Revista MVZ Córdoba 20(2) by Revista MVZ Córdoba

Rev.MVZ Córdoba 20(2):4511-4512, 2015. ISSN: 0122-0268

EDITORIAL

Now is the time for the Zika virus El turno ahora es para el virus Zika In April 1947 it was discovered through an experimental animal model a jungle fever. During the experiment, monkeys (macaques) were placed in cages and left exposed in the Zika forest (Uganda); one of the monkeys became ill and died. They filtered postmortem monkey tissues were inoculated into mouse brain and from there, a virus called Zika (ZIKV) was cultured. In 1948 ZIKV was also isolated from mosquitoes Aedes africanus captured in the Zika forest. In 1956 ZIKV transmission in mosquitoes Ae. aegypti was found, as well as a monkey. Between 1968 and 1975, ZIKV was subsequently isolated from humans (Nigeria); 40% of those patients analized by PRNT shown antibodies. The ZIKV is a flavivirus and the same family of viruses of dengue, yellow fever and West Nile. The Zika is a RNA virus closely related to the Spondweni, Ilheus, Rocio and St. Louis encephalitis viruses. Furthermore, immunological studies suggest that ZIKV blocking yellow fever virus viremia in monkeys (1-3). In 2007 Yap, one of the Caroline Islands in the western Pacific Ocean (Polynesia), the ZIKV caused an outbreak that affected more than 20,000 people. The clinical manifestations are similar to patients with dengue and chikungunya. The incubation period is 3-6 days and macular or papular rash, fever, arthritis or arthralgia, nonpurulent conjunctivitis, myalgia and headache are frequent. Fever is self-limited, while the rash is widespread and can reach up to 14 days. The ZIKV apparently does not trigger haemorrhagic disorders such as dengue and chikungunya. Hospitalization is generally not required and no mortality has been reported yet. There is also no vaccine for this virus and treatment is symptomatic. The outbreak on the island of Yap was the first reported outside Africa and Asia and from there jumped to Europe and the Americas (2). Moreover, an important and peculiar epidemiological aspect of ZIKV is that it also can be transmitted through sexual contact (3).

En abril de 1947 se descubrió a través de un modelo experimental animal una fiebre selvática. Durante el experimento, se introdujeron monos (macacos) en jaulas y se dejaron expuestos en el bosque de Zika (Uganda); uno de los monos se enfermó y murió. Filtrados de los tejidos del mono fallecido se inocularon en cerebros de ratón y desde allí, se cultivó un virus al que se le denominó Zika (ZIKV). En 1948 el ZIKV también se aisló de mosquitos Aedes africanus capturados en el bosque Zika. En 1956 se comprobó la transmisión del ZIKV en mosquitos Ae. aegypti, así como en un mono. Posteriormente el ZIKV fue aislado de humanos (Nigeria) entre 1968 y 1975; el 40% de los pacientes tuvieron anticuerpos comprobados por PRNT (1). El ZIKV es un flavivirus de la misma familia de los virus del dengue, fiebre amarilla y Oeste del Nilo. El ZIKV es un virus ARN estrechamente relacionado con los virus Spondweni, Ilheus, Rocío y encefalitis de San Louis. Además, estudios inmunológicos sugieren que el ZIKV bloquea la viremia del virus de la fiebre amarilla en monos (1-3). En 2007 en Yap, una de las islas Carolinas en el océano Pacífico occidental (Polinesia), el ZIKV causó un brote que afectó a más de 20.000 personas. Las manifestaciones clínicas son similares a las del dengue y del chikungunya. El período de incubación es de 3-6 días y se presenta con exantema macular o papular, fiebre, artritis o artralgia, conjuntivitis no purulenta, mialgias y cefalea. La fiebre es auto limitada, en tanto que el rash se generaliza y puede prolongarse hasta por 14 días. El ZIKV al parecer no desencadena hemorragias como el dengue y el chikungunya. La hospitalización generalmente no se requiere y hasta la presente no se ha reportado mortalidad. Tampoco existe vacuna para este virus y el tratamiento es sintomático. El brote en la isla de Yap fue el primero descrito fuera de África y Asia y desde allí saltó a las Américas y a Europa (2). De otra parte, un aspecto epidemiológico importante y peculiar del ZIKV, es que también puede ser transmitido por vía sexual (4).

In February 2015, in Isla de Pascua (Chile), was En febrero de 2015, en Isla de Pascua (Chile), se found the first indigenous case of the Americas. comprobó el primer caso autóctono de las Américas. In May 2015, Pan American Health Organization 4511

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confirmed in Brazil the first 16 cases of infections ZIKV. On June 4, 2015 in Dominican Republic it was presented the first case of ZIKV (4). This geographical proximity reminds us of chikungunya entry to Colombia in July 2014, and allow us to predict the arrival to Colombia of ZIKV will be imminent.

En mayo del 2015, la OPS confirmó en Brasil los primeros 16 casos de infecciones por el ZIKV. En junio 4 de 2015 en República Dominicana se presentó el primer caso de ZIKV (4). Esta cercanía geográfica nos recuerda la entrada del chikungunya a Colombia en julio del 2014, y nos permite predecir que el arribo del ZIKV a Colombia será inminente.

The scenario that currently exists in Polynesia where co-circulate, dengue, chikungunya and ZIKV, it will be lived in Colombia very soon. This prediction is based on the geo-climatic, vector and susceptibility of the population conditions. But perhaps, from the clinical and public health point of view, most disturbing it is that the three viruses cause similar clinical symptoms and that the country would not have sufficient resources to make a differential diagnosis of the virus (1-3).

El escenario que actualmente se vive en la Polinesia en donde co-circulan, dengue, chikungunya y ZIKV, muy pronto se vivirá en Colombia. Esta predicción se basa en las condiciones geoclimáticas, vectoriales y de susceptibilidad de la población. Pero tal vez lo más preocupante desde el punto de vista clínico y de salud pública, es que los tres virus producen cuadros clínicos similares y que el país no tendría suficientes recursos para hacer un diagnóstico diferencial de los virus (1-3).

The ZIKV has spread from the Pacific Ocean and is no longer a threat it is a reality in the Americas. Soon, we will have like chikungunya, local and exponential transmission in Aedes mosquitoes, which are perfectly adapted to our enviroment to aerotransport arboviruses. Climate change and global warming are affecting both the natural cycle of the virus as their vectors, a situation that favors the emergence and spread of diseases. With the arrival of ZIKV, the Colombian government must develop a contingency measures to mitigate the morbidity, in order to decrease cases of sickness absence due to illness caused by ZIKV. If the ministeries of health, environment and education of Colombian, do not take mesaures to preserve the little that we have, we will soon have new and unexpected diseases that it will affect so much the population.

El ZIKV se ha diseminado desde el Océano Pacífico y ya no es una amenaza sino una realidad en las Américas. Pronto tendremos al igual que el chikungunya, transmisión local y exponencial en los mosquitos Aedes, los cuales están perfectamente adaptados en nuestro medio para aerotransportar arbovirus. Los cambios climáticos y el calentamiento global están afectando tanto el ciclo natural de los virus como el de sus vectores, situación que favorece la aparición y la extensión de enfermedades. El gobierno colombiano deberá diseñar medidas de contingencia para mitigar los efectos de la morbilidad con la llegada del ZIKV, con el fin de disminuir la tasa de ausencia laboral que se presentará en la población. Si el gobierno colombiano a través de los Ministerios de Salud, Medio Ambiente y Educación, no toman medidas para preservar lo poco que tenemos, pronto tendremos nuevas e impensables enfermedades que afectarán a gran parte de la población.

Salim Mattar V. Ph.D.

Marco González T. M.Sc. REFERENCES

Hayes E. Zika Virus Outside Africa. Emerg Infect Dis 2009; 15(9):1347-1360.

2. Roth A, Mercier A, Lepers C, Hoy D, Duituturaga S, Benyon E, Guillaumot L, Souarès Y. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections–an unprecedented epidemic wave of mosquitoborne viruses in the Pacific 2012–2014. Euro Surveill. 2014; 19(41):pii=20929. Available online: http://www.eurosurveillance.org/ ViewArticle.aspx?ArticleId=20929

3. Dupont-Rouzeyrol M, O’Connor O, Calvez E, Daurès M, John M, Grangeon JP, Gourinat AC. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerg Infect Dis 2015; 21(2):381-2. doi: 10.3201/eid2102.141553. 4.

Musso D, Roche C, Robin E, Nhan T, Teissier A, Cao-Lormeau VA. Potential Sexual Transmission of Zika Virus. Emerg Infect Dis 2015; 21:359-361).

Rev.MVZ Córdoba 20(2):4513-4521, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Sows’ parity and coconut oil postnatal supplement on piglets performance Número de partos y la suplementación de aceite de coco para lechones recién nacidos Luan S Santos,1 M.Sc, Fabiana R Caldara,2* Ph.D, Sivanilza T Machado,2 M.Sc, Irenilza A Nääs,2 Ph.D, Luciana Foppa,2 M.Sc, Rodrigo G Garcia,2 Ph.D, Rafael Moura,2 M.Sc, Simone P Machado,2 M.Sc. Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, SP, Brazil. Universidade Federal da Grande Dourados, Faculdade de Ciências Agrárias, Dourados, MS, Brazil. *Correspondence: fabianacaldara@ufgd.edu.br 1 2

Received: August 2014; Accepted: December 2014.

ABSTRACT Objectives. The study aimed to evaluate the effect of sows’ of different parities and the supplement of coconut oil for piglets, on the development of litter. Materials and methods. A total of 51 sows of different parities and their 642 piglets were used in the trial. Each piglet was weighed and identified at birth in a sequential order. They were randomly distributed in two treatments (CG=control group and TG=test group). TG piglets had the first access to a dosage of 3.0 ml of coconut oil 12 hours after birth, and the second at 36 h after the first. Piglets were weighed at 21 days. In order to analyze the effect of the coconut oil supplement as a function of the weight at birth, piglets were grouped according to their weight (0.600 to 0.900 kg; 1.000 to 1.499kg; 1.500 to 1.999 kg; and 2.000 to 2.499 kg). Results. Sows parity affected the number and weight of born piglets. Sows in 4th, 5th and 7th parity had a larger litter than those from the 2nd parity. Sows from 2nd and 3rd parity had a lower number of piglets but heavier litter. No effect of the coconut oil supplement on neonatal piglets’ performance was found. Conclusions. The coconut meal was neither beneficial to neonatal piglets nor to those with low weight at birth, which usually present low body energy. Key words: Energy sources, fatty acids, litter size, newborn animal (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. El objetivo del estudio fue evaluar el efecto del número de partos y el suplemento de aceite de coco en lechones recien nacidos. Materiales y métodos. Se utilizaron 51 cerdas de diferentes partos y sus 642 lechones. Cada lechón se pesó y se identificó al nacer en orden secuencial. Fueron distribuidos aleatoriamente en dos grupos (CG = control y TG=tratamiento). Lechones TG tenían el primer acceso a una dosis de 3.0 ml de aceite de coco 12 horas después del nacimiento, y el segunda a las 36 h después de la primera. Los lechones fueron pesados a los 21 días. Con el fin de analizar el efecto de los suplementos de aceite de coco con relación al peso al nacer. Los lechones fueron agrupados de acuerdo con su peso (0.600 a 0.900 kg; 1.000 a 1.499 kg; 1.500 a 1.999 kg y 2.000 a 2.499 kg). Resultados. El número de partos afectó el peso y el número de lechones nacidos. Cerdas 4513

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en cuarto, quinto y séptimo parto, tuvieron una camada mayor que las de segundo parto. Las cerdas de segundo y tercer parto tuvieron menor número de lechones y con peso mayor. No se encontró efecto del suplemento de aceite de coco en el desarrollo de los lechones recién nacidos. Conclusiones. Lo aceite de coco no es favorable para los lechones recién nacidos, tampoco para aquellos con el bajo peso al nacer, que normalmente presentan la energía corporal baja. Palabras clave: Ácidos grasos, animales recién nacidos, fuentes de energía, tamaño de la camada (Fuente: CAB).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Sows genetic development is intended for breeding, and to obtain prolific sows. Changes in management allowed the increase in a large number of weaned piglets per sow per year, from an average of 21-23 piglets (1) to near 28-30 weaned piglets per female per year (2). Consequently, there was an increase of problems related to birth weight, a large variability in weight between piglets (3), and competition for colostrum between pigs, increasing the challenge of the pig farmers in relation to management practices adopted after the farrowing. Besides this, sows of different age and different parities tend to have different litter size and weight at birth and weaning (4).

El desarrollo genético de las cerdas está enfocado en la reproducción, y para obtener cerdas prolíficas. Los cambios en gestión permitieron incrementar en un gran número de lechones destetados por cerda por año, de un promedio de 21-23 lechones (1) a casi 28-30 lechones por hembra por año (2). Consecuentemente, hubo un incremento en los problemas relacionados con el peso al nacer, una gran variabilidad de peso entre lechones (3) y competencia por calostro entre cerdos, incrementando el reto de los granjeros de cerdos en relación con las prácticas de gestión adoptadas durante el parto. Además, las cerdas de diferentes edades y paridades tienden a tener camadas y pesos distintos al momento de nacer y destetar (4).

The piglet body energy stored at birth is present in the form of glycogen and fat. However, the available energy from glycogen and fat derivatives for newborn piglets is particularly low. Carbohydrates are the first source of energy used by newborn pig, and its absorption is significantly accelerated during the exposure to cold (5) leading to rapid depletion of glycogen. The amount of body fat is also particularly low at birth, and most of them are not available for oxidation. Thus, large litter with low weight neonatal piglets may result in high mortality rates in the first three days of life, mainly during cold weather (6). One way to overcome this issue may be to supply energy-rich supplements from sources of fast digestion and absorption to the piglets in their first days of life. Triglycerides of medium chain fatty acids have 6 to 12 carbon atoms which are more easily digestible and metabolized than those of the long chain. The best response of lipids from coconut oil is related to its high number of medium chain fatty acids, which provides higher and faster absorption by the lymphatic system. This peculiarity distinguishes it from fatty acids of the other animal or vegetable fats. Thus, studies were carried out to assess the feasibility of using supplements such as coconut oil on blood homeostasis and improvement of the energy status of newborns piglets (7) obtaining conflicting results about to its benefits. The present study aimed to evaluate the effects of parity and coconut oil supplement on the development of piglets after the farrowing.

Le energía corporal de un lechón almacenada al nacer está presenta en forma de glucógeno y grasa. Sin embargo, la energía disponible de glucógeno y derivados de la grasa es particularmente baja en lechones. Los carbohidratos son la primera fuente de energía utilizada por un cerdo neonato, y su absorción se acelera de manera significativa durante su exposición al frío (5) llevando a un agotamiento rápido de glucógeno. La cantidad de grasa corporal es particularmente baja al nacer, y la mayoría de ellas no está disponible para oxidación. Por esto, un camada grande con cerdos neonatos de bajo peso puede resultar en altas tasas de mortalidad en los primeros tres días de vida, principalmente durante clima frío (6). Una forma de sobrellevar este problema puede ser proveer suplementos ricos en energía de fuentes de rápida digestión y absorción para los lechones durante sus primeros días de vida. Los triglicéridos de ácidos grasos de cadena media tienen de 6 a 12 átomos de carbono los cuales son más fácilmente digeribles y de metabolizar que los de cadena larga. La mejor respuesta a los lípidos del aceite de coco está relacionada a este alto número de ácidos grasos de cadena media, lo cual proporciona una absorción mayor y más rápida en el sistema linfático. Esta peculiaridad los distingue de ácidos grasos de grasas animales o vegetales. Por ende, se llevaron a cabo estudios para evaluar la factibilidad de utilizar suplemento como el aceite de coco en homeostasis de sangre

Santos - Sows’ parity and coconut oil to postnatal piglets

MATERIALS AND METHODS Animals and husbandry. The study was carried out in a commercial pig farm located at latitude 22°18’50’’ S and longitude 53°49’3’’ W, and an altitude of 360 m in Midwestern Brazil. The regional climate is Aw (according to Köpper classification), which means tropical climate with rain during the summer and dry season during winter. The farm had a total of 2300 sows genetically bred for prolific results. A total of 51 sows from different parity and their litter (624 piglets) were used in the trial. Sows were selected according to their integrity (locomotion, udder morphology, body score - 3 or 4 in a 5 scale). Primiparous sows were identified and analyzed separately. All females were kept under the same housing conditions, handling and feeding, and parturient sows had full assistance. After birth, the piglets were dried with paper towels and the umbilical cord cut and disinfected with iodine solution. Approximately 12 hours after the end of each birth piglets were individually weighed and identified with earrings numbered in sequential order. After identification, all of the piglets in the room the litters were equalized. Experimental procedure. The piglets were distributed in a completely randomized design in two treatments (CG - control group and TGtest group). Each litter was present in the two treatments (50% of piglets in each group). Piglets from the test group received 3.0 ml of coconut oil 12 hours after birth and a second dose (3.0 ml) was provided 36 hours after the first. The coconut oil was administrated via oral. Piglets were weighed again individually at 21 days of age. For evaluating the results of the coconut oil in the piglets weight gain, they were grouped according to their weight range 0.600 to 0.900 kg; 1.000 to 1.499 kg; 1.500 to 1.999 kg; and 2.000 to 2.4999 kg. To determine the effect of the sows’ parity on the litter size and neonatal piglets’ weight sows parity sequence (1st to 7th) were considered the treatments. Analysis of variance was applied to data on weight of neonatal piglets and at 21 days of age, and F test was used for comparing the mean values. To evaluate the effects of parity the number of piglets and their neonatal weight data analysis of variance was applied, and Turkey’s test was used at a 95% level of confidence. To assess the correlations between parity, size and litter weight Pearson correlation analysis was applied. SAS (8) statistical program was used for computing data.

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y una mejora en el estado de energía de lechones neonatos (7) obteniendo resultados conflictivos con relación a sus beneficios. Este estudio tiene el objetivo de evaluar los efectos de paridad y suplementos de aceite de coco en el desarrollo de lechones después del parto.

MATERIALES Y MÉTODOS Animales y cría. El estudio fue llevado a cabo en una granja comercial de cerdos ubicada en latitud 22°18’50’’ S y longitud 55˚49’3’’ O, a una altitud de 360 m en el medio oeste de Brasil. El clima regional es Aw (de acuerdo a la clasificación Kopper), lo cual significa un clima tropical con lluvias durante el verano y un clima seco durante el invierno. La granja tenía un total de 2300 cerdas genéticamente criadas para resultados prolíficos. Un total de 51 cerdas de diferente paridad y sus camadas (624 lechones) fue utilizada para la prueba. Las cerdas fueron seleccionadas de acuerdo a su integridad (locomoción, morfología de la ubre, puntaje de cuero – 3 o 4 en una escala de 5). Las cerdas primíparas fueron identificadas y analizadas de manera separada. Todas las hembras se mantuvieron bajo las mismas condiciones de vivienda, manejo y alimentación, y se les dio asistencia completa a las cerdas parturientas. Luego de nacer, los lechones fueron secados con toallas de papel y su cordón umbilical cortado y desinfectada con solución de yodo. Aproximadamente 12 horas después del final de cada parto, los lechones fueron individualmente pesados y identificados con aretes numerados en orden secuencial. Luego de su identificación, todos los lechones en el cuarto y las camadas fueron ecualizadas. Procedimiento experimental. Los lechones fueron distribuidos en un diseño completamente aleatorio en dos tratamientos (CG – grupo de control y TG – grupo de prueba). Cada camada estuvo presente en dos tratamientos (50% de los lechones en cada grupo). Los lechones del grupo de prueba recibieron 3.0 ml de aceite de coco 12 horas después de nacer, y el segundo recibió 3.0 ml de aceite de coco 36 horas después de su primera comida. El aceite de coco fue administrado vía oral. Los lechones fueron individualmente pesados a los 21 días de nacer. Para evaluar los resultados del aceite de coco en el incremento de peso de los lechones, fueron agrupados de acuerdo a su rango de peso (0.600 a 0.900 kg; 1.000 a 1.499 kg; 1.500 a 1.999 kg; y 2.000 a 2.499 kg).

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RESULTS Effect of parity on the number and weight of neonatal piglets and at 21 days of age. In general, both variable’s size of litter (SL) and neonatal piglet weight (NPW) were influenced by parity. Smaller variations of both size of litter and weight of neonatal piglets were observed for 3rd and 4th parity. For the sows in 1st, 2nd, 5th, 6th and 7th parity a variation was found in the range of 15.36% to 26.86% for SL, and from 13.76 to 19.96% to NPW. Results suggest greater homogeneity in terms of both the size of litter and weight of neonatal piglets for sows between the 3rd and 4th gestation. There was an effect of parity in SL and NPW (Table 1).

Table 1. Mean values of size of litter, and weight of neonatal piglet for each treatment. Parity

n(1)

SL(2)*

NPW (3)*

13.62 ± 2.09ab

1.29 ± 0.21abc

10.25 ± 4.74b

1.63 ± 0.74ª

12.25 ± 5.51ab

1.53 ± 0.68ab

15.0 ± 3.75a

1.38 ± 0.34abc

15.0 ± 6.8a

1.26 ± 0.58bc

13.5 ± 6.96ab

1.30 ± 0.65abc

14.70 ± 2.72a

1.17 ± 0.16c

16.97

15.63

CV%

Mean followed by the same letter do differ by Tukey test, p<0.05. (1) Number of sows per treatment. (2) Size of litter. (3) Weight of neonatal piglets. *

Females of 4th, 5th, and 7th parity had larger litters than those from 2nd parity. Other sequence of parity did not differ. These results are in agreement with Bortolozzo and Wentz (9) who claim to have reduced the number of piglets born on the second parity in relation to the first, in several Brazilian farms. Sows from 1st and 2nd parity presented longer time to return to estrus than sows from the 3rd parity (10). Sows from 1st and 2nd parity often eat less fodder during lactation (11) and, therefore, present stronger association between body weight loss during lactation and the weaning-to-estrus interval (12). Low ingestion of energy combined with high demand of energy for maintenance, milk production and body growth enhance the negative energy balance and catabolic stage in primiparous sows. This worsens the secretion of LH, the follicles maturation, and the occurrence of post weaning estrous. Sows which returned to estrus 7 to 10 days after weaning present decrease in farrowing rate and litter size, when compared to sow which return to estrous in 5 to 6 days (13). This may explain the reduction in size litter found in the present study, in sows, during 2nd parity.

Para determinar el efecto de la paridad de cerdas en el tamaño de la camada y el peso de los lechones neonatos la secuencia de paridad (1ra a 7ª) fue tomada en cuenta en los tratamientos. El análisis de varianza fue aplicado a los datos del peso de lechones neonatos y a los 21 días de edad, y una prueba F fue utilizada para compara los valores medios. Para evaluar los efectos de la partida del número de lechones y el análisis de datos de peso al nacer se aplicó la varianza, y la prueba de Turquía fue utilizada a un nivel de confianza del 95%. Para evaluar las correlaciones entre paridad, tamaño y peso de la camada se utilizó un análisis de correlación Pearson. El programa estadístico SAS (8) fue utilizado para computar los datos.

RESULTADOS Efectos de paridad sobre el número y peso de lechones neonatos y a los 21 días de edad. En general, ambas variables, tamaño de camada (SL) y peso de lechón neonato (NPW) fueron influenciadas por la paridad. Se observaron menores variaciones tanto en el tamaño de la camada como en el peso de los lechones neonatos para la 3ra y 4ta paridad. Para las cerdas de paridad 1ª, 2da, 5ta, 6ta y 7ª, la variación se encontró en el rango entre 15.36% y 36.86% para SL, y de 13.76 a 19.96% para NPW. Los resultados sugieren una mayor homogeneidad en términos de tamaño de la camada y peso de lechones neonatos para cerdas entre la 3ra y 4ta gestación. Hubo un efecto de la paridad en SL y NPW (Tabla 1). Las hembras de 4ta, 5ta, y 7ta paridad tuvieron mayores camadas que aquellas de 2da paridad. Ninguna otra secuencia de paridad difirió. Los resultados están de acuerdo con Bartolozzo y Wentz (9) quienes dicen haber reducido el número de lechones nacidos en la segunda paridad con relación a la primera en granjas Brasileras. Las cerdas de 1ra y 2da paridad presentaron un mayor tiempo de regreso al estro que aquellas de 3ra paridad (10). Las cerdas de 1ra y 2da paridad a menudo consumen menos forraje durante la lactancia (11) y por ende presentan una más fuerte asociación entre pérdida de peso corporal durante la lactación y el intervalo destete-a-estro (12). La baja ingesta de energía combinada con una alta demanda de mantenimiento de energía, producción de leche y crecimiento corporal aumenta el balance negativo de energía y fase catabólica de cerdas primíparas. Esto empeora la secreción de LH, la maduración de folículos, y la ocurrencia de celo post-destete. Las cerdas que

Santos - Sows’ parity and coconut oil to postnatal piglets

The piglets from the sows of 2nd, 3rd, and 4th sequence of parity were found within the ideal range of mean birth weight (14). However, those born from sows of 1st, 5th, and especially 7th parity presented neonatal weight considered low to critical. The age of sows interfere directly on the size of litter. Holanda et al (4) found quadratic effect of the age of sows on the size of litter, and the age in which this effect is maximized is 3.12 years. Higher size litters were found in sows aging 2.84 to 3.84 years, in the 5th and 6th parity, respectively. Quesnel et al (15) found an increase in the number of neonatal born alive piglets up to the 6th parity, and for the total size of litter up to the 7th parity. It should be expected an increase in the size of litter after the 2nd parity, and this occurs due to the increase in the ovulation rate and/or the survival of neonatal piglets. However, Vonnahme et al (16) found that parity sequence (2nd to 14th) did not affect ovulation rate and number of viable embryos and length of uterine horns sows at 25, 36 and 44 days of gestation, suggesting that the increase in embryos survival is responsible for the increase in litter size as the number of reproductive cycles increases. The increase of prolificacy with increasing age of the sow has an indirect influence on individual neonatal piglet weight, assuming substantial value on the characteristics of variability of litter (4). The results found in the present study differ from those of Holanda et al (4) whose findings show a positive and linear effect of sows’ age at parity on the weight of neonatal piglets showing that the aging of sows led to heavier born piglets. In a study using sows in 1st to 10th parity sequence. Borges et al (17) found that parity affects the mean neonatal piglet weight, and the best findings were shown in sows, in the 3rd parity. However, the authors did not find a difference in relation to the number of born-alive piglets, dead neonatal piglets, or mummified embryos. Other researches also show an association between the size of litter and the weight of neonatal piglets, indicating a reduction of nearly 20 g in each additional piglet (4,18). This result of the size of litter on the weight of neonatal piglets confirms the results found by

1.7

16 15

1.6 1.55

1.5 1.45

1.4 12

1.35 1.3

1.25 1.2

Number of neonatal piglets in litter

1.65 Piglets’ weight at birth (kg)

Sows from 2nd and 3rd parity sequence had heavier piglets in litter, when compared to others, which is probably due to the fact that the litter had fewer piglets with higher individual weight. This could be confirmed by the correlations between the factors of order of birth, weight and litter size at birth. Higher parity increased the size of litter (0.2665; p<0.01), but decreased piglet’s weight at birth (-0.3144; p<0.01). And higher the birth order and the number of piglets per litter, the smaller the individual weight of neonatal piglets (-0.4334; p<0.01; Figure 1).

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10 1

Parity PWB

NBP

Figure 1. Association between the weight of neonatal piglets (NPW) and the number of neonatal piglets in litter (SL).

regresaron al estro entre 7 y 10 días después del destete presentaron una reducción en la tasa de parto y el tamaño de la camada, en comparación con cerdas que regresaron al estro en 5 a 6 días (13). Esto puede explicar la reducción en el tamaño de camada en este estudio, en cerdas, durante la 2da paridad. Las cerdas de 2da y 3ra secuencia de paridad tuvieron lechones más pesados en camada, en comparación con otras, lo cual se debe probablemente al hecho de que la camada tenía menos lechones y un mayor peso individual. Esto se puede confirmar por las correlaciones entre los factores de orden de nacimiento, peso y tamaño de camada al nacer. La mayor paridad incrementó el tamaño de la camada (0.2665;p<0.01), pero redujo el peso del lechón al nacer (-0.3144; p<0.01). Y a mayor orden de nacimiento y un mayor número de lechones por camada, menor el peso individual de los lechones neonatos (-0.4334; p<0.01; Figura 1). Los lechones de cerdas de 2da, 3ra y 4ta secuencia de paridad se encontraron dentro del rango medio ideal de peso al nacer (14). Sin embargo, aquellos nacidos de cerdas de 1ra, 5ta y especialmente 7ta paridad presentaron un peso neonato considerado bajo a crítico. La edad de las cerdas interfiere directamente en el tamaño de la camada. Holanda et al (4) encontró un efecto cuadrático de la edad de las cerdas sobre el tamaño de la camada, y la edad en la cual el efecto es maximizado es 3.12 años. Camadas de mayor tamaño se encontraron en cerdas de edades entre 2.84 y 3.84 años, de 5ta y 6ta paridad, respectivamente. Quesnel et al (15) encontraron un incremento en el número de lechones neonatos nacidos vivos hasta las 6ta paridad, y para el tamaño total de la camadas hasta la 7ª paridad. Se debe esperar un incremento en el

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Kapell et al (19) and Bianchi (20). The authors show that large litter size with low neonatal weight leads to weak and less active piglets than others, implicating in high mortality before weaning. Effect of coconut oil supplement in the weight gain of piglets. Mean neonatal piglets weight was 1.262 and 1.254 kg for the group test and control, respectively. Of all neonatal piglet weight, the higher frequency occurred between 0.9 and 1.5 kg (Figure 2). Similar values of mean average of weight of neonatal piglets were found by Fraga et al (21). Overall, there was no effect of supplementation of coconut oil on the weight of the piglets 21 days old, which were 5.080 kg and 5.020 kg for piglets supplemented with coconut oil and non-supplemented, respectively. The highest frequency of weight of piglets 21 days old occurred between the values of 4.2 to 6.0 kg suggesting that despite the oil supplementation did not contribute to the weight gain of the piglets, most of these had normal development during farrowing, as recommended by EMBRAPA (14). In a previous study, Hollanda et al (4) found slightly higher values for neonatal piglet weight (1.35 kg) and at 21 days old (5.6 kg). When different weight categories were evaluated no beneficial effect of coconut oil supplementation on the performance of piglets (p>0.05) was 17.5

Frequency (%)

15.0 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0

0.15

0.45

0.75

Expected distribution

1.05

1.35

1.65

Weight at birth

1.95

2.25

2.55

2.85

Observed distribution

(kg)

22.5 20.0

Frequency (%)

17.5

tamaño de la camada luego de la 2da paridad, y esto ocurre debido al incremento en la tasa de evolución y/o la supervivencia de lechones neonatos. Sin embargo, Vonnahme et al (16) encontraron que la secuencia de paridad (2da a 14ava) no afecta la tasa de ovulación y el número de embriones viables y la longitud de las trompas uterinas en cerdas a los 25, 36, y 44 días de gestación, sugiriendo que el incremento de embriones sobrevivientes es responsable por el incremento en el tamaño de la camada a medida que el ciclo reproductivo aumenta. El incremento de prolificidad con el aumento de la edad de la cerda tiene una influencia indirecta sobre el peso individual del lechón neonato, asumiendo un valor sustancial de las características de variabilidad de la camada (4). Los resultados encontrados en el presente estudio difieren de aquellos de Holanda et al (4) cuyos hallazgos muestran un efecto lineal y positivo entre la edad de la cerda en paridad sobre el peso de los lechones neonatos mostrando que el envejecimiento de las cerdas llevó a lechones más pesados al nacer. En un estudio utilizando cerdas de 1 ra a 10 ª secuencia de paridad, Borges et al (17) encontró que la paridad afecta el peso medio del lechón neonato, y los mejores hallazgos se encontraron en cerdas de 3ra paridad. Sin embargo, los autores no encontraron una diferencia en relación con el número de lechones nacidos vivos, lechones neonatos muertos y embriones momificados. Otras investigaciones muestran también una asociación entre el tamaño de la camada y el peso de lechones neonatos, indicando una reducción de casi 20 g por cada lechón adicional (4,18). El resultado del tamaño de la camada sobre el peso de los lechones neonatos confirma los resultados encontrados por Kapell et al (19) y Bianchi (20). Los autores muestran que el tamaño de la camada con peso neonato bajo lleva a lechones débiles y menos activos que los demás, implicando una alta mortalidad antes del destete.

15.0 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0

0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 3.6 4.2 4.8 5.4 6.0 6.6 7.2 7.8 8.4 9.0 9.6 10.2 10.8 Expected distribution

Weight at 21 days

Observed distribution

(kg)

Figure 2. [A]. Distribution of the weight of neonatal piglets, and [B] at 21 days of age.

Efecto del suplemento del aceite de coco en aumento de peso en lechones. La media de peso de lechones neonatos fue 1.252 y 1.254 para el grupo de prueba y control, respectivamente. De todos los pesos de lechones neonatos, la mayor frecuencia ocurrió entre 0.9 y 1.5 kg (Figura 2). Valores similares de media de promedio de peso en lechones neonatos se encontró por Fraga et al (21). En general, no hubo un efecto de suplementar con aceite de coco sobre el peso de lechones e 21 días de edad, los cuales

Santos - Sows’ parity and coconut oil to postnatal piglets detected, indicating that the supply of energy supplement showed no advantages on piglets weight gain, even for those of low neonatal weight, which typically have low body energy reserves (Table 2). Table 2. Relative frequency (%), neonatal weight (NPW) , weight at 21 days of age (PW21) and daily weight gain (DWG) of piglets with (TG) or without (CG) coconut oil supplementation, as a function of various range of neonatal weight. Range of PWB (kg) 0.600 a 0.999 (n=154)*

1.000 a 1.499 (n=320)

1.500 a 1.999 (n=131)

2.000 a 2.499 (n=19)

Frequency (%) NPW /Range NPW (kg)

PW21 (kg)

DWG (kg)

Group

46.75

0.835 ±0.12

4.319 0.166 ±0.78 ±0.03

53.25

0.843 ±0.09

4.108 0.155 ±0.77 ±0.04

178

55.63

1.240 ±0.13

5.042 ±0.9

0.181 ±0.04

142

44.38

1.238 ±0.13

4.987 ±0.9

0.178 ±0.03

50.38

1.652 ±0.12

5.654 0.191 ±0.96 ±0.02

49.62

1.679 ±0.13

5.833 0.198 ±0.95 ±0.02

52.63

2.157 ±0.13

7.448 0.252 ±1.84 ±0.03

47.37

2.136 ±0.09

7.88 0.274 ±1.43 ±0.03

*Values inside parenthesis mean the size of the sample for each weight range.

DISCUSSION According to Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) (14), pig farmers must do their best to ensure that piglets obtain average daily weight gain of greater than 0.250 kg per day during farrowing. In the present study only the piglets belonging to the range of birth weight from 2.000 to 2.499 kg proven to increase this amount of weight. The body and colostrum carbohydrates are the main energy sources during the first hours, but the progressive decline of the respiratory rate during the first postnatal day provides evidence of the growing importance of lipids as an energy source during this time (22, 23). However, the low use of fatty acids as energy source during the neonatal period could be due to the limited potential for oxidation of fatty acids or other substrates of carbohydrates (24). The limited role of oxidation of fatty liver in newborn piglets acid level is low due to the mitochondrial activity and quantity of the enzyme 3-hydroxy- 3-methyl glutaryl - CoA synthase (25), which develops gradually with age. This fact could explain the findings in the present study. Thus, energy supplements to be provided in the first neonatal hours can cause some benefit when it is of digestible carbohydrates.

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fueron lechones de 5.080 kg y 5.020 kg para lechones suplementados con aceite de coco y no suplementados, respectivamente. La mayor frecuencia de peso de lechones de 21 días de edad ocurrió entre los valores de 4.2 y 6.0kg sugiriendo que a pesar del suplemento de aceite no contribuyó al aumento de peso en los lechones, la mayoría de los cuales tuvieron un desarrollo normal durante la cría, según recomendaciones EMBRAPA (14). En un estudio previo, Hollanda et al (4) encontré valores ligeramente superiores del peso de lechones neonatos (1.35kg) y a los 21 días (5.6kg). Cuando se evaluaron distintas categorías de peso no se encontró ningún efecto beneficiosos del suplemento con aceite de coco en el desempeño de los lechones (p>0.05), indicando que el suministro de un suplemento energético no mostró ninguna venta sobre el aumento de peso de los lechones, aún para aquellos de bajo peso al nacer, los cuales típicamente muestran reservas bajas de energía corporal (Tabla 2).

DISCUSIÓN Según la Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria (EMBRAPA) (14), los granjeros de cerdos deben hacer su mejor esfuerzo para asegurar que obtengan una ganancia de peso diaria promedio mayor a 0.250 kg por día durante la cría. En este estudio sólo los lechones que pertenecían al rango de peso al nacer entre 2.000 y 2.499 kg mostraron ganar esta cantidad de peso. Los carbohidratos del cuerpo y calostro son las principales fuentes de energía durante las primeras horas, pero el declive progresivo de la frecuencia respiratoria durante el primer día posparto ofrece evidencia de la creciente importancia de lípidos como fuente de energía durante este periodo (22,23). Sin embargo, el bajo uso de ácidos grasos como fuente de energía durante el periodo neonato podría deberse al potencial limitado de oxidación de ácidos grasos y otros sustratos de carbohidratos (24). El papel limitado de la oxidación de ácido graso en el nivel de ácido en lechones neonatos es bajo debido a la actividad mitocondrial y la cantidad de enzima 3-hidroxi-3metil glutaril – CoA sintasa (25), la cual se desarrolla gradualmente con la edad. Este hecho podría explicar los hallazgos del presente estudio. Entonces, los suplementos de energía a ser provistos durante las primeras horas neonatas puede causar un beneficio cuando se trata de carbohidratos digeribles. La paridad afectó el peso de los lechones y el tamaño de la camada. La 2da paridad de cerdas tuvo un menor tamaño de camada, pero con un

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Parity affected the weight of piglets and the size of litter. Sows in second parity had smaller litter size, but with higher mean neonatal piglet weight. Energy diet of coconut oil in the first 48 hours did not increase piglets’ performance, even for those with low neonatal weight, which typically have very low body energy reserves.

peso promedio del lechón neonato. La energía de la dieta de aceite de coco durante las primeras 48 horas no incrementó el desempeño de los lechones, aún para aquellos con bajo peso neonatal, que típicamente tienen reservas bajas de energía corporal.

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Santos - Sows’ parity and coconut oil to postnatal piglets

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Rev.MVZ Córdoba 20(2):4522-4533, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Evaluation of Digestible lysine levels in diets with high energy density for finishing pigs Evaluación de niveles de lisina digestible en dietas con alta densidad energética para cerdos en finalización Janeth Colina R,1* Ph.D, Miguel Díaz E,2 Ing. Agrónomo, Luis Manzanilla M,2 Ing. Agrónomo, Humberto Araque M,2 M.Sc, Gonzálo Martínez G,2 Ph.D, Mario Rossini V,3 M.Sc, Nancy Jerez-Timaure,4 Ph.D. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Ciencias Veterinarias. Cátedra de Producción Animal. Final prolongación de la Av. 19 de Abril con Av. Casanova Godoy. Ofic. 15. Maracay, estado Aragua. 2101. Venezuela. 2Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronomía, Instituto de Producción Animal. Final prolongación de la Av. 19 de Abril con Av. Casanova Godoy Edif. 1. Maracay, estado Aragua. 2101. 3Universidad Central de Venezuela. Facultad de Ciencias Veterinarias. Laboratorio de Patología Clínica. Final prolongación de la Av. 19 de Abril con Av. Casanova Godoy. Edif. 2. Maracay, estado Aragua. 2101. Venezuela. 4Universidad del Zulia. Facultad de Agronomía, Departamento de Zootecnia. Av. Goajira. Edif. 1. Maracaibo, estado Zulia. 4005. Venezuela. *Correspondencia: janeth. colina@ucv.ve 1

Received: May 2014; Accepted: December 2014.

ABSTRACT Objective. To evaluate the effects of different levels of digestible lysine in diets with high energy density on productive performance and carcass characteristics of finishing pigs. Materials and Methods. Seventy crossbred barrows (initial body weight of 83.36 kg) were used and allotted in a randomized block design with five treatments, seven replications and two pigs per experimental unit. Pigs were fed ad libitum with diets containing 3.5 kcal/kg of ME and five levels of digestible lysine (0.46, 0.52, 0.58, 0.64 and 0.70%) during four weeks. Final live weight (FLW), daily feed intake (DFI), daily weight gain (DWG), feed conversion (FC), daily lysine intake (DLI), and the amount of lysine per body weight gain (DLI/DWG), were evaluated. At the end of the experiment, blood samples were taken from each pig to determine urea nitrogen concentration (UN) in serum and slaughtered to evaluate quantitative and qualitative carcass characteristics. Results. The FLW increased linearly (p<0.05).There were no differences among treatments for DFI, DWG, FC, carcass characteristics and UN. The DLI and DLI/DWG varied significantly (p<0.001) and increased linearly (p<0.001) with each lysine level. Pigs that consumed the limiting diet in lysine (0.46%) showed less DLI and DLI/DWG (p<0.001) than pigs fed the other diets. Conclusions. The amount of DLI/DWG increased with the evaluated levels of digestible lysine in diets with high energy density, without effects on productive performance and carcass characteristics of finishing pigs. Key words: Amino acids, backfat thickness, barrows, growth, pork, urea (Source: Agrovoc).

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Colina - Digestible lysine in pigs

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RESUMEN Objetivo. Evaluar los efectos de diferentes niveles de lisina digestible en dietas con alta densidad energética sobre el desempeño productivo y características de la canal de cerdos en finalización. Materiales y métodos. Se utilizaron 70 cerdos (peso inicial de 83.36 kg) mestizos castrados, distribuidos en un diseño de bloques al azar con cinco tratamientos, siete repeticiones y dos cerdos por unidad experimental. Los cerdos fueron alimentados ad libitum con dietas que contenían 3.5 Mcal/kg de energía metabolizable y cinco niveles de lisina digestible (0.46, 0.52, 0.58, 0.64 y 0.70%) durante cuatro semanas. Se evaluaron: peso vivo final (PVF), consumo diario de alimento (CDA), ganancia diaria de peso (GDP), conversión de alimento (CA), consumo diario de lisina (CDLis) y la cantidad de lisina por peso ganado (CDLis/GDP). Al final de experimento, se extrajeron muestras de sangre de todos los cerdos para determinar la concentración de nitrógeno ureico (NU) en suero sanguíneo y luego se sacrificaron para evaluar las características cualitativas y cuantitativas de la canal. Resultados. No se observaron diferencias significativas entre tratamientos para CDA, GDP, CA, características de la canal y NU. El PVF incrementó linealmente (p<0.05). El CDLis y la CDLis/ GDP variaron significativamente (p<0.001) e incrementaron linealmente (p<0.001) con cada nivel de lisina. Los cerdos que consumieron la dieta limitante en lisina (0.46%) mostraron menor consumo y CDLis/GDP (p<0.001) que los cerdos alimentados con las otras dietas. Conclusiones. Los niveles de lisina digestible evaluados en dietas con alta densidad energética aumentan la CDLis/GDP, sin efectos sobre el desempeño productivo y las características de la canal de los cerdos en finalización. Palabras clave: Aminoácidos, carne de cerdo, cerdo castrado, crecimiento, tocino magro, urea (Fuente: Agrovoc).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Modern pork production is based on using breeds whose optimal performance is determined, principally, by the quality of the diet. Genetic improvement has led to a selection of pigs with greater protein deposition and muscle development (1), which deserves to evaluate amino acids requirements for adequate diet formulation. Also, the amount of an amino acid and energy density in these diets determine the deposition of protein and fat in the pork carcass (2). Lysine is the first limiting amino acid in pig diets, and is used as a reference in the formulation, considering the recommended levels of standardized digestible lysine to estimate the requirements of other essential amino acids and guarantee optimum growth and yield in lean meat (3-5). For finishing pigs between 80 and 120 kg of weight, 0.52% dietary digestible lysine is recommended (6).

La producción porcina moderna se sustenta en la utilización de líneas genéticas cuyos óptimos rendimientos están determinados, principalmente, por la calidad de la dieta. El mejoramiento genético ha conducido a la selección de cerdos con mayor deposición de proteína y desarrollo de tejido muscular (1), lo que amerita evaluar las necesidades de los aminoácidos en las dietas para formularlas adecuadamente. Además, la cantidad de un aminoácido y la densidad energética en esas dietas determinan la deposición de proteína y grasa en la canal porcina (2). La lisina es el primer aminoácido limitante en dietas para cerdos, y se utiliza como referencia en la formulación considerando los valores recomendados de lisina digestible estandarizada para estimar los requerimientos de los otros aminoácidos esenciales y garantizar un óptimo crecimiento y rendimiento en carne magra (3-5). Se recomienda 0.52% de lisina digestible en la dieta de cerdos en etapa de finalización entre 80 y 120 kg de peso (6).

Additionally, feed intake is determined by dietary energy density (6), and it is therefore appropriate to adjust the proportion of amino acids if the energy density or feed intake changes (7). Previous studies in temperate climates (8-11) have evaluated the growth and carcass characteristics of pigs in response to different levels of lysine in high energy density diets without evidence of negative effects on these characteristics. On the other hand, it has been demonstrated that high energy density diets limiting in lysine do not have deleterious effects

Adicionalmente, el consumo de alimento está determinado por la densidad energética de la dieta (6), por lo que es apropiado ajustar la proporción de los aminoácidos si la densidad energética o el consumo de alimento varían (7). Estudios previos en condiciones de clima templado (8-11), han evaluado el crecimiento y las características de la canal de cerdos en respuesta a diferentes niveles de lisina en dietas

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on growth but increase the fat content in the carcass of finishing pigs (12), while pigs fed during this phase with diets low in lysine and energy have increased deposition of back and intramuscular fat in the carcass (13). In Venezuela, studies have been conducted to evaluate the carcass characteristics of pigs (14,15) without considering the effect of digestible lysine on that. In this sense, it is necessary to investigate this highly relevant point in the tropic, since climatic conditions affect the requirements of amino acids and the productive performance of pigs (4) while genetic factors and variations between animals also influence the results obtained (2). The objective of this study was to evaluate the effects of different levels of digestible lysine in diets with a high energy density on the productive performance and carcass characteristics of finishing pigs.

MATERIALS AND METHODS Bioethical aspects. The Bioethics Committee of the Faculty of Veterinary Sciences at the Universidad Central de Venezuela (FCV-UCV) endorsed this study, which was within established protocol when using experimental animals. Study location. The study was performed in the Laboratory of the Swine Section of the Institute of Animal Production in the Agronomy Faculty at the Universidad Central de Venezuela (UCV) in Maracay, Aragua State. The climatic conditions of the area: (67°36’36’’ longitude, 10°16’20’’ latitude, and 443 meters above sea level), average temperature of 25.1°C and average annual rainfall of 1.063 mm. Two experimental barns and 35 pens were used. In one barn 20 pens were used (4 m2 each), with a concrete floor and separated by walls; and in the second barn 15 pens were used (4.2 m2 each), with half solid flooring and half drainage, with concrete divisions. Both barns had aluminum sheeting roofs and natural light. Each pen had a fixed self feeder and a stainless steel nipple waterer to provide feed and water ad libitum, respectively. Animals. Seventy crossbred barrows (Yorkshire × Landrace × Duroc) with an average initial body weight of 83.36 kg, from a commercial farm were used. Pigs were randomly allotted, two per pen, to one of five experimental diets (treatments) for four weeks. Diets. Table 1 shows the ingredients and chemical composition of the experimental diets, formulated to obtain five different levels

con alta densidad energética sin evidencia de efectos negativos sobre estas características. Por otra parte, se ha demostrado que el consumo de dietas con alta densidad energética y limitantes en lisina no tiene efectos deletéreos sobre el crecimiento pero aumenta el contenido de grasa en la canal de cerdos en etapa de finalización (12), mientras que los cerdos alimentados en esta etapa con dietas de bajo contenido de lisina y energía han resultado en incrementos en la deposición de la grasa dorsal e intramuscular en las canales obtenidas (13). En Venezuela se han realizado estudios para evaluar las características de las canales porcinas (14,15) sin considerar el efecto del contenido de lisina digestible sobre las mismas. En tal sentido, en condiciones tropicales se hace necesario indagar sobre este aspecto, lo cual es de gran relevancia ya que las condiciones climáticas afectan los requerimientos de los aminoácidos y el desempeño productivo de los cerdos (4) mientras que los factores genéticos y las variaciones entre animales también influyen en la respuesta obtenida (2). El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de diferentes niveles de lisina digestible en dietas con alta densidad energética sobre el desempeño productivo y características de la canal de cerdos en finalización.

MATERIALES Y MÉTODOS Aspectos de bioética. El Comité de Bioética de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Central de Venezuela (FCV-UCV) avaló la ejecución de este estudio, por ajustarse a los procedimientos establecidos en el protocolo para uso de animales en investigación. Sitio de estudio. El estudio se realizó en el Laboratorio de la Sección de Porcinos del Instituto de Producción Animal en la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela (UCV) en Maracay, Estado Aragua. Las condiciones climáticas de la zona (67°36’36’’ longitud, 10°16’20’’ latitud, y 443 m.s.n.m), son temperatura media de 25.1°C y pluviosidad promedio anual de 1063 mm. Se dispuso de dos galpones experimentales y 35 corrales. En un galpón se utilizaron 20 corrales (4 m2 cada uno), con piso de concreto y separados por paredes; y en el segundo galpón se utilizaron 15 corrales (4.2 m2 cada uno), piso mitad sólido y mitad con drenaje, con divisiones de concreto. Ambos galpones con techo de láminas de aluminio e incidencia de luz diurna. Cada corral estaba provisto de un comedero fijo y un bebedero tipo

Colina - Digestible lysine in pigs of digestible lysine (0.46; 0.52; 0.58; 0.64 y 0.70%). The increase in each level of digestible lysine was obtained by adjusting the amount of corn, soybean meal and synthetic lysine in each one of the diets, which contained 5% raw palm oil, obtaining 3.50 Mcal/kg of metabolizable energy (ME). The content of the rest of the nutrients was adjusted according to the nutritional needs (6). The chemical composition of the ingredients used (corn and soybean meal) and the experimental diets was determined by analyzing the dry matter (DM:105°C/24 h) and crude protein (N Kjeldahl × 6.25) according to the procedures described (16). The content of lysine in experimental diets was determined using near infrared spectroscopy (NIRS). Table 1. Experimental diets. Ingredients, % Yellow corn meal

81.87 81.87 81.85 81.90 81.92

Soybean meal

9.40

9.30

9.24

9.10

9.00

Raw palm oil

5.00

Wheat bran

1.50

Calcium carbonate, 32%

1.15

Phosphate, 18/20

0.27

Vitamins and mineralsa

0.50

Salt

0.30

L-Lysine HCl

0.02

0.11

0.19

0.28

0.36

3.50

Chemical composition Metabolizable energy, Mcal/kgb Total protein, %c

11.57 11.56 11.61 11.63 11.67

Available phosphorus, %b

0.15

Total lysine, %c

0.50

0.57

0.63

0.69

0.76

Digestible lysine, %

0.46

0.52

0.58

0.64

0.70

Calcium, %

0.45

Provides the following quantities per kg of diet according to the manufacturer: Vitamin A, 7000 UI; Vitamin D3, 2000, Vitamin E, 5UI; Vitamin K3, 2 mg; Thiamine, 1.5 mg; Riboflavin, 4 mg; Pyridoxine, 3 mg; Vitamin C, 70 mg; nicotinic acid, 20 mg; pantothenic acid, 8 mg; choline, 130 mg; Antioxidant, 50 mg; Se, 0.23 mg; Mn, 50 mg; Zn, 60mg; Cu. 40 mg; Fe, 80 mg; Co, 0.10 mg b Calculated values c Analyzed values a

Productive performance variables. The pigs were weighed weekly using an electronic scale (TruTest® Speedrite, Series EC 2000) with a 1500 kg capacity. The daily feed intake (DFI) was determined through weighing and recording the feed placed in the feeders minus the feed not consumed weekly by each experimental unit. The average initial live weight (ILW) and the final live weight (FLW) of pigs in each experimental unit, were used to calculate the daily weight gain (DWG) and the feed conversion (FC= DFI/DWG) was estimated. Additionally, the daily intake of lysine (DLI) was estimated considering the content of lysine obtained through analysis of each diet formulated and the intake of lysine for each kilogram of live weight gained (DLI/DWG) according to what suggested in other studies (7,10).

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chupón de acero inoxidable, para suministro de alimento y agua ad libitum, respectivamente. Animales. Se utilizaron 70 cerdos mestizos (Yorkshire × Landrace × Duroc) castrados, con peso promedio inicial de 83.36 kg, provenientes de una granja comercial. Los cerdos fueron alojados al azar, dos por corral y asignados a una de cada cinco dietas experimentales (tratamientos), durante cuatro semanas. Dietas. En la tabla 1 se muestran los ingredientes y composición química de las dietas experimentales, formuladas para obtener cinco diferentes niveles de lisina digestible (0.46; 0.52; 0.58; 0.64 y 0.70%). El incremento en cada nivel de lisina digestible se obtuvo ajustando la cantidad de maíz, soya y lisina sintética en cada una de las dietas, las cuales contenían 5% de aceite crudo de palma, obteniéndose 3.50 Mcal/kg de energía metabolizable (EM). El contenido del resto de los nutrientes se ajustó de acuerdo con las necesidades nutricionales (6). Las composición química de los ingredientes utilizados (maíz y soya) y las dietas experimentales se determinó mediante análisis de la materia seca (MS:105°C/24 h) y proteína cruda (N Kjeldahl × 6.25) de acuerdo a los procedimientos descritos (16). El contenido de lisina en las dietas experimentales se determinó mediante espectroscopia en infrarrojo cercano (NIRS). Variables de desempeño productivo. Los cerdos fueron pesados semanalmente utilizando una báscula electrónica (Tru-Test® Speedrite, Serie EC 2000) con capacidad para 1500 kg. El consumo diario de alimento (CDA) se determinó a través del pesaje y registro del alimento colocado en los comederos menos el alimento no consumido semanalmente para cada unidad experimental. El peso vivo inicial (PVI) y final (PVF) promedio de los cerdos en cada unidad experimental permitieron calcular la GDP y se estimó la conversión de alimento (CA=CDA/ GDP). Adicionalmente, se estimó el consumo diario de lisina (CDLis) considerando el contenido de lisina obtenido mediante análisis de cada dieta formulada y el consumo de lisina por cada kilogramo de peso vivo ganado (CDLis/GDP) de acuerdo con lo señalado en otros estudios (7,10). Determinación de nitrógeno ureico. Para determinar la concentración de nitrógeno ureico (NU) en suero sanguíneo, se extrajeron muestras de sangre a todos los cerdos, entre las 08:00 y 10:00 h el último día del experimento, para ello, se consideraron las normas de bioética para la utilización de animales con fines experimentales en Venezuela (17).

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Determining urea nitrogen. To determine the concentration of serum urea nitrogen (UN), blood samples were taken from each pig between 08:00 y 10:00 h the last day of the experiment considering the bioethical standards for using experimental animals in Venezuela (17). Blood samples were extracted in duplicate by puncture of external jugular vein using 18 G x 1 ½’’ needles and 5 mL vacuum tubes (Gel Clot Activator, Vacuum Diagnostics, Zhejiang, China). The samples were transported to the Laboratory of Clinical Pathology of the FCV-UCV, where the serum was separated by centrifuge at 1.200 g for 20 min at 4°C within 8 h after collection and were conserved in 2 mL aliquots at -20°C until analysis. The analysis was done in duplicate using a quantitative kinetic determination kit (Chemroy®, procedure CR245, Texas, U.S.A.) and the concentration of UN in serum was expressed in mg/dL. Carcass evaluation. When the pigs reached slaughter weight (an average of 102.81 kg), were subjected to a 24 h period of fasting and were moved to the commercial slaughter facility; after 6 h of rest, the pigs were electrically stunned and slaughtered by exsanguination, according to the procedures established in the code for hygiene practices in Venezuela (18). The hot carcass weight was recorded (HCW, with the head and feet), carcass yield (CY) was calculated, and the carcass were later refrigerated (4-6°C) for 16-24 h. After this period the head was removed and the carcass was cut longitudinally into two equal halves, allowing the quantitative characteristics to be evaluated. The backfat thickness (BFT) was measured with a metric ruler in three places: opposite to the first rib, last rib, and last lumbar vertebra, respectively, obtaining an average of the three measurements. A transverse cut between the 10th and 11th intercostal space was performed to measure the Longissimus dorsi muscle area (LDMA) using a grid; the depth of the back fat (BFD) that covers the LDMA was measured with a metric ruler in three positions of the muscle area (1/4, 1/2, and 3/4). The values obtained of the LDMA and the BFD were used to calculate the lean carcass yield (LCY) using prediction equations (6,19). The qualitative characteristics evaluated in the carcass were pH, temperature and water holding capacity (WHC). The pH and the temperature of the carcass were measured in the semimembranious muscle at 45 min (pH45 y T45, respectively) and at 24 h (pH24 y T24, respectively) postmortem using a measuring instrument of pH and temperature (Testo, Testo 23 model), connected to two gauges of solid and semisolid penetration. The

Las muestras de sangre se extrajeron por duplicado mediante punción de la vena yugular externa, utilizando agujas de 18 G x 1 ½’’ y tubos al vacío de 5 mL (Gel Clot Activator, Vacuum Diagnostics, Zhejiang, China). Las muestras fueron transportadas al Laboratorio de Patología Clínica de la FCV-UCV, donde el suero fue separado por centrifugación a 1.200 g por 20 min a 4°C dentro de las 8 h posteriores a su recolección y se conservaron en alícuotas de 2 mL a -20°C hasta su análisis. Los análisis se realizaron por duplicado utilizando un kit de determinación cuantitativa cinética (Chemroy®, procedimiento CR245, Texas, E.E.U.U.) y se expresó la concentración de NU en suero en mg/dL. Evaluación de las canales. Cuando los cerdos alcanzaron el peso para el sacrificio (102.81 kg en promedio), se sometieron a un periodo de ayuno de 24 h y se trasladaron a la planta de faenado industrial; después de 6 h de reposo, los cerdos se aturdieron eléctricamente y se sacrificaron mediante desangrado, de acuerdo con los procedimientos establecidos en el código de prácticas de higiene en Venezuela (18). Se registró el peso de la canal caliente (PCC, con la cabeza y las patas), se calculó el rendimiento en canal (RCC) y luego las canales se refrigeraron (4-6°C) durante 16-24 h. Concluido este periodo, se retiró la cabeza y se dividió la canal longitudinalmente en dos partes iguales, permitiendo evaluar las características cuantitativas. El espesor de grasa dorsal (EGD) se midió con una regla métrica en tres ubicaciones: opuesto a la primera costilla, a la última costilla y a la última vértebra lumbar, respectivamente, obteniéndose el promedio de las tres mediciones. Se realizó un corte transversal entre el 10mo y 11vo espacio intercostal para exponer y medir el área del músculo Longissimus dorsi (AMLD) utilizando una plantilla cuadriculada; la profundidad de la grasa dorsal (PGD) que recubre el AMLD se midió con una regla métrica, en tres posiciones (1/4, 1/2, y 3/4) del área del músculo). Los valores obtenidos del AMLD y la PGD se utilizaron para calcular el rendimiento magro de la canal (RMC) mediante ecuaciones de predicción (6,19). Las características cualitativas evaluadas en la canal fueron pH, temperatura y capacidad de retención de agua (CRA). El pH y la temperatura de las canales se midieron en el músculo semimembranoso, a los 45 min (pH 45 y T 45, respectivamente) y a las 24 h (pH 24 y T 24, respectivamente) postmortem mediante un instrumento de medición de pH y temperatura (Testo, modelo Testo 23), acoplado a dos sondas de penetración de sólidos y semisólidos. La CRA se determinó de acuerdo con la metodología aplicada por Jerez-Timaure et al (20), utilizando

Colina - Digestible lysine in pigs WHC was determined using the methodology applied by Jerez-Timaure et al (20), using 1.6 g of the sample of a fresh steak obtained from the Longissimus dorsi muscle at the 10th intercostal space. The samples were subjected to refrigerated centrifugation to obtain the percentage of water lost due to differences in weight. Additionally, it was estimated through a frequency distribution analysis, the proportion (%) of pale, soft and exudative meat (PSE); dry, firm and dark (DFD); and normal for each treatment, according to the classification suggested by Castrillón et al (21). Experimental design and statistical analysis. The pigs were distributed in a randomized block design (two blocks represented by each barn) with five treatments (levels of digestible lysine), seven replications, and two pigs per experimental unit. The results were expressed as an average of weekly measurements of the DFI, DWG, FC, DLI and DLI/DWG variables of the same experimental unit. The values considered in the analysis of the ILW, FLW, UN variables and the carcass characteristics corresponded to a single measurement. The statistical analysis for all the variables was performed using the Proc Mixed of SAS software (22). A regression analysis was used to observe the linear and quadratic effect on the levels of digestible lysine on each variable. Probability values of p≤0.05 were considered significant.

