more susceptible to parasite infections than adult pigs (20), as it was shown in the current study where young pigs showed a higher presence of some parasites. (Table 2, Table 3).

Pocos estudios hacen referencia al tipo de parásitos gastrointestinales encontrados por grupo etario en cerdos de producción; sin embargo, un estudio realizado en Cuba reportó B. coli en lechones destetados 21%, lechones lactantes 20%, cerdos de levante 30%, hembras 16% y reproductores 3%; A. suum en lechones destetados 12%, lechones lactantes 6%, cerdos de levante, hembras y reproductores 0%; T. suis en lechones lactantes 4%, lechones destetados, cerdos en levante, hembras y reproductores 0%; Strongyloides spp. en lechones destetados 31%, lechones lactantes 0%, cerdos de levante 4%, hembras 5% y reproductores 1%; este estudio determinó que los cerdos jóvenes son más susceptibles a las infecciones parasitarias que los adultos (20), como se demostró en el presente estudio, donde los cerdos jóvenes mostraron mayor presencia de algunos parásitos. (Tabla 2, Tabla 3).

According to the data obtained and analyzed by means of the statistical Chi2 test, this study proves the existent relationship between the presence of parasites and the type of farm analyzed (semi-technified and technified farms) with a value of p<0.001 indicating a higher presence of parasites in the semi-technified farms; simultaneously it shows an existent relationship between the presence of parasites and the age group involved with a value of p<0.001. Additionally, when the test of proportion hypothesis was done it was able to determine that B. coli, was found in a higher proportion in technified farms than in semi-technfied farms with a value of p<0.001. E. nana and I. bütschlii were found in a higher proportion in the semi techn farms than techn ones with a value of p<0.01 and p<0.001 respectively.

De acuerdo con la información obtenida y analizada por medio del test estadístico Chi2, este estudio demuestra la relación existente entre la presencia de parásitos y el tipo de granja analizada (granjas semitecnificadas y tecnificadas) con un valor p<0.001 indicando una mayor presencia de parásitos en las granjas semi-tecnificadas; simultáneamente es evidente la relación existente entre la presencia de parásitos y los grupo por edades como lo indica el valor p<0.001. Adicionalmente, cuando se realizó el test de hipótesis para la proporción, se pudo determinar que B. coli se encontraba en mayor proporción en las granjas tecnificadas que en las granjas semi-tecnificadas con un valor p<0.001. E. nana e I. bütschlii se encontraron en mayor proporción en las granjas semi-tecnificadas que en las tecnificadas con un valor p<0.01 y p<0.001 respectivamente.

It is important to acknowledge that the higher prevalence of parasites is found in the nursing females, pregnant sows, weaners and suckling piglets in technified as in semi-technified farms as well, this higher presence in these age groups is possibly given due to the physiological conditions in which the animals are living; in the females, the stress conditions and well as the immune suppression physiological process they deal during their pregnancy period, making them more susceptible to infections by diverse parasites, thus constituting the main source of infection for the weaners (4) additionally, studies have proved that the age of the weaners is a critical factor in parasite infections, due to the high sensibility of piglets to infections by their immune immaturity in their first

Es importante reconocer que la mayor prevalencia de parásitos se detectó en las hembras lactantes, las hembras gestantes y en los lechones lactantes y destetados, tanto en las granjas tecnificadas como en las semi-tecnificadas; esta mayor presencia en los grupos de edad se debe, posiblemente, a las condiciones fisiológicas en las que viven los animales; en las hembras, las condiciones de estrés así como el proceso fisiológico de inmunosupresión que afrontan durante su período de preñez, las hacen más susceptibles a las infecciones por diversos parásitos; constituyendose estas en la principal fuente de infección de los lechones destetados (4); adicionalmente, estudios han demostrado que la edad de los lechones destetados es un factor crítico en las infecciones parasitarias

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three days of life, whereas they achieve a high immunity against infections by their 2 week, (4). As a opposing argument to the report of the current study in, the suckling piglets with an average of 5 weeks of life, were found with a higher prevalence of parasites in both types of farms, a 50% in technified farms and a 81.3% in semi-technified farms. It has been proven that the prevalence of parasites varies depending on the management, location, weather and deworming processes implemented in each one of the farms. (21) One of the reasons why it is believed that the presence of parasites varies from one farm to another is the weather conditions; this data is relevant for the association of certain parasite species, as the samples in both technified farms were done during the months of August and September in 2012, and according to the report by the hydrology, meteorology and environmental studies institute (IDEAM) (9), the Cundinamarca zone showed pluviosity excess (8). This could be related to the absence of some parasites that are reported in literature and were not found in the current study, such as, Oesophagostomum spp., that reports an optimum temperature for its development of 25°C, (10) whereas for Eimeria spp. and Cryptosporidium spp. a temperature between 21 y 22°C is reported and optimal dry conditions for its development and latter infection (21). Thus, the above might be one of the reasons by which these parasites were not found in farms T1 and T2, due to the temperatures and pluviosity in both locations during the months of the study, and so not helping the infection of these parasites. On the contrary, in the semi-technified farms the presence of Eimeria spp., Isospora spp. and Cryptosporidium spp. were evident and the presence Oesophagostomum spp. was not found, thus this might be related to the weather conditions during the months of April and May of 2013, during which the samples were taken and had a dry weather as reported by IDEAM. (9) Another important condition related to the prevalence of parasites are the hygienic and sanitary conditions managed by each farm, as it can be clearly seen in the semi-technified farm ST2, were the water used for animal consumption came from a natural source without any type of treatment due to the owner of the farm who considers that the water is completely pure and so it does not need any treatment whatsoever, and thus this might be related to the high prevalence and variety of parasites found there.

debido a su alta sensibilidad a las infecciones por su inmadurez inmunológicas durante sus tres primeros días de vida, mientras logran una alta inmunidad contra las infecciones a las dos semanas (4). En contraposición con lo reportado, en el presente estudio los cerdos de pre-cebo que tienen en promedio 5 semanas de vida, se encontraron con una mayor prevalencia de parásitos en los dos tipos de granjas, con un 50% en granjas tecnificadas y un 81.3% en granjas semi-tecnificadas. Se ha demostrado que la prevalencia de los parásitos varía dependiendo del manejo, localización, clima y procesos de desparasitación implementados en las granjas (21). Una de las razones por las que se cree que la presencia de parásitos varía de una granja a otra son las condiciones climáticas; esta información es relevante para la asociación de ciertas especies parasitarias, debido a que las muestras de las dos granjas tecnificadas se obtuvieron durante los meses de agosto y septiembre de 2012, cuando la zona de Cundinamarca mostraba una pluviosidad excesiva (8) de acuerdo con el informe del Instituto de Estudios Hidrológicos, Meteorológicos y Ambientales (IDEAM) (9). Esto podría estar relacionado con la ausencia de algunos parásitos que se reportan en la literatura y no se encontraron en el estudio actual, como es el caso del Oesophagostomum spp., que se reporta en una temperatura óptima de 25°C para su desarrollo, (10) mientras Eimeria spp., y Cryptosporidium spp., en una temperatura entre 21 y 22°C y condiciones secas óptimas para su desarrollo y posterior infección (21). Así pues, lo anterior podría ser una de las razones por la que estos parásitos no se encontraron en las granjas T1 y T2, debido a que la temperatura y la pluviosidad en ambos lugares durante los meses del estudio no favorecen a la infección con estos parásitos. Por el contrario, en las granjas semi-tecnificadas la presencia de Eimeria spp., Isospora spp. y Cryptosporidium spp. fue evidente y no se encontró Oesophagostomum spp., lo que podría estar relacionado con las condiciones climáticas durante los meses de abril y mayo de 2013, período durante el cual se tomaron las muestras y presentaba tiempo seco según lo informado por el IDEAM. (9) Otra condición importante en cuanto a la prevalencia de parásitos son las condiciones higiénico sanitarias que se manejan en cada granja, lo que puede ser evidenciado claramente en la granja semitecnificada ST2 en donde el agua utilizada para el consumo de los animales proviene de una fuente natural sin que posiblemente tenga alguna clase de tratamiento debido a que el propietario considera que el agua es totalmente pura y no necesita tratamiento alguno, lo que puede estar relacionado con la alta prevalencia y variedad de parásitos encontrados en esta granja.

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In the present study I. bütschlii was found, and it is reported in literature as an intestinal non pathogen amoeba in humans, apes and swine; even though it was described as the most common intestinal amoeba in swine (22) its presence has not been reported in this host; only one study made in twelve boar intestines in Iran during 2004 showed a prevalence of 17% of I. bütschlii (7).

En el presente estudio se encontró I. bütschlii que es reportada como una ameba intestinal no patógena en los humanos, los monos y los cerdos; aunque fue descrita como la ameba intestinal más común de los cerdos no se ha reportado su presencia en este hospedero; solamente un estudio realizado en 12 intestinos de jabalíes examinados en Irán en el año 2004 se encontró una prevalencia del 17% para I. bütschlii (7).

It is of relevance to acknowledge, the presence of Cryptosporidium spp. in a semi-technified farm in a very low proportion (1+) in three different age groups; the infections by this agent have a higher frequency rate in early stages as weaners and suckling piglets, whereas in adults is slightly probable; the absence of this specie in the other farms might be due to the preventive measures taken such as a pretreatment with coccidiostatics in early stages. On the contrary to the report of the literature in the current study there was evidence of the presence of Cryptosporidium spp., in suckling piglets and females stages (23).

Es importante reconocer la presencia de Cryptosporidium spp. en una granja semitecnificada en una proporción muy baja (1+) en tres diferentes grupos de edad; las infecciones por este agente tienen mayor índice de frecuencia en etapas tempranas como lechones destetados y lactantes, mientras en los adultos es poco probable; la ausencia de esta especie en las otras granjas se podría deber a las medidas preventivas adoptadas, tales como el tratamiento previo con coccidiostáticos en las primeras etapas. Al contrario de lo reportado en la literatura, en el presente estudio se evidenció de la presencia de Cryptosporidium spp., en etapas de pre-cebo y en hembras (23).

The consistency of the fecal matter samples analyzed from humans in its majority was very soft but not watery. According to the results found in the sampling procedure done to some of the workers of both technified and semi-technified farms, a possible zoonotic process might be correlated with B. coli were the pigs the reservoir of the parasite and the main source of infection for the human (24). The presence of this parasite in humans is conditioned to bad health conditions, lack of basic utilities (water, sinks) and the breeding of the swine in open fields (10), this last aspect was not prevalent in the current study, due to the breeding swine in barns; nevertheless, the conditions and sanitary-hygienic habits of the humans are possibly the highest risk factors in the zoonotic processes.

La consistencia de las muestras de materia fecal analizadas procedentes de humanos en su mayoría fueron muy blandas sin llegar a ser acuosas. De acuerdo con los resultados obtenidos en los trabajadores de las granjas tecnificadas y semitecnificadas, podría correlacionarse un posible proceso zoonótico con B. coli donde los cerdos fueron el reservorio del parásito y la principal fuente de infección para los humanos (24). La presencia de este parásito en las personas está determinada por las malas condiciones de salubridad, carencia de servicios básicos (agua, desagüe) y crianza de cerdos a campo abierto (10); este último aspecto no fue predominante en el estudio actual debido a que la cría de los cerdos se lleva a cabo en corrales; sin embargo, las condiciones y hábitos higiénicosanitarios de los seres humanos son, posiblemente, los factores de riesgo más altos en los procesos zoonóticos.

In Latin America, the prevalence of the infection by B. coli ranges between 0.5 and 2.1% (21), showing low among other protozoan intestinal infections. The quality of the water and thus the presence of parasites, to establish with certainty what is the true source of infection and the existence of transmission between species. A wide study done in Bolivia in 2.000 samples of feces coming from Aymara native children from the Bolivian steep lands region, showed a disseminated infection by B. coli with a general prevalence of 1.2%; besides this, swine fecal samples were analyzed, and the results showed that more than half of the swine (n=50) living in this native community were infected by B. coli, wich clearly indicates

En América Latina la prevalencia de la infección por B. coli en humanos, oscila entre el 0.5 y el 2.1% (21), siendo baja frente a otras infecciones intestinales por protozoos. Son necesarios estudios adicionales donde se evalué la calidad del agua y presencia de parásitos para saber con certeza cuál es la verdadera fuente de infección y si hay transmisión entre especies. Un amplio estudio realizado en Bolivia con 2.000 muestras de heces procedentes de niños Aymaras nativos de regiones escarpadas bolivianas, mostró una infección por B. coli con una prevalencia general de 1.2%; adicional a esto se analizaron muestras de heces de cerdos y los resultados mostraron que más de la mitad de los cerdos (n=50) que viven en esta

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a zoonotic transmission (5). The illness in swine is asymptomatic, whereas, in humans it might show clinical outcomes ranging from asymptomatic to severe ones, where the asymptomatic ones serve as reservoirs and disseminators of the illness; diarrhea, blood feces, cramps and abdomen pain is shown in the severe ones (5). A study made in Egypt, showed the presence of de E. coli and E. histolytica/dispar in samples of swine and dogs in a 7.56% y 3.84% respectively, additionally samples of children with diarrhea were analyzed and showed a high prevalence of both species, thus suggesting a possible anthropozoonotic infection with dogs and swine in the area (25). Additionally, during the current study the presence of E. nana was evidenced, and from which its zoonotic potential has not been established yet, but it is said that it might be involved in zoonosis were swine and humans are in high contact with the infective form (Cysts) by water consumption, food or contaminated hands and thus helping the zoonotic pathogens transmission between species, causing disease (7,26). A study made in the Republic of Korea, related to zoonotic parasites reported that the main parasites with zoonotic potential are E. nana and I. bütschlii, which are protozoans with sapro-zoonotic potential, meaning humans become infected by contaminated food or water with feces of swine, dogs and cattle (7). Another parasite found was Blastocystis hominis, which pathogen potential in humans and swine is still controversial due to the absence of symptoms, the presence of this microorganism in feces of a variety of animal species such as birds, apes, rodents, amphibians and humans suggests the rotation among them, thus considered a protozoan with zoonotic potential (7,26), also it is associated with the consumption of water, fruits and vegetables contaminated with feces. This parasite is found in a high prevalence in human population, for example, in Argentina in a 43% of children in school age was found, it has been registered in Venezuela with a prevalence of 27%, from which 24% of children in school age, mainly between the age of 9 and 11 years old and 23.9% of the elderly population were infected by this protozoan. (23) Although in the analyzed humans, were not observed compatible structures with A. suum, T. suis and Cryptosporidium spp., it is of importance to stand out the zoonotic potential of these parasites. Ascaris lumbricoides and

comunidad nativa estaban infectados por B. coli, lo cual claramente indica una transmisión zoonótica (5). La enfermedad en los cerdos es asintomática mientras en los seres humanos podría mostrar resultados clínicos que van desde asintomáticos hasta severos, donde los asintomáticos sirven como reservorios y diseminadores de la enfermedad mientras en los severos se pueden presentar diarrea, deposiciones con sangre, calambres y dolor abdominal (5). Un estudio realizado en Egipto mostró la presencia de E. coli y E. histolytica/dispar en muestras de porcinos y caninos en el 7.56% y 3.84% respectivamente; adicionalmente se analizaron muestras de niños con diarrea que mostraron alta prevalencia a las dos especies, lo que sugiere una posible infección antropozoonótica con los perros y los cerdos de la zona (25). Adicionalmente, durante el presente estudio se evidenció la presencia de E. nana, cuyo potencial zoonótico no se ha establecido aún, pero se dice que podría estar involucrado en zoonosis con cerdos y los seres humanos que están en alto contacto con la forma infecciosa (quistes) por el consumo de agua, la comida o manos contaminadas, ayudando así a la transmisión de agentes patógenos zoonóticos entre las especies y causando la enfermedad (7, 26). Otro estudio realizado en la República de Corea relacionado con parásitos zoonóticos reportó que los principales parásitos con potencial zoonótico son E. nana e I. bütschlii, que son protozoos con potencial sapro-zoonótico, lo que significa que los seres humanos se infectan por alimentos o agua contaminada con heces de porcinos, caninos y ganado (7). Otro parásito encontrado fue el Blastocystis hominis, cuyo potencial patógeno en humanos y cerdos sigue siendo controvertido debido a la ausencia de síntomas; la presencia de este microorganismo en las heces de varias especies de animales como aves, monos, roedores, anfibios y los humanos sugiere la rotación entre ellas, por lo que se considera un protozoario con potencial zoonótico (7, 26); también se asocia con el consumo de agua, frutas y verduras contaminadas con materia fecal. Este parásito se encontró con alta prevalencia en la población humana; por ejemplo, en Argentina se halló en el 43% de los niños en edad escolar, también se ha registrado en Venezuela con una prevalencia de 27%, donde el 24% de los escolares, principalmente niños entre 9 y 11 años de edad y 23.9% de los ancianos estaban parasitados por este protozoo (23). Aunque en los seres humanos analizados no se observaron estructuras compatibles con A. suum, T. suis y Cryptosporidium spp., es importante destacar el potencial zoonótico de estos parásitos. Ascaris lumbricoides y Trichuris trichiura infectan a más de mil millones de personas en todo el mundo

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Trichuris trichiura, infect more than a thousand million people worldwide (27), the species A. suum and T. suis in swine have a global distribution, due to the presence of infected swine mainly in the production system (27). Swine and humans alike are infected by the ingestion of the eggs that acquire an infectious stage in the environment (26). This type of parasitosis produces high economic impact, due to the frequent delay in growth and diarrhea in swine. The differentiation between human and swine parasites species has been hard and due to this reason the frequency of infection of A. suum and T. suis in humans cannot be determined (26), but a zoonotic implication is not discarded due to it similarity and the possibility to infect humans especially in areas where swine and humans live close to each other or swine feces is used as agricultural fertilizer in vegetables for human consumption or by water pollution and bad hygiene of workers in the swine farms, thus existing a potential risk of crossed infections (27). The cryptosporidiosis is a disease of high zoonotic importance, known worldwide as a public health problem that affects mainly people that interact with farm animals on a daily basis (5). Generally, the infections by Cryptosporidium in domestic swine are higly frequent in animals between 1 and 6 months old, reaching a prevalence between 24 and 60%; the 16.5% of the adults had an infection by Cryptosporidium spp. (21), this data supports the fact that adult swine are parasited in a lower degree (21). Recent studies have showed the existence of Cryptosporidium suis, finding done by means of molecular biology which evidenced that this is genetically different from the other species of Cryptosporidium known (21). It is relevant to evidence the presence of pathogens with zoonotic potential, thus they might prove to become relevant public health issues, besides, pitching in knowledge concerning these type of parasites, will make decision making in preventive measures that deny the rotation of parasites between animal and humans. Infection due to contaminated water, bad human hygienic practices contributes to the transmission of parasites to swine, and thus these act as a reservoir disseminating the parasites by fecal means. When used as agricultural fertilizer it contaminates crops and water supplies acting as a source of infection for humans and animals alike in an endless cycle.

