Revista MVZ Córdoba 21(1):2016 by Revista MVZ Córdoba

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Revista MVZ Córdoba Journal MVZ Córdoba EDITOR

Marco González T. M.Sc. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COEDITOR CO-EDITOR

Salim Máttar V. Ph.D. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

ASISTENTES DEL EDITOR - ASSISTANT EDITORS Luis Carlos Salgado A. Ing. German Arrieta B. M.Sc. Diva Santana C. Lic. Universidad de Córdoba. Montería, Colombia

COMITÉ EDITORIAL - EDITORIAL COMMITTEE James N. Mills Nelson Alvis G. Raúl Poutou P. Oscar Vergara G.

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA U. de Cartagena, Cartagena, Colombia Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá Universidad de Córdoba, Colombia

COMITÉ CIENTIFICO - SCIENTIFIC COMMITTEE Nicholas Komar Maria Aguero R. Joaquín Quilez C. Claudio C. Fonseca Priscila V. Logato Marcelo B. Labruna

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

C.D.C. Atlanta, USA N. Y. Medical College, USA U. de Zaragoza, España U. Fed. de Vioçosa, Brasil U. Fed. de Lavras, Brasil U. de São Paulo, Brasil

Jorge Salazar B. Juan Carulla F. Henry Grajales L. Claudia Jiménez E. Agustin Góngora O. Sandra Pardo C.

Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D. Ph.D.

Texas Tech. University U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. Nacional, Colombia U. de Los Llanos, Colombia U. Nacional, Colombia

Revista MVZ Córdoba La Revista MVZ Córdoba es una publicación científica de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba, Montería, Colombia. Se publican artículos de procedencia nacional e internacional que estén relacionados con las ciencias agropecuarias en la modalidad de artículos originales de investigación, revisiones de literatura, comunicaciones breves y casos clínicos. Los temas que publica la Revista MVZ Córdoba tienen correspondencia con la medicina veterinaria, zootecnia, acuicultura, biología, biotecnología, ciencias básicas biomédicas, salud pública y otros tópicos de interés de las ciencias agropecuarias. La revista está dirigida a los profesionales de la medicina veterinaria, zootecnia, salud pública, epidemiología, acuicultura, biología, ciencias básicas biomédicas y biotecnología. Artículos y correspondencia: Los artículos deben ser enviados por correo electrónico al Editor de la Revista MVZ Córdoba. Correos: revistamvz@gmail.com revistamvz@unicordoba.edu.co Preparación de artículos: La información se puede encontrar en la sección Instrucciones para los Autores. También se puede consultar en el sitio web: http:// apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm. Suscripción: La Revista MVZ Córdoba se publica cada cuatro meses y circula los meses de abril, agosto y diciembre. Los números de un año se agrupan en un volumen comenzando por el del mes de abril. La suscripción anual tiene un valor de US $40 para Colombia; US $55 para América Latina y el Caribe; US $60 para USA y Canadá; US $75 para otras regiones. Para suscribirse, se debe diligenciar el formulario que aparece al final de cada revista. Reproducción e impresos: Se autoriza la copia de artículos para uso académico o científico de las instituciones, citando la fuente. Para obtener ejemplares impresos se debe hacer la solicitud al Editor a través de los correos de correspondencia de la Revista MVZ Córdoba. Publicidad: La Revista MVZ Córdoba y la Universidad de Córdoba aclaran que la aceptación de publicidad no compromete la aprobación ni el respaldo de los productos o servicios que contraten pautas comerciales o de difusión. Teléfono: (57) (4) 756 9027 - Montería, Colombia. Acceso en línea: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm En el enlace anterior, se puede encontrar la revista a partir del volumen 5, número 1 enero-junio de 2000, y acceder a los artículos completos, las instrucciones para los autores y las suscripciones.