RESULTS Under the evaluated conditions, significant differences in the productive performance were not detected in FLW, DFI, DWG and FC of the pigs due to the effect of digestible lysine levels, as is shown in table 2. The quadratic effect of the level of digestible lysine was not significant for any of the variables, therefore only the linear effect is presented. The FLW increased linearly (p<0.05) while the FC tended to decrease (p=0.08) with the increase in the level of lysine in the diet. There was no evidence of the increase of DWG per unit of digestible lysine in the diet, as was expected. The DLI and the DLI/DWG varied significantly (p<0.001) among treatments and increased linearly (p<0.001) with the content of digestible lysine in the diet (Table 2). In that sense, the pigs that consumed the diet limiting in lysine (0.46%) had less DLI (p<0.001), in conjunction with the lower quantity (p<0.001) required of this amino acid per kilogram of

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1.6 g de la muestra de un bistec fresco obtenido del músculo Longissimus dorsi a nivel del 10mo espacio intercostal. Las muestras fueron sometidas a centrifugación refrigerada, para obtener el porcentaje de agua perdida por diferencias de peso. Adicionalmente, se estimó mediante un análisis de distribución de frecuencia, la proporción (%) de carnes pálidas, suaves y exudativas (PSE); secas, firmes y oscuras (DFD); y normal para cada tratamiento, de acuerdo con la clasificación sugerida por Castrillón et al (21). Diseño experimental y análisis estadístico. Los cerdos fueron distribuidos en un diseño de bloques al azar (dos bloques representados por cada galpón) con cinco tratamientos (niveles de lisina digestible), siete repeticiones y dos cerdos por unidad experimental. Los resultados se expresan como el promedio de las mediciones semanales de las variables CDA, GDP, CA, CDLis y CDLis/GDP sobre la misma unidad experimental. Los valores considerados en el análisis de las variables PI, PVF, NU y las características de la canal correspondieron a una medición única. El análisis estadístico para todas las variables se realizó utilizando el Proc Mixed del programa SAS (22). Se realizó un análisis de regresión para observar el efecto lineal y cuadrático de los niveles de lisina digestible sobre cada variable. Se consideraron significativos los valores de probabilidad p≤0.05.

RESULTADOS Bajo las condiciones evaluadas, no se detectaron diferencias significativas en el desempeño productivo reflejado en el PVF, CDA, GDP y CA de los cerdos por efecto de los niveles de lisina digestible como se evidencia en la tabla 2. El efecto cuadrático del nivel de lisina digestible no fue significativo para ninguna de las variables, por lo que se presenta únicamente el efecto lineal. El PVF incrementó linealmente (p<0.05) mientras que la CA tendió a disminuir (p=0.08) con el incremento del nivel de lisina en la dieta. No se evidenció el incremento de la GDP por cada unidad del contenido de lisina digestible en la dieta como era de esperarse. El CDLis y la CDLis/ GDP variaron significativamente (p<0.001) entre tratamientos e incrementaron linealmente (p<0.001) con el contenido de lisina digestible de la dieta (Tabla 2). En tal sentido, los cerdos que consumieron la dieta limitante en lisina (0.46%) mostraron menor CDLis (p<0.001), conjuntamente con la menor cantidad (p<0.001) requerida de este aminoácido por kilogramo

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Table 2. Effect of digestible lysine levels in high energy density diets on the productive performance and blood urea of finishing pigs. Variables

Digestible Lysine, % 0.46

0.52

0.58

0.64

0.70

ILW, kg

80.22 83.33 83.22 84.75 85.29 1.70

FLW, kg

99.09 101.66 103.13 102.83 106.23 2.29

DFI, kg

2.95

2.87

2.89

2.79

2.98

0.11

P valuef Lysine Linear 0.30 0.80

0.03 0.96

0.90

0.79

0.92

0.88

0.97

0.06

0.35

0.23

FC, kg/kg

3.29

3.61

3.17

3.15

3.07

0.19 0.13

0.08

13.57a 14.91b 16.77 c 17.89 d 20.87e 0.38 <0.001<0.001

DLI/DWG, 16.34a 19.96bc 18.84ab 21.78c 22.44c 0.97 <0.001<0.001 g/kg UN, mg/dL 40.76 40.76 38.53 38.99 35.03 1.80

0.18

Variables

0.02

SE: Standard error; ILW: initial live weight; FLW: final live weight; DFI: daily feed intake; DWG: daily weight gain; FC: feed conversion (DFI/DWG). The DFI, DWG and FC values correspond to the average over four weeks. DLI: daily lysine intake; DLI/DWG: Lysine intake per kg of live weight gained; UN: concentration of urea nitrogen in serum. abcde Different letters in the same row indicate significant differences according to the value of probability corresponding to the effect of the level of digestible lysine (treatment). f Probability value corresponding to the effect of the level of digestible lysine (treatment) and the linear effect of digestible lysine as the result of the regression analysis, respectively.

P valuea

Digestible Lysine, % 0.64

0.70

Lysine Linear

0.46

0.52

0.58

HCW, kg

74.83

76.12

78.47 76.03 79.97 2.25

0.50

0.06

CY, %

75.99 74.62 75.29 1.12

DWG, kg

DLI, g/d

Table 3. Effect of digestible lysine levels in high energy density diets on the quantitative carcass characteristics of finishing pigs.

75.58

74.91

0.91

0.96

BFT, cm

1.58

1.29

1.55

1.59

1.45 0.13

0.46

0.93

BFD, cm

1.27

0.85

1.13

1.12

0.90 0.10

0.07

0.23

LDMA, cm2 61.23

59.15

61.80 61.73 63.01 2.47

0.85

0.46

LYC, %

63.57

62.57 62.55 63.62 0.96

0.87

0.79

62.53

SE: Standard error; HCW: hot carcass weight; CY: carcass yield; BFT: backfat thickness; BFD: backfat depth; LDMA: longissimus muscle area; LYC: lean yield of carcass. a Probability value corresponding to the effect of the level of digestible lysine (treatment) and the linear effect of digestible lysine as the result of the regression analysis, respectively.

weight gained, while the pigs that consumed the diet with 0.70% of digestible lysine showed the greatest DLI (p<0.001). However, the DLI/DWG of the pigs fed with the diet that contained 0.52% of digestible lysine was not significantly different from that observed in the pigs whose diets contained a greater amount of lysine.

de peso ganado, mientras que los cerdos que consumieron la dieta con 0.70% de lisina digestible mostraron el mayor CDLis (p<0.001). Sin embargo, el CDLis/GDP de los cerdos alimentados con la dieta que contenía 0.52% de lisina digestible no fue significativamente diferente del observado en los cerdos cuyas dietas contenían mayor cantidad de lisina.

The concentration of UN (Table 2) did not significantly change among treatments but decreased linearly (p<0.05) with the increase of digestible lysine in the diet.

La concentración de NU (Tabla 2) no varió significativamente entre tratamientos pero disminuyó linealmente (p<0.05) con el incremento en el contenido de lisina digestible de la dieta.

There were not significant differences among treatments for the quantitative carcass characteristics (Table 3), however the BFD tended to be lower (p=0.07) in the carcass of pigs whose diets contained the greatest level of lysine (0.70%). The HCW tended to increase (linear effect, p<0.06), with the level of lysine in the diet. The qualitative carcass characteristics of the evaluated pigs did not show differences among treatments (Table 4).

No se evidenciaron diferencias significativas entre tratamientos para las características cuantitativas de la canal (Tabla 3), no obstante la PGD tendió a ser menor (p=0.07) en las canales de los cerdos cuyas dietas contenían el más alto nivel de lisina (0.70%). El PCC tendió a aumentar (efecto lineal, p<0.06), con el nivel de lisina en la dieta. Las características cualitativas de la canal de los cerdos evaluados no mostraron diferencias entre tratamientos (Tabla 4).

The result of the frequency analysis to estimate the proportion of PSE, DFD and normal meats (Table 5) showed a greater proportion of meats with normal pH in the pigs fed with the experimental diets; however, within each treatment group and for the total of the samples, the percentage of meats with pH values below normal (PSE) oscillated between 15 and 28%.

El resultado del análisis de frecuencia para estimar la proporción de carnes PSE, DFD y normal (Tabla 5), evidenció en los cerdos alimentados con las dietas experimentales, una mayor proporción de carnes con pH normal; sin embargo dentro de cada grupo de tratamiento y para el total de las muestras, el porcentaje de carnes con valores de pH por debajo de lo normal (PSE) osciló entre 15 y 28%.

Colina - Digestible lysine in pigs Table 4. Effect of digestible lysine levels in high energy diets on the qualitative carcass characteristics of finishing pigs. Variables

Digestible Lysine, % 0.46 0.52 0.58 0.64 0.70

P valuea SE

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Table 5. Proportion (%) of pale, soft and exudative meat (PSE), dry, firm and dark meats (DFD) and normal ones for each treatment. Digestible Lysine, % Variables

Lysine Linear

0.46

0.52

0.58

0.64

0.70

Total

pH45

6.35

6.13

6.26

6.32

6.27

0.09

0.47

0.89

PSE, at pH24

15.38

28.57

9.09

25.0

19.05

pH24

5.71

5.67

5.60

5.68

5.63

0.05

0.60

0.37

DFD, at pH24

7.69

1.59

T45 , C

36.58 36.12 37.15 36.81 36.75 0.53

0.73

0.59

Normal, at pH 24 h

76.92

84.62

71.43

90.91

75.0

79.37

T24, 0C

11.11 11.62 11.59 11.80 11.44 0.46

0.86

0.55

0.11

0.57

CRA, %

6.21

6.39

8.46

5.54

7.40

0.79

SE: Standard error; pH45: pH measured at 45 min postmortem; pH24: pH measured at 24 h postmortem; T45: temperature measured at 45 min postmortem; T24: temperature measured at 24 h postmortem; WHC: water holding capacity, expresses the water lost by effect of centrifugation. a Probability value corresponds to the effect of the level of digestible lysine (treatment) and the lineal effect of digestible lysine as the result of regression analysis, respectively.

Total evaluated

Estimated proportion using the measurement of pH at 24 h (pH24) according to that suggested by Castrillón et al (21).

DISCUSSION

DISCUSIÓN

The results indicate that it is probable that the levels of digestible lysine evaluated were not adequate to detect the differences in the DWG, DFI, FC and FLW variables due to the treatment. Studies conducted on finishing pigs fed with deficient diets or ajusted to the lysine requirement and containing 3.4 Mcal/ kg of EM have also shown that there is no effect of dietary lysine level on DFI and DWG (12). Even in growing pigs, fed with lower energy density diets, the effect of lysine on the productive performance has not been observed (3,23). According to those reported by several authors (4,12,13,23,24), the DFI is a variable that generally is not affected by the content of lysine in the diet, response that is observed when the diets are isocaloric and the daily intake of lysine increases linearly with the content of lysine in the diet, such as in the case of the present study. Although this response was evident without significant variations in the DFI among treatments, it is indicative that the pigs do not regulate this intake in function to the amino acids present in the diet (5) but the increase of lysine intake is proportional to the content of this amino acid in it (3,23,24). This argument explains the differences in DLI with each increase in the level of digestible lysine.

Los resultados indican que es probable que los niveles de lisina digestible evaluados no fueran adecuados para detectar diferencias en las variables GDP, CDA, CA y PVF por efecto de tratamiento. Estudios conducidos con cerdos en finalización alimentados con dietas deficientes o ajustadas al requerimiento de lisina y que contenían 3.4 Mcal/kg de EM, también han señalado que no hay efecto del nivel de lisina en la dieta sobre el CDA y la GDP (12). Aún en cerdos en etapa de crecimiento, alimentados con dietas de menor densidad energética, no se ha observado efecto del contenido de lisina sobre su desempeño productivo (3,23). De acuerdo con lo señalado por diversos autores (4,12,13,23,24), el CDA es una variable que generalmente no es afectada por el contenido de lisina en la dieta, respuesta que se evidencia cuando las dietas son isocalóricas y el consumo diario de lisina aumenta linealmente con el contenido de lisina de la dieta, tal como es el caso del presente estudio. Aunque esta respuesta se evidenció sin variaciones significativas del CDA entre tratamientos, es indicativa de que los cerdos no regulan este consumo en función de los aminoácidos presentes en la dieta (5), pero el incremento del consumo de lisina es proporcional al contenido de este aminoácido en la misma (3,23,24). Argumento que permite explicar las diferencias en el CDLis con cada aumento en el nivel de lisina digestible.

Previous studies have observed significant variations in DWG and FC by increasing the levels of lysine in diets with 3.6 Mcal/kg (9) and 3.48 Mcal/kg of EM (10), however, the response could be influenced by the ingredients used. Other studies (9,10) used choice white grease to maintain high the energy density of the diets and increasing the content of lysine,

Estudios previos han observado variaciones significativas en la GDP y la CA al incrementar los niveles de lisina en dietas con 3.6 Mcal/kg (9) y 3.48 Mcal/kg de EM (10), no obstante, la respuesta podría estar influenciada por los ingredientes utilizados. Otros estudios (9,10) utilizaron grasa selecta para mantener alta la densidad energética

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while in the present study raw palm oil was used. This energetic ingredient, an alternative to traditional lipid sources in the tropics, can be added in a diet for finishing pigs without effects on productive performance (25). It was observed that DLI/DWG in the diet of 0.52%, corresponding to the recommended value (6), did not significantly differ from that obtained with diets that contained a greater amount of lysine. The pigs in this study consumed between 16.34 and 22.44 g of lysine/kg of DWG, values within the range observed in the literature for pigs of similar weight (8-10). It has also been shown that the quantity of DLI/DWG increases linearly and the DWG does not significantly change by increasing the content of lysine in the diet (4), response that also coincides with the results. The UN concentration did not change significantly among treatments, which is explainable since the diets had similar values of crude protein. On the other hand, the regression analysis showed a linear reduction of UN with the increase of the digestible lysine levels in the diet. In that sense, it is probable that the digestible lysine levels used were very close to each other, impeding noticeable differences among treatments. It has been highlighted that the quantity of lysine consumed is used for maintenance and protein deposition (6), after which it is catabolized and the resulting nitrogen is excreted as urea. The excess of amino acids in the diet has been related to high UN concentrations (26) and therefore the concentration of urea in blood is an indicator of protein metabolism. In this study the concentration of UN decreased linearly, which indicates that there was no excess of amino acids. Respecting the results obtained in the UN, other studies (24,26) have not observed differences among treatments by increasing the levels of digestible lysine in the diet. Referring to the quantitative carcass characteristics, although there was a linear trend of HCW to increase with the lysine content, overall no significant differences were observed among treatments. This result indicates that the increase of HCW was associated to the simultaneous increase of the FLW. According to the results of the current study, increasing the levels of digestible lysine in the diet does not affect the quantitative carcass characteristics of finishing pigs (8, 24) nor have significant effects been detected when changing the nutritional plan by adjusting those levels in the diets on carcass yield or lean carcass yield (5).

de las dietas e incrementando el contenido de lisina, mientras que en el presente estudio se utilizó aceite crudo de palma. Este ingrediente energético alternativo a las fuentes lipidicas tradicionales en el trópico, puede ser incluido en la dieta para cerdos en finalización sin efectos sobre el comportamiento productivo (25). Se observó que el CDLis/GDP en la dieta de 0.52%, correspondiente al valor recomendado (6), no difirió significativamente de la obtenida con las dietas que contenían mayor cantidad de lisina. Los cerdos del presente estudio consumieron entre 16.34 y 22.44 g de lisina/kg de GDP, valores que se ubicaron dentro del rango observado en la literatura para cerdos de peso similar (8-10).También se ha demostrado que la cantidad de CDLis/GDP aumenta linealmente y la GDP no varía significativamente al incrementar el contenido de lisina en la dieta (4), respuesta que también coincide con los resultados expuestos. La concentración de NU no varió significativamente entre tratamientos, lo cual es explicable ya que las dietas mantuvieron valores semejantes de proteína cruda. Por otra parte, el análisis de regresión evidenció la disminución lineal de NU con el incremento en los niveles de lisina digestible en la dieta. En tal sentido, es probable que los niveles de lisina digestible utilizados fueran muy cercanos entre sí, impidiendo evidenciar diferencias entre tratamientos. Se ha señalado que la cantidad de lisina consumida es utilizada para cubrir las necesidades de mantenimiento y deposición de proteína (6), luego de lo cual es catabolizada y el nitrógeno resultante de ese catabolismo es excretado como urea. El exceso de aminoácidos en la dieta, se ha relacionado con altas concentraciones de NU (26) por lo que la concentración de urea en sangre es un indicador del metabolismo proteico. Debido a que en el presente estudio la concentración de NU disminuyó linealmente, indica que no existió exceso de aminoácidos. Con respecto a los resultados obtenidos en la NU, otros estudios (24,26) no han observado diferencias entre tratamientos al incrementar los niveles de lisina digestible en la dieta. Referente a las características cuantitativas de la canal, aunque se observó una tendencia lineal del PCC a aumentar con el contenido de lisina,de manera general,no se observaron diferencias significativas entre tratamientos para estas características. Este resultado indica que el aumento en el PCC estuvo asociado al aumento simultáneo del PVF. De acuerdo con los resultados del presente estudio, se ha evidenciado que el incremento de los niveles de lisina digestible en la dieta no afecta las características cuantitativas de la canal de cerdos en etapa de finalización (8,24), así como tampoco

Colina - Digestible lysine in pigs Regarding the qualitative carcass characteristics of finishing pigs fed with different levels of lysine, it has been shown that characteristics such as pH (2,3,12) and WHC (2) are not affected. It has been noted (3,24) that carcass characteristics vary little in response to variations in the content of lysine in the diet, which may be attributed in this study to the fact that the feed intake was similar among different treatments and when experimental diets were formulated, a similar energy density was maintained, and the digestible amino acid requirements were considered. Moreover, these aspects also explain the invariable response in the productive performance of the pigs evaluated. With respect to the frequency distribution analysis to estimate the proportion of PSE, DFD and normal meat, there was greater proportion of meat with normal pH in all the carcass evaluated. Lysine levels in the diet did not affect the pH or temperature of the carcass, so that the occurrence of PSE meat can be attributed to chronic stress just before slaughter (27) or the handling of pigs, especially while stunning (20). The PSE meat is a defect associated with a rapid rate of postmortem glycolysis, which is characterized by a high acidification rate in the meat; while DFD meats are due to prolonged stress that consumes the reserves of muscular glycogen before slaughter, resulting in a low production of lactic acid (1). Studies in Mexico have found a proportion of PSE pork meat between 3.5 and 8.0% (1), while in Venezuela va l u e s b e t w e e n 8 a n d 1 0 % h a v e b e e n observed, and a greater percentage of meats with pH24 values that have oscillated between 5.5 and 6.0 (20). However, the proportion of PSE meats was lower when compared with that shown in this study, while the pH24 values are slightly lower than those observed in the country (15). According to Castrillón et al (21), for pork meat, values of pH24 ≤ 5.5 indicate PSE meats; values of pH24 ≥ 6.0, are considered DFD meats, while values between 5.6 and 5.9 indicate normal meats. The proportion of normal meat was close to that obtained by Alarcón et al (1), although inferior to that observed in a study in Venezuela (20). The results allow to conclude that the levels of digestible lysine between 0.46 and 0.70% in diets with 3.5 Mcal/kg of ME do not affect the productive performance and carcass characteristics of finishing pigs. However, the amount of lysine consumed per unit of weight gained increased with the level of digestible lysine in the diet.

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se han detectado efectos significativos al variar el plano nutricional ajustando estos niveles en las dietas, sobre el rendimiento en canal o rendimiento magro de la canal (5). Con respecto a las características cualitativas de la canal de cerdos alimentados en la etapa de finalización con diferentes niveles de lisina, se ha demostrado que las características como pH (2,3,12) y CRA (2) no se afectan. Se ha señalado (3,24) que las características de la canal varían poco en respuesta a variaciones en el contenido de lisina en la dieta, lo que puede atribuirse en el presente estudio, a que los cerdos mostraron un consumo de alimento semejante en los distintos tratamientos, y al formular las dietas experimentales se mantuvo similar la densidad energética de la dieta y se consideraron las necesidades de aminoácidos digestibles. Además, estos aspectos también permiten explicar la respuesta sin variaciones en el desempeño productivo de los cerdos evaluados. Con respecto al análisis de distribución de frecuencia para estimar la proporción de carnes PSE, DFD y normal, existió mayor proporción de carnes con pH normal en todas las canales evaluadas. Los niveles de lisina en la dieta no afectaron el pH ni la temperatura de las canales, por lo que la ocurrencia de carnes PSE puede atribuirse al estrés crónico justo antes del beneficio (27) o al manejo de los cerdos, principalmente durante el aturdimiento (20). La carne PSE es un defecto asociado con una tasa rápida de glicólisis post-mortem, la cual se caracteriza por una alta tasa de acidificación de la carne; mientras que las carnes DFD se debe a un estrés prologando que consume las reservas de glucógeno muscular antes del sacrificio, resultando en escasa producción de ácido láctico (1). Estudios en México, han encontrado una proporción de carne de cerdo PSE entre 3.5 y 8.0% (1), mientras que en Venezuela se han observado valores entre 8 y 10% y mayor porcentaje de carnes con valores de pH24 que han oscilado entre 5.5 y 6.0 (20). No obstante, la proporción de carnes PSE fue menor al compararse con la evidenciada en el presente estudio, mientras que los valores de pH24 son ligeramente más bajos a los observados en el país (15). Según Castrillón et al (21), para carne de cerdo, valores de pH24 ≤ 5.5 indican, carnes PSE; valores de pH24 ≥ 6.0, se consideran carnes DFD, mientras que valores entre 5.6 y 5.9 indican carnes normales. La proporción de carnes normales se aproximó a la obtenida por Alarcón et al (1), aunque inferior a la observada en un estudio de Venezuela (20). Los resultados permiten concluir que los niveles de lisina digestible entre 0.46 y 0.70% en dietas

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The linear increase of final live weight per unit of lysine was noted without the concomitant increase in weight gain, and without differences among treatments, which may be associated with the fact that lysine levels evaluated were not wide enough each other to detect it. In this regard, conducting further studies to evaluate digestible lysine levels of greater amplitude at various levels of metabolizable energy is recommended. Acknowledgments To the Council of Scientific and Humanistic Development of the Universidad Central de Venezuela (Proyect-PG-11-8192-2011/1). To Crisna Tovar, Assistant of the Laboratory of Clinical Pathology of the FCV-UCV and Franklin Mora, Swine Section of the Agronomy FacultyUCV, for the support given in the laboratory and experimental activities, respectively.

con 3.5 Mcal/kg de EM no afectan el desempeño productivo y las características de la canal de los cerdos en etapa de finalización. No obstante, la cantidad de lisina consumida por unidad de peso ganado aumenta con el nivel de lisina digestible en la dieta. El incremento lineal del peso vivo final por cada unidad del contenido de lisina se evidenció sin el concomitante aumento en la ganancia de peso, y sin diferencias entre tratamientos lo que podría asociarse a que los niveles de lisina evaluados no fueron lo suficientemente amplios entre sí para detectarlas. En tal sentido, se recomienda la realización de nuevos estudios dirigidos a evaluar niveles de lisina digestible de mayor amplitud a varios niveles de energía metabolizable. Agradecimientos Al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Central de Venezuela (ProyectoPG-11-8192-2011/1). A Crisna Tovar, Asistente del Laboratorio de Patología Clínica de la FCV-UCV y al Ing. Franklin Mora de la Sección Porcinos de La Facultad de Agronomía-UCV, por su apoyo en las actividades de laboratorio y campo, respectivamente.

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Rev.MVZ Córdoba 20(2):4534-4543, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Subclinical laminitis and its association with pO2 and faecal alterations: Isikli, Aydin experience Laminitis subclínica y su asociación con pO2 y alteraciones fecales: experiencia Isikli, Aydin Ibrahim Akin,1* Ph.D, Deniz Alic Ural,2 Ph.D, Mehmet Gultekin,3 Ph.D, Kerem Ural,3 Ph.D Adnan Menderes University, Faculty of Veterinary, 1Department of Surgery, 2Faculty Farm, 3Department of Internal Medicine, 09016, Isikli, Aydin-Turkey. Corresponding: ibraak@hotmail.com Received: June 2014; Accepted: December 2014.

ABSTRACT Objective. The aim of this field trial was to investigate the relationships among subclinical laminitis, hematological, ruminal and faecal alterations. Materials and Methods. To this extent dairy cows presenting subclinical laminitis (n=11) and to those of other healthy cows without laminitis (n=10) were enrolled and assigned into two groups. All animals were receiving the same daily ration formulated to contain 47% cornsilage and 18% hay, mainly. Effects of subclinical laminitis challenges on measurements of feces, and blood samples, were investigated to determine which of these measurements may aid in the diagnosis. pH changes in ruminal fluid collected via rumenocentesis were measured. Besides the following parameters were also measured; blood pH, faecal pH and faecal scoring. Blinded investigators performed the sample collection. Results. No statistical differences between the groups were detected for blood gas values studied regarding pCO2, HCO3, BE, indeed mean that pO2 values decreased statistically (p<0.05) and faecal pH was significantly decreased (p<0.05) in cows with subclinical laminitis in contrast to healthy controls. Conclusions. pO2 values and faecal pH may be valuable as indirect indicators of subclinical laminitis in cattle. Key words: Dairy cattle, laminitis, nutrition (Source: CAB).

RESUMEN Objetivos. El objetivo de esta prueba de campo fue investigar las relaciones entre la laminitis subclínicay alteraciones hematológicas, ruminales y fecales. Materiales y métodos. Las vacas lecheras que presentaron laminitis subclínica (n=11) y las vacas sanas sin laminitis (n=10) fueron reclutadas y asignadas en dos grupos. Todos los animales recibieron la misma ración diaria que contenía 47% de ensilaje de maíz y 18% de heno, principalmente. Los efectos de la laminitis subclínica sobre las mediciones de las heces y muestras de sangre, fueron investigados para determinar cuál de estas mediciones pueden ayudar en el diagnóstico. Se midieron los cambios de pH en el fluido ruminal recogido a través rumenocentesis. Además, también se midieron los siguientes parámetros; pH de la sangre, el pH fecal y la puntuación fecal. La toma de las muestras se realizó a doble ciego. Resultados. No se detectaron diferencias significativas entre los grupos para los valores de los gases sanguíneos estudiados en relación con la pCO2, HCO3, BE; lo que significa que los valores de pO2 disminuyeron estadísticamente (p<0.05) y que el pH fecal se redujo significativamente (p<0.05) en las vacas con laminitis subclínica; en contraste con los controles sanos. Conclusiones. Los valores de PO2 y pH fecal pueden ser valiosos como indicadores indirectos de la laminitis subclínica en el ganado. Palabras clave: Ganado de leche, laminitis, nutrición (Fuente: CAB). 4534

Akin - Subclinical laminitis related to ruminal and faecal indicators

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The economic significance and animal welfare consequences of lameness in dairy cattle are substantial (1). Subclinical laminitis (inflammation of the corium within the hoof) is a well recognized trigger condition for many of disorders in the hoof, and is considered by predisposing factor in lameness in dairy cattle (2,3). Therefore, it has been considered the main factor to iniating lameness following lactations in dairy cows (4).

La importancia económica y consecuencias de claudicación en ganado lechero para el bienestar animal (1). La laminitis subclínica (inflamación del corión en el casco) es una condición desencadenante ampliamente reconocida para muchos desórdenes de los cascos, y es considerada un factor predisponente para la claudicación en el ganado lechero (2,3). En consecuencia, ha sido considerado el principal factor para iniciar claudicación luego de lactaciones en vacas lecheras (4).

Lameness is one of the major cow health concerns regarding dairy industry (5-7). Physical etiology of lameness, are discussed in detail (3,8,9), indeed nutrition is frequently dictated as a major cause of lameness. Despite what has been discussed, the significant relationship regarding lameness and dietary composition is comparatively poorly described. Contrarily, ruminal functioning is almost suggested as the predisposing factor, even if lameness is attributable to nutrition (10). On the basis of previous works lacking detailed information, the present authors examined ruminal pH, blood pH, faecal pH and blood gas during subclinical laminitis in dairy cows with the aim of identifying any relationships among laminitis and those aforementioned physiological parameters in association to a suitable nutrition.

MATERIAL AND METHODS Study site and geographical location. The present retrospective study was performed in a private dairy farm located at Isikli, Aydin province of Turkey. Aydin city is located at the Eagean region of Turkey. The dairy farm consisted 500 dairy cattle. The latter city has warm climatic conditions in general, which is quite suitable for dairy farming. The diet involved for the dairy cattle in the present study was shown in table 1. Inclusion criteria and sampling. Cows enrolled in the present study were examined in the hoof trimming chute in an attempt to evaluate the presence of the clinical findings (involving yellowish discoloration and waxy hoof, heel erosion, sole haemorrage, white line separation, abnormal hoof grown), of subclinical laminitis (11). Cows, diagnosed within subclinical laminitis had two or more mentioned laminitis-like lesions of the subclinical laminitis, and were enrolled within the study as subclinical laminitis group. Healthy group did not present mentioned lesions and regular hoof shape was detected. Regarding time of sampling for collection of ruminocentesis and other relevant parameters, samples were collected at a time when rumen pH

La claudicación es uno de las principales preocupaciones de salud bovina en la industria lechera (5,7). La etiología física de claudicación se discute en detalle (3,8,9), de hecho la nutrición es a menudo considerada como la principal causa de claudicación. A pesar de lo que ha sido discutido, la importante relación entre la claudicación y la composición de la dieta es comparativamente descrita de manera vaga. Por el contrario, el funcionamiento ruminal es casi sugerido como un factor predisponente, aún si la claudicación es atribuible a la nutrición (10). Basado en trabajos anteriores que carecen de información detallada, las autores actuales examinaron el pH ruminal, pH de la sangre, pH fecal y gas en la sangre durante laminitis subclínica en vacas lecheras con el propósito de identificar cualquier relación entre laminitis y los parámetros fisiológicos anteriormente mencionados, en asociación con una nutrición idónea.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio y ubicación geográfica. El presente estudio retrospectivo fue llevado a cabo en una granja lechera privada ubicada en Isikly, Aydin, provincia de Turquía. La granja lechera consistía de 500 vacas lechera. La anterior ciudad tiene condiciones climáticas cálidas en general, lo cual es adecuado para la ganadería lechera. La dieta del ganado lechero en este estudio se muestra en la tabla 1. Criterios de inclusión y muestreo. Las vacas inscritas en el presente estudio fueron examinadas en la tolva de recorte de pezuña con el propósito de evaluar la presencia de hallazgos clínicos (involucrando descoloración amarillenta y casco grasoso, erosión de talón, hemorragia de la planta, separación de línea blanca y crecimiento anormal del casco), de laminitis subclínica (11). Las vacas, diagnosticadas con laminitis subclínica tuvieron dos o más de las mencionadas lesiones de tipo laminitis de laminitis subclínica, y fueron inscritas en estudio dentro del grupo de laminitis

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Table 1. Ingredient and chemical composition of the diet. Ingredient

% DM

Corn silage (35% DM)

47.79

Hay

17.80

Sunflower meal (25% CP) Soybean meal (44% CP) Wheat bran

4.45 6.75 22.76

Dicalcium phosphate (DCP)

0.10

Calcium carbonate, CaCO3

0.25

Salt

0.05

Vitamin and mineral premix

0.05

Chemical composition and nutritional facts NDF, % DM

45.80

Dry matter intake/day

19.77

Crude protein, % DM

14.5

Nel, Mcal/kg DM

1.45

Ca, % DM

0.45

Adopted similarly from the study of Ural et al (10).

is likely to be near the lowest point of the day, as reported previously (12). As the ration was fed as a total mixed ration (TMR), the samples were withdrawn at 4 hours after the cows get access to the fresh ration. All samples were collected once throughout the study period. Laboratory measurements

subclínica. El grupo saludable no presente las mencionadas lesiones y se detectó forma normal del casco. Con relación al tiempo de recolección de muestras de ruminocentesis y otros parámetro relevantes, las muestras fueron recolectadas en momentos en los que el pH del rumen es más probable cercano al punto más bajo del día, según se reportó anteriormente (12). Como la ración fue suministrada como una ración total mixta (RTM), las muestras fueron tomadas 4 horas después de que las vacas tuvieron acceso a la ración fresca. Todas las muestras fueron recolectadas una sola vez durante el periodo de estudio. Mediciones de laboratorio. Medición del pH del Rumen. El pH de muestras de fluido ruminal recolectados a las 15.00 del día, como se reportó anteriormente (13), en un momento óptimo para mediciones de pH ruminal, 5 horas después de pastar y suministro de concentrado, fueron determinadas inmediatamente después de la recolección con un calibrador electrónico Accumet Basic 15pH. Los datos de pH fueron resumidos como pH mínimo, máximo y promedio.

Rumen pH measurement. The pH of the rumen fluid samples collected at 15.00 of day time, as reported previously (13), at optimal recommended timing for ruminal pH measuremets, 5 hours after forage and concentrated fed separately were determined immediately after collection with an electronic caliber Accumet Basic 15 pH meter. The pH data were summarized as minimum, maximum and average pH.

Muestreo fecal y análisis. Las muestras fecales fueron recolectadas luego de restringir los animales y desinfectar el área perianal. Cada muestra individual fue fotografiada y luego diligentemente mezclada. Una submuestra de 10 gramos fue mezclada en 10 ml de agua destilada. Lo anterior fue seguido de una medición de pH fecal utilizando el mismo calibrador electrónico utilizado para la medición del pH del fluido ruminal.

Faecal sampling and analysis. Faecal samples, were collected after restraining the animals and disinfection of the perianal area. Each individual sample was photographed, and then was thoroughly mixed. A subsample of 10 g was mixed into distilled water of 10 ml. This was followed by the faecal pH measurement using the same caliber, used for the rumen fluid pH measurement.

Muestras de sangre y análisis. Sangre entera sacada en tubos vacutainer con K3EDTA, fue analizada en la facultad de Veterinaria, Laboratorio Central ubicado en Adnan Mederes University, Aydin (no se muestran datos). La sangre entera heparinizada también fue analizada con relación a pH, pCO2, pO2, Na+, K+, and Ca2+ utilizando un analizador de gases en sangre Trupoint.

Blood sampling and analysis. Whole blood withdrawn into vacutainer tubes with K3EDTA, was analyzed at the Veterinary Faculty, Central Laboratory located in Adnan Menderes University, Aydin (data not shown). Heparinized whole blood was also analyzed for pH, pCO2, pO2, Na+, K+, and Ca2+ using a Irma Trupoint blood gas analyzer.

Análisis Estadístico. Los datos normalmente distribuidos fueron analizados con pruebas t a muestras independientes para comparar las medias de los dos grupos. Las calificaciones fecales fueron analizadas con la Prueba U Mann-Whitney. Los valores P≤0.05 fueron considerados significativos. Los resultados fueron presentados como medas ± SE.

Akin - Subclinical laminitis related to ruminal and faecal indicators Table 2. Blood gas, ruminal and faecal analysis in cows with subclinic laminitis and healthy cows without laminitis. Groups

ScL group (n:11)

C group (n:10)

pCO2 pO2 HCO3 TCO2 BE Blood pH Ruminal pH Faecal pH Faecal score

47.42±0.78 38.93±1.70 31.30±0.41 32.72±0.42 7.37±0.49 7.43±0.01 6.06±0.05 6.14±0.14 4 (1-4)

48.38±1.11 46.11±2.01 31.29±1.64 32.71±1.69 6.34±1.47 7.43±0.01 6.20±0.06 6.50±0.10 3 (2-4)

0.480 0.014* 0.995 0.996 0.522 0.990 0.097 0.050* 0.809

ScL group=cows with subclinical laminitis; C group= Healthy cows without laminitis. Values were expressed as means ± SE mean. Faecal scores were presented as the median (min-max). (*p<0.05).

Statistical analysis. Normal distributed data were analyzed by independent samples t-test to compare means of two groups. Faecal scores were analyzed by Mann-Whitney U test. p≤0.05 were considered to be significant. The results were presented as the means ± SE.

RESULTS The average values of analyzed parameters and their standard error of the means were presented in table 2. No statistical differences between the groups were detected for blood gas values studied regarding pCO2, HCO3, BE, indeed mean pO2 values decreased statistically (p<0.05) in cows with subclinical laminitis. Ruminal fluid pH changes. Normal rumen pH condition was detected within the vast majority of the animal enrolled in group ScL, whereas only one cow with subclinical laminitis had a ruminal pH value of 5.79, in which is a critical value regarding subacute ruminal acidosis (SARA) (14-17). Faecal alterations. Faecal pH and faecal scoring results were shown in table 2. Analysis deemed statistical significance for faecal pH values. Subclinical laminitis signs. Relevant clinical findings were shown in figure 1.

DISCUSSION Ruminal changes and its interpretation. In the present study Subacute Ruminal Acidosis (SARA) was not a contributing factor the relationship among physiological parameter detected and laminitis, as 1 cow was diagnosed with suspected SARA. Gozho et al (14) stated

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RESULTADOS Los valores promedio de los parámetros analizados y su desviación estándar de la media se presentan en la tabla 2. No hubo diferencias estadísticas entre los valores de gas en sangre detectados con relación a pCO2, HCO3, BE, de hecho los valores de pO2 se redujeron estadísticamente (p<0.05) en vacas con laminitis subclínica. Cambio en pH del fluido ruminal. Se detectó una condición del pH ruminal normal en la gran mayoría de animales inscritos en el grupo ScL, mientras que sólo una vaca con laminitis subclínica tenía un pH ruminal con un valor de 5.79, el cual es crítico con relación a acidosis ruminal subaguda. (SARA) (14-17). Alteraciones fecales. El pH fecal y los resultados de puntuación fecal se muestran en la tabla 2. El análisis arrojó significancia estadística para los valores de pH fecal. Señales de laminitis subclínica. Hallazgos clínicos relevantes se muestran en la figura 1.

DISCUSIÓN Cambios ruminales y su interpretación. En el presente estudio la Acidosis Ruminal Subaguda (SARA) no fue un factor contributivo a la relación entre el parámetro fisiológico detectado y la laminitas, ya que 1 vaca fue diagnosticada con sospecha de SARA. Gohzo et al (14) establecen la detección de SARA por pH ruminal entre 5.2-5.6 durante por lo menos 3 horas continuas en una medición diaria por catéter permanente de pH. Para el contexto completo del presente estudio, la se considera que ocurre acidosis ruminal cuando el pH ruminal <5.8, y acidosis ruminal aguda con pH <5.2, aun si se observó cualquier caso. De hecho, pueden ser necesarias más alteraciones severas del pH ruminal para predecir cambios en el funcionamiento epitelial ruminal (16,17), la disponibilidad del uso del pH 5.8 como umbral de derivación de la eficacia de un pH bajo en la digestión de fibras, así como el riesgo probable de daño epitelial. En el presente estudio sólo 1 vaca presentó un valor de pH ruminal de 5.79, lo cual sugiere que las otras vacas no estaban experimentando SARA, por lo menos en el momento de inscripción al estudio. Por ende SARA no acompaña la laminitis en relación a los animales involucrados en este estudio. Cambios fecales y su interpretación. Las heces del ganado pueden ofrecer conocimientos

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Figure 1. Subclinical laminitis signs on the hoof as solear view after griming in some cases of the study. Case a: Normal healthy hoof. Case b: Hemorrhagic discoloration on the sole and white line, yellowish and waxy hoof. Case c: Hemorrhagic discoloration, yellowish and waxy hoof, slightly heel erosion. Case d: Yellowish discoloration, waxy hoof, heel erosion, abnormal hoof grown, irregular white line and sole horn.

determining SARA by rumen pH between 5.2-5.6 for at least 3 hours continuously in a daily measurement via an indwelling pH catheter. For the entire context of the present study, ruminal acidosis was considered to occur when ruminal pH<5.8, and acute ruminal acidosis when pH<5.2, even if any case was observed. Indeed more severe alterations within the ruminal pH might be necessary to predict changes in ruminal epithelial functioning (16,17), the availability to use of pH 5.8 as a threshold bypass the efficacy of low pH on fiber digestion, as well as the probable risk regarding epithelial damage. In the present study solely 1 cow presented a ruminal pH value of 5.79, suggesting that other cows were not experiencing SARA, at least at the time of study enrollment. Therefore SARA was not accompanying to laminitis for the animals involved at the present study. Faecal changes and its interpretation. The faeces of stock may provide significant knowledge regarding indirect proof of clinical and sub-clinical acidosis. Several factors involving parasites and diseases may result in scouring.

significativos con relación a pruebas indirectas de acidosis clínica y subclínica. Varios factores que involucran parásitos y enfermedades pueden resultar en scouring. Las manadas que cuentan con un alto porcentaje de contenido fecal blando y no formado, las vacas con una prevalencia alta de scouring o material fecal en el perineo pueden mostrar acidosis. Esta condición puede apoyarse en otros factores relevantes, incluyendo la prevalencia de claudicación, evaluación de raciones, muestro de rumen, concentración de grases en la lecha y actividad de masticado reducida, para un mejor y más definitivo diagnóstico (9,13,15). Como se mencionó anteriormente sólo 1 vaca con un valor crítico de SARA presento scour, con un puntaje fecal de 1. Interesantemente, el anterior puntaje no tuvo efecto alguno sobre el puntaje clínico total del grupo ScL, lo cual resultó en ausencia de significancia estadística entre los grupos. Las alteraciones por SARA no tuvieron influencia en el pH fecal (13,18). En un estudio relativamente reciente se sugiere que existen diferencias en el pH fecal entre 09:00 y 15:00, lo cual indica que el

Akin - Subclinical laminitis related to ruminal and faecal indicators Herds possessing large percentage of soft and un-formed faecal content, cows with a high prevalence scouring or faecal material within the perineum might be showing acidosis. This condition might be supported with other relevant indicators, including the prevalence of lameness, ration evaluation, rumen sampling, milk fat concentration and reduced chewing activity for a better and definitive diagnosis (9,13,15). As aforementioned above only 1 cow with a critical value for SARA was presenting scour, with a faecal score as 1. Interestingly the latter score did not have an effect on total clinical score in group ScL, resulting within no statistical significance between groups. SARA alterations did not have influence on faecal pH (13,18). In a relatively new study it was suggested that there was differences in faecal pH between 09:00 and 15:00, indicating that the timing of the faecal pH analysis must be considered for evaluation of the faecal pH (13). In contrast Morgante et al (12) determined that cows with SARA [ruminal pH>5.8 (acidotic cows)] presented a faecal pH (6.50±0.04) lower than that from cows (6.65±0.03) without SARA (ruminal pH>5.8). Eastridge (19) stated that faecal pH might be reduced, even in case of excessive amounts of starch escape digestion, resulting in large elevation of hindgut fermentation. Relevant differences in the dietary concentrate contents among the present study and those of Li et al (13), Morgante et al (12) and Enemark et al (18) may be briefly explained within the discrepancy among the effects of SARA on faecal pH for those studies. Only one cow with laminitis was diagnosed within a critical value for SARA due to low ruminal pH, as 5.79, in the present study, whereas the rest of the animal did not present SARA. Faecal pH was variable and did not correlate with the ration involved in the present study. Faecal pH showed differences among groups, in which cows with subclinic laminitis presented a significantly lower faecal pH. It has been well known that faecal pH monitoring is strongly dependent on duration between sampling and measuring, besides may be influenced by management factors, (cattle movement/feding, barn cleaning i.e.) (20). In the present study the duration between sampling and analysing was too short (within seconds), suggesting that time was excluded as a factor influencing analysis. From another point of view as SARA alterations did not have influence on fecal pH (15, 18), whereas timing of the sampling had had disperancy on fecal pH as must be taken into consideration (15). Fecal pH is lowered when excessive amount of starch escape digestion from the rumen and intestines, resulting with an increased hindgut fermentation

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tiempo de análisis de pH fecal debe considerarse para la evaluación del pH fecal (13). En contraste, Morgante et al (12) determinaron que las vacas con SARA [pH ruminal > 5.8 (vacas acidóticas)] presentaron un pH fecal (6.50±0.04) menor que el de vacas (6.50±0.03) sin SARA (pH ruminal >5.8). Eastridge (19) estableció que el pH fecal puede reducirse, aun en casos de digestión con excesivo escape de almidón, resultando en una alta elevación de fermentación del intestino posterior. Diferencias relevantes en los contenidos del concentrado en la dieta entre el estudio actual y el de Li et al (13), Morgante et al (12) y Enemark et al (18) pueden ser brevemente explicadas dentro de las discrepancias entre los efectos de SARA en el pH fecal para estos estudios. Una vaca con laminitis fue diagnosticada con un valor crítico de SARA debido a bajo pH ruminal, de 2.79, en el presente estudio, mientras que el resto de los animales no presentaron SARA. El pH fecal fue variable y no tuvo correlación con las raciones involucradas en el presente estudio. El pH fecal mostró diferencias entre grupos, en las que vacas con laminitis subclínica presentaron un pH fecal significativamente bajo. Es de conocimiento que el monitoreo del pH fecal depende fuertemente de la duración entre el muestreo y la medición, además de ser influenciado por factores de gestión (movimiento del ganado/alimentación, limpieza de establos, por ejemplo) (20). En el presente estudio la duración entre el muestreo y el análisis fue muy corto (en segundo), sugiriendo que el tiempo fue excluido como un factor que influencia el análisis. Desde otro punto de vista, las alteraciones de SARA no tuvieron influencia en el pH fecal (15,18), mientras que si los tiempos de muestreo tuvieron discrepancias en el pH fecal debe tenerse en cuenta (15). El pH fecal se disminuye cuando una cantidad excesiva de digestión con escape de almidón existe del rumen e intestinos, resultando en fermentación del intestino posterior incrementada (19). No debería ser poco sabio sacar la conclusión probable de que el menor pH fecal obtenido entre vacas con laminitis subclínica puede ser debido a un incremento en la digestión de intestino posterior. De acuerdo con esta opinión, los datos disponibles de caballos con laminitis sugieren que las enzimas de metaloproteinasa producidas por Streptococcus Bovis en el intestino posterior pueden ser la causa existente de laminitis (21). Aún si estas enzimas están involucradas en la laminitis del ganado lechero, pueden existir dentro del origen del intestino posterior. De acuerdo a esta hipótesis, la laminitis puede ser consecuencia de fermentación anormal de carbohidratos en el intestino posterior en lugar de la acidosis ruminal en el ganado (22), como se menciona anteriormente.

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(19). It should not be unwise to draw a probable conclusion that lower fecal pH obtained among cows with subclinic laminitis may be due to increased hindgut fermentation. In aggreement within this opinion, available data from horse with laminitis suggested that metalloproteinase enzymes produced by Streptococcus bovis in the hindgut might be the existing cause for laminitis (21). Even if the latter enzymes are involved in dairy cattle laminitis, they may exist within hindgut origin. According to the latter hypothesis, laminitis may be a consequence of abnormal hindgut fermentation of carbohydrates instead of ruminal acidosis in cattle (22), as aforementioned above. Significant blood gas alterations. pO2 changes. Given the statistical changes in the present study, mean pO2 values decreased statistically (p>0.05) in cows with subclinical laminitis. This may be partly explained from the observations/conclusions arising in a prior study evaluating the blood gas changes in induced laminitis among horses (23). In an attempt to draw conclusion from the latter study one should precisely evaluate the results. During experimentally induced laminitis in horses there was a significant alteration in the median palmar venous pO2 and concurrent decline in the median palmar avO2, observed during the onset of lameness. According to the latter investigators, several factors might have influence on this. There was no difference in the arterial oxygen pressure excluding out external conditions (i.e. mechanical or atmospheric influences). Besides no concurrent alteration was noticed in respiratory rate or frequency. Investigators suggested some probable explanations including: (i) changed blood flow over the capillary vessels (vasoconstriction/ arteriovenous shunting); ii) lack of oxygen delivery to the tissues, iii) declined cellular utilization of oxygen, via altered tissue metabolism or any obstruction for cellular respiratory enzymes; iv) thickened or edematous vascular membrane resulting within a failure of oxygen to diffuse out of the capillaries to the tissues (23). pO2 decline detected in horse in the latter study involved digital arteries, however the blood samples and therefore the results of pO2 values were related to central blood. It must be mentioned that obtaining a venous sample is easier than an arterial sample. Venous blood may possess enough information for assisting in clinical decisions; besides the vast majority of blood gas values are similar in venous and arterial blood (24). In agreement within the latter authors, and as expected, the latter two conditions (i.e. iii and iv.) might play a pivotal role for pO2 alterations, during laminitis, as identified within the cows of the present study.

Alteraciones significativas de gas en la sangre. Cambios de pO2. Dados los cambios estadísticos de este estudio, los valores medios de pO2 decrecieron estadísticamente (p>0.05) en vacas con laminitis subclínica. Esto puede ser parcialmente explicado con las observaciones / conclusiones que surgen de un estudio anterior que evalúa los cambios de gas en la sangres en laminitis inducida en caballos (23). En un intento por sacar una conclusión del anterior estudio uno debe evaluar estos resultados de manera precisas. Durante laminitis inducida experimentalmente en caballos existe una alteración significativa del pO2 vena palmar media y un declive concurrente en avO2 palmar medio observado durante la aparición de claudicación. De acuerdo a los anteriores investigadores, varios factores pueden haber influenciado esto. No hubo diferencia entre la presión de oxígeno arterial excluyendo condiciones externas (i.e. influencias mecánicas o atmosféricas). Además, ninguna alteración concurrente fue observada en la frecuencia respiratoria. Los investigadores sugirieron que explicaciones probables incluyen: (i) flujo sanguíneo cambiado en los vasos capilares (vasoconstricción/ derivación arteriovenosa); (ii) falta de suministro oxígeno a los tejidos, (iii) utilización reducida de oxígeno por las células, a través de metabolismo de tejidos alterados u obstrucción debido a enzimas respiratorias celulares; (iv) membrana vascular edematosa o engrosada como resultado de falla del oxígeno en difundirse de los capilares a los tejidos (23). El declive de pO2 en los caballos en el estudio anterior involucró arterias digitales, sin embargo las muestras de sangre y por ende los resultados de los valores de pO2 tuvieron relación con la sangre central. Debe mencionarse que obtener una muestra venosa es más sencillo que una muestra de arteria. La sangre venosa puede tener suficiente información para asistir en decisiones clínicas; además la amplia mayoría de valores de gas en sangre es similar para sangre venosa y arterial (24). De acuerdo con los anteriores autores, como se espera, las anteriores condiciones (i.e. iii y iv) pueden jugar un papel fundamental en las alteraciones de pO2, durante la laminitis, como se observa en las vacas del presente estudio. El suministro de oxígeno a los tejidos es un requerimiento que amenaza la supervivencia. El pO2 es una gran parte de la condición fisiológica de un órgano, lo cual resulta de la asociación entre el suministro y el consumo de oxígeno. La oxigenación de tejidos se altera bajo condiciones patológicas (25), como hipoxia hepática (26) o laminitis en caballos (23), que puede resultar

Akin - Subclinical laminitis related to ruminal and faecal indicators Oxygen supply into tissues is a life threatening requirement for survival. The pO2 is one of the major part of a physiological condition of an organ, resulting from the association among oxygen delivery and consumption. Tissue oxygenation is altered during pathological conditions (25), such as hepatic hypoxia (26) or laminitis in horses (23), that may result with decreased pO2, meant hypoxia a significant correlation was evident between hepatic tissue pO2 and arterial blood pO2 in hypoxic rabbits (26). Another study among horses with laminitis revealed that median palmar vein pO2 was increased in horses with laminitis. On the other hand in dairy cows with subclinical laminitis no acid base imbalance were detected, whereas in that study in Portuguese language, solely abstract was available in English revealed that the results of pO2 was unknown (27). It should also be noted that hepatic hypoxia (26) might also play a role for significant pO2 changes detected. However the present authors could not draw this conclusion, as the limitation of the study was lack of hepatic enzyme analysis. Further analysis are warranted analyzing serum biochemical changes, evolving ALT, AST and other relevant hepatic enzyme changes. None of the cows in this study developed severe alterations in acid-base balance or hypothermia, which could have effected the availability of oxygen. It is possible to state that further research of this phenomenon may lead to the development of blood gas analysis, and probably pO2 as a presumptive diagnostic tool in cattle with subclinical laminitis. Pain may accompany an autonomic response elevating adrenergic nerve activity and plasma catecholamine levels. As a result vasoconstriction of arterioles, reduced wound perfusion, and decreased tissue pO2 may occur (28). Therefore the present authors may possibly suggest that the other condition that might be resulting within the decreased pO2 in cattle with subclinical laminitis is that pain. This study has demonstrated that there might be a correlation among subclinical laminitis and pO2 values. As aforementioned above and pO2 values might probably indicate the pathophysiological changes that occur as part of the pathogenesis of the condition. Besides faecal pH alternatively might be a supportive finding in cattle with subclinical laminitis, at least for the present cases observed in this study. Obtained data did not support that fecal pH may be an early indicator of laminitis, besides decreases in fecal pH both at onset and during disease condition, whereas it may be a helpful parameter in in cattle with subclinical laminitis.

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de pO2 reducido, lo cual significa que existe una correlación importante entre la hipoxia y el pO2 en los tejidos y el pO2 de sangre arterial en conejos con hipoxia (26). Otro estudio entre caballos con laminitis reveló que el pO2 de vena palmar media se incrementó en caballos con laminitas. Por otro lado, en vacas lecheras con laminitis subclínicas no se detectó ningún desbalance en la base ácida, mientras que en un estudio en Portugués, sólo estaba disponible el abstracto en Inglés, reveló que los resultados de pO2 eran desconocidos (27). También cabe anotar que la hipoxia hepática (26) puede también jugar un papel importante en los cambios de pO2 detectados. Sin embargo, los actuales actores no pudieron llegar a esta conclusión, ya que la limitación del estudio fue la falta de un estudio de enzimas hepáticas. Un mayor análisis fue garantizado utilizando cambios bioquímicos del suero, ALT evolutivo, AST y otros cambios relevantes de enzimas hepáticas. Ninguna de las vacas en este estudio desarrollo alteraciones severas en el balance ácido-base o hipotermia, los cuales podrían haber afectado la disponibilidad de oxígeno. El dolor puede acompañar la respuesta autonómica elevando la actividad nerviosa adrenérgica y los niveles de catecolaminas en plasma. Como resultado, puede ocurrir vasoconstricción de arteriolas, perfusión reducida de heridas y reducción del pO2 en tejido (28). Por ende los presentes autores pueden posiblemente sugerir que otra condición que puede resultar en reducción de pO2 en ganado con laminitis subclínica es el dolor. Este estudio ha demostrado que puede existir una correlación entre laminitis subclínica y valores de pO2. Como se menciona anteriormente, los valores de pO2 pueden probablemente indicar los cambios fisiopatológicos que ocurren como parte de la patogénesis de la condición. Además el pH fecal puede ser un hallazgo de soporte en ganado con laminitis subclínica, por lo menos para los casos actuales observados en este estudio. Los datos obtenidos no apoyaron que el pH fecal pueda ser un indicador temprano de laminitis, más allá de la reducción del pH fecal en los inicios y durante la condición de la enfermedad, considerando que puede ser un parámetro útil en ganado con laminitis subclínica.