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(27) y las especies A. suum y T. suis en los cerdos tienen distribución mundial debido a la presencia de cerdos infectados, principalmente en los sistemas de producción (27). Los cerdos y los seres humanos se infectan igualmente por la ingestión de huevos que son el estadío infeccioso en el medio ambiente (26). Este tipo de parasitosis produce alto impacto económico debido al retraso frecuente en el crecimiento y la diarrea en los cerdos. La diferenciación entre las especies de los parásitos en humanos y en los porcinos ha sido difícil y por esta razón la frecuencia de infección con A. suum y T. suis en humanos no se puede determinar (26), pero no se descarta una implicación zoonótica debido a su similitud y a la posibilidad de infectar a los seres humanos, especialmente en las zonas donde los cerdos y los humanos viven cerca unos de otros, o donde el estiércol porcino se utiliza como fertilizante agrícola de hortalizas destinadas al consumo humano, o por la contaminación del agua y la mala higiene de los trabajadores en las granjas porcinas, por lo que existe un riesgo potencial de infecciones cruzadas (27). La criptosporidiosis es una enfermedad de gran importancia zoonótica, conocida en todo el mundo como un problema de salud pública que afecta principalmente a las personas que a diario interactúan con animales de granja (5). En general las infecciones por Cryptosporidium en cerdos domésticos son frecuentes en animales entre 1 y 6 meses de edad, alcanzando una prevalencia entre el 24 y el 60%; el 16,5% de los adultos tuvo una infección por Cryptosporidium spp. (21), información que apoya el hecho de que los cerdos adultos están parasitados en un grado menor (21). Estudios recientes han mostrado la existencia de Cryptosporidium suis, hallazgo hecho por medio de la biología molecular, que evidencian que este parásito es genéticamente diferente de las otras especies de Cryptosporidium conocidos (21). Es importante demostrar la presencia de patógenos con potencial zoonótico que podrían llegar a convertirse en problemas de salud pública; además, difundir el conocimiento sobre este tipo de parásitos hará tomar decisiones sobre las medidas preventivas que impidan la rotación de los parásitos entre los animales y seres humanos. La infección por agua contaminada y las malas prácticas de higiene de los humanos contribuyen en la transmisión de parásitos a los cerdos y estos actúan como reservorio diseminando los parásitos por medio de las heces, las cuales al usarse como abono en agricultura contaminan las hortalizas y las aguas siendo fuente de infección tanto para los humanos como para otros animales siguiendo un ciclo sin fin.

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Acknowledgements

Agradecimientos

Pontificia Javeriana University. Academic research vice direction. Research proposals financed by own resources of the academic units ID PPTA 00004645, ID PRY 004437. Swine producer’s Colombian association, specially the field technicians.

A la Pontificia Universidad Javeriana. Subdirección de Investigación Académica. Propuestas de investigación financiadas con recursos propios de las unidades académicas ID PPTA 00004645, ID PRY 004437. A la Asociación Colombiana de Porcicultores (ACP), especialmente a los técnicos de campo.

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):5028-5036, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Growth and mortality of Cachana (Cynopotamus atratoensis) in the cienaga Grande de Lorica, Colombia Crecimiento y mortalidad de la Cachana (Cynopotamus atratoensis) en la ciénaga Grande de Lorica, Colombia Charles Olaya-Nieto1*, M.Sc, Fredys Segura-Guevara,1 M.Sc, Antonio Vergara-Paternina,1 Prof. Acuicul. Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Ciencias Acuícolas, Laboratorio de Investigación Biológico Pesquera-LIBP. Cra 23 No. 2A-20, Piso 2. Lorica, Colombia. *Correspondencia: charles_olaya@hotmail.com 1

Received: June 2014; Acepted: February 2015.

ABSTRACT Objective. Growth and mortality parameters of Cachana Cynopotamus atratoensis Eigenmann, 1907 in the cienaga Grande de Lorica, Sinu river basin, Colombia, were estimated. Materials and methods. The length frequency analysis to the information collected between January 2001 to December 2002, was applied. Results. The estimated values for asymptotic length, growth rate and age at zero length were 43.4 (±0.52) cm of total length, 0.29 (±0.02) year-1 and -0.53 years, respectively. Total mortality was estimated at 0.97 year-1, natural mortality at 0.72 year-1, fishing mortality at 0.25, the average catch size was 24.8 cm total length, being fully recruited to the fishery with 16.6 cm total length, with low exploitation rate (E: 0.26). Conclusions. Cachana is a fish with medium longevity and growth rate with low exploitation rate, suggesting that there is still no overfishing on the species. However, as it is an very important fish in the food security of fishermen and their families, its necessary to increase the basic biology research pointing to the management and conservation of the species in the cienaga and the Sinu basin. Key words: Conservation, exploitation rate, management, migration, overfishing (Source: ASFA).

RESUMEN Objetivos. Estimar los parámetros de crecimiento y mortalidad de la Cachana Cynopotamus atratoensis Eigenmann, 1907 en la ciénaga Grande de Lorica, cuenca del río Sinú, Colombia. Materiales y métodos. Se aplicó el análisis de frecuencia de tallas a la información colectada en el período comprendido entre enero 2001 y diciembre 2002. Resultados. Los valores estimados para la longitud asintótica, tasa de crecimiento y edad a la longitud cero fueron 43.4 (±0.52) cm de longitud total, 0.29 (±0.02) año-1 y -0.53 años, respectivamente. La mortalidad total fue estimada en 0.97 año-1, la mortalidad natural en 0.72 año–1, la mortalidad por pesca en 0.25 año–1, la talla media de captura fue 24.8 cm de longitud total, siendo reclutada totalmente a la pesquería con 16.6 cm de longitud total, con baja tasa de explotación (E=0.26). Conclusiones. La Cachana es un pez de longevidad y tasa de crecimiento medios con baja tasa de explotación, lo que sugiere que aún no hay sobrepesca sobre la especie. Sin embargo, como es un pez muy importante en la seguridad alimentaria de los pescadores y sus familias, es necesario incrementar la investigación sobre su biología básica apuntando al manejo y conservación de la especie en la ciénaga y la cuenca del Sinú. Palabras clave: Conservación, manejo, migración, sobrepesca, tasa de explotación (Fuente: AIMS). 5028

Olaya-Nieto - Growth and mortality of Cachana in Colombia

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Cachana Cynopotamus atratoensis (1) is a carnivorous fish found in the Ciénaga Grande de Lorica. Its main habitat is in the basin of the Sinú River, where they are mainly caught, with a maximum length of 45.3 cm TL and maximum weight of 1.1 kg.

La Cachana Cynopotamus atratoensis (1) es un pez carnívoro residente en la ciénaga Grande de Lorica, su hábitat principal en cuenca del río Sinú, Colombia y área en donde se presentan las mayores capturas de la especie, registrándose una talla máxima de 45.3 cm LT y un peso máximo de 1.1 kg.

It feeds mainly on fish such as Yalúa Cyphocharax magdalenae, Mayupa Sternopygus macrurus, Chipe Hoplosternum magdalenae, and others of its same species, indicating a tendency towards cannibalism. It maintains its preferences as it grows, year-round, and the swamp’s hydrological cycle, with a r2 type reproductive strategy and two periods of spawning and high fertility levels.

Se alimenta principalmente de peces como Yalúa Cyphocharax magdalenae, Mayupa Sternopygus macrurus, Chipe Hoplosternum magdalenae, y algunos de su misma especie, lo que denota conducta caníbal. Mantiene sus preferencias por los peces a medida que va creciendo, a lo largo del año y del ciclo hidrológico de la ciénaga, presentando estrategia reproductiva del tipo r2, con dos períodos de desove y alta fecundidad.

The objective of this work was to estimate the growth and mortality parameters of the Cachana in the Ciénaga Grande de Lorica Sinú River basin to contribute to the knowledge of its lifecycle, fishery procedures and species management and conservation in the swamp and the Sinú basin.

MATERIALS AND METHODS Area of study. This research took place in the Ciénaga Grande de Lorica, wetlands located 9° north latitude and 75° 40’ west longitude, downstream of the Urra dam and on the right border of the Sinú River, Colombia, connected by the Bugre and Aguas Prietas streams. Sampling. The information was taken between January 2001 and December 2002. Some samples were collected by researchers involved in the project and the rest were taken by fishermen in their work in the study area, which were given to the laboratory. Only cast nest catches were considered, a type of fishing that makes it possible to obtain different size samples and thus avoids distortions biases due to selectivity. The following measurements were taken for each individual: total length (TL), fork length (FL) and standard length (SL) to the closest millimeter with a graduated ictiometer (Tridente, Spain) and total weight (TW) to the closest gram with an electric scale (Ohaus, USA) with a 5000 (±0.1) g capacity. Estimating growth parameters. The information was truncated to avoid biases in the estimates. The class interval used was 1 cm to obtain the length frequency distribution, which was run through the normality test (2). Initially the growth coefficient was estimated (b) for the total length-total weight relationship for the samples collected, using the Student test to establish if it was isometric or allometric.

El objetivo de este trabajo fue estimar los parámetros de crecimiento y mortalidad de la Cachana en la ciénaga Grande de Lorica, cuenca del río Sinú, como contribución al conocimiento de su ciclo de vida, al ordenamiento de su pesquería y al manejo y conservación de la especie en la ciénaga y en la cuenca del Sinú.

MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio. Esta investigación se desarrolló en la ciénaga Grande de Lorica, humedal ubicado a los 9° de latitud Norte y 75° 40’ de longitud Oeste, aguas abajo de la represa de Urrá y en la margen derecha del río Sinú, Colombia al cual se conecta mediante los caños Bugre y Aguas Prietas. Muestras. La información fue tomada entre enero 2001 y diciembre 2002. Parte de las muestras fue colectada por los investigadores involucrados en el proyecto y el resto por los pescadores en las faenas que efectúan en el área de estudio, las cuales fueron cedidas al laboratorio. Solo se consideraron las capturas con atarraya, arte de pesca que permite obtener ejemplares de diferentes tallas, evitando que se presenten sesgos en las mismas debido a la selectividad del arte. Las mediciones que se tomaron para cada ejemplar fueron: longitud total (LT), longitud horquilla (LH) y longitud estándar (LS) al milímetro más cercano con un ictiómetro graduado (Tridente, España) y peso total (WT) al gramo más cercano con una balanza eléctrica (Ohaus, USA) con capacidad de 5000 (±0.1) g. Estimación de los parámetros de crecimiento. La información se truncó para evitar sesgos en las estimaciones. El intervalo de clase utilizado fue de 1 cm para obtener la distribución de frecuencia de tallas, a la cual se le realizó la prueba de normalidad (2). Inicialmente se estimó el coeficiente de crecimiento (b) de la relación longitud total-peso

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The linear regressions estimated were standard length-total length (SL-TL), fork length-total length (FL-TL) and standard length-fork length (SL-FL), applying the method of minimum squared (3): y=a+bx Where y is the dependent variable in centimeters, a is the regression intercept, b is the regression slope and x is the independent variable in centimeters. ELEFAN I (4) was applied to the distribution of length frequency to estimate the asymptotic length (Linf) and the growth coefficient (K) for the Von Bertalanffy equation (5), corrected since the growth coefficient was allometric: Lt = Linf {1-e

[-K*D (t-to)]1/D

}

Where Lt is the average length at age t, Linf is the asymptotic length or the maximum theoretical length size that the fish can reach, K is the coefficient to reach Linf, D is equal to 3 [1- (0.6742 + 0.03574*Log10 TWMáx)], TWMáx is the highest weight collected and t0 the “age” at zero length. Different combinations were applied to the growth parameters (Linf and K) in an attempt to seek the best adjustment possible for the data set, selecting 10 pairs, estimating measurements and standard deviation for each parameter. It should be noted that t0 cannot be estimated applying the length frequency analysis, including ELEFAN, so it was obtained through this empirical equation (3): Log10 (-t0) = -0.3922 - 0.2752 Log10 Linf - 1.038 Log10 K To check if this parameter was different from zero, the Student test was applied. Finally, the empirical equation of the growth performance index (ø´) (6) was estimated, which makes it possible to compare different estimates of growth parameters within the species, order or family: (ø´) = Log10 K + 2 Log10 Linf Estimation of mortality parameters. The instantaneous rate of total mortality Z) was estimated using the length converted in catch curve method (3) with the following equation: Loge (N/Δt) = a + bt Where e is the base of the neperian logarithm, N is the number of fish in the sample, Δt is the

total de la muestra colectada, utilizando el test de Student para establecer si era isométrico o alométrico. Se estimaron las regresiones lineales longitud estándar-longitud total (LS-LT), longitud horquillalongitud total (LH-LT) y longitud estándar-longitud horquilla (LS-LH), aplicando el método de los mínimos cuadrados (3): y=a+bx En donde y es la variable dependiente en centímetros, a es el intercepto de la regresión, b es la pendiente de la regresión y x es la variable independiente en centímetros. Se aplicó ELEFAN I (4) a la distribución de frecuencia de tallas para estimar la longitud asintótica (Linf) y el coeficiente de crecimiento (K) de la ecuación de Von Bertalanffy (5), corregida debido a que el coeficiente de crecimiento fue alométrico: Lt = Linf {1-e

}

[-K*D (t-to)]1/D

En donde, Lt es la longitud media a la edad t, Linf es la longitud asintótica o la máxima talla teórica que puede alcanzar el pez, K es el coeficiente con el cual se alcanza Linf, D es igual a 3 [1- (0.6742 + 0.03574*Log10 WTMáx)], WTMáx es el mayor peso colectado y t0 la “edad” a la longitud cero. Se aplicaron diferentes combinaciones de los parámetros de crecimiento (Linf y K), tratando de buscar el mejor ajuste posible para la serie de datos, seleccionándose 10 parejas, estimándose la media y la desviación estándar para cada parámetro. Cabe notar que t0 no se puede estimar aplicando análisis de frecuencia de tallas, incluido ELEFAN, por tanto se obtuvo mediante la ecuación empírica (3): Log10 (-t0) = -0.3922 - 0.2752 Log10 Linf - 1.038 Log10 K Para comprobar si este parámetro era diferente de cero se le aplicó el test de Student. Finalmente, se estimó la ecuación empírica del Índice de desempeño del crecimiento (ø´) (6), índice que permite efectuar comparaciones de las diferentes estimaciones de los parámetros de crecimiento dentro de la especie, género o familia: (ø´) = Log10 K + 2 Log10 Linf Estimación de los parámetros de mortalidad. La tasa instantánea de mortalidad total (Z) se estimó con el método de tallas convertidas en curvas de captura (3) con la siguiente ecuación: Loge (N/Dt) = a + bt

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interval necessary for the fish to go from one length to the next, a is the regression intercept, b is the regression slope and t is the relative average age. The catch curve was based on the estimated average values for growth parameters, tracing the regression line above the points located in the descending part of the curve where the instantaneous mortality rate (Z) is the slope (b) with changed signs. The confidence interval at 95% and the coefficient of determination were obtained using only the values in x e y involved in the regression.

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The instantaneous rate of natural mortality (M) was estimated with the equation (3):

En donde, e es la base del logaritmo neperiano, N es el número de peces en la muestra, Dt es el intervalo de tiempo necesario para que un pez pase de una talla a otra, a es el intercepto de la regresión, b es la pendiente de la regresión y t es la edad media relativa. La curva de captura se construyó con los valores promedios estimados anteriormente para los parámetros de crecimiento, trazándose la línea de regresión sobre los puntos ubicados en la parte descendente de la curva, en donde la tasa instantánea de mortalidad (Z) es la pendiente (b) con signo cambiado. El intervalo de confianza al 95% y el coeficiente de determinación se obtuvieron teniendo en cuenta únicamente los valores en x e y involucrados en la regresión.

Log10 M = - 0.0066 - 0.279 Log10 Linf + 0.6543 Log10 K + 0.4634 Log10 T

La tasa instantánea de mortalidad natural (M) se estimó con la ecuación (3):

Where T is the average annual water temperature, measured with portable multi parametric equipment (Hanna Instruments, USA). The instantaneous rate of fishing mortality (F) was calculated with F=Z-M and the exploitation rate (E) was obtained with the relation E=F/Z, routines that are part of ELEFAN II (4). To estimate the pattern of selection and recruitment, the Tresierra & Culquichicón (7) method was applied using asymptotic length data (Linf), growth coefficient (K) and the age at zero length (t0), previously obtained with the following equation: Lc = Linf {1-e [-K (t50%-t0)]}, where Lc is the length of the first catch and t50% is the average capture age.

Log10 M = - 0.0066 - 0.279 Log10 Linf + 0.6543 Log10 K + 0.4634 Log10 T

Confidence intervals were established at 95% for Linf, K and Z, as well as for the morphometric relationships SL-TL, FL-TL and SL-FL. Each of these regressions is estimated for a correlation coefficient (r), and the determination (r2) for Z.

RESULTS Between January 2001 and December 2002 1893 individuals were collected (Table 1), information that was combined to improve quality. The minimum length collected was 13.6 cm TL (July 2002) and the maximum length was 41.5 cm TL (January 2002). The length frequency distribution shows a bimodal curve normally distributed in both cases with modal frequencies of 22.0 and 34.0 cm TL (Figure 1). Linear regressions obtained with 95% confidence (Figure 2) were: TL = 0.91 (± 0.01) + 1.17 (± 0.005) SL TL = 0.31 (± 0.06) + 1.09 (± 0.003) FL FL = 0.58 (± 0.08) + 1.07 (± 0.004) SL

En donde T es la temperatura media anual del agua, medida con un equipo multi parámetro portátil (Hanna Instruments, USA). La tasa instantánea de mortalidad por pesca (F) se calculó con F =Z-M y la tasa de explotación (E) se obtuvo con la relación E =F/Z, y son rutinas que hacen parte de ELEFAN II (4). Para estimar el patrón de selección y reclutamiento se aplicó la metodología de Tresierra & Culquichicón (7), utilizando los datos de longitud asintótica (Linf), coeficiente de crecimiento (K) y la edad a la longitud cero (t0), obtenidos anteriormente, con la siguiente ecuación: Lc = Linf {1-e [-K (t50%-t0)]}, en donde Lc es la longitud de primera captura y t50% es la edad media de captura. Se establecieron intervalos de confianza al 95 % para Linf, K y Z, al igual que para las relaciones morfométricas LS-LT, LH-LT y LS-LH. A cada una de estas regresiones se les estimó el coeficiente de correlación (r), y el de determinación (r2) para Z.