Journal MVZ Córdoba The Journal MVZ Cordoba is a scientific publication of the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechny of the University of Córdoba, Montería, Colombia. It publishes national and international articles related to the agricultural sciences in the form of original investigation, literature reviews, short communications and clinical cases. The subjects that are published in Journal MVZ Córdoba correspond to veterinary medicine and zootechny, agriculture, biology, biotechnology, biomedical basic sciences, public health and other subjects of interest in agricultural sciences. The magazine is directed to professionals in veterinary and zootechny medicine, public health, epidemiology, aquaculture, biology, biomedical basic sciences and biotechnology. Articles and correspondence: Articles should be sent by via e-mail to the Editor of the Journal MVZ Córdoba. E-mails: revistamvz@gmail.com. revistamvz@unicordoba.edu.co. Articles preparation: Information can be found in the Instructions for Authors section. The website can also be consulted: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/ revistamvz/index.htm. Subscription: The Journal MVZ Córdoba is published every four months and circulates in the months of April, August and December. The issues are compiled in a yearly volume beginning with the month of April. The yearly subscription costs US$40 for Colombia; US $55 for Latin America and the Caribbean; US $60 for USA and Canada; US $75 for other regions. To subscribe, fill out the form that appears at the end of each magazine. Reproduction and printing: Copying articles for academic or scientific use of the institutions is authorized, citing the source. To obtain printed issues a request should be made to the Editor through the correspondence address of the MVZ Córdoba Magazine. Publicity: The Journal MVZ Córdoba and the Universidad de Córdoba make clear that accepting advertising does not affect the approval or backing of the products or services that have commercial ads or diffusion. Telephone: (57) (4) 756 9027 Montería, Colombia. Online access: http://apps.unicordoba.edu.co/revistas/revistamvz/index.htm. Starting with Volume 5, Issue 1 from January-June 2000, access to complete articles of the journal as well as instructions for authors and for subscriptions can be found in the above link.

Revista MVZ Córdoba Journal MVZ Córdoba

Categoría A1

Impresa desde Volumen 1, número 1, año 1994 Printed effective with Volume 1, issue 1, 1994 Publicación cuatrimestral / Published triannualy ISSN 0122-0268 Rev.MVZ Córdoba © 2016 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, Montería, Colombia. Financiada por / Sponsored by: Universidad de Córdoba

Revista MVZ Córdoba Volumen 21

ENERO - ABRIL

Número 1

CONTENIDO EDITORIAL

Virus Heartland: una nueva y emergente encefalitis transmitida por garrapatas Marco González, Salim Mattar

5099

ORIGINALES Efecto de factores ambientales sobre algunas características de la camada de cerdas 5102 en el trópico de México Jesús Ek M, José Segura, Alejandro Alzina Interacción época/densidad de siembra sobre la producción de ocho híbridos de maíz 5112 forrajeros, Ecuador Álvaro Cañadas, Carlos Molina, Diana Rade, Francisco Fernández

Relación entre el polimorfismo de genes y rasgos de producción de leche en la ovejas 5124 Teleorman cabeza negra Gras MA, Pistol GC, Pelmus RS, Lazar C, Grosu H, Ghita E

Eficiencia del uso de treonina para cerdos en fase de crecimiento

Marcos Ceron, Vladimir de Oliveira, Arlei de Quadros, Clóvis Gewehr, Leonardo Rocha, Débora Alves

5137

Comportamiento productivo de pollos cuello desnudo que se alimentaron con harina 5145 de hojas de arbustos Santos Herrera, Aslam Díaz

El Uso de las nuevas prácticas para la evaluación de la condición corporal Deniz Alic Ural

5154

Efecto del Glycoline® sobre la eficiencia reproductiva en vacas lecheras de alta 5163 producción Marcelo Del Campo, Marco Gonzalez, Hans Andresen, Freddy Cea

Digestibilidad de dietas con harina de hidrolizado de pescado, para el levante de 5177 arawana (Osteoglossum bicirrhossum) Mario Paz, John Meneses, Jorge López

Hábitos alimentarios de Cocobolo (Andinoacara pulcher) en la ciénaga Grande de 5189 Lorica, Colombia Charles Olaya-Nieto, Liquey Camargo-Herrera, Vanessa Díaz-Sajonero, Fredys SeguraGuevara

El suplemento de sustancias húmicas afecta la inmunidad innata en gallinas ponedoras 5198 en fase posmuda Rosa Sanmiguel, Iang Rondón

Distribución espacial y temporal de tallas de captura de Zungaro zungaro en la 5211 Orinoquia colombiana Hernando Ramírez-Gil

Revista MVZ Córdoba Volumen 21

ENERO - ABRIL

Número 1

Primera aproximación a la epidemiología molecular de la tuberculosis bovina en 5222 Colombia Jimena Jojoa-Jojoa, Maira Wintaco, Francisco Osorio, Gloria Puerto-Castro, Martha GuerreroGuerrero

Persistencia de patógenos en porcinaza líquida procesada en tanques estercoleros y 5237 biodigestores Oscar Betancur, Antonio Betancourt, Julián Estrada, Francisco Henao