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Rev.MVZ Córdoba 20(2):4544-4555, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Palatability and digestibility of horse diets containing increasing levels of citrus pulp Palatabilidad y digestibilidad de las dietas que contienen pulpa de cítricos para caballos Camilla G Moreira,1 M.Sc, Ives CS Bueno,1 Ph.D, Madalena L Menezes,1 M.Sc, Thaís P Mota,1 Zoot, Aline D Souza,1 Zoot, Amanda F Tavares,1 Zoot, Laise S Augusto,1 Zoot, Roberta A Brandi,1* Ph.D. Departamento de Zootecnia, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos - FZEA/ USP, Pirassununga, SP. Brasil. Av. Duque de Caxias norte, 225. Campus USP, CEP: 13635-900. *Correspondence: robertabrandi@usp.br 1

Received: May 2014; Accepted: January 2015.

ABSTRACT Objective. To evaluate the impact of citrus pulp on the palatability and digestibility of horse diets and the physicochemical characteristics of the feces. Materials and methods. The diets were composed of 60% of the energy from the forage and 40% from the concentrate, with increasing levels of citrus pulp. Two different tests were performed. The first test assessed the palatability of concentrates. Using a randomized experimental design, 15 horses were observed for 10 days. The variables recorded were first action, first choice and intake ratio (IR). Five horses were arranged in 5x5 Latin Square design for the test assessing digestibility and fecal physicochemical characteristics. The apparent digestibility of the nutrients and the color, consistency, pH and buffering capacity (BC) of the feces were evaluated. Results. The addition of increasing levels of citrus pulp had an effect (p≤0.001) on first action. A difference was also observed in first choice, and the addition of 0, 7 or 14% of citrus pulp was preferred. A difference between treatments (p≤0.001) was also observed for IR, and the control concentrate was consumed the most. The amount of citrus pulp included had no effect (p>0.05) on the digestibility of nutrients, fecal consistency and color, and there was no effect (p>0.05) on fecal pH and BC. Conclusions. Horses can identify the presence of citrus pulp in concentrates but prefer concentrates without added citrus pulp. Citrus pulp does not negatively affect the digestibility of concentrates or the physicochemical characteristics of the feces; thus, citrus pulp is a viable alternative ingredient in the formulation of horse diets. Key words: Fecal pH, pectin, preference, super fiber (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. Evaluar la inclusión de pulpa de cítricos en la dieta de los caballos a través de la evaluación de la de palatabilidad, digestibilidad y características fisicoquímicas de las heces. Materiales y métodos. El valor energético de las dietas fue aportado en el 60% por la energía del forraje y en el 40% a partir del concentrado con niveles crecientes de pulpa de cítricos. En la primera prueba se evaluó la palatabilidad de los concentrados. Se utilizó un diseño experimental aleatório. Se observaron 4544

Moreira - Palatability and digestibility of citrus pulp for horses

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15 caballos durante 10 días. Las variables registradas fueron la primera acción, la primera opción y la relación de la ingesta (IR). Cinco caballos fueron dispuestos en un diseño cuadrado latino 5x5 para la evaluación de la digestibilidad y las características fisicoquímicas fecales. La digestibilidad de los nutrientes y el color, la consistencia, el pH, y se evaluó la capacidad de tamponamiento (CT) de las heces. Resultados. El nível de inclusión de pulpa de cítricos tuvo un efecto (p<0.001) en la primera acción. Una diferencia también se observó en primera elección. Una diferencia (p<0.001) entre los tratamientos también se observó para IR. El nível de inclusión de pulpa de cítricos no efectó (p>0.05) la digestibilidad, consistencia fecal y el color de las heces, pH fecal y CT de las heces. Conclusiones. Los caballos pueden identificar la presencia de pulpa de cítricos en los concentrados, pero prefieren concentrados sin pulpa de cítricos. La pulpa de cítricos no afecta la digestibilidad de los nutrimentos en el concentrado, ni las características fisicoquímicas de las heces; la pulpa de cítricos es un ingrediente alternativo viable en la formulación de dietas para caballos. Palabras clave: Pectina, pH fecal, preferencia, super fibra (Fuente: CAB).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The horses can use large quantities of forage to meet their nutritional requirements (1). However, diets with a high percentage of grains are used to maximize productivity (2). Currently, researchers are searching for alternative ingredients that can replace traditional ingredients such as corn, soybean meal and wheat bran for use the alternative ingredients, easily fermentable fibers, or “super fibers”, such as citrus pulp, seem especially promising (3).

Los caballos pueden usar grandes cantidades de forraje para satisfacer sus requerimientos nutricionales (1). Sin embrago, las dietas con altos porcentajes de granos se utilizan para maximizar la productividad (2). En la actualidad, los investigadores buscan ingredientes alternativos que puedan reemplazar a los ingredientes tradicionales como el maíz, la harina de soya y el salvado de trigo por el uso de ingredientes alternativos, las fibras de fácil fermentación, o “superfibras”, como la pulpa de cítricos, parecen ser especialmente prometedoras (3).

However, only a few studies have been published regarding the use of citrus pulp in horse feed (4-7). Ott et al (4) investigated the acceptability and digestibility of diets with increasing levels of citrus pulp (0, 15 and 30%) and observed that diets with 30% citrus pulp were rejected by horses. Nevertheless no difference was observed in the digestibility of the nutrients. Manzano et al (5) observed an increase in the digestibility of dry matter and crude protein with the addition of citrus pulp; these authors using no more than 15% citrus pulp to prevent a decrease in palatability. Another important factor to determine the digestibility of horse diets is the physicochemical characteristics of the feces, as: Feces parameters (8) such as color (9), consistency (10), pH (8) and buffering capacity (BC) (11) are important to evaluate the gastrointestinal tract health (10). The aim of this study was to evaluate the effect of increasing levels of citrus pulp in concentrate on the palatability and apparent digestibility of horse diets, as well as the physicochemical characteristics of the feces.

Sin embargo, sólo se han publicado unos pocos estudios relativos al uso de pulpa de cítricos en los alimentos para caballos (4-7). Ott et al (4) investigó la aceptabilidad y la digestibilidad de las dietas con niveles cada vez mayores de pulpa de cítricos (0, 15 y 30%) y observó que los caballos rechazaron las dietas con un 30% de pulpa de cítricos. Sin embrago, no observó diferencia alguna en la digestibilidad de la materia seca y la proteína cruda al añadir pulpa de cítricos; éstos autores no usaron un porcentaje mayor al 15% de pulpa de cítricos para evitar una disminución en la palatabilidad. Otro factor importante para determinar la digestibilidad de las dietas para caballos son las características fisicoquímicas de las heces, tales como: Algunos parámetros de las heces (8) como el color (9), la consistencia (10), el pH (8) y la capacidad tampón (CT) (11) son importantes para evaluar la salud del tracto gastrointestinal (10). El objetivo de este estudio fue el de evaluar el efecto de niveles cada vez mayores de pulpa de cítricos en el concentrado sobre la digestibilidad y palatabilidad de los alimentos para caballos, como también sobre las características fisicoquímicas de las heces.

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MATERIALS AND METHODS

MATERIALES Y MÉTODOS

Study site. This study was performed in the Equine Production section of the Pirassununga Administrative Campus of Animal Science and Food Engineering School, University of São Paulo.

Lugar del estudio. Este estudio se realizó en la sección de Producción Equina del Campus Administrativo Pirassunga de la Facultad de Ciencias Animales e Ingeniería de Alimentos, Universidad de São Paulo.

Two experiments were conducted: a palatability test (test 1) and a test of apparent digestibility and physicochemical characteristics of feces (test 2). Animals and experimental design. Fifteen horses, 10 years old, and 400 kg body weight, were used in the study. The adaptation period lasted five days and the experimental period lasted 10 days; protocol was performed once a day totalizing 150 observations. The animals were observed by instantaneous focal sampling for three consecutive minutes, and an ethogram to organize the dates. It was tested concentrates with 0, 7, 14, 21 or 28% citrus pulp (Table 1). Table 1. Percentage composition of the experimental concentrates with increasing levels of citrus pulp added to the diet. Ingredients Ground corn

Level of citrus pulp added to the diet 0%

14%

21%

28%

60.43

60.32

59.00

58.0

55.92 9.45

Soybean meal

3.90

6.20

5.73

7.95

Wheat bran

30.00

21.00

16.00

7.93

1.78

Citrus pulp

0.00

7.00

14.00

21.0

28.00

Premix*

0.67

Lime

2.86

2.30

1.82

1.33

0.81

Dicalcium phosphate

1.27

1.63

1.90

2.25

2.50

Salt

0.88

* Guaranteed Analysis: Linoleic acid: 3.630 mg; Oleic Acid: 3 mg; Calcium (Min): 150 g; Calcium (max.): 170 mg; Phosphorus: 80 g, Sodium 121 g, Potassium: 10 g; Sulfur: 4.954 mg; Cobalt: 30 mg; Tyrosine: 34 mg, Copper: 1.400 mg; Iodine: 200 mg; Chrome: 12 mg; Lysine: 4.000 mg; Magnesium: 7.225 mg; Manganese: 1.400 mg; Phosphatidylcholine: 1,000 mg; Methionine: 14 mg, Selenium: 27 mg, Iron: 2000 mg, Zinc: 3.500 mg, Vitamin A: 85,000 KIU/kg, Vitamin C: 200 mg, Vitamin D: 8,500 KIU/kg, Vitamin E: 200 mg; Saccharomyces cerevisiae: 0.01500X107 CFU.

Before starting the trial, the animals received 1 kg of concentrate (different from concentrates to be tested) in stall one hour before the test and were then led individually to the arena to conduce the trial. The troughs containing 200 g of each concentrate were arranged in five equidistant points, and the treatments and animals were randomized each day. The preference test was used to assess the palatability of the concentrates (12). The first action (1 - sniffed, 2 - ate), first choice (first concentrate actually consumed) and intake ratio (amount of each concentrate ingested) were evaluated.

Se realizaron dos experimentos: una prueba de palatabilidad (prueba 1) y una prueba de la digestibilidad aparente y las características fisicoquímicas de las heces (prueba 2). Animales y diseño experimental. En este estudio se utilizaron quince caballos, de 10 años de edad y con un peso corporal de 400 kg. El periodo de adaptación duró cinco días y el periodo experimental duró 10 días; el protocolo se llevo a cabo una vez por día para un total de 150 observaciones. Los animales fueron observados mediante un muestreo focal instantáneo durante tres minutos consecutivos, utilizando un etograma para organizar las fechas. Antes de iniciar el estudio, los animales recibieron 1kg de concentrado (distinto a los concentrados que serían sujetos a prueba) en una cuadra una hora antes de realizar la prueba y luego fueron llevados individualmente al estadio para realizar el estudio. Los comederos, cada uno con 200 g de concentrado, se organizaron en cinco puntos equidistantes, y los tratamientos y animales fueron aleatorizados diariamente. La prueba de preferencia se utilizó para evaluar la palatabilidad de los concentrados (12). Se evaluaron la primera acción (1–olisqueó, 2–comió), la primera elección (primer concentrado consumido efectivamente) y la tasa de ingesta (cantidad de concentrado ingerida). Las sobras fueron retiradas y pesadas, y la tasa de ingesta (TI) se calculó utilizando la siguiente ecuación: TI = concentrado (% de pulpa de cítricos)/ (ingesta de 0% de concentrado + ingesta de 7% de concentrado + ingesta de 14% de concentrado + ingesta de 21% de concentrado + ingesta de 28% de concentrado). Análisis estadístico. El diseño experimental fue de parcela dividida. Se utilizó una prueba chi cuadrado de bondad de ajuste para evaluar la primera elección y la primera acción, bajo la hipótesis nula de que todos los tratamientos ocurrirían con la misma probabilidad. Un modelo mixto lineal con esquema factorial de 5x10 se utilizó para analizar la TI, teniendo en

Moreira - Palatability and digestibility of citrus pulp for horses The leftovers were removed and weighed, and the intake ratio (IR) was calculated using the equation below: IR = concentrate (% citrus pulp) / (intake of 0% concentrate + intake of 7% concentrate + intake of 14% concentrate + intake of 21% concentrate + intake of 28% concentrate). Statistical analysis. The experimental design was a split pot. A chi-square goodness of fit test was used to evaluate the first choice and first action, under the null hypothesis that all treatments would occur with equal probability. A linear mixed model with a 5x10 factorial scheme was used to analyze the IR, taking into consideration the fixed effects of the treatment and the day, as well as the random effect of the animal, in addition to the effect of the residue. In the case of a significant interaction, Student’s t test was used to assess each treatment within each evaluation day. All analyses were performed using the Statistical Analysis System software, version 9.1.3. (13). Animals and experimental design. Were used five nonpregnant mares, Brasileiro de Hipismo breed, weighing 406.6±76.86 kg and aging six years were housed in individual stalls and arranged in 5x5 Latin Square design. The experimental period included seven days of adaptation followed by three days of data collection and analysis. The experimental diets were formulated to meet the maintenance requirements for horses, as recommended by the National Research Council, 2007 (14). The diet were composed by 60% of the energy coming of forage (Coast Cross hay) and 40% came from concentrate with increasing levels of citrus pulp (0, 7, 14, 21 and 28%), (Table 1 and Table 2). To evaluate the physicochemical characteristics of the feces, the samples were collected for three days in plastic bags. Subsequently, the pH was measured using a bench pH meter, and the BC was measured as described in Zeyner et al (11). The consistency of the feces was evaluated as described by Berg et al (9), and the feces color was evaluated as described by Godoi et al (8). Laboratory methods. A composite sample from each animal was obtained at the end of the experiment and sent to the Bromatology laboratory at the FZEA/USP. The dry matter (DM), mineral matter (MM), ether extract (EE) and

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cuenta los efectos fijos del tratamiento y del día, además del efecto aleatorio del animal y el efecto del residuo. En caso de haber una interacción significativa, se utilizó la prueba t de Student para evaluar cada tratamiento dentro de cada día de evaluación. Todos los análisis de llevaron a cabo utilizando el software Statistical Analysis System, versión 9.1.3 (13). Animales y diseño experimental. Se utilizaron cinco yeguas no embarazadas, de raza Brasileiro de Hipismo, con un peso de 406.6±76.86 kg y de seis años de edad, las cuales fueron alojadas en cuadras independientes dispuestas en diseño Cuadrado Latino de 5x5. El periodo experimental incluyó siete días de adaptación seguidos de tres días de recolección de datos y análisis. Las dietas experimentales se formularon para cumplir con los requisitos de manutención de caballos, conforme a las recomendaciones del Concejo de Investigación Nacional, 2007 (14). Las dietas estuvieron compuestas de un 60% de la energía proveniente de forraje (heno Cross Coast) y el 40% restante de concentrado con niveles cada vez mayores de pulpa de cítricos (0, 7, 14, 21 y 28%), (Tabla 1 y Tabla 2). Para evaluar las características fisicoquímicas de las heces, se tomaron muestras en bolsas de plástico durante tres días. Posteriormente, se midió el pH utilizando un medidor de pH de banco, y la CT se midió conforme a lo descrito por Zeyner et al (11). La consistencia de las heces fue evaluada conforme a los descrito por Berg et al (9), y el color de las heces se midió conforme a lo descrito por Godoi et al (8). Métodos de laboratorio. Se obtuvo una muestra compuesta de cada animal al final del experimento y se envió al laboratorio de Bromatología del FZE/USP. Los contenidos de materia seca (MS), materia mineral (MM), extracto de éter (EE) y proteína cruda (PC) de los concentrados, el heno y las heces fueron determinados de acuerdo a los procedimientos de la Asociación de Química Analítica Oficial (15). Los contenidos de fibra detergente acida (FDA), fibra detergente neutra (FDN), celulosa (CEL) y hemicelulosa (HEM) fueron analizados conforme a lo descrito por Van Soest et al (16). Se determinó la energía bruta (EB) utilizando una bomba calorimétrica. Determinamos además los coeficientes de digestibilidad de MS, MO PC, EE, FDA, CEL, HEM y EB.

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Table 2. Chemical composition of concentrates and experimental diets with increasing levels of citrus pulp added to the diet. Nutrient

Hay 1

Hay 2

Hay 3

Dry Matter

85.29

85.67

Organic Matter

94.51

Mineral Matter

5.49

Crude Protein

Level of citrus pulp added to the diet (%) 0

83.41

88.48

88.6

87.92

88.29

88.28

92.99

93.58

93.22

92.32

93.79

93.9

93.22

7.01

6.42

6.78

7.68

6.21

6.1

6.78

13.11

12.53

12.8

13.92

12.52

13.74

13.9

13.96

Crude Fiber

31.1

31.82

30.73

5.78

6.54

5.86

5.95

6.07

Ether Extract

0.56

0.62

0.65

3.87

3.02

3.29

3.1

3.26

Nitrogen-free extract

49.74

48.02

49.4

69.65

70.24

70.9

70.95

69.93

Acid detergent fiber

39.11

35.55

35.35

5.25

5.74

8.98

7.07

7.63

Neutral detergent fiber

83.69

68.77

69.65

22.29

26.06

21.46

26.92

21.77

Hemicellulose

44.58

33.22

34.3

17.04

20.32

12.48

19.85

14.14

Calcium

1.63

1.54

1.4

1.49

1.39

Phosphorus

0.57

0.51

0.53

0.54

0.56

Starch

39.09

35.5

34.61

36.58

32.29

4136.00

3954.00

3957.00

3684.00

3706.00

3771.00

3809.00

3826.00

Gross energy (Kcal/kg)

Chemical composition of the experimental diets (60:40 forage:concentrate ratio) 0

Dry Matter

86.27

86.31

86.04

86.19

Organic Matter

93.50

93.14

93.73

93.77

93.50

Mineral Matter

6.50

6.86

6.27

6.23

6.50

Crude Protein

13.25

12.69

13.18

13.25

13.27

Crude Fiber

21.04

21.35

21.08

21.11

21.16

1.91

1.57

1.61

1.67

Nitrogen-free extract

57.29

57.53

1.68 57.59

57.81

57.40

Acid detergent fiber

24.10

24.30

25.59

24.83

25.05

Neutral detergent fiber

53.34

54.85

53.01

55.19

53.13

Hemicellulose

29.24

30.55

27.41

30.36

28.08

3883.00

3891.80

3917.80

3933.00

3939.80

Ether Extract

Gross energy (Kcal/kg)

crude protein (CP) contents of the concentrates, hay and feces were determined according to the procedures described by the Association of Official Analytical Chemistry (15). The acid detergent fiber (ADF), neutral detergent fiber (NDF), cellulose (CEL) and hemicellulose (HEM) contents were analyzed as described by Van Soest et al (16). The gross energy (GE) was determined using a bomb calorimeter.

Análisis estadístico. Para evaluar la digestibilidad utilizamos el diseño Cuadrado Latino de 5x5 utilizando cinco animales alimentados con cinco dietas con niveles cada vez mayores de pulpa de cítrico, repitiéndolo en cinco periodos consecutivos. Los parámetros cuantitativos fueron analizados de acuerdo al siguiente modelo estadístico:

We further determined the digestibility coefficients of DM, OM, CP, EE, NDF, ADF, CEL, HEM and GE.

En donde, Yijk, representa la variable dependiente µ, la media global Ai, el efecto del animal (i = 1 a 5) Tj, el efecto del tratamiento (j = 1 a 5) Pk, el efecto del periodo (k = 1 a 5) y εijk, el error residual.

Statistical analysis. To evaluate the digestibility, we used the 5x5 Latin Square design using five animals fed with five diets with increasing levels of citrus pulp, repeated in five consecutive periods. The quantitative parameters were analyzed according to the statistical model: Yijk = µ + Ai + Tj + Pk + εijk, Where, Yijk represents the dependent variable µ, the overall mean

Yijk = µ + Ai + Tj + Pk + εijk,

Se utilizó la función PROC GLM del paquete estadístico del SAS para Windows (13) para el análisis estadístico. Las medias se compararon utilizando la prueba de Turkey con un nivel de probabilidad del 5%.

Moreira - Palatability and digestibility of citrus pulp for horses Ai, the effect of the animal (i = 1 to 5) Tj, the effect of the treatment (j = 1 to 5) Pk, the effect of the period (k = 1 to 5) and εijk, the residual error. The PROC GLM function of the SAS statistical package for Windows (13) was used for statistical analysis. The means were compared by Tukey’s test with a probability level of 5%. The consistency and color of the feces were assessed using the chi-square goodness of fit test. The BC and fecal pH were assessed using the mixed linear model function of the SAS (13) program.

RESULTS Palatability. There was a difference in first action (p≤0.001), 66.91% of the animals sniffed the concentrates upon initial exposure to them, while 33.09% of the animals ate the concentrates. There was a difference (p<0.001) between treatments for the first choice variable, and treatment with 0, 7 and 14% citrus pulp were preferred (Table 3). There was a difference (p≤0.001) in IRs, as the control treatment (0%) was consumed the most, followed by treatments with 7, 14, 21 and 28% citrus pulp (Table 3). Apparent digestibility of the diets and physicochemical characteristics of the feces. The addition of citrus pulp had no effect (p>0.05) over the digestibility coefficients of DM, CP, OM, EE, GE, CEL, HEM, NDF or ADF (Table 4). Treatment with citrus pulp had no effect (p>0.05) on fecal consistency or color. The color of the feces remained greenish, and the consistency was classified as normal (score of 3). Adding citrus pulp had no effect (p>0.05) on BC or fecal pH. The mean values observed for BC at pH 5, BC at pH 6 and pH are shown in table 5.

Se evaluaron la consistencia y el color de las heces utilizando la prueba chi cuadrado de bondad de ajuste. La CT y el PH fecal fueron evaluados utilizando la función de modelo lineal mixto del programa SAS (13). RESULTADOS Palatabilidad. Se encontró una diferencia en la primera acción (p≤0.001), 66.91% de los animales olisquearon los concentrados al ser expuestos a ellos por primera vez, mientras que 33.09% de los animales comieron los concentrados. Se encontró una diferencia (p≤0.001) entre los tratamientos para la variable de primera elección y se prefirieron los tratamientos con 0, 7 y 14% de pulpa de cítricos (Tabla 3). Hubo una diferencia (p≤0.001) en las TI, ya que el tratamiento de control (0%) fue el más consumido, seguido por los tratamientos con contenido de pulpa de cítricos de 7, 14, 21 y 28% (Tabla 3). Digestibilidad aparente de las dietas y características fisicoquímicas de las heces. El añadir pulpa de cítricos no tuvo efecto alguno (p>0.05) en los coeficientes de digestibilidad de MS, PC, OM, EE, EB, CEL, HEM, FDN o FDA (Tabla 4). El tratamiento con pulpa de cítricos no tuvo efecto alguno (p>0.05) en la consistencia o el color fecal. Las heces permanecieron de un color verdoso, y la consistencia se clasificó como normal (puntaje de 3). El añadir pulpa de cítricos no tuvo efecto (p>0.05) en la CT o en el pH fecal. Los valores medios de CT en un pH de 5, CT en un pH de 6 y de pH se relacionan en la tabla 5.

Table 4. Digestibility coefficients of the nutrients of diets with increasing levels of citrus pulp added to the diet. Nutrient

Table 3. First choice and intake ratio of concentrates with increasing levels of citrus pulp added to the diet. Treatment

First choice (%)

Intake Ratio

21.46

0.3137

28.78

0.2366

14%

28.06

0.1913bc

21%

11.51

0.1521cd

28%

7.19

0.1087d

Lowercase letters indicate significantly different pairs, as determined by Student’s t test (p<0.001).

4549

Levels of added citrus pulp (%) 0

CV* Mean

Dry matter1

48.74 49.24 49.14 49.68 47.65 5.83 48.89

Organic matter1

49.99 50.71 50.74 51.34 49.47 5.45 50.45

Crude protein1

60.27 58.98 60.75 59.53 60.22 4.59 59.95

Ether extract1

30.92 28.61 31.80 24.45 35.57 23.01 31.10

Neutral detergent fiber1 38.58 39.59 39.01 43.78 41.43 9.47 40.14 Acid detergent fiber1

24.98 30.40 31.02 39.50 32.76 18.69 32.15

Cellulose1

27.16 30.94 32.80 40.31 35.27 17.54 32.95

Hemicellulose1

49.06 51.34 49.16 52.58 50.31 8.42 50.06

Gross energy1

45.38 45.43 46.44 47.43 46.07 7.60 46.15

No significant difference in the mean, as determined by Tukey test (p>0.05). * CV - coefficient of variation. 1

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Table 5. Buffering capacity and pH of feces from horses fed on diets with increasing levels of citrus pulp. Treatment

BC at pH 5 (mmol/L)

BC at pH 6 (mmol/L)

6.62

15.83

5.27

6.69

16.92

5.54

14%

6.64

16.94

5.37

21%

6.51

15.24

3.71

28%

6.67

17.79

5.67

Means

6.62

16.53

5.13

DISCUSSION Palatability. The first action performed by the animals upon to the initial exposure to the concentrates was sniffing (66.91%), which demonstrates that horses can select the preferred concentrate through smell (17). This selection ability was reiterated by observation of the first choice, which demonstrated that lower levels of citrus pulp (0, 7 and 14%) were preferred (Table 3). The concentrates containing 21% and 28% citrus pulp were chosen less frequently, most likely because citrus scents are not preferred by horses (18). In an investigation of the acceptability and digestibility of diets with increasing levels of citrus pulp (0, 15 and 30%), Ott et al (4) observed that six out of eight horses refused a diet containing 30% citrus pulp. It was not observed effect when 28% citrus pulp was added to the concentrate in this trial. In contrast to our results, Tribucci et al (18) found no effect of different levels of citrus pulp on the first choice when studying the palatability of diets with increasing levels of citrus pulp (7, 14, 21 and 28%) in horse diets. However, they did observe an effect on the first action. The methodology used in these studies may have influenced the results, as Tribucci et al (18) used continuous troughs in a stall, while our study used separate troughs in a round pen (open area). In addition, the authors of the previous study noted a strong citrus pulp odor, which we did not observe in this study. Assis et al (19) reported that the palatability and composition of citrus pulp can be altered by factors such as: fruit varieties, the presence of seeds, whether essential oils are removed and the processes that the fruit and fruit residues were subjected to. This variation in the composition of citrus pulp may change the taste of the final product, and could therefore

DISCUSIÓN Palatabilidad. La primera acción realizada por los animales al estar expuestos por primera vez a los concentrados fue olisquear (66.91%), por lo cual se demuestra que los caballos pueden seleccionar el concentrado de su preferencia por medio del olfato (17). Dicha capacidad de selección se reiteró por la observación de la primera elección, que demostró que se prefirieron los niveles más bajos de pulpa de cítricos (Tabla 3). Los concentrados con contenido de pulpa de cítricos de 21% y 28% fueron elegidos con menor frecuencia, probablemente porque los caballos no muestran una preferencia por los aromas cítricos (18). En una investigación sobre la aceptabilidad y digestibilidad de dietas con niveles cada vez más altos de pulpa de cítricos (0, 15 y 30%), Ott et al (4) observó que seis de cada ocho caballos rechazaron una dieta con un contenido de pulpa de cítricos del 30%. Este efecto no se observó en este estudio al agregarle un 28% de pulpa de cítricos al concentrado. A diferencia de nuestros resultados, Tribucci et al (18) no encontró ningún efecto en la primera elección causado por los distintos niveles de pulpa de cítricos al estudiar la palatabilidad de las dietas con cantidades cada vez mayores de pulpa de cítricos (7, 14, 21 y 28%) en las dietas de los caballos. Sin embrago, sí observaron un efecto en la primera acción. La metodología utilizada en estos estudios puede haber influenciado los resultados, ya que Tribucci et al (18) utilizó comederos continuos en una cuadra, mientras que en nuestro estudio se utilizaron comederos separados en un corral redondo (espacio abierto). Además, los autores del estudio anterior notaron un olor fuerte en la pulpa de cítricos, cosa que nosotros no observamos en este estudio. Assis et al (19) reportó que la palatabilidad y la composición de la pulpa de cítricos pueden verse alteradas por factores como: la variedad de las frutas, la presencia de semillas y si los aceites esenciales fueron eliminados en los procesos a los que se sometieron las frutas y los residuos de las frutas. Esta variación en la composición de la pulpa de cítricos puede cambiar el sabor del producto final, por lo cual podría justificar las disparidades entre los estudios sobre esta materia. Para reforzar la clara capacidad de selección de los caballos, observamos una TI mayor en concentrados con niveles menores de pulpa de cítricos (Tabla 3) y además los animales prefirieron el concentrado de control.

Moreira - Palatability and digestibility of citrus pulp for horses account for the disparities between studies of this subject. Reinforcing the distinct selection capacity of horses, we observed a higher IR for concentrates with lower levels of citrus pulp (Table 3), and the control concentrate was preferred by animals. Considering only the IR, the concentrate containing 0% citrus pulp was the favorite, with an IR=0.3137 (the reference value for preference was IR>0.25). This reinforces the preference for this level (0%) of citrus pulp in the concentrate. Manzano et al (5) observed different results in their study of growing fillies when three levels of citrus pulp (0, 7.5 and 15%) were added to the diet. The diet containing 15% citrus pulp was consumed more by the fillies. The animals in our study received experimental concentrates only during the evaluation, whereas in the protocol developed by Manzano et al (5), the animals received hay and the test concentrates. The use of different tests to assess palatability and acceptability greatly influences experimental results. Ott et al (4) and Manzano et al (5) concluded that horses had a preference for certain diets by assessing intake and leftovers, whereas Müller and Udén (20) used the first choice test. In these studies, the duration of testing and the form of assessment were the primary variables. Our study analyzed multiple factors to explain preference; thus, it is difficult to compare our results with the literature. To better understand preference and feeding behavior, it is necessary to standardize the tests used in these studies. Apparent digestibility of the diets and physicochemical characteristics of the feces. We observed different values for the nutrient digestibility coefficients (Table 4) compared to other studies (5-7), which may have been affected by factors such as: the forage:concentrate ratio, the composition of the diet ingredients and the quantity of food provided. The total amount of DM provided per animal in this experiment was 2% of body weight, including at least 1% of the body weight of the animal as forage (Coast Cross hay), as recommended by the NRC (14). The forage:concentrate ratio was 60:40, based on the energy supply, representing a 75:25 DM ratio. Miraglia et al (6) analyzed the digestibility of different forage:concentrate ratios and observed that, as the percentage of concentrate increased, the apparent digestibility

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Considerando únicamente la TI, el concentrado con un contenido de pulpa de cítricos de 0% fue el favorito, con una TI = 0.3137 (el valor de referencia para la preferencia fue de TI>0.259). Lo anterior refuerza la preferencia por este nivel (0%) de pulpa de cítricos en el concentrado. Manzano et al (5) observó resultados distintos en su estudio de potras en crecimiento cuando se agregaron tres niveles de pulpa de cítricos (0, 7.5 y 15%) a la dieta. La dieta con un contenido de pulpa de cítricos de 15% fue la más consumida por las potras. Los animales de nuestro estudio recibieron únicamente concentrados experimentales durante la evaluación, mientras que en el protocolo desarrollado por Manzano et al (5) los animales recibieron heno y los concentrados de prueba. El empleo de distintas pruebas para evaluar la palatabilidad y la aceptabilidad influye significativamente en los resultados experimentales. Ott et al (4) y Manzano et al (5) llegaron a la conclusión de que los caballos prefirieron ciertas dietas al evaluar la ingesta y las sobras, mientras que Müller y Udén (20) utilizaron la prueba de primera elección. En estos estudios, la duración de las pruebas y la forma de evaluación fueron las principales variables. Nuestro estudio analizó múltiples factores para explicar la preferencia; por lo tanto, es difícil comparar nuestros resultados con la literatura. Es necesario estandarizar las pruebas utilizadas en estos estudios para entender mejor el comportamiento alimentario. Digestibilidad aparente de las dietas y características fisicoquímicas de las heces. Observamos distintos valores en los coeficientes de digestibilidad de nutrientes (Tabla 4) al compararlos con otros estudios (5-7), que pudieron verse afectados por factores como: la relación forraje:concentrado, la composición de los ingredientes de la dieta y la cantidad de alimento suministrado. La cantidad total de MS suministrada a cada animal en este experimento fue el equivalente al 2% del peso corporal, incluyendo como mínimo el 1% del peso corporal del animal como forraje (heno Cross Coast), conforme a las recomendaciones del Consejo Nacional de Investigación (14). La relación forraje:concentrado fue de 60:40, con base en el suministro de energía, lo cual representa una relación de MS de 75:25. Miraglia et al (6) analizó la digestibilidad de distintas proporciones de forraje:concentrado y observó que a medida que aumentaba el porcentaje de concentrado, los coeficientes de digestibilidad de MS, materia orgánica, EB y PC también aumentaron. Cuando dichos autores utilizaron una relación de 75:25 en la dieta, al igual que lo hicimos nosotros, éstos

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coefficients of the DM, organic matter, GE and CP also increased. When these authors used a 75:25 diet ratio, as we did, they observed similar apparent digestibility values. The differences between the results can be attributed to different qualities of forage used in the studies. Manzano et al (5) provided food with forage:concentrate ratio of 40:60 ad libitum and observed higher nutrient digestibility coefficients than we did. Miraglia et al (6) note that when a diet comprised of concentrate and lower quality forage favors nutrient digestibility. The forage used in the present study had a chemical composition similar to that the Bermuda Grass hay recommended by NRC (14) and superior to the hay used by Miraglia et al (6). The hay used in our study is considered a good quality hay for horses, and accounted for a greater proportion of the total diet, which may have contributed to the consistency of the digestibility coefficients. The amount of citrus pulp added to the concentrate did not affect the digestibility of the fiber fraction. These results are consistent with a study by Oliveira et al (2), in which pectin was added to horse diets. According to the authors, the rapid rate of food passage in horses may not have allowed sufficient microorganism activity to degrade the fiber, which resulted in no change in the digestibility of NDF and ADF. A similar observation was made by Weyenberg et al (21), who noted that the higher forage:concentrate ratio in the diet, the faster the rate of passage through the entire gastrointestinal tract. According to Miraglia et al (6), the digestibility of the fiber fraction decreases with the addition of concentrate to the diet. We observed no decrease in fiber digestibility in this study, most likely due to the low percentage of concentrate in the diet and the quality of the hay, which provided a substrate for microorganism activity in the large intestine of horses. We observed a GE digestibility coefficient of 46.15%, which is close to that found in diets composed solely of forage (7). This coefficient is lower than that observed by Ott et al (4) and Manzano et al (5), which could be explained by the higher amount of concentrate provided in the earlier studies. Although the GE digestibility coefficient we observed was lower than that reported in other studies using citrus pulp (5-6), the values did not differ depending on the levels of citrus pulp included (Table 4), indicating that the

observaron valores de digestibilidad aparente similares. Las diferencias entre los resultados se pueden atribuir a las distintas calidades de forraje utilizadas en los estudios. Manzano et al (5) suministró alimentos una relación forraje:concentrado de 40:60 ad libitum y observó coeficientes de digestibilidad de nutrientes más altos que los que observamos nosotros. Miraglia et al (6) observó que una dieta compuesta por concentrado y un forraje de menor calidad favorece la digestibilidad de nutrientes. El forraje utilizado en el presente estudio tenía una composición química similar a aquella del heno Bermuda Grass recomendado por el Consejo Nacional de Investigación (14) y superior al heno utilizado por Miraglia et al (6). El heno utilizado en nuestro estudio se considera heno de buena calidad para el consumo de caballos y representó una proporción mayor en la dieta total, lo cual pudo haber contribuido a la consistencia en los coeficientes de digestibilidad. La cantidad de pulpa de cítricos que se añadió al concentrado no afectó la digestibilidad de la fracción de fibra. Estos resultados son consistentes con el estudio de Oliveira et al (2), en el cual se añadió pectina a las dietas de los caballos. Según los autores, la rápida tasa de paso del alimento en lo caballos puede no haber permitido que hubiera la suficiente actividad de microorganismos como para degradar la fibra, lo cual resultó en que no hubiera ningún cambio en la digestibilidad de FDA y FDN. Weyenberg et al (21) hizo una observación similar al afirmar que entre mayor proporción forraje:concentrado en la dieta, más rápido sería el paso del alimento por el tracto gastrointestinal. Según Miraglia et al (6), la digestibilidad de la fracción de fibra disminuye al añadir concentrado a la dieta. En este estudio no observamos disminución alguna en la digestibilidad de fibra, probablemente debido al bajo porcentaje de concentrado en la dieta y a la calidad del heno, el cual proporcionó un sustrato para la actividad de microorganismos en el intestino grueso de los caballos. Observamos un coeficiente de digestibilidad de EB de 46.15%, el cual se aproxima al porcentaje encontrado en dietas compuestas únicamente de forraje. Este coeficiente es menor al observado por Ott et al (4) y Manzano et al (5), lo cual podría explicarse por una mayor cantidad de concentrado que fue suministrada en los estudios anteriores. Aunque el coeficiente de digestibilidad de EB que observamos fue menor a aquel reportado en otros estudios que utilizaron pulpa de cítricos (5-6), no hubo diferencia en los valores de acuerdo a los niveles de pulpa de cítricos incluidos (Tabla 4), lo cual indica que la inclusión de este ingrediente no

Moreira - Palatability and digestibility of citrus pulp for horses inclusion of this ingredient did not negatively alter the digestibility of GE. The consistent GE digestibility coefficients can also be explained by the consistent levels of NDF and ADF digestibility (2), which provided a constant substrate for degradation by microorganisms, which produces energy. Adding fiber to the diet increases intestinal motility, which may impair the digestibility of nutrients in the small intestine. This could explain the low value of the GE digestibility observed in this study.

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alteró de forma negativa la digestibilidad de EB. La consistencia de los coeficientes de digestibilidad de EB también se puede explicar por los niveles consistentes de digestibilidad de FDA y FDN, que proporcionaron un sustrato para la degradación por parte de microorganismos, lo cual produce energía. Añadir fibra a la dieta aumenta la motilidad intestinal, lo cual puede afectar la digestibilidad de los nutrientes en el intestino delgado. Esto podría explicar los bajos valores de digestibilidad de EB observados es este estudio.

We observed no effect (p>0.05) of diet on the color of the feces, which had a greenish color. Feces color is primarily influenced by the forage used (22), and the color observed in this study was due to the characteristics and the amount of the hay provided (75% Coast Cross hay on a DM basis).

La presencia de fibra, al igual que la cantidad y la calidad de la ingesta de alimentos, el tamaño de las partículas y la velocidad del tránsito de la digesta pueden afectar tanto la digestibilidad de nutrientes como la calidad de las heces en caballos (21). Estudiar la digestibilidad de nutrientes conjuntamente con las características fisicoquímicas de las heces resulta importante para evaluar la función del aparato digestivo, ya que permite diagnosticar trastornos gastrointestinales. No observamos que la dieta tuviera efecto alguno (p>0.05) en el color de las heces, que fueron de color verdoso. El color de las heces está influenciado principalmente por el tipo de forraje utilizado (22), y el color observado en este estudio se dio por las características y la cantidad del heno que fue suministrado (75% de heno Coast Cross a base de MS).

The consistency of the feces observed in this study was normal, suggesting that adding citrus pulp to the diet does not promote production of high levels of lactic acid and consequently feces fluidization, which can be proven by maintaining the pH and buffering capacity (Table 5).

En este estudio se observó que la consistencia de las heces fue normal, lo cual indica que agregar pulpa de cítricos a la dieta no propicia la producción de altos niveles de ácido láctico y por ello la fluidización de las heces, lo cual se puede demostrar ya que se mantiene el pH y la capacidad tampón (Tabla 5).

The fecal pH was not influenced (p>0.05) by treatment (Table 5). The mean pH value we observed (6.62) is considered appropriate for the activity of cellulolytic bacteria that ferment cell wall carbohydrates, thereby producing short chain fatty acids (SCFA) that are absorbed in the large intestine (23,24).

El tratamiento no tuvo influencia (p>0.05) sobre el pH fecal (Tabla 5). El valor medio de pH que observamos (6.62) se considera apropiado para la actividad de bacterias celulolíticas que fermentan los carbohidratos de la pared celular, produciendo así ácidos grasos de cadena corta (AGCC) que son absorbidos en el intestino grueso (23,24).

The buffering capacity conferred the feces, may be related to ion exchange at the SCFA absorption time, which occurs through the absorption of sodium ions (Na+) at the apical membrane of the absorptive cells in exchange with hydrogen ions (H+), this process can be directly linked to the exchange of chlorine (Cl) and bicarbonate (HCO 3) (21), process according to Van Soest et al (15), is essential for maintaining proper pH levels, as evidenced in this study.

La capacidad tampón hallada en las heces puede estar relacionada al intercambio de iones en el tiempo de absorción de los AGCC, que ocurre por mediante la absorción de iones de sodio (Na+) en la membrana apical de las células absortivas en el intercambio de iones hidrógeno (H+), este proceso puede estar ligado directamente al proceso de intercambio de cloro (Cl) y bicarbonato (HCO3) (21), proceso que según Van Soest (15) es esencial para mantener niveles de pH adecuados, según lo confirma este estudio.

The presence of fiber as well as the quality and quantity of food intake, particle size and speed of transit of the digesta can affect both nutrient digestibility and feces quality in horses (21). Studying nutrient digestibility in conjunction with the physicochemical characteristics of feces is important for evaluating digestive tract function, as it allows the diagnosis of gastrointestinal disorders.

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The forage:concentrate ratio (75:25, based on DM) may have created favorable conditions in the large intestine for cellulolytic bacteria, data that corroborate with Hoffman (25) findings, which cites that diets with higher amounts of roughage, the main SCFA produced is the acetate. This indicates that the main substrates for fermentation in large intestine were rapidly and slowly fermentable carbohydrate, with predominance production of weak acids. The quantity and the quality of fiber in the diet may modify intestinal transit, leading to changes in fecal characteristics. The treatment tested in this present study provided a high amount of fiber as a substrate for the microorganisms. The fiber also has high BC due to the exchange of cations and metallic ions (16). Consistent with this concept, we observed no reduction in BC in this study (Table 5), this demonstrates that animals fed diets with increasing levels of citrus pulp –an ingredient that is considered a “super fiber”– maintained a fecal pH of above 6.0, which is optimal for fermentation by cellulolytic bacteria. In conclusion horses can identify the presence of citrus pulp in concentrate and prefer concentrates without citrus pulp. Adding up to 28% citrus pulp to horse diets does not negatively affect the digestibility of nutrients and the physicochemical characteristics of the feces; thus, it is an alternative energy ingredient in the formulation of horse diets.

La proporción forraje:concentrado (75:25, con base en MS) puede haber propiciado condiciones favorables para las bacterias celulolíticas en el intestino grueso, datos corroborados por los hallazgos de Hoffman (25), quien cita que en las dietas con mayores cantidades de forraje, el principal AGCC producido es el acetato. Lo anterior indica que los principales sustratos para la fermentación en el intestino grueso fueron carbohidratos fermentables rápida y lentamente, con un predominio en la producción de ácidos débiles. La cantidad y la calidad de fibra en la dieta pueden modificar el tránsito intestinal, lo cual lleva a cambios en las características fecales. El tratamiento sometido a prueba en este estudio brindo una alta cantidad de fibra como sustrato para los microorganismos. La fibra también una alta CT debido al intercambio de cationes e iones metálicos (16). De manera consistente con este concepto, no observamos una reducción de CT en este estudio (Tabla 5), lo cual demuestra que los animales alimentados con dietas con un contenido cada vez mayor de pulpa de cítricos –ingrediente que se considera una “supefibra”- mantuvieron un pH superior a 6.0, nivel óptimo para la fermentación por parte de las bacterias celulolíticas. En conclusión, los caballos pueden identificar la presencia de pulpa de cítricos en el concentrado y prefieren los concentrados que no contienen pulpa de cítricos. Agregar un 28% de pulpa de cítricos a las dietas de los caballos no afecta de forma negativa la digestibilidad de los nutrientes ni las características fisicoquímicas de las heces, y por lo tanto es una alternativa de ingrediente energético en la formulación de dietas para caballos.

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Rev.MVZ Córdoba 20(2):4556-4563, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Interpretation of doxycycline+chloroquine dual therapy for A. phagocytophilum infection in dogs Interpretación de terapia dual de doxicilina+cloroquina para la infección con A. phagocytophilum en perros Kerem Ural, Ph.D. Adnan Menderes University, Faculty of Veterinary, Department of Internal Medicine, Isikli, Aydin, Turkey. *Corresponding: uralkerem@gmail.com Received: March 2014; Accepted: January 2015.

ABSTRACT Objective. A. phagocytophilum, an obligate intracellular pathogen, is a well-known agent causing granulocytic infections in both animals and humans. The purpose of the present study was to describe clinical course and consequences of Canine Granulocyctic Anaplasmosis among dogs in Aydin province, Turkey with special reference to hematological alterations and possible interpretations of doxycycline+chloroquine dual therapy. Materials and methods. A controlled clinical trial was carried out on 14 dogs referred and diagnosed as Canine Granulocyctic Anaplasmosis within Snap 4dx test. Relevant haematological data were recorded before (day 0) and after treatment (day 30) in both groups. Group I (n=7) were adminestered doxycycline (10 mg/kg q 12 h via oral route for 14 days) and chloroquine (2.5 mg/kg q 12 h for 14 days) and group II (n=7) received only doxycycline (10 mg/kg q 12 h for 14 days via oral route) therapy. Results. Doxycycline treatment hasten resolution of clinical signs in all dogs in about 2 to 7 days. There was no statistically significant differences among hematological variances detected (p>0.05). Conclusions. It may suggest that in conjunction with doxycycline chloroquine may have helped to speed up relevant clinical signs of CGA. Key words: Anaplasmosis, Canine, chloroquine, doxycycline, granulocyctic (Source: CAB). RESUMEN Objetivo. A. phagocytophilum, un patógeno intracelular obligado, es un agente ampliamente conocido que causa infecciones granulocíticas tanto en animales como en humanos. El propósito del presente estudio fue describir la evolución clínica y las consecuencias de la Anaplasmosis Granulocítica Canina en perros de la provincia de Aydin, Turquía, con especial referencia a las alteraciones hematológicas y a las posibles interpretaciones de una terapia dual de doxicilina+cloroquina. Materiales y métodos. Se realizó un estudio clínico controlado en 14 perros remitidos y diagnosticados con Anaplasmosis Granulocítica Canina usando de una prueba Snap 4dx. Se registraron datos hematológicos pertinentes antes (día 0) y después del tratamiento (día 30) en ambos grupos. Al Grupo I (n=7) se le administró doxicilina (10 mg/kg q 12 h por vía oral durante 14 días) y cloroquina (2.5 mg/kg q 12 h durante 14 días), mientras que el Grupo II (n=7) recibió una terapia únicamente con doxicilina (10 mg/kg q 12 h por vía oral durante 14 días). Resultados. La doxicilina aceleró la resolución de los signos clínicos en todos los perros en un periodo de aproximadamente 2 a 7 días. No se detectaron diferencias estadísticas significativas entre las variaciones hematológicas (p>0.05). Conclusiones. Lo anterior puede sugerir que, conjuntamente con la doxicilina, la cloroquina puede haber ayudado a acelerar los signos clínicos pertinentes de la Anaplasmosis Granulocítica Canina (AGC). Palabras clave: Anaplasmosis, canino, doxycycline, chloroquine, granulocyctico (Fuente: CAB). 4556

Ural - Doxycycline chloroquine combination therapy of Anaplasmosis in dogs

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The canine vector-borne infectious diseases are emerging problems in veterinary medicine, besides the zoonotic potential of the latter causative agents may carry of importance for human health ( 1 ) . T h e ve c t o r- b o r n e c a n i n e d i s e a s e s , especially human granulocytic ehrlichiosis caused by Anaplasma phagocytophilum (A. phagocytophilum) is frequently observed worldwide. Ticks are well recognized as the main method of transmission of the HE.

Las enfermedades caninas infecciosas trasmitidas por vectores representan un problema emergente en la medicina veterinaria; además, el potencial zoonótico de los agentes causales puede ser de importancia para la salud humana (1). Las enfermedades caninas transmitidas por vectores, especialmente la ehrlichiosis granulocítica humana causada por Anaplasma phagocytophilum (A. phagocytophilum), se observan con frecuencia a nivel mundial. Las garrapatas han sido ampliamente reconocidas como el principal medio de transmisión de la EH.

Anaplasma phagocytophilum is a well recognized agent of granulocytic anaplasmosis, possessing influence on neutrophils and rarely eosinophils (2). A. phagocytophilum infections can be detected either directly in blood smears (morulae in granulocytes) or by PCR or indirectly by serology. Many laboratories perform serological testing for IgG antibodies by using indirect immunofluorescent antibody techniques (IFAT). Regarding human granulocytic anaplasmosis, diagnosis rely upon relevant clinical signs and laboratory analysis as follows; (i) microscobic morulae observation among neutrophils on satined blood smears along with antibody titer positivity against A. phagocytophilum; (ii) a 4-fold antibody titer elevation/reducing in 1 month; (iii) PCR positivity; or (iv) A. phagocytophilum identification and isolation in blood sample (3). Aforementioned criteria may also be adapted to dogs, apart from microbiological isolation (2,4-6). Doxycycline is the armoured therapy option for Canine Granulocyctic Anaplasmosis (CGA). Indeed further research are warranted in an attempt to investigate any adjuvant or combined therapy alternatives for better releiving the hematopathogical and clinical signs. The aim of this study was to analyze clinical consequences of CGA among dogs, besides to scrutinize hematological alterations and interpretation of doxycycline+ chloroquine dual therapy.

Anaplasma phagocitophylum es un agente ampliamente reconocido de la anaplasmosis granulocítica, que ejerce una influencia sobre los neutrófilos y raras veces sobre los eosinófilos (2). Las infecciones de a+ se pueden detectar ya sea directamente en frotis de sangre (mórulas en granulocitos), por reacción en cadena de la polimerasa o indirectamente por serología. Varios laboratorios realizan pruebas serológicas de anticuerpos IgG técnicas indirectas de anticuerpos inmunofluorescentes (IFAT por su sigla en inglés). En cuanto a la anaplasmosis granulocítica humana, los diagnósticos dependen de signos clínicos pertinentes y análisis de laboratorio de la siguiente manera; (i) observación de mórulas microscópicas en neutrófilos en frotis de sangre junto con positividad de título de anticuerpos contra a+; (ii) una elevación/reducción cuádruple de título de anticuerpo en 1 mes; (iii) positividad de reacción en cadena de polimerasa; o (iv) identificación y aislamiento en sangre de a+ (3). Los criterios antes mencionados también se pueden adaptar a perros, salvo por el aislamiento microbiológico (2, 4-6). La doxicilina es la opción terapéutica blindada para la Anaplasmosis Granulocítica Canina (AGC). En efecto, se justifica realizar investigaciones adicionales para investigar alternativas terapéuticas adyuvantes o combinadas para mejorar el alivio de signos hematopatológicos y clínicos. El objetivo de este estudio fue analizar las consecuencias clínicas de la AGC en perros, como también mirar en detalle las alteraciones hematológicas e interpretar de la terapia dual con doxicilina+ cloroquina.

MATERIAL AND METHODS

MATERIALES Y MÉTODOS

Conclusion criteria, sampling. The present study was enrolled among 14 dogs referred to the Small Animal Clinics at the Department of Internal Medicine, Faculty of Veterinary, Adnan Menderes University and privately owned small animal clinics in Aydin province between 2013 March-2014 February. All diseased dogs, referred with histories of at least one of the

Criterios de conclusión, muestreo. El presente estudio se llevó a cabo entre 14 perros remitidos a las Clínicas de Animales Pequeños del Departamento de Medicina Interna, Facultad de Veterinaria, Universidad Adnan Menders y en pequeñas clínicas privadas en la provincia de Aydin entre marzo de 2013 y febrero de 2014. Todos los perros

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clinical signs involving fever, anorexia, weight loss, fever, generalized lymphadenopathy, arthropathy, muscle weakness, epistaxis and distal limb edema were evaluated using a canine point-of-care ELISA kit for diagnosis of naturally occuring vector borne diseases (SNAP 4Dx, IDEXX Laboratories, USA). Informed written consent was obtained from all of the dogs owners prior to enrolment of the dogs participated in study (n=14, at the age of 16 months to 4 years, 8 male, 6 female). Laboratory analyses Haematological analysis. Blood samples were withdrawn from vena cephalica antebrachii into anticoagulated (EDTA) tubes. Complete blood counts were performed on referral within Abacus Junior Vet hematology analyzer. Serological analysis. Sera samples were tested within ELISA kit (SNAP 4Dx, IDEXX Laboratories, USA) in an attempt to diagnose antibodies against A. phagocytophilum, Ehrlichia canis, and Borrellia burgdorferi and antigen of Dirofilaria immitis, according to the protocol listed in the product insert. This assay detects antibodies reacting to immunodominant protein (msp2) of A. phagocytophilum. Only dogs naturally and mono-infected with A. phagocytophilum were enrolled in the present study. The test results were recorded in an Excel spreadsheet. Treatment procedure. Fourteen dogs with a diagnosis of CGA were randomly enrolled into 2 groups. Treatment in both groups involved peroral administration. Group I (n=7) received doxycycline [(Monodoks capsule, 100 mg, Deva, Turkey) (10 mg/kg q 12 h for 14 days)] + chloroquine [(Kutlu tablet, 250 mg, Abdi İbrahim, Turkey) (2.5 mg/kg 12 h for 14 days)] and group II (n = 7) received mono-doxycycline (10 mg/kg q 12 h for 14 days) therapy. Statistical analysis. Data were analyzed using the Mann-Whitney U (inter-group comparison) and the Wilcoxon test (intra-group comparison) procedures.

RESULTS Serological results. Sera samples were tested within ELISA kit (SNAP 4Dx, IDEXX L a b o ra t o r i e s , U SA ) r e ve a l e d a n t i b o d i e s reacting to immunodominant protein (msp2) of A. phagocytophilum in all cases. Clinical cure. Treatment in both groups resulted in rapid resolution of clinical signs in all dogs in about 2 to 7 days. Although not significant and statistically not important (data

enfermos, remitidos con al menos un signo clínico que involucrara fiebre, anorexia, pérdida de peso, linfadenopatía, artropatía, debilidad muscular, epistaxis y edema distal en miembros, fueron evaluados utilizando un kit de ELISA canino en el punto de atención para diagnosticar enfermedades transmitidas por vectores que ocurren naturalmente (SNAP 4Dx, IDEXX Laboratories, EE.UU.). Se obtuvo consentimiento informado por escrito por parte de todos los dueños de los perros que participaron antes de vincularlos al estudio (n=14, en edades desde los 16 meses hasta los 4 años, 8 machos, 6 hembras). Análisis de laboratorio Análisis hematológico. Se tomaron muestras de sangre de la vena cephalica antebrachii en tubos anticoagulados (ácido etildiaminotetraacético – EDTA).Se realizaron conteos de sangre completos al ser remitidos utilizando un analizador de hematología Abacus Junior Vet. Análisis serológico. Se tomaron muestras de suero utilizando un kit de ELISA (SNAP 4Dx, IDEXX Laboratories, EE.UU.) buscando diagnosticar los anticuerpos contra A. phagocytophilum, Ehrlichia canis, y Borrellia burgdorferiy y el antígeno de Dirofilaria immitis, de acuerdo al protocolo relacionado en el folleto del producto. Este ensayo detecta anticuerpos que reaccionan a las proteínas inmunodominantes (msp2) de A. phagocytophilum. En este estudio participaron sólo participaron perros infectados únicamente con A. phagocytophilum. Los resultados de las pruebas se registraron en una hoja de cálculo de Excel. Procedimiento del tratamiento. Catorce perros diagnosticados con AGC fueron inscritos aleatoriamente en 2 grupos. En ambos grupos, el tratamiento involucró una administración peroral. El grupo I (n=7) recibió una terapia de doxicilina [(Monodokus cápsula, 100 mg, Deva, Turquía) (10 mg/kg q 12 h durante 14 días)] + cloroquina [(Kutlu tableta, 250 mg, Abdi İbrahim, Turquía) (2.5 mg/kg 12 h durante 14 días)] y el grupo II (n=7) recibió una terapia únicamente con doxicicilina (10 mg/kg q 12 h durante 14 días). Análisis estadístico. Los datos se analizaron utilizando como procedimientos la U Mann-Whitney (comparación intergrupal) y la prueba de Wilcoxon (comparación intragrupal). RESULTADOS Resultados serológicos. Las pruebas de las muestras de suero se llevaron a cabo en un kit de ELISA (SNAP 4Dx, IDEXX Laboratories, EE.UU.), revelando los anticuerpos que reaccionaron

Ural - Doxycycline chloroquine combination therapy of Anaplasmosis in dogs not shown) dogs enrolled in group I, that were dual treated, presented a more rapid clinical cure. Treatment in both groups resulted with clinical remission regarding aforementioned clinical signs. On day 30 no fever was evident in treated dogs. Spontaneous and gradual regression of enlarged lymp nodes occurred in 4 to 12 days in both groups. Finnaly on day 30 all dogs presented complete clinical recovery. Analysis for relevant hematological variables. No significant difference was found among the mean hematological values of the two groups before and after treatment (p>0.05) (Table 1). Intra-group comparison revealed that there was no significant difference between mean values of hematological variances before and after treatment (p>0.05). Solely in doxycycline group showed significantly altered mean values regarding RBC, Hb, HCT and PLT before and after treatment (p≤0.05).