RESULTADOS Se colectaron 1893 individuos entre enero 2001 y diciembre 2002 (Tabla 1), información que debió fusionarse para mejorar su calidad. La talla mínima colectada fue 13.6 cm LT (julio 2002) y la talla máxima 41.5 cm LT (enero 2002). La distribución de frecuencia de tallas presenta una curva bimodal normalmente distribuida en ambos casos, con frecuencias modales de 22.0 y 34.0 cm LT (Figura 1). Las regresiones lineales obtenidas con el 95% de confianza (Figura 2) fueron: LT = 0.91 (± 0.01) + 1.17 (± 0.005) LS

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Table 1. Length frequency data of Cachana in the Ciénaga Grande de Lorica.. length (cm TL)

Jan

Feb

Mar

April

May

June

July

Aug

Sep

Oct

Nov

Dec

10 27

Total

93 112

158

175 213

173

150

105

49 24

47 59

30 23

TOTAL

132

138

171

203

257

258

259

218

1893

LT = 0.91 (± 0.01) + 1.17 (± 0.005) LS r = 0.99 n = 1893

Longitud total (cm)

40 30 20 10 0 0

Longitud estándar (cm)

Figure 1. Length frequency distribution of Cachana.

Figure 2. Length-length relationship of Cachana.

The length-weight relationship (Figure 3) was estimated at TW = 0.003 (±0.04) TL 3.4 (± 0.03), r=0.99, n=1893), with a positive allometric growth coefficient. The estimated values for Linf, K and t0 to the growth equation were 43.4 (±0.52) cm TL, 0.29 (±0.02) year-1 and -0.53 years, respectively, with average annual temperatures of 28°C and confidence limits at 95%. The value of t0 is low and is not significantly different from zero (p>0.05).

LT = 0.31 (± 0.06) + 1.09 (± 0.003) LH LH = 0.58 (± 0.08) + 1.07 (± 0.004) LS La relación longitud-peso (Figura 3) se estimó en WT=0.003 (±0.04) LT 3.4 (± 0.03), r=0.99, n=1893), con coeficiente de crecimiento alométrico positivo. Los valores estimados para Linf, K y t0 de la ecuación de crecimiento fueron 43.4 (±0.52) cm LT, 0.29 (±0.02) año-1 y -0.53 años, respectivamente, con

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1000

WT = 0.003 (± 0.04) LT

temperatura media anual de 28°C y límites de confianza del 95%. El valor de t0 es bajo y no es significativamente diferente de cero (p>0.05).

3.4 (± 0.03)

r = 0.99

Peso total (g)

800

n = 1893

600 400 200 0 0

Longitud total (cm)

Figure 3. Length-weight relationship of Cachana.

In table 2 the length-at-age key is presented, with whose data the growth curve was drawn (figure 4). The growth performance index (ø’) was 2.73. In figure 5 it is possible to observe the length converted in catch curve and the corresponding regression. The estimated instantaneous rates were: 0.97 (±0.16) yr-1 for total mortality (Z), 0.72 (±0.03) yr-1 for natural mortality (M) and 0.25 yr-1 for capture mortality (F) with 95% of confidence for all three values.

En la tabla 2 se presenta la clave talla-edad, con cuyos datos se trazó la curva de crecimiento (figura 4). El Índice de desempeño del crecimiento (ø’) fue 2.73. En la figura 5 se observan las tallas convertidas en curva de captura y su correspondiente regresión. Las tasas instantáneas estimadas fueron las siguientes: 0.97 (±0.16) año1 para la mortalidad total (Z), 0.72 (±0.03) año–1 para la mortalidad natural (M) y 0.25 año–1 para la mortalidad por captura (F), con 95% de confianza para los tres valores. La talla media de captura estimada para la Cachana fue 24.8 cm LT, siendo reclutada a la pesquería (Lc) con 16.6 cm LT (Figura 6), con tasa de explotación de 0.26.

The average catch length estimated for Cachana was 24.8 cm TL, recruited to the fishery (Lc) at 16.6 cm TL (Figure 6), with an exploitation rate of 0.26.

Tabla 2. Length-at-age key. t (years)

TL (cm)

0.0

6.2

1.0

12.7

2.0

18.0

3.0

22.5

4.0

26.1

5.0

29.1

6.0

31.6

7.0

33.7

Figure 5. Length converted in catch curve of Cachana.  Used  Not used.

Frecuencia relativa (%)

1.0

0.8

0.5

0.3

0.0 05

15 Longitud total (cm)

Figure 6. Catch selection curve. Figure 4. Von Bertalanffy growth curve.

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DISCUSSION

DISCUSIÓN

The length frequency distribution presents a normally distributed curve, where the estimated values for asymptotic length (Linf=43.4 cm TL) and the growth coefficient (K=0.29 yr-1) make it possible to infer that Cachana is a fish with average longevity and growth rate, taking into account the life cycle parameters for stocks reported by Musick (8).

La distribución de frecuencia de tallas presenta una curva normalmente distribuida, en donde los valores estimados para la talla asintótica (Linf=43.4 cm LT) y el coeficiente de crecimiento (K=0.29 año-1) permiten inferir que la Cachana es un pez de longevidad y tasa de crecimiento medios, teniendo en cuenta los parámetros del ciclo de vida para poblaciones de peces reportados por Musick (8).

The estimated growth rate for the total length-total weight relationship shows that species growth under study is not isometric (b>3.0). This, and the fact that two curves in the length frequency distribution can be seen, suggests that the species makes lateral trophic or reproductive migrations in the Ciénaga Grande de Lorica to a still undisclosed location. All processes operating in floodplains are closely related to the hydrological regime, where alternation between periods of drought and flooding determines the structure and functioning of these environments (9-10). The influence of hydrological cycle attributes on migration, reproduction, juvenile survival and recruitment has been widely discussed by other authors (11-12).

El coeficiente de crecimiento estimado para la relación longitud total-peso total, muestra que el crecimiento de la especie en estudio no es isométrico (b >3.0). Esto, y el hecho de observarse dos curvas en la distribución de frecuencia de tallas, sugieren que la especie realiza migraciones laterales tróficas o reproductivas de la ciénaga Grande de Lorica hacia un lugar no determinado a la fecha. Todos los procesos que operan en las llanuras de inundación están estrechamente relacionados con el régimen hidrológico, en donde la alternancia entre inundaciones y períodos de sequía determina la estructura y funcionamiento de estos ambientes (9-10). La influencia de los atributos del ciclo hidrológico sobre la migración, reproducción, supervivencia juvenil y reclutamiento ha sido ampliamente discutida por otros autores (11-12).

In rivers with flood plains, fishery production tends to be strongly related to flooding intensity (13), which was observed in this study where the species caught in this study fluctuated in the Sinú basin between 9.1, 54.8, 8.8, 4.0 and 3.4 tons between 1997 and 2002, respectively (14-18). Additionally, in 2001 and 2002 in the fishery it was found that 75.5% (1429 individuals) of the catch was below the minimum catch length established for the Ciénaga Grande de Lorica and the Sinú River basin, 23.0 cm SL (27.8 cm TL), by means of Resolution 000520 from November 8, 2001 (19).

En los ríos con planos inundables, la producción pesquera tiende a estar fuertemente relacionada con la intensidad de las inundaciones (13), lo cual se observó en este trabajo en donde la captura de la especie en estudio ha mostrado fluctuaciones en la cuenca del Sinú de 9.1, 54.8, 8.8, 4.0 y 3.4 toneladas entre los años 1997 y 2002, respectivamente (14-18). Sumado a lo anterior, se encontró que durante los años 2001 y 2002 en la pesquería de la Cachana, el 75.5% (1429 individuos) de la captura se realizó por debajo de la talla mínima de captura establecida para la ciénaga Grande de Lorica y la cuenca del Sinú en 23.0 cm LS (27.8 cm LT) mediante la Resolución 000520 de noviembre 8 del 2001 (19).

However, according to the length-at-age key estimated, the species under study is recruited entirely to the fishery (Lc=16.6 cm TL) at 1.7 years, with a low exploitation rate (E=0.26), so it appears that there is still no overfishing considering that the optimal value for the exploitation rate is 0.5 and corresponds to a resource that is not being exploited in a disorganized or irrational way, which argues against the current regulations in the country. The minimum catch length established for Ciénaga Grande de Lorica and the Sinú Basin (23.0 cm SL, 27.8 cm TL) corresponds to the average length found in the length frequency distribution with a bimodal curve normally distributed as estimated in this study (22.0

Sin embargo, de acuerdo con la clave talla-edad estimada, la especie en estudio es reclutada totalmente a la pesquería (Lc =16.6 cm LT) a los 1.7 años de vida, con baja tasa de explotación (E = 0.26), por lo que infiere que aún no hay sobrepesca sobre el recurso teniendo en cuenta que el valor óptimo para la tasa de explotación es de 0.5 y corresponde a un recurso que no se está explotando desordenada o irracionalmente, lo cual controvierte la normatividad vigente en el país. La talla mínima de captura establecida para la ciénaga Grande de Lorica y la cuenca del Sinú (23.0 cm LS, 27.8 cm LT) corresponde al promedio de las tallas encontradas en la distribución de frecuencia de tallas con curva

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and 34.0 cm TL). Therefore, it is inferred that biases could exist in the estimation of the minimum catch length established for the species if not enough larger fish were collected that correspond to older specimens of the species in question. Therefore, the results of this study should be discussed with the fishery authority in Colombia (AUNAP) to analyze if the current legal minimum catch size established by Resolution 000520 is indeed consistent with the biology of this species. If most of fishing was focused on individuals below the legal size, the rate of exploitation would be very high, above 0.5, which is the optimum level of exploitation, and would result in overfishing; this was not observed in this study. A review, update and/or adjustment of the standard should be suggested to the AUNAP so that the fish can be caught following duly estimated growth parameters. Unlike commercially important fish species in the Sinú River basin, Cachana is not reported in fishery monitoring studies of INPA-Urrá agreement as a fish with commercial interest, so there is little biological information regarding its growth, mortality, feeding habits and reproductive biology. However, since it is a very important fish for the food security of fishermen and their families, as well as for those who sell fish in the market places or on the streets throughout Bajo Sinú, it is necessary, as for the most commercially important species, to research on its biology and ecology for the adequate management and conservation of the species in the cienaga and the Sinu River basin. Acknowlegements To the fishermen and fish traders in the Ciénaga Grande de Lorica and the lower Sinú River basin, and to the researchers involved in the “Estimación de los parámetros biológicos básicos de peces comerciales del Río Sinú– Fase II” project, Code FMV-01-04, Number 1120107, which formed part of this study. To the Universidad de Córdoba for the funding received.

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bimodal normalmente distribuida estimada en este trabajo (22.0 y 34.0 cm LT). Por tanto, se infiere que pudo haber sesgos en la estimación de la talla mínima de captura establecida para la especie al no colectarse suficientes peces con tallas más grandes correspondientes a cohortes de mayor edad de la especie en mención. Por lo anterior, los resultados de este trabajo deberían discutirse con la autoridad de pesca en Colombia (AUNAP), para analizar si en verdad la actual talla mínima legal de captura establecida por la Resolución 000520, es acorde con la biología de esta especie, puesto que si la mayor parte de la pesquería se centró en individuos por debajo de la talla legal establecida, se esperaría que la tasa de explotación fuese muy alta, mayor de 0.5, que es el nivel óptimo de explotación, lo que se traduciría en sobrepesca sobre el recurso; lo que no se observó en este trabajo. Se debería promover ante la AUNAP una revisión, actualización y/o ajuste de la norma, para que de esta manera la pesquería de la especie se realice siguiendo parámetros de crecimiento adecuadamente estimados. A diferencia de los peces comercialmente importantes en la cuenca del río Sinú, la Cachana no es reportada en los estudios de monitoreo pesquero del Convenio INPA-Urrá como un pez de interés comercial, por lo que se tiene poca información biológica básica con respecto a su crecimiento, mortalidad, hábitos alimentarios y biología reproductiva. Sin embargo, como es un pez muy importante en la seguridad alimentaria de los pescadores y sus familias, así como de quienes comercializan el pescado en las plazas de mercado o a nivel callejero en todo el Bajo Sinú, es necesario, al igual que para con las especies de mayor importancia comercial, investigar sobre su biología y ecología para el manejo y conservación de la especie en la ciénaga y la cuenca del río Sinú. Agradecimientos A los pescadores y comercializadores de pescado de la ciénaga Grande de Lorica y de la cuenca baja del río Sinú y a los investigadores involucrados en el proyecto “Estimación de los parámetros biológicos básicos de peces comerciales del Río Sinú–Fase II”, Código FMV-01-04, Numeral 1120107, del cual hace parte este trabajo. A la Universidad de Córdoba, por la financiación recibida.

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REFERENCES 1.

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):5037-5045, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Electrocardiographic parameters in captive, clinically healthy, Amazona ochrocephala Parámetros electrocardiográficos en Amazona ochrocephala clínicamente sanas en cautiverio Claudia Guerrero S,1 MV, Janeth Bolivar B,1 MV, Piero Vargas-Pinto,1* MV, Pedro Vargas-Pinto,2 Ph. D, Claudia Brieva-Rico,1 M.Sc. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Salud Animal, Carrera 30#45. Bogotá, Colombia. 2Universidad de la Salle. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Carrera 7º # 172-85. Bogotá, Colombia. *Correspondencia: piavargaspi@unal.edu.co. 1

Received: September 2014; Acepted: February 2015.

ABSTRACT Objective. To stablish the electrocardiographic parameters of individuals of the species Amazona ochrocephala, from the Unidad de Rescate y Rehabilitacion de Animales Silvestres at the Universidad Nacional de Colombia. Materials and methods. The electrocardiographic examination was performed under inhaled anesthesia with isoflurane. Leads I, II, III, aVL, aVR and aVF were measured. Results. Electrocardiographic parameters obtained in Lead II. P wave Duration: 0.015-0.044 s, P wave amplitude: 0.031 to 0.6 mv, R wave duration: 0.015-0.022 s, amplitude R: 0.034-0.038 mv, S wave Duration: 0.019- 0.042 s, amplitude S: 0.194-0.815 mv, T wave Duration: 0.025-0.064 s, T-wave amplitude: 0.010 to 0.5 mv, PQ Duration: 0.021-0.076 s, QRS Duration: 0.036-0.068 s, QT Duration: 0.070-0.015 s, RR Duration: 0.104-0.324 s, EEM: -111° to -80°, FC: 240-600 ppm. Conclusions. The results showed different values for amplitude and duration of the P, R and T waves in comparison to those obtained in other studies. However, they were similar for heart rate, MEA and duration of the PQ/R, QT and QRS segments. Key words: Amazona ochrocephala, diagnosis, electrocardiography. (Sources: MeSH).

RESUMEN Objetivo. Establecer los parámetros electrocardiográficos en individuos de la especie Amazona ochrocephala, de la Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá. Materiales y Métodos. El examen electrocardiográfico se realizó bajo anestesia inhalada con Isoflurano. Se tomaron derivadas I, II, III, aVL, aVR y aVF y posterior medición de ondas e intervalos usando magnificación con lupa. Resultados. Parámetros electrocardiográficos de la segunda derivada. Duración onda P: 0.015-0.044 s, amplitud onda P: 0.031-0.6 mv, duración onda R: 0.015-0.022 s, amplitud R: 0.034-0.038 mv, Duración onda S: 0.019- 0.042 s, Amplitud S: 0.194-0.815 mv, Duración onda T: 0.025-0.064 s, Amplitud onda T: 0.010-0.5 mv, Duración PQ: 0.021-0.076 s, Duración QRS: 0.036-0.068 s, Duración QT: 0.070-0.015 s, Duración R-R: 0.104-0.324 s, EEM: -111° a -80°, FC: 240-600 ppm. Conclusiones. Los resultados mostraron valores diferentes para los rangos de amplitud y duración de las deflexiones P, R y T en comparación a los obtenidos en otros estudios pero similares en cuanto al rango de frecuencia cardiaca, EEM y a la duración de los segmentos PQ/R, QT y QRS. Palabras clave: Amazona ochrocephala, diagnóstico, electrocardiografía. (Fuentes: MeSH). 5037

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The yellow-crowned parrot (Amazona ochrocephala) belongs to the psittacidae family that inhabits forests, mangroves, and tropical forests on the American continent. Although in Colombia this species is in a “least concerned” conservation state, in the country it is one of the wild birds that is most sold due to its demand as a pet, which is an illegal practice (1,2) and they are often caught by the environmental authorities and turned over fauna centers such as the Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres (URRAS) of the National University of Colombia.

El loro real (Amazona ochrocephala) es un ave perteneciente a la familia psittacidae que habita bosques, manglares y zonas selváticas tropicales del continente americano. Aunque en Colombia esta especie se encuentra en estado de conservación “preocupación menor” es una de las aves silvestres que más se trafican en el país debido a su demanda como mascota, lo que representa una práctica ilegal (1,2) por lo cual corresponden a una gran parte de los animales incautados por las autoridades ambientales y que ingresan a centros de fauna como la Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres (URRAS) de la Universidad Nacional de Colombia.