Heredabilidades y tendencias genéticas para características reproductivas en una 5250 población de ganado Romosinuano en Colombia Oscar Vergara, Gustavo Ossa, Julieth Cabrera, Juan Simanca, Juan Pérez

COMUNICACIONES BREVES Análisis de la composición proximal de Chaetoceros calcitrans posterior a su 5258 criopreservación Joan Salas-Leiva, Enrique Dupré, Dayana Salas-Leiva

Parámetros hematológicos en guitarra shortnose Zapteryx brevirostris especies Müller 5265 y Henle, 1841 (Chondrichthyes, Rhinobatidae) Nathalia Barreto, Daniela Ferrer, Paula Baldassin, Denise Bobany

Journal MVZ Córdoba Volume 21

JANUARY - APRIL

Issue 1

CONTENTS EDITORIAL

Heartland virus: a novel and emerging tick-borne encephalitis Marco González, Salim Mattar

5099

ORIGINALS Effect of environmental factor on some litter traits of sows in the tropics Mexican

5102

Seasons and planting densities interaction on forage production of eight hybrids maize, Ecuador

5112

Relationship between gene polymorphism and milk production traits in Teleorman Black Head sheep breed

5124

Efficiency of threonine utilization in the growing pigs

5137

Productive performance of naked neck chickens that were fed leaf meal shrubs

5145

The use of new practices for assessment of body condition score

5154

The effect of Glycoline ® on reproductive efficiency in high-producing dairy cows

5163

Digestibility of diets with flour fish silage for the growing of arawana (Osteoglossum bicirrhossum)

5177

Feeding habits of Cocobolo Andinoacara pulcher in the cienaga Grande de Lorica, Colombia

5189

Supplementation with humic substances affects the innate immunity in layer hens in posfasting phase

5198

Spatial and temporal length distribution of Zungaro zungaro caught in the Orinoco River Basin of Colombia

5211

Jesús Ek M, José Segura, Alejandro Alzina

Álvaro Cañadas, Carlos Molina, Diana Rade, Francisco Fernández

Gras MA, Pistol GC, Pelmus RS, Lazar C, Grosu H, Ghita E

Marcos Ceron, Vladimir de Oliveira, Arlei de Quadros, Clóvis Gewehr, Leonardo Rocha, Débora Alves Santos Herrera, Aslam Díaz Deniz Alic Ural

Marcelo Del Campo, Marco Gonzalez, Hans Andresen, Freddy Cea

Mario Paz, John Meneses, Jorge López

Charles Olaya-Nieto, Liquey Camargo-Herrera, Vanessa Díaz-Sajonero, Fredys SeguraGuevara

Rosa Sanmiguel, Iang Rondón

Hernando Ramírez-Gil

Journal MVZ Córdoba Volume 21

JANUARY - APRIL

First approach to molecular epidemiology of bovine tuberculosis in Colombia

Jimena Jojoa-Jojoa, Maira Wintaco, Francisco Osorio, Gloria Puerto-Castro, Martha GuerreroGuerrero

Issue 1 5222

Persistence of pathogens in liquid pig manure processed in manure tanks and 5237 biodigesters Oscar Betancur, Antonio Betancourt, Julián Estrada, Francisco Henao

Heredabilities and genetic trends for reproductive traits in a population of Romosinuano 5250 cattle in Colombia Oscar Vergara, Gustavo Ossa, Julieth Cabrera, Juan Simanca, Juan Pérez BRIEF COMUNICATION

Proximate composition analysis posterior to the cryopreservation of Chaetoceros 5258 calcitrans Joan Salas-Leiva, Enrique Dupré, Dayana Salas-Leiva

Hematological parameters in shortnose guitarfish Zapteryx brevirostris Müller and 5265 Henle, 1841 (Chondrichthyes, Rhinobatidae) Nathalia Barreto, Daniela Ferrer, Paula Baldassin, Denise Bobany

Rev.MVZ Córdoba 21(1):5099-5101, 2016. ISSN: 0122-0268

EDITORIAL

Heartland virus: a novel and emerging tick-borne encephalitis Virus Heartland: una nueva y emergente encefalitis transmitida por garrapatas Heartland virus (HRTV) is a Bunyaviridae, phlebovirus that it has recently emerged as the causative agent of human disease characterized by thrombocytopenia and leukopenia in the United States and China. It seems to be the HRTV has been also reported in China, Japan and Korea. Recently the first fatal case of HRTV disease in an 80-year-old Tennessee resident was reported (1).