DISCUSSION A. phagocytophilum, capable of infecting granulocytes, and so far neutrophils and eosinophils (7), frequently cause an acute febrile systemic illness, namely CGA. In an attempt to make precise diagnostic tests for CGA microscopic detection of specific morulae, anti-Anaplasma IgM and IgG antibody detection and PCR analysis, which is most reliable for early diagnosis (8). Recent exposure to A. phagocytophilum may be determined in dogs and human by acute and convalescent serologic testing, to those of IFA assays (9). IgG class antibodies primarily are detectable following 8 days after first exposure, corresponding to 2–5 days after morulae presence. It is therefore may be suggested that antibody detection may not be possible during acute infection (7). Seronegative dogs could probably have been recently infected; indeed a seropositive case could have been exposed to the etiological agent preceeding months, in association with elimination of infection thorugh immunity (10). Polymerase chain reaction (PCR) assays can be used to detect organism-speciﬁc DNA sequences in the blood during the early stages (11). Therefore, the present authors may suggest that seropositive dogs obtained in the present study may have been infected weeks to months earlier, similar to previous description (9). The major flaw in the present research was that serological or molecular testing results at the time of diagnosis was not available,

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a la proteína inmunodominante (msp2) de A. phagocytophilum en todos los casos. Curación clínica. El tratamiento en ambos grupos dio como resultado una rápida resolución de los signos clínicos en todos los perros en un periodo de aproximadamente 2-7 días. Los perros en el grupo I, que recibieron tratamiento dual, presentaron una curación clínica más rápida, aunque no significativamente y sin importancia estadística (no se muestran los datos). El tratamiento en ambos grupos resultó en la remisión clínica respecto de los signos clínicos antes mencionados. En el día 30 no se observó una presencia evidente de fiebre en los perros sometidos a tratamiento. En ambos grupos se observó una regresión espontánea y gradual de los ganglios linfáticos entre los 4 y los 12 días. Finalmente, en el día 30 todos los perros presentaron una recuperación clínica total. Análisis de las variables hematológicas pertinentes. No se encontró una diferencia significativa antes y después del tratamiento entre los valores hematológicos medios de los dos grupos (p>0.05) (Tabla 1). La comparación intragrupal reveló que no hubo una diferencia significativa entre los valores medios de las varianzas hematológicas antes y después del tratamiento (p>0.05). Únicamente el grupo tratado con doxicilina mostró valores medios alterados significativamente en cuanto a RBC, Hb, HCT y PLT antes y después del tratamiento (p≤0.05). DISCUSIÓN A. Phagocytophilum, capaz de infectar a los granulocitos, y a saber también a los neutrófilos y a los eosinófilos (7), a menudo causa una enfermedad febril aguda, concretamente AGC. En un intento por hacer precisas las pruebas de diagnóstico de detección microscópica de mórulas en AGC, se utilizó la detección de anticuerpos IgM e IgC antiAnaplasma y el análisis de reacción en cadena de la polimerasa, ya que son los más fiables para un diagnóstico temprano (8). Es posible determinar una exposición reciente a A. phagocytophilum en perros y en humanos por medio de pruebas de sueros agudos y convalecientes, con ensayos indirectos de anticuerpos inmunofluorescentes (IFA) (9). Los anticuerpos de clase IgG son detectables mayormente a los 8 días de la primera exposición, correspondientes a 2-5 días posteriores a la presencia de mórulas. Es por ello que se puede sugerir que no es posible la detección de anticuerpos durante la infección aguda (7). Es probable que los perros seronegativos hayan sido infectados recientemente; en efecto, un caso seropositivo

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Table 1. Hematological variances and relevant statistical analysis. Parameters

Group I

Group II

Before

After

Before

After

WBC (x109/l)

15.5±2.20 (6.7-22.1)

11.5±1.24 (7.6-15.9)

15.5±2.44 (6.2-25.3)

11.2±1.31 (6.7-16.0)

RBC (x1012/l)

5.6±0.29 (4.0-6.4)

6.8±0.49 (5.0-8.1)

5.0±0.44 (4.0-6.6)

6.3±0.39 (4.6-7.5)

HG (g/dl)

12.5±0.74 (8.5-14.3)

14.8±1.32 (10.0-18.0)

11.0±1.19 (7.9-15.0)

14.4±0.76 (11.3-16.8)

HCT (%)

37.2±2.06 (25.6-41.1)

44.6±3.16 (31.5-51.7)

32.8±3.13 (25.4-43.2)

42.2 ± 2.36 (33.6-50.7)

PLT (x109/l)

155.4± 71.58 336.0±57.75 107.1±33.01 461.5±42.65 (9.0-557) (224-619) (5.0-248) (328-619)

†values were expressed in terms of Mean ± SEM (SEM denoted; Standard Error of Mean) and values in brackets showed minimum-maximum values. Inter-group comparison revealed that solely in Group II there was statistical significance among mean RBC, Hb, HCT and PLT values before and after treatment (p≤0.05).

other than Snap 4 Dx tests. Dogs enrolled in the present study w ere analyzed on referral with a qualitative ELISA assay able to determine A. phagocytophilum antibody. The aforementioned Snap 4 Dx test platform determines antibodies directed against a synthetic A. phagocytophilum peptide of a major surface protein, namely p44/MSP2, with sensitivity and speciﬁcity of 99 and 100%, respectively, in comparison to an immunoflourescent assay (1). During acute infection with vector-borne organisms, involving Anaplasma species, clinical signs may be evident before the dog has a measureable antibody response (10). From another point of view clinical signs usually present 1 or 2 weeks following tick transmission of Anaplasmosis, indeed. The vast majority of exposed dogs may not develop overt clinical disease. According to the acute nature of the latter infection, about 40% of clinically ill dogs possess antibodies directed against CGA at the time of referral (11, 12). Thus therapy applications might not solely based on antibody testing, even if the results are negative or positive (10). In a recent prospective study in which the present author (K.U.) was also involved, doxycycline-chloroquine combination therapy was successfull against Canine Monocytic Ehrlichiosis (13). The results of the latter study suggested doxycycline+chloroquine combination as efficacous for releiving of clinical signs during Canine Monocytic Ehrlichiosis. In the doxycycline+chloroquine group all of the hematological parameters analyzed returned to physiological levels after

pudo haber estado expuesto al agente etiológico en los meses anteriores, asociado a la eliminación de la infección por inmunidad (10). Los ensayos de reacción en cadena de polimerasa pueden ser utilizados para detectar secuencias de ADN específicas al organismo en la sangre en las etapas tempranas (11). Por lo tanto, los autores del presente estudio pueden sugerir que los perros seropositivos objeto del presente estudio pueden haber sido infectados semanas e incluso meses antes, acorde con la descripción anterior (9). La principal falla de la presente investigación fue que los resultados de pruebas serológicas o moleculares distintas a las pruebas Snap 4 Dx no estuvieron disponibles en el momento del diagnóstico. Los perros que participaron en el presente estudio fueron analizados al ser remitidos con un ensayo ELISA cualitativo para determinar el anticuerpo de A. phagocytophilum. La plataforma de dicha prueba Snap 4 Dx determina los anticuerpos dirigidos contra un péptido sintético de A. phagocytophilum de una proteína de superficie principal, a saber p44/MSP2, con una sensibilidad y una especificidad de 99% y 100% respectivamente, en comparación con un ensayo inmunofluorescente (1). Durante la infección aguda por organismos transmitidos por vectores, que involucran especies de Anaplasma, los signos clínicos pueden ser evidentes antes de que el perro tenga una respuesta de anticuerpos medible (10). Desde otro punto de vista, los signos clínicos normalmente se presentan 1 o 2 semanas después de la transmisión efectiva de la Anaplasmosis por garrapatas. La gran mayoría de los perros expuestos pueden no desarrollar una enfermedad clínica manifiesta. Según lo aguda que sea la infección, cerca del 40% de los perros clínicamente enfermos poseen anticuerpos para contrarrestar a la AGC en el momento en que son remitidos (11,12). Por lo tanto, las aplicaciones de la terapia pueden no estar basadas exclusivamente en las pruebas de anticuerpos, independientemente de si los resultados son negativos o positivos (10). En un estudio prospectivo reciente en el que estuvo involucrado el presente autor (K.U.), una terapia combinada de doxicilina+-cloroquina tuvo éxito en combatir la Ehrlichiosis Monocítica Canina (13). Los resultados de dicho estudio sugieren que la combinación doxicilina+cloroquina es igual de eficaz para aliviar signos clínicos en la Ehrlichiosis Monocítica Canina. En el grupo doxicilina + cloroquina, todos los parámetros hematológicos analizados volvieron a los niveles fisiológicos después del tratamiento (13). Los autores (13) también afirmaron que el tratamiento con doxicilina probablemente podría aliviar los efectos sistémicos

Ural - Doxycycline chloroquine combination therapy of Anaplasmosis in dogs this treatment (13). The latter authors (13) also claimed that treatment with doxycycline may probably alleviate the systemic effects of the tumor necrosis factor alpha, a cytokine that plays a role in the pathogenesis of acute canine ehrlichiosis, by reducing or eliminating parasitemia load (14). Furthermore chloroquine may have possessed anti-inflammatory effects (15, 16) and may have helped lowering the proinflammatory cytokines, or may be of beneficial for reducing infection of microbiological agents (17).

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del factor alfa de necrosis tumoral, citoquina que juega un papel en la patogénesis de la ehrlichiosis canina aguda al reducir o eliminar la carga de parasitemia (14). Además, la cloroquina puede haber tenido efectos antiinflamatorios (15,16) y puede haber contribuido a reducir las citoquinas proinflamatorias, o podría ser beneficiosa para reducir la infección por agentes microbiológicos (17).

In another study 18 clinically ill dogs diagnosed with CGA by use of Snap 4 Dx analyte and PCR application, were treated with doxycycline (5-8 mg/kg q 12 h, for 14-30 days), which resulted in rapid resolution (the vast majority of the dogs treated showed recovery in 1-2 days) of clinical signs (10). A 7-year-old Labrador retriever with nonspecific clinical signs was diagnosed within CGA based on serological studies and PCR testing. The dog recovered after treatment with tetracycline (750 mg, PO, q8h for 14 d) (18). Another case from Czech Republic, an 11-months-old male Golden Retriever developed the acute onset of fever, lameness, inappetence, depression, ataxia and reluctance to move, was diagnosed within Anaplasma phagocytophilum infection. Oral doxycycline treatment for 14 days at adosage of 10 mg/ kg q 12 h resulted within resolution of clinical symptoms in six days (19).

En otro estudio, 18 perros clínicamente enfermos fueron diagnosticados con AGC utilizando la aplicación de analito en Snap 4 Dx y reacción en cadena de la polimerasa, y fueron tratados con doxicilina (5-8 mg/kg q 12 h, durante 14-30 días) dando como resultado una rápida resolución (la gran mayoría de los perros que recibieron el tratamiento mostraron una rápida resolución (entre 1 y 2 días) de los signos clínicos (10). Un Labrador Retriever con signos no específicos fue diagnosticado con AGC con base en estudios serológicos y pruebas de reacción en cadena de la polimerasa. El perro se recuperó después del tratamiento con tetraciclina (750 mg, PO, q8h durante 14 d) (18). En otro caso ocurrido en la República Checa, un Golden Retriever varón de 11 años desarrolló un inicio agudo de fiebre, cojera, falta de apetito, depresión, ataxia y reticencia a moverse, por lo cual fue diagnosticado con infección de Anaplasma phagocytophilum. Se le administró un tratamiento oral de doxicilina durante 14 días con una dosis de 10 mg/kg q 12 h que dio como resultado la resolución de los síntomas clínicos al cabo de seis días (19).

Chloroquine is a 4-aminoquinoline derivative possessing antimalarial activity for treatment and prevention (20,21). It has advantages due to its safety and effective usage, with a reasonable price of economic significance (20,21). Regarding its 60 days half-live, chemoprophylactic effect occurs during the elimination phase (21,22). Chloroquine might be safe therapy option for anti-inflammatory diseases. Although in the present study immunological parameters were not analyzed, chloroquine might have helped for a faster clinical remission in conjunction with doxycycline, as reported previously (13). However regarding hematological parameters evaluated, there was no statistical difference among groups treated solely with doxycycline or doxycycline + chloroquine. It should not be unwise to draw conclusion that larger dog population infected with CGA must be involved in studies evaluating chloroquine or similar antiprotozoer/antiinflammatory drug trials in an attempt to better understanding adjuvant therapy. Regardless of the interpretation, it must be kept in mind that Anaplasmosis may affect each dog differently, so alternative

La cloroquina es un derivado de 4-aminoquinolina que posee una actividad antimalárica para el tratamiento y la prevención (20,21). Presenta ventajas debido a que es segura y tiene un uso efectivo, a un precio razonable económicamente significativo (20,21). Con respecto a su semivida de 60 días, el efecto quimoprofiláctico ocurre durante la fase de eliminación (21,22). La cloroquina puede ser la opción terapéutica segura para enfermedades antiinflamatorias. Aunque en el presente estudio no se analizaron los parámetros inmunológicos, la cloroquina puede haber contribuido a una remisión clínica más rápida en conjunto con la doxicilina, de acuerdo a lo reportado previamente (13). Sin embargo, en cuanto a los parámetros hematológicos evaluados, no hubo una diferencia estadística entre los grupos tratados únicamente con doxicilina y los tratados con doxicilina+ cloroquina. No sería insensato llegar a la conclusión de que se debe involucrar a una población mayor de perros infectados con AGC en estudios que evalúen la cloroquina o en estudios farmacéuticos antiprotozarios/antiinflamatorios en aras de una mejor comprensión de la terapia adyuvante. Independientemente de la interpretación, se debe tener en cuenta que la Anaplasmosis puede

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therapy protocols, as shown in this study, might aid clinicians for dissolving related clinical signs resulting in better animal welfare.

afectar a cada perro de forma distinta, por lo tanto los protocolos de terapia alternativos, según lo demuestra este estudio, pueden ayudar a los médicos a disolver los signos clínicos relacionados dando como resultado un mejor bienestar animal.

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Rev.MVZ Córdoba 20(2):4564-4571, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Productivity and Composition of Fatty Acids in Chicks fed with Azadirachta indica A. Juss Productividad y composición de ácidos grasos en pollos alimentados con Azadirachta indica A. Juss Imna Trigueros V,1,2 M.Sc, Miguel Ramón C,1,2* M.Sc, José Vázquez O,3 Ph.D, Juan Aguirre M,1,2 Ph.D, Carlos Garcia C,1,2 M.Sc, Jaime Martínez T,1,2 Ph.D. Universidad Autónoma de Chiapas, Facultad de Ciencias Agrícolas, Campus IV, C.A. Ganadería Tropical Sustentable. Entronque Carretera Costera-Pueblo, Huehuetán, Chiapas, México, C.P. 30660. 2 Maestría en Ciencias en Producción Agropecuaria Tropical, 3Universidad Autónoma de Chiapas. Centro de Biociencias, C.A. Biotecnología Avanzada, *Correspondence: miguelr00@hotmail.com 1

Received: June 2014; Accepted: January 2015.

ABSTRACT Objective. Evaluate the productivity and composition of fatty acids in chicks fed diets enriched with neem Azadirachta indica A. Juss seed flour. Materials and methods. 80 mixed broiler chicks of Arbor Acres stock and levels 0, 1, 3 and 5% neem seed flour added to a commercial diet were evaluated. 20 experimental units were included in each treatment for five weeks. The consumption and weight gain were recorded, as well as the composition of fatty acids in the fat by means of alkaline transesterification. Data was statistically analyzed by a completely random procedure and the measurements were compared with the Tukey test(p≤0.05). Results. The greatest weight gain, consumption and best feed conversion were found in the treatment that contains 1% neem seed flour. It also produced the increase in the proportion of polyunsaturated fatty acids, especially linoleic acid (C18:2 Omega-6) and eicosapentaenoic acid (C20:5 omega-3), and the proportion of palmitic acid (C16:0). The consumption of feed diminished when 5% of neem flour was added. Conclusions. It was demonstrated that incorporating 1% neem seed flour in the diet of broiler chicks modifies the consumption of fatty acids without harming its productive behavior. Key Words: Consumption, weight gain, neem (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. Evaluar la productividad y composición de ácidos grasos en pollos alimentados con dietas adicionadas con harina de semilla de neem Azadirachta indica A. Juss. Materiales y métodos. Se emplearon 80 pollos mixtos de la estirpe Arbor Acres de engorda y se evaluaron los niveles 0, 1, 3 y 5% de harina de semilla de neem añadidos a una dieta comercial. En cada tratamiento se tuvieron 20 unidades experimentales con una duración de cinco semanas. Se registró el consumo y la ganancia de peso, así como la composición de los ácidos grasos de la grasa mediante transesterificación alcalina. Los datos se analizaron estadísticamente por el procedimiento completamente al azar y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤ 0.05). Resultados. La mayor ganancia de peso, consumo y la mejor conversión alimenticia correspondió al tratamiento que contenia 1% de harina de semilla de 4564

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neem. También propició el aumento en la proporción de ácidos grasos poliinsaturados especialmente en el ácido linoleico, (C18:2 omega-6) y en el ácido eicosapentaenoico (C20:5 omega-3), y de manera concomitante se redujo la proporción del ácido palmítico (C16:0). El consumo de alimento disminuyó al adicionar 5% de harina de neem. Conclusiones. Se demostró que la incorporación de 1% de harina de semilla de neem en la dieta de los pollos de engorda modifica la composición de ácidos grasos sin perjudicar su comportamiento productivo. Palabras clave: Consumo, ganancia de peso, neem (Fuente: CAB).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Poultry farming produces protein at a lower cost in comparison with products of a similar origin. The demand for quality protein for the population has driven the study and exploitation of different plant species that could favor an increase in poultry breeding (1) with additional benefits for the consumer, such as a greater proportion of unsaturated or polyunsaturated acids, and higher quality protein in chicken meat (2). Some of these characteristics have been developed by feeding poultry with vegetable products, such as seeds and fruits, which contain unsaturated fatty acids (3). Consequently, the production and commercializing of poultry meat with a lesser proportion of fats and saturated fatty acids, as well as increasing the omega-3 polyunsaturated acids, is highly desirable as a nutritional element to prevent cardiovascular diseases or inflammatory pathologies (4-6). In this sense, neem Azadirachta indica A. Juss has been considered, a species that belongs to the Meliaceae family and that is highly adaptable in tropical and subtropical regions (7), as a potential for poultry feed, by considering that the seeds contain considerable amounts of unsaturated and polyunsaturated fatty acids and proteins. However, neem seeds also contain high amounts of raw fiber as well as some triterpenoid compounds that could seriously limit its consumption (8). Due to the above, the general objective was to evaluate the productivity and composition of fatty acids in the fat of chickens fed different compositions of neem Azadirachta indica A. Juss seed flour.

La avicultura proporciona proteína a menor costo en comparación con productos de origen similar. La demanda de proteína de calidad por la población ha impulsado el estudio y la explotación de diferentes especies de plantas que podrían favorecer un aumento en la producción avícola (1) con beneficios adicionales para el consumidor, tales como una mayor proporción de ácidos insaturados o poliinsaturados, y proteína de mayor calidad en la carne de pollo (2). Algunas de estas características se han desarrollado alimentando a las aves con productos de origen vegetal, como semillas y frutas, que contienen ácidos grasos insaturados (3). En consecuencia, la producción y comercialización de carne de ave con menor proporción de grasa y ácidos grasos saturados, así como el incremento de ácidos poliinsaturados omega-3, es altamente deseable como elemento nutricional para la prevención de enfermedades cardiovasculares o patologías inflamatorias (4-6). En ese sentido, se ha considerado a neem Azadirachta indica A. Juss., especie perteneciente a la familia Meliaceae y de amplia adaptación en las regiones tropicales y subtropicales (7), como especie potencial para la alimentación avícola, al considerar que contiene en sus semillas cantidades considerables de ácidos grasos insaturados, poliinsaturados y de proteínas. Sin embargo, la semilla de neem contiene alto contenido de fibra cruda así como algunos compuestos triterpenoides que pueden limitar seriamente su consumo (8). Por lo anterior el objetivo general fue evaluar la productividad y composición de ácidos grasos en la grasa de los pollos alimentados a diferentes concentraciones de harina de semilla de neem Azadirachta indica A. Juss.

MATERIALS AND METHODS Study site and stages. This study was developed in two stages; one in the field for the weight, consumption and feed conversion variables (FC) of the birds, and the other in the laboratory to determine in each treatment the profile of fatty acids in the chickens fed. The first stage was done in the poultry module of the Faculty of Agricultural Sciences (FCA) Campus IV, of the Universidad Autónoma de Chiapas,

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio y etapas del estudio. El presente estudio se desarrolló en dos etapas; una de campo para las variables peso, consumo y conversión alimenticia (CA) de las aves, y otra de laboratorio para determinar en cada tratamiento el perfil de acidos grasos en los pollos alimentados. La

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municipality of Huehuetán, Chiapas, Mexico, located at parallel 14°59’50” N and meridian 92°24’0” west of Greenwich. The region’s climate is subhumid tropical with summer rains (Am). The second stage was carried out in the research laboratory of the Center of BioSciences of the Universidad Autónoma de Chiapas, city of Tapachula de Córdova y Ordoñez, Chiapas, located at 14°53’36.31” N and 92°16’22.83” W and 147 meters above sea level. Birds and diet preparation. 80 commercial chicks of the Arbor stock, one day old, were randomly distributed in four groups of 20 chicks and each group was placed in a 6 m2 space. Neem seeds were obtained from trees that were 20 years old that had grown in the FCA. The fruit was collected in autumn and were deposited in water for 24 h. After this time, the mesocarp was manually removed to separate the seed, which was washed and sun-dried for a week, and was later put in a forced air oven (Sheldon, VWR 1390FM, USA) at 70°C for 24 h to reduce the humidity to 12%. The dried seeds were ground and sifted to obtain flour with particle sizes between 1 and 2 mm, and it was incorporated and mixed manually in the commercial diets each week, according to the corresponding percentage of the treatment (Table 1). Table 1. Proximal composition of experimental diets depending on the inclusion of neem Azadirachta indica A. Juss seed flour Parameter

CACI

Percentage of neem seed flour 1%

9.03±0.08

8.45±0.05

7.63±0.10

Humidity (%)

12.0

Protein (%)

17.0

14.97±1.37 17.55±1.65 16.96±0.16

Raw fiber %

5.0

4.32±0.01 10.55±0.21 13.30±0.85

Fat (%)

3.0

7.67±1.59

5.30±0.30

7.1±1.05 8.49±0.02

Ashes (%) ELN (by difference) EM Kcal/kg

8.0

9.24±0.29

8.72±0.32

55.0

54.77

49.43

46.52

1069.30

962.41

1086.07

CACI: Composition of commercial starter feed Nc: Not calculated. The values are the mean of three repetitions ± standard error.

During the first eight days of the study, all the chicks were only given commercial feed, early stage. From day nine until day 23 the chicks were given diets with the respective treatments using early stage feed base. From day 23 to the end of the study (day 35), the early stage feed was substituted for the neem flour that corresponded to each treatment. The chicks were fed ad libitum. Treatments and feeding. The treatments were: 1) control that consumed only commercial feed (CF), 2) CF plus1% neem seed flour (NSF), 3)

primera etapa se realizó en el modulo avícola de la Facultad de Ciencias Agrícolas (FCA) Campus IV, de la Universidad Autónoma de Chiapas, municipio de Huehuetán, Chiapas, México, ubicada geográficamente en el paralelo 14°59’50” latitud N y el meridiano 92°24’0” longitud Oeste de Greenwich. El clima de la región pertenece al tropical subhúmedo con lluvias en verano (Am). La segunda etapa se llevó a cabo en el laboratorio de Investigación del Centro de Biociencias de la Universidad Autónoma de Chiapas, ciudad de Tapachula de Córdova y Ordoñez, Chiapas, ubicado en las coordenadas geográficas 14°53’36.31” N y 92°16’22.83” O y 147 msnm. Aves y preparación de dietas. Se utilizaron 80 pollos comerciales de la estirpe Arbor de un día de edad, distribuidos aleatoriamente en cuatro grupos de 20 pollos y cada grupo colocado en un espacio de 6 m2. Las semillas de neem se obtuvieron de los árboles de 20 años de edad que han crecido en la FCA. Se recolectaron los frutos en los meses de otoño y se depositaron en agua por 24 h. Después de este tiempo, se retiró manualmente el mesocarpio hasta separar la semilla, la cual fue lavada y secada al sol durante una semana, y posteriormente se introdujeron en estufa de aire forzado (Sheldon, VWR 1390FM, USA) a 70°C durante 24 h para reducir la humedad hasta 12%. Las semillas secas fueron molidas y tamizadas para obtener la harina con tamaño de partícula entre 1 y 2 mm, y la misma fue incorporada y mezclada manualmente en las dietas comerciales cada semana, de acuerdo con el porcentaje correspondiente del tratamiento (Tabla 1). Durante los primeros ocho días del estudio, a todos los pollos se les proporcionó solamente alimento comercial etapa iniciador. A partir del día nueve, y hasta el día 23, a los pollos se les suministraron las dietas de los respectivos tratamientos empleando como base alimento iniciador. Del día 23 y hasta el final del estudio (35 d), se sustituyó el alimento iniciador por finalizador más la harina de neem que correspondió a cada tratamiento. Los pollos fueron alimentados ad libitum. Tratamientos y alimentación. Los tratamientos fueron: 1) Testigo consumiendo sólo el alimento comercial (AC), 2) AC más 1% de harina de semilla de neem (HSN), 3) AC más 3% de HSN y 4) AC más 5 % con HSN. Se utilizó un diseño completamente al azar con 4 repeticiones y cada repetición estuvo integrada por 20 pollos en cada uno de los tratamientos.

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CF plus 3% NSF and 4) CF plus 5% with NSF. A completely ramdomized design was used with four repetitions, and each repetition integrated 20 chicks in each treatment.

Parámetros productivos. Se registró semanalmente el peso corporal de cada ave, y el consumo diario de alimento y la CA se calculó con la cantidad de alimento rechazado por el grupo.

Productive parameters. The weekly body weight of each bird was recorded weekly, and the daily consumption of feed and CF was calculated by the amount of feed rejected by the group.

Composición de ácidos grasos. Se obtuvo la grasa mediante el método de Soxhlet (9), y se procedió a obtener los esteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), mediante transesterificación alcalina (10). El procedimiento inició depositando en un vial (lavado con hexano y secado por 2 h a 300°C) 2 ml de hexano y 40 mg de grasa abdominal a 40°C por 1 min, y después de éste tiempo, se agregaron 100 µl de metóxido de sodio (preparado con NaOH 2M en metanol absoluto), se agitó vigorosamente por 2 min, se calentó por 5 min (40°C) y fue centrifugado a 5000 rpm por 10 min. El sobrenadante conteniendo los FAMEs se empleó para determinar la composición de ácidos grasos por cromatografía de gases-espectrometría de masas (cromatógrafo Thermo Scientific Focus GC y espectrómetro de masas Thermo Scientific DSQ II).

Composition of fatty acids. Fat was obtained by means of the Soxhlet method (9), and the fatty acid methyl ester (FAMEs) were obtained by means of alkaline transesterification (10). The procedure was started by depositing in a vial (washed with hexane and dried for 2 h at 300°C) 2ml of hexane and 40 mg of abdominal fat at 40°C for 1 min, and after this time, 100 µl of sodium methoxide were added (prepared with NaOH 2M in absolute methane), was shaken vigorously for 2 min, was heated for 5 min (40°C) and was centrifuged at 5000 rpm for 10 min. The supernatant containing the FAMEs was used to determine the composition of fatty acids by gas chromatography mass spectrometry (Thermo Scientific Focus GC chromatograph and Thermo Scientific DSQ II spectrometer of mass). 1 µl of the FAMEs was injected in a column of intermediate polarity with the following temperature program: 100°C, heated 25°C min-1 to 200°C, 2.5°C min-1 to 230°C for 1 min, and 10°C min-1 to 250°C. The chromatograph was operated with helium gas, creating a pressure of 3.5 psi. The injector was programmed in Split 60:1 mode at a temperature of 280°C. The spectrometer of masses was operated with ionization voltage of 70 eV, and interface temperature of 280°C in Scan and mass range from 50 a 500 m z-1. The compounds of each sample were identified by comparison with it mass spectrum with the compounds of the library of the National institute of Standards and Technology (NIST). The sum of all the proportions of fatty acids was considered 100% of the fat and the proportion of each fatty acid was reported as a relative percentage. Four repetitions of each treatment were analyzed. Statistical analysis. Data were statistically analyzed by means of the SAS program version 8.2, and the comparisons between treatment means by Tukey (p≤ 0.05)(11).

RESULTS Productive parameters. Greater weight at sacrificing was seen in chicks that consumed the diet with the least percentage of NSF

Se inyectó 1 µl de los FAMEs en una columna de polaridad intermedia con el siguiente programa de temperaturas: 100°C, calentamiento 25°C min-1 hasta 200°C, 2.5°C min-1 hasta 230°C por 1 min, y 10°C min-1 hasta 250°C. El cromatógrafo se operó con helio como gas acarreador a una presión de 3.5 psi. El inyector se programó en modo Split 60:1 a una temperatura de 280°C. El espectrómetro de masas se operó con voltaje de ionización de 70 eV, y temperatura de interface de 280°C en modo Scan y rango de masas de 50 a 500 m z-1. Los compuestos de cada muestra se identificaron por comparación de su espectro de masas con los compuestos de la biblioteca del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST). Se consideró la suma de todas las proporciones de ácidos grasos como el 100% de la grasa y se reportó la proporción de cada ácido graso como porcentaje relativo. Se analizaron cuatro repeticiones por tratamiento. Análisis estadístico. Los datos se analizaron estadísticamente por medio del programa SAS ver 8.2, y las comparaciones entre medias de tratamientos por Tukey (p≤ 0.05)(11).

RESULTADOS Parámetros productivos. El mayor peso al sacrificio se presentó en los pollos que consumieron la dieta con menor porcentaje de HSN (1%) y en el tratamiento testigo (p≤0.05). El menor peso corporal se observó en los pollos que consumieron 5% de HSN (Tabla 2). El aumento en el porcentaje

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(1%) and the constant treatment (p≤0.05). The lowest body weight was observed in the chicks that consumed 5% of NSF (Table 2). The increase in the percentage of NSF in the diet induced a lower body weight in the birds. When 5% NSF was added to commercial feed, the final weight of the birds was 10.2% less in comparison with birds fed with 1% neem seed and 5.9% less weight in comparison with chicks fed with only commercial feed. The birds’ consumption of feed was restricted by the increase in the NSF percentages. The greater consumption was presented in the treatment where the birds consumed the lesser proportion of NSF. The differences in consumption between the groups were statistically different (p≤0.05). In the case of the treatment with 1% NSF the consumption diminished only 0.6% and as the NSF was increased to 3, the consumption diminished by 2% and when it was at 5% the same was reduced to 2.6% in relation to the consumption of the birds that only consumed CF. In the case of CF the tendencies of inclusion of the different percentages of NSF in the commercial diet was contrary to the consumption; that is, the lower percentage (1% of NSF) presented the lesser CF and this value increased as the NSF percentage increased. Composition of fatty acids. The composition of fatty acids found in the abdominal fat of chicks treated in this study is presented in table 3. By increasing the concentration of NSF the saturated fatty acids were significantly diminished. The saturated fatty acids in the C16:0 series, of which palmitoleic and palmitic acid presented the largest proportion in a control group, that is, in the birds fed only with commercial feed, in comparison with the treatments that included Table 2. Productive parameters of broiler chicks fed with different percentages of neem seed flour. Treatment

Final weight (g.ave-1)

2208.33 ab ±31.8

1% NSF plus CF

2312.94 a ±42.6

3% NSF plus CF

2123.83 bc ±17.3

5% NSF flour plus CF

2076.11 c ±29.3

El consumo de alimento de las aves fue restringido por el aumento en los porcentajes de HSN. El mayor consumo se presentó en el tratamiento donde las aves consumieron la menor proporción de HSN. Las diferencias en el consumo entre los grupos fueron estadísticamente diferentes (p≤0.05). En el caso del tratamiento con 1% de HSN el consumo disminuyó solamente 0.6% y conforme se incrementó a 3 HSN, el consumo disminuyó 2% y cuando fue del 5% el mismo se redujo a 2.6% en relación al consumo de las aves que sólo consumieron AC. En el caso de la CA las tendencias de la inclusión de los diferentes porcentajes de HSN en la dieta comercial fue contraria al consumo; es decir, el porcentaje más bajo (de 1% de HSN), presentó la menor CA y se incrementó este valor, conforme aumentó el porcentaje HSN. Composición de ácidos grasos. En la tabla 3, se presenta la composición de ácidos grasos encontrados en la grasa abdominal de los pollos tratados en este estudio. Al aumentar la concentración de HSN disminuyeron significativamente los ácidos grasos saturados. Table 3. Percentage relative to the composition of the principal fatty acids contained in abdominal fat in broiler chicks fed with different concentrations of neem seed flour. Fatty acid

Commercial Feed

Percentage of neem seed flour in commercial feed CV 1%

C14:0 Myristic

0.46* ±0.025b

C16:1 Palmitoic

5.64 ±0.013a

C16:0 Palmitic

22.28 ±0.167a

C18:0 Stearic

5.77 ±0.019bc

6.08 ±0.029a

0.56 0.54 0.51 3.9 ±0.0017a ±0.0151ab ±0.0004ab 4.80 ±0.157b

4.86 ±0.011b

4.61 ±0.071b

2.4

20.10 ±0.245b

1.7

5.86 ±0.024b

5.71 ±0.005c

0.5

18:1n-9 Oleic

44.62 ±0.340 a

44.43 44.14 ±0.017 a ±0.718 a

43.55 ±0.554a

1.5

18:3n-3 Linolenic

0.14 ±0.004a

0.15 ±0.021a

0.18 ±0.009a

12.8

24.02 ±0.869a

3.5

0.16 ±0.006b

10.9

21.31 20.83 ±0.372ab ±0.212ab

Feed consumption (g.bird.week-1)

Feed conversion

1666 a**

1.83 b ±0.05

18:2n-6 Linoleic

20.25 ±0.481 b

1657 a

1.75 a ±0.07

C20:5n-3 EPA

0.055 ±0.001c

1635 b

1.87 bc 0.04

C20:4n-6 Arachidonic

0.11 ±0.006a

0.07 0.06 ±0.0004a ±0.0005a

0.19 10.4 ±0.0060a

1623 c

1.94 c 0.05

C20:3n-6 Dihomo and linolenic

0.15 ±0.0022a

0.13 0.14 ±0.0018b ±0.0055b

0.10 ±0.0051c

Values with different letters within each factor and column are statistically different (p ≤ 0.05). ** The value indicates the rejection of the feed by the group of 20 chicks per treatment. *

de HSN en la dieta indujo menor peso corporal de las aves. Cuando se adicionó 5% de la HSN al alimento comercial, el peso final de las aves fue 10.2% menor en comparación a los pollos alimentados con el 1% de la harina de neem y 5.9% menor peso en comparación a los pollos alimentados solo con el alimento comercial.

0.16 ±0.011a

21.16 22.22 ±0.104ab ±0.474ab 0.29 ±0.028a

0.21 ±0.001ab

4.6

CV: % Coefficient of variation. *Average values with the same letter within each factor and column are not statistically different (Tukey, p≤0.05).

Trigueros - Productivity and fatty acid composition in broiler chickens some percentage of NSF in the diet. The results were statistically different (p≤0.05). Stearic acid was increased with the 1% NSF in the diet and was statistically different from the other treatments (p≤0.05). Oleic acid presented similar percentages among the treatments and without statistical differences (p≥0.05) between them. The concentrations of polyunsaturated linoleic acids were increased as the percentages of NSF were increased in the diet. Linoleic acid, with a diet of 1%, increased 4.4%, 9.7% with 3% and 18.6% with the 5% dose in relation to the birds that consumed only commercial feed and were statistically different (p≤0.05). The differences found in linolenic acid by adding 1, 3 and 5% de NSF to the commercial diet were 7.1, 14.2 and 28.5% in relation to the commercial diet and without differences (p≥0.05) between the treatments. Instead of eicosapentaenoic acid was found in greater proportion with the lesser quantity of NSF added to the commercial diet. This represents the greater increase between the fatty acids evaluated. The arachidonic acid did not show an increasing tendency with the NSF levels in the diet, only with a greater percentage, the increase of it was the highest, but without significant differences between them. The control, with no added NSF, presented a lesser content of fatty Omega-6 acids with 20.90% (p≥0.05) respecting 1, 3 and 5% with 21.47, 21.96 and 23.30% respectively (Table 3). As far as the relationship of omega-6 and omega-3 fatty acids, significant differences were not seen (p≥0.05) in any of the four treatments (Table 3).

DISCUSSION The final weight of the birds fed with NSF was different in the percentages added to the commercial diet. Adding 1% NSF increased the final weight of the chicks. The differences in weight of the birds, with their different percentages of NSF, can be influenced by the decrease in the consumption, caused by the increase of the raw fiber content with the addition of the percentages 3 and 5% of flour, at the same time that the greater percentage of NSF restricted consumption and consequently the final weight decreased. The decrease in consumption of the feed with high fiber content for the birds has been consigned (12, 13). Additionally, the fiber content, another factor that could have restricted the consumption in the different diets is the presence of polyfenols, triglycerides and some triterpenoid compounds

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Los ácidos grasos saturados de la serie C16:0, del cual el ácido palmitoleico y palmítico presentaron mayor proporción en el grupo testigo, es decir, en las aves alimentadas solo con alimento comercial, en comparación con los tratamientos que incluyeron algún porcentaje de HSN en la dieta. Los resultados fueron diferentes estadísticamente (p≤0.05). El ácido estéarico se incrementó con el porcentaje de 1% de HSN en la dieta y fue estadísticamente diferente a los otros tratamientos (p≤0.05). El ácido oleico presentó porcentajes semejantes entre tratamientos y sin diferencias estadísticas (p≥0.05) entre ellos. Se incrementaron las concentraciones de ácidos poliinsaturados linoleico, conforme aumentaron los porcentajes de HSN en la dieta. El ácido linoleico, con la dieta de 1%, aumentó 4.4%, 9.7% con 3% y 18.6% con la dosis de 5% en relación a las aves que consumieron sólo alimento comercial y fueron estadísticamente diferentes (p≤0.05). Las diferencias encontradas con el ácido linolénico al adicionar 1, 3 y 5% de HSN a la dieta comercial, fueron de 7.1, 14.2 y 28.5% con relación a la dieta comercial y sin diferencia (p≥0.05) entre tratamientos. En cambio el ácido eicosapentanoico se encontró en mayor proporción con la menor cantidad de HSN adicionada al alimento comercial. Esto representó el mayor incremento entre los ácidos grasos evaluados. El ácido araquidónico no registró tendencia ascendente con los niveles de HSN en la dieta, solamente, con el mayor porcentaje, el incremento del mismo fue el más alto, pero sin diferencias significativas entre ellos. El testigo sin adición de HSN presentó el menor contenido de ácidos grasos omega-6 con 20.90% (p≥0.05) respecto a 1, 3 y 5% con 21.47, 21.96 y 23.30% respectivamente (Tabla 3). En cuanto a la relación de ácidos grasos omega-6 y omega-3 no se demostraron diferencias significativas (p≥0.05) para ninguno de los cuatro tratamientos (Tabla 3).

DISCUSIÓN El peso final de las aves alimentadas con la HSN fue diferente en los porcentajes adicionados a la dieta comercial. Adicionar 1% de HSN incrementó el peso final en los pollos. Las diferencias en el peso de las aves, con los diferentes porcentajes de HSN pueden estar influenciadas por la disminución en el consumo, ocasionado a su vez por el aumento en el contenido de fibra cruda con la adición de los porcentajes de 3 y 5% de harina, toda vez que a mayor porcentaje de HSN, se restringió su consumo y en consecuencia disminuyó su peso final. La disminución del consumo de alimento con alto contenido de fibra por las aves ha sido consignado (12,13). Además, del contenido de fibra, otro factor que pudo haber restringido el consumo en las diferentes dietas es la presencia de polifenoles,

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in the neem, which determine the bitter taste that interferes in the sensorial perception of the birds (14). By increasing the percentages of fiber in the flour, the ingestion of feed diminishes (12), and therefore, lesser body weight is seen (12, 13) due to a reduction in the metabolizing the nutrients (12). The lowest percentage of NSF in the conventional diet induced greater CA, as well as consumption and weight gain. The final weight of the birds fed with NSF is greater in comparison with providing other components in the birds’ diet (15,16). The decreased concentration of saturated fatty acids in the fat of birds fed with NSF suggests benefits to the health of consumers (17). Other authors (18) fed chicks with 10% pumpkin seed (Cucurbita moschata) and found that it diminished the abdomen and thigh fat in birds (19), added 33 and 66g of pumpkin flour per kg of feed and they did not find significant differences in the variables of weight and feed conversion, but yes in the diminished abdominal fat in the birds. Broiler chicks with 5 and 10% chia flour (Salvia hispanica L.) found a greater content of linolenic acid and a reduction in the content of palmitic acid in the tissue analyzed as the percentage of chia increased (20). Similarly, by adding 1% NSF produced an increase both in the proportion of linolenic acid (18:2 omega-6) and eicosapentaenoic (EPA: C20:5 n-3). These results are greater when compared with the constant (without adding NSF). In conclusion, the NSF of Azadirachta indica A. Juss., is a feed alternative for chicks and the greater weight and CA recorded when they consumed a diet that includes 1% NSF. Adding 1% NSF increased the proportion of unsaturated fatty acids (linoleic) and polyunsaturated (eicosapentaeonic) and diminished the proportion of palmitic acid. Acknowledgments The authors would like to express their appreciation to the Center for Biosciences of the Universidad Autónoma de Chiapas and the National Council on Science and Technology (CONACYT) for their economic support to continue this investigation.

trigliceridos y algunos compuestos triterpenoides en el neem, los cuales determinan el sabor amargo que interfieren en la percepción sensorial de las aves (14). Al aumentar los porcentajes fibra de la harina, disminuye la ingestión de alimento (12) y, por tanto, se tiene menor peso corporal (12,13) por la disminución en la metabolización de los nutrientes (12). El menor porcentaje de HSN en la dieta convencional indujo mayor CA, de igual forma para el consumo y la ganancia de peso. El peso final de las aves alimentadas con HSN es mayor en comparación con el suministro de otros componentes en las dietas de aves (15,16). La disminución en la concentración de ácidos grasos saturados en la grasa de las aves alimentadas con HSN, sugiere beneficios a la salud de los consumidores (17). Otros autores (18) alimentaron pollos con 10% de semilla de calabaza (Cucurbita moschata) y encontraron disminución de la grasa en abdomen y muslo de las aves (19) agregaron 33 y 66 g de harina de calabaza por kg de pienso y no encontraron diferencias significativas en las variables de peso y conversión alimenticia, pero sí, en la disminución de la grasa abdominal de las aves. En pollos de engorda con 5 y 10 % de harina integral de chía (Salvia hispanica L.) se encontró mayor contenido de ácido linolénico y reducción en el contenido de ácido palmítico en los tejidos analizados a medida que se incrementó el porcentaje de chia (20). De manera similar, la adición del 1% de HSN propició aumento tanto en la proporción de ácido linolenico (18:2 omega-6) y eicosapentaenoico (EPA: C20:5 n-3). Estos resultados son mayores al ser comparados con el testigo (sin adicionarle HSN). En conclusión la HSN de Azadirachta indica A. Juss., es una alternativa alimenticia para los pollos y el mayor peso y la CA se registró cuando consumieron la dieta con 1% de inclusión de HSN. La adición de HSN en un 1% propició el aumento en la proporción de ácidos grasos insaturados (linoleico) y poliinsaturados (eicosapentaenoico), y la disminución en la proporción del ácido palmítico. Agradecimientos Los autores quieren expresar sus agradecimientos al Centro de Biociencias, Universidad Autónoma de Chiapas Y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo económico para continuar con esta investigación.

Trigueros - Productivity and fatty acid composition in broiler chickens

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Rev.MVZ Córdoba 20(2):4572-4580, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Performance and plasma urea nitrogen of immunocastrated males pigs of medium genetic potential Rendimiento y nitrógeno de urea en plasma de cerdos machos inmunocastrados de potencial genético medio Fabiana R Caldara,1* Ph.D, Rita KS Santos,1 M.Sc, Luan S Santos,1 B.Sc, Luciana Foppa,1 B.Sc, Irenilza A Nääs,1 Ph.D, Rodrigo G Garcia,1 Ph.D, Simone P Machado,1 B.Sc. Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD), Faculdade de Ciências Agrárias (FCA), Zip Code 79823-350, Dourados, MS, Brazil. *Correspondence: fabianacaldara@ufgd.edu.br 1

Received: June 2014; Accepted: January 2015.

ABSTRACT Objective. A study was carried out to evaluate the performance and the plasma urea nitrogen (PUN) of male pigs of medium genetic potential for lean meat deposition in carcass, which underwent immunocastration. Materials and methods. Forty-five seventy-days old Large White x Landrace crossbred were used. The pigs were distributed in a randomized design in three treatments: castrated males, females and immunocastrated males. Each treatment group was replicated three times with five pigs per replicate. The trial period was of 70 days, divided into phases of growing (70 to 110 days old) and finishing (111 to 140 days old). The pigs were weighed four times: at the beginning of the trial, at the first immunocastration vaccine dose (80 days old), at the second immunocastration vaccine dose (110 days old) and just before slaughter (140 days old). Blood samples were taken on the same day that the animals were weighed. Results. Between 80 and 110 days old, there was an increase in PUN value, only for castrated males and females. No differences were found in weight gain between the studied groups within the periods. Immunocastrated males had lower feed intake than females and these had a lower feed intake than castrated males. To 110 days old, immunocastrated animals showed feed conversion ratio similar to females and better than castrated males. However, after the second dose of the vaccine, feed conversion was similar between groups. Conclusions. The benefits of immunocastration are prominent in animals with low to medium genetic potential. Key words: Castration, feed conversion, feed intake, immunocastration, swine production, weight gain (Source: USDA).

RESUMEN Objetivo. Se realizó un estudio para evaluar el rendimiento y la concentración de urea en plasma (PUN) de los cerdos machos de medio potencial genético de carne magra en la canal sometidos a la inmunocastración. Materiales y métodos. Se utilizaron 45 cerdos de 70 días de edad Landrace x Large White. Los animales se distribuyeron en un diseño completamente al azar con tres tratamientos: machos castrados, hembras y machos inmunocastrados. Cada tratamiento consistió en tres repeticiones, con cinco animales por réplica. El período experimental fue de 70 días, divididos en las etapas de crecimiento (70 a 110 días de edad) y terminación (111 a 140 días de edad). Los cerdos fueron pesados cuatro veces: al inicio del experimento, en la primera dosis de vacuna de inmunocastración (80 días de edad), en la segunda dosis de la vacuna de inmunocastración (110 días de edad) y antes 4572

Caldara - Performance and plasma urea nitrogen of immunocastrated pigs

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de el sacrificio (140 días de edad). Las muestras de sangre se recogieron en el mismo día en que se pesaron los animales. Resultados. Entre 80 y 110 días de edad, hubo un aumento en la cantidad de PUN, sólo para machos castrados y hembras. No hubo diferencias en la ganancia de peso entre los grupos en ninguno de los períodos estudiados. Machos inmunocastrados tuvieron menor consumo de alimento que las hembras y éstas mostraron un menor consumo que los machos castrados. En 110 días de edad, los animales inmunocastrados mostraron la conversión de alimento similar a las hembras y mejor que los machos castrados. Sin embargo, después de la segunda dosis de la vacuna, la conversión alimenticia fue similar entre los grupos. Conclusiones. Los beneficios de inmunocastración son prominentes en animales con bajo a médio potencial genético Palabras clave: Castración, conversión alimentícia, consumo de alimento, inmunocastración, producción porcina, ganacia de peso (Source: USDA).

INTRODUCTION Surgical castration of young male pigs is a common practice in swine production worldwide. However, castrated male pigs have feed conversion efficiency and nitrogen retention impaired and they present lower lean: fat ratio than boars, which makes production significantly more expensive. The boars have the capability of high protein retention caused by the anti catabolic effect of gonadal steroids. The gonadal steroids influence the balance between protein synthesis and breakdown in favor of a high protein deposition (1). The anti catabolic effect of androgens, and thus the improved N-retention, is partly explained by the fact that androgens antagonize glucocorticoids and their catabolic functions (2). Surgical castration without anesthesia has become an animal welfare issue and has been banned in many countries (3,4). However, anesthesia may promote acute pain during castration and does not eliminate stress and discomfort due handling the animals before surgery and it will not prevent the chronic postcastration pain (5,6). Although these factors produce significant importance to its progressive elimination in swine production, problems associated with boar taint, still are successfully solved by the adoption of the surgical castration. The odor is associated with sexual maturity and swine male hormones production, making the meat of uncastrated pigs unsuitable for human consumption (7). It is clear that alternatives to the surgical castration of pigs need to be found. They must have practical application, be economically viable, do not present adverse impacts to the productive performance of the animals and meet consumer requirements and principles of welfare animal. The immunocastration is a procedure, which can replace surgical castration of male pigs, as it has proved effective in reducing the

INTRODUCCIÓN La castración quirúrgica de los cerdos machos jóvenes es una práctica común en la producción porcina a nivel mundial. Sin embargo, los cerdos machos castrados presentan una eficiencia de conversión de alimentos y una retención de nitrógeno deficientes, además tienen un menor índice magra:grasa que los verracos que hace que la producción sea sustancialmente más costosa. Los verracos tienen la capacidad de una alta retención de proteínas debida al efecto anti-catabólico de los esteroides gonadales. Los esteroides gonadales influyen en el balance entre la síntesis y la descomposición de proteínas, favoreciendo una alta deposición de proteínas (1). El efecto anticatabólico de los andrógenos, y por lo tanto la retención de nitrógeno mejorada, se puede explicar parcialmente por el hecho de que los andrógenos antagonizan a los glucocorticoides y a sus funciones catabólicas (2). La castración quirúrgica sin anestesia se ha convertido en un asunto de bienestar de los animales y ha sido prohibida en varios países (3,4). Sin embargo, la anestesia puede provocar dolores agudos durante la castración y no elimina ni el estrés ni el malestar en la manipulación de los animales antes de la cirugía, ni tampoco evita el dolor crónico post-castración (5,6). Aunque estos factores le dan una importancia significativa a la eliminación progresiva de de ésta en la producción porcina, los problemas asociados al olor sexual aún pueden solucionarse exitosamente por medio de la adopción de la castración quirúrgica. El olor está asociado a la madurez sexual y a la producción de hormonas masculinas en porcinos machos, lo cual hace que la carne de cerdos no castrados sea inapropiada para el consumo humano (7). Es claro que existe la necesidad de encontrar alternativas a la castración quirúrgica de los cerdos. Dichas alternativas deben tener una aplicación práctica, ser viables económicamente,

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concentration of the hormones responsible for the boar taint (8). It also allows the animals to have longer satisfactory performance and carcass characteristics than those of non-castrated males; generating positive productive impact on the pig production (9). Many studies support the effectiveness of the immunocastration, which is used in animals of high genetic potential (pigs of commercial lines genetically improved, with potential for lean meat deposition in carcass greater than 56%)(9-12), with benefits that are not automatically extended to pigs with lower performance. The research aimed to evaluate the effects of immunocastration on performance parameters and plasma urea levels of medium genetic potential pigs.

MATERIAL AND METHODS Study site and animals. A study was carried out at the Swine Experimental Sector, at the Agrarian Sciences College, Universidade Federal da Grande Dourados (Federal University of Grande Dourados), MS, Brazil, using 45 crossbreed of Landrace and Large White genetic strains pigs. The animals were 70 days old, with an average weight of 25.2 ± 2.8 kg, being 15 females and 30 males. All pigs were submitted at the same rearing conditions, in open sided pens with semiautomated feeders and nipple drinkers, concrete floor and a herd density of 0.8 m2/ animal. Treatments and experimental design. The animals were distributed in a fully randomized experimental design with three treatments, and three replications with 15 pigs per treatment. The treatments were T1 (females), T2 (surgically castrated males), and T3 (immune-castrated males). The pigs in the castrated group underwent the orchiectomy procedure on the seventh day of life. The group of immunocastrated animals were subjected to two doses of Vivax®, which is a vaccine based on a synthetic analogue of GnRH coupled to a large carrier protein. It was applied subcutaneous in two dosages: the first at 60 days before slaughter (80 days old), and the second at 30 days before slaughter (110 days old). Nutritional management and experimental period. The trial period lasted 70 days, divided into two phases: growing (from 70 to 110 days) and finishing (from 111 to 140 days). The experimental diets were based on corn and soybean meal and were formulated using the

estar exentas impactos adversos en el rendimiento productivo de los animales, satisfacer las exigencias de los consumidores y cumplir con los principios del bienestar de los animales. La inmunocastración es un procedimiento que puede reemplazar a la castración quirúrgica de los cerdos machos y que ha demostrado ser efectiva para reducir la concentración de hormonas responsables del olor sexual (8). Además, permite que los animales tengan un mayor rendimiento satisfactorio y mejores características en la canal que los machos no castrados, lo cual genera un impacto positivo en la producción porcina (9). Varios estudios respaldan la efectividad de la inmunocastración, utilizada en animales con un alto potencial genético (cerdos de líneas comerciales mejorados genéticamente, con un potencial de deposición de carne en la canal mayor al 56%) (9,12), con beneficios que no se extienden automáticamente a los cerdos con un menor rendimiento. La investigación buscó evaluar los efectos de la inmunocastración en parámetros de rendimiento y de niveles de urea en plasma en cerdos con un potencial genético medio.

MATERIALES Y MÉTODOS Lugar de estudio y animales. Se realizó un estudio en el Sector Experimental Porcino, en la Escuela de Ciencias Agrarias, Universidade Federal da Grande Dourados (Universidad Federal de Grande Dourados), MS, Brasil, utilizando 45 cerdos cruzados entre las cepas genéticas Landrace y Large White. Los animales tenías 70 días de edad, con un peso promedio de 25.2 ± 2.8 kg, donde 15 cerdos fueron hembras y 30 machos. Todos los cerdos fueron sometidos a las mismas condiciones de crianza, en corrales abiertos a los lados con alimentadores semiautomatizados y bebederos de pezón, piso de concreto y una densidad de rebaño de 0.8 m2/ animal. Tratamientos y diseño experimental. Los animales se distribuyeron en un diseño experimental totalmente aleatorizado con tres tratamientos y tres réplicas usando 15 cerdos para cada tratamiento. Los tratamientos fueron T1 (hembras). T2 (machos castrados quirúrgicamente) y T3 (machos inmunocastrados). Los cerdos en el grupo castrado fueron sometidos a un procedimiento de orquiectomía en su séptimo dúa de vida. El grupo de

Caldara - Performance and plasma urea nitrogen of immunocastrated pigs nutritional requirements according to Rostagno et al (13), for entire males during growth and for females in the finishing phase. These recommendations were adopted to ensure that both phases in all categories evaluated would be assisted in their nutritional requirements, thus opting for formulating rations based on the most demanding category in each phase. In the finishing phase were used the dietary recommendations for females, since the animals immunocastrated group after receiving the second dose of vaccine, have lower requirements for entire males. The diets and water were provided ad libitum throughout the trial (Table 1). Table 1. Percentual diet composition and nutritional characteristics for growing and finishing pigs. Ingredients

*Growing(%) **Finishing (%)

Soybean meal 46%

27.60

22.00

Corn

68.50

75.30

Soybean oil

0.50

0.13

NaCl

0.40

0.35

Dicalcium phosphate

1.40

1.00

Limestone

0.71

0.60

L-lysine HCl, 78.5%

0.40

0.25

DL-methionine 98%

0.10

0.05

L-threonine 98%

0.14

0.07

Supplement vitamin and mineral

0.25

Metabolizable energy (kcal/kg)

3229

3237

Crude protein (%)

18.4

16.2

Ether extract (%)

3.46

3.25

Crude fiber (%)

2.65

2.47

Calcium (%)

0.70

0.55

Available phosphorus (%)

0.36

0.28

Sodium (%)

0.18

0.16

Chlorine (%)

0.29

0.26

Digestible Lysine (%)

1.14

0.83

Digestible Methionine (%)

0.35

0.26

Methionine + Cystine (%)

0.62

0.52

Digestible Threonine (%)

0.74

0.56

Digestible Tryptophan (%)

0.20

0.16

Nutritional calculated values

*recomendation for entire males of high genetic potential and mean performance (average values for animals 30-70 kg); **recommendation for females of high genetic potential and mean performance (average values for animals 70-100 kg), according to Rostagno et al (13). Vitamin and mineral supplement provide per kg: Folic acid – 167.0 mg; Vit. A – 2.330.000 UI; B.H.T.- 32.700 mg; Selenium) – 66.7 mg; Choline – 43.300 mg; Pantothenic acid – 2.667 mg; Nicotinic acid – 5.567 mg; Vit. B12 – 66.700 mcg; Vit. B6 - 667 mg; Vit. B2- 1000 mg; Vit. B1 - 234 mg; Vit. K3 - 667 mg; Vit. E - 5000 IU; Vit. D3 – 833,000 IU; Biotine - 25 mg; Co - 500 mg; Cu – 87,500 mg; Zn – 50.000 mg; Fe- 50.000 mg; Mn – 20.000 mg; I - 750 mg

Evaluation parameters. The animals of the all experimental treatments were weighed four times, at the beginning of the trial, at the first immunocastration vaccine dose, at the second immunocastration vaccine dose, and at the day to the slaughter. The diets provided and feed remainder were weighed weekly to evaluate the performance, which was measured as the

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animales inmunocastrados fueron sometidos a dos dosis de Vivax®, que es una vacuna con base en un análogo sintético de GnRH acoplado a una proteína portadora grande. Se aplicó subcutáneamente en dos dosis: la primera a 60 días antes de la matanza (80 días de edad) y la segunda a 30 días antes de la matanza (110 días de edad). Manejo nutricional y periodo experimental. El periodo del estudio fue de 70 días divididos en dos fases: de crecimiento (desde los 70 a los 100 días) y de finalización (desde los 111 a los 140 días). Las dietas experimentales a base de maíz y harina de soya fueron formuladas utilizando requerimientos nutricionales conforme a Rostango et al (13) en todos los machos durante el crecimiento y en las hembras en la fase de finalización. Las anteriores recomendaciones se adoptaron para garantizar que ambas fases de todas las categorías estuvieran asistidas en términos de requisitos nutricionales, para así optar por formular las raciones con base en la categoría más exigente de cada fase. En la fase de finalización se utilizaron las recomendaciones dietéticas para las hembras, ya que los animales del grupo inmunocastrado tienen menores requerimientos que el resto del grupo de machos después de recibir la segunda dosis de la vacuna. Las dietas y el agua se suministraron ad libitum a lo largo del estudio (Tabla 1). Parámetros de evaluación. Los animales de todos los tratamientos experimentales se pesaron cuatro veces, al inicio del estudio, en el momento de la primera dosis de vacuna de inmunocastración, en el momento de la segunda dosis de vacuna de inmunocastración y en el día de la matanza. Las dietas suministradas y el sobrante de los alimentos se pesaron semanalmente para evaluar el rendimiento, que se midió como el aumento de peso diario, al igual que la ingesta diaria de alimentos y la conversión de alimentos en cada etapa. Se tomaron muestras de sangre por venopunción en tubos heparinizados en el mismo día en que se pesaron los animales. Antes de tomar las muestras, los lechones fueron puestos en ayunas desde las 18:00 h a las 07:00 h hasta el siguiente día. Desde las 07:00 h hasta las 08:00 h, los animales fueron alimentados ad libitum y volvieron a ser puestos en ayunas desde las 08:00 h hasta las 13:00 h, momento en el cual se realizó la toma de muestras de sangre. La sangre se centrifugó a 3000 rpm durante 15 min para obtener el plasma, que fue trasladado a tubos Eppendorf

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daily weight gain, daily feed intake and feed conversation rate at each stage. Blood samples were taken in heparinized tubes, by the vein puncture on the same day of animal weighing. Before collection, piglets were fasted from 18:00 h to 07:00 h in the following day. From 07:00 h to 08:00 h, the animals were fed ad libitum and returned to fast from 08:00 h until 13:00 h, when it was started the blood sampling. The blood was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes to get the plasma, which was transferred to Eppendorf tubes (± 1.5 ml) and stored in a freezer (-18°C). The concentration of plasma urea nitrogen (PUN) was obtained using the enzymatic method (commercial kit). Statistical analysis. The results were analyzed using the SAS 9.2 software (14). ANOVA was applied to mean values using the general linear model (GLM). The means were compared by Tukey test considering a 5% level of significance. Ethical considerations. This investigation was conducted according to the guidelines established by the Ethical Committee on the Animal Use in Experimentation of the Universidade Federal da Grande Dourados (Brazil), under Protocol N o031/2013, in accordance with the ethical principles for animal experimentation, animal care and use.