These birds differ significantly from mammals in their cardiovascular functions (3) and greater research is needed to understand the physiology, pathology and diagnostic methods. Additionally, environmental and nutritional changes of those that are taken to different habitats can alter their normal cardiovascular functioning. One of the most frequently used diagnostic tests in cardiology is electrocardiography (2), and reference values for chickens, turkey, doves and Amazona parrots are available. There is also information (mostly taken from domestic species) on the physiologic and anatomic traits of the cardiovascular system of these birds (3), as well as certain diagnostic procedures on diseases and their treatments. However, there is little information on electrocardiography on Amazona parrots and the authors have not come across studies that report the normal values for electrocardiography parameters for a determined parrot species; a similar study conducted in 1992 took individuals from the Amazona ochrocephala, A. festiva and A. amazonica species to obtain references for ECG parameters (4). Due to this tendency and the lack of information avai l abl e concerning normal values for electrocardiographic parameters in this species, the objective of this study was to determine the ECG parameters in Amazona ochrocephala from the Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres (URRAS) of the Universidad Nacional de Colombia, Bogotá headquarters.

MATERIALS AND METHODS Type of study. A non-experimental, transversal type descriptive study was conducted in the period between August and October 2013. Study site and geoclimate. Unidad de rehabilitación de Animales Silvestres (URRAS), Clínica para Pequeños Animales (CPA) of the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National University of Colombia. Latitude: 4°35’46.3215”N

Las aves poseen diferencias bastante significativas con los mamíferos en su funcionamiento cardiovascular (3) por lo cual requieren mayor investigación en cuanto a la fisiología, patología y métodos diagnósticos. Adicionalmente los cambios medioambientales y nutricionales a los que son sometidas al ser llevadas a hábitats diferentes a los de su medio pueden alterar el funcionamiento cardiovascular normal. Una de las técnicas diagnósticas más utilizadas en el campo de la cardiología es la electrocardiografía (2), teniendo actualmente valores de referencia en especies de pollos, pavos, palomas y loras del género Amazona. También existe información (que en su mayoría se extrapola de otras especies domesticas) sobre las características fisiológicas y anatómicas del sistema cardiovascular de las aves (3), además de ciertos procedimientos diagnósticos, enfermedades y tratamientos. Sin embargo es poca la información que se encuentra sobre electrocardiografía en loras del género Amazona y los autores no conocen la existencia de estudios que reporten los valores normales de parámetros electrocardiográficos para una especie determinada de lora; en un estudio similar realizado en el año 1992 se tomaron individuos de las especies Amazona ochrocephala, A. festiva y A. amazónica para obtener parámetros electrocardiográficos de referencia (4). Debido a esta tendencia y a la poca información disponible sobre los valores normales de parámetros electrocardiográficos para ésta especie, el objetivo de este estudio fue determinar los parámetros electrocardiográficos en individuos de la especie Amazona ochrocephala de la Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres (URRAS) de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá.

MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio. Se realizó un estudio no experimental, descriptivo de tipo transversal en el periodo comprendido entre Agosto y Octubre de 2013.

Guerrero - Electrocardiographic parameters in captive, Amazona ochrocephala

Longitude: 74°4’39.0285”W (5) Altitude: 2560 msnm, average T°: 13.8°C, relative humidity: 7380% (6); atmospheric pressure 560 mmHg (7). Study population. Birds from the Amazona ochrocephala species (n=17) kept in individual cages and group enclosures with perches, thermic support and elements to enrich the environment. Fed with a special diet for this species which is composed of fruit, vegetables, seeds, and vitamin and mineral supplements. Ethic aspects. The study was conducted with the approval of the Bioethics Committee of the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics, National University of Colombia, in session from August 14, 2013 (Act 06). Electrocardiographic record. Before the ECG exam, a basic clinical exam was performed, evaluating the state of hydration, cardiovascular and lung functionality, temperature and weight. For the ECG exam, the animals were put under anesthesia, inhaled with isoflurane between 3-4% for induction (with mask) and 1.5 - 2% for maintenance; tubing was done with endotracheal tube No. 2 or 3 without balloon. With animals in supine position, alligator clips were used for the electrocardiographic procedure, connecting them to the fold of the wings and the thighs (Figure 1). Gel and diluted alcohol was used to improve electric conduction. The ECG record was taken both in bipolar as well as increased unipolar derivatives (ECG Biocare 101G, China) (Figure 2 and 3) with a paper speed of 50 mm/s and an amplitude of 20 mm/mv (8). Anesthesia monitoring was performed by taking heart rate, respiration and temperature. Thermal support was provided during and after the procedure.

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Sitio de estudio y geoclima. Unidad de rehabilitación de Animales Silvestres (URRAS), Clínica para Pequeños Animales (CPA) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá. Latitud: 4°35’46.3215”N Longitud: 74°4’39.0285”W (5) Altitud: 2560 msnm, T° media: 13.8°C, Humedad relativa: 73-80% (6); presión atmosférica 560 mmHg (7). Población de estudio. Aves de la especie Amazona ochrocephala (n=17), alojadas en jaulas individuales y encierros grupales con perchas, soporte térmico y elementos de enriquecimiento ambiental. Alimentadas con una dieta especial para ésta especie, la cual se componía de frutas, verduras, semillas, suplementos vitamínicos y minerales. Aspectos éticos. El estudio se realizó bajo la aprobación del Comité de Bioética de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, en sesión del 14 de agosto de 2013 (acta 06). Registro electrocardiográfico. Previo al examen electrocardiográfico se practicó un examen clínico básico, evaluando el estado de hidratación, funcionalidad cardiovascular, pulmonar, temperatura y pesaje. Para el examen

Obtaining electrocardiographic parameters. The ECG analysis was performed using five continuous qRs complexes with adequate morphology, measuring each one of the waves and intervals for duration and amplitude in every derivative taken, with the aid of magnifying glass in cases where the deflections were very small (Figure 4). To calculate the mean electric axis, Bailey Axis system was used, taking the sum of the positive and negative deflections (R and S) that represent ventricular depolarization of leads I and III and taking the point where these measurements transpose (9). Statistical analysis. Data obtained by manual measurements was entered onto a form in Microsoft Excel® version 2010 (Microsoft Corporation®), and a descriptive statistical analysis was compiled. The final results were obtained through averages, standard deviation, minimum and maximum values, which were presented in tables and charts.

Figure 1. Electrode position for Amazona ochrocephala parrot. Red and yellow cables in superior members in the dorsal fold of the wing, black and green cable on inferior members on the knee joint.

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Figure 2. Normal ECG tracing in Amazona ochrocephala parrots. Bipolar leads: a) I, b) II, c) III. At a speed of 50 mm/s and 20 mm/mv.

Figure 3. Normal ECG tracing in Amazona ochrocephala parrots. Augmented monopolar leads: a) aVR, b) aVL, c) aVF. At a speed of 50 mm/s and 20 mm/mv.

Figure 4. Normal ECG tracing in Amazona ochrocephala parrots for lead II. a) Waves P, r, S, T; b) Segments Pq, qrS, qT. At a speed of 50 mm/s and 20 mm/mv.

RESULTS The electrocardiograph technique used in this study made it possible to measure the heart rate in all the cases (n= 17), and deflections and intervals in the majority of the parrots. The ECG parameters for lead II are illustrated in tables 1 and 2. The heart rate was found between 240 y 600

electrocardiográfico los animales fueron puestos bajo anestesia inhalada con isoflurano entre el 3 - 4% para la inducción (con mascarilla) y el 1.5 - 2% para el mantenimiento; la intubación se realizó con sonda endotraqueal No. 2 o 3 sin balón. Con los animales en decúbito dorsal, se utilizaron clips de caimán para el procedimiento electrocardiográfico, ubicándolos en el pliegue de las alas y de los muslos (Figura 1); se utilizó gel y alcohol diluido para mejorar la conducción eléctrica.

Guerrero - Electrocardiographic parameters in captive, Amazona ochrocephala Table 1. Reference values for electrocardiographs in healthy A. ochrocephala in Lead II. Average

Standard deviation

Amplitude P (mV)

0.178

0.156

0.031

Duration P (ms)

25.108

9.222

15.2

Amplitude R (mV)

0.035

0.002

0.034

0.038

Parameter

Minimum Maximum value value 0.6

Duration R (ms)

19.733

3.925

15.2

Amplitude S (mV)

0.566

0.187

0.194

0.815

Duration S (ms)

23.976

5.996

19.2

Amplitude T (mV)

0.284

0.163

0.011

0.585

Duration T (ms)

48.04

11.019

Table 2. Reference values for electrocardiographs in healthy A. ochrocephala in Lead II. Parameter

Average

Standard deviation

Minimum Maximum value value

Duration PQ (ms)

47.169

14.652

21.6

QT Corrected (ms)

16.365

9.893

27.63

Duration QT (ms)

119.338

22.022

154

Duration QRS (ms)

48.461

8.532

Duration R-R (ms)

168.894

56.654

104

324

beats/minute with an average of 426 beats/ minute (SD 115 beats/minute). (Table 3). P wave. This wave could only be measured in 76.47% Table 3. Reference values for electrocardiographs in healthy A. ochrocephala in Lead II. Parameter

Average

Standard deviation

Minimum value

Maximum value

Heart rate (ppm)

426.470

115.377

240

600

EEM (°)

-94.769

-34.721

-111

-80

of the parrots (n=13) for lead II, which was the most frequent one. In the majority of cases it was presented as a positive wave, with the exception of the aVL lead in which 33.33% (4 of 12 waves) of the waves were negative. R wave. This wave was difficult to observe in the ECG tracing, since in the majority of cases it was absent or reading was impossible due to its size. Lead II could only be measured in 17.64% of the cases (n=3 parrots). In aVR and aVL leads it was more difficult to find this wave, in 82.35 and 76.47% of the cases respectively. S wave. A difficult wave to observe in augmented unipolar leads, in lead II a reliable measurement was taken in 76.47% of the cases (n=13 parrots). There was a negative deflection in all the parrots in all leads. T wave. For lead II this wave could be measured in

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El registro electrocardiográfico se tomó tanto en derivadas bipolares como unipolares aumentadas (ECG Biocare 101G, China) (Figura 2 y 3) a una velocidad de papel de 50 mm/s y a una amplitud de 20 mm/mv (8). Se realizó monitoreo anestésico tomando la frecuencia cardiaca, respiratoria y temperatura. Se dio soporte térmico durante y después del procedimiento. Obtención de parámetros electrocardiográficos. El análisis electrocardiográfico se realizó utilizando cinco complejos qRs continuos con una adecuada morfología, midiendo cada una de las ondas e intervalos en duración y amplitud, en todas las derivadas tomadas con ayuda de magnificación con lupa en los casos en que las deflexiones eran muy pequeñas (Figura 4). Para calcular el eje eléctrico medio se utilizó el sistema hexaxial de Baileys tomando la suma de las deflexiones positivas y negativas (R y S) que representan la despolarización ventricular de las derivadas I y III y tomando el punto en el cual estas medidas se transponen (9). Análisis estadístico. Los datos obtenidos en la medición manual fueron ingresados a una planilla de Microsoft Excel® versión 2010 (Microsoft Corporation®) y se realizó un análisis estadístico de tipo descriptivo. Los resultados finales se obtuvieron a través de promedios, desviación estándar, valores mínimos y máximos, los cuales fueron representados mediante tablas y cuadros.

RESULTADOS La técnica electrocardiográfica empleada en este estudio permitió la medición de la frecuencia cardiaca en la totalidad de los casos (n= 17), y de las deflexiones e intervalos en la gran mayoría de las loras. Los parámetros electrocardiográficos para la derivada II, se ilustran en las tablas 1 y 2. La frecuencia cardiaca se encontró entre 240 y 600 latidos/minuto, con un promedio de 426 latidos / minuto (SD 115 latidos/minuto). (Tabla 3). Onda P. Esta onda solo pudo ser medida en el 76.47% de las loras (n=13) para la derivada II, siendo ésta derivada en la que se presentó con mayor frecuencia. En la gran mayoría de los casos estuvo representada como una onda positiva, a excepción de la derivada aVL en la cual el 33.33% (4 de 12 ondas) de las ondas fueron negativas. Onda R. Esta onda fue de difícil observación en el trazado electrocardiográfico ya que en la mayoría de los casos se encontraba ausente o su lectura era imposible debido a su tamaño. En la derivada II solo se pudo medir en el 17.64% de los casos

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94.11% of the cases (n=16), in the majority as a positive deflection of 93.75% and a negative one of 6.25% in just one parrot. In leads III and aVF, the deflections were completely positive, just the opposite of leads aVR and aVL. For lead I the deflection was mostly positive at 81.25%. PQ, QT, QRS intervals. These intervals could be measures in 76.47% of the cases (n= 13), for lead II. (Table 2). To discover the QT interval independent of the heart rate, this value was calculated using the Friederichia value of the corrected QT in Lead II, with an average of 16.365 ms and a standard deviation of 9.893 ms. R-R intervals. For lead II this interval had an average duration of 168.894 ms with a standard deviation of 56.654 ms, this interval produced similar values in all the leads.

DISCUSSION Due to being exposed to environmental factors that are different from their habitat, as well as handling in captivity, wild birds are prone to develop cardiovascular abnormalities that can harm their well-being and life (10,11). Changes in temperature, humidity, altitude and pressure, as well as a lack of exercise and inadequate diets, can result in cardiovascular diseases such as arteriosclerosis, pulmonary hypertension and congestive heart failure, among others. Reported heart abnormalities range from 9.7 to 36% (12). Although ECGs in birds is similar to those used in mammals, there are some differences and chemical restriction or general anesthesia is often required during the procedure, as well as the use of subcutaneous electrodes. The ECG exam under general anesthesia with isoflurane (between 1 and 4%) was safe and a good quality tracing was obtained for the majority of the ECGs recorded, with little interference caused by movements of the animals or electrodes. Also, during the study there were no complications due to anesthesia and postsurgical effects were minimal (emesis and hypothermia). Regarding the ECG record, the most significant differences have to do with phenomenon such as superimposing T and P waves, the presence of Ta waves, the absence of Q and R waves on some occasions, QRS complexes and short or absent ST segments. Both in presentation such as size and quality in the deflections recorded in the ECG vary in each lead and with each animal. In lead I, the majority of animals presented an isoelectric tracing with

(n=3 loras). En las derivadas aVR y aVL fue más fácil encontrar ésta onda, en el 82.35 y 76.47% de los casos respectivamente. Onda S. Onda de difícil observación en las derivadas monopolares aumentadas, en la derivada II se realizó una medición confiable en el 76.47% de los casos (n=13 loras). Encontrándose en todas las loras como una deflexión negativa, para todas las derivadas. Onda T. Para la derivada II esta onda fue posible medirla en el 94.11% de los casos (n=16), mostrando en su mayoría una deflexión positiva 93.75% y negativa en un 6.25% presentándose en un solo loro. En las derivadas III y aVF, las deflexiones fueron en su totalidad positivas, al contrario de lo sucedió con las derivadas aVR y aVL. Para la derivada I la deflexión fue en su mayoría positiva 81.25%. Intervalo PQ, QT, QRS. Estos intervalos pudieron ser medidos en el 76.47% de los casos (n= 13), para la derivada II. (Tabla 2). Para conocer el valor del intervalo QT, independiente de la frecuencia cardiaca, se calculó este valor utilizando la fórmula de Friederichia el valor del QT corregido en Derivada II tuvo un promedio de 16.365 ms y una desviación estándar de 9.893 ms. Intervalo R-R. Para la derivada II este intervalo tuvo una duración promedio de 168.894 ms con una desviación estándar de 56.654 ms, este intervalo mostró valores similares en todas las derivadas.

DISCUSIÓN Debido a la exposición a factores medioambientales diferentes a los de su medio y al manejo en cautividad, las aves silvestres son propensas a desarrollar anormalidades del sistema cardiovascular que pueden comprometer su vida y su bienestar (10,11). El cambio de temperatura, la humedad, altitud y presión, al igual que la falta de ejercicio y dietas inadecuadas, pueden favorecer la presentación de enfermedades cardiovasculares como arterioesclerosis, hipertensión pulmonar y falla cardiaca congestiva, entre otras. La presentación de anormalidades cardiacas reportadas va desde el 9.7 hasta el 36% (12). Aunque la técnica electrocardiográfica en aves es similar a la utilizada en mamíferos, existen algunas diferencias y pueden requerir restricción química o anestesia general durante el procedimiento, así como el uso de electrodos subcutáneos. El examen electrocardiográfico bajo anestesia general con isoflurano (entre el 1 y 4%) fue seguro y permitió obtener un trazado de muy buena calidad para la mayoría de los ECGs registrados, con poco ruido

Guerrero - Electrocardiographic parameters in captive, Amazona ochrocephala

very small deflections and complex QRS that were difficult to define. The aVL lead was more homogenous among all the animals, with regular tracing, good quality and the majority of the deflections were present and easy to measure. As far as the deflections, the P wave in all the leads was too small, making it difficult to get a reliable reading, while the R wave was difficult to obtain in the majority of the bipolar leads, though not so in the augmented unipolar leads where it was frequently recorded. The S wave was absent or difficult to distinguish in the aVR and aVL leads, while in the other leads it was easily identified. Only two birds (lead I and aVL) did not show any deflection that represented ventricular depolarization (R or S wave). On the other hand, the T wave was present in all the leads in almost all the animals examined. As in other species, infectious and noninfectious diseases have been reported to alter the ECG parameters, causing phenomena such as lengthening waves (P, R, S, T), intervals (PR, TP and QRS), tachycardia and ventricular arrhythmia, premature ventricular contractions, bradycardia and high T waves (13-16). Although the birds used in this study were apparently healthy, it cannot be ruled out that some type of pathology could have affected the ECG results. In a study done on birds of prey, a wide variability in the morphology of the P wave in lead III was found [positive in 72.5%, negative in 15.7% and biphasic in 11.8% of the animals] (8). In this study, the P wave was always positive in leads I, II, III and aVF, negative in aVR, an positive in 60% of the animals and negative in 40% in aVL. It was also observed that T and P waves were fused or superimposed in 17.6% of the animals (3 of 17 animals) in leads II, III and aVF, and in the majority of recorded ECGs the Q and R waves were absent or too small to be measured. Finally, it is possible to conclude that a very good quality ECG tracing was obtained when doing the procedure under general anesthesia with Isoflurane (Table 4). Additionally, the results were similar to those reported in the study done by Nap et al (4) with reference to the duration of P, QRS and T waves, heart rate and electric axis, while the amplitude of P, QRS and T waves was lower in our study. However, these differences can be due to the conditions of each study; in the Nap et al (4) study, Amazona ochrocephala, A. amazónica and A. festiva parrots were used, while in this