El Virus Heartland (HRTV) es un Bunyaviridae, Phlebovirus que ha surgido recientemente en los Estados Unidos y China como el agente causal de una enfermedad humana caracterizada por trombocitopenia y leucopenia. Parece ser que el HRTV ha sido reportado en China, Japón y Corea. Recientemente se reportó el primer caso fatal de la enfermedad HRTV en un residente de 80 años de edad de Tennessee (1).

Amblyomma americanum and Dermacentor variabilis ticks have been involved as a vector of HRTV in USA. The vertebrates amplification hosts associated with enzootic maintenance of the HRTV have been studied in Missouri. Neutralizing antibodies to HRTV in raccoons (42.6%), horses (17.4%), white-tailed deer (14.3%), dogs (7.7%) and opossums (3.8%) were identified. No antibodies were found in birds. The high seroprevalence associated with local abundance of white-tailed deer and raccoons demonstrated these species may be an amplification hosts. Virus isolation experiments from sera and ticks to detect HRTV virus were unsuccessful (2).

Las garrapatas Amblyomma americanum y Dermacentor variabilis han sido implicadas como vectores de HRTV in EEUU. La amplificación de huéspedes vertebrados asociados con el mantenimiento enzootico del HRTV ha sido estudiada en Missouri. Se identificaron anticuerpos neutralizantes a HRTV en mapaches (42.6%), caballos (17.4%), venado cola blanca (14.3%), perros (7.7%) y zarigüeyas (3.8%). No se encontraron anticuerpos en aves. La alta seroprevalencia asociada con abundancia local de venados cola blanca y mapaches demostró que estas especies pueden ser huéspedes amplificadores. Experimentos para aislar el HRTV a partir de sueros y garrapatas no han sido exitosos (2).

In 2012 in Missouri farms, 56.428 ticks of Amblyomma americanum and Dermacentor variabilis were collected. By using RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction), several nymphs pools of A. americanum were positive, 8 pools yielded viable viruses. Sequence data from the nonstructural protein of the small segment demonstrates that tick strains and human strains are very similar, ≥97.6% sequence identity (3).

En 2012, en fincas de Missouri, se recolectaron 56.428 garrapatas Amblyomma americanum y Dermacentor variabilis. Mediante el uso de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscriptasa inversa), varios grupos de ninfas de A. americanum fueron positivos, en 8 grupos se detectaron virus viables. Datos de la secuencia de la proteína no estructural del segmento pequeño demostró que las cepas de garrapatas y cepas humanas son muy similares, con un ≥97.6% de identidad en las secuencias (3).

This was the first study to isolate HRTV from ticks and they seem to be implicating as potential vectors. Amblyomma americanum possible to becomes infected by feeding on viremic hosts during the larval stage, and transmission to humans occurs during the spring and early summer when nymphs are abundant and actively host seeking (3).

Este fue el primer estudio para aislar HRTV de las garrapatas y al parecer están implicas como vectores potenciales. Amblyomma americanum es posible que se infecte al alimentarse de los huéspedes virémicos durante la etapa larval y la transmisión a los seres humanos se produce durante la primavera y principios del verano cuando las ninfas son abundantes y están activas buscando un huésped (3).