RESULTS No differences were found (p>0.05) for Plasma Urea Nitrogen (PUN) in the first two samplings (at the beginning of the trial and just before immunocastrated animals receive the first dose of vaccine) amongst the three animal groups. However, for females and castrated males there was an increase in PUN after the second sampling. This might indicate a reduction in the efficiency of protein utilization from this stage, while, for immunocastrated males there was an increase in PUN which occurred only after the third sampling, after immunocastration vaccine second shot. This may indicate advantage in the utilization of dietary protein by this animal category in this period, between the first and second dose of vaccine (Table 2). No difference (p>0.05) was found in PUN results in 4th sampling between groups. This might indicate that the effect of vaccine second dose, in which immunocastrated animals begin to behave physiologically as castrated animal, may lead to the ability of retaining nitrogen and protein deposition in muscle similar to boars.

(±1.5 ml) y almacenado en un congelador (-18°C). La concentración de nitrógeno ureico en plasma (PUN por su sigla en inglés) se obtuvo usando el método enzimático (kit comercial). Análisis estadístico. Los resultados se analizaron utilizando el software SAS 9.2 (14). Se aplicó ANOVA a los valores medios utilizando el modelo lineal general (MLG). Las medias fueron comparadas aplicando la prueba de Turkey considerando un nivel de significancia del 5%. Consideraciones éticas. Esta investigación se realizó conforme a los lineamientos del Comité Ético sobre el Uso de Animales de la Universidade Federal da Grande Dourados (Brasil), bajo el protocolo N o 031/2013, de acuerdo a los principios éticos de experimentación, cuidado y uso de animales.

RESULTADOS No se encontraron diferencias (p>0.05) en el nitrógeno ureico en plasma (PUN) en las primeras dos muestras (al inicio del estudio y justo antes de que los animales inmunocastrados recibieran la primera dosis de la vacuna) entre los tres grupos de animales. Sin embargo, en hembras y en machos castrados hubo un aumento en el PUN después de la secunda muestra. Esto puede indicar una reducción en la eficiencia del uso de proteínas en esta etapa, mientras que en los machos inmunocastrados se vio un aumento en el PUN que ocurrió únicamente después de la tercera muestra, después de la segunda dosis de la vacuna de inmunocastración. Lo anterior puede indicar que existe una ventaja en la utilización de la proteína en la dieta por esta categoría de animales y en este periodo, entre la primera y la segunda dosis de la vacuna (Tabla 2).

Table 2. Plasma urea nitrogen (PUN) concentration (mg/dL) of pigs: castrated males, females and immunocastrated males in different periods of blood collection. Treatment Sampling 1 Sampling 2 Sampling 3 Sampling 4 Castrated

34.23ab

26.97b

41.25a

Females

39.81

28.63

42.79

Immunocastrated

33.68ab

25.24b

27.22b

a A

CV (%)

37.59ab

17.87

36.00

20,63

44.03a

24.30

Means followed by lowercase letters in line and uppercase letters in columns differ by Tukey test at 5% probability (p<0.05). Sampling 1: beginning of the experiment; Sampling 2: immediately before immunocastrated animals group receive the vaccine 1st dose; Sampling 3: immediately before immunocastrated animals group receive vaccine 2nd dose; Sampling 4: end of the experiment

Caldara - Performance and plasma urea nitrogen of immunocastrated pigs No difference (p>0.05) was found in average daily weight gain between immunocastrated males and other groups in all evaluated periods. Castrated males and females differed only in period 2 (80 to 110 days old), (Table 3). Table 3. Daily weight gain (DWG), daily feed intake (DFI) and feed conversion rate (FC) in pigs: castrated males, immunocastrated males and females. Variable DWG (kg)

DFI(kg)

Period

Castrated

Female

Immunocastrated

CV%

0.748a

0.703a

0.709a

12.71

0.976

0.890

0.907

1.004a

0.969a

1.007a

6.88 17.53

Total

0.955

0.897

0.922

1.737a

1.536b

1.321c

1.35

2.832a

2.522b

2.362c

0.07 0.05

4.152

3.850

3.771

Total

3.241a

2.950b

2.817b

2.301a

2.147ab

1.895b

12.28

2.902a

2.842ab

2.618b

7.35

4.151

4.001

3.570

12.18

Total

3.351b

3.239ab

2.923a

Means followed by different letters in line differ statistically from each other by Tukey test (p>0.05). Period 1 - before the immunocastration vaccine shot 1st dose (70-80 days old); Period 2 - between the 1st and 2nd vaccine dose application (80-110 days old); Period 3 - after the immunocastration shot vaccine 2nd dose (110-140 days old)

Immunocastrated males showed lower feed intake than females and these, on the other hand, presented lower intake than castrated males in the first and second periods. In the third period, immunocastrated animals present feed intake similar to females, and lower than it was in the castrated group. In the first and second periods, the immunocastrated males present feed conversion similar to females, and better than it was in the castrated group. After the second dose of the vaccine (period 3), the feed conversion was similar between treatments.

DISCUSSION The reduction of PUN concentration reflects the superior nitrogen use efficiency and can be used to estimate the quantity and quality of dietary protein (15) and its increase may indicate inefficient use of amino acids (16). Since the diets were formulated to comply with the boars’ requirements for growing pigs and for females in the finishing phase (13), the greatest potential for utilization of amino acids dietary by

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No se encontró ninguna diferencia (p>0.05) en el promedio diario de aumento de peso entre los machos inmunocastrados y los otros grupos en ninguno de los periodos evaluados. Los machos castrados y las hembras sólo mostraron diferencias en el periodo 2 (de 80 a 110 días de edad) (Tabla 3). Los machos inmunocastrados mostraron una menor ingesta de alimentos que las hembras y éstas, por otro lado, presentaron una ingesta menor a la de los machos castrados en el primer y segundo periodo. En el tercer periodo, los animales inmunocastrados presentaron una ingesta de alimentos similar a la de las hembras, a su vez menor a la ingesta del grupo castrado. En el primer y segundo periodo, los machos inmunocastrados presentaron una conversión de alimentos similar a la de las hembras, que a su vez fue mejor a la del grupo castrado. Después de la segunda dosis de vacuna (periodo 3), la conversión de alimentos fue similar entre los tratamientos.

DISCUSIÓN La reducción en la concentración de PUN refleja una eficiencia de uso del nitrógeno superior y puede ser utilizada para estimar la cantidad y la calidad de proteína en la dieta (15) y su aumento puede indicar un uso ineficiente de los aminoácidos (16). Dado que las dietas se formularon para cumplir con los requerimientos de los verracos, los cerdos en crecimiento y las hembras en la fase de finalización (13), se hace evidente el mayor potencial para la utilización dietética de los aminoácidos por parte de los machos inmunocastrados después de recibir la segunda dosis de la vacuna. Esta diferencia se traduce en el aumento de sus requerimientos nutricionales, ya que los valores de PUN en los animales castrados y las hembras en la primera fase indican que dichos animales no pudieron mantener el nitrógeno en la misma medida que los animales inmunocastrados. La maximización en la utilización eficiente de los aminoácidos es de importancia considerable para los productores porcinos, ya que la provisión de aminoácidos es uno de los puntos más relevantes para el costo final del alimento. La concentración de nitrógeno ureico en plasma puede ser utilizada para evaluar la calidad de la proteína consumida y puede ser utilizada como un indicador de la máxima utilización de aminoácidos (16).

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immunocastrated males, after receiving the second dose of vaccine, becomes clear. This difference translates their increased nutritional requirement, since increased PUN values for castrated and females in the first phase indicate that these animals were not able to maintain nitrogen in the same proportion that immunocastrated animals. The maximization of amino acids efficient utilization has considerable importance for swine producer because the amino acids supply is one of the most relevant items on the final cost of feed. The concentration of urea nitrogen in plasma can be used to evaluate the quality of protein consumed and may be used as an indicator of maximum amino acids utilization (16). In this way, concentration of PUN is particularly useful in comparing the protein utilization effective for different swine’s groups (females and castrated males immunocastrated males). Disagreeing from the present study other researchers have demonstrated positive effects on daily weight gain and immunocastrated males showed superior performance about 8.3% and 32% (8,17) respectively compared to castrated males. The superior performance of immunocastrated males in relation to castrated males, in the delayed finishing phase, can be considered an indicative of nutrient requirements for these different groups. Both studies used animals with superior genetic potential while in the present study the animals were from medium genetic potential. These results suggest that the benefits of immunocastration may not be extended in the same proportion to the low genetic potential animals for both weight gain and lean meat deposition in the carcass. Comparing the effects on the pigs’ performance, Santos et al (17) found that immunocastrated swine showed better feed-conversion than castrated males. Immunocastrated animals were more effective in the nutrients use than barrows, even after the second immunization dose, similar to the response observed by other authors (12). The authors refer these results to the temporary existence of residual effect of endogenous anabolic hormones in immunocastrated pigs. Castrated male pigs have higher feed consumption than the entire males (18), whose response has been related to low testosterone concentration in these animals (8). Furthermore, it has been observed an increase in daily amount of feed ingested by immunocastrated males when compared to castrated animals after the second dose of immunocastration vaccine (19). This fact may be related to the sharp decline in testosterone levels in immunocastrated pigs.

De esta manera, la concentración de PUN es particularmente útil para comparar la utilización de proteínas efectiva en los distintos grupos porcinos (hembras, machos castrados y machos inmunocastrados). Discrepando del presente estudio, otros investigadores han demostrados efectos positivos en el aumento de peso diario, y los machos inmunocastrados mostraron un rendimiento superior al de los machos castrados, 8.3% y 32% (8,17) respectivamente. El rendimiento superior de los machos inmunocastrados en comparación con los machos castrados, en la parte tardía de la fase de finalización, se puede considerar como un indicador de los requerimientos de nutrientes de los distintos grupos. Ambos estudios usaron animales con un potencial genético superior, mientras que en el presente estudio los animales poseían un potencial genético medio. Estos resultados sugieren que los beneficios de la inmunocastración pueden no extenderse en la misma proporción en los animales con potencial genético bajo, tanto en el aumento de peso como en la deposición de carne magra en la canal. Comparando los efectos sobre el rendimiento de los cerdos, Santos et al (17) encontró que los porcinos inmunocastrados demostraron una mejor tasa de conversión de alimentos que los machos castrados. Los animales inmunocastrados fueron más eficientes en el uso de nutrientes que los cerdos castrados, incluso después de la segunda dosis de inmunización, respuesta similar a la observada por otros autores (12). Los autores atribuyen estos resultados a la existencia temporal de un efecto residual de hormonas anabólicas endógenas presente en los cerdos inmunocastrados. Los cerdos machos castrados tienen un mayor consumo de alimentos que todos los machos (18), cuya respuesta se ha correlacionado con una baja concentración de testosterona en estos animales (8). Además, se ha observado un aumento en la cantidad diaria de alimentos ingerida por los machos inmunocastrados en comparación con los animales castrados después de la segunda dosis de la vacuna de inmunocastración (19). Este hecho puede estar relacionado a la vertiginosa disminución en los niveles de testosterona observada en los cerdos inmunocastrados. Sin embargo, esta respuesta no se observó en el presente estudio, lo cual coincide con los resultados que obtuvo Janos et al (20). En un estudio de machos sometidos a inmunocastración, los investigadores encontraron que en el momento de la segunda dosis de

Caldara - Performance and plasma urea nitrogen of immunocastrated pigs However, this response was not observed in the present study, agreeing with the result obtained by Jaros et al (20). In a study involving males undergoing to the immunocastration, the reserachers found that at the time of the second dose of immunogenic vaccine, 85% of treated males had a serum testosterone level above 2 nM. Two weeks after the second vaccination, only 6% of the animals had testosterone concentrations above 2 nM, which did not differ from castrated males. This may explain the results of the present study, in which immunocastrated animals showed similar performance than females and higher than castrated males in the period before the second dose of vaccine, becoming physiologically as a castrated animal after the second immunization (8). Researchers (10) compared the growth performance and carcass characteristics of castrated males, immunocastrated males and boars. The authors found for immunocastrated animals that the feed intake and feed conversion values are similar to the reported for boars, but lower than those found in castrated males. This may indicate that there is better efficiency in nutrients utilization and higher daily weight gain in boars than in castrated males, found especially during the late finishing phase.

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la vacuna de inmunocastración, 85% de los machos tratados tenían un nivel de testosterona en suero de 2 nM. Dos semanas después de la segunda vacuna, sólo el 6% de los animales tuvieron concentraciones de testosterona superiores a 2 nM, nivel que no fue distinto al de los machos castrados. Esto podría explicar los resultados de este estudio, en el cual los animales inmunocastrados mostraron un rendimiento similar al de las hembras y superior al de los machos castrados antes de la segunda dosis de la vacuna, tornándose fisiológicamente como animales castrados después de la segunda inmunización (8). Algunos investigadores (10) compararon el rendimiento en el crecimiento y las características de la canal de machos castrados, machos inmunocastrados y verracos. Los autores encontraron que en los animales inmunocastrados los valores de ingesta de alimentos y los de conversión de alimentos son similares a los encontrados en verracos, pero menores a los encontrados en machos castrados. Esto podría indicar que hay una mayor eficiencia en la utilización de nutrientes y un mayor aumento de peso diario en verracos que en machos castrados, lo cual se observó particularmente en la fase de finalización.

Immunocastrated males presented lower plasma urea nitrogen concentrations in relation to females and castrated males, before to the second dose of the vaccine. The best utilization of dietary protein resulted in a performance benefits, with a reduction in the feed intake and the feed conversion, even for animals of low to medium genetic potential.

Los machos inmunocastrados presentan menores concentraciones de nitrógeno ureico en plasma en relación con las hembras y los machos castrados, antes de la segunda dosis de la vacuna. La mejor utilización de la proteína alimentaria presenta beneficios, con una reducción en la ingesta de alimentos y la conversión de alimentos, incluso en animales de potencial genético de bajo a medio.

Acknowledgments

Agradecimientos

FUNDECT - Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul, for the financial support to conduct the research.

FUNDECT - Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul, por el apoyo financiero brindado para realizar la investigación.

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Rev.MVZ Córdoba 20(2):4581-4590, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Reference values of parathyroid hormone and vitamin D Hormone by chemiluminescent automated assay Valores de referencia de hormona paratiroidea y vitamina D por método quimioluminiscente automatizado en perros Beatriz Martiarena,1* Esp, Nadia Kogovsek,5 Bioq, Helena Salerni,5 Esp, Víctor Castillo,2 Ph.D, Georgina Brandi,3 MV, Mariela Regonat,1 MV, Andrea Visintini,1 Esp, Héctor Quintana,4 MV, P Otero,5 Bioq. Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Veterinarias, Cátedra de Clínica Médica de Pequeños Animales y Hospital Escuela de Medicina Veterinaria, 1Servicios de Nefrología, 2Endocrinología y 3 Laboratorio, 4Nutrición. Av. Chorroarrín 280, Ciudad Autónoma de Buenos Aires (CP1427) (C.A.B.A.), Argentina. 5Hospital General de Agudos “Carlos G.Durand” Servicio de Endocrinología, Av. Diaz Velez 5044 (CP 1405DCS) C.A.B.A. *Correspondencia: bmartiar@fvet.uba.ar Received: July 2014; Accepted: January 2015.

ABSTRACT Objective. Provide reference data for parathyroid hormone 1-84 (PTH 1-84) and 25OH Vitamin D (25OH D) using a new technique. Materials and methods. The hormones were evaluated, in serum, using a third generation automated chemiluminescent method for PTH in a group of 60 adult dogs, clinically healthy, grouped according to age in years in GA: 1 to 5, GB: 6 to 10 and GC:>10. Results. Data expressed as average ± DS were for PTH (pg/ml): 9.3±2.3; 12±6.3; 12.2±3.7; and for 25OH D (ng/ml): 84.2±27.8; 68.2±16.0; 63.6±23.1, respectively. The PTH value was significantly greater (p<0.05) in groups B and C in comparison with A, but no significant differences were observed between GB and GC. The 25OH D concentration was significantly less in GB (p<0.05) and in GC (p<0.01) in comparison with GA, showing no differences between GB and GC. A negative correlation between 25OH D and PTH was found (r= -0.28; p=0.015). Conclusions. Data contributed by this study provide reference values for PTH 1-84 and 25OH D, evaluated using a third generation automated chemiluminescent method for PTH in local dogs. The results will facilitate monitoring diseases that alter the metabolism of calcium and phosphorus in dogs. Key Words: Calcium, phosphorus, parathyroid hormone, metabolism, vitamin D (Source: MeSH).

RESUMEN Objetivo. Aportar datos de referencia, para hormona paratiroidea 1-84 (PTH 1-84) y 25OH Vitamina D (25OH D) con una nueva técnica. Materiales y métodos. Las hormonas fueron valoradas, en suero, por un método quimioluminiscente automatizado, y de tercera generación para la PTH, en una población de 60 perros adultos clínicamente sanos, agrupados según edad en años en GA: 1 a 5, GB: 6 a 10 y GC:>10. Resultados. Los datos expresados como media ± DS fueron para la PTH (pg/ml): 9.3±2.3; 12±6.3; 12.2±3.7; y para la 25OH D (ng/ml): 84.2±27.8; 68.2±16.0; 63.6±23.1, respectivamente. El valor de PTH fue significativamente mayor (p<0.05) en los grupos B y C con respecto al A, pero no se observó diferencia significativa entre GB y GC. La concentración de 25OH D fue significativamente menor 4581

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en el GB (p<0.05) y en el GC (p<0.01) con respecto al GA, sin haber diferencias entre los GB y GC. Se encontró una correlación negativa entre 25OH D y PTH (r= -0.28; p=0.015). Conclusiones. Los datos aportados en este trabajo permiten disponer de valores de referencia de PTH 1-84 y de 25OH D, valorados por un método quimioluminiscente automatizado y de tercera generación para la PTH, en una población local de perros. Los resultados facilitarán el seguimiento de enfermedades que alteran el metabolismo del calcio y fósforo en perros. Palabras clave: Calcio, fósforo, hormona paratiroidea, metabolismo, vitamina D (Fuente: MeSH).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The parathyroid hormone (PTH) is the one that controls the concentration of ionic calcium (iCa) in blood and extracellular liquid. Binding to membrane receptors on bone and kidney, it triggers a response that increases iCa; also, it stimulates the renal synthesis of 1.25 (OH)2D3 (Calcitriol), the active form of Vitamin D. This acts through the specific receptors for Vitamin D (VDR) in the intestines; increasing the absorption of dietary calcium in bones and kidneys to induce the flow of calcium towards the blood.

La hormona paratiroidea (PTH) es la encargada de controlar la concentración de calcio iónico (Cai) en sangre y líquido extracelular. Su unión a receptores de membrana, en el hueso y el riñón, desencadena una respuesta que aumenta el Cai; también, estimula la síntesis renal de 1.25 (OH)2D3 (Calcitriol), la forma activa de vitamina D. Ésta actúa, a través de receptores específicos para vitamina D (VDR), en el intestino; aumentando la absorción del calcio dietario, y en el hueso y los riñones para inducir el flujo de calcio hacia la sangre. El consiguiente aumento del calcio sérico y de la 1.25 (OH)2D3 ejercen un control negativo en la síntesis y secreción de PTH en las células paratiroideas. El aumento del fósforo en sangre produce importantes incrementos en la secreción de PTH (1,2).

The resulting increased serum calcium and 1.25 (OH)2D3 exert a negative control on PTH synthesis and secretion in parathyroid cells. The increased blood phosphorus produces significant increases in the secretion of PTH (1,2). Dogs ineffectively photosynthesize Vitamin D through their skin, so that concentration depends on dietary intake and absorption through the intestines. Transported to the liver, it becomes 25-hydroxyvitamin D (25OH D or Calcidiol), to be later hydroxylated in the renal proximal tubule to calcitriol via stimulation by PTH (2.3). PTH is a peptide molecule with 84 amino acids, synthesized in cells of the parathyroid gland as a precursor of 115 amino acids called pre-proPTH. The pre and pro sequences are unfolded and degraded during their transit through the cisterns of the endoplasmic reticulum, and the hormone is stored in two types of secretory vesicles: some contain the intact molecule with 84 amino acids (PTH 1-84) which it is the biologically active form, and the others contain proteases that degrade the molecule generating different carboxyl-terminal fragments (PTH Ct) (5,6). According to the extracellular concentration of iCa, parathyroid cells can secrete both PTH 1-84 and PTH Ct. iCa levels in the extracellular fluid are maintained within normal limits by a sensor calcium receptor (Ca-SR) coupled to a G protein located in the membrane of parathyroid cells. Low concentrations of extracellular iCa stimulate the secretion of PTH 1-84, and high levels of iCa activate Ca-SR which initiates an intracellular signaling cascade that culminates in the inhibition of biologically active PTH secretion

Los perros fotosintetizan en forma ineficaz la vitamina D en su piel, por lo que su concentración depende de su ingesta en la dieta y su absorción por el intestino. Transportada hasta el hígado se transforma en 25-hidroxivitamina D (25OH D o Calcidiol), para luego ser hidroxilada en el túbulo proximal renal a calcitriol, vía estimulación por la PTH (2,3). La PTH es una molécula peptídica de 84 aminoácidos, sintetizada en las células de la glándula paratiroides como un precursor de 115 aminoácidos llamado pre-pro-PTH. Las secuencias pre y pro son desdobladas y degradadas, durante su tránsito a través de las cisternas del retículo endoplásmico, y la hormona es almacenada en dos tipos de vesículas secretorias: unas contienen la molécula intacta con sus 84 aminoácidos (PTH 1-84), que es la forma biológicamente activa, y las otras contienen proteasas que degradan la molécula generando distintos fragmentos carboxiterminales (PTH Ct) (5,6). De acuerdo con la concentración extracelulares de Cai, las células paratiroideas son capaces de secretar tanto PTH 1-84 como PTH Ct. Los niveles de Cai en el líquido extracelular se mantienen dentro de la normalidad gracias a un receptor sensor de calcio (CaSR) acoplado a una proteína G localizada en la membrana de las células paratiroideas. Baja

Martiarena - Reference values of parathyroid hormone and vitamin D and increases PTH proteolysis. Accordingly, by increasing the concentration of extracellular iCa, the proportion of PTH Ct fragments secreted are increased (2,3-5). While it was believed that these fragments had no biological activity, it has been demonstrated in humans and animals that some PTH Ct fragments have an opposite effect on blood concentration of iCa (5-7). PTH in plasma circulates at very low concentrations and the presence of circulating peptide fragments makes it difficult to measure. This situation presents a wide variability between methods of measurement. The first generation of PTH analysis was done with radioimmunoassay, and the few sensitive and specific studies measured both the intact form and their fragments. Second generation immunoassays, called intact PTH analysis, have a system of two antibodies, one specifically for the carboxyl terminal portion and one for the amino terminal portion of the molecule. Initially it was believed that these methods only detected PTH 1-84. However, later studies showed that there are circulating PTH fragments which, being degraded in the amino terminal portion of the molecule, do not possess amino acids 1-7 that are responsible for the biological activity of the hormone. This PTH 7-84 molecule and other long PTH Ct fragments can be detected by some second generation immunoassay with different specificity. This produces a great variation in the results obtained using different methodologies, especially in samples of patients with kidney disease, which have higher proportion of serum PTH Ct due to decreased renal clearance (1,2,5,7). In recent years third generation immunoassays were developed that are more specific, and they do not detect PTH 7-84 fragments since the antibodies used in their design are directed against amino acids 1-7 of the molecule, so they confer less variability in measuring biologically active PTH (1,2,5-7). There are no previous reports of reference values in dogs with automated chemiluminescent method for 25OH D and PTH, and the latter with new third generation technology. The aim of this study was to measure both hormones in a population of clinically healthy adult dogs to obtain reference values.

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concentración de Cai extracelular estimulan la secreción de PTH 1-84; en cambio altos niveles de Cai activan el CaSR lo cual inicia una cascada de señalización intracelular que culmina con la inhibición de secreción de PTH biológicamente activa y aumento de proteólisis de PTH. En consecuencia, al aumentar la concentración de Cai extracelular aumenta la proporción de fragmentos PTH Ct secretados (2,3-5). Si bien se creía que estos fragmentos no tenían actividad biológica, se ha demostrado en humanos y animales que algunos fragmentos de PTH Ct tienen un efecto opuesto sobre la concentración de Cai en sangre (5-7). En el plasma la PTH circula en concentraciones muy bajas y la presencia de fragmentos peptídicos circulantes dificulta su medición. Dicha situación plantea una amplia variabilidad entre los métodos de medición. La primera generación de análisis de PTH fueron por radioinmunoensayos, estudios pocos sensibles y específicos, medían tanto la forma intacta como sus fragmentos. Los inmunoensayos de segunda generación, llamados análisis de PTH Intacta, poseen un sistema de dos anticuerpos, uno específico para la porción carboxi terminal y otro para la porción amino terminal de la molécula. Inicialmente se creía que estos métodos detectaban únicamente la PTH 1-84. Sin embargo, estudios posteriores demostraron que existen en circulación fragmentos de PTH que, al estar degradados en la porción aminoterminal de la molécula, no poseen los aminoácidos 1-7 responsables de la actividad biológica de la hormona. Esta molécula PTH 7-84 y otros fragmentos PTH Ct largos pueden ser detectados por algunos inmunoensayos de segunda generación con diferente especificidad. Esto produce una gran variación en los resultados obtenidos con distintas metodologías, especialmente en las muestras de los pacientes con enfermedad renal, que tienen mayor proporción de PTH Ct en suero, debido a la disminución de su depuración renal (1,2,5,7).

MATERIALS AND METHODS

En los últimos años se desarrollaron inmunoensayos de tercera generación, más específicos, que no detectan los fragmentos de PTH 7-84 ya que los anticuerpos utilizados en el diseño de los mismos están dirigidos contra los aminoácidos 1-7 de la molécula, por lo que confieren menor variabilidad en la medición de PTH biológicamente activa (1,2,5-7).

Study population. Sixty clinically healthy dogs were studied, both sexes, older than one year, between 5 and 50 kg of weight. The animals

No se han encontrado publicaciones previas de valores de referencia en perros con método quimioluminiscente automatizado, para 25OH

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came from the city and province of Buenos Aires (latitude: 34º30’S, longitude: 58º26’W, altitude: 25 m.a.s.l.), they lived in spacious kennels with access to a yard and garden. The geoclimatic condition at the time the study was during the month of August (austral winter). The average amount of daily sunlight was 10 h 25 min, with an average of 10 h 04 min, an average heliophany of 4.2 h/day and average temperature 12.0±0.8ºC (source: National Meteorological Service of Argentina). They were fed commercial feed with an adequate intake of calcium and phosphorus for their age and body condition. Experimental design Selecting clinically health animals. The criteria used were the absence of clinical signs, normal physical examination, and the evaluation of urine, blood count and serum biochemistry within the laboratory references. Formation of study groups. They were divided into three groups according to age range in years: Group A (GA): 1-5, Group B (GB) of 6-10 and group C (GC):> 10. While each was formed of 10 males and 10 females, the data were analyzed without distinction by sex, because a preliminary assessment, at this writing, found no gender differences in age groups. Collection and processing of samples for urine, general and endocrine biochemistry. Blood and urine samples were collected solids, 12 h fasting, in the morning (8 and 10 am). To determine the normality of the animals studied, a full analysis of total urine, protein / creatinine ratio of urine (UP/C), hemogram and serum biochemical measurements (with automated enzymatic colorimetric methods) of: total protein, albumin, urea, creatinine, AP, GPT (ALT) and GOT (AST), total calcium (Ca), inorganic phosphate (Pi) was done. The Ca total value was corrected with the albumin by formula (Ca - Albumin + 3.5). Measuring PTH and Vitamin D. The blood of each dog was centrifuged within 30 minutes of collection, and the serum was stored at - 20ºC until processed. The PTH 1-84 measurement was by third generation chemiluminescence (DiaSorin Liaison) with functional sensibility: 4.0 pg/ml; 100% specificity for PTH 1-84 and 0% crossed reactivity for PTH 7-84 and other fragments; with coefficient variation (CV) intra-essay at 6% and CV inter-essay at 9%. The total 25OH D measurement was also done by chemiluminescence (DiaSorin Liaison) with a functional sensibility of 4.0 ng/ml, 100% specificity for 25-OH Vitamin D2 and 25-OH

D y PTH y esta última con una nueva técnica de tercera generación. El objetivo del presente trabajo fue medir ambas hormonas en una población de perros adultos clínicamente sanos para obtener valores de referencia.

MATERIALES Y MÉTODOS Población de estudio. Se estudiaron 60 perros clínicamente sanos, de ambos sexos, mayores a 1 año, que tenían entre 5 y 50 kg de peso. Los animales procedieron de la ciudad y provincia de Buenos Aires (latitud: 34º30’S, longitud: 58º26’W, altitud: 25 m.a.s.l.), vivían en caniles amplios con acceso a patio y jardín. La condición geoclimática en el momento de realizar el estudio fue durante el mes de agosto (invierno austral). La cantidad promedio de horas luz (solar) fue de 10 h 25 min, con promedio de 10 h 04 min, una media de heliofanía efectiva de 4.2 h/día y temperatura media 12.0±0.8ºC (fuente: Servicio Meteorológico Nacional Argentina). Se alimentaron con balanceado comercial con un aporte de calcio y fósforo adecuado según edad y condición corporal. Diseño Experimental Selección de animales clínicamente sanos. Los criterios que se utilizaron fueron la ausencia de signos clínicos, examen físico sin alteración, y evaluación de orina, hemograma y bioquímica sérica dentro de los intervalos de referencia del laboratorio. Formación de grupos de estudio. Se los dividió en tres grupos según rango etario, en años: Grupo A (GA): de 1-5, grupo B (GB): de 6 a 10 y grupo C (GC): > 10. Si bien cada uno fue conformado por 10 machos y 10 hembras, los datos se analizaron sin distinción por sexo, debido a que una evaluación preliminar, al presente escrito, no halló diferencias por género en los grupos etarios. Obtención y procesamiento de las muestras para: orina, bioquímica general y endócrina. Se recolectaron muestras de sangre y orina, en ayuno de sólidos de 12 h, durante la mañana (8 y 10 am). Para determinar la normalidad de los animales estudiados se realizó análisis de orina completa, relación proteína/creatinina en orina (UP/C), hemograma y mediciones bioquímicas en suero (por métodos enzimáticos colorimétricos automatizados) de: proteínas totales, albúmina, urea, creatinina, FAS, GPT (ALT) y GOT (AST), Calcio total (Ca), fósforo inorgánico(Pi). El valor de Ca total fue corregido con el de la albúmina mediante la fórmula (Ca – Albúmina + 3.5).

Martiarena - Reference values of parathyroid hormone and vitamin D Vitamin D3 and 1.3% crossed reactivity with 3-epi 25-OH Vitamin D3; CV intra-essay at 3.9% and CV inter-essay at 9.8%. P r o c e s s i n g s i t e . S a m p l e s f o r g e n e ra l biochemistry were processed at the Teaching Hospital Laboratory, Faculty of Veterinary Medicine, University of Buenos Aires. The hormone measurement was performed at the Laboratory of the Endocrinology Division of the Hospital General de Agudos Carlos G. Durand. Ethic approval. The Committee on Animal Welfare of the Faculty of Veterinary Medicine, UBA, approved the CICUAL N 2013/3 procedure subsidized by UBACyt 2011/2014 V-05. Statistical analysis. The distribution of variables was analyzed with the D’Agostino and Pearson Test. Because PTH and Pi did not show a normal distribution, all variables were normalized transforming them into the logarithmic form, allowing, in this way, using one way ANOVA parametric tests followed by the Bonferroni test for multiple comparison of means to compare the three age groups. The variables were correlated using Pearson’s test. To obtain minimum and maximum values, 3 and 97 percentiles were calculated. The values are expressed in natural form (anti logarithmic) as mean ± DS, and the minimum values (percentile 3) and maximum (Percentile 97). The selected level of meaning was p<0.05.

RESULTS The values obtained for calcium (mg/l) were: median 10.9, with a range between 8.8 and 12, and for phosphorus (mg/dl) median 4.2, with a range between 2.2 and 5.5. They remain within the reference values for the laboratory, and no differences between age groups (p = 0.1 Ca and Pi, p = 0.3) were found.

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Medición de PTH y vitamina D. La sangre de cada perro fue centrifugada, dentro de los 30 minutos de obtenida, y el suero fue almacenado a - 20ºC hasta su procesamiento. La medición de PTH 1-84 fue por quimioluminiscencia de tercera generación (DiaSorin Liaison) con sensibilidad funcional: 4.0 pg/ml; especificidad de 100% para PTH 1-84 y 0% de reactividad cruzada para PTH 7-84 y otros fragmentos; con coeficiente de variación (CV) intra-ensayo de 6% y CV interensayo de 9%. La medición de 25OH D total se realizó, también, por quimioluminiscencia (DiaSorin Liaison), con una sensibilidad funcional de 4.0 ng/ml, especificidad de 100% para 25-OH Vitamina D2 y 25-OH vitamina D3 y 1.3% de reactividad cruzada con 3-epi 25-OH vitamina D3; CV intra-ensayo de 3.9% y CV inter-ensayo de 9.8%. Sitio de procesado. Las muestras para bioquímica general se procesaron en el Laboratorio del Hospital Escuela de la Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Buenos Aires. La medición de las hormonas se realizó en el Laboratorio de la División Endocrinología del Hospital General de Agudos Carlos G. Durand. Aprobación ética. El comité de Bienestar animal de la Facultad de Medicina Veterinaria, UBA, aprobó el procedimiento CICUAL N 2013/3 de subsidio UBACyt 2011/2014 V-05. Análisis estadístico. La distribución de las variables se analizó con el Test de D’Agostino y Pearson. Debido a que la PTH y el Pi no mostraron una distribución normal, todas las variables fueron normalizadas transformándolas a su forma logarítmica, permitiendo, de esta manera, utilizar las pruebas paramétricas ANOVA de una vía, seguido por el test de Bonferroni de múltiple comparación de medias, para comparar los tres

For PTH significant differences between the three groups studied (p=0.04) were found, increasing significantly (p≤0.05) in groups B and C compared to GA. No differences between GB and GC (Figure 1) were found. For 25OH D significant differences were also found between the three groups (p = 0.005). Contrary to what happens with PTH, the concentration of this hormone decreases significantly in GB (p≤0.05) and GC (p≤0.01) compared to GA, with no difference between groups B and C (Figure 1).

Figure 1. Concentration of PTH and 25OH D, in dogs, by the third generation automated chemiluminescent method for PTH according to age groups. An increase in PTH is observed with a decrease in 25OH D in dogs older than 5 years. Group A (GA): 1-5, Group B (GB): 6-10 years and Group C (GC): older than 10 years.

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The 25OH D had a negative and weak correlation with the PTH in a significant way (r= -0.28; p=0.015) (Figure 2).

grupos etarios. Las variables se correlacionaron por medio de la prueba de Pearson. Para obtener valores mínimos y máximos se calcularon los percentiles 3 y 97. Los valores se expresan en su forma natural (anti logarítmica) como media ± DS, y los valores mínimos (percentil 3) y máximos (Percentil 97). El nivel de significación seleccionado fue de p<0.05.

RESULTADOS Los valores obtenidos para el calcio (mg/l) fueron: mediana 10.9, con intervalo entre 8.8 y 12, y para el fósforo (mg/dl) mediana: 4.2, con intervalo entre 2.2 y 5.5. Estando dentro de los valores de referencia para el laboratorio, no se hallaron diferencias entre los grupos etarios (Ca p=0.1 y Pi, p=0.3). Figure 2. Correlation between 25-OH D vs PTH, evaluated by the by the third generation automated chemiluminescent method for PTH, in dogs. As the PTH increases there is a decrease in the 25-OH D.

No correlation was observed between the hormones studied and the concentration of Ca and Pi. PTH and 25OH-D values, expressed as median and minumun-maximun according to the group, are showed in the table 1

Table 1. PTH and 25-OH D values by the third generation automated chemiluminescent method for PTH, in dogs, expressed in mean and interval (values by Percentile 3 and 97 cuts) according to age group. Group A

Group B

Group C

mean

P3–P97

mean

P3 –P97

mean

P3 – P97

PTH (pg/mL)

8.8

5 - 15.3

10.3

5 – 21.2

12.4

6.3 –32.3

25OH D (ng/mL)

75.5

45.3 -143

35.6 - 98

66.7

21.3 - 109

Group A (GA): 1-5, Group B (GB): 6-10 years and Group C (GC): older than 10 years.

DISCUSSION The few publications that evaluate PTH in clinically healthy dogs were performed with different methodologies than those used in this study. Some used IRMA (8.9) and other second-generation chemiluminescence (using a

Para la PTH se hallaron diferencias significativas entre los 3 grupos estudiados (p=0.04), aumentando significativamente (p≤0.05) en los grupos B y C con respecto al GA. No se hallaron diferencias entre el GB y GC (Figura 1). Para la 25OH D, también, se hallaron diferencias significativas entre los tres grupos (p=0.005). Contrariamente a lo que sucede con la PTH, la concentración de esta hormona disminuye significativamente en el GB (p≤0.05) y en el GC (p≤0.01) respecto del GA, sin diferencias entre los grupos B y C (Figura 1). La 25OH D correlacionó negativa y débilmente con la PTH en forma significativa (r= -0.28; p=0.015) (Figura 2). No se observó correlación entre las hormonas estudiadas y la concentración del Ca y Pi. Los valores de PTH y 25OH D, expresados en mediana y valores máximos y mínimos, según grupo etario, se muestran en la tabla 1.

DISCUSIÓN Las escasas las publicaciones que valoran PTH en perros clínicamente sanos se realizaron con diferentes metodologías al presente estudio. Unos fueron mediante IRMA (8,9) y otros por quimioluminiscencia de segunda generación (utilizan un sistema de 2 anticuerpos: uno dirigido contra un epítope en la región Ct y otro contra la región Nt de la molécula (aminoácidos 1-34), mide PTH intacta y fragmentos NO 1-84) (1,8,7,10-12).

Martiarena - Reference values of parathyroid hormone and vitamin D system of two antibodies, one directed against an epitope in the Ct region and another against the Nt region of the molecule (amino acids 1-34), measuring intact PTH and NO fragments 1-84) (1,8,7,10-12). In this study an automated third generation chemiluminescence method was used (Ac directed against the Nt region of PTH, specific for amino acids 1-4 of the molecule, this allows avoiding cross-reactions with PTH peptides that have the same biological activity, particularly PTH 7-84, so only intact PTH values are evaluated) (13). The quality of avoiding interference of the fragments make it of special interest in chronic renal failure, as they accumulate in the blood by decreasing glomerular filtration, since the kidney is responsible for cleansing the urine (2,6,7). A third generation model was used by Machado and Moutinho (14) in dogs, but they concluded that it was not useful to evaluate PTH. Pineda et al (15) were able to measure it in cats with a manual technique, which required 2 successive measurements per sample. The discrepancy in the results reported by other authors and in this study result from intermethod variability that cannot be correctly compared. However, they provide higher maximum values than this study, possibly due to not only measuring active PTH (8-14). The decrease in glomerular filtration that occurs with age decreases urine phosphorus elimination, and consequently it increases in the blood, followed by a decrease in serum calcium. Although both ions are kept within the range of reference serum, this situation stimulates the synthesis and secretion of PTH. This physiological variation explains the slight increase in PTH levels observed in dogs older than 5 years (GB and GC) and agrees with the results found by Aguilera-Tejero et al (8) in a study with another methodology PTH and found in a population of clinically healthy dogs over 10 years.

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En este trabajo se utilizó un método por quimioluminiscencia, automatizado, de tercera generación (el Ac dirigido contra la región Nt de la PTH, es específico para los aminoácidos 1-4 de la molécula, esto le permite evitar reacciones cruzadas con péptidos de PTH que no tienen la misma actividad biológica, especialmente la PTH 7-84, de esta manera sólo valora PTH intacta) (13). La cualidad de evitar la interferencia de los fragmentos la hacen de especial interés en la insuficiencia renal crónica, ya que éstos se acumulan en sangre al disminuir el filtrado glomerular, por ser el riñón el encargado de depurarlos por orina (2,6,7). Un método de tercera generación fue utilizado por Machado y Moutinho (14) en perros, pero concluyeron que no era útil para valorar PTH. Pineda et al (15) lograron medirla en gatos con una técnica manual, que necesita realizar 2 mediciones sucesivas por muestra. La discrepancia en los resultados aportados por otros autores y por el presente trabajo resultan de una variabilidad intermétodo, que no permite compararlos correctamente. Sin embargo, aportan valores máximos más elevados al presente estudio; lo que posiblemente se deba a que no sólo miden PTH activa (8-14). La disminución del filtrado glomerular, que se produce con la edad, disminuye la eliminación del fósforo por orina, y consecuentemente aumenta en sangre seguido de una disminución de la calcemia. Aunque ambos iones se mantienen dentro del intervalo de referencia sérica, dicha situación estimula la síntesis y secreción de PTH. Esta variación fisiológica explicaría el ligero aumento de los valores de PTH que se observa en perros mayores de 5 años (GB y GC) y concuerda con los resultados encontrados por Aguilera-Tejero et al (8) en un estudio realizado con otra metodología de PTH y hallados en una población de perros clínicamente sanos mayores de 10 años.

PTH results obtained in this study are similar to those reported in human medicine with the same method, which also observed higher values in the elderly such as those found in GB and GC (2, 16).

Los resultados de PTH obtenidos en este estudio son similares a los reportados en medicina humana con el mismo método, donde también fueron observados valores más altos en ancianos como los hallados en el GB Y GC (2,16).

The variability in PTH results is related to the clinical condition of the patient (primary and secondary conditions of the parathyroid) and are based on pre-analytical and analytical biological conditioning. The first is inherent in handling samples, considering that circulating PTH concentration varies throughout the day (circadian rhythm, intake of calcium and

La variabilidad en los resultados de la PTH está relacionada con la situación clínica del paciente (afecciones primarias y secundarias de las paratiroides) y en función de condicionamientos biológicos, pre-analíticos y analíticos. Los primeros son inherentes al manejo de la muestra, hay que considerar que la concentración circulante de PTH varía a lo largo del día (ritmo

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phosphorus, etc.) (1,2,5,8,17). To minimize these changes, it is advisable to remove the blood sample at the same time of day and under the same conditions. Also, there are differences in the results of PTH according to the serum, plasma, type of anticoagulant, time and storage method of the sample. Intact PTH concentration decreases starting at 24 h at temperatures of 18-25°C (1,2). Veterinary measurements with a second g e n e ra t i o n m e t h o d w e r e p e r f o r m e d o n plasma (8-10,18). In this study, pre-analytical conditions that guarantee the stability of the sample from blood collection to processing were established, thereby minimizing errors inherent in sample preservation. The level of vitamin D sufficiency is evaluated in human medicine, through 25OH D, with an expected desirable value, at present, greater than 30 ng/ml (reserving 1-25 OH D measurements to exceptional cases), and is considered insufficient between 20 and 29 (commonly found in older adults ≥ 70 years) and poor <19 ng / ml (2.19). A similar situation was observed in our study where values > 30 ng/ml were found in groups A and B, with the lowest value (3rd percentile) below 30 ng/ml for the group C. This finding determined that the lower value in dogs older than 10 years is 20 ng / ml; or three dogs that were within this value could be considered insufficient. The few studies that evaluate vitamin D in dogs found no differences with age (8), although the method of measurement was different to that used in the present work. The lowest concentration of 25OH D observed in elderly humans is explained by skin aging and less exposure to the sun, among other causes (2). This explanation would not be extrapolated to dogs because they ineffectively photosynthesize vitamin D in their skin, so that its concentration depends on dietary intake and absorption through the gut (1820). In any case, our study population had adequate sun exposure. All the dogs ate the same food to avoid variations in intake, which is why intestinal absorption dysfunction would be a possible cause of the differences found between groups. The reduced concentration of 25OH D in older dogs in the study population was reflected by increased PTH to maintain calcium and phosphorus metabolism, since the decline in vitamin D decreases the inhibitory effect on PTH (1,2). In conclusion, the contribution of PTH reference intervals with a third generation method

circadiano, ingesta de calcio y fósforo, etc.) (1,2,5,8,17). Para minimizar dichos cambios es aconsejable extraer la muestra de sangre al paciente en el mismo momento del día y en iguales condiciones. También, existen diferencias en los resultados de PTH de acuerdo a si se utiliza suero, plasma, tipo de anticoagulante, el tiempo y modo de conservación de la muestra. La concentración de PTH intacta disminuye a partir de las 24 h a temperatura de 18-25°C (1,2). Las mediciones en veterinaria con el método de segunda generación fueron realizadas en plasma (8-10,18). En este trabajo se establecieron condiciones preanalíticas que garantizan la estabilidad de la muestra desde la extracción de sangre hasta su procesamiento, minimizando así los errores inherentes a la conservación de la muestra. El nivel de suficiencia de vitamina D es valorado, en medicina humana, a través de la 25OH D, con un valor deseable esperado, en la actualidad, mayor de 30 ng/ml (reservando la medición de 1-25 OH D para casos excepcionales), y se considera insuficiente entre 20 y 29 (hallazgo frecuente en adultos ancianos ≥ 70 años), y deficiente < de 19 ng/ml (2,19). Similar situación fue observada en nuestro estudio donde se encontraron valores > de 30 ng/ml en los grupos A y B, siendo el valor inferior (percentil 3) menor de 30 ng/ml para el grupo C. Dicho hallazgo determinaría que el valor inferior en perros mayores de 10 años sea 20 ng/ml; o los tres perros que se encontraron dentro de este valor podrían ser considerados como insuficientes. Los escasos estudios que valoran la vitamina D en el perro no encontraron diferencias con la edad (8), aunque el método de medición fue diferente al utilizado en el presente trabajo. La menor concentración de 25OH D observada en humanos ancianos se explicaría por envejecimiento de la piel y menor exposición al sol entre otras causas (2). Esta explicación no sería extrapolable al perro, porque ellos fotosintetizan en forma ineficaz la vitamina D en su piel, por lo que su concentración depende de su ingesta en la dieta y su absorción por el intestino (18-20). De todas formas nuestra población de estudio tuvo una exposición solar adecuada. Todos los perros comieron el mismo tipo de alimento para evitar variaciones por la ingesta, motivo por el cual una disfunción en la absorción intestinal sería una posible causa de las diferencias halladas entre grupos. La disminución de la concentración de 25OH D en los perros de mayor edad, en la población de estudio, se vio reflejada con un incremento de la PTH, para mantener el metabolismo fosfocálcico, debido a que el descenso de la vitamina D disminuye el efecto inhibitorio sobre la PTH (1,2).

Martiarena - Reference values of parathyroid hormone and vitamin D and 25OH D in dogs, both by automated chemiluminescent technique, will be used to study diseases that alter calcium and phosphorus metabolism. This is the first report classified by age and where both hormones are correlated. In dogs older than 5 years, it is expected to find values of calcium and phosphorus in normal reference ranges with a physiological increase of PTH to counteract declining 25OH D. Acknowledgment Project CV-05, subsidized by UBACyT 2011/2014.

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En conclusión el aporte de los intervalos de referencia de PTH, con un método de tercera generación y de 25OH D en perros, ambas mediante técnica quimioluminiscente automatizada, servirán para estudiar a las enfermedades que alteran el metabolismo fosfocálcico. Este sería el primer reporte estadificado por edad, y en donde se correlacionan ambas hormonas. En perros mayores de 5 años es de esperar encontrar valores de calcio y de fósforo en intervalos de referencia normales con un incremento fisiológico de PTH para contrarrestar el descenso de 25OH D. Agradecimientos Proyecto CV-05, subsidiado por UBACyT 2011/2014

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Rev.MVZ Córdoba 20(2):4591-4601, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Physiology of acid-base balance in bovines with diarrhea backgrounds from Monteria, Colombia Fisiología del estado ácido-básico en bovinos con antecedentes diarreicos de Montería, Colombia César Betancur H,1* M.Sc, Yordan Martínez A,2 Ph.D, Luis Cruz M,3 Esp. Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Departamento de Ciencias Pecuarias. Montería, Colombia. 2Universidad de Granma, Facultad de Medicina Veterinaria. Centro de Estudios de Producción Animal. Bayamo, Granma. Cuba. 3Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina, Unidad de Fisiología. Bogotá, Colombia. *Correspondencia: betanci@yahoo.com 1

Received: April 2014; Accepted: January 2015.

ABSTRACT Objective. Evaluate the acid-base balance (ABB) in bovines with diarrheic backgrounds in four areas of Montería, Colombia. Materials and methods. From a total of 300 pregnant cows, 60 were selected with their newborns. A direct inspection was performed of vital signs on the calves and the ABB indicators were determined using a gasometric method. Data were processed by means of descriptive statistics and the Duncan test was used to differentiate between the averages. The degree of association was established between the ABB indicators in cows and calves by using the Pearson correlation and a comparison of proportions was performed on the indexes of the newborns. Results. Regarding the cows, the ABB indicators were found within the reference values; however, in the calves the pH, pCO2, HCO3-, the anion gap (AG) and the bases excess (BE) varied. A correlation was found between AG, BE and metabolic hydrogen ions (M*H). The AG in cows and calves showed notable differences (p<0.05) among the farms in the study. According to the numeric classification system, the suction reflect indicated a greater percentage of calves in group one. Conclusions. The ABB analyte measurement in cows was similar to the consulted reference; however, in calves some analytes did not coincide. This suggests metabolic acidosis in newborn calves due to the increase of AG and the decrease of BE. Additionally, its correlation with M*H opens the possibility of new proposals to determine ABB in bovines. Key Words: Metabolic acidosis, anions, diarrhea, metabolic hydrogen ions (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. Evaluar el equilibrio ácido-básico (EAB) en bovinos con antecedentes diarreicos de cuatro zonas de Montería, Colombia. Materiales y métodos. De un total de 300 vacas preñadas se seleccionaron 60 vacas y sus recién nacidos. Se realizó una inspección directa de los signos vitales en terneros y los indicadores del EAB se determinaron mediante técnica gasométrica. Los datos se procesaron mediante estadística descriptiva y para la diferencia entre medias se empleó la prueba de Duncan. El grado de asociación se estableció entre los indicadores del EAB en vacas y terneros mediante la correlación de Pearson y una comparación de proporciones se realizó en los índices del recién nacido. Resultados. En las vacas, los indicadores del EAB se encontraron dentro de los valores 4591

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de referencia; sin embargo, en los terneros varió el pH, pCO2, HCO3-, la brecha aniónica (AG) y el exceso de bases (EB). Se encontró correlación entre AG, EB e hidrogeniones metabólicos (H+M). El AG en vacas y terneros indicó diferencias notables (p<0.05) entre las fincas de estudio. De acuerdo con el sistema de calificación numérica, el signo reflejo de succión indicó el mayor porcentaje de terneros en el grupo uno. Conclusiones. La medición de los analitos del EAB en vacas fue similar a la referencia consultada; sin embargo, en terneros no coincidió con algunos analitos. Se sugiere acidosis metabólica en los terneros recién nacidos por el aumento del AG y descenso del EB, además, su correlación con los H+M abre la posibilidad de nuevas propuestas para la determinación del EAB en bovinos. Palabras clave: Acidosis metabólica, aniones, diarrea, hidrogeniones metabólicos (Fuente: CAB).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Diverse alterations of acid-base balance (ABB) are found in bovines, among which metabolic acidosis is particularly frequent (1). The diarrheic syndrome is the most frequent cause of metabolic acidosis in calves, especially during the neonatal period (first 28 days of life) (2). The cause of neonatal diarrhea is multifactorial; the calves at birth are susceptible to being agammaglobulinemic, and therefore they tend to suffer specific or secondary infections unless they quickly ingest colostrum (3); but beyond the causes of diarrhea, a hydroelectrolytic imbalance develops that generally causes dehydration, acidosis, and frequently death (4).

Diversas alteraciones del estado ácido-base (EAB) son encontradas en bovinos, dentro de las cuales es particularmente frecuente la acidosis metabólica (1). El síndrome diarreico es la causa más frecuente de acidosis metabólica en terneros, en especial durante el período neonatal (primeros 28 días de vida) (2). La causa de diarrea neonatal es multifactorial; los terneros al nacer son susceptibles a ser agammaglobulinémicos, por lo que tienen tendencia a sufrir infecciones específicas o secundarias, a menos que ingieran pronto el calostro (3); pero más allá de las causas de diarrea, se desarrolla un desbalance hidroelectrolítico que por lo general causa deshidratación, acidosis y en muchas ocasiones la muerte (4).

The first physiological model to evaluate ABB was proposed in 1908 by Lawrence Henderson. This author worked on the concept of acid as a donator of protons and hydrogen ions (Arrhenius definition 1890), (5). In 1916, Hasselbalch converted the Henderson equation into a logarithmic expression, which describes this known equation as Henderson-Hasselbalch (HH); where the ABB is obtained from measuring the HCO-3/H2CO3 buffer pair (6). The HH equation has been a valuable tool to help understand the physiology of the acid base balance and is used in the clinical management of ABB disorders in ruminants; this equation explains the pH changes due to the changes in the concentration of HCO-3 and the pressure values of CO2 (pCO2) (7). For many years, the bicarbonate/carbonic acid system has been kept in mind to define the terms acidosis and alkalosis, using the total content of CO2 and bicarbonate as reference points to classify respiratory or metabolic alterations (8). However, the HH equation does not separate the respiratory component from the metabolic one. In 1948, Singer and Hastings (9) proposed the concept of the buffer base (BB) from the concept of the electroneutrality of solutions and

El primer modelo fisiológico para evaluar el EAB fue propuesto en el año de 1908 por Lawrence Henderson. Este autor trabajó en el concepto de ácido como un donador de protones o hidrogeniones (definición de Arrhenius 1890), (5). En 1916, Hasselbalch convirtió la ecuación de Henderson a su expresión logarítmica, lo que describe de esta forma la conocida ecuación de Henderson-Hasselbalch (HH); donde se obtiene el EAB a partir de mediciones del par tampón HCO-3/H2CO3 (6). La ecuación de HH ha sido una herramienta valiosa para ayudar a comprender la fisiología del estado ácido base y se emplea en el manejo clínico de los trastornos del EAB en rumiantes; dicha ecuación explica los cambios en el pH con base en los cambios en la concentración de HCO-3 y los valores de la presión de CO2 (pCO2)(7). Durante muchos años, el sistema de bicarbonato/ ácido carbónico se ha tenido en cuenta para definir los términos acidosis y alcalosis, tomando el contenido total de CO2 y el bicarbonato como los puntos de referencia para clasificar las alteraciones en respiratorias o metabólicas (8). Sin embargo, la ecuación de HH no separa el componente respiratorio del metabólico.

Betancur - Physiology acid-base balance during diarrhea in calves interpreting that anions behaves as acids; thus, in 1960 Anderssen et al (10) introduced the term Excess of Bases (BE) as an independent variable of the pCO2. The BE represents the metabolic component or change of non-volatile acids or bicarbonate, calculated under ideal conditions, that is, with a pCO2 of 40 mmHg; since then the BB and the BE were used to support the diagnosis of the metabolic component (11). The concept of anionic gap or Anion Gap (AG) arose in the 1970s as a way to classify metabolic acidosis and explain its causes (12). The importance of the calculation is that it allows differentiating of metabolic acidosis into two main types: metabolic acidosis with elevated AG or normal AG, caused by a loss of bicarbonate (13). Recently, Cruz et al (14) of the Physiology Unit of the Medical Faculty of the Universidad Nacional of Colombia proposed differentiating hydrogen ions (H+) that generate blood pH in metabolic H+ (M+H) and H+ derived from CO2 (H+-CO2). Due to this, the total hydrogen ions (Htot) are those that are derived from the pH value and that classically corresponds to the antilogarithm of the negative value of pH; then, knowing the slope of the relationship between pH and PCO2, the H+-CO2 (15) are obtained. These latter approaches have been denominated as “semi-quantitative” and have an important place in clinical use, and would be taken as objective information. There are other parameters that are considered to be subjective information; those that could estimate the presence of acidosis in a newborn calf; the hypothesis that arises about the possibility of determining the ABB in a calf in field conditions, without recurring to the determination of blood gases. In the studies consulted, there was not enough information found about assessing ABB during the establishment of enteric syndrome in bovines, and therefore the objective of this study was to determine the ABB in cow blood with diarrheic background, and their respective calves, at four farms in the department of Córdoba, Colombia, to establish if there are differences between those indicators in the farms studied, and evaluate if there is a correlation between the classically diagnosed ABB based on the HH equation, the BE, alterations in AG and with a new proposal for M+H, as well as analyzing the indexes of the newborn.