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causado por movimientos del animal o de los electrodos. Además durante todo el estudio no se presentó ninguna complicación durante la anestesia y los efectos postquirúrgicos fueron mínimos (emesis e hipotermia). En cuanto al registro electrocardiográfico, las diferencias más significativas comprenden fenómenos como la superposición de las ondas T y P, la presencia de la onda Ta, la ausencia de ondas Q y R en algunas ocasiones, los complejos QRS y segmentos ST cortos o ausentes. Tanto la presentación como el tamaño y calidad de las deflexiones registradas en el ECG varían en cada derivada y en cada animal. En la derivada I la mayoría de animales presentaron un trazado isoeléctrico con deflexiones muy pequeñas y complejos QRS difíciles de definir. La derivada aVL fue la más homogénea entre todos los animales, presentando un trazado regular, de buena calidad y con la mayoría de las deflexiones presentes y fáciles de medir. En cuanto a las deflexiones, la onda P en todas las derivadas fue demasiado pequeña haciendo difícil realizar una medición confiable, mientras que la onda R fue difícil de obtener en la mayoría de las derivadas bipolares, pero no siendo así en las derivadas unipolares aumentadas en donde su registro fue frecuente. La onda S estuvo ausente o fue difícil de distinguir en las derivadas aVR y aVL, mientras que en las demás derivadas se identificó fácilmente. Solo dos aves (en derivada I y aVL) no graficaron ninguna deflexión que representara la despolarización ventricular (onda R o S). Por otro lado, la onda T estuvo presente en todas las derivadas en casi la totalidad de los animales examinados. Así como en otras especies, se ha reportado que enfermedades infecciosas y no infecciosas pueden alterar los parámetros electrocardiográficos causando fenómenos como la ampliación de ondas (P, R, S, T), intervalos (PR, TP y QRS), taquicardias y arritmias ventriculares, contracciones ventriculares prematuras, bradicardia y ondas T altas (13-16). Aunque las aves utilizadas en el presente estudio estaban aparentemente sanas, no se puede descartar algún tipo de patología que pudiera alterar los resultados del ECG. En un estudio realizado en aves rapaces se encontró una gran variabilidad en la morfología de la onda P en derivada III [positiva en el 72.5%, negativa en el 15.7% y bifásica en el 11.8% de los animales] (8). En el presente estudio se observó que la onda P fue siempre positiva en las derivadas I, II, III y aVF, negativa en aVR y positiva en el 60% de los animales y negativa en el 40% en aVL. También se observó el fenómeno de fusión o superposición de ondas T y P en el 17.6% de los animales (3 de

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Table 4. Range comparison for ECG references in Amazona ochrocephala. Parameter

Range Amazona spp Range Amazona Nap et al (4) ochrocephala (lead II)

Wave duration P

0.008-0.07 s

0.015-0.044 s

Wave amplitude P

0.25-0.60 mV

0.031-0.6 mv

Duration PR

0.042-0.055 s

0.021-0.076 s

Duration QRS

0.010-0.015 s

0.036-0.068 s

Amplitude R

0.00-0.65 mV

0.034-0.038 mv

Amplitude S

0.70-2.30 mV

0.19-0.81 mv

Duration QT

0.048-0.070 s

0.070-0.154 s

Wave duration T

0.020-0.035 s

0.025-0.064 s

Wave amplitude T

0.30-0.80 mV

0.010-0.5 mv

EEM

-107° to -90°

-111° to -80°

340-600 ppm

240-600 ppm

study only Amazona ochrocephala parrots were included, and the conditions of altitude and pressure were not the same in each case, which can affect the parameters. This study aspires to make more information available about ECGs in Amazona birds in order to facilitate the clinical practice of this important diagnostic tool and thus contribute to the study of physiology and pathologies of the cardiovascular system in these birds. Acknowledgments To the Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres (URRAS), la Clínica para Pequeños Animales (CPA) of the Universidad Nacional de Colombia-Bogotá, Dr. Milena Lamprea, Dr. Ángela Bermúdez and Dr. José Luis Granados for their participation in this study and for sharing their knowledge with us.

17 animales) en las derivadas II, III y aVF y en la mayoría de registros electrocardiográficos las ondas Q y R fueron ausentes o demasiado pequeñas para medirlas. Finalmente es posible concluir que se obtuvo un trazado electrocardiográfico de muy buena calidad al realizar el procedimiento bajo anestesia general con Isoflurano (Tabla 4). Adicionalmente los resultados obtenidos fueron similares a los reportados en el estudio de Nap et al (4) en lo que se refiere a la duración de ondas P, QRS y T, frecuencia cardiaca y eje eléctrico, mientras que la amplitud de ondas P, QRS y T fue menor en nuestro estudio. Sin embargo estas diferencias pueden deberse a las condiciones propias de cada estudio; en el estudio de Nap et al (4). se utilizaron loras de la especie Amazona ochrocephala, A. amazónica y A. festiva, mientras que en el presente estudio solo se incluyeron individuos de la especie Amazona ochrocephala, además las condiciones de altitud y presión no fueron las mismas en cada caso lo cual puede afectar los parámetros. Con este estudio se espera ampliar la información existente sobre la electrocardiografía en aves del género Amazona para así facilitar la práctica clínica de ésta importante herramienta diagnóstica y contribuir así al estudio de la fisiología y patologías del sistema cardiovascular en estas aves. Agradecimientos A la Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres (URRAS), la Clínica para Pequeños Animales (CPA) de la Universidad Nacional de Colombia-Bogotá, la Dra. Milena Lamprea, la Dra. Ángela Bermúdez y al Dr. José Luis Granados por su colaboración en el estudio y aportarnos parte de su conocimiento.

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):5046-5052, 2015. ISSN: 0122-0268 CLINICAL CASE

Fatal parasitosis in blackbucks (Antilope cervicapra): a possible factor risk in hunting units Parasitosis fatal en el antílope negro (Antilope cervicapra): un posible factor de riesgo en unidades de cacería Ned de la Cruz-Hernández,1 M.Sc, Edgar López-Acevedo,1 M.Sc, Lorena Torres-Rodríguez,1 M.Sc, Gabriel Aguirre-Guzmán,1* Ph.D. Universidad Autónoma de Tamaulipas, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Km 5 Carretera Victoria-Mante, Ciudad Victoria, Tamaulipas, México. *Correspondence: gabaguirre@uat.edu.mx 1

Received: April 2014; Acepted: February 2015.

ABSTRACT In February 2012, a reproductive group of 60 adult blackbucks (Antilope cervicapra) from Veracruz, Mexico was relocated to hunting units in eastern and northeastern Mexico. Seven individuals died due to hemorrhagic parasitic, abomasitis and enteritis caused by Haemonchus spp., Setaria spp., and Trichostrongylids. Deaths were associated with hepatic necrosis, bilateral congestive distention of heart and fibrinonecrotic bronchopneumonia. Also Anaplasma marginale was identified. The blackbucks’ population displayed a general mortality rate of 11.67%, where 25% of total male and 9.62% of total female died. The mortality was controlled by segregation of all remaining blackbucks and the treatment for internal and external parasites (biting flies and ticks). After the treatment, no fatality cases related to parasitosis were recorded. The results presented here exhibit the high relevance of parasitosis as possible factor risk in the survival of tis specie. Key words: Anaplasma marginale, antelope, diseases, hunting, parasite, trichostrongylids (Source:CAB).

RESUMEN En febrero del 2012, un grupo de 60 individuos adultos reproductivos de antílope negro (Antilope cervicapra) provenientes de Veracruz, México fueron reubicado en unidades de cacería del este y noreste de este país. Siete individuos murieron presentando hemorragias parasíticas, abomasitis y enteritis ocasionadas por Haemonchus spp., Setaria spp. y Trichostrongylids. Las muertes estuvieron asociadas con necrosis hepática, distensión congestiva del corazón y bronconeumonía fibronecrótica, donde Anaplasma marginale fue identificada. La población de antílopes negros mostró un porcentaje de mortalidad del 11.67%, en donde el 25 y 9.62% de los machos y hembras totales murieron. La mortalidad fue controlada mediante el aislamiento de los antílopes negros restantes y un tratamiento contra parásitos internos y externos (garrapatas y moscas picadoras), lo cual controló las mortalidades y reveló la importancia de la parasitosis como factor de riesgo que afecta la sobrevivencia de esta especie. Palabras claves: Anaplasma marginale, antílope, caza, enfermedad, parásitos, trichostrongylids, (Fuente:CAB).

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INTRODUCTION

INTRODUCCION

The blackbucks (Antilope cervicapra) are indigenous to the Indian subcontinent where their population has decreased for excessive hunting and loss of their natural habitat (1,2). The population of this specie is expected to decline in the next decade and a become vulnerable or threatened.

Los antílopes negros (Antilope cervicapra) son nativos del subcontinente Indio, en donde su población ha disminuido por exceso de caza y pérdida de su hábitat natural (1,2). En la próxima década, se espera que haya un descenso de la población hasta que esta especie se convierta en vulnerable y amenazada.

In Mexico (Figure 1) as in other countries, blackbuck has been introduced in hunting units, where they have increased their populations rapidly and have produced important economic resources as an exotic hunt product (1,3). Low information about the parasites diseases of exotic blackbucks in hunting units has been little studied (4). Some parasites as Amphistoma sp., Camelostrongylus mentulatus, Haemonchus contortus, Neospora caninum, Nematodirus spathiger, Oesophagostomum sp Strongyle sp., Strongyloides sp., Trichostrongylus axei, T. colubriformis, T. probolurus, Toxoplasma gondii and Trichuris have been identified and associated with disease and mortality of A. cervicapra (4-6). In Mexico, only one survey has been carried out involving a hunting unit with free-ranging blackbuck populations (7). Thus, the objective of this study was to describe a fatal parasitic disease associated with respiratory lesions in a hunting unit with free-ranging blackbucks re-located in northeastern, Mexico.

En México (Figura 1) como en otros países, el antílope se ha introducido en unidades de cacería, en donde su población aumenta rápidamente y produce grandes recursos económicos como un producto de cacería exótica (1,3). Existe poca información sobre los estudios acerca de las enfermedades parasitarias de los antílopes exóticos en las unidades de cacería (4). Se han identificado algunos parásitos como Amphistoma sp., Camelostrongylus mentulatus, Haemonchus contortus, Neospora caninum, Nematodirus spathiger, Oesophagostomum sp., Strongyle sp., Strongyloides sp., Trichostrongylus axei, T. colubriformis, T. probolurus, Toxoplasma gondii y Trichuris y se han relacionado con la enfermedad y la mortalidad de A. cervicapra (4-6). En México, se ha llevado a cabo solamente una investigación que involucra una unidad de cacería con poblaciones de antílopes negros criados en libertad (7). Así, el objetivo de este estudio fue describir una enfermedad parasitaria fatal relacionada con lesiones respiratorias en una unidad de cacería con antílopes re ubicados y criados en libertar en el noreste de México.

CASE HISTORY Clinical findings. In February 2012, a group of 60 adult blackbucks (8 males and 52 females, 37-42 kg) was translocated for reproduction from the State of Veracruz, Mexico to a hunting unit with free-ranging animals in Padilla, Tamaulipas, Mexico (Figure 1). This area is located in the coordinates 24°03’N and 98°37’W and show 153 MASL, an average annual rainfall of 700 mm and an average annual of 22°C (ranging from 1 to 43°C). Two weeks post-introduction to the grassland, seven blackbucks (two males and five females) presented an acute clinical history related with abdominal pain, feces with abundant mucus, hair loss, pale membranes (anemia), progressive wasting, prostration, seborrhea, skin lesions due to fly-bites, and weakness; however, the animals did not present fever. These clinical signs lasted for one week before the death of the blackbucks. Pathological analysis. Dead animals were transported to the Pathology Laboratory of Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia of

HISTORIA DEL CASO Resultados clínicos. En febrero del 2012, se trasladó un grupo de 60 antílopes negros (8 machos y 52 hembras, 37-42 kg) para su reproducción desde el estado de Veracruz, México hasta la unidad de cacería con animales criados en libertad, en Padilla, Tamaulipas, México (Figura 1). Esta área está localizada en las coordenadas 24°03’N y 98°37’O y a 153 msnm (metros sobre el nivel del mar), con un promedio anual de precipitaciones de 700 mm y una temperatura promedio anual de 22°C (rango de 1 a 43°C). Dos semanas después de la introducción al pastizal, siete antílopes negros (dos machos y cinco hembras) presentaron una historia clínica aguda relacionada con dolor abdominal, heces con moco abundante, pérdida de pelo, membranas pálidas (anemia), atrofia progresiva, postración, seborrea, lesiones de la piel debidas a picaduras de mosca, y debilidad; sin embargo, los animales no presentaron fiebre. Estos síntomas clínicos continuaron por una semana, antes de la muerte de los antílopes.

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Figure 1. Growth of hunting units in Mexico from 1998 to 2013 and States of Mexico (Coahuila, Durango, Estado de México, Guanajuato, Hidalgo, Nuevo León, Puebla, Querétaro, San Luis Potosi, Sonora, Tamaulipas and Veracruz) with hunting units of blackbucks (Antilope cervicapra) (2).

the Universidad Autonoma de Tamaulipas for diagnosis as part of the continuing cooperation with productive hunting unit and wildlife agency’ in Mexico (Figure 2a). Pathology evaluation was carried out in the seven blackbucks where main identified gross signs and histopathological lesions from different tissues (brain, hearth, liver, kidney, and tissues form digestive, respiratory and reproductive system) were analyzed according to standard protocol. Samples should be fixed in buffered formalin 10%, processed routinely, embedded in paraffin, sectioned and stained with hematoxylin–eosin stain. In addition, blood samples were collected from the sacrificed animals (lung and heart) and placed immediately on ice. EDTA was used as an anticoagulant and non-coagulated blood was tested, shortly after collection, for packed cells volume, and hemoglobin by microhematocit and spectrophotometry respectively. Also, blood samples were stained with Giemsa. Blood samples were fixed (1 min) in absolute methanol and stained with 10% Giemsa for 30 min. After staining, samples were washed three or four times with tap water to remove adhering stain and then air dried. The samples are examined under oil immersion to increased 700-1000 x.

Análisis patológico. Los animales muertos se transportaron al Laboratorio de Patología de la Facultad de Medicina, Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Tamaulipas para su diagnóstico, como parte de la cooperación continuada con la unidad de cacería productiva y la oficina de vida silvestre en México (Figura 2a). Se llevó a cabo una evaluación patológica de los siete antílopes negros, identificando los principales síntomas masivos y analizando las lesiones histopatológicas de diferentes tejidos (cerebro, corazón, hígado, riñón, y los que forman los sistemas digestivo, respiratorio y reproductivo) de acuerdo con el protocolo estándar. Las muestras se fijaron con formalina tampón al 10%, se procesaron rutinariamente, se mezclaron con parafina, se separaron y se tiñeron con tinte hematoxylina– eosina. Además, se recolectaron muestras de sangre de los animales sacrificados (pulmón y corazón) y se colocaron inmediatamente en hielo. Se usó como anticoagulante EDTA y rápidamente se analizó la sangre no coagulada para medir el volumen de células empacadas o hematocritos y hemoglobina mediante microhematocitos y espectrofotometría, respectivamente. Además, las muestras de sangre se tiñeron con Giemsa al 10% por 30 minutos, después de fijarse (1 min) con metanol absoluto. Después de la tinción, las muestras se lavaron tres o cuatro veces con agua corriente para remover la tintura adherida, luego

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Figure 2. a) Male of Antilope cervicapra with abdominal distension (head arrow), b) Brown atrophy with gelatinous degradation of adipose tissue in coronary artery (head arrow), c) Severe injury to abomasum and edema in mucosal tissue (white arrow), abomasal fluid with high level of blood (white head arrow), d) High number of Trichostrongylus spp eggs (head arrow), e) Light micrographs showing a fresh specimen of Setaria spp. from gut and abdominal cavity (head arrow) (4X), and f) Anaplasma marginale (head arrow) as basophilic and spherical inclusions located near the margin of erythrocytes (100X, Giemsa stained).

CLINICAL RESULTS The diseases impact in introduced wildlife species on local wildlife populations has become a recent issue of global priority, which is critical when disease risks involve the livestock industries and human health (1,8-10). The blackbucks (A. cervicapra) were introduced to Mexico for their importance as trophy hunting. The study population in the hunting unit consisted of 60 adult blackbucks (8 studs male and 52 reproductive females). The general mortality rate was 11.67%, but the sex-specific mortality rates were 25% (n=2) and 9.62% (n=5) for male and female, respectively.

se secaron con aire y se examinaron con aceite de inmersión para aumentos de 700-1000 x.