5100

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 21(1) Enero - Abril

A seroprevalence survey performed in Minnesota, USA, tested blood samples from domestic animals to determine antibodies to HRTV. Antibodies against virus nucleoproteins in 10%18% of samples from cattle, sheep, goats, deer, and elk in Minnesota counties were found (4). M o s t p a t i e n t s w i t h H R T V s h o w f e v e r, thrombocytopenia, leukopenia fatigue, anorexia, headache, nausea, myalgia, or arthralgia. A clinically compatible disease have been defined as fever (≥38.0°C), leukopenia (white blood cell count <4.500 cells/mm3; normal range = 4.500–12.000 cells/mm3), and thrombocytopenia (platelet count <150.000/mm3; normal range =150.000–400.000/ mm3) without a more probably clinical explanation. Physicians in Colombia and Latin America should recognize Heartland virus testing in patients who show fever, leukopenia, and thrombocytopenia without more likely evidence and who have tested negative for Ehrlichia, Anaplasma and Babesia infection or have not responded to doxycycline therapy (5). Recently, there was a report of the first fatal case of HRTV disease in an 80-year-old Tennessee resident. The patient was admitted at the clinic with fever, confusion, leukopenia, and thrombocytopenia and developed multiorgan failure and hemorrhage. The patient died on hospital day 15, and autopsy specimens were tested for various pathogens as part of an unexplained death evaluation. HRTV antigens were detected in postmortem spleen and lymph nodes by immunohistochemistry, and HRTV was detected in premortem blood by RT-PCR and the virus was isolated in cell culture (6). Because HRTV is an emerging virus, laboratory diagnosis is incipient yet, the diagnosis in Colombia and Latin America is extremely difficult. However, detection of viral RNA by RT-PCR on blood or tissue can be carry out, hence a ≥4-fold rise antibody titers by PRNT in acute and convalescent serum specimens can be carry out (5). Like other viruses, no vaccine or medication is available to prevent or treat Heartland virus disease. Because the virus possible is transmitted through infected ticks or other arthropods, prevention depends on using insect repellents, wearing long sleeves and pants and performing tick checks after spending time outdoors (5). In Colombia especially in the tropics, there are strong evidence of Amblyomma sp and Dermacentor ticks thus, it is likely that HRTV is circulating. The fatal cases in USA demonstrate

2016

En una encuesta de seroprevalencia realizada en Minnesota, EE.UU, en muestras de sangre de animales domésticos para determinar anticuerpos para HRTV. Los anticuerpos contra nucleoproteínas del virus fueron encontrados en un 10% -18% de las muestras provenientes de ganado, ovejas, cabras, ciervos y alces en el condado de Minnesota (4). La mayoría de los pacientes con HRTV presentan fiebre, trombocitopenia, leucopenia fatiga, anorexia, dolor de cabeza, náuseas, mialgia y artralgia. Una enfermedad clínicamente compatible con HRTV ha sido definida con fiebre (≥38.0°C), leucopenia (glóbulos blancos recuento <4.500 células/mm3; rango normal = 4.50012.000 células/mm3) y trombocitopenia (recuento de plaquetas <150.000 / mm3; rango normal = 150.000400.000/mm3) y sin una explicación clínica diferente a HRTV. Los médicos en Colombia y Latinoamérica deben reconocer el virus de Heartland en pacientes que presentan fiebre, leucopenia y trombocitopenia y que han resultado negativos para la infecciones por Ehrlichia, Anaplasma y Babesia o no han respondido a la terapia con doxiciclina (5). Recientemente hubo un informe del primer caso fatal de la enfermedad HRTV en un residente de Tennessee de 80-años de edad. El paciente fue ingresado a la clínica con fiebre, confusión, leucopenia, trombocitopenia, hemorragia y desarrollo de insuficiencia multiorgánica. El paciente falleció en el hospital 15 días después y muestras provenientes de la autopsia fueron probadas para diversos agentes patógenos como parte de una evaluación de una muerte inexplicable. Se detectaron antígenos HRTV post mortem en el bazo y los ganglios linfáticos por inmunohistoquímica y HRTV se detectó en la sangre pre mortem por RT-PCR y el virus se aisló en cultivo celular (6). Debido HRTV es un virus emergente, el diagnóstico de laboratorio todavía es incipiente, sin embargo, el diagnóstico en Colombia y Latinoamérica es extremadamente difícil. Sin embargo, la detección de ARN viral mediante RT-PCR en sangre o tejido se puede llevar a cabo, por tanto, un aumento de ≥4 de títulos de anticuerpos por PRNT en muestras de suero en convalecientes se puede llevar a cabo (5). Al igual que otros virus, no existe una vacuna o medicamento que esté disponible para prevenir o tratar la enfermedad de virus Heartland. Dado que es posible que el virus sea transmitido por garrapatas infectadas u otros artrópodos, la prevención depende del uso de repelentes de insectos, el uso de mangas largas, pantalones y la realización de controles de garrapatas después de pasar tiempo al aire libre (5). En Colombia, especialmente en los trópicos, hay una fuerte evidencia de Amblyomma sp y Dermacentor por lo tanto, es probable que HRTV esté circulando. Los

Mattar - Heartland virus: a novel and emerging tick-borne encephalitis

5101

that HRTV infection can cause severe disease and death. In Colombia, tick´s population are endemic affecting animals and people, the dissemination of the HRTV in Colombia is likely because the favourable geoclimatic conditions (7).

casos fatales en EE.UU. demuestran que la infección HRTV puede causar una enfermedad grave y la muerte. En Colombia, la población de garrapatas es endémica y