MATERIALS AND METHODS Type of study. A prospective cross-sectional study was done.

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En 1948, Singer y Hastings (9) propusieron el concepto de base búfer (BB), partiendo del principio de electroneutralidad de las soluciones y de interpretar que los aniones se comportan como ácidos; así en 1960, Anderssen et al (10), introdujeron el término Exceso de Bases (EB), como variable independiente de la pCO2. El EB representa el componente metabólico o cambio de los ácidos no volátiles o del bicarbonato, porque se calcula bajo condiciones ideales, es decir, con una pCO2 de 40 mmHg; desde entonces la BB y el EB se convirtieron en el punto de apoyo para el diagnóstico del componente metabólico (11). El concepto de brecha aniónica o Anion Gap (AG) surge en la década de los 70 como una forma de clasificar las acidosis metabólicas y explicar las causas de las mismas (12). La importancia de su cálculo, radica en que permite diferenciar las acidosis metabólicas en dos tipos principales: acidosis metabólica con AG elevado, lo que indica que la acidosis está causada por ganancia de ácidos o con AG normal, ocasionada por pérdida del bicarbonato (13). Recientemente, Cruz et al (14) de la Unidad de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia, proponen diferenciar los hidrogeniones (H+) que generan el pH sanguíneo en H+ metabólicos (H+M) e H+ derivados del CO2 (H+-CO2). Para esto se denominan hidrogeniones totales (Htot) los derivados del valor de pH y clásicamente corresponden al antilogaritmo del valor negativo del pH; luego conociendo la pendiente de la relación entre pH y PCO2 se obtienen los H+-CO2 (15). Estos últimos enfoques, que han sido denominados como “semicuantitativos”, han ganado un espacio importante en el uso clínico, y serían tomados como información objetiva. Existen otros parámetros que son considerados como información subjetiva; los cuales podrían estimar la presencia de la acidosis en un ternero recién nacido; surge la hipótesis de si es posible determinar el EAB en el ternero en condiciones de campo, sin recurrir a la determinación de los gases sanguíneos. En los trabajos consultados no se encontró información suficiente de la valoración del EAB durante la instauración del síndrome entérico en bovinos, por ello el objetivo del presente estudio fue determinar el EAB en sangre de vacas con antecedentes diarreicos y sus respectivos terneros en cuatro fincas del departamento de Córdoba, Colombia; establecer si hay diferencias entre estos indicadores en las fincas de estudio, evaluar si hay correlación entre el EAB diagnosticado clásicamente con base en

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Study site. The work was done in the municipality of Montería, department of Córdoba, located at 8°45’ north and 75°53’ west; the average temperature was between 28 and 35°C, 85% relative humidity, with an annual precipitation of 1.200 to 1.500 mm, and an altitude of 18 meters above sea level. The municipal area is 3.043 km2, with 27 divisions. Its northern border is Puerto Escondido, San Pelayo and Cereté; the eastern, San Carlos and Planeta Rica; the southern, Tierralta and Valencia; and the western with the department of Antioquia and Canalete. Study population. Animals from four farms located in the municipality of Montería were used, with a history of diarrheic symptoms frequent in calves. The sample was composed of 300 pregnant cows in good condition, which corresponded to 10% of the population of four farms (A=70; B=50; C=60 y D=120) from the region. The calves were born over a two month period of time, so the weather had no influence during that time period. Sample size calculation. From a population of 300 cows, a sample of n size was selected to determine the following formula:

with Where Z corresponds to the percentile of the normal distribution that will be tested at 90, 91, 92, 93, 94 and 95%. P corresponds to the proportion, in this case unknown, of animals with a certain trend, which was considered as being equal to 0.5 given that it provides a greater sample size. E, is the maximum possible error that would be tested at levels 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10. N=300. According to data reported by the Colombian Cattle Federation (FEDEGAN), in 2007 the bovine population in the municipality of Montería was 178.320 females older than two years (16); this was considered n. The bovines in these areas are mostly composed of Zebu crossbred with European breeds, mixed: Zebu x Holstein and Brown Swiss. To determine the size of the sample, a normal distribution table was used, with a statistical reliability rate of 94% and with a maximum allowed error rate of 5%, and the size of the final sample was 60 animals. Sixty pregnant cows and their respective offsprings were evaluated in the four farms that were selected. Taking and processing the sample. After disinfecting the area and subjecting the animal adequately, 5 ml of blood was obtained from the

la ecuación de HH, el EB, las alteraciones en el AG y con la nueva propuesta de H+M, así como analizar los índices del recién nacido.

MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio. Se realizó un estudio prospectivo de corte transversal. Sitio de estudio. El trabajo se realizó en el municipio de Montería, departamento de Córdoba, ubicado a 8°45’ de latitud norte y a 75°53’ de longitud oeste; la temperatura promedio osciló entre 28 y 35°C, humedad relativa del 85%, con una precipitación anual de 1.200 a 1.500 mm y una altitud de 18 msnm. El área municipal es de 3.043 km2, conformado por 27 corregimientos. Limita al norte con Puerto Escondido, San Pelayo y Cereté; al este con San Carlos y Planeta Rica; al sur con Tierralta y Valencia; y al oeste con el departamento de Antioquia y Canalete. Población objeto de estudio. Se utilizaron los animales de cuatro fincas ubicadas en el municipio de Montería, con antecedentes de cuadros diarreicos frecuentes en terneros. La muetra estaba conformaba por 300 vacas preñadas con buena condición, las cuales correspondieron al 10% de la población de cuatro fincas (A=70; B=50; C=60 y D=120) de la región. Los terneros nacieron en un lapso de 2 meses, de tal manera que no hubiera influencia del clima en el tiempo. Cálculo del tamaño de la muestra. A partir de la población de 300 vacas se seleccionó una muestra de tamaño n determinado por la siguiente fórmula: n=

n0 n 1+ 0 N

2 Con n = Z P(1 − P) 0 2

Donde Z corresponde al percentil de la distribución normal que se probará a los niveles 90, 91, 92, 93, 94 y 95%. P, corresponde a la proporción, en este caso desconocida, de animales con una cierta característica, este se tomará igual a 0.5 dado que arroja el mayor tamaño de muestra. E, es el error máximo permisible y se probará a los niveles 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. N=300. Según los datos reportados por la Federación Colombiana de Ganaderos (FEDEGAN), para el año 2007 la población bovina del municipio de Montería estuvo compuesta por 178.320 hembras mayores de dos años (16); este dato fue tomado como n. Las especies bovinas de estas zonas están compuestas principalmente por animales cebuínos cruzados con razas europeas, mestizas: cebú x Holstein y Pardo Suizo.

Betancur - Physiology acid-base balance during diarrhea in calves umbilical vein of the calves after birth without allowing them to suck colostrum and in the coccygeal vein of the cows. The procedure was done with commercial heparinized syringes (200 µl of sodium heparin), bending the needle to avoid forming bubbles, and the samples were held on ice and were analyzed within two hours. The identifying data were recorded on individual medical record sheet. The presence of diarrhea syndrome was observed between 8-12 hours after birth. To perform the procedures described above, the regulations contained in bill 84 of 1989 related to animal welfare were observed (17). A direct inspection was performed of vital signs on calves using the table 1 (18) as well as the laboratory variables needed to perform ABB calculations by means of an ionogram and the gasometric method. A Rapidlab 348 (Bayer Lab. Germany) apparatus was used for blood gases, which works with selective direct ion electrodes and measuring bands for the results of pCO2, Na+, K+, Cl- and pH. Bicarbonate calculation and BE were determined in an automated way by means of gas equipment. The AG was calculated using the formula (Na+ + K+) – (Cl- + HCO3-) (13) and the metabolic hydrogen ions (M+H) as total hydrogen ions (Htot) minus the H + derived from the CO 2 (H+-CO2). M+H values greater than +5 mmol/L correspond to a metabolic acidosis and a value less than -2 mmol/L to a metabolic alkalosis (14).

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Para determinar el tamaño de muestra se utilizó una tabla de distribución normal, con una confiabilidad estadística del 94% y con un error máximo permisible del 5%, el tamaño de muestra final fue de 60 animales. Se evaluaron 60 vacas preñadas y sus respectivas crías en las cuatro fincas seleccionadas. Toma y procesamiento de la muestra. Previa desinfección del área y adecuada sujeción del animal, se obtuvieron 5 ml de sangre, de la vena umbilical en los terneros después del nacimiento sin que succionaran el calostro y en la vena coccígea de las vacas. El procedimiento se realizó con jeringas heparinizadas comerciales (200 µl de heparina sódica), doblando la aguja para evitar formación de burbujas y las muestras conservadas en hielo fueron analizadas antes de 2 horas. Los datos de identificación fueron registrados en una hoja clínica individual. Entre 8 a 12 horas de nacidos se observó la presencia del síndrome diarreico. Para la realización de los procedimientos antes descritos se tuvo en cuenta la reglamentación consignada en la ley 84 de 1989 en lo referente al bienestar animal (17). Los signos vitales del recién nacido se registraron por inspección directa usando la tabla 1 (18) y las variables de laboratorio necesarias para realizar los cálculos del EAB mediante ionograma y el método gasométrico.

The samples were processed at the Zairo Laboratory of the Zayma Clinic in Montería, Colombia.

Se utilizó un aparato de gases sanguíneos Rapidlab 348 (Lab. Bayer, Alemania), que trabaja con electrodos de ion selectivo directo y bandas de medición para los resultados de pCO2, Na+, K+, Cl- y pH. El cálculo del bicarbonato y el EB se determinó de forma automatizada mediante un equipo de gases.

Statistical analysis. Data were processed using descriptive statistics, and the arithmetic mean and standard deviation were determined for each of the measured indicators. The Duncan

El AG se calculó según la fórmula (Na+ + K+) – (Cl+ HCO3-) (13) y los hidrogeniones metabólicos (H+M) como hidrogeniones totales (Htot) menos los H+ derivados del CO2 (H+-CO2). Valores de

Table 1. Numeric rating system (expressed as a depression rating) used to rate vital signs in calves with metabolic acidosis (18). Variable

Exploration method

Time to lift head

Should not be more than a minute after Does not raise head Raises it but keeps resting birth

Raised and moving

Suction reflex

Introduce finger in its mouth

Absent

Present, weak or not sustained

Stays strong

Response to stimulus

Pink croup Press at the base of the ear Drip water in ear

Does not react

Reacts weakly to all three

Reacts well to all three

Interest in surroundings

Looks at everything in its surroundings

Little interest

Looks at everything

Time to try to stand up

Spontaneously in the first 20 minutes

Does it in time but weakly

Does it in time

Detached Does not stand

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test for the multiple comparisons of means was used when necessary. In addition, a Pearson correlation was developed to establish the degree of association between pH, AG, BE and M+H in calves, cows and both. Also, the indexes of the newborn were determined by comparing proportions. Statistical software SPSS, version 16, was used (19).

RESULTS Descriptive statistics of ABB in cows and calves. In table 2 the medium, minimum and maximum values are observed of the ABB in cows with diarrheic backgraunds and calves, as well as a comparison with reference values. In cows only the pCO2 (39.63 mm/Hg) diminished in comparison with the reference values (7) (Table 2). On the other hand, in calves the concentration of electrolytes Na + (144.33 mEq/L) and Cl (104.23 mEq/L) and AG (18.95 mEq/L) increased in comparison with the reference values (20); nevertheless, in these animals a reduction of pH (7.38), HCO-3 (23.57 mEq/L), pCO2 (44.97 mm/ Hg) and BE (0.47 mEq/L) was found. Table 2. Descriptive statistic of ABB in cows and calves on farms in Montería, Córdoba, Colombia. Animals Cows (n=60)

Average

SD±

Minimum Maximum

Reference values*

7.41

0.060

7.21

7.54

7.31 to 7.53

145.77

3.628

138.00

156.00

132 to 152

K (mEq/L)

4.58

0.439

3.66

6.19

3.9 to 5.8

Cl- (mEq/L)

106.21

3.420

98.00

113.00

97 to 111

HCO3- (mEq/L)

23.80

2.630

12.50

29.20

17 to 29

pCO2 (mm/Hg)

39.63

6.979

27.50

56.10

41 to 46

AG (mEq/L)

19.67

4.789

9.89

35.27

10 to 20

BE (mEq/L)

0.49

4.166

-17.20

6.60

0 to 6

-0.84

3.800

-7.94

11.53

-2 to 5***

Average

SD±

7.38

0.052

7.22

7.52

Na+ (mEq/L) +

M H +

Calves (n=60)

pH Na (mEq/L)

Minimum Maximum

Reference values**

7.39 to 7.42

144.33

2.932

138.00

153.00

136 to 137

K+ (mEq/L)

4.54

0.466

3.54

5.85

4.36 to 4.58

Cl- (mEq/L)

104.23

3.738

93.00

111.00

98 to 99

HCO3- (mEq/L)

23.57

2.299

16.10

28.40

29 to 30

pCO2 (mm/Hg)

44.97

5.491

28.00

57.60

46 to 48

AG(mEq/L)

18.95

4.354

11.80

29.93

11 to 12

BE(mEq/L)

0.47

3.018

-10.40

6.00

4.84 to 6.08

M+H

-1.60

3.631

-8.39

9.91

-2 to 5***

Average and SD±: standard deviation. pCO2: CO2 Pressure; BE: Excess of Base; AG: Anion Gap. M+H: metabolic hydrogen ions. *Reference values for cows (7) **Reference values for calves (20) *** Reference for M+H (14).

H+M superiores a +5 mmol/L, corresponde a una acidosis metabólica y un valor menor de -2 mmol/L a una alcalosis metabólica (14). Las muestras se procesaron en el laboratorio Zairo de la clínica Zayma en Montería, Colombia. Análisis estadísticos. Los datos se procesaron mediante estadística descriptiva, se determinó la media aritmética y la desviación estándar a cada uno de los indicadores medidos. En los casos necesarios se utilizó la dócima de Duncan para la comparación múltiple de medias. Además, se desarrolló una correlación de Pearson para establecer el grado de asociación entre pH, AG, EB e H+M en terneros, vacas y ambos. También se determinaron los índices del recién nacido mediante comparación de proporciones. Se usó el software estadístico SPSS versión 16 (19).

RESULTADOS Estadística descriptica del EAB de vacas y terneros. En la tabla 2 se observan los valores medios, mínimos y máximos de los indicadores del EAB en vacas con antecedentes diarreicos y terneros; así como una comparación con valores de referencia. En las vacas solo la pCO2 (39.63 mm/Hg) disminuyó en correspondencia con los valores de referencia (7)(Tabla 2). Por otro lado, en terneros la concentración de los electrolitos Na+ (144.33 mEq/L) y Cl- (104.23 mEq/L) y del AG (18.95 mEq/L) aumentó en correspondencia con los valores de referencia (20); sin embargo, en estos animales, se encontró una disminución del pH (7.38), HCO-3 (23.57 mEq/L), pCO2 (44.97 mm/Hg) y EB (0.47 mEq/L). Correlación de pH, AG, EB e H+M en vacas y terneros. La tabla 3 muestra las correlaciones del EAB en terneros y vacas. El pH (t) mostró una correlación positiva con el EB (v) (p<0.05) y una correlación negativa con el AG (v) (p<0.05) y los H+M (v) (p<0.01). También, el AG (t) influyó en una correlación positiva con el AG (v) (p<0.01) y los H+M (v) (p<0.05). Además, se observó una correlación negativa entre el EB (t) y con los H+M (v) (p<0.05). De la misma manera los H+M (t) Table 3. Correlation of pH, AG, BE and H+M in cows (n=60) and calves (n=60). Indicators

pH (v)

AG (v)

BE (v)

H+M (v)

pH (t)

0.11

-0.31*

0.26*

-0.30**

AG (t)

-0.10

0.54**

-0.17

0.14*

BE (t)

0.17

-0.20

0.15

-0.31*

M+H (t)

-0.33*

0.08

-0.13

0.33*

** p<0.01; *p<0.05 (Pearson) V: cow; t: calf

Betancur - Physiology acid-base balance during diarrhea in calves Correlation of pH, AG, BE and M+H in cows and calves. Table 3 shows the comparison with ABB in calves and cows. The pH (t) had a positive correlation with BE (v) (p<0.05) and a negative correlation with AG (v) (p<0.05) and the M+H (v) (p<0.01). Also, the AG (t) affected a positive correlation with AG (v) (p<0.01) and M+H (v) (p<0.05). Additionally, a negative correlation between BE (t) and with M+H (v) (p<0.05) was observed. In the same way M+H (t) indicated a negative and positive correlation with reference to pH (v) (p<0.05) and M+H (v) (p<0.05). The finding of a high correlation between the cows with their respective newborns for AG (0.54**) was noteworthy. Tables 4 and 5 indicate the correlations between the ABB in cows and calves separately. All the correlated indicators showed significant differences (p<0.05) and the same correlational tendencies. Table 4. Correlation of pH, AG, BE and M+H in cows (n=60). Indicators

-0.497**

M+H

0.310* -0.514**

-0.431** 0.422** -0.671**

** p<0.01; *p<0.05 (Pearson).

Table 5. Correlation of pH, AG, BE and M+H in calves (n=60). Indicators

-0.600**

AG BE

M+H

0.595**

-0.467**

-0.378**

0.268* -0.761**

** p<0.01; *p<0.05 (Pearson)

The pH indicated negative correlations with AG (p<0.05) and M+H (p<0.01) and positive with BE (p<0.05). However, AG showed a negative correlation with BE (p<0.01) and a positive one for M+H (p<0.05; p<0.01). Also, a negative correlation was observed for the BE and M+H indicators (p<0.01) (Tables 4 and 5). ABB indicators in cows and calves at four farms in the municipality of Montería. The pH and BE in cows and calves and M+H in calves did not show significant differences (p>0.05) between the farms in the study; nevertheless, AG (cow) increased in Farm C and showed statistical differences (p<0.05) with Farm D. In cows, M+H indicated significant differences (p<0.05) for Farms B and C. On the other hand, in calves, AG showed notable differences (p<0.05) between the same farms with relation to Farms A and

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indicaron una correlación negativa y positiva con respecto al pH (v) (p<0.05) e H+M (v) (p<0.05). Se destaca el hallazgo de una correlación alta entre las vacas con sus respectivos neonatos para el AG (0.54**). Las tablas 4 y 5 indican las correlaciones del EAB en las vacas y los terneros por separado. Todos los indicadores correlacionados mostraron diferencias significativas (p<0.05) y las mismas tendencias correlacionales. El pH indicó correlaciones negativas con el AG (p<0.05) y los H+M (p<0.01) y positivas con el EB (p<0.05). Sin embargo, el AG mostró una correlación negativa con el EB (p<0.01) y positiva para los H +M (p<0.05; p<0.01). También, se observó una correlación negativa para los indicadores EB e H+M (p<0.01) (Tablas 4 y 5). Indicadores del EAB de vacas y terneros en cuatro fincas del municipio de Montería. El pH y EB en vacas y terneros e H+M en terneros se mantuvieron sin diferencias significativas (p>0.05) entre las fincas de estudio; sin embargo, AG (vaca) aumentó en la finca C y mostró diferencias estadísticas (p<0.05) con la finca D. En las vacas los H+M indicaron diferencias significativas (p<0.05) para las fincas B y C. Por otro lado, en terneros el AG mostró diferencias notables (p<0.05) entre las mismas fincas con relación a las fincas A y D (Tabla 6). Destacar que el AG mostró diferencias significativas en vacas y terneros en las mismas zonas de estudio. Índices del recién nacido. La proporción de terneros en cada índice según los resultados subjetivos se observa en la figura 1. Los signos levantar cabeza, respuesta a estímulo, interés por el entorno y tiempo para colocarse en estación mostraron las mayores proporciones (p<0.05) en el grupo de calificación dos, según el sistema de calificación numérica (Tabla 1), contrario al Table 6. ABB indicators in cows and calves on four farms in the municipality of Montería. Indicators

Farms A

7.42

7.40

7.41

7.43

SE±

P Value

0.016

0.527

1.210

0.041

0.954

0.099

Cows pH AG

20.64ab 20.50ab 22.46a 17.75b

M+H

0.18ab

0.45a

-0.259b -1.40ab

-1.75

-0.83

1.42

-8.020

1.06

0.192

7.38

7.36

7.37

7.38

Calves pH

0.014

0.300

19.04b 22.37a 23.73a 19.12b

1.103

0.006

M+H

-1.81

-0.33

-1.36

-2.90

0.930

0.280

0.74

-1.08

0.61

1.60

0.750

0.097

Means with different letters in the same row differ by p<0.05 (Duncan).

a,b

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Indexes of the newborn. The proportion of calves in each index according to the subjective results is observed in figure 1. Signs such as raising the head, responding to stimulus, interest in the environment and time to get into station are shown in greater proportions (p<0.05) in rating group two, according to the numeric rating system (Table 1), on the opposite of the suction reflex (p<0.05), which showed significant values in rating group one. It is noteworthy that except for the suction reflex sign, other indexes did not indicate animals (calves) in group zero.

DISCUSSION The results obtained showed that the ABB indicators were generally within the physiological reference values according to the literature consulted (7,14,20); however, in calves the following analytes did not match: pH, pCO2, HCO-3, AG, and BE. The increase of plasmatic Na+ can be explained by a raise in the level of aldosterone at birth, Cl- follows Na+; these results are similar to those reported by Herosimczyk et al (21). In calves, the decrease of pH, pCO2 and HCO-3 (Table 2) suggests a condition of metabolic acidosis, which agrees with that obtained by Lisboa et al (22) in newborn animals; the low pH stimulates the increase of ventilation which involves a decrease of PCO2. The increase of AG and the reduction of the BE (Table 2) in some calves could indicate a possible metabolic acidosis; this condition is caused, among other reasons, by diarrhea, which causes alterations in the hemogasometric parameters such as the decrease of serum bicarbonate, BE and increases AG; these results are similar to those obtained by Freitas (20). If this state is maintained, the calves would enter a state of serious metabolic acidosis, which would mean death for most of the animals due to metabolic alterations. In Farm B there were two calves that died from diarrhea, with low concentrations of pH and BE (data not shown). On the other hand, a direct relationship with the AG value was found between cows and their respective newborns (Table 3). At the time of

Calves in each group (%)

D (Table 6). It is noteworthy that AG showed significant differences in cows and calves in the same areas of the study.

Time to lift head

Sucking reflex

Stimulus response

Interest in Time to surroundings stand up

Figure 1. Index of newborn calves (calves, N=60).

reflejo de succión (p<0.05) que mostró valores significativos en el grupo de calificación uno. Destacar, que excepto el signo de reflejo de succión, los otros índices no indicaron animales (terneros) en el grupo cero.

DISCUSIÓN Los resultados obtenidos mostraron que los indicadores del EAB en su mayoría estuvieron dentro de los valores fisiológicos de referencia de acuerdo con la literatura consultada (7,14,20); sin embargo, en los terneros no coincidieron los siguientes analitos: pH, pCO2, HCO-3, AG, y EB. El incremento de Na + plasmático puede ser explicado por un aumento en el nivel de aldosterona al nacimiento, el Cl- sigue al Na+; estos resultados son similares a los reportados por Herosimczyk et al (21). En los terneros la disminución del pH, de la pCO2 y del HCO-3 (Tabla 2) sugieren una condición de acidosis metabólica; lo cual concuerda con lo obtenido por Lisboa et al (22) en animales recién nacidos; el pH bajo estimula el aumento de la ventilación lo que conlleva a un descenso de la PCO2. El aumento del AG y la disminución del EB (Tabla 2) en algunos terneros podría indicar una posible instauración de acidosis metabólica; esta condición causada entre otras por diarrea imprime al animal alteraciones en los parámetros hemogasométricos como la reducción del bicarbonato sérico, el EB y el aumento del AG; estos resultados son similares a los obtenidos por Freitas (20). De mantenerse este estado, los terneros entrarían en estado de acidosis metabólica grave, lo que conllevaría a la mayoría de las crías al fallecimiento por alteraciones metabólicas. En la finca B hubo dos terneros muertos por diarrea, los cuales

Betancur - Physiology acid-base balance during diarrhea in calves birth the fetus suffered metabolic acidosis as a consequence of suspending the umbilical flow of blood, the effort made during birth established an anaerobic metabolic process, at least until the beginning of respiratory functions (3). The correlations in cows and calves between pH with AG, BE and M+H (Tables 4 and 5) is important, since it allows using any technique to identify ABB in bovines, differentiate and rate metabolic acidosis with AG and M+H, and BE is a fundamental indicator to diagnose and establish corrective therapies in ABB (23). The significant differences (p<0.05) in AG in calves and cows between Farms B and C regarding Farms A and D (Table 6) can be explained due to the geographic location, since Farms B and C are found in areas that are prone to flooding, which can predispose the appearance of acidosis, given that flooding causes anoxia, which provokes the formation of volatile sulphuric acid (24); on the other hand, flooding can facilitate the presence of infectious diseases. The correlation between the different variables (pH, BE, AG) with M + H is important from a practical point of view, since only by determining the pH and the pCO2 can the ABB be evaluated (25); also, it opens the way to use M+H as part of the ABB diagnosis in bovines in field conditions where analytical tools are not available. Metabolic acidosis causes clinical symptoms that are attributable to a neurological dysfunction (26). Diarrhea is the most important and frequent cause of metabolic acidosis in calves and one of the principal neurological changes in an acidotic calf is the loss of the suction reflex (27). In this sense, studies have been done to indicate the association between systemic acidosis with the deterioration of the suction reflex (28) and between BE with changes in attitude and behavior (29) as well as the relationship between dehydration and the posture of the animal (30). Therefore, these vital signs of the newborn could be used as clinical physiological indicators of newborn acidosis in bovines. It is concluded that in the studied population, ABB analyte measurements in bovines were similar to the reference consulted and could be used as a reference for future studies. Metabolic acidosis is suggested in calves keeping in mind the values of AG and BE and with M +H; this last variable that rates the

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tenían bajas concentraciones de pH y EB (datos no mostrados). Por otra parte, se encontró una relación directa en el valor del AG entre las vacas y sus respectivos terneros (Tabla 3). En el momento del parto el feto sufre de acidosis metabólica como consecuencia de la suspensión del flujo de sangre umbilical, el esfuerzo realizado durante el parto establece un proceso metabólico anaerobio, por lo menos hasta el inicio de la función respiratoria (3). La correlación en vacas y terneros entre el pH con AG, EB e H*M (Tablas 4 y 5); es importante, ya que permite el empleó de cualquiera de las técnicas para conocer el EAB en bovinos, diferenciar y cuantificar la acidosis metabólica con el AG e H*M y el EB es un indicador fundamental para el diagnóstico e instauración de terapias correctivas en el EAB (23). Las diferencias significativas (p<0.05) en el AG en terneros y vacas entre las fincas B y C con respecto a las fincas A y D (Tabla 6), podrían ser explicadas por la ubicación geográfica, ya que las fincas B y C se encuentran en zonas inundables, lo que puede predisponer la instauración de la acidosis, dado que en la inundación se producen condiciones de anoxia, lo que provoca la formación de sulfuro ácido volátil (24); de otro lado, las inundaciones puede facilitar la presencia de enfermedades infecciosas. La correlación entre las diferentes variables (pH, EB, AG) con H+M es importante desde el punto de vista práctico, ya que con sólo determinar el pH y la pCO2 se puede evaluar el EAB (25); además, abre el camino para el uso de los H+M como parte del diagnóstico de EAB en bovinos en condiciones de campo donde las herramientas analíticas no están disponibles. La acidosis metabólica causa signos clínicos atribuibles a una disfunción neurológica (26). La diarrea es la causa más importante y frecuente de acidosis metabólica en terneros y uno de los principales cambios neurológicos en el ternero acidótico es la pérdida del reflejo de succión (27). En este sentido, se han realizado estudios para indicar asociación entre la acidosis sistémica con el deterioro del reflejo de succión (28) y entre el EB con cambios de actitud y comportamiento (29), así como relación entre la deshidratación y la postura del animal (30). Por lo tanto estos signos vitales del recién nacido podrían ser utilizados como indicadores clínico-fisiológicos de la acidosis neonatal de los bovinos. Se concluye que en la población estudiada, la medición de los analitos del EAB en bovinos fue similar a la referencia consultada y se podrían utilizar como referencia para futuros trabajos.

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metabolic component of ABB is evaluated for the first time in bovines. When evaluating the indexes of the newborn in bovines by means of vital signs, opens the possibility of using them in a predictive way, especially the suction reflex, in order to prevent the newborn acidosis in calves under field conditions without recurring to a hemogasometric determination. Acknowledgements To the research and extension office of the Universidad de Córdoba, Colombia. FMV-05-06.

Se sugiere acidosis metabólica en los terneros teniendo en cuenta los valores de AG y EB y con H+M; esta última variable que cuantifica el componente metabólico del EAB, se evalúa por primera vez en bovinos. Al evaluar los índices del recién nacido en bovinos mediante signos vitales abre la posibilidad de utilizarlos de una manera predictiva, especialmente el reflejo de succión, para prevenir la acidosis neonatal en los terneros en condiciones de campo sin recurrir a la determinación hemogasométrica. Agradecimientos A la oficina de investigación y extensión de la Universidad de Córdoba, Colombia. FMV-05-06.

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Rev.MVZ Córdoba 20(2):4602-4613, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Serological evidence of Hepatitis E Virus infection in Antioquia, Colombia slaughtered pigs Evidencia serológica de infección por el Virus de Hepatitis E en cerdos faenados en Antioquia, Colombia Jorge Forero D,1* M.Sc, Cristian Gutiérrez V,1 M.Sc, Jaime Parra S,1 Ph.D, Guillermo Correa L,1 Ph.D, Berardo Rodríguez,2 Ph.D, Lina Gutiérrez B,3 Ph.D, Albeiro López-Herrera.1 Ph.D. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Agrarias. Departamento de Producción Animal, Grupo Biodiversidad y Genética Molecular BIOGEM. Calle 59A No.63-020, Autopista Norte, Bloque 50, Piso 3, Oficina 310. Medellín, Colombia. 2Universidad de Antioquia. Facultad de Ciencias Agrarias. Laboratorio de Patología Animal. Grupo de Investigación en Patobiología QUIRON. Carrera 75 No. 65-87. Bloque 47-134. Medellín. Colombia.. 3Universidad Pontificia Bolivariana, Facultad de Medicina, Escuela de Ciencias de la Salud, Grupo Biología de Sistemas, Calle 78B N°72A-109, Bloque B. Medellín, Colombia. *Correspondencia: jforeroduarte@gmail.com 1

Received: June 2014; Accepted: December 2014.

ABSTRACT Objective. To detect the presence of specific antibodies against Hepatitis E virus (HEV) in pigs slaughtered in Antioquia, the department where the greatest amount of pork is produced and consumed in Colombia. Materials and methods. Between September 2011 and May 2012, blood samples from pigs were obtained in five slaughterhouses of Antioquia, four of them located in the Aburrá Valley subregion and other located in northern subregión. Serum were evaluated with a commercial ELISA kit for diagnosing HEV in humans but adapted to detect IgG and IgM antibodies in pigs. Results. A 100.0% seropositivity for IgG antibodies was found in 1000 samples evaluated, and 82.06% for IgM antibodies were found in 740 samples. Conclusions. These results indicate that pigs in slaughter age in Antioquia, and possibly in Colombia, have been exposed to HEV at some point in their production process and a high percentage of them can arrive to slaughterhouses with recent infection. Key Words: Antibodies, ELISA, Hepevirus, IgM, IgG, zoonosis (Source: DeCS).

RESUMEN Objetivo. Detectar la presencia de anticuerpos específicos contra el virus de la Hepatitis E (HEV) en cerdos faenados en Antioquia, departamento donde se produce y consume la mayor cantidad de carne de cerdo en Colombia. Materiales y métodos. Entre septiembre de 2011 y mayo de 2012, se obtuvieron muestras de sangre de cerdos en cinco plantas de faenado, cuatro de ellas ubicadas en el Valle de Aburrá y una en la subregión Norte del departamento de Antioquia, las cuales fueron evaluadas mediante un kit de ELISA comercial para diagnóstico de HEV en humanos pero adaptado para la detección de anticuerpos tipo IgG e IgM en cerdos. Resultados. Se encontró una seropositividad de 100.0% para anticuerpos tipo IgG en 1000 muestras evaluadas y de 82.06% para anticuerpos tipo 4602

Forero - Hepatitis E virus infection in Antioquia pigs

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IgM en 740 muestras. Una muestra de heces positiva para la detección del genoma HEV es similar al genotipo 3 encontrada en Estados Unidos. Conclusiones. Estos resultados indican que los cerdos en edad de faenado en Antioquia y posiblemente en Colombia, han tenido exposición a HEV del, un virus zoonótico emergente a nivel mundial, en algún momento de su proceso productivo. Palabras clave: Anticuerpos, ELISA, Hepevirus, IgM, IgG, zoonosis (Fuente: DeCS).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Hepatitis E is an acute liver disease in humans caused by the hepatitis E virus (HEV). Although this type of hepatitis has a global distribution, in some countries of Africa and Asia outbreaks associated with contamination of water sources for consumption are presented, while in other regions such as Europe and the United States there are sporadic outbreaks associated with the consumption of raw or undercooked food (1, 2). It is estimated that every year around the world, 20 million humans are infected, with about three million cases of acute hepatitis and 57,000 deaths related to Hepatitis E (1.3). Most of the time the disease is self-limiting in humans; however, it can be extremely serious for pregnant women, and the mortality rate for this population may exceed 20% (4).

La Hepatitis E es una enfermedad hepática aguda en humanos causada por el Virus de la Hepatitis E (HEV). Aunque este tipo de hepatitis presenta una distribución global, en algunos países de Africa y Asia se presentan brotes epidémicos asociados a contaminación de fuentes de aguas para consumo humano, mientras que en otras regiones como Europa y Estados Unidos se presentan brotes esporádicos asociados al consumo de alimentos crudos o mal cocidos (1,2). Se estima que en el mundo cada año hay 20 millones de infecciones en humanos, cerca de tres millones de casos de hepatitis aguda y 57.000 muertes relacionadas a la Hepatitis E (1,3). La mayoría de las veces la enfermedad es auto limitada en el humano; sin embargo, puede llegar a ser extremadamente grave en mujeres embarazadas, con una mortalidad para esta población que puede superar el 20% (4).

There are four major HEV genotypes that are recognized in mammals. Genotypes 1 and 2 are restricted to humans while genotypes 3 and 4 can infect, in addition to humans, other species, mainly domestic pigs (3). Genotype 1 is found mainly in India, while genotype 2 has been detected in several countries of Africa and in Mexico. Genotype 3 is found around the world, while genotype 4 is often found in Asian countries like China and Japan (1-3). In Latin America, the first serologic evidence of the virus in humans was found in Venezuela in 1994; later, in other research on the seroprevalence of HEV in countries in the region, varying percentages were found in the different human populations studied, none of which exceed 20% (5). Additionally, the viral genome has been detected in humans in Argentina, Brazil, Bolivia and Uruguay, where genotype 3 has been identified; however, in Venezuela and Argentina genotype 1 has been found (5). In addition to the findings in humans, serologic evidence of infection has been found in other species such as cattle, dogs and chickens (6), and the viral genome in wild boars, deer, rabbits, rats and bats (2,7,8) but it is still unclear what role these species play in the epidemiology of the infection. On the other hand, the increased

Se reconocen cuatro genotipos de HEV en mamíferos. Los genotipos 1 y 2 están restringidos a los humanos, mientras que los genotipos 3 y 4 pueden infectar además, de humanos otras especies, como el cerdo (3). El genotipo 1 se ha encontrado principalmente en India, mientras que el genotipo 2 se ha detectado en varios países de África y también en México. El genotipo 3 presenta una distribución mundial, mientras que el genotipo 4 se encuentra frecuentemente en países asiáticos como China y Japón (1-3). En Latinoamérica, la primera evidencia serológica del virus en humanos se encontró en Venezuela en 1994; posteriormente en otras investigaciones sobre seroprevalencia de HEV en países de la región, se encontraron porcentajes variables en las distintas poblaciones humanas estudiadas, los cuales no superan el 20% (5). Junto a esto, el genoma viral se ha detectado en humanos en Argentina, Brasil, Bolivia y Uruguay, donde se ha podido identificar el genotipo 3; no obstante, en Venezuela y Argentina se ha encontrado el genotipo 1 (5). Junto a los hallazgos en seres humanos, se ha encontrado evidencia serológica de la infección en otras especies como bovinos, perros y gallinas (6),

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risk of infection in swine handlers (9), the high genetic identity between swine and human HEV viral sequences (10,11), and the experimental infection with swine genotypes to nonhuman primates, are findings which identified the pig as the viral reservoir of infection (2,10,11). Serological studies in swine show a wide distribution of the virus in herds around the world. In the United States seropositivity reached 41% (12), 90% in New Zealand (13), 100% in Mexico (14) and 98% in Spain (15). Studies in Latin America have reported the circulation of HEV in pigs in Argentina (16), Brazil (17), Chile (18), Costa Rica (19) and Mexico (14). Pig production is an important part of the livestock sector in Colombia, with a positive impact on the economy, not only by promoting the livestock sector, but as a source of employment in the country (20). Antioquia is the department in Colombia with the greatest production and consumption of pork, as it provides about 45% of total production in the country (20). Hepatitis E is considered a global public health problem; however, in Colombia, despite some isolated efforts, the status for HEV in the population is unknown, as well as the presence of specific antibodies in pigs bred in the country. The aim of this study was to determine the presence of IgG and IgM antibodies in pigs slaughtered in the main slaughterhouses in the department of Antioquia.

MATERIALS AND METHODS Ethical aspects. This study was conducted in accordance with protocols approved by the Ethics Committee of the Universidad Nacional of Colombia, Medellin (Act CEMED-226, of October 14, 2011). Sampling and size of sample. Sampling was conducted with slaughtered pigs between September 2011 and May 2012 at five slaughterhouses, four of them located in the Aburrá Valley and in the northern subregion of the department of Antioquia, which were identified in the present study with letters A to E (randomized) in order to maintain confidentiality. The selected plants process the majority of the swine production in Antioquia. The average number of animals slaughtered per day during the six months prior to the start of the study was 450, 200, 400, 800 and 400 animals in plants A, B, C, D and E, respectively. Based on the sample size required to estimate seropositivity in Antioquia with a confidence

y del genoma viral en jabalíes, venados, conejos, ratas y murciélagos (2,7,8), pero todavía no es claro el papel que desempeñan estas especies en la epidemiologia de la infección. Por otro lado, el mayor riesgo de infección que tienen las personas que manipulan cerdos (9), la alta identidad genética entre los genotipos detectados en cerdos y humanos (10,11) y la infección experimental con los genotipos de cerdos en primates no humanos son hallazgos que permitieron identificar al cerdo como el reservorio para la trasmisión zoonótica del virus (2,10,11). Los estudios serológicos en cerdos, muestran una amplia distribución del virus en las piaras del mundo. En Estados Unidos la seropositividad alcanza el 41% (12), 90% en Nueva Zelanda (13), 100% en México (14) y 98% en España (15). Los estudios realizados en Latinoamérica han reportado la circulación de HEV en cerdos de Argentina (16), Brasil (17), Chile (18), Costa Rica (19) y México (14). La producción porcina es parte importante del sector pecuario de Colombia, con un impacto positivo sobre la economía, no solo por favorecer al sector pecuario, sino por constituirse en una fuente de empleo en el país (20). Antioquia es el departamento colombiano con mayor producción y consumo de carne de cerdo, pues aporta aproximadamente el 45% de la producción total del país (20). La Hepatitis E es considerada como un problema de salud pública mundial; sin embargo, en Colombia, a pesar de algunos esfuerzos aislados, se desconoce el estatus serológico para HEV en la población, al igual que la presencia de anticuerpos específicos en los cerdos que se crían en el país. El objetivo del presente trabajo fue determinar la presencia de anticuerpos IgG e IgM en cerdos beneficiados en las principales plantas de faenado del departamento de Antioquia.

MATERIALES Y MÉTODOS Aspectos éticos. Este estudio fue realizado de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín (Acta CEMED-226, del 14 de octubre de 2011). Muestreo y tamaño de muestra. El muestreo se realizó en una población de cerdos beneficiados entre septiembre de 2011 y mayo de 2012, en cinco plantas de faenado, cuatro de ellas ubicadas en el Valle de Aburrá y una en la subregión Norte del departamento de Antioquia, las cuales se identificaron en el presente estudio

Forero - Hepatitis E virus infection in Antioquia pigs level of 95% and a maximum error of 3%, a total of 1,000 samples were evaluated, allocating per plant the average daily amount of animals processed over the past six months. Within each slaughterhouse a sampling by quotas was performed, where each quota was calculated in proportion to the number of animals slaughtered in the subregion of origin. In each slaughterhouse, the pigs were selected systematically, with a random start. Collecting information. The sampled animals were identified by place of origin, classified as healthy, and approved for slaughter and commercialization, according to the pre and postmortem health inspection done by the responsible veterinarians at each processing plant. Serum samples. Blood samples were obtained on the slaughtering line after desensitizing the animal, at the time of bleeding. Approximately 10ml of blood was taken per animal in sterile 15 ml tubes. The samples were put in cold storage to be transported to the laboratory of Animal Biotechnology of the Universidad Nacional of Colombia, in Medellin, where they were immediately centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes to obtain the serum, which was stored at -20ºC until analyzed. Indirect ELISA immunoenzymatic analysis to detect specific IgG and IgM antibodies against HEV. To detect IgG antibodies against HEV in pigs, the commercial kit of indirect ELISA HEV-IGAB (Dia.Pro-Diagnostic Bioprobes, Italy) for dual detection of IgG and IgM antibodies in human serum was used, replacing the antihuman conjugate with a conjugated goat antibody anti-IgG for swine (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) according to the methodology used by other researchers (17,21-23) at the dilution recommended by the manufacturer (1:5000). As a negative swine control (NPC), a serum of newborn piglets (in triplicate) that did not ingest colostrum was used, to avoid the presence of maternal antibodies; and as a positive control (CPP) a sample of the study that showed high OD values in the ELISA was employed. In each of the dishes that swine serum was evaluated, and for purposes of internal quality control for each test, the controls recommended and provided by the manufacturer were included: three negative controls (NC), a positive control (CP) and two calibrators (C) evaluated with the anti-human conjugate in the case. To detect IgM antibodies to HEV in pigs, the same strategy previously mentioned was used, but a commercial indirect ELISA kit HEV-IgM (Dia.Pro-Diagnostic Bioprobes, Italy) was used,

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con letras de la A a la E (asignadas al azar) con el fin de guardar confidencialidad. Las plantas seleccionadas reciben la mayor parte de la producción de cerdos de Antioquia. El número promedio de animales sacrificados por día durante los seis meses previos al inicio del estudio fue de 450, 200, 400, 800 y 400 animales para las plantas A, B, C, D y E, respectivamente. Tomando como base el tamaño muestral requerido para estimar la seropositividad en Antioquia, con un nivel de confianza del 95% y un error máximo de 3%, se evaluaron en total 1000 muestras, con afijación por planta proporcional al promedio diario de beneficio de los últimos seis meses. Dentro de cada planta, se empleó un muestreo por cuotas, donde cada cuota se calculó proporcionalmente al número de animales beneficiados por subregión de procedencia. En cada planta, los cerdos fueron seleccionados de manera sistemática con inicio aleatorio. Recolección de la información. Los animales muestreados fueron identificados por lugar de procedencia, clasificados como sanos, y aprobados para beneficio y posterior comercialización, según el proceso de inspección sanitaria pre y postmórtem realizado por los médicos veterinarios responsables de cada planta de beneficio. Muestras de suero. Las muestras de sangre fueron obtenidas en la línea de faenado posteriormente a la insensibilización del animal, en el momento de la exanguinación. Se tomaron aproximadamente 10ml de sangre por animal en tubos estériles de 15 ml. Las muestras se almacenaron en frío para su transporte al laboratorio de Biotecnología Animal de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, donde fueron centrifugadas inmediatamente a 1500 r.p.m. durante 10 minutos, para la obtención del suero, el cual fue almacenado a -20ºC hasta su análisis. Análisis inmunoenzimático ELISA indirecto para detección de anticuerpos IgG e IgM específicos contra HEV. Para la detección de anticuerpos tipo IgG contra HEV en cerdos, se empleó el kit comercial de ELISA indirecto HEV-IgAB (Dia.Pro-Diagnostic Bioprobes, Italia) para detección dual de anticuerpos tipo IgG e IgM en suero humano, para lo cual se remplazó el conjugado anti-humano del estuche, por un anticuerpo conjugado de cabra anti-IgG de cerdo (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) acorde a la metodología usada por otros investigadores (17,21-23) a la dilución recomendada por el fabricante (1:5000). Como control negativo porcino (CNP) se utilizó (por triplicado) un suero de lechón recién nacido que no ingirió

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replacing the human anti-IgM conjugate with a goat antibody conjugate anti-IgM for swine (ScientificInc Thermo Fisher, USA) in a 1:5000 dilution recommended by the manufacturer. A serum sample from a newborn piglet was used as CNP with the above mentioned characteristics, and as CPP a serum sample of a pig with molecular detection of viral shedding in feces affected by PCR for the ORF1 region of HEV. For purposes of internal quality control of each test, controls that are recommended and provided by the manufacturer were included: three CN and one CP evaluated with the anti-human conjugate of the case. The microplate of the cases used in this study were coated with specific synthetic HEV antigens derived from the ORF2 and ORF3 regions of the 4 genotypes as described by the manufacturer. OD readings were obtained on an ELISA reader (Biotek, USA) with a 450 nm filter. Viability of the indirect modified ELISA test to detect IgG and IgM antibodies. To ensure the viability of the modified conjugated immunoassays with the anti-swine conjugates, initially a positive swine serum sample for IgG anti-HEV characterized and evaluated in a previous study, kindly donated by Dr. Munné (National Reference Laboratory for viral hepatitis INEI ANLIS “Carlos Malbrán”, Argentina), (17). This serum was positive with the selected cutoff point in this project, but preliminary tests indicated that the optical density reading at 450 nm (OD 450) for the Argentine positive serum were two times lower than DO450 of some Colombian samples (data not shown); for this reason, and because the volume of the donated positive serum was insufficient to use as a positive control in all assays, the CPP and CNP described above were used. To assess the repeatability of ELISA assays modified anti- IgG and IgM in swine, six successive tests on different days, with two different operators and under the same laboratory conditions, were performed and a coefficient of variation (CV) was obtained with less than 20% gross absorbance values, so it was considered that the trials had adequate levels of repeatability (23,24). Estimating the value of the cut for positive IgG and IgM antibodies. Obtaining the cutoff for positivity of the IgG and IgM antibodies was performed based on Chebyshev inequality (25), which states that, regardless of the probability distribution of a random variable, no more than (1/k2) % of those distribution values found over k standard deviations from the mean. To control the probability of false positives, the maximum tolerable probability was set at 0.0102, which

calostro para evitar la presencia de anticuerpos maternales; y como control positivo porcino (CPP) se empleó una muestra del estudio que mostró altos valores de DO en la ELISA. En cada uno de los platos en los que se evaluaron sueros porcinos y para efectos de control de calidad interno de cada ensayo, se incluyeron los controles recomendados y proporcionados por el fabricante: tres controles negativos (CN),un control positivo (CP) y dos calibradores (C) evaluados con el conjugado anti-humano del estuche. Para la detección de anticuerpos tipo IgM contra HEV en cerdos, se empleó la misma estrategia anterior, pero usando un estuche comercial de ELISA indirecto HEV-IgM (Dia.Pro-Diagnostic Bioprobes, Italia) remplazando el conjugado anti-IgM humano por un anticuerpo conjugado de cabra anti-IgM de cerdo (Thermo Fisher ScientificInc, USA) en una dilución 1:5000 recomendada por el fabricante. Se utilizó como CNP una muestra de suero lechón recién nacido con las características antes mencionadas, y como CPP una muestra de suero de un cerdo con detección molecular de excreción viral en heces efectuada mediante PCR para la región ORF1 de HEV. Para efectos de control de calidad interno de cada ensayo, se incluyeron los controles recomendados y proporcionados por el fabricante: tres CN y un CP evaluados con el conjugado anti-humano del estuche. Las microplacas de los estuches utilizados en el presente estudio, estaban recubiertas con antígenos sintéticos específicos de HEV derivados de las regiones ORF2 y ORF3 de los 4 genotipos según lo descrito por el fabricante. Las lecturas de DO fueron obtenidas en un lector de ELISA (Biotek, USA) con un filtro a 450 nm. Viabilidad de la prueba de ELISA indirecta modificada para la detección de anticuerpos tipo IgG e IgM. Para asegurar la viabilidad de los inmunoensayos modificados con los conjugados anti-cerdo, se evaluó inicialmente una muestra de suero de cerdo positivo para IgG anti-HEV caracterizada y evaluada en un estudio previo, gentilmente donada por la Dra. Munné (Laboratorio Nacional de Referencia para las hepatitis virales INEI ANLIS “Carlos Malbrán” de Argentina), (17). Este suero fue positivo con el punto de corte seleccionado en este proyecto, pero los ensayos preliminares indicaron que la lectura de densidad óptica a 450 nm (DO450) para el suero positivo argentino fueron dos veces menores que las DO450 de algunas muestras colombianas (datos no mostrados), por esta razón, y debido a que el volumen del suero positivo donado era insuficiente para ser usado

Forero - Hepatitis E virus infection in Antioquia pigs corresponds to the cutoff given by the average value of the readings of the negative controls plus seven standard deviations. Using this criterion, the cutoffs were 0.220 and 0.545 for IgG and IgM, respectively. Statistical methods. Repeatability analysis was based on the evaluation of the DO results obtained by the CV, standard deviation (SD) and standard error (SE). Control charts of Levey Jennings were constructed from DO data using the Excel program. To analyze HEV seropositivity in pigs in the slaughterhouses and by geographic subregion, the frequencies of data were estimated, the confidence intervals (with a confidence level of 95%) and differences between proportions (based on Fisher’s exact test), with a confidence level of 95%; they are considered significant at p <0.05. All analysis was performed using GraphPad Prism tools 5 (GraphPad Software, Inc. La Jolla, USA).

RESULTS Repeatability and consistency of modified indirect ELISA tests to detect IgG and IgM antibodies. After determining the optimal dilution of the conjugate and the test samples, the repeatability of the test was evaluated by evaluating the CPP in six independent trials with two different operators. The CV values obtained for the CPP were 3.86% and 18.88% for IgG and IgM respectively (Table 1). The DO450 values of the CPP in each of the tests for the two antibodies were controlled throughout the study by means of Levey-Jennings graphics as shown in figure 1, the values obtained in each one of the determinations did not exceed the average value in more than two DE both for IgG as well as IgM. Similarly, it is noted that all the kit controls operated within the parameters defined Table1. Repeatability of indirect ELISA assays with conjugated swine anti-IgG and anti-IgM.

No 1a 2b 3a 4b 5b 6b X DE EE CV

DO450Conjugated swine anti-IgG *

DO450Conjugated swine anti-IgM *

CPP 3.351 3.196 3.466 3.170 3.444 3.421 3.346 0.118 0.045 3.86%

CPP 1.378 0.832 0.918 1.050 1.165 1.265 1.101 0.2079 0.08489 18.88%

*Dilution1:5000; a Values obtained by one of the operators, b tests thtat were done by the second operator. Each one of the 6 tests was done under the same conditions but on different days. CPP: Positive Pig Control; X: Average; DE: Standard Deviation; EE: Standard Error; CV Coefficient of variation.

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como control positivo en todos los ensayos, se utilizaron los CPP y CNP descritos anteriormente. Para evaluar la repetibilidad de los ensayos de ELISA modificada anti-IgG e IgM de cerdo, se realizaron seis ensayos consecutivos en días diferentes, con dos operarios distintos y bajo las mismas condiciones de laboratorio, y se obtuvo un coeficiente de variación (CV) menor del 20% en los valores brutos de absorbancia, por lo que se consideró que los ensayos realizados contaron con un nivel adecuado de repetibilidad (23,24). Estimación del valor de corte para la positividad de anticuerpos tipo IgG e IgM. La obtención del punto de corte para la positividad de anticuerpos tipo IgG e IgM se realizó con base en la desigualdad de Chebyshev (25), la cual establece que, cualquiera que sea la distribución probabilística de una variable aleatoria, no más de (1/k2)% de los valores de dicha distribución se encontrarán a más de k desviaciones estándar de la media. Para controlar la probabilidad de falsos positivos, se fijó en 0.0102 la probabilidad máxima tolerable, lo cual corresponde a punto de corte dado por el valor medio de las lecturas de los controles negativos más 7 desviaciones estándar. Usando este criterio los puntos de corte fueron 0.220 y 0.545 para IgG e IgM respectivamente. Métodos estadísticos. El análisis de repetibilidad se basó en la evaluación de las dispersiones de los resultados de las DO obtenidas, mediante el CV, la desviación estándar (DE) y el error estándar (EE). Las gráficas de control de Levey Jennings fueron construidas a partir de los datos de DO utilizando el programa de Excel. Para el análisis de seropositividad de HEV en cerdos en las plantas de beneficio y según la subregión geográfica, se estimaron las frecuencias de los datos, los intervalos de confianza (con un nivel de confianza del 95%) y las diferencias entre proporciones (con base en la prueba exacta de Fisher), con un nivel de confianza del 95%; se consideran significativos valores de p<0.05. Todos los análisis fueron realizados usando las herramientas del programa GraphPad Prisma 5 (GraphPad Software, Inc. La Jolla, USA).

RESULTADOS Repetibilidad y consistencia de las pruebas de ELISA indirecta modificadas para la detección de anticuerpos tipo IgG e IgM. Una vez determinada las diluciones óptimas de conjugado y de las muestras para el ensayo, se procedió a evaluar la repetibilidad de la prueba mediante la evaluación del CPP en seis

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(2) Mayo - Agosto 2015 ensayos independientes con dos operarios distintos. Los valores obtenidos del CV para el CPP fueron de 3.86% y 18.88% para IgG e IgM respectivamente (Tabla 1). Los valores de DO450 de los CPP en cada uno de los montajes de las pruebas para los dos anticuerpos, fueron controlados a lo largo del estudio mediante gráficos de Levey-Jennings como lo muestra la figura 1, los valores obtenidos en cada una de las determinaciones no excedieron el valor promedio en más de dos DE tanto para IgG como IgM. De igual manera se observó que todos los controles del kit funcionaron dentro de los parámetros definidos por el fabricante en cada una de las pruebas realizadas (datos no mostrados). Frecuencia de anticuerpos específicos para HEV en suero de cerdos de Antioquia. La frecuencia de positividad encontrada en los sueros de los porcinos muestreados en las plantas de beneficio de Antioquia, con los puntos de corte estimados en el estudio para la detección de anticuerpos IgG e IgM fue de 100% y 82.06%, respectivamente.

Figure 1. Control of the Variation of the DO450de Positive Pig Control values (CPP). A: Levey-Jennings graphic for 12 determinations in different days for CPP for IgG. B; Levey-Jennings graphic for 10 determinations on different days for CPP for IgM. DE: Standard deviation.

by the manufacturer in each of the tests (data not shown). Frequency of specific HEV antibodies in swine serum from Antioquia. The frequency of positivity found in the serum of pigs sampled in the slaughterhouses in Antioquia, with cut off points estimated in the study to detect IgG and IgM, was 100% and 82.06%, respectively.

La positividad para IgM en cada planta de beneficio fueron similares y oscilaron entre 74.49 y 87.98% (Tabla 2), con una diferencia significativa entre la planta A y las plantas B y E con valores p=0.0067 y p=0.0042 respectivamente. Al analizar la procedencia de los cerdos, se identificó que los animales muestreados provenían de seis de las nueve subregiones del departamento de Antioquia (Figura 2). Los porcentajes de cerdos positivos y los intervalos de confianza para la detección de anticuerpos IgM anti HEV según las subregiones de procedencia se muestran en la tabla 2. El porcentaje de cerdos positivos para IgM fluctuó entre 77.78% para la subregión Occidente y 88.89% para la subregión Nordeste (Figura 2), pero no se encontró diferencia significativa entre las regiones analizadas.

Table 2. Percentage of positive pigs to detect IgM anti-HEV antibodies per plant and subregion. A B C D E

N(+) 183(161) 98(73) 149(124) 188(159) 157(125)

Plant % 87.98 74.49 83.22 84.57 75.78

IC 92.31-82.37 82.76-64.69 88.84-76.24 89.42-78.60 82.27-68.32

Total

775(636)

82.06

84.70-79.18

Valle de Aburra North West Southeast East Northeast Total

N: Number of animals sampled. (+) Number of positive animals. 95% IC: Intervals of confidence of 95% for the proportion of positive animals.

N(+) 165(132) 405(336) 54(42) 84(71) 49(39) 18(16) 775(636)

Subregion % 80.00 82.96 77.78 84.52 79.59 88.89 82.06

IC 85.81-73.08 86.50-78.94 87.96-64.40 91.49-74.99 89.76-65.66 98.62-65.29 84.70-79.18

Forero - Hepatitis E virus infection in Antioquia pigs IgM positivity in each slaughterhouse were similar and ranged between 74.49 and 87.98% (Table 2), with a significant difference between Plant A and Plant B and E with values at p=0.0067 and p=0.0042, respectively. By analyzing the origin of the swine, it was seen that the sampled animals came from six of the nine subregions of the department of Antioquia (Figure 2). The percentages of positive pigs and confidence intervals for detecting IgM anti HEV antibodies by subregion of origin are shown in table 2. The percentage of pigs positive for IgM ranged from 77.78% for the West subregion and 88.89% for the Northeast subregion (Figure 2), but no significant difference was found between the regions analyzed.

Figure 2: Distribution of frequencies of the DO450 to detect antibodies in sampled pigs. A: Distribution of 1000 samples of pig serum, evaluated for IgG, with the cut-off point (PC) at 0,220. B. Distribution of 775 samples of pig serum evaluated for IgM, with the cut-off point (PC) at 0.545.

DISCUSSION Many of the reported tests for the detection of anti HEV antibodies in pigs and other animals use modified commercial immunoassays to detect antibodies of the animal of interest (8,16); however, there are few reports about the reliability of such modifications. Evaluating the repeatability of a diagnostic test is one of the most important parameters to determine its reliability (23). The CV for the CPP for IgG and IgM obtained from the modifications to the commercial test, on different days and with different operators, were within the acceptable ranges for a diagnostic test (25); however, it is necessary in future studies to reaffirm the data obtained from the modified assay by evaluating the serum with a specific validated case for detecting antibodies in pigs and establishing the diagnostic sensitivity and specificity of the test.