RESULTADOS CLINICOS El impacto de las enfermedades de especies de vida silvestre introducidas sobre la poblaciones locales llegó a ser un tema reciente de prioridad mundial, el cual es crítico cuando el riesgo de enfermedad involucra las industrias ganaderas y la salud humana (1,8-10). Los antílopes negros (A. cervicapra) se introdujeron a México por su importancia como trofeo de caza. La población estudiada en la unidad de cacería estaba compuesta por 60 antílopes negros adultos (8 machos y 52

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Blackbucks dead animals presented paleness and jaundice of the mucosal membrane of the oral cavity, also hydrothorax, hydropericardium and ascitis were observed. Both atrophy with gelatinous degradation of adipose tissue in coronary artery, and an injury to abomasum and edema in mucosal tissue were detected (Figure 2b,c). The gross and histopathological lesions were consistent with a hemorrhagic parasitic abomasitis, catarrhal and hemorrhagic enteritis, hepatic necrosis, bilateral congestive distention of heart and fibrinonecrotic bronchopneumonia. Also, a high number of Trichostrongylids eggs were observed (Figure 2d). The examination of abdominal cavity show several parasitic structures, those were removed and identified under light microscopy as compatible with Haemonchus spp., Setaria spp. (Figure 2e), and Trichostrongylids. Consistent with other studies, the total burden of gastrointestinal nematodes was dominated by abomasal parasites characteristic for cattle and wild ruminants, i.e. Haemonchus spp. and Trichostrongylids (4,5,11). Both nematodes cause lesions consistent with injuries presented at necropsy of animals examined. While Setaria spp. not cause injury in to abdominal cavity (12). The presence of endoparasites on blackbucks was 11.67% where a prevalence of 25.6 – 30% for Trichostrongylids and/or Haemonchus spp. were reported for California bighorn (Ovis canadensis califoriniana), Rocky Mountain bighorn (O. canadensis canadensis), white-tailed deer (Odocoileus virginianus) and sambar deer (Cervus unicolor) (9,11,13). Whereas studies and case reports of blackbucks reported prevalences of gastrointestinal nematodes ranging from 65 to 100% (4,5,11). The hematological analysis revealed the presence of icteric animal with low values for packed cell volume and hemoglobin concentration (< 8 g dL1 ) on blood samples; also, Anaplasma marginale (10-15 cells per camp) was detected at light microscopy examination with Giemsa-stained thin blood smears of meningeal and splenic vessels (Figure 2f). A. marginale usually infects cattle however exist reports in wildlife ungulates kept as hunting species by Mexican ranchers infected with this pathogen agent (14-15). This hemoparasite is present in populations of whitetailed deer from the northeast of Mexico where display a reported prevalence from 20.0 to 69.7% (7,15). The ectoparasites found in blackbucks dead animals were B. microplus and H. irritans. Both are consider as vectors for biological and mechanical transmission respectively (14,15,17). Our knowledge this is the first journal report of the presence of Setaria spp. and A. marginale

hembras reproductoras). La tasa de mortalidad general fue del 11.67%, pero la tasa específica por sexo fue del 25% (n=2) y 9.62% (n=5) para machos y hembras, respectivamente. Los antílopes negros muertos presentaban palidez e ictericia en la membrana mucosa de la cavidad oral; además se observó hidrotórax, hidropericardio y ascitis. Se detectó tanto atrofia con degradación gelatinosa de tejido adiposo en la arteria coronaria, como una lesión en el abomaso y edema en el tejido de la mucosa (Figura 2b,c). Las lesiones masivas e histopatológicas eran consistentes con una abomasitis parasitaria hemorrágica, enteritis hemorrágica y catarral, necrosis hepática, distensión congestiva bilateral del corazón y bronconeumonía fibronecrótica. También se observó un alto número de huevos de Trichostrongylidae (Figura 2d). El examen de la cavidad abdominal mostró algunas estructuras parasitarias, las cuales se removieron y se identificaron, con microscopía de luz, como compatibles con Haemonchus spp., Setaria spp. (Figura 2e), y Trichostrongylidae. De acuerdo con otros estudios, la carga total de nematodos gastrointestinales estaba dominada por parásitos abomasales característicos del ganado y rumiantes silvestres, es decir Haemonchus spp y Trichostrongylidae (4,5,11). Ambos nematodos causan lesiones consistentes con las presentadas en la necropsia de los animales examinados. Mientras que Setaria spp. no causa lesiones en la cavidad abdominal (12). La presencia de endoparásitos en los antílopes negros fue del 11.67%, reportándose una prevalencia que oscila de 25.6 a 30% para Trichostrongylidae y/o Haemonchus spp. para el cimarrón californiano (Ovis canadensis califoriniana), el cimarrón de las Montañas Rocosas (O. canadensis canadensis), el venado cola blanca (Odocoileus virginianus) y el ciervo Sambar (Cervus unicolor) (9,11,13). Mientras que los estudios e informes de casos de antílopes negros reportaron prevalencias de nematodos gastrointestinales que varían desde el 65 al 100% (4,5,11). Las muestras de sangre sometidas a análisis hematológicos revelaron la presencia de animal ictérico con bajos valores en la concentración de hematocritos y hemoglobina (< 8 g dL-1). También se detectó Anaplasma marginale (10-15 células por campo) en los vasos meníngeos y esplénicos, mediante un examen con microscopía de luz en frotis delgados de sangre, preparados con la tinción de Giemsa (Figura 2f). El A. marginale usualmente infecta el ganado, sin embargo existen reportes de ungulados de vida silvestre, mantenidos como especies de caza por rancheros mexicanos, infectados con el agente patógeno (14-15). Este hemoparásito existe en poblaciones de venados

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in blackbucks (A. cervicapra) from hunting unit with in free-ranging. Based on the findings of this report, we can hypothesize that blackbucks acquired parasites at their original location at the state of Veracruz, but the relocation process associated with stress, trauma, ticks, fly-bites and malnutrition are considered to have contributed to the death of the animals. Once the diagnosis was reached, the treatment measures were implemented for controlling and eradicating of diseases, and consisted of a strict segregation of all remaining blackbucks from any other animals, application of oxytetracycline (1 mL per 10 kg body weight) and oral Ivermectin (22,23-dihydroavermectin B1a+22,23-dihydroavermectin B1b9) as treatment against internal and external parasites (biting flies and ticks). After these measures were carried out, no further fatality cases were present in blackbucks (A. cervicapra) for this hunting unit. In conclusion the present case represents the first report of the presence of Setaria spp. and A. marginale in blackbucks (A. cervicapra) from hunting unit with in free-ranging. This findings may involve the blackbuks as reservoirs for A. marginale because exist the appropriated vectors for biological and mechanical transmission (14,15,17) Additionally, this case indicated the importance of monitoring levels of parasitic infection in hunting units or their respective freeranging and may invite a more comprehensive study into the epidemiology, pathogenesis, treatment and prophylaxis of parasite diseases in wild mammals and their possible relation with domestic organisms. Acknowledgments The study was supported by Universidad Autonoma de Tamaulipas. The publication of this paper was supported by the Fondo Mixto de Fomento a la Investigación Científica y Tecnológica CONACYT - Gobierno del Estado de Tamaulipas (México).

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cola blanca procedentes del noreste de México, mostrando una prevalencia reportada del 20.0 al 69.7% (7,15). Los ectoparásitos encontrados en los antílopes negros muertos eran B. microplus y H. irritans. Ambos son considerados vectores para la transmisión biológica y mecánica respectivamente (14,15,17). En nuestro conocimiento este es el primer informe de la actividad de Setaria spp. y A. marginale en antílopes negros (A. cervicapra) procedentes de unidades de cacería con crianza en libertad. Basados en las conclusiones de este informe, podemos plantear la hipótesis de que los antílopes adquieren los parásitos en sus lugares de origen, en el estado de Veracruz, y se considera que el proceso de reubicación relacionado con estrés, trauma, garrapatas, picadura de moscas y mala nutrición ha contribuido a la muerte de los animales. Una vez obtenido el diagnóstico, se implementaron medidas para el tratamiento, con el fin de controlar y erradicar las enfermedades. Estas medidas consistieron en una separación estricta de todos los antílopes negros restantes de los otros animales, aplicación de oxytetracyclina (1 mL por 10 kg de peso corporal) e Ivermectina oral (22,23-dihydroavermectina B1a + 22,23-dihydroavermectina B1b9) como tratamiento contra los parásitos internos y externos (moscas y garrapatas). En estas unidades de cacería no se presentaron más casos fatales de antílopes negros (A. cervicapra), después de que se implementaran estas medidas. En conclusión, este caso representa el primer informe de la presencia de Setaria spp. y A. marginale en antílopes negros (A. cervicapra) procedentes de unidades de cacería con crianza en libertad. Estos resultados implican que los antílopes pueden ser depósitos de A. marginale, ya que existen los vectores apropiados para su transmisión biológica y mecánica (14,15,17). Adicionalmente, este caso demostró la importancia de supervisar los niveles de infección parasitaria en las unidades de cacería o en sus respectivos lugares de crianza en libertad y podrían invitar a un estudio exhaustivo de la epidemiología, patogénesis, tratamiento y profilaxis de las enfermedades parasitarias en mamíferos silvestres y su posible relación con microorganismos nativos. Agradecimientos El estudio recibió el apoyo de la Universidad Autónoma de Tamaulipas. La publicación de este documento se realizó con el apoyo del Fondo Mixto de Fomento a la Investigación Científica y Tecnológica CONACYT – Gobierno del Estado de Tamaulipas (México).

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Rev.MVZ Córdoba 20(Supl):5053-5067, 2015. ISSN: 0122-0268 LITERATURE REVIEW

Importance of ticks in the transmission of zoonotic agents Importancia de las garrapatas en la transmisión de agentes causantes de zoonosis Oscar Betancur H,1* Ph.D, Antonio Betancourt E,2 Ph.D, Cristian Giraldo R,2 MVZ. Elanco Animal Health, Transversal 18 No 96-41. Piso 6, Bogotá D.C., Colombia. 2Investigador independiente. *Correspondence: betancur_oscar_jaime@elanco.com 1

Received: March 2015; Acepted: July 2015.

ABSTRACT The pathogens transmitted by ticks to human beings are a motive of public health concern around the world, such is the case of Lyme disease in the northern hemisphere, Encephalitis virus in Europe, the recurrent fevers and the Rocky Mountains spotted fever, better known in Colombia as “Tobia Fever”. People of all economic and social conditions are prone to develop a zoonotic agent transmitted by these vectors, which could be infected by several pathogens through co-infection mechanisms. The epidemiology and prevalence of these diseases are affected by ecological, climatic and anthropogenic factors. All these factors, affect in a different manner the enzootic cycle between pathogens, ticks and wild hosts. Current molecular diagnostic tools have allowed to progress in pathogen identification, previously unknown or undetermined. The government intervention capacity of each country, and the multidisciplinary professional cooperation, especially from physicians and veterinarians, is fundamental in order to strategically implement control and prevention plans that can deal with this problematic. The present article aims to make a thorough review of the factors which are favoring the transmission of zoonotic agents by ticks, contextualizing the most important aspects that determine their prevalence, and the most relevant control and prevention measures. Key words: Diseases, hosts, pathogens, public health, vectors (Sources: CAB, IEDCYT).

RESUMEN Los patógenos transmitidos por garrapatas a los seres humanos son motivo de preocupación para la salud pública alrededor del mundo; tal es el caso de la enfermedad de Lyme en el hemisferio norte, el virus de la encefalitis en Europa, las fiebres recurrentes y la fiebre manchada de las montañas rocosas, conocida en Colombia como la “Fiebre de Tobia”. Las personas de todas las condiciones económicas y sociales son susceptibles de contraer un agente zoonótico transmitido por estos vectores, pudiendo ser infectadas incluso por varios patógenos a través de mecanismos de coinfección. La epidemiología y la prevalencia de estas enfermedades se ven afectadas por factores ecológicos, climáticos y antropogénicos. Todos estos factores comprometen de diferente manera el ciclo enzoótico entre patógenos, garrapatas y hospederos silvestres. Las herramientas actuales de diagnóstico molecular han permitido avanzar en la identificación de patógenos anteriormente desconocidos o indeterminados. La capacidad de intervención de los gobiernos de cada país, y la cooperación multidisciplinaria de profesionales, especialmente de médicos y veterinarios es fundamental para implementar planes 5053

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de control y prevención estratégicos que enfrenten esta problemática. El presente artículo pretende hacer una amplia revisión de los factores que están favoreciendo la transmisión de agentes causantes de zoonosis por las garrapatas, contextualizando los aspectos más importantes que determinan su prevalencia, y las medidas de prevención y control relevantes. Palabras clave: Enfermedades, hospedadores, patógenos, salud pública, vectores (Fuentes: CAB, IEDCYT). INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Zoonoses are diseases and infections naturally transmitted between vertebrate animals and humans. The transmission can be direct, or indirect, by means of vectors (1). Close to 60% of pathogens recognized as causing human disease are zoonotic (2) and the amount of diseases of this type tend to increase (3).

Las zoonosis son enfermedades e infecciones naturalmente transmitidas entre animales vertebrados y humanos. La transmisión puede ser directa, o indirecta a través de vectores (1). Cerca del 60% de los patógenos reconocidos como causantes de enfermedad humana son zoonóticos (2), y la cantidad de enfermedades de este tipo tiende a aumentar (3).

The increase in the appearance of zoonotic pathogens transmitted through ticks is a serious threat to public health worldwide, due to its morbidity and mortality in humans (4). Those of special concern are those that appear for the first time in a population (emergent), or those that have existed and have been labeled under control or extinct, but that quickly increase their prevalence (re-emerging) (2,3). Due to the impact of these diseases on the human population for many decades, the World Health Organization (WHO) and the Pan American Health Organization (PAHO) have formulated guidelines and recommendations in order to advise countries about control of zoonoses (5). According to Vega (3), it is difficult to know the precise situation of the zoonoses in Colombia because there is no monitoring system designed for such ends; only the casuistry of some zoonoses that are considered priority to the country is gathered; besides, many of the reports of infection are based on the detection of antibodies and, thus, should be considered with caution. In the present review it is intended to contextualize the factors that facilitate the transmission of tick-borne zoonotic agents, and the key factors that determine its prevalence, as well as the most relevant measures of prevention and control. Ticks as vectors of zoonotic agents. Only after mosquitos, ticks are considered to be the most important vectors of infectious agents worldwide (6). They are found thoroughly distributed, but their prevalence is greater in countries with warm and humid climates (7). The majority of species of ticks occupy habitats such as forests, savannahs, grasslands and

El incremento en la aparición de patógenos zoonóticos transmitidos por garrapatas es una seria amenaza para la salud pública en todo el mundo, por su morbilidad y mortalidad en seres humanos (4). Son de especial importancia aquellas que aparecen por primera vez en una población (emergentes), o aquellas que han existido y se han considerado bajo control o extintas y que rápidamente incrementan su prevalencia (reemergentes) (2, 3). Debido al impacto de estas enfermedades en la población humana, desde hace algunas décadas, la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Organización Panamericana de la Salud (OPS) han formulado directrices y recomendaciones para orientar a los países en el control de las zoonosis (5). Según Vega (3), es difícil conocer la situación exacta de las zoonosis en Colombia porque no hay un sistema de vigilancia diseñado para tal fin; sólo se recoge la casuística de algunas zoonosis, consideradas prioritarias para el país; además, muchos de los reportes de infección, son basados en detección de anticuerpos y, por lo tanto, deben ser tomados con cautela. En la presente revisión se pretende contextualizar sobre los factores que favorecen la transmisión de agentes causantes de zoonosis por las garrapatas, y los aspectos de mayor importancia que determinan su prevalencia, así como las medidas de prevención y control de mayor relevancia. Las garrapatas como vectores de agentes causantes de enfermedades zoonóticas. Las garrapatas se consideran, después de los mosquitos, los vectores más importantes de agentes infecciosos en todo el mundo (6). Se encuentran ampliamente distribuidas, pero la prevalencia es mayor en países con climas cálidos y húmedos (7). La mayoría de especies de garrapatas ocupan hábitats como bosques, sabanas, pastizales y matorrales, en los

Betancur - Importancia de las garrapatas en las zoonosis

scrublands, in which they can survive long periods of time until they find a host on which to feed (8). Ticks are arthropods belonging to the Arachnid class (9). They are a diverse group, with at least 896 recognized species, distributed into three families: Argasidae or “soft ticks” (193 spp), Ixodidae or “hard ticks” (702 spp), and only one species belonging to the Nuttalliellidae family (10). T i c k s a r e i m p o r t a n t ve c t o r s o f va r i o u s pathogenic bacteria, such as protozoans and viruses that cause diseases in animals and humans (11). These microorganisms have evolved to take advantage of the life cycle of ticks, using them as a means to disperse from one vertebrate host to another (8). The life cycle of ticks, which include consumption of host blood, the secretion of saliva into the tissue of the host, the movement between different hosts, and the production of eggs from which a new generation of ticks develops that inevitably makes them an adequate home for other organisms (12). Transmission of pathogens. Some species of ticks can transmit pathogens from wild animals (for example, rodents) to humans (9); the transmission can also be made through domestic animals (7). The risk of transmission is determined by the prevalence of ticks in the environment and by the probability of an encounter between an infected tick and a susceptible host (9). The transmission of pathogens requires, in the first place, that during feed-uptake, the tick acquires the pathogens of an infected vertebrate host (13). Ticks also can transmit infectious agents from an infected tick to another by co-feeding at the same site in the host, even when the latter is not infected (14); transovarial and/or trans-stadial transmission is an important trait (15). Evolutionally, ticks have developed a protective response to limit levels of pathogen infection, which contribute to their survival (16). Secondly, pathogenic agents must survive to the development and change between stages of the tick, and become established in the salivary glands of the tick for transmission during the next feeding (13). In this way, some studies indicate that the prevalence of infection in ticks by pathogenic agents is reduced dramatically when there is a change of stage in the tick (15).

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que pueden esperar largos periodos de tiempo hasta encontrar un hospedero para alimentarse (8). Las garrapatas son artrópodos pertenecientes a la clase Arachnida (9). Son un grupo diverso, con al menos 896 especies reconocidas, distribuídos en tres familias: Argasidae o “garrapatas blandas” (193 spp), Ixodidae o “garrapatas duras” (702 spp), y solo una especie perteneciente a la familia Nuttalliellidae (10). Las garrapatas son importantes vectores de varias bacterias patógenas, así como protozoos y virus que causan enfermedades en animales y humanos (11). Estos microorganismos han evolucionado para aprovechar el ciclo de vida de las garrapatas, usándolas como un vehículo para la dispersión de un hospedador vertebrado a otro (8). El ciclo de vida de las garrapatas que incluye el consumo de sangre en los hospedadores, la secreción de saliva en los tejidos del hospedero, el movimiento entre diferentes hospedadores y la producción de huevos a partir de los que se desarrolla una nueva generación de garrapatas, inevitablemente hace que sean adecuadas para albergar otros organismos (12). Transmisión de patógenos. Algunas especies de garrapatas pueden transmitir los patógenos desde animales silvestres (por ejemplo, roedores) a los seres humanos (9); la transmisión también puede darse a través de los animales domésticos (7). El riesgo de transmisión está determinado por la prevalencia de garrapatas en el ambiente y por la probabilidad de un encuentro entre una garrapata infectada y un hospedador susceptible (9). La transmisión de patógenos requiere, en primer lugar, que la garrapata durante la alimentación adquiera los patógenos de un hospedador vertebrado infectado (13). Las garrapatas también pueden adquirir los agentes infecciosos desde una garrapata infectada a otra que no lo está por coalimentación en el mismo sitio en el hospedador, aún cuando este último no se encuentre infectado (14); la transmisión transovárica o transestadial es una propiedad importante (15). Evolutivamente, las garrapatas han desarrollado una respuesta protectiva para limitar los niveles de infección de patógenos, lo que contribuye a su supervivencia (16). En segundo lugar, los agentes patógenos deben sobrevivir al desarrollo y la muda entre estados de la garrapata, y deben establecerse en las glándulas salivales de la misma para su transmisión en la próxima alimentación (13). En este sentido, algunos estudios indican que la prevalencia de la infección de garrapatas por agentes patógenos se reduce drásticamente cuando se produce un cambio de estado (muda) de la garrapata (15).

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Finally, hosts should be competent enough to allow the establishment, the replication and the survival of the infected agents (13). Hosts normally acquire the infection through infected saliva when the ticks are feeding, but in addition, other routes of transmission include infection through the consumption of infected ticks, the manipulation of the tissue of dead infected animals, inhalation, ingestion of non-pasteurized milk and artificial infection through blood transfusion, this latter transmission being of special attention in human and veterinary medicine (12).

Finalmente, los hospederos deben ser competentes para permitir el establecimiento, la replicación y la supervivencia de los agentes infecciosos (13). Los hospedadores adquieren normalmente la infección a través de la saliva infectada durante la alimentación de las garrapatas, pero además, otras rutas de transmisión incluyen la infección por el consumo de garrapatas infectadas, la manipulación post sacrificio de tejidos de animales infectados, la inhalación, la ingestión de leche no pasteurizada y la infección artificial a través de la transfusión de sangre, esta última de especial atención en medicina humana y veterinaria (12).

Many ticks can house two or more infected agents and transmit them simultaneously (14, 17). This phenomenon is especially frequent in the species of tick known as Ixodes ricinus, which has non-specific feeding habits and feeds on a great variety of vertebrate species that are reservoirs for multiple pathogens (18, 19). Alternatively, hosts can be coinfected when bitten by different ticks and at different times (12). Co-infection with multiple pathogens occurs frequently, which causes a serious challenge for adequate diagnosis and treatment (18). On the other hand, even though some pathogens can be transmitted by the same tick (example, Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophilum and Rickettsia helvetica), they have different ecological cycles and transmission patterns that influence the prevalence of the infection in the different life stages of the tick (20).

Muchas garrapatas pueden albergar dos o más agentes infecciosos y transmitirlos de forma simultánea (14, 17). Este fenómeno es especialmente frecuente en especies de garrapatas como Ixodes ricinus, que tienen hábitos alimentarios no específicos y se alimentan de una gran variedad de especies de vertebrados que son reservorios de múltiples patógenos (18, 19). Alternativamente, los hospedadores pueden ser coinfectados por mordeduras de diferentes garrapatas y en diferentes momentos (12). La coinfección con múltiples patógenos se produce con frecuencia, lo que plantea un serio desafío para el diagnóstico y tratamiento adecuado (18). Por otro lado, aunque algunos patógenos puedan ser transmitidos por la misma garrapata (ejemplo, Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophilum y Rickettsia helvetica), tienen diferentes ciclos ecológicos y patrones de transmisión que influyen en la prevalencia de la infección en las diferentes etapas de la vida de una garrapata (20).

Most important pathogens causing tickborne zoonoses. Worldwide, the number of different and epidemiologically important diseases recognized as caused by tick-borne pathogens has considerably increased during the las 30 years (16). For example, Lyme disease in North America and Europe (21); the encephalitis virus transmitted by ticks in Europe and Asia; relapsing fevers in Africa, North America, Europe and Asia (22); and the Rocky Mountain spotted fever in all of the America, known in Colombia as the “Tobia Fever”, all have recorded instances of fatality (23). In Europe, ticks are the principle vectors of zoonotic agents (24), which present a challenge for public health because of its great impact on human health and world economy (8). Some important zoonotic agents transmitted by ticks can be found in tables 1, 2 and 3.

Patógenos causantes de zoonosis más importantes transmitidos por garrapatas. A nivel mundial, el número reconocido de enfermedades distintas y epidemiológicamente importantes causadas por patógenos transmitidos por las garrapatas ha aumentado considerablemente durante los últimos 30 años (16). Por ejemplo, la Enfermedad de Lyme en Norte América y Europa (21); el virus de la encefalitis transmitido por garrapatas en Europa y Asia; las fiebres recurrentes en África, Norte América, Europa y Asia (22); y la fiebre manchada de las montañas rocosas en toda América, conocida en Colombia como la “Fiebre de Tobia”, donde se han presentado casos fatales (23). En Europa, las garrapatas son los principales vectores de agentes causantes de zoonosis (24), lo que representa un reto para la salud pública por el enorme impacto en la salud humana y en la economía en el mundo (8). Algunos agentes zoonóticos importantes transmitidos por garrapatas pueden encontrarse en las tablas 1, 2 y 3.

Betancur - Importancia de las garrapatas en las zoonosis

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Table 1. Zoonotic bacteria transmitted by ticks around the world. ZOONOSIS

TRANSMITTED PATHOGEN

TICK VECTOR

REF

Human granulocytic anaplasmosis

Anaplasma phagocytophilum

Ixodes scapularis Ixodes pacificus, Ixodes persulcatus, Ixodes ricinus

(21)

Ehrlichia chaffeensis

Amblyomma americanum

(22)

E. chaffeensis; E. ewingii

Rhipicephalus sanguineus ?

(17)

Ehrlichia canis

Rhipicephalus sanguineus

(25)

Lyme disease

Borrelia burgdorferi sensu lato

Ixodes spp. (I. scapularis; I. pacificus; I. persulcatus; I. ricinus)

(21,22,26)

Tick-borne African fever

Rickettsia africae

Amblyomma hebraeum, Amblyomma variegatum

(22,27)

Mediterranean spotted fever

Rickettsia conorii

Rhipicephalus sanguineus

(22, 28)

Rocky Mountain spotted fever “Tobia Disease”

Rickettsia rickettsii

Amblyomma cajennense, Dermacentor andersoni, Dermacentor variabilis, Rhipicephalus sanguineus

(9,22)

Q Fever

Coxiella burnetii

More than 40 species of different kinds. Haemaphysalis spp., and Ixodes spp., (of highest prevalence in Europe), and Rhipicephalus spp., Amblyomma spp., and Dermacentor spp., of highest prevalence in America.

(22,29)

Relapsing fever

Borrelia spp.

Ornithodorus spp.

(22)

Tularemia

Francisella tularensis

Dermacentor andersonii, D. variabilis, D. occidentalis, and Amblyomma americanum

(9)

Human monocytic ehrlichiosis

Table 2. Zoonotic viruses transmitted by ticks around the world. Powassan encephalitis

Flavivirus

Ixodes spp. (I. cookei, I. marxi, I. spinipalpus, I. persulactus), Dermacentor spp. (D. andersoni, D. silvarum), y Haemaphysalis sp (H. longicornis)

(1)

Tick-borne encephalitis

Flavivirus

Ixodes spp. (I. ricinus; I. persulcatus)

(1,22)

Kyasanur forest disease

Flavivirus

Haemaphysalis spinigera

(1,22)

Colorado tick fever

Coltivirus

Dermacentor andersoni

(22,30)

Omsk hemorrhagic fever

Flavivirus

Dermacentor marginatus, D. reticulatus, Ixodes persulcatus

(1,22)

Crimean-Congo haemorrhagic fever

Nairovirus

Hyalomma marginatum

(22,31)

Thrombocytopenia syndrome with severe fever

Flebovirus

Haemaphysalis longicornis

(32)

Langat Virus

Flavivirus

Ixodes granulatus, I. persulcatus; Haemaphysalis papuana

(1)

Tyuleniy Virus

Flavivirus

Ixodes uriae

(1)

Babesia microti

Ixodes scapularis

(21, 33)

B. divergens; B. venatorum (EU1-3), B WA1, B MO1, B CA1, B TW1

Ixodes ricinus Ixodes scapularis

(33)

Table 3. Zoonotic parasites transmitted by ticks around the world.

Babesiosis

REF: reference

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Ecological factors associated with tickborne zoonotic agents (TBZA). TBZAs typically appear because of interference in circulation between animals, wild reservoirs and ticks (12). Even though it is considered that wild animals are the principle reservoirs of various pathogens that cause disease in humans, for some TBZAs, domestic animals can eventually become important reservoirs for human pathogens (34). The displacement of ticks is limited, and they cannot be displaced over great distances without the help of a vertebrate that acts as a mechanical vector with which ticks can cross natural boundaries and be dispersed over mountain chains, islands and bodies of water (35); ticks also colonize new territories when mechanical vectors are introduced by humans in new areas (12). After arriving to a new territory, the survival of the ticks is limited by the presence of other competitors, predators and the availability of hosts (35). The most competent natural reservoirs for some tick-borne pathogens are hosts that tend to have high population densities and rapid life cycles (36); such as rodent and birds (20). In the same way, rodents constitute one of the most important hosts for ticks, especially for larvae and nymphs. Nonetheless, the microclimatic conditions of a particular zone can affect contact between ticks and rodents, which can influence the selection of new hosts (37). For their part, birds have be found to be carriers of some species of ticks (16), in which case migratory birds are particularly important, since the presence of Bartonella spp. (38), Anaplasma sp., Borrelia sp., and Rickettsia sp., have already been proven in ticks obtained from birds (39). Birds are not simple mechanical vectors; they can develop an infection, which converts them into active pathogen hosts, for example, the developing of bacteremia such as Rickettsia helvetica and Anaplasma phagocytophilum. The prevalence of tick-borne infestations in birds is associated to a large degree with the habit of ground feeding (40). Birds have great epidemiological importance due to the fact that they can fly great distances in the course of only a few days (40). Epidemiologic potential is greater because of horizontal transmission of TBZAs between birds that share ecological niches (39).

Factores ecológicos asociados a los agentes zoonóticos transmitidos por garrapatas (AZTG). Los AZTG típicamente se presentan por una interferencia en la circulación entre los animales, reservorios silvestres y las garrapatas (12). Aunque se considera que los animales silvestres son los principales reservorios de varios patógenos que causan enfermedades humanas, para algunos AZTG, los animales domésticos pueden eventualmente emerger como reservorios importantes para patógenos humanos (34). La capacidad de desplazamiento de las garrapatas es limitada, y no pueden hacerlo por grandes distancias sin la ayuda de un vertebrado que actúe como vector mecánico, con los cuales las garrapatas pueden atravesar barreras naturales para la dispersión, como cadenas montañosas, islas o cuerpos de agua (35); las garrapatas también colonizan nuevos territorios cuando los vectores mecánicos son introducidos en nuevas áreas por los seres humanos (12). Después de llegar a un nuevo territorio, la supervivencia de las garrapatas se ve limitada por la presencia de otros competidores, de depredadores y la disponibilidad de hospedadores (35). Los reservorios naturales más competentes para algunos patógenos transmitidos por garrapatas son hospedadores que tienden a tener altas densidades de población y ciclos de vida rápidos (36); como roedores y aves (20). En ese mismo sentido, los roedores constituyen uno de los hospedadores más importantes para las garrapatas, especialmente para las larvas y las ninfas. No obstante, las condiciones microclimáticas de una zona en particular pueden afectar el contacto entre garrapatas y roedores, lo que puede predisponer a la selección de nuevos hospedadores (37). Por su parte, las aves han sido conocidas como portadores de algunas especies de garrapatas (16), lo que cobra especial importancia en el caso de las aves migratorias, ya que se ha comprobado la presencia de Bartonella spp. (38), Anaplasma sp., Borrelia sp., y Rickettsia sp., en garrapatas obtenidas de las aves (39). Las aves no son simples vectores mecánicos; éstas pueden desarrollar una infección, lo que las convierte en hospederos activos de los patógenos, por ejemplo, el desarrollo de bacteremia por Rickettsia helvetica y Anaplasma phagocytophilum. La prevalencia de la infestación por garrapatas en las aves está asociada en gran medida con el hábito de alimentación en el suelo (40). Las aves tienen una gran importancia epidemiológica debido a que pueden volar grandes distancias en el curso de unos pocos días (40). El potencial epidemiológico es mayor por la posibilidad de transmisión horizontal de los AZTG entre aves que comparten nichos ecológicos (39).

Betancur - Importancia de las garrapatas en las zoonosis

The increase in interaction between wild and domestic animals has increased the transmission of ticks to humans (7). In regards to canines, they can serve as reservoirs for human pathogens, as definitive hosts or mechanical transporters of ticks, and as sentinel indicators of regional disease risk (9). Although the majority of species of ticks are of a singular host, the introduction of infected larvae and nymphs to a home can cause the transmission of pathogens to humans after the tick’s change of stage inside the house. On the other hand, the introduction of an engorged female can facilitate the establishment of a population of ticks inside the home, some of which are able to successfully adapt to the conditions of human residences (as R. sanguineus) (34). Anthropogenic factors associated with TBZAs. One would think that humans were one of the most common food sources for ticks having in mind the huge size of human population in the world, its great density in some areas, and the size of a human adult’s body; however, they are not important reservoirs for TBZAs, although ticks can potentially cause sickness in a great number of individuals, such episodes typically are an accident (12). Over a long period of time, all countries have experienced important changes in their epidemiological profile as a result of social, economic and cultural transformations (5). In recent years, many factors have changed the interactions between humans, animals and the environment, which has caused the emergence and re-emergence of many diseases (7). The appearance of AZTGs is becoming an increasing problem due to the intensification of migrations of humans and animals, and environmental changes (18). In effect, human populations are growing and expanding in new geographic areas, invading wild ecological niches and facilitating the transmission of pathogens to humans (41). The emergence of tick-borne zoonotic diseases is associated with changes in the use of the soil, which obligate pathogens and ticks to find new transmission mechanisms associated with humans; on the other hand, the population’s social economic conditions also facilitate the emergence of these diseases; the risk is greater for people with high and low incomes than those of the middle class. For example, people of higher income look for country homes near forests (42), or they have the possibility of travelling to previously inaccessible places;

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El aumento de las interacciones de los animales salvajes con los animales domésticos, ha aumentado la transmisión de garrapatas hasta los seres humanos (7). En el caso de los perros, pueden servir como reservorios de patógenos humanos, como hospedadores definitivos o transportadores mecánicos de garrapatas, y como indicadores centinela de riesgo de enfermedad regional (9). Aunque la mayoría de especies de garrapatas son de un solo hospedador, la introducción de larvas y ninfas infectadas en una casa puede provocar la transmisión de patógenos a seres humanos después del cambio de estadío de la garrapata dentro de la casa. Por otra parte, la introducción de hembras ingurgitadas puede permitir el establecimiento de una población de garrapatas dentro de la casa, algunas de las cuales logran adaptarse exitosamente a las condiciones de las viviendas (como R. sanguineus) (34). Factores antropogénicos asociados a los AZTG. Se esperaría que los seres humanos fueran una de las fuentes de alimento más comunes para las garrapatas teniendo en cuenta el gran tamaño de la población humana en el mundo, la alta densidad en algunas áreas, y el tamaño del cuerpo humano adulto; sin embargo, estos no son importantes reservorios de los AZTG y, aunque potencialmente pueden causar enfermedad en un gran número de individuos, tales episodios son típicamente un accidente (12). Todos los países han presentado a lo largo del tiempo, cambios importantes en su perfil epidemiológico, como resultado de las transformaciones sociales, económicas y culturales (5). En los últimos años, muchos factores han cambiado las interacciones entre los seres humanos, los animales y el medio ambiente, lo que ha provocado la emergencia y reemergencia de muchas enfermedades (7). La aparición de AZTG se está convirtiendo en un problema cada vez mayor debido a la intensificación de las migraciones de humanos y animales, y a los cambios ambientales (18). En efecto, las poblaciones humanas están creciendo y expandiéndose en nuevas áreas geográficas invadiendo nichos ecológicos silvestres, facilitando la transmisión de patógenos al ser humano (41). La emergencia de las enfermedades zoonóticas causadas por agentes transmitidos por garrapatas se asocia con cambios en el uso de la tierra, que obligan a los patógenos y garrapatas a encontrar nuevos mecanismos de transmisión asociados con el desarrollo humano; por otro lado, las condiciones socioeconómicas de la población también favorecen la emergencia de estas enfermedades; ésto puede ser mayor en las personas de ingresos altos y bajos que en aquellos con ingresos intermedios. Por ejemplo, las personas de altos ingresos buscan

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in addition, the popularity of out-door activities such as hiking and fishing has increased (14). On the other hand, economically disadvantaged people can be less protected against infection (because of malnutrition or immune suppression). In addition, access to available vaccines for some AZTGs, which are usually expensive, is limited (43). Climatic factors associated with TBZAs. Without a doubt, climate change has a strong impact on the dynamics of infectious diseases (5). Climate directly affects the livelihood of ticks (16) and can also indirectly affect them through the effect it has on vegetation and hosts, as much in terms of abundance as survival (26). Microclimatic variables such as the temperature of ground surface and relative humidity can be crucial in determining the distribution pattern of specific niches and the survival of ticks in a given area (26). The abundance of ticks is greater in lower altitudes, where the climate is warmer. At high altitudes where the temperatures are lower, ticks are less active, which reduces their access to hosts, because of which they can have a lesser probability of survival than ticks in low altitudes (24). The decreased activity of ticks in cold environments lowers pathogen transmission (16). Climate change can facilitate the migration of vertebrate hosts, which permits the spread of ticks and pathogens to new territories (12); because of weather changes, these new areas can be transformed into favorable habitats for ticks (for example, the warmest temperatures in the highest elevations or latitudes) (9). Another point-of-view indicates that, although climate change can result in adequate climate conditions in some places, these zones will remain free of the disease unless all components of the system (host, vector and pathogen) arrive and are simultaneously sustained in these locations during a period of time sufficient for establishing transmission cycles (35). In common with almost all arthropods, development rates of ticks increases with the rise of temperature (13). Specifically, the highest temperatures raise three fundamental aspects: the vector’s bite rate, development rate and the rate of pathogen replication; none the less, frequently they diminish the survival of the vector, especially when it is associated with a lack of humidity (42). The combined effects of temperature and humidity influence the behavior, survival and reproduction of

vivir en casas campestres cerca de bosques (42), o tienen la posibilidad de viajar a lugares previamente inaccesibles del planeta; además ha crecido la popularidad de actividades al aire libre como el senderismo y la pesca (14). Por el contrario, las personas económicamente desfavorecidas pueden estar menos protegidas contra una infección (por desnutrición, inmunodepresión). Sumado a esto, el acceso a las vacunas disponibles para algunos de los AZTG, las cuales suelen ser costosas, es limitado (43). Factores climáticos asociados a los AZTG. Sin duda, el cambio climático incide con fuerza en la dinámica de las enfermedades infecciosas (5). El clima afecta directamente la capacidad de subsistencia de las garrapatas (16); y también puede indirectamente afectarlas por los efectos directos sobre la vegetación y los hospederos, tanto en términos de abundancia como de supervivencia (26). Las variables microclimáticas como temperatura de la superficie del suelo y la humedad relativa pueden ser cruciales para determinar el patrón de distribución de nichos específicos y supervivencia de las garrapatas dentro de un área (26). La abundancia de garrapatas es mayor a menor altitud, donde el clima es más cálido. A grandes altitudes donde las temperaturas son bajas, las garrapatas son menos activas, lo cual reduce el acceso a los hospedadores, por lo que pueden tener una menor probabilidad de supervivencia que las garrapatas a baja altura (24). La menor actividad de las garrapatas en ambientes fríos también disminuye la transmisión de patógenos (16). El cambio climático puede facilitar la migración de los vertebrados hospederos de garrapatas, lo que permite la dispersión de estas y de patógenos a nuevos territorios (12); estas nuevas áreas pueden por efecto de las modificaciones climatológicas, haberse transformado en hábitats favorables para las garrapatas (por ejemplo, las temperaturas más cálidas en las elevaciones más altas o latitudes superiores) (9). Otro punto de vista indica que, aunque el cambio climático podría resultar en condiciones climáticas adecuadas en algunos lugares, estas zonas se mantendrán libres de la enfermedad a menos que todos los componentes del sistema (hospedador, vector, patógenos) lleguen y se sostengan simultáneamente en estos sitios durante el tiempo suficiente para establecer los ciclos de transmisión (35). En común con casi todos los artrópodos, las tasas de desarrollo de las garrapatas incrementan al aumentar la temperatura (13). En concreto, las temperaturas más altas aumentan tres aspectos fundamentales: la tasa de mordedura del vector, la tasa de desarrollo de vectores y la tasa de replicación del patógeno; sin embargo, con frecuencia también disminuyen