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DISCUSIÓN Muchos de los ensayos reportados para la detección de anticuerpos anti HEV en cerdos y otros animales utilizan inmunoensayos comerciales modificados para la detección de anticuerpos del animal de interés (8,16); sin embargo, son escasos los reportes acerca de la confiabilidad de dichas modificaciones. La evaluación de repetibilidad de una prueba diagnóstica es uno de los parámetros más importantes para determinar la viabilidad de la misma (23). Los CV para los CPP para IgG e IgM obtenidos de las modificaciones del ensayo comercial, tanto en días diferentes, como con operarios distintos, estuvieron dentro de los rangos de aceptación para una prueba diagnóstica (25), sin embargo, es necesario en futuros estudios reafirmar los datos obtenidos del ensayo modificado mediante la evaluación de los sueros con un estuche específico y validado para la detección de anticuerpos en cerdos y establecer la sensibilidad y especificidad diagnóstica de la prueba. Para cualquier ensayo serológico es fundamental la determinación del punto de corte, el cual se define como el nivel de actividad de anticuerpo que discierne el estatus positivo del negativo de un animal para un analito biológico particular (26). La forma más apropiada para calcularlo es utilizando sueros de referencia con estatus de infección conocido (25,26). Ante la ausencia de sueros de referencia, frecuentemente se emplean estimaciones aproximadas mediante la evaluación de la distribución de frecuencias de la DO del anticuerpo que se desea detectar en una población numerosa o el empleo del promedio de los valores de DO de los controles negativas y sumándole varias DS (27). En este estudio se obtuvo una distribución de frecuencias bimodal, en el caso de la detección de anticuerpos tipo IgG, por lo cual se hizo una primera aproximación al punto de corte usando una herramienta estadística de resolución de mezclas finitas (8,24,26), (datos no mostrados). A partir de aquí se pudo estimar un punto de corte en 3.31, que arrojó una seropositividad de 26% (datos no mostrados). Este valor podría sobreestimar la especificidad de la prueba, pues valores de DO 450 por ejemplo de 1.6 se declararían como negativos, aumentando el riesgo de tener una proporción de falsos negativos. Por lo tanto, se determinaron los puntos de corte mediante un segundo enfoque que consistió en establecer el valor de corte

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For any serological test it is essential to determine the cutoff, which is defined as the level of activity of antibody that discerns the positive status of the negative of an animal for a particular biological analyte (26). The most appropriate way to calculate it is by using the reference serum of known status (25,26). In the absence of reference serum, often rough estimates are used by evaluating the distribution frequencies of the OD of the antibody to be detected in a large population or using the average OD values of the negative controls are used and adding various DS (27). In this study a distribution of bimodal frequencies was obtained in the case of detecting IgG antibodies, for which a first approach to the cutting point was made using a statistical tool to resolve finite mixtures (8,24,26) (data not shown). From that it was possible to estimate a cut-off point of 3.31, which yielded a seropositivity of 26% (data not shown). This value may overestimate the specificity of the test, since DO450 values, for example of 1.6, would be declared negative, increasing the risk of having a proportion of false negatives. Therefore, the cutoff points were determined using a second approach that consisted of establishing the cut-off value based on the average values of DO450 of the negative controls plus 7 DS (27), decreasing the probability of false negatives, methodology which allows a more realistic approximation of the situation of virus positivity for pigs in this study. In this context, the results shown indicated that all animals that arrived at slaughterhouses in Antioquia in the study period (the average slaughter age in Antioquia is 22 weeks (28)), were exposed to HEV at some point in the production process. Studies of natural infection in pigs show that these are infected at some point after the titers of maternal antibodies for IgG have decreased (between 8-10 weeks of life) approximately between week 14 to 17. Their IgG antibodies can be detected in a high proportion of pigs at slaughter age (29), which is consistent with that observed in this study. Unlike IgG antibodies, IgM antibodies in naturally infected pigs decreased 4 to 7 weeks after infection, that is, between 15-17 weeks of age in a large amount of positive animals, but at slaughter age this ratio tends to decrease (29). The reason why in this study the proportion of pigs that are seropositive for IgM at slaughter age was high is unknown, but it could be related to the handling of animals in herds (density of animals on the premises, biosanitary management on farms, type of production, level of technology etc.) or greater pathogenicity of the virus circulating in the region.

basado en los valores del promedio de las DO 450 de las controles negativos más 7 DS (27), disminuyendo la probabilidad de falsos negativos, metodología que permite hacer una aproximación más realista de la situación de positividad para este virus en los cerdos del estudio. En este contexto, los resultados mostrados indicaron que todos los animales que llegaron a beneficio en las plantas de faenado de Antioquia en el periodo de estudio (la edad promedio de sacrificio en Antioquia es de 22 semanas (28)), estuvieron expuestos al HEV en algún punto en el proceso de producción. Los estudios de infección natural en cerdos muestran que estos se infectan tiempo después de que han disminuido los títulos de anticuerpos maternales tipo IgG, (entre las semana 8-10 de vida) luego seroconvierten aproximadamente entre las semana 14 a 17. Los anticuerpos propios tipo IgG pueden ser detectados en una proporción alta de los cerdos en la edad de sacrificio (29), lo que coincide con lo observado en este estudio. A diferencia de los anticuerpos tipo IgG, los anticuerpos tipo IgM en los cerdos infectados naturalmente disminuyen 4 a 7 semanas después de la infección, es decir que entre las semanas 15-17 de vida hay una gran proporción de animales positivos, pero en la edad de sacrificio esta proporción suele disminuir (29). La razón por la cual en este estudio la proporción de cerdos seropositivos para IgM en edad de beneficio fue alta se desconoce, sin embargo podría estar relacionada con el manejo de los animales en las piaras (densidad de animales en las instalaciones, manejo biosanitario en las granjas, tipo de producción, nivel de tecnificación etc.) o mayor patogenicidad del virus que circula en la región. Adicional a esto, la positividad para anticuerpos tipo IgM, sugiere infección reciente y aunque la viremia y la periodo de excreción son relativamente cortos en los cerdos (17), cabe la posibilidad de que una proporción importante de animales que estuvieron excretando virus al ambiente al momento del faenado. Las diferencias observadas en la positividad para IgM en las plantas de beneficio podrían estar relacionadas con el flujo de animales procedentes de las subregiones con mayor positividad, pues es poco probable que haya un aumento en la producción de IgM por la permanencia tan corta de los cerdos en cada planta antes del beneficio.

Forero - Hepatitis E virus infection in Antioquia pigs In addition to this, the positivity for IgM antibodies suggests recent infection and although viremia and the excretion period are relatively short in pigs (17), it is possible that a significant proportion of animals that were the environment were excreting the virus at the time of slaughter. The observed differences in positivity for IgM in slaughterhouses could be related to the flow of animals from the subregions with greater positivity, since it is unlikely to have increased in IgM production in the short stay at the slaughterhouse. HEV infection in pigs produced no apparent clinical signs or caused changes that were visible in the health inspections carried out in the slaughterhouse (29); however, given the high rates of positivity found, it is possible that the pigs may be have associated microscopic liver lesions. Pork meat and in particular livers are major part of the diet in some sectors of the Colombian population. The high percentage of recent infection in pigs at slaughterhouses suggests that livers sold in Antioquia may be contaminated with the virus, so it is advisable to take care to consume them after an adequate cooking process, since it has been shown that the virus is inactivated at temperatures above 70°C held for 10 minutes (30). The high seropositivity of IgG and IgM antibodies found in this study are greatly important to public animal health since it indicates that the virus is circulating on swine herds of department of Antioquia (and probably the country), and that a significant proportion of animals at slaughter age could be shedding the virus into the environment, which should draw the attention of the scientific community to study the dynamics of the virus in the country, and the health authorities to implement assessment and control measures to prevent the transmission of HEV to the swine production in the country. In conclusion, as far as the research group knows, this is the first serologic evidence of the presence of HEV in pigs at slaughtering age in Colombia, and although the values of antibody seropositivity in the animals in the study was high, it is necessary to investigate individual conditions that contribute to pigs for human consumption in Antioquia being exposed to the virus and therefore generate control measures to prevent the spread of the virus in swine production in the department.

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La infección por HEV en cerdos no produce signos clínicos aparentes, ni provoca cambios que sean visibles en las inspecciones sanitarias que se realizan en las líneas de beneficio (29); sin embargo, dados los altos porcentajes de positividad encontrados es posible que los cerdos puedan presentar lesiones hepáticas microscópicas asociadas. La carne de cerdo y en particular los hígados hacen parte importante de la dieta en algunos sectores de la población colombiana. El alto porcentaje de infección reciente en los cerdos en las plantas de beneficio siguiere que los hígados comercializados en Antioquia podrían estar contaminados con el virus, por lo que es recomendable tomar la precaución de consumirlos tras un buen proceso de cocción, pues se ha demostrado que el virus se inactiva a temperaturas por encima de 70ºC, durante 10 minutos (30). La alta seropositividad de los anticuerpos tipo IgG e IgM encontrados en este estudio son de gran importancia para la salud publica animal puesto que indican que el virus está circulando en buena parte de las producciones porcinas del departamento de Antioquia (y probablemente del país) y que una proporción considerable de los animales en edad de sacrificio podrían estar excretando virus al ambiente, lo cual debe llamar la atención de la comunidad científica para realizar estudios sobre la dinámica del virus en el país y a las autoridades sanitarias para implementar medidas de evaluación y control que permitan evitar la trasmisión del HEV entre las producciones porcinas del país. En conclusión, para conocimiento del grupo de investigación, esta es la primera evidencia serológica de la presencia de HEV en cerdos en edad de beneficio en Colombia y aunque los valores de seropositividad de anticuerpos en los animales del estudio fue alta, se hace necesario investigar las condiciones particulares que están contribuyendo a que los cerdos para consumo humano en Antioquia estén expuestos al virus y de esta forma generar medidas de control que impidan la diseminación del virus en las producciones porcinas del departamento.

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Forero - Hepatitis E virus infection in Antioquia pigs

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Rev.MVZ Córdoba 20(2):4614-4621, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Profile of canine patient with esophageal foreign bodies Perfil del paciente canino con cuerpos extraños esofágicos Carlos Rodríguez-Alarcón,1 Ph.D, Diana Beristain R,1* Ph.D, Ramón Rivera B,1 Ph.D, Eva Pérez M,2 Ph.D, Jesús Usón C,2 Ph.D. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Departamento de Ciencias Veterinarias, Hospital Veterinario Universitario, Ciudad Juárez, México. 2Universidad de Extremadura, Facultad de Veterinaria, Hospital Clínico Veterinario, Cáceres, España. *Correspondencia: diana.beristain@uacj.mx, marcela. 1

beristain@gmail.com

Received: September 2013; Accepted: August 2014.

ABSTRACT Objective. Determine the profile of the canine patient with esophageal foreign bodies to identify risk factors associated with the foreign bodies. Materials and Methods. This is a retrospective study made by the Veterinary Hospital Clinic of the Universidad de Extremadura (VHC). Different factors were analyzed in dogs with an endoscopic diagnosis of esophageal foreign bodies. Results. This pathology was more commonly found in young adult dogs and in small breeds. This pathology was present for the first time in the Portuguese Warren Hound, which was also the breed with the highest risk. Conclusions. The results obtained in this investigation are in agreement with the previous description of a patient that presents esophageal foreign bodies. Also, the Portuguese Warren Hound was found to be predisposed to this problem, with a higher risk factor than other breeds previously mentioned in the literature. To prevent esophageal foreign bodies, dogs should be fed raw meat and bones, especially small breeds. This pathology should always be kept in mind in dogs with esophagitis symptomology regardless of age, although it is most common in young adult dogs. Key Words: esophagitis, esophagoscopy, risk factor (Source: MeSH). RESUMEN Objetivo. Determinar el perfil del paciente canino que presenta cuerpos extraños esofágicos para identificar las características de riesgo al presentar esta entidad. Materiales y métodos. Este es un estudio retrospectivo realizado en el Hospital Clínico Veterinario de la Universidad de Extremadura (HCV). Se analizaron diferentes parámetros de los perros que presentaron un diagnóstico endoscópico de cuerpos extraños esofágicos. Resultados. Esta patología se presentó más comúnmente en perros adultos jóvenes y en pacientes de raza pequeña. Se presenta por primera vez al Podenco Portugués, el cual además representó la raza con mayor factor de riesgo. Conclusiones. Los resultados obtenidos en esta investigación concuerdan con lo descrito anteriormente en cuanto a las características del paciente con cuerpo extraño esofágico. Asimismo, se reporta el Podenco Portugués como predispuesto a esta entidad, con un factor de riesgo mayor al de otras razas anteriormente mencionadas en la literatura. Para prevenir los cuerpos extraños esofágicos, se debe alimentar con carne cruda y huesos a los perros, especialmente a los de raza pequeña. Siempre se debe tener en cuenta está patología en los perros con sintomatología de enfermedad esofágica sin importar su edad, pues su presentación es más común en perros adultos jóvenes. Palabras clave: Enfermedad esofágica, esofagoscopia, factor de riesgo (Fuente: MeSH). 4614

Rodríguez-Alarcón - Profile of canine patient with foreign bodies

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Esophageal foreign bodies are relatively common in the treatment of small animals, most frequently in dogs. They cause symptoms characteristic of esophagitis like dysphagia, ptyalism and regurgitation (1). Moreover, they can cause severe damage to the esophagus, producing severe esophagitis and cicatricle stenosis as sequela. For these reasons, immediate diagnosis of this pathology is important (2).

Los cuerpos extraños esofágicos son una entidad que se presenta con relativa frecuencia en la clínica de pequeñas especies, más frecuentemente en perros. Causan signología característica de enfermedad esofágica como disfagia, sialorrea y regurgitación (1). Además, pueden causar un daño severo al esófago; produciendo esofagitis severas y estenosis cicatrizales como secuela. Por estos motivos es importante el diagnóstico rápido de esta patología (2).

Esophageal foreign bodies are more common in dogs than in cats due to their eating habits and way of playing. Among dogs, it is most frequently seen in small breeds, thus research exists where dogs less than 10 kg are observed to be more greatly affected by esophageal foreign bodies. However, the weight range in some studies varies between 1.8 and 56.0 kg (3). The risk factor is defined as the characteristic or factor that is observed to be associated with an increase in probability that the sickness should occur. The term of risk implies that the presence of a factor increases the probability of adverse consequences (4). Among these factors is the breed of dog (5). The factor of relative risk or hazard ratio (HR) is interpreted in the following way: the sickness is HR times more probable to occur in animals exposed to the risk factor than those who have not been exposed (5). The objective of the present work was to determine characteristics of patients with esophageal foreign bodies to identify the risk factors of this condition.

MATERIAL Y METHODS Study Site. The present study was done at the Veterinary Hospital Clinic (VHC) of the University of Extremadura, Cáceres, Spain. Animals. The work was carried out with dogs with endoscopic diagnosis of an esophageal foreign body. The evaluation parameters were: origin of the patient (referred or internal), sex, age of the patient; dividing this segment in 5 groups: a) less than a year old, b) patients from 1 to 4 years old, c) from 5 to 7 years old, d) from 8 to 10 years old and d) older than 11. Also, the breed and weight of the patient were taken into account; with this criteria, groups were formed according to size of the breed according to the Federation Cynologique Internationale (FCI): a) miniature breeds or less than 6 kg, b) small breeds or from 6 to 11.9 kg, c) medium breeds or from 12 to 32.9 kg, d) large breeds or from 33 to 49.9 kg and d) giant breeds or more than 50kg.

Los cuerpos extraños esofágicos son más comunes en perros que en gatos debido a sus hábitos alimenticios y a su manera de jugar. Dentro de los perros, se ha visto que son más frecuentes en razas pequeñas, pues existen investigaciones donde se ha observado que perros menores de 10 kg son mayormente afectados por cuerpos extraños esofágicos, pero los rangos de peso en algunos estudios van de los 1.8 a 56.0 kg (3). El factor de riesgo está definido como la característica o factor, que al ser observado está asociado a un aumento de la probabilidad de que aparezca una enfermedad. El término de riesgo implica que la presencia de una característica aumenta la probabilidad de consecuencias adversas (4). Entre estas características se encuentra la raza del perro (5). El factor de riesgo relativo o razón de riesgo (RR) se interpreta de la siguiente manera: la enfermedad es RR veces más probable que ocurra en los animales expuestos al factor de riesgo que en aquellos que no han sido expuestos (5). El objetivo del presente trabajo fue determinar las características del paciente con cuerpos extraños esofágicos para identificar los factores de riesgo para presentar esta condición.

MATERIAL Y MÉTODOS Sitio de estudio. El presente estudio se llevó a cabo en el Hospital Clínico Veterinario (HCV) de la Universidad de Extremadura, Cáceres, España. Animales. El trabajo se realizó con perros diagnosticados con cuerpo extraño esofágico por medio de endoscopia. Los parámetros a evaluar fueron: procedencia del paciente (remitido o interno), sexo, edad del paciente; dividiéndose este segmento en 5 grupos: a) menores de un año, b) pacientes de entre 1 a 4 años, c) de 5 a 7 años, d) de 8 a 10 años y d) mayores de 11 años. También se tomó en cuenta la raza y el peso del paciente; con este criterio se formaron grupos de acuerdo con el tamaño de las razas según la Federación Cinológica Internacional (FCI):a)

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Experimental Design and Analysis of Statistics. This is a retrospective study carried out over the course of 10 years. With the results that were obtained, a data base was produced with the SPSS program, through which an analysis was made of the frequency of the different parameters and of contingency tables. Also, the risk factor was calculated for breeds of dogs that most frequently presented an esophageal foreign body through endoscopic diagnosis. In addition, the risk factor was calculated for the Spanish Greyhound and the Spanish Mastiff who were fed food scraps and bones. The total number of dogs, attended and sick, and the formula used can be seen in table 1. The dog breeds to be evaluated were considered as exposed, and every other breed as not exposed, while dogs with an esophageal foreign body were considered sick animals. Table 1. Formula for the relative risk factor, where exposed dogs are the breeds to be evaluated; not exposed are all other breeds and sick, animals with esophageal foreign objects. Sick

Healthy

Total

Exposed

a+b

Not exposed

c+d

Total

a+c

b+d

a+b+c+d

RESULTS During 10 years of study, a total of 6,770 dogs were treated by surgery. Through endoscopic diagnosis, thirty of those were found to have an esophageal foreign body, representing 0.44% of the treated patients. Esophageal foreign bodies represented 24.06% of digestive tract endoscopies and also represented 50% of diagnoses through esophagoscopy. Additionally, 57.69% of foreign bodies found through an endoscopy were esophageal, 36.58%were found in the stomach and only 5.76% in the duodenum. 67.85% of patients that had an esophagoscopy because of a foreign object were referred. In relation to the sex of the animals, 56.6% of patients that had an esophagoscopy because of a foreign object were females and 43.4% were males. Even through esophageal foreign objects were found in animals that ranged from 1 month to 9 years old, half the patients that had a foreign object in their esophagus were in the 1 to 4 year age group (Figure 1), with a mean of 2 years and 7 months.

razas miniatura o menores de 6 kg, b) razas pequeñas o de 6 a11.9 kg, c) razas medianas o de 12 a32.9 kg, d) razas grandes o de 33 a 49.9 kg y d) razas gigantes o de más de 50 kg. Diseño experimental y análisis estadístico. El presente es un estudio retrospectivo realizado a lo largo de 10 años. Con las fichas obtenidas se elaboró una base de datos en el programa SPSS, mediante el cual se realizaron análisis de frecuencia de los diferentes parámetros, y tablas de contingencia. También se calculó el factor de riesgo de las razas de perros que más frecuentemente presentaron cuerpo extraño esofágico como diagnóstico endoscópico. También se calculó el factor de riesgo a las razas Galgo Español y Mastín Español por ser alimentados con sobras de alimentos y huesos. El número total de perros atendidos y enfermos y la fórmula utilizada se puede observar en la tabla 1. Se consideraron como expuestos a los perros de la raza a evaluar, y los no expuestos todas las demás razas y como enfermos los animales con cuerpo extraño esofágico.

RESULTADOS

Durante 10 años de estudio un total de 6770 perros fueron tratados por el servicio de cirugía. De estos, 30 perros fueron diagnosticados con cuerpo extraño esofágico por vía endoscópica, representando el 0.44% de los pacientes tratados. Los cuerpos extraños esofágicos representaron el 24.06%, de las endoscopias del tracto digestivo y además representaron el 50% de los diagnósticos realizados por esofagoscopia. También, se encontró que 57.69% de los cuerpos extraños localizados endoscópicamente fueron esofágicos, 36.58% se encontraron en estómago y tan sólo 5.76% se localizaron en duodeno. El 67.85% de los pacientes en los que se realizó esofagoscopia por un cuerpo extraño fueron remitidos. Con relación al sexo de los animales, el 56.6% de los pacientes sometidos a esofagoscopia por cuerpo extraño fueron hembras, frente al 43.4% de machos. Aunque los cuerpos extraños esofágicos fueron observados en animales desde un mes de vida hasta los 9 años, la mitad de los pacientes que presentaron un objeto alojado en el esófago pertenecen al grupo de edad de 1 a 4 años (Figura 1), con una media de 2 años y 7 meses. El tamaño del paciente también influyó en la frecuencia de aparición de los cuerpos extraños

Rodríguez-Alarcón - Profile of canine patient with foreign bodies

Figure 1. Distribution of patients with esophageal foreign objects according to age. No dogs are older than 11.

The size of the patient influenced the frequency of appearance of esophageal foreign objects. The study found that almost half of the animals (48.28%) were less than 6 kg (Figure 2). The size of the patient was a parameter linked to its breed, which is why its influence was also analyzed noticing that 90% of esophagoscopies done because of foreign objects were on purebred dogs, while only 10% were done on mix breed dogs. This percentage is low if we take into account that 27.65% of all patients brought to the VHC were mix breed dogs. Among the purebreds the Portuguese Warren Hound (8 to 20 kg.) was the one that presented the most esophageal foreign objects (20%), followed by the Yorkshire Terrier (16.16%), Miniature Poodle (13.33%), West Highland White Terrier (10%) and others (Figure 3).

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Figure 2. Distribution of patients with esophageal foreign objects according to weight. No dogs were above 32 kg.

esofágicos, ya que se encontró que casi la mitad de los animales del presente estudio (48.28%) fueron menores a 6 kg (Figura 2). El tamaño del paciente es un parámetro ligado a su raza, por lo que se analizó también su influencia, advirtiendo que en los perros de raza pura se practican el 90% de esofagoscopias por cuerpos extraños, mientras que tan sólo se realizaron en el 10% de perros mestizos. Este porcentaje es escaso si se considera que de todos los pacientes que acuden a la consulta de cirugía del HCV, el 27.65% son mestizos. Dentro de las razas puras, el Podenco portugués (8 a20 kg.) fue el que más cuerpos extraños esofágicos presentó (20%), seguidos por orden descendente del Yorkshire Terrier (16.16%), Poodle miniatura (13.33%) y West Higland White Terrier (10%) y otros (Figura 3).

DISCUSIÓN El porcentaje de animales remitidos al HCV para la realización de diagnósticos y tratamiento por cuerpos extraños esofágicos es mayor al de la media de solicitud de esofagoscopias en general, es decir, los veterinarios externos remiten y solicitan esofagoscopias en un mayor número de pacientes cuando la patología es un cuerpo extraño, demostrando así conocer la utilidad de esta técnica en el tratamiento de esta patología.

Figure 3. Distribution of dogs with esophageal foreign objects and the relation to the total amount of cases brought in according to breed.

En el presente estudio, el porcentaje de perros diagnosticados endoscópicamente con cuerpos extraños esofágicos con relación al total de perros atendidos en la sección de cirugía del HCV es similar al presentado recientemente en otra investigación(6), donde mencionan que los cuerpos extraños esofágicos representan 0.32% de la consulta en el hospital, de igual forma, la cantidad de pacientes presentados con esta entidad durante el período de tiempo es similar al descrito por otros investigadores (2,3).

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DISCUSION The percentage of animals referred to the VHC for diagnoses and treatment of esophageal foreign objects is greater than the average of esophagoscopy requests in general. External veterinarians refer and request esophagoscopies to a greater number of patients when the pathology is a foreign object, proving that they recognize the usefulness of this technique in the treatment of this pathology. I n t h i s s t u d y, t h e p e r c e n t a g e o f d o g s endoscopically diagnosed with esophageal foreign objects in relation to the total of dogs attended in the surgery section of the VHC is similar to the one recently shown in another research (6) that mentions that esophageal foreign objects represent 0.32% of hospital visits. Similarly, the number of patients that visited this institution during the time period is similar to the one described by other researchers (2,3). At the same time, esophageal foreign objects were the most frequent digestive pathology condition diagnosed through endoscopy (24.06%). They also represent 57.69% of foreign objects in the digestive tract. This study has substantial differences with another retrospective research that showed that 62.96% of foreign objects were in the stomach, and 22.22% in the esophagus (7). On the other hand, Aprae et al (8) in 2004 mentioned that of 38 endoscopies on the digestive tract, 38% presented foreign objects, without differentiating between the esophageal and gastric. The data obtained in this research on the canine species as the only one that had esophageal foreign object endoscopy is similar to the bibliography. There it mentions that foreign objects are more common in dogs due to the habit of eating without chewing and their playfulness. Additionally, another retrospective study of gastrointestinal foreign objects, mentions that of 17 pets affected, just one was a cat (9). With regards to the sex of the animals in this study, despite having a slight majority of females, which has already been described by other authors (9, 10) this does not represent a meaningful difference. The age group with most patients was from 1 to 4 years old. This number coincides with a previous study where the average age of dogs with esophagitis by foreign objects was 4 years (10). In human medicine, esophageal foreign

Asimismo, los cuerpos extraños esofágicos fueron la condición más frecuente de todas las patologías digestivas diagnosticadas por endoscopia (24.06%). Además, representaron el 57.69% de los cuerpos extraños del tracto digestivo. En este sentido en el presente estudio se registraron diferencias sustanciales con otra investigación retrospectiva en cuya experiencia 62.96% de los cuerpos extraños fueron de estómago, y 22.22% de esófago (7). Por otro lado, Apreaet al (8) en 2004 sólo mencionan que de 38 endoscopias del tracto digestivo, 38% presentaron cuerpos extraños, pero no señalan diferencias entre los esofágicos y los gástricos. El dato obtenido en este estudio sobre la especie canina como la única presentada a endoscopia por cuerpos extraños esofágicos, es similar a lo descrito en la bibliografía, donde se menciona que los cuerpos extraños son más comunes en los perros debido al hábito de comer sin masticar los alimentos y a su gusto por los juegos. De igual forma, en otro estudio retrospectivo de cuerpos extraños gastrointestinales se menciona que de 17 mascotas afectadas sólo uno era gato (9). Con respecto al sexo de los animales representados en este estudio, a pesar de existir una ligera mayoría de hembras, lo que ya es descrito por otros autores (9,10), esto no representa una diferencia significativa. El grupo de edad donde se presentaron más pacientes fue el de 1 a 4 años, dato que coincide por lo presentado en un estudio donde la media de edad de los perros con esofagitis por cuerpos extraños fue de 4 años (10). En medicina humana, los cuerpos extraños esofágicos son más frecuentes en niños de entre 1 y 3 años debido a su inquietud y a la tendencia a introducirse objetos en la boca y simultáneamente llorar, correr o jugar (11). A priori, se podría pensar que los cachorros son más propensos a esta patología que los perros adultos, tanto por su inexperiencia y hábitos de juego como por la extrapolación que se hace de los hallazgos en medicina humana. Sin embargo, los datos presentados en este estudio muestran que no existe evidencia que apoye esta afirmación, pues los perros menores de un año sólo representaron el 23.33% de los pacientes con cuerpo extraño esofágico en el presente trabajo. En la presente investigación se confirma que son los animales de talla pequeña los más afectados por esta patología ya que se encuentra alrededor de la mitad de los animales de nuestro estudio (48.28%) fueron menores a 6 kg (Figura 2). De hecho, la tasa de pacientes es muy elevada si se considera que las razas afectadas concurren

Rodríguez-Alarcón - Profile of canine patient with foreign bodies objects are most common in children between 1 and 3 years old because of their restlessness and their tendency to put things in their mouth while crying, running or playing (11). One could assume that puppies have a higher tendency to suffer from this pathology due to their inexperience and playing habits, and the extrapolation of the findings in human medicine. Data from this study shows that there is no evidence to support that assumption, because dogs under 1 year of age only represented 23.33% of patients with esophageal foreign objects. This research confirms that small size dogs are more affected by this pathology, showing that almost half the animals in the study (48.28%) were less than 6 kg (Figure 2). As a matter of fact, the percentage of patients is very high if we take into account that the affected breeds visit the VHC’s surgery service in a low proportion; the Yorkshire terrier representing only the 3.39%, and the West highland terrier and the Warren Hound representing only 2% of the total. The results coincide with those of other authors. There is a retrospective study conducted in 19 veterinary hospitals in the United States in a period of 6 years where the esophageal obstruction caused by dental hygiene treats is described. Of all dogs with this problem the majority were small breeds, representing an 83.9% (12). At The same time, other studies mention several small breeds with a tendency to have this problem, among them are Poodle (9), Yorkshire terriers (10, 13) and West Highland white terrier (13, 14). It is confirmed in the literature that along with the tendency of the West Highland White Terrier, there is an increase in the number of cases because of the new practice of feeding dogs with raw food and bones (7, 15). It is evident that these small breeds have a tendency to have esophageal foreign objects, but other small breeds with similar habits like the Chihuahua, the miniature Pinscher and Pomeranian do not present this phenomena at the same rate. For this reason, it is necessary to investigate why certain small breeds have a higher tendency, in order to establish if the Miniature Poodle, the West Highland White Terrier and the Yorkshire Terriers have a relatively narrower esophagus or thorax, or a difference in the size of their abdominal esophagus; this supports the importance of the abdominal esophagus, that according to the La Place law, the greater the size the greater the intra-abdominal pressure producing higher resistance (16). Additionally, a study showed that the portion of the abdominal esophagus has different sizes according to the breed, even reaching the thorax (17).

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en escasa proporción en el servicio de cirugía del HVU, donde el Yorkshire terrier únicamente representa 3.39%, y tanto el West Higland Terrier como el Podenco tan sólo 2% del total. Los resultados del estudio concuerdan con los obtenidos por otros autores, pues existe un estudio retrospectivo realizado en 19 hospitales veterinarios de Estados Unidos en un período de 6 años, donde se describe la obstrucción esofágica causada por premios para limpieza dental. De los perros que presentaron este problema la mayoría fueron de raza pequeña representando un 83.9% (12). Asimismo, otros estudios mencionan a diversas razas pequeñas como las que estan predispuestas a presentar esta entidad, entre ellas el Poodle (9), Yorkshire terriers (10,13) y West Highland White Terrier (13,14). En la literatura está confirmado que junto con la predisposición del West Highland White Terrier existe un aumento de los casos por la moda de alimentar a los perros con “huesos y comida cruda” (BARF en inglés) (7,15). Está claro que estas razas pequeñas presentan una predisposición a presentar cuerpos extraños esofágicos; sin embargo, en otras razas pequeñas, de hábitos de vida similares como el Chihuahueño, Pinscher miniatura o Pomerania no se da este fenómeno en igual medida. Por este motivo es necesario investigar por qué ciertas razas pequeñas presentan una mayor prevalencia, para establecer si los Poodles Miniatura, West Highland White Terrier y Yorkshire Terriers presentan un esófago o tórax relativamente más estrecho o alguna diferencia en el tamaño del esófago abdominal; esto último apoyado en que la longitud el esófago abdominal es muy importante, pues según la ley de La Place, a mayor tamaño la presión intraabdominal aumenta y produce una mayor resistencia (16). Además, en una investigación encontraron que la porción del esófago abdominal tiene diferentes medidas según la raza, incluso localizándose en el tórax (17). Con la presente investigación también se ha publicado una comunicación donde se reporta al Podenco Portugués como la raza con más diagnósticos de cuerpos extraños esofágicos (17). Es fácil pensar que esta raza es la más afectada al ser común en la península, y por la tendencia a alimentar con sobras y huesos a los perros de cacería en Extremadura, España. Sin embargo, otras razas alimentadas con huesos comúnmente presentadas al HCV como el Mastín Español presentó un factor de riesgo muy bajo y el Galgo Español no presentó ningún cuerpo extraño esofágico (Tabla 2).

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Along with this research a report has been published mentioning that the Portuguese Warren Hound is the breed with more diagnoses of esophageal foreign objects (17). It is easy to think that this breed is the most affected because of how common it is in the Peninsula and the tendency to feed hunting dogs with bones and scraps in Extremadura, Spain. However, other breeds fed with bones commonly brought into the VHC like the Spanish Mastiff, had a very low risk factor and the Spanish Greyhound did not present esophageal foreign objects (Table 2). The risk factor is a characteristic or factor associated to the increase in the probability of developing a sickness (4,5). The breed can, therefore, be considered a risk factor (5). Based on this data one concludes that there is a tendency of the Portuguese Warren Hound to have esophageal foreign objects. This breed’s relative risk factor is 9.81, the highest of the study, even higher than the breeds traditionally considered of high risk like the Yorkshire Terrier and the Poodle. A limiting factor of this study is the number of patients brought in with esophageal foreign objects; nevertheless, there are other publications with a similar number of patients (2, 3, 6). It is important to take into account that to calculate the relative risk prevalence rate, the population is all the patients that visited a veterinary school clinic or a reference clinic (18) as in the case of the VHC of the Universidad de Extremadura. In conclusion the results of this research coincide with what has been previously described in terms of characteristics of the patient with esophageal foreign objects. It is also reported that the Portuguese Warren Hound has a predisposition to suffer this ailment, with a higher risk factor than other breeds in Spain. This pathology always needs to be taken into account with dogs with esophageal sickness symptomatology regardless of its age, because it is more common in young adult dogs. Finally, to prevent esophageal foreign objects, dogs, especially small breeds, should not be fed raw meat and bones.

Table 2. Relative risk factor of different dog breeds with esophageal foreign objects. Total dogs brought in

Total dogs with esophageal foreign objects.

Relative risk to have esophageal foreign object

Portuguese Warren Hound

135

9.81

York-Shire Terrier

235

5.5

Poodle

300

3.3

Spanish Mastiff

329

0.05 0.0

Breed

Spanish Greyhound

191

Total dogs

6770

El factor de riesgo es una característica o factor asociado con un aumento en la probabilidad de que aparezca una enfermedad (4,5). Por lo tanto, la raza puede ser considerada como un factor de riesgo (5). Con baseen estos datos, se concluye que existe predisposición del Podenco Portugués a presentar cuerpos extraños esofágicos, pues el factor de riesgo relativo de 9.81 es el más elevado del estudio, siendo mayor que el de razas tradicionalmente consideradas de alto riesgo como el York-Shire Terrier y Poodle. Como limitante de este estudio se tiene el número de pacientes presentados con cuerpo extraño esofágico; sin embargo, existen publicaciones con un número similar de pacientes (2,3,6). Es importante considerar que para el cálculo de las tasas de prevalencia de riesgos relativos se pueden tomar en cuenta la como población a todos los pacientes que hayan acudido a un hospital de enseñanza o de referencia (18), como el caso del HVU de la Universidad de Extremadura. En conclusión los resultados obtenidos en esta investigación concuerdan con lo descrito anteriormente en cuanto a las características del paciente con cuerpo extraño esofágico. Empero, se reporta el Podenco Portugués como predispuesto a esta entidad, con un factor de riesgo mayor que el de otras razas en España. Siempre se debe tener en cuenta está patología en los perros con sintomatología de enfermedad esofágica sin importar su edad, pues su presentación es más común en perros adultos jóvenes. Finalmente, para prevenir los cuerpos extraños esofágicos, no se debe alimentar con carne cruda y huesos a los perros, especialmente a los de raza pequeña.

Rodríguez-Alarcón - Profile of canine patient with foreign bodies

4621

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Rev.MVZ Córdoba 20(2):4622-4628, 2015. ISSN: 0122-0268 SHORT COMMUNICATION

Evaluation of macrominerals concentrations in blood of lactating and dry Desi cows Evaluación de concentraciones de macrominerales en sangre de vacas Desi lactantes y secas Zafar Iqbal Khan,1 Ph.D, Alireza Bayat,2 Ph.D, Kafeel Ahmad,1 Ph.D, Muhammad Sher,3 Ph.D, Muhammad Khalid Mukhtar,1 Ph.D, Zafar Hayat,4 Ph.D, Vincenzo Tufarelli,5* Ph.D. University of Sargodha, Department of Biological Sciences, Pakistan. 2Animal Production Research, MTT, FI 31600, Jokioinen, Finland. 3University of Sargodha, Department of Chemistry, Pakistan. 4 University of Sargodha, Department of Animal Sciences, Pakistan. 5University of Bari ‘Aldo Moro’, Department of Emergency and Organ Transplantation, Section of Veterinary Science and Animal Production, Bari, Italy. *Correspondence: vincenzo.tufarelli@uniba.it 1

Received: October 2014; Accepted: March 2015.

ABSTRACT Objective. This study was conducted during winter season at rural livestock farm of district Sargodha, Pakistan, in order to define the macrominerals status in blood plasma of lactating and dry Desi breed cows . Material and methods. Twenty lactating and twenty dry cows were used and their blood plasma was analyzed for Ca, Mg, Zn, Cu and Fe using atomic absorption spectrophotometer. Results. In lactating cows, the plasma Ca concentration was lower than dry cows (6.8 vs. 7.6 mg/dl, p<0.001), while Mg concentration was similar between lactating and dry cows. Plasma Zn concentration in lactating cows was higher than dry cows (0.78 vs. 0.60mg/l, p<0.01) and it resulted lower than the normal range in both groups. Plasma Cu level in lactating cows was lower than dry cows (0.56 vs. 0.76 mg/L, p<0.001) and it was lower than the normal range only in lactating cows. Lactating cows resulted in higher plasma Fe concentration compared to dry cows (3.8 versus 2.6 mg/L; p<0.01). Conclusions. From our findings, it can be concluded that the observed minerals level meets the needs of ruminants and the plasma level of different minerals is affected by the physiological stages of cows. Key words: Dry cow, lactating cow, minerals, plasma (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. Este estudio se realizó durante la estación de invierno en la granja de ganado rural del distrito de Sargodha, Pakistán, con el fin de definir el estado de macrominerales en el plasma sanguíneo de vacas lactantes y secas de raza Desi. Materiales y métodos. Veinte vacas lactantes y veinte vacas secas fueron utilizadas y se analizó el plasma para el Ca, Mg, Zn, Cu y Fe utilizando un espectrofotómetro de absorción atómica. Resultados. En las vacas lactantes, la concentración de Ca en plasma fue menor que en las vacas secas (6.8 frente a 7.6 mg/dl, p<0.001), mientras que la concentración de Mg fue similar entre las lactantes y las vacas secas. La concentración plasmática de Zn en las vacas lactantes fue mayor que en las vacas secas (0.78 frente a 0.60 mg/L, p<0.01) y resultó inferior al rango normal en ambos grupos. Nivel de plasma de Cu en vacas lactantes fue inferior al de las vacas secas (0.56 vs a 0.76 mg/L, p<0.001) y fue inferior al rango normal sólo en las vacas lactantes. Las vacas lactantes resultaron en mayor concentración de Fe plasmático en comparación con las vacas secas (3.8 frente a 2.6 mg/l, p<0.01). Conclusiones. A partir de los resultados, se puede concluir que el nivel de minerales observados satisface las necesidades de los rumiantes y el nivel plasmático de diferentes minerales se ve afectado por las etapas fisiológicas de las vacas. Palabras clave: Plasma, minerales, vacas en lactación, vaca seca (Source: CAB). 4622

Khan - Macrominerals status in Desi breed Cows

4623

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Livestock needs the balanced and suitable levels of all the required nutrients for their animal health and production in any physiological s ta g e ( 1 ). M i n e ra l s r e p r e s e n t e sse nt i a l nutrients having a pronounced function in the life of organisms as their imbalances exert undesirable effects, especially in ruminants. Various microelements and some macro elements have been known to be very essential for livestock growth (2,3). Microelements function as cofactors are involved in many structural molecules in living organisms (2,4).

El ganado necesita niveles balanceados y adecuados de todos los nutrientes que se requieren para su salud zoosanitaria y para la producción en cualquier etapa fisiológica (1). Los minerales representan nutrientes esenciales que tienen una función pronunciada en la vida de los organismos, ya que su desequilibrio ejerce efectos no deseados, específicamente en el caso de los rumiantes. Se han identificado varios microelementos y algunos macroelementos que son esenciales para el crecimiento del ganado (2,3). Los microelementos funcionan como cofactores involucrados en varias moléculas estructurales de los organismos vivos (2,4).

The elemental composition of body tissue fluids commonly reflects the dietary level of ruminants to a certain extent, depending on the animal tissue fluid and the mineral element in question. Chemical composition of animal tissue fluids can therefore be employed to assess the range of mineral elemental adequacies in ruminants. The blood plasma is an excellent indicator of minerals in animals, and also can be easily obtained from the animal without slaughtering procedures (2). Although some information is attainable on the normal mineral profile of Sahiwal cattle (5), however very little information is available on the mineral status of Desi cows. Therefore, the aim of this investigation is to evaluate the mineral status of lactating and dry cows comparatively. It is expected that the results will be useful for formulating the mineral mixtures to overcome the deficiency and toxicity of different minerals in this livestock species.

MATERIALS AND METHODS Study site. Pakistan is mainly an agricultural country with an arid and semi-arid continental subtropical climate. It is located between 23 and 36o N latitude and 60 and 75° E longitude. The present investigation was conducted on Desi breed cows reared in the district of Sargodha, at a rural livestock farm during the winter season of 2013. The district of Sargodha is located between 30° 05′ N longitude and 72° 67′ E latitude and its altitude is 180 m above sea level. Different improved pastures as feeding sites for animals are possessed by the livestock farm. The pastures were fertilized and irrigated with tubewell and canal water. The main forage species available to animals during the winter were Medicago sativa and Trifolium alexandrinum as major forages, and Cichorium intybus, Brassica compestris, and Avena sativa as minor forages. The pasture was the main source of feeding for dairy cattle during the research period.

La composición elemental de los fluidos del tejido corporal normalmente refleja en cierta medida los niveles dietéticos de los rumiantes, dependiendo del fluido de tejido animal y del elemento mineral en cuestión. Por lo tanto, la composición química de los fluidos de tejido animal puede ser empleada para evaluar el qué tan adecuado es el nivel de minerales elementales en los rumiantes. El plasma sanguíneo es un excelente indicador de los minerales presentes en animales y a la vez puede obtenerse fácilmente sin necesidad de procedimientos de matanza (2). Aunque es posible acceder a cierta información del perfil mineral del ganado Sahiwal (5), hay muy poca información disponible acerca del estado de los minerales en las vacas Desi. Por lo tanto, el objetivo de esta investigación es evaluar comparativamente el estado de los minerales en vacas secas y lactantes. Se espera que los resultados sean útiles para formular las mezclas minerales que permitan superar la deficiencia y la toxicidad de distintos minerales en esta especie de ganado.

MATERIALES Y MÉTODOS Lugar del estudio. Pakistán es un país principalmente agrícola con clima continental subtropical árido y semiárido. Está ubicado entre las latitudes 23 y 36° norte y las longitudes 60 y 75° este. La presente investigación se realizó en vacas de raza Desi criadas en el distrito de Sargodha, en una finca ganadera rural durante el invierno de 2013. El distrito de Sargodha está ubicado entre las latitudes 30° 05´norte y 72° 67’ este, con una altitud de 180 m sobre el nivel del mar. La finca ganadera posee distintos pastizales mejorados que sirven como lugar de alimentación para los animales. Los pastizales fueron fertilizados y regados con agua de pozos entubados y de canales. Las principales especies de forraje disponibles para los animales durante el invierno fueron Medicago sativa y Trifolium alexandrinum en mayor medida,

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Animals, sample collection and analysis. Twenty lactating and twenty dry Desi cows, with an average body weight of 315 ± 37 kg (mean ± standard deviation) and having 2-5 years old of age, were chosen and considered as experimental groups. About 20 ml of blood from each animal was obtained in a clean sterilized glass test tube having heparin, as an anticoagulant, through jugular vein three times from October to December by one month interval at 11:00 am. Blood was centrifuged (3.000 rpm × 15-30 min) and separated plasma was stored at -20°C until analysis. Wet digestion using perchloric acid and nitric acid (6). The plasma minerals including calcium (Ca), magnesium (Mg), copper (Cu), zinc (Zn) and iron (Fe) were determined using atomic absorption spectrophotometer (Perkin Elmer Corp.) according to the method of Akhtar et al (3). Statistical analysis. Data were subjected to statistical analysis using the SPSS software and one-way analysis of variance (ANOVA) worked out. Statistical significance between the mean values was tested at p<0.05 level (7,8).

RESULTS Mean plasma concentrations for Ca, Mg, Zn, Cu and Fe in lactating and dry cows are presented in table 1. Plasma Ca concentration was significantly higher in dry compared to lactating cows (7.6 versus 6.8 mg/dl; p<0.001). Plasma Mg level was higher, but not significantly, in lactating compared to dry cows (1.60 versus 1.20 mg/ dl; p>0.05). Significant higher blood plasma Zn concentration was found in the lactating cows compared to the dry cows (0.78 versus 0.60 mg/l; p<0.01). The Cu concentration of plasma was significantly lower in lactating compared to dry cows (0.56 versus 0.76 mg/l; p<0.001). The Table 1. Mineral plasma concentrations of lactating and dry Desi cows. Mineral

Critical value1

Lactating cows

Dry cows

Significance 2

Ca, mg/dl

8.00

6.8 ± 0.153

7.6 ± 0.09

***

Mg, mg/dl

2.00

1.6 ± 0.04

1.2 ± 0.03

Zn, mg/L

0.80

0.78 ± 0.08

0.60 ± 0.05

Cu, mg/L

0.65

0.56 ± 0.07

0.76 ± 0.04

***

Fe, mg/L

1.10

3.8 ± 0.03

2.6 ± 0.10

According to McDowell and Arthington (13) and McDowell (16); 2 **, p < 0.01; ***, p < 0.001; NS, not significant ; 3 mean ± standard error. 1

y en menor medida Cichorium intybus, Brassica compestris y Avena sativa. Los pastizales fueron la principal fuente de alimentación para el ganado lechero durante el periodo de investigación. Animales, recolección de muestras y análisis. Se eligieron veinte vacas Desi lactantes y veinte secas, con un peso corporal promedio de 315±37 kg (media±desviación estándar) y una edad de 2 – 5 años, que fueron consideradas como grupos experimentales. Se obtuvieron 20 ml de sangre de cada animal en un tubo de ensayo de vidrio limpio y esterilizado, con heparina como anticoagulante, extraídos de la yugular tres veces de octubre a diciembre a intervalos de un mes a las 11:00 am. La sangre se centrifugó (3.000 rpm × 15-30 min) y el plasma separado se almacenó a una temperatura de -20°C hasta ser analizado. Luego se hizo una digestión húmeda utilizando ácido perclórico y ácido nítrico (6). Se determinaron los materiales del plasma, incluyendo calcio (Ca), magnesio (Mg), cobre (Cu), zinc (Zn) y hierro (Fe), utilizando un espectrómetro de absorción atómica (Perkin Elmer Corp.) según el método de Akhatar et al (3). Análisis estadístico. Los datos fueron sometidos a un análisis estadístico utilizando software SPSS y se realizó un análisis de varianza en un solo sentido (ANOVA). La prueba de significación estadística entre los valores de medios se hizo a un nivel de p<0.05 (7,8).

RESULTADOS La concentración media de Ca, Mg, Zn, Cu y Fe en plasma de vacas lactantes y secas se relaciona en la tabla 1. La concentración de Ca en plasma fue significativamente mayor en vacas secas en comparación con vacas lactantes (7.6 frente a 6.8 mg/dl; p<0.001). La concentración del nivel de Mg en plasma fue mayor, pero no de manera significativa, en vacas lactantes en comparación con vacas secas (1.60 frente a 1.20 mg/dl; p>0.05). Se encontró una concentración en plasma de Zn significativamente mayor en las vacas lactantes en comparación con las vacas secas (0.78 frente a 0.60 mg/l; p<0.01). La concentración de Cu en plasma fue significativamente menor en vacas lactantes en comparación con vacas secas (0.56 frente a 0.76 mg/l; p<0.001). La concentración de Fe en plasma fue significativamente mayor en vacas lactantes en comparación con vacas secas (3.8 frente a 2.6 mg/l; p<0.01). DISCUSIÓN Otros Autores (5,9) ya han reportado diferencias significativas en las concentraciones de Ca en plasma en las distintas etapas fisiológicas de las

Khan - Macrominerals status in Desi breed Cows Fe concentration in blood plasma was significantly higher in lactating cows compared to dry cows (3.8 versus 2.6 mg/l; p<0.01).

DISCUSSION Significant differences in plasma Ca concentrations in cows in different physiological stages, similarly to our results, have been previously reported by other Authors (5,9). In the present investigation, the low plasma Ca concentrations in lactating animals might be due to the physiological status of the animals; since blood Ca concentration is under the control of hormones, such as calcitonin and parathormone, acting on the kidneys, intestines and bones, and in dry cows, the blood levels of some vitamins which are under the control of these hormones increasing with the beginning of lactation (10). When ruminants start the lactation period, a reduction in plasma Ca concentration takes place due to high Ca requirements for milk production, and then Ca level starts to increase due to decreasing milk yield (11,12). In both dry and lactating groups, the plasma Mg concentrations were lower than the suggested value of 2 mg/dl for ruminants as described by Xin et al (13). Low plasma Mg concentration would be expected due to low Mg concentration in the forage and the mineral supplement consumed. The findings of the present investigation are also consistent with those reported by Khan et al (14) who reported similar low Mg concentration in the blood plasma of cattle and buffalo indicating the deficiency of this element. The most plausible reasons for low plasma Mg concentration might be the low absorption capacity of Mg in the gastrointestinal tract of animals (15) and the low Mg concentration in forage and mineral supplement. Plasma Zn concentrations of cows in both physiological stages were below the normal range of 0.80 mg/L suggested by McDowell (16). However, no animal in both groups exhibited clinical signs of Zn deficiency such as rough skin with lesions. Other elements are involved in Zn metabolism in non ruminants, although in ruminants no such interactions with other elements have been yet reported (16,17). It has also been reported that when Zn is bound to cell wall constituents, its bioavailability might reduce in livestock (18). Therefore, low Zn availability in animals in the present investigation might be due to such factors, hindering its availability. However, results of the current study are in agreement with the findings of other trials (19-21). The Cu concentration in plasma of lactating cows was lower than the critical concentration

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vacas. En la presente investigación, las bajas concentraciones de Ca en animales lactantes puede deberse al estado fisiológico de los animales; dado que la concentración de Ca en sangre está bajo el control de las hormonas, tales como la calcitonina y la paratirina, que actúan sobre los riñones, intestinos y huesos, y en vacas secas, los niveles en sangre de algunas vitaminas que están controladas aumentan con el inicio de la lactancia (10). Cuando los rumiantes inician el periodo de lactancia, ocurre una reducción en la concentración de Ca en plasma debida a los altas exigencias de Ca para producir leche; posteriormente, el nivel de Ca empieza a aumentar conforme disminuye la producción de leche (11,12). Tanto en los grupos secos como en los lactantes, las concentraciones de Mg en plasma fueron menores al valor de 2 mg/dl sugerido para rumiantes según Xin et al (13). Se podría esperar una baja concentración de Mg en plasma debido a la baja concentración de Mg en el forraje y en el suplemento mineral consumidos. Los hallazgos de la presente investigación también son consistentes con los hallazgos reportados por Khan et al (14), quien reportó una baja concentración de Mg en el plasma sanguíneo de vacunos y búfalos similar, indicando la deficiencia de este elemento. Las razones más plausibles para explicar la baja concentración de Mg en plasma pueden ser la baja capacidad de absorción de Mg en el tracto gastrointestinal de los animales (15) y la baja concentración de Mg en el forraje y en el suplemento mineral. Las concentraciones de Zn en las vacas de ambos estados fisiológicos estuvieron por debajo del rango normal de 0.80 mg/L sugerido por McDowell (16). Sin embargo, en ambos grupos ningún animal presentó signos clínicos de deficiencia de Zn tales como una textura de piel áspera con lesiones. En no rumiantes, hay otros elementos involucrados en la metabolización de Zn, aunque en rumiantes no se han reportado aún interacciones tales con otros elementos (16,17). También se ha reportado que cuando el Zn está ligado a los componentes de la pared celular, su biodisponibilidad se puede ver reducida en el ganado (18). Por lo tanto, la baja disponibilidad de Zn en los animales que se observó en la presente investigación puede ser debida a dichos factores, los cuales dificultan su disponibilidad. Las concentraciones de Cu en vacas lactantes estuvieron por debajo de la concentración crítica de 0.65 mg/L sugerida por McDowell (16). Sin embargo, en el caso de vacas secas, el mayor nivel en la concentración de Cu comparado con el valor crítico sugiere que estos animales sufren de deficiencia de Cu. Investigadores en Paquistán (5,21), Colombia (22) y Nicaragua ya han reportado

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of 0.65 mg/L suggested by McDowell (16). However, in dry animals, the higher plasma Cu concentration compared to the critical value suggests that these animals do suffer from Cu deficiency. Similar differences in plasma Cu concentration have already been reported between different physiological groups of ruminants by researchers in Pakistan (5,21), Colombia (22) and Nicaragua (23). These differences may be due to difference in geographical areas because of the blood mineral concentrations in animals have been reported to be differ from area to area (24). Contrary to our findings, Asif et al (5) reported significant lower Cu in plasma of cattle; however, the reason is still unclear. The Fe plasma concentrations were sufficiently higher than the critical value of 1.10 mg/L suggested by McDowell (16). It has been reported that Fe deficiency is not a relevant problem in ruminant species and it only occurs when there is some loss of blood (15). Plasma Fe levels similar to the values obtained in our investigation have previously been reported for various classes of animals (22,25). Availability of Fe in blood plasma is dependent on many factors; for instance, in some cases, high concentrations of phosphorus and phytate in the diet may reduce its absorption due to formation of insoluble complexes in the intestinal tracts of animals (17). In fact, Fe deficiency is not commonly widespread for grazing ruminants due to high concentrations of Fe in pasture as well as contamination of forages by soil particles and both these factors contribute much to the Fe requirements of animals (12). The Fe deficiency becomes a problem when livestock are kept on low Fe content forages, and supplementation of this element may reduce weight losses in lactating animals and cause very rapid weight compensation in suckling animals (12). The Fe deficiency has been reported in some regions of the world at a time when ruminants grazed forage plants grow on sandy soils and have heavy insects or parasite infestation, then Fe supplementation has been useful for the suffering animals. The blood levels, as well as the condition of the ruminants have been improved under supplementation regime (12,26). It has also been investigated that Fe supplementation shows no response in older animals consuming ordinary diets. However, Fe deficiency exists and in some cases, its supplementation exhibit marked improvement in the reproduction potential of the ruminants (10). In our investigation, the animal s showed no Fe deficiency but it is possible that its supplementation would encourage reproduction capacity of the livestock grazing therein as Fe levels in blood plasma was lower than the suggested level.

diferencias similares en la concentración de Cu en plasma entre distintos grupos fisiológicos de rumiantes. Dichas diferencias pueden deberse a las diferencias de las zonas geográficas, ya se ha reportado que las concentraciones de minerales en sangre de los animales difieren de una zona a la otra (24). A diferencia de nuestros hallazgos, Asif et al (5) reportó un nivel de Cu en plasma significativamente menor en el ganado; sin embrago, la razón aún no es clara. Las concentraciones de Fe en plasma fueron suficientemente mayores al valor crítico de 1.10 mg/L sugerido por McDowell (16). Se ha reportado que la deficiencia de Fe no es un problema pertinente en las especies rumiantes y que ocurre únicamente cuando hay una pérdida de sangre (15). Para varias clases de animales, niveles de Fe en plasma similares a los valores obtenidos en nuestra investigación ya han sido reportados (22,25). La disponibilidad de Fe en plasma depende de múltiples factores; por ejemplo, en algunos casos las altas concentraciones de fósforo y fitato en la dieta pueden reducir su absorción debido a la formación de complejos insolubles en el tracto intestinal de los animales (17). De hecho, la deficiencia de Fe comúnmente no se ve extendida en rumiantes de pastoreo debido a las altas concentraciones de Fe en los pastos, como también por la contaminación de partículas de tierra en los forrajes. Ambos factores contribuyen en gran medida a satisfacer los requerimientos de Fe en animales (12). La deficiencia de Fe se vuelve problemática cuando el ganado se mantiene con forrajes de baja concentración de Fe, en donde el suplemento de este elemento puede reducir la pérdida de peso en animales lactantes y puede causar una muy rápida compensación en el aumento de peso de los animales amamantados (12). Se ha reportado una deficiencia de Fe en algunas regiones del mundo cuando los rumiantes se alimentan de forraje proveniente de plantas que crecen en suelos arenosos y que están altamente infestadas con insectos o parásitos, en donde el suplemento de de Fe ha sido útil para los animales afectados. Tanto los niveles en sangre como la condición de los rumiantes han mejorado bajo el régimen de suplemento (12,26). También se ha investigado que el suplemento de Fe no demuestra respuesta alguna en animales mayores que consumen dietas normales. Sin embargo, la deficiencia de Fe existe y en algunos casos la administración de suplementos ha demostrado una mejoría notoria en el potencial de reproducción de los rumiantes (10). En nuestra investigación, los animales no presentaron una deficiencia de Fe, aunque es posible que el aporte de suplementos hubiera podido favorecer la capacidad de reproducción del ganado que allí pastaba, ya que los niveles de Fe en el plasma sanguíneo fueron menores al nivel sugerido.