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many species of vectors. The same conditions limit the ability of ticks to find hosts in exposed environments (35). In addition, relatively prolonged periods of high temperatures and low humidity can interrupt the enzootic cycle of some tick-borne pathogens, for example that of tick-borne encephalitis (37). Although the impact of climate change has been supported on the basis of the rise in temperature, the potential influence of changes in rainfall patterns has frequently been ignored, even when this could have a greater effect than temperature on the ability of tick populations to establish themselves in new zones (16) Diagnosis. The prevalence or the report of zoonotic diseases from tick-borne pathogens has increased in the past years, in great measure because of advancements made in diagnostic tools, especially in molecular techniques which have permitted laboratories to increase the ability of detecting new pathogens and distinguish between microorganism species and strains (12). Techniques such as the polymerase chain reaction (PCR) have allowed simultaneous identification of different types of viruses, in addition to bacteria that are difficult to grow in traditional culture mediums, or that have been found in samples that have been treated with antibiotics. Nonetheless, the use of serology, cultures and histopathology among others, continue to be tools of vital importance in identifying zoonotic agents (44). However, the diagnostic ability of some countries like Colombia can be limited, where an adequate network of zoonosis detection laboratories that facilitate the adequate process and the confirmation of these diseases is lacking; also, diagnostic and epidemiological methods are unknown (3). In the same way, it is presumed that some cases of zoonosis are processed sub-clinically and thus never diagnosed (45).

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la supervivencia del vector, especialmente cuando se asocia con la falta de humedad (42). Los efectos combinados de la temperatura y la humedad afectan el comportamiento, la supervivencia y reproducción de muchas especies de vectores. Las mismas condiciones limitan la capacidad de las garrapatas de buscar hospedadores en ambientes expuestos (35). Además, periodos de altas temperaturas y baja humedad relativa prolongados en el tiempo pueden interrumpir el ciclo enzoótico de algunos patógenos transmitidos por garrapatas, por ejemplo el del virus de la encefalitis transmitido por garrapatas (37). Aunque el impacto del cambio climático sobre los AZTG se ha sustentado sobre la base del aumento de temperatura, la influencia potencial de los cambios en los patrones de lluvia ha sido frecuentemente ignorada, aún cuando esto puede tener un efecto mayor que la temperatura en la capacidad de las poblaciones de garrapatas de establecerse en nuevas áreas (16). Diagnóstico. La prevalencia o el reporte de las enfermedades zoonóticas causadas por patógenos transmitidos por garrapatas se ha incrementado en los últimos años, en gran medida por los avances en las herramientas de diagnóstico, especialmente de técnicas moleculares que han permitido a los laboratorios ampliar la capacidad de detectar nuevos patógenos, y distinguir entre especies y cepas de microorganismos (12). Técnicas como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) han permitido la identificación simultánea de diferentes tipos de virus, además de bacterias de difícil crecimiento en medios de cultivo tradicionales, o que se encuentran en muestras que han sido tratadas con antibióticos. Sin embargo, la utilización de serologías, cultivos, histopatología, entre otras, siguen siendo herramientas de vital importancia para la identificación de agentes causantes de zoonosis (44).

On the other hand, important advances in epidemiology studies have been made. The use of multivariate analysis has facilitated a better understanding of all the components that are part of the complex cycles involving ticks, reservoirs, and pathogens (35).

No obstante, la capacidad diagnóstica en algunos países como Colombia puede ser limitada, donde se carece de una adecuada red de laboratorios de detección de zoonosis que permita un proceso adecuado y la confirmación de estas patologías. Además, existe un desconocimiento por parte de médicos y veterinarios, de la clínica de estas enfermedades; también se desconocen los métodos de diagnóstico y epidemiológicos (3). Asimismo, es de suponer que algunos de los casos de zoonosis, pueden cursar de manera subclínica y como consecuencia nunca ser diagnosticados (45).

Multi-parametric models have made it possible to predict and estimate changes in geographic distribution areas of ticks (12). The most commonly used strategy for estimating the potential geographic distribution area of a species is the characterization of environmental

Por otro lado se han logrado avances importantes en estudios epidemiológicos. La utilización de análisis multivariados ha permitido una mejor interpretación de todos los componentes que hacen parte de los complejos ciclos entre garrapatas, reservorios, y patógenos (35).

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conditions that are adequate for the species, and later identifying where the right environment exists (16). Although simple predictions about changes in tick abundance can be made, it is necessary to make similar predictions about the availability of appropriate hosts coinciding with the population increase of ticks over space and time (24). Control and prevention. Zoonotic diseases caused by tick-borne pathogens can be difficult to control due to the complex epidemiology that involves different ticks and hosts (34). For this reason, the fundamental tool for control is permanent epidemiological monitoring. Programs for control of these diseases requires the integration of data from veterinary and human information systems, the monitoring of wild animals and tick populations, and teams of experts from various scientific disciplines such as entomology, epidemiology, medicine, public health and veterinary medicine (12). Government agencies in charges of public health are fundamental as a base for information for all epidemiological studies (46). A database has been developed that involves ticks as vectors for zoonotic pathogens within a project financed by the European Union, with the collaboration of SAPUVETNET III, in which not only information about this subject is offered, but predictive maps of geographic distribution of ticks and zoonotic diseases caused by tickborne pathogens (4). Principles, strategies and control and prevention tactics for TBZAs in humans should be adapted to the conditions of each country (3). It is imperative to develop measures of integrated control, which include: vectors control, vaccination programs against tick-borne zoonotic agents, betterment of treatment strategies, improvement of diagnostic and monitoring equipment, and public awareness campaigns (47). The principal method for controlling ticks is the application of chemical compounds. The problem with this is that it requires frequent reapplication, which is a risk to the health of non-objective, incidentally exposed animals (9). On the other hand, the constant reapplication can cause resistance to the compound; in addition, very little is known about the degree to which biocides and their toxic degradation products are accumulated in predators, scavenger birds, and mammals (8); in the same way, a control strategy based exclusively on the use of acaricides, implies risks to humans because of the danger of deposition of pesticide residues in products

Los modelos matemáticos multiparamétricos han permitido hacer predicciones y estimativos sobre los cambios en las áreas de distribución geográfica de las garrapatas (12). La estrategia más común para estimar el área potencial de distribución geográfica de una especie es la caracterización de las condiciones ambientales que son adecuados para la especie, y después identificar dónde existe el ambiente adecuado distribuido en el espacio (16). Aunque se pueden hacer predicciones simples sobre los cambios en la abundancia de garrapatas, es necesario hacer predicciones similares sobre la disponibilidad de los hospedadores competentes coincidiendo con el aumento de población de garrapatas en el espacio y el tiempo (24). Control y prevención. Las enfermedades zoonóticas causadas por patógenos transmitidos por garrapatas pueden ser difíciles de controlar debido a la compleja epidemiología que involucra diferentes garrapatas y hospedadores (34). Por ello la herramienta fundamental de control es la vigilancia epidemiológica permanente. Los programas de control de estas enfermedades requieren la integración de datos de los sistemas de información veterinaria y humana, la vigilancia de los animales salvajes y poblaciones de garrapatas, y equipos combinados de expertos de varias disciplinas científicas como la entomología, epidemiología, la medicina, la salud pública y la medicina veterinaria (12). Las entidades gubernamentales encargadas de la salud pública son fundamentales como base de información para todos los estudios epidemiológicos (46). Se ha desarrollado una base de datos que involucra a las garrapatas como vectores de patógenos que causan zoonosis dentro de un proyecto financiado por la Unión Europea, con la colaboración de SAPUVETNET III, en el cual no solo se ofrece información sobre este tema, sino que se están preparando mapas predictivos para distribución geográfica de garrapatas y enfermedades zoonóticas causadas por patógenos transmitidos por garrapatas (4). Los principios, las estrategias y las tácticas de control y prevención de los AZTG en el hombre deben adaptarse a las condiciones de cada país (3). Es imperativo elaborar medidas de control integrado, que incluyan: el control de vectores, programas de vacunación contra los agentes zoonóticos transmitidos por garrapatas, mejora de las estrategias de tratamiento, mejora de las herramientas de diagnóstico y vigilancia, campañas de sensibilización pública (47). El principal método para controlar garrapatas, es la aplicación de compuestos químicos. El problema es que se requiere de la reaplicación frecuente, lo cual puede representar riesgos para la salud de los animales no-objetivo incidentalmente expuestos (9). Por otra parte, la reaplicación constante puede promover resistencia a los insecticidas; además, se

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and sub-products of animal origin (such as meat, milk and eggs), in addition to being a contaminate to the environment. The direct application of acaricides to vertebrate hosts of ticks reduces the effects on nonobjective species, but should be included in a strategic control plan (48). This plan should include the rotation of products by action mechanisms of their active ingredients and not by their commercial names, for example organophosphate and pyrethroid insecticides alternated with fluazuron as a quitine inhibitor. When also turning to non-chemical control as part of an integrated plan, it becomes and important complementary alternative to chemical compounds; normally they are not toxic to non-objective humans or animals, and reduce the risk of forming resistance. These include the use of natural predators of ticks such as insectivorous birds, unfavorable hosts, parasitoid wasps, nematodes, bacteria and entomopathogenic fungi. The latter in particular have proven to be very effective in controlling all types of ticks: Rhipicephalus (Boophilus spp.), and Amblyomma spp. associated with livestock (8). Human vaccination programs against tickborne zoonotic agents are very effective but have some limitations. On one hand, the cost makes them unavailable to the entire population, making governmental assistance through public health authorities necessary (43); on the other hand, vaccines for the majority of tick-borne pathogens do not exist (32); only some such as tick-borne encephalitis (1) or that of Lyme disease. It is important to understand that vaccination against specific pathogens does not omit the need for other measures to prevent tick bites, being that the vaccine does not give cross protection against other TBZAs (9). Educating pet owners on the implementation of integrated tick control programs could be crucial in reducing the risk of infestation and can decrease the probability of bringing infected ticks into homes. For people who visit or work in environments with tick infestations, the use of tick repellent and acaricide is advised (34). In summary, preventative measures should be taken and strategic short, medium and long-term control plans should be adopted. The most effective preventative measures are: immunoprophylaxis, if a vaccine exists, and use of protective clothing and repellent. In areas that are natural focal points for

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sabe muy poco sobre el grado en que los biocidas y sus productos de degradación tóxicos se acumulan en los depredadores, carroñeros de aves y mamíferos (8); en este mismo sentido, la estrategia de control basada exclusivamente en el empleo de acaricidas químicos, conllevaría riesgos en los humanos por el peligro de deposición de residuos de pesticidas en productos y subproductos de origen animal (carne, leche, huevos), además de ser contaminante del ambiente. La aplicación directa de acaricidas a los hospedadores vertebrados de las garrapatas reduce los efectos a especies no objetivo, pero deben hacer parte de un plan estratégico de control (48). Este plan debe incluir la rotación de los productos por los mecanismos de acción de sus principios activos y no por los nombres comerciales, por ejemplo insecticidas organofosforados y piretroides alternados con fluazurón como inhibidor de la quitina. Cuando adicionalmente se recurre al control no químico como parte de un plan integrado, éste se convierte en una importante alternativa complementaria a los compuestos químicos; normalmente no son tóxicos para los seres humanos y la fauna no objetivo, y reducen el riesgo de resistencia. Estos incluyen el uso de enemigos naturales de las garrapatas como aves insectívoras, hospederos desfavorables, avispas parasitoides, nemátodos, bacterias y hongos entomopatógenos. Estos últimos en particular han mostrado ser muy eficaces para el control de garrapatas de los géneros: Rhipicephalus (Boophilus spp.), y Amblyomma spp. asociadas al ganado (8). Los programas de vacunación en humanos contra los agentes zoonóticos transmitidos por garrapatas, son muy efectivos, pero presentan algunas limitaciones. Por un lado, el costo hace que no sean accesibles para toda la población, siendo necesario el apoyo gubernamental a través de las autoridades de salud pública (43); por otra parte, no existen vacunas para la mayoría de patógenos transmitidos por garrapatas (32); solo algunas como la del virus de encefalitis transmitida por garrapatas (1) o la de la enfermedad de Lyme. Es importante entender que la vacunación contra un patógeno específico no obvia la necesidad de otras medidas para evitar las mordeduras de garrapatas, ya que la vacuna no confiere protección cruzada contra otros AZTG (9). Educar a los dueños de mascotas para que implementen programas integrales de control de garrapatas podría ser crucial para reducir el riesgo de infestación y con ello disminuir la probabilidad de llevar garrapatas infectadas a las viviendas. Para las personas que visitan o trabajan en ambientes infestados de garrapatas se aconseja el uso de repelentes de garrapatas o acaricidas (34). En resumen, se deben tomar todas las medidas de carácter preventivo y adoptar planes estratégicos de

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ticks (such as natural parks, reserves and city suburbs), preventative measures are centered on: establishing barriers for the vector, eliminating feeding sites close to human settlements and applying insecticides to surrounding areas (3). It should be understood that no technique alone is 100% effective; nonetheless, a program should be chosen that integrates various preventative components to maximize protection against TBZAs (9). Research perspectives. The Colombian panorama in terms of epidemiological studies regarding TBZAs is large. Demographic expansion in many cases forces invasion into diverse ecological niches; for this reason, organizations that manage land development plans should consider epidemiological studies of all zones that can be focal points of infection; requiring that investigations are made to facilitate the identification of possible TBZAs and risk factors associated with a particular zone. Activities such as ecotourism, hiking and fishing, among others, can be a risk factor for contracting TBZAs; it is necessary to carry out studies which evaluate risk factors and can implement prevention and control measures in places where these activities are promoted, especially, when the end of the Colombian armed conflict ends in the near future, which will promote in great measure the increase of these forms of entertainment. Multifactorial studies can be carried out in which the effects on TBZAs on climate change in Colombia are considered, having in mind variables such as temperature, relative humidity and rainfall, in addition to current tick species and the availability of native hosts as well as potential said arthropods. Another possible investigation can be made to assess migratory birds that arrive to Colombia and ticks that they carry, where the role that these vertebrates play in the spread of zoonotic diseases caused by tick-borne pathogens in this nation can be established.

control a corto, mediano y largo plazo. Las medidas de prevención más efectivas son: la inmunoprofilaxis, si existe vacuna; uso de ropa protectora y de repelentes. En zonas que son focos naturales de las garrapatas (parques naturales, zonas de reserva, suburbios de las ciudades), las medidas se centran en: establecer barreras para el vector, eliminar sitios de alimentación cercanos al asentamiento humano, aplicar insecticidas en los alrededores (3). Debe entenderse que ninguna técnica por si sola es 100% eficaz; sin embargo, debe elegirse un programa integrado de varios componentes preventivos para maximizar la protección contra los AZTG (9). Perspectivas de investigación. El panorama de Colombia en términos de estudios epidemiológicos referentes a los AZTG es amplio. La expansión demográfica obliga en muchas ocasiones a la invasión de diversos nichos ecológicos; por esta razón las entidades encargadas de los Planes de Ordenamiento Territorial deben considerar estudios epidemiológicos de todas las zonas que puedan ser focos de infección; siendo por lo tanto necesaria la realización de investigaciones que permitan identificar los posibles AZTG y los factores de riesgo asociados a alguna zona en particular. Actividades como el ecoturismo, el senderismo, la pesca, entre otras, pueden ser un factor de riesgo para contraer AZTG; es necesario hacer estudios en lugares en los que se promueven estas actividades donde se evalúen los factores de riesgo y se puedan implementar medidas de prevención y control, sobre todo, cuando en el futuro cercano se vislumbra el final del conflicto armado colombiano, lo que promoverá en gran medida el aumento de éstas formas de entretenimiento. Podrían realizarse estudios multifactoriales en los que se consideren los efectos del cambio climático en Colombia en los AZTG, teniendo en cuenta variables como la temperatura, humedad relativa, pluviosidad, así como las especies de garrapatas presentes y la disponibilidad de hospedadores nativos y potenciales para dichos artrópodos. Otra posibilidad de investigación se presenta en la valoración de las aves migratorias que llegan a Colombia y las garrapatas que portan, donde se pueda establecer el rol que desempeñan éstos vertebrados en las enfermedades zoonóticas causadas por patógenos transmitidos por garrapatas en esta nación.

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(Supl) Diciembre 2015

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Betancur - Importancia de las garrapatas en las zoonosis

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