Khan - Macrominerals status in Desi breed Cows The plasma concentrations of elements were not only different in animals with different physiological stages (i.e., lactating vs. dry cows), but were also different compared to the animals in other areas and zones, indicating the area effect. It is possible that forage plants grown in pastures grazed by animals may have lower mineral element levels, at least for some minerals, due to leaching soil minerals by water and this deficiency is shown in the plasma minerals profile of ruminants reared in these areas. It has already been reported the mineral profiles of plants vary with the soil chemistry and also by the climatic factors such as temperature, precipitation and drainage of the particular region (2,13). In conclusion the results of this trial indicated that plasma Ca, Mg, Zn, Cu and Fe concentrations are influenced by physiological stage in dairy cows. In fact, the plasma Ca and Cu concentrations were higher whereas plasma Mg, Zn and Fe levels were lower in dry cows compared to lactating cows. Therefore, our results can be considered useful for formulating the mineral mixtures to overcome the deficiency and toxicity of different minerals in cows.

4627

Las concentraciones en plasma de los elementos fueron distintos no solo en animales que estaban en distintas etapas fisiológicas (es decir, vacas lactantes frente a vacas secas), sino que también fueron distintos entre animales de distintas áreas y zonas, lo cual indica que existe un efecto de área. Es posible que las plantas de las cuales se compone el forraje que crecen en pastizales en donde pastan los animales tengan contenidos menores de los elementos minerales, al menos en el caso de algunos minerales, debido a la lixiviación de los minerales en el suelo por acción del agua, deficiencia que se evidencia en el perfil de minerales en plasma de los rumiantes criados en estas zonas. Ya ha sido reportado que los perfiles de minerales de las plantas varían con la química del suelo, como también por factores climáticos particulares de esta región tales como temperatura, precipitación y drenaje (2,13). En conclusión, los resultados de este estudio indicaron que las concentraciones en plasma de Ca, Mg, Zn, Cu y Fe se ven influenciadas por la etapa fisiológica de las vacas. De hecho, las concentraciones en plasma de Ca y Cu fueron mayores, mientras que los niveles de Mg, Zn y Fe fueron menores en vacas secas comparadas con vacas lactantes. Por lo tanto, nuestros resultados pueden considerarse útiles para formular las mezclas de minerales para superar la deficiencia y la toxicidad de los distintos minerales en las vacas.

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Rev.MVZ Córdoba 20(2):4629-4635, 2015. ISSN: 0122-0268 SHORT COMMUNICATION

Estimation of milk production in hair ewes by two methods of measurement Estimación de la producción de leche en ovejas de pelo mediante dos métodos de medición Irina Peniche G,1* M.Sc, Luis Sarmiento F,1 Ph.D, Ronald Santos R,1 Ph.D. Autonomous University of Yucatan, Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science, Department of Animal Nutrition, Carr. Mérida-X’matkuil km 15.5, Apdo. 4-116 Itzimná, CP 97100, Mérida, Yucatán, México. *Corresponding: ironadieska@gmail.com 1

Received: June 2014; Accepted: December 2014.

ABSTRACT Objective. The objective of the current study was to compare two methods to estimate daily milk production in crossbred hair ewes. Materials and methods. Eight multiparous, crossbred (Pelibuey x Katahdin) lactating hair ewes were used in a completely randomized design with repeated measurements, for 56 days. Ewes were fed ad libitum with a diet based on concentrate. Milk production was estimated twice a week for each ewe by both methods, suckled-hand (SH) and weigh-suckle-weigh (WSW) method. Results. Milk production (p>0.05) means were 1031.9±95.6 and 1119.0±95.6 g/day/ewe for SH and WSW method, respectively. Conclusions. No significant differences (p>0.05) were found between methods for milk yield. Key words: Hand milking, lambs, weighing (Source: AGROVOC).

RESUMEN Objetivo. El objetivo del presente trabajo fue comparar dos métodos para estimar la producción diaria de leche en ovejas de pelo cruzadas. Materiales y métodos. Se utilizaron ocho ovejas multíparas, cruzadas (Pelibuey x Katahdin) y lactantes, en un diseño completamente al azar, con medidas repetidas, durante 56 días. Las ovejas fueron alimentadas ad libitum con una dieta basada en concentrado. La producción de leche se estimó dos veces a la semana a cada oveja, mediante ambos métodos, el doble pesaje del cordero-ordeño manual de la ovejas (DPC-OMO) y el doble pesaje del cordero (DPC). Resultados. La producción de leche estimada (p>0.05) fue de 1031.9±95.6 y 1119.0±95.6 g/día/ovejas para el DPC-OMO y DPC, respectivamente. Conclusión. No se encontraron diferencias significativas (p>0.05) entre métodos de estimación de la producción de leche. Palabras clave: Corderos, ordeño manual, pesaje (Fuente: AGROVOC).

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Daily milk intake is the most important factor in determining lamb growth rate; therefore survival and potential growth of lambs depend on lactation of the dam. Due to the influence of milk yield on weaning weight and to the large variation in milking ability among the genotypes available in tropical areas, the estimation of milk production by lactating ewes contributes with useful information for the implementation of management strategies for ewes and their lambs. Direct measurement of milk production in non-dairy tropical sheep is difficult. For these reasons direct (e.g. hand or mechanic milking) and indirect (e.g. weigh-suckle-weigh method, udder dimensions) methods are commonly used to estimate milk production, however, these methods have demonstrated inaccurate results (1,2).

El consumo diario de leche es el factor más importante en la determinación de la tasa de crecimiento del cordero; por consiguiente la supervivencia y el crecimiento potencial de los corderos depende de la lactancia de la madre. Debido a la influencia de la producción de leche sobre el peso al destete y a la gran variación en la habilidad lechera entre los fenótipos disponibles en las áreas tropicales, la estimación de la producción de leche en ovejas en lactación contribuye con información útil para la implementación de estrategias de manejo para las ovejas y sus corderos. La medición directa de la producción de leche en ovejas tropicales no lecheras es difícil. Por estas razones, los métodos directos (ej. Ordeño mecánico o manual) e indirectos (ej. Doble pesaje del cordero, dimensiones de la ubre) son los más comúnmente usados para estimar la producción de leche, sin embargo, estos métodos han demostrado resultados imprecisos. (1,2).

One of the most cited methods for measuring milk production is the weigh-suckle-weigh (WSW) method (3,4). Some authors describe that use of the WSW method can generate underestimation of milk production at the beginning of lactation (1,5), mainly in ewes with single lambing. For this reason, other authors modified the WSW method (6), by adding a hand milking after second weighing of the lamb, in an attempt to obtain a valid estimation of milk production. The evaluation or comparison of methods to estimate milk yield in non-dairy tropical sheep has been little documented; however some authors reported milk production of 1029 g/day in Pelibuey ewes at the first 20 days post-lambing by WSW method (7). The objective of the current study was to compare two methods to estimate daily milk production in crossbred hair ewes.

MATERIALS AND METHODS Study site. The study was conducted at the Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science, Autonomous University of Yucatan (20°58´N and 89°37´O) Yucatan, Mexico. The climatic conditions in the study area correspond to the AW0 classification, characterized as warm and subhumid with a single rainy season between May and October, annual rainfall from 800 to 1000 mm, annual temperature from 26 to 28°C and relative humidity between 65-85% (8). Animals and experimental design. In this trial eight multiparous hair ewes (Pelibuey x Katahdin) with single lamb (five females and three males) and average body weight (BW) of 42.93±9.93 kg were used in a completely randomized design with repeated measurements. Animals were

Uno de los métodos más citados para la medición de la producción de leche es el método del doble pesaje del cordero (DPC) (3,4). Algunos autores describen que el uso del método DPC puede generar una subestimación de la producción de leche al principio de la lactancia (1,5) principalmente en ovejas con una sola cría. Por este motivo, otros autores modificaron el método DPC (6) adicionando un ordeño manual luego del segundo pesaje del cordero, tratando de obtener una estimación de producción de leche válida. La evaluación o comparación de los métodos para estimar la producción de leche en ovejas tropicales no lecheras ha sido poco documentada; sin embargo algunos autores reportaron producción diaria de leche de 1029 g/día en ovejas Pelibuey durante los primeros 20 días post-parto con el método DPC (7). El objetivo del presente estudio fue comparar dos métodos para estimar la producción diaria de leche en ovejas de pelo cruzadas.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. El estudio fue llevado a cabo en la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán (20°58´N and 89°37´O) Yucatán, México. Las condiciones climáticas del área de estudio corresponden a la clasificación AW0, caracterizada como cálida y subhúmeda con una sola temporada de lluvias entre mayo y octubre, con precipitación anual de 800 a 1000mm, temperatura anual de 26 a 28°C y humedad relativa entre el 65 y el 85% (8). Animales y diseño experimental. Durante esta prueba, ocho ovejas de pelo multíparas (Pelibuey x Katahdin) con una sola cría (cinco hembras

Peniche - Milk production by two methods of measurement individually housed (2.5x2.0 m) with their lambs in pens equipped with feed and water containers. The experimental period was the first 56 days of lactation, considering the first seven days as an adaptation period. Ewes were fed ad libitum with a diet based on concentrate, 10.25% crude protein (CP) and 12.32 MJ/kg dry matter (DM) of metabolizable energy (ME), balanced according to NRC (9) requirements. Pens and feed containers were arranged so that the lambs have no access to the dam’s feed. Ewes were dewormed after lambing by an intramuscularly application of Levamisole (Aranda Laboratories, Queretaro, Qro., Mexico). Milk production was estimated twice a week for each ewe by both methods, suckled-hand (SH) method (6) and weigh-suckle-weigh (WSW) method (10), from the second to the eighth week of lactation. Milk estimation through SH method. Once a week, lambs were separated from their dams for 12 h beginning at 20:00 h. The day after lambs were weighed with a digital weighing scale (5 g/kg of precision) at 8:00 h and at that moment they were allowed to suckle the ewe for 10 minutes, then lambs were weighed again immediately to estimate the amount of milk suckled. Additionally, after suckling, the ewes were hand milked soon after to get the milk left in their udders and this quantity of milk was recorded. In order to obtain the residual milk in dams an intramuscular injection of three IU of synthetic oxytocin (Aranda Laboratories, Queretaro, Qro., Mexico) was used. During the separation period lambs were located in pens allowing sight and smell contact with their dams and avoiding suckling. After milk measurement lambs were kept with their dams the rest of the day. Daily milk production was calculated by summing up the milk suckled by lambs (difference between lamb’s weights) and milk obtained by hand milking. Then, the result of this calculation was multiplying by two, with the aim to extrapolate the estimation of the milk production in 24 h period. Milk estimation through WSW method. Once a week, lambs were separated at 3:00 a.m. from their dams for three hours and after that, they were allowed to suckle for 10 minutes. Then, lambs were separated again from the ewes for three hours. During the separation time lambs were located in pens allowing sight and smell contact with their dams and avoiding suckling. After this second separation period (9:00 h), lambs were weighed and then they were allowed to suckle the ewe for 10 minutes, after that they immediately were weighed again. The difference

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y tres machos) y peso vivo (PV) promedio de 42.93±9.93 kg fueron utilizados en un diseño completamente al azar con medidas repetidas. El periodo experimental fueron los primeros 56 días de lactancia, considerando los primeros siete días como un periodo de adaptación. Las ovejas fueron alimentadas ad libitum con una dieta basada en concentrado, 10.25% proteína cruda (PC) y 12.32 MJ/kg de materia seca (MS) de energía metabolizable (EM), balanceada de acuerdo a los requerimientos del NRC (9). Los corrales y contenedores de alimentos fueron organizados para que los corderos no tuvieran acceso al alimento de las madres. Las ovejas fueron desparasitadas luego del parto mediante la aplicación intramuscular de Levamisol (Laboratorios Aranda, Querétaro, Qro., México). La producción de leche fue estimada dos veces por semana para cada oveja mediante ambos métodos, doble pesaje del cordero-ordeño manual de la oveja (DPC-OMO) (6) y doble pesaje del cordero (DPC) (10) desde la segunda hasta la octava semana de lactancia. Estimación de leche con el método DPCOMO. Una vez por semana, los corderos fueron separados de sus madres por 12 h desde las 20:00 h. Al día siguiente los corderos fueron pesados a las 8:00h con una balanza digital (5g/kg de precisión) y en ese momento se les permitió amamantar a la oveja por 10 minutos. Inmediatamente después, los corderos fueron pesados nuevamente para estimar la cantidad de leche consumida. Adicionalmente, después del amamantamiento, las ovejas fueron ordeñadas manualmente poco después para recolectar la leche restante en las ubres y esta cantidad de leche fue medida. Con el fin de obtener la leche residual en las madres se usó una inyección intramuscular de tres UI de oxitocina sintética (Laboratorios Aranda, Querétaro, Qro., México). Durante el periodo de separación los corderos fueron ubicados en corrales permitiendo contacto de vista y olfato con sus madres y evitando el amamantamiento. Luego de la medición de leche los corderos se mantuvieron con sus madres durante el resto del día. La producción diaria de leche se calculó sumando la leche amamantada por los corderos (diferencia entre los pesajes del cordero) y la leche obtenida por ordeño manual. Luego, el resultado de este cálculo fue multiplicado por dos, para extrapolar la estimación de la producción de leche en un periodo de 24h. Estimación de leche con el método DPC. Una vez por semana, los corderos fueron separados a las 3:00 a.m. de sus madres por tres horas y después de esto se les permitió amamantar por 10

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between pre and post-suckling weights was defined as milk consumption and consequently milk production. This recording was made over the 12 h period (6:00, 9:00, 12:00, 15:00 and 18:00 h). Then, the daily milk production was calculated by summing up the estimations recorded and multiplying the result by two. Ethics aspects. The present trial was approved by the Bioethic Committee at the Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science of the Autonomous University of Yucatan. Statistical analysis. Repeated measurements for estimations of weekly milk production was conducted using MIXED procedure of SAS (11). The fixed effects were the methods of estimation of milk production and the random effects were the animals. Additionally, orthogonal regression analysis was used to verify if both methods provide comparable milk production measurements. Orthogonal regression is useful when both axis, the predictor (x) and answer (y), have estimation error. Accordingly, the WSW method was considered the predictor for the SH method in the milk production estimation. The error variance ratio (σ SH/ σ WSW) was estimated and included in the orthogonal regression analysis using Minitab (12).

RESULTS Mean milk production of hair ewes measured using two different methods are presented in table 1. No significant differences (p>0.05) were found between methods for estimate the milk production. Daily estimation of milk production showed similar coefficient of variation (0.35 for SH and 0.34 for WSW method). Milk production between weeks (Figure 1) was different (p≤0.05). At the seventh post-lambing week there was significant difference (p≤0.05) in the estimation of milk production (1043 and 1497 g/day for SH and WSW, respectively) according to the method used.

minutos. Luego, los corderos fueron nuevamente separados de sus madres por tres horas. Durante el periodo de separación los corderos fueron ubicados en corrales permitiendo contacto de vista y olfato con sus madres y evitando el amamantamiento. Luego de este segundo periodo de separación (09:00h), los corderos fueron pesados y se les permitió amamantar por 10 minutos y luego fueron nuevamente pesados. La diferencia entre los pesos del pre y post amamantamiento fue definida como el consumo de leche y por consiguiente producción de leche. Este registro fue hecho durante un periodo de 12h (6:00, 9:00, 12:00, 15:00 y 18:00 h). Posteriormente, la producción diaria de leche fue calculada sumando las estimaciones registradas y multiplicando el resultado por dos. Aspectos éticos. Esta prueba fue aprobada por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Yucatán. Análisis estadístico. Se llevaron a cabo medidas repetidas para las estimaciones semanales de la producción de leche usando el procedimiento MIXED de SAS (11). Los efectos fijos fueron los métodos de estimación de la producción de leche y los efectos aleatorios fueron los animales. Adicionalmente, un análisis de regresión ortogonal fue utilizado para verificar si los dos métodos proporcionaban mediciones comparables de la producción de leche. La regresión ortogonal es útil cuando ambos ejes, el predictor (x) y la respuesta (y), tienen error de estimación. Por consiguiente, el método DPC fue considerado como predictor para el método DPC-OMO en la estimación de la producción de leche. La relación de la varianza del error (σDPCOMO/σ DPC) fue estimada e incluida en el análisis de regresión ortogonal usando Minitab (12).

Table 1. Weekly estimation of milk production by two methods of measurements. Method

Milk production, g/day

Suckled-hand

1031.9

Weigh-suckle-weigh

1119.0

Standard error

95.6

p-value

0.55

Figure 1. Weekly milk production (g/day) of hair ewes estimated by two methods, suckled-hand (SH) and weigh-suckle-weigh (WSW), of measurements.

Peniche - Milk production by two methods of measurement The orthogonal regression (Table 2), shows no significant difference (p>0.05) between methods in the estimation of milk production coefficient. The confidence intervals (95%) for the intercept (a) and the slope (b), included 0 (p>0.05) and 1 (p≤0.001), respectively. Moreover, the errorvariance ratio (SH/WSW) between methods around 1 suggests equality in the estimation by both methods.

Table 2. Orthogonal regression coefficient to compare the estimation of milk production by two methods (SH and WSW) of measurements. Item

P–value (Intercept)

P–value (slope)

Variance of error ratio (SH/WSW)

-9.87 (SE 297.21)

0.97

0.93 (SE 0.26)

0.00

0.87

MP: milk production, SH: suckled-hand, WSW: weigh-suckle-weigh, SE: standard error.

DISCUSSION The estimation of milk production by the methods used in this study was similar to the results reported in Pelibuey (1029 g/day) and Karadi ewes (1223 g/day) by different authors (6,7) and higher than the results described (603-750 g/day) in West African ewes (4,13). The maximum milk production for the SH method in the fourth post-lambing week is in agreement with other studies (6,14) where the production peak were reached between the third and fifth week of lactation. In the normal curve of lactation, close to the third week, a peak of lactation is expected (6). Furthermore, some authors have reported that milk production on non-dairy sheep maintains a maximum level during the first four or five weeks of lactation (2). On the contrary, the peak of milk production with the WSW method disagrees with the literature as it reaches the maximum level lately; at seventh week normally milk production decreases (15). It could be partially related to the fact that methods used to measure milk production have the potential to interfere with the natural behaviour of the dam and her young. Besides, it is considered that in early lactation the WSW method can generate underestimation of milk production when a single lamb is used, as in this study, considering that in non-dairy ewes there is surplus milk in the udder at the beginning of

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RESULTADOS Los promedios de la producción de leche en ovejas de pelo medida utilizando dos métodos diferentes se presenta en la tabla 1. No se encontraron diferencias significativas (p>0.05) entre ambos métodos para estimar la producción de leche. La estimación diaria de la producción de leche mostró un coeficiente de variación similar (0.35 para DPC-OMO y 0.34 para DPC). La producción entre semanas (Figura 1) fue diferente (p≤0.05). En la séptima semana postparto hubo diferencia significativa (p≤0.05) en la estimación de la producción de leche (1041 y 1497 g/día para DPC-OMO y DPC, respectivamente) de acuerdo con el método utilizado. La regresión ortogonal (Tabla 2) no muestra diferencia significativa (p>0.05) entre métodos en el coeficiente de estimación de la producción de leche. Los intervalos de confianza (95%) para el intercepto (a) y la pendiente (b), incluyeron al 0 (p>0.05) y al 1 (p≤0.01), respectivamente. Además, la relación de la varianza del error (σDPC-OMO/σ DPC) entre métodos cercana a 1 sugiere igualdad en la estimación hecha por ambos métodos. DISCUSIÓN La estimación de la producción de leche con los métodos utilizados en este estudio fue similar a los resultados reportados en ovejas Pelibuey (1029 g/ día) y Karadi (1223 g/día) por diferentes autores (6,7) y mayor que los resultados (603-750 g/día) descritos para ovejas West African (4,13). La producción máxima de leche para el método DPC-OMO ocurrió en la cuarta semana post-parto y está de acuerdo con otros estudios (6,14) donde el pico de producción se alcanzó entre la tercera y quinta semana de lactancia. En la curva normal de la lactancia, el pico de la lactancia es esperado cerca de la tercera semana (6). Adicionalmente, algunos autores han reportado que la producción de leche en ovejas no lecheras mantiene un nivel máximo durante las primeras cuatro o cinco semanas de lactación (2). Por el contrario, el pico de la producción de leche con el método DPC no concuerda con la literatura ya que alcanza el máximo nivel tardíamente; en la séptima semana la producción de leche normalmente decrece (15). Esto podría estar parcialmente relacionado con el hecho de que los métodos utilizados para medir producción de leche tienen el potencial para interferir con el comportamiento natural de la madre y sus crías. Además, se considera que en la lactancia temprana

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lactation which small lambs are not able to ingest (1). The results of the orthogonal regression for both methods showed that the estimation of milk production with SH method is comparable with the measurement by WSW method. Since estimation of the weekly milk production did not show significant difference between methods and both methods showed a similar coefficient of variation, it is concluded that both methods can be used in hair ewes; however, the authors of the present study consider that the SH method requires less animal management, which support the use of that under experimental conditions. Acknowledgements The first author would like to express her gratitude to the International Center for D e v e l o p m e n t a n d D e c e n t Wo r k ( I C D D Germany) and to the Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia (CONACyT-México) for the PhD scholarships awarded.

el método DPC puede generar una subestimación de la producción de leche cuando se utiliza una sola cría, como en este estudio, considerando que en las ovejas no lecheras hay un excedente de leche en la ubre al principio de la lactancia, el cual los pequeños corderos no alcanzan a ingerir (1). Los resultados de la regresión ortogonal para ambos métodos mostraron que la estimación de la producción de leche con el método DPC-OMO es comparable con la medición con el método DPC. Debido a que la estimación de la producción semanal de leche no mostró diferencias significativas entre métodos y ambos métodos mostraron un coeficiente de variación similar, se concluye que ambos métodos pueden ser utilizados en ovejas de pelo; sin embargo, los autores de este estudio consideran que el método DPC-OMO requiere un manejo menor del animal, lo cual soporta el uso de este bajo condiciones experimentales. Agradecimientos El primer autor quisiera expresar su gratitud al Centro International para el Desarrollo y Trabajo Decente (ICDD – Alemania) y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT – México) por las becas de doctorado otorgadas.

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14. Neville TL, Meyer AM, Reyaz A, Borowicz PB, Redmer DA, Reynolds LP, Caton JS, Vonnahme KA. Mammary gland growth and vascularity at parturition and during lactation in primiparous ewes fed differing levels of selenium and nutritional plane during gestation. J Anim Sci Biotech 2013; 4(6):1-7. 15. Ochoa MA, Torres G, Ochoa AE, Vega L, Mandeville PB. Milk yield and composition of Rambouillet ewes under intensive management. Small Rum Res 2002; 43(3): 269-274.

Rev.MVZ Córdoba 20(2):4636-4645, 2015. ISSN: 0122-0268 SHORT COMMUNICATION

Aglepristone efficiency with and without the canine pyometra cloprostenol Eficacia del aglepristone con y sin cloprostenol en el tratamiento del piómetra canino Víctor Molina D,1* M.Sc. CAEQUINOS-Unisabaneta. Grupo de investigación RICERCA, Calle 75 Sur N 34-120, Sabaneta, Colombia. *Correspondencia: dooncanmc@hotmail.com 1

Received: August 2014; Accepted: February 2015.

ABSTRACT Objective. Evaluate the effectiveness of aglepristone with and without cloprostenol for treating canine pyometra. Materials and methods. Ten female French Bulldogs between 3-8 years of age diagnosed with pyometra were divided into two groups, one receiving a 10 mg/kg dose of aglepristone subcutaneously on days 1, 2, 8, 14 and 28, and the other an equal dose on days 1, 3, 8 and 15, as well as a 1 µg/kg dose of cloprostenol subcutaneously on days 3 and 8. Both groups received 5 mg/kg of enrofloxacin orally every 12 hours for 28 days. Hematic profiles were generated on days 1 and 28 and counted days until the next heat, expelling purulent material and of clinical recuperation. Results. There was no statistical difference in the variables of the line red blood cells between times and protocols. The line of white blood cells showed a statistical difference between days of treatment but not between the two groups. Both treatments were effective resulting in complete clinical recuperation. The combination of aglepristone with cloprostenol acted more quickly, decreasing the number of days of secretion, abdominal pain, and the recuperation of normal activity and appetite. All 10 females were bred during their first heat. Three females from the aglepristone group and one from the combined aglepristone with cloprostenol group were impregnated. Conclusions. Both protocols, combined with enrofloxacin, produced complete clinical recuperation in bitches with pyometra, but it was achieved more rapidly when given the combination of both aglepristone and cloprostenol. Key words: Antiprogestins, estrogens, endometrial hyperplasia, bitch, progesterone, prostaglandin (Source: MeSH).

RESUMEN Objetivo. Evaluar la efectividad del aglepristone con y sin el cloprostenol en el tratamiento del piómetra canino. Materiales y métodos. Diez hembras Bulldog Francés entre 3–8 años de edad con diagnóstico de piómetra, se dividieron en dos grupos, uno recibió aglepristone a la dosis de 10 mg/kg subcutáneo los días 1, 2, 8, 14 y 28, y otro una dosis igual los días 1, 3, 8 y 15, más cloprostenol a dosis de 1 µg/kg subcutáneo los días 3 y 8. Ambos grupos recibieron enrofloxacina 5 mg/kg oral cada 12 horas por 28 días. Se realizaron perfiles hemáticos los días 1 y 28, y se valoraron días de retorno al celo, expulsión del material purulento y de recuperación clínica. Resultados. No hubo diferencia estadística en las variables de la línea roja sanguínea entre tiempos y protocolos. La línea de glóbulos blancos mostró diferencia estadística entre los días de tratamiento pero no entre los dos grupos. Ambos tratamientos fueron eficaces en la 4636

Molina - Aglepristone efficiency with and without cloprostenol

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recuperación clínica completa, siendo el aglepristone más cloprostenol más rápido en disminuir los días de secreción, dolor abdominal, recuperación de la actividad normal y apetito. Las 10 hembras fueron servidas en el primer celo y quedaron preñadas tres hembras del grupo del aglepristone y una del grupo aglepristone con cloprostenol respectivamente. Conclusiones. Ambos protocolos combinados con enrofloxacina, produjeron la recuperación clínica completa en perras con piómetra, pero se consiguió más rápidamente en el grupo de aglepristone con cloprostenol. Palabras clave: Antiprogestágenos, estrógenos, hiperplasia endometrial, perra, progesterona, prostaglandina (Fuente: MeSH).

INTROODUCTION

INTRODUCCIÓN

Pyometra is a uterine pathology of bacterial origin stimulated by progesterone during consecutive heat cycles, and by an exogenous estrogen and/ or progesterone treatment (1). It is reported principally in females over six years of age (2,3).

El piómetra es una patología uterina de origen bacteriano favorecida por acción de la progesterona durante ciclos de celos sucesivos, también por una terapia exógena con estrógenos y/o progestágenos (1). Se reporta principalmente en hembras mayores de 6 años (2,3).

It is a pathological process that usually begins with cystic endometrial hyperplasia (CEH), and that permits the proliferation of vaginal bacteria, accumulating purulent material inside the uterus (3-5). It is considered one of the most frequent pathological alterations in canine reproduction (4, 6). It begins during the estrous phase of the reproductive cycle, by morphological changes induced by progesterone (P4) and estrogen (E2), along with an abnormal response in the uterus during the luteal phase, which combined with bacterial action results in pyometra (5,7). Two clinical forms are distinguished: closed pyometra, whose signs are very severe and open pyometra. Some of the common signs are: vomiting, polydipsia, polyuria and anorexia (2,3,5). Treatment of pyometra should be urgent and aggressive, including the extraction of contents, which is generally surgical in 80% of cases (810). None the less, pharmacological treatment is also possible (11-13). The effectiveness of the use of natural prostaglandin F2α has been traced in 55% of cases of open pyometra and 24% of closed pyometra, respectively (14-16). It was found least effective in cases of closed pyometra (24%), which brought about the use of progesterone antagonists like aglepristone (15,17), which improve efficacy when combined with prostaglandins, above all, in order to carry out therapies in bitches of high economic value and where surgery is not an option (18). The principal cause of canine pyometra, in 90% of cases, is Escherichia coli in 90% of cases (2,6,19), which penetrates the uterus during estrus (5,19,20). For this reason treatment should always be accompanied by antibiotics or antimicrobials, especially with a spectrum

Es un proceso patológico que suele iniciar con hiperplasia endometrial quística (HEQ), y que permite la proliferación de bacterias provenientes de la vagina, llevando a la acumulación de material purulento al interior del útero (3–5). Es considerada como una de las alteraciones patológicas más frecuentes en reproducción de caninos (4,6). Se inicia en la fase estral del ciclo reproductivo, por cambios morfológicos inducidos por la progesterona (P4) y los estrógenos (E2), con una respuesta anormal del útero en la fase lútea, que unido a la acción bacteriana ocasiona el piómetra (5,7). Se distinguen dos formas clínicas: piómetra de cuello cerrado, cuyos signos son más severos y el piómetra de cuello abierto. Algunos de los signos comunes son: vómito, polidipsia, poliuria y anorexia (2,3,5). El tratamiento del piómetra debe ser urgente y agresivo, con la extracción del contenido, que por lo general es quirúrgico en el 80% de los casos (810). Sin embargo, el tratamiento farmacológico también es posible (11–13). La efectividad en el uso de prostaglandina natural F2α se ha descrito en el 55% de casos de piómetra abierto y 24% en piómetra cerrado, respectivamente (14–16). La menor efectividad encontrada en los casos de piómetra cerrado (24%), llevó al uso de antagonistas de la progesterona como aglepristone (15,17), los cuales mejoraron la efectividad al unirse con las prostaglandinas, sobre todo para realizar terapias en perras de alto valor económico y donde la cirugía no es una opción (18). El principal agente causante del piómetra canino es Escherichia coli en el 90% de los casos (2,6,19), el cual penetra al útero durante el estro (5,19,20). Por ello el tratamiento debe ir siempre

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against Gram-negative microorganisms such as gentamicin, amikacin, enrofloxacin, ciprofloxacin, among others (19). Females treated jointly with progesterone antagonists and natural or synthetic prostaglandins F2α were 75% of the time cured (11,15,17), while patients that only received prostaglandins only reached 60% (13). This is due to the fact that the canines presented less uterine response to the use of prostaglandins (11, 160); other treatments have been mentioned as having similar results (8,12,18). Among these Corrada et al (14) describe the effectiveness of using dopamine agonists (Cabergoline) in treating canine pyometra. Various studies demonstrated the cure of pyometra with only a single use of 10 mg/kg of antiprogestin aglepristone subcutaneously on days 1, 2 and 8 of the diestrus, combined with cloprostenol, which induces the opening of the cervix and the resulting drainage of the uterus (13-15). Other protocols with an efficacy of 95% are: 10 mg/kg of aglepristone subcutaneously on days 1, 3, 8, and 15 of the diagnosis, combined with cloprostenol 1 µg/kg subcutaneously on days 3 and 8, or both combined on days 3, 5, 8, 10, 12 and 15 (13,18). Only Molina (18) describes using aglepristone as a singular therapy in a report on the case of a French Bull Dog with pyometra. However, the efficacy of aglepristone as a singular medicine for this treatment has not been determined in a comparative study. The objective of the present study was to value the efficacy of the antiprogestin aglepristone with and without cloprostenol in treating pyometra in female canines.

MATERIAL AND METHODS Study location. Veterinary Clinic of Antioquia, Medellín Colombia, from 2011 to 2013. Animals. 10 female French Bulldogs, between 3–8 years of age, diagnosed with closed pyometra. All animals used were of high breeding value because of which their owners sought alternative therapy to conventional ovariohysterectomy. All bitches had closed pyometra, with clinical signs of polydipsia, polyuria, vomiting, lack of energy and anorexia; as well as their last heat being 45-60 days prior. Experimental design and treatments. The females were randomly assigned to one of the two treatment groups, one with a 10 mg/kg dose

acompañado de antibióticos o antimicrobianos, en especial con espectro contra microorganismos Gram negativos como lo son la gentamicina, amikacina, enrofloxacina, ciprofloxacina, entre otros (19). Las hembras tratadas conjuntamente con antagonistas de la progesterona y prostaglandinas F2α natural o sintéticas curan en un 75% (11,15,17), mientras que pacientes que sólo reciben prostaglandinas lo hacen hasta en el 60% (13). Lo cual se debe a que los caninos presentan menor respuesta uterina al sólo uso de prostaglandina (11,16); otros tratamientos se han descrito con resultados similares (8,12,18). Dentro de los cuales Corrada et al (14), describen la efectividad del uso de agonistas de la dopamina (Cabergolina) en el tratamiento del piómetra canino. Varios estudios demostraron resolución del piómetra con el sólo uso del antiprogestágeno aglepristone a dosis de 10 mg/kg subcutáneo, los días 1,2 y 8 del diestro, unido a cloprostenol, el cual induce la apertura del cérvix y el consiguiente drenaje uterino (13–15). Otros protocolos con eficacia del 95%, son: aglepristone 10 mg/kg subcutáneo a los días 1, 3, 8, y 15 del diagnóstico, combinado con cloprostenol 1 µg/kg subcutáneo los días 3 y 8, o bien ambos combinados los días 3, 5, 8 10, 12 y 15 (13,18). Pero sólo Molina (18) describe el uso de aglepristone como única terapia en un reporte de un caso de una Bulldog francés con piómetra. Pero no se ha determinado la efectividad del aglepristone como único medicamento para este tratamiento, en un estudio comparativo. El objetivo del presente estudio fue valorar la eficacia del antiprogestágeno aglepristone con y sin el cloprostenol en el tratamiento del piómetra en hembras caninas.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. Clínica Veterinaria de Antioquia, Medellín Colombia, entre los años 2011 a 2013. Animales. 10 hembras caninas de la raza Bulldog Francés, entre 3–8 años de edad, con diagnóstico de piómetra cerrado. Todas las hembras utilizadas eran animales de alto valor reproductor por lo que el propietario buscaba otra alternativa terapéutica diferente a la ovariohisterectomía convencional. Todas las perras presentaron piómetra cerrado, con los signos clínicos de polidipsia, poliuria, vómito, decaimiento y anorexia; Así como historia de celo hace 45-60 días.

Molina - Aglepristone efficiency with and without cloprostenol of aglepristone administered subcutaneously on days 1, 2, 8, 14 and 28; the other with a 10 mg/kg dose of aglepristone administered subcutaneously on days 1, 3, 8 and 15, and 1 µg/kg of cloprostenol given subcutaneously on days 3 and 8. Both groups received a complementary therapy with 5 mg/kg of enrofloxacin given orally every 12 hours for 28 days. The pyometra diagnosis in all patients was made by means of a clinical exam, blood profile, as cited later on, and confirmation by echography. Evaluation of the bitches. The hematological evaluation was carried out starting with blood samples from the jugular vein, gathered in tubes with EDTA on days 1 and 28 of the diagnostic. The samples were processed on Abacus junior vet® (Diatron Ltda, Austria) equipment according to the following parameters: hematocrit (HCT), hemoglobin (HGB), mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), erythrocytes, leukocytes, neutrophils (N), eosinophils (E), lymphocytes (L), lemniscus (B), monocytes (M), platelets (PL) and plasma proteins. The evaluation of uterine contents was made with an abdominal echography using a Midray DP 3300 B/N® system every 8 days, during the 28 days of treatment. In addition, the followup included: time until the next proestrus (by vaginal smear and progesterone measurements above 8 mg/ml), the days of expulsion uterine content and the time of clinical recuperation of each patient, measured by the absence of clinical signs; among which were evaluated: absence of vomiting, absences of abdominal pain through palpation, measured according to the Universidad de Melbourne (UMPS) pain scale, return of appetite and normal activity. The evaluation of the patient was ambulatory until resolving the symptoms. The females were paired and naturally mated on days 11, 14 and 16 from the initial day of proestrus. For this study only the presence or absence of gestation was evaluated by echography 23 days after copulation; no further monitoring was carried out on the non-pregnant females. Statistical analysis. The variables were subject to ANOVA, with Tukey HSD and Chi2 tests for qualitative variables and with a non-parametric test (Mann Whitney test). Informed consent. All owners of the bitches signed a consent form, accepting the administration of medication as an alternative to ovariohysterectomy. The investigation was approved by the University Corporation of Sabanet (Unisabaneta) ethics

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Diseño experimental y tratamientos. Las hembras fueron asignadas de manera aleatoria a uno de los dos grupos de tratamiento, un grupo con aglepristone a dosis de 10 mg/kg subcutáneo los días 1, 2, 8, 14 y 28; el otro con aglepristone a dosis de 10 mg/kg subcutáneo los días 1, 3, 8 y 15, más cloprostenol 1 µg/kg subcutáneo el día 3 y 8. Ambos grupos recibieron una terapia complementaria con enrofloxacino 5 mg/kg vía oral cada 12 horas por 28 días. El diagnóstico de piómetra en todas las pacientes fue realizado mediante el examen clínico, perfil sanguíneo como se cita a continuación y confirmados por ecografía. Evaluación de las perras. La evaluación hematológica fue realizada a partir de muestras de sangre de la vena yugular, recolectada en tubos con EDTA los días 1 y 28 del diagnóstico. Las muestras fueron procesadas en equipo Abacus junior vet® (Diatron Ltda, Austria) para los siguientes parámetros: hematocrito (Hto), hemoglobina (Hg), volumen corpuscular medio (VCM), hemoglobina corpuscular media (HgCM), concentración de hemoglobina corpuscular media (CHgCM), eritrocitos, leucocitos, neutrófilos (N), eosinófilos (E), linfocitos (L), bandas (B), monocitos (M), plaquetas (PL) y proteínas plasmáticas. La evaluación del contenido uterino, se realizó mediante ecografía abdominal con un equipo Midray DP 3300 B/N® cada 8 días, durante los 28 días de tratamiento. Además, el seguimiento incluyó: tiempo de retorno al proestro (por citología vaginal y mediciones de progesterona por encima de 8 mg/ml), los días de expulsión del contenido uterino y el tiempo de recuperación clínica de cada paciente, medido por la ausencia de signos clínicos; dentro de los cuales fueron evaluados: ausencia de vómito, ausencia de dolor abdominal por palpación, medido según escala de dolor Universidad de Melbourne (UMPS), retorno del apetito y retorno de actividad normal. La evaluación del paciente fue realizada de manera ambulatoria hasta resolver los signos. Las hembras fueron apareadas con monta natural los días 11, 14 y 16 de iniciado el proestro. Para este estudio sólo fue evaluada la presencia o ausencia de la gestación por ecografía a los 23 días de la cópula; a las hembras no gestantes no se les realizó seguimiento posterior. Análisis estadístico. Las variables fueron sometidos a ANOVA, con el test de HSD Tukey y Chi2 para las variables cualitativas y con test no paramétrico (Mann Whitney test).

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committee, by means of resolution 001 on October 2013.

RESULTS Ten female French Bulldogs were evaluated, of which there was not found a significant difference between groups and protocols (p≥0.05). In the aglepristone group the average age was 4.2±1.92 years and in the combined aglepristone and cloprostenol group 3.2±1.30 years. In the hemogram evaluation during the two periods, day 0 and 28, no variation in the red line was observed, neither before nor after the treatment (Table 1), there was no significant difference between inter or intra treatments (p≥0.05). Table1. Average values (±D.S) of some hemogram variables during the evaluation of the pyometra treatment. Treatment

Hematocrit (%)

Hemoglobin Red blood cells (g/dl) (1 x 106/ml)

Day 0 Day 28 Day 0 Day 28 Day 0 Day 28 Aglepristone Group

43.2 ±5.9a

42.6 ±3.8a

14.4 ±1.9a

14.2 ±1.3a

4.0 ±0.4a

4.4 ±0.3a

Aglepristone cloprostenol Group

43.4 ±3.4a

42.2 ± 2.6a

14.5 ±1.2a

14.0 ±0.9a

4.5 ±0.5a

4.6 ±0.5a

None of the variables had significant difference (p≥0.05).

In the leukogram there was no statistical difference found between aglepristone and aglepristone in addition to cloprostenol (p≥0.05), but there a difference was found between the values on day 0 and 28. For this reason the information from both treatment groups was analyzed together for each variable and time measurement. In this analysis it was found that all variables analyzed by the leukogram showed lesser post treatment values (Table 2). These results show that both treatments decreased the number of white blood cells, neutrophils and lemniscus’, compared with the values before treatment (p≤0.05). There was no significant difference (p≥0.05) between both protocols in regards to days of recuperation for the following clinical variables: days until the next proestrus (138 days), days until a normal echography (15 days), days until absence of vomiting (6.2 days) and days until an absence of polydipsia/polyuria (5.6 days) (Table 3). However, variables such as the days of absence of abdominal pain, days of vaginal secretion, days until normal appetite and days of normal activity, showed statistical

Consentimiento informado. Todos los propietarios de las hembras firmaron un consentimiento informado, aceptando la realización de la medicación como alternativa a la ovariohisterectomía. La investigación fue aprobada por el comité de ética de la Corporación Universitaria de Sabaneta (Unisabaneta), mediante resolución número 001 de octubre 2013.

RESULTADOS Diez hembras Bulldog Francés fueron evaluadas, de las cuales para el grupo de aglepristone la edad promedio fue 4.2±1.92 años y de 3.2±1.30 años para el aglepristone más cloprostenol, no se encontró diferencia significativa entre grupos y protocolos (p≥0.05). En la evaluación del hemograma durante los dos tiempos día 0 y 28, no se observó variación en la línea roja, ni antes ni después del tratamiento (Tabla 1), no hubo diferencia significativa inter o intra tratamientos (p≥0.05). En el leucograma no se encontró diferencia estadística entre aglepristone y aglepristone más cloprostenol (p≥0.05), pero sí encontró una diferencia entre los valores del día 0 y 28. Por esto se analizaron en conjunto los datos de los dos grupos de tratamiento por cada variable y momento de medición. En este análisis se encontró que todas las variables analizadas del leucograma mostraron valores menores postratamiento (Tabla 2). Estos resultados muestran que ambos tratamientos disminuyeron los valores de los glóbulos blancos, neutrófilos y bandas, comparado con los valores antes del tratamiento (p≤0.05). No hubo diferencias significativas (p≥0.05) entre ambos protocolos para los días de recuperación de las siguientes variables clínicas: días de retorno al proestro (138 días), días para ecografía aparentemente normal (15 días), días para ausencia de vómito (6.2 días) y días para ausencia de polidipsia/poliuria (5.6 días) (Tabla 3). Pero las variables días de ausencia de dolor abdominal, días de secreción vaginal, días a apetito normal y días de actividad normal, mostraron diferencia estadística (p≤0.05), siendo menor para el grupo de Aglepristone cloprostenol (Tabla 3). Las 5 hembras de cada protocolo se aparearon en el primer celo. De ellas, el 40% (3 de 5) del grupo de aglepristone quedo gestante, con diagnóstico ecográfico a los 23 días pos monta, mientras que sólo el 20% (1 de 5) del grupo aglepristone y cloprostenol quedo preñada. Todas las hembras

Molina - Aglepristone efficiency with and without cloprostenol Table 2. Average values (±DS) of the leukogram for French Bulldog bitches with pyometra and treated with aglepristone alone or combined with cloprostenol. Treatment

White blood cells (1 x 103/ml)

Neutrophils (1 x 103/ml)

Lemniscus’ (1 x 103/ml)

Day 0 Day 28 Day 0 Day 28 Day 0 Day 28 20.7 ±0.9a

14.6 ±1.2b

16.1 ±0.6a

9.5 ±0.6b

0.7 ±0.2a

0.2 ±0.2b

A g l e p r i s t o n e 20.1 cloprostenol Group ±2.3a

13.7 ±0.9b

14.7 ±1.2a

8.8 ±0.9b

0.8 ±0.1a

0.2 ±0.2b

Aglepristone Group

The numbers with a different superscript for each row imply significant differences (p≤0.05). There was no significant difference between both groups for each variable of the same day. a,b

differences (p≤0.05), being less for the combined aglepristone and cloprostenol group (Table 3). All 5 females in each protocol paired during their first heat. Of them, 40% (3 out of 5) of the aglepristone group became pregnant, with a diagnostic echography on day 23 post mating, while only 20% (1 out of 5) of the aglepristone and cloprostenol group were impregnated. All pregnant females carried their pregnancy to full term. The present study did not evaluate the number of puppies or the vitality and malformation of the neonates. None of the bitches showed adverse clinical signs or local effects associated with the treatments.

DISCUSSION The presence of the disease does not coincide with population data found by other authors, and there is no particular prevalence according to breed, thus, the French Bulldog was chosen in particular because of its high economic value. The table refers to females greater than four years of age, as mentioned by other authors (2,3), which does not coincide with the present work where the age was 4.2 years for the aglepristone group and 3.2 years for the aglepristone and cloprostenol group, indicating that they were young females, one cannot infer that the French Bulldog as a breed is the explanation, since pyometra has been found in young animals of different breeds (3). The results indicate that treatments with aglepristone or aglepristone with cloprostenol probably have similar results as regards to the values of the full blood count. It is evident that the increase in the number of white blood cells, neutrophils and lemniscus’ are characteristic to canine pyometra, as mentioned by many authors (15, 21). However, the aglepristone and the aglepristone with cloprostenol treatments,

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Table3. Average values (±DS) of days until the normalization of the clinical variables during the evaluation of the pyometra treatment. Treatment

DNE

DAV

DAP DNA DNA

DAPP

A g l e p r i s t o n e 10.0 139.8 16.0 6.8 10.2 10.4 7.8 Group ±1.6a ±17.8a ±2.0a ±1.9a ±1.5a ±1.1a ±1.3a

5.6 ±1.5a

Aglepristone 7.2 137.0 13.8 5.6 7.0 7.0 5.0 cloprostenol ±1.3b ±17.7a ±1.5a ±0.5a ±1.6b ±1.0b ±1.0b Group

5.6 ±1.1a

DS: Days of secretion; DP: Days of proestrus DNE: Days to normal echography; DAV: Days until absence of vomiting; DAP: Days until the absence of pain; DNA: Days to normal activity; DNA: Days to normal appetite; DAPP: Days until the absence of polydipsia/polyuria. a, b The numbers with a different superscript for each column implies a significant difference (p≤0.05).

gestantes presentaron una gestación a término. En el presente estudio, no se evaluó el número de cachorros, vitalidad y malformación de los neonatos. Ninguna de las perras mostró signos clínicos adversos o efectos locales asociados con los tratamientos.

DISCUSIÓN La presencia de la enfermedad no coincide con los datos poblacionales encontrados por otros autores, pero no hay prevalencia en particular según la raza, debido a que se escoge una raza en particular Bulldog francés, por tratarse de animales de alto valor económico. La edad descrita por otros autores refiere el cuadro a hembras mayores de 4 años (2,3), lo cual no coincide en el presente trabajo donde las edades estaban en 4.2 para el aglepristone y 3.2 años para aglepristone más cloprostenol respectivamente, lo cual indica que se trataba de hembras jóvenes, no se puede inferir que por tratarse de la raza Bulldog francés esta sea la explicación pues el piómetra se ha descrito en animales jóvenes de diferentes razas (3). Los resultados indican que probablemente los tratamientos con aglepristone o aglepristone con cloprostenol, tienen resultados similares en cuanto a los valores del hemoleucograma. Es evidente que los valores aumentados de los glóbulos blancos, neutrófilos y bandas son característicos del piómetra canino, como los describen muchos autores (15,21). Pero el tratamiento con aglepristone y aglepristone con cloprostenol, combinados con antimicrobianos, permitieron la recuperación de las variables del leucograma alteradas, lo que concuerda con resultados de otros estudios (19,21), donde la leucocitosis y neutrofilia sede al uso de ambos protocolos, debido a la eliminación del contenido piógeno. Además, el uso de enrofloxacina, demostró ser eficaz, en el control de la infección,

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combined with antimicrobials, allowed the recuperation of the altered leukogram variables, which agrees with the results of other studies (19,21), where the use of both protocols mitigates leukocytosis and neutrophil by eliminating pyogenic material. Moreover, the use of enroflaxacin proved to be effective in the control of the infection, similar to those already mentioned for gentamicin in another study (19). All bitches in this study presented uterine contents in the ultrasound evaluation, from 15 days on average which coincide with the results of other authors (13,15,18). Also, both treatments showed a similar behavior in regards to days of recuperation of the clinical variables: days of proestrus, days until absence of vomiting and days until absence of polydipsia/polyuria (15, 16). Treatment with a combination of aglepristone and cloprostenol showed an advantage in regards to days of secretion, with an average of 7.2 days compared with 10 days for treatment with only aglepristone. This coincides with other studies where the greater effect of this combination is confirmed (22); none the less, this data differ from the 3 days of secretion reported by those who used at least one protocol of aglepristone with cloprostenol similar to that of this study (17). In vitro studies have demonstrated that the progesterone antagonist induced by aglepristone improves contractile activity of the myometrium induced by prostaglandins (16), which clinically implies assistance in the elimination of pyogenic material in less time, facilitating recuperation. In this study the lowest average number of days until absence of pain, and days to normal activity and appetite associated with the combined treatment of aglepristone with cloprostenol, is related to the lowest number of days of uterine discharge and improvement of clinical evaluation, which can be related to studies that indicate a higher contractile capacity of the myometrium from the combination of aglepristone with cloprostenol than only aglepristone (15,18). However, the present study did not determine values according to the UMPS scale, it was only used to determine presence or absence of pain and this was observed when values decreased, indicating improvement. None of the bitches in this study had a recurrence of the disease, at least not in the estrous cycle subsequent to this study, which does not rule out the occurrence of the disease in the rest of the subsequent estrous cycles, because they could not be evaluated in this study. The group of bitches in this study were young, none of which passed 7 years of age, which coincides with previous studies where there was no recurrence

similar a los ya descritos para la gentamicina en otro estudio (19). Todas las perras de este estudio a la evolución ecografica presentaron contenido uterino, a partir del día 15 en promedio y coincide con los resultados de otros autores (13,15,18). Además, ambos tratamientos mostraron un comportamiento similar en los días de recuperación de las variables clínicas días de proestro, días a ausencia de vómito y días a ausencia de polidipsia/poliuria (15,16). En el tratamiento de aglepristone con cloprostenol se observa una ventaja en los días de secreción, con un promedio de 7.2 días comparado con los 10 días del tratamiento con aglepristone sólo y coincide con otros estudios donde se ratifica el mejor efecto de esta combinación (22); sin embargo, estos datos difieren de los 3 días de secreción reportados por quienes utilizaron al menos un protocolo de aglepristone y cloprostenol similar al de este estudio (17). Estudios in vitro han demostrado que el antagonismo de la progesterona inducido por el aglepristone mejora la actividad contráctil del miométrio inducido por las prostaglandinas (16), lo que clínicamente implica que se favorece la eliminación del contenido piógeno en menor tiempo, favoreciendo la recuperación. En este estudio el menor promedio de días a ausencia de dolor, días a actividad normal y días a apetito normal asociadas a la adición del tratamiento de aglepristone con cloprostenol, está relacionado con el menor número de días de descargas uterinas y la mejora de la evolución clínica puede estar relacionada con los estudios que indican una mayor capacidad contráctil del miometrio de aglepristone con cloprostenol, que aglepristone sólo (15,18). Pero el presente estudio no determina los valores según la escala UMPS, sólo se usó para determinar presencia o ausencia de dolor y esto se dió cuando los valores disminuyeron como indicativo de mejoría. Ninguna de las perras de este estudio presentaron recidiva de la enfermedad al menos en un ciclo estral posterior a este estudio, lo que no descarta la presencia de esta enfermedad en los demás ciclos posteriores, que para este estudio no pudieron ser evaluado. El grupo de perras de este estudio fue joven pues ningún animal superó los 7 años de edad y coincide con estudios previos en donde no hubo reincidencia de la enfermedad en el siguiente ciclo en animales menores de 5 años y de donde se concluye que se obtienen mejores resultados en preservar la fertilidad de la hembras tratadas en animales jóvenes (23).

Molina - Aglepristone efficiency with and without cloprostenol of the disease in the following cycle in animals less than 5 years of age and from which it is concluded that better results in preserving female fertility is obtained in young animals (23). In the present study no side effects associated with the use of prostaglandins was found, such as: vomiting, sialorrhea, nausea, diarrhea, hypotension, tachycardia, shock and death, as is described in handling doses of 2.5 µg/kg (16). Similar circumstances were reported by other canine studies (13). This could be due to the use of low doses of cloprostenol in this study. Further, neither the aglepristone treatment reported side effects, which compares with the results of previous studies (24). These results should continue to be analyzed, even though there is clinical evidence that the combination of aglepristone with cloprostenol can generate better results, as are describes by Gobello et al (13), Fieni (15) and Jena et al (21), in curing patients. The present study demonstrates that only using aglepristone is sufficient for guaranteeing the recuperation of the patient, similar to what is described by Molina (18). The analysis should be guided toward not only guaranteeing future fertility, but also to avoid side effects and risk to the life of the female, through the use of synthetic prostaglandin (16,25). In addition, to dispute the concept that pyometra is a reproductive disease in female canines that requires surgical treatment (3,5,26), due to the pathogenicity of its etiologic agent and its death rate (2,3,21), it is known that procedures like the ovariohysterectomy, which eliminates possible recurrence (11), leave breeding females without the possibility of progeny. None the less, surgical treatments have their limits when the surgical risk increases or the owner refuses OVH because they are patients of high breeding value, in which the possibility of sterilization is considered expensive (20). It is at this point where progesterone antagonists play an important role, especially the use of aglepristone, which due to its medical advantage in facilitating the contractibility of the myometrium, permits the elimination of pyogenic material (12,15,26), relaxing the uterine neck, due to its competitive effect against progesterone (17). Compared to the use of prostaglandin, which smooth the corpus luteum (16), giving the doctor a new possibility of high effectiveness in treating both open and closed pyometra. Reports are found where the use of aglepristone as the sole medication achieved beneficial curative effects greater than 75% (11); similar to those

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En el presente estudio no se encontraron efectos colaterales asociados con el uso de prostaglandinas, como: vómito, sialorrea, nauseas, diarrea, hipotensión, taquicardia, choque y muerte, como se describen con el manejo de dosis de 2.5 µg/kg (16). Similares circunstancias fueron de reportadas por otros estudios en caninos (13), esto se puede deber al uso de bajas dosis de cloprostenol utilizadas en este estudio, además, el tratamiento con aglepristone tampoco reportó efectos colaterales comparado con los resultados de estudios previos (24). Estos resultados deben seguir siendo analizados, pues aunque hay evidencia clínica de que la combinación aglepristone con cloprostenol, puede generar mejores resultados, como los descritos por Gobello et al (13), Fieni (15) y Jena et al (21), en la curación del paciente. El presente estudio demostró que sólo el uso de Aglepristone es suficiente para garantizar la recuperación del paciente, similar a los descrito por Molina (18). El análisis debe ser encaminado no sólo a garantizar la fertilidad futura, sino de evitar los efectos colaterales y el riesgo para la supervivencia de la hembra, tras el uso de la prostaglandina sintética (16,25). Además, controvertir el concepto de que el piómetra como enfermedad reproductiva de la hembra canina, es una enfermedad de tratamiento quirúrgico (3,5,26), debido a la patogenicidad de su agente etiológico y su mortalidad (2,3,21), pues se sabe que los procedimientos como la ovario histerectomía, que elimina la posible recurrencia (11). Pero dejan a las hembras reproductoras sin la posibilidad de progenie. Sin embargo, los tratamientos quirúrgicos tienen sus límites donde el riesgo de cirugía se incrementa o existe el caso donde el dueño reproche la OVH porque son pacientes de alto costo reproductivo, en el que la posibilidad de esterilizaciones se considera onerosa (20). Es en este punto donde los antagonistas de la progesterona juegan un papel importante, en especial el uso del aglepristone, que debido a su ventaja farmacológica al facilitar la contractibilidad del miometrio, permite la eliminación del contendido piógeno (12,15,26), relajando el cuello uterino, debido a su efecto competitivo frente a la progesterona (17). Comparado con el uso de prostaglandina, que lisa el cuerpo lúteo (16), este permite al clínico una nueva posibilidad de alta efectividad en el tratamiento del piómetra tanto abierto como cerrado, se encontró reportes donde sólo el uso del aglepristone como único medicamento logró efectos benéficos curativos por encima del 75% (11); similar a lo descrito por Molina (18), donde encontró una recuperación total del

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mentioned by Molina (18), where the patient was completely cured, while the complementary use of aglepristone with prostaglandin F2α was 90% effective (7,15). Achieving recuperation within the first 3 weeks after initiating the treatment; with a short-term successful healing rate of 92.3%, the use of aglepristone as the only tool is certainly justifiable.

paciente. Mientras que el uso complementario de aglepristone con prostaglandina F2α, alcanzó el 90% de efectividad (7,15). Logrando la recuperación dentro de las 3 primeras semanas después de iniciado el tratamiento; con una tasa de curación exitosa de corto plazo de 92.3%, el uso de aglepristone como única herramienta es ciertamente justificable.

The therapeutic response to the use of aglepristone was excellent with no side effects. In addition, the presence of two treatment protocols allows the veterinarian the opportunity to manage medication depending on the severity of the case.

La respuesta terapéutica al uso de aglepristone fue excelente con efectos secundarios nulos, además, la presencia de dos protocolos de tratamiento permiten al médico veterinario tratante la oportunidad de manejar la medicación dependiendo de la severidad del cuadro.

In conclusion, treatments with aglepristone and a combination of aglepristone with cloprostenol, along with enrofloxacin, permit the recuperation of the animal with pyometra in the variables of the full blood count on day 28; nonetheless, the combination of aglepristone with cloprostenol obtained better results in the recuperation of the treated females.

En conclusión los tratamientos con aglepristone y aglepristone con cloprostenol, más combinación con enrofloxacina, permitieron la recuperación de los animales con piómetra en las variables de hemoleucograma al día 28 de evolución; sin embargo, la combinación aglepristone con cloprostenol obtuvo mejores resultados en la recuperación de las hembras tratadas.

Acknowledgements

Agradecimientos

To the Veterinary Clinic of Antioquia for allowing us to use their facilities and patients for the present study. To the Corporación Universidad de Sabaneta and to Caequinos for providing the technical personnel for the present study.

A la colaboración de la Clínica Veterinaria de Antioquia, por facilitar las instalaciones y pacientes para la presente investigación. A la Corporación Universitaria de Sabaneta y a Caequinos por proveer el personal técnico para el presente estudio.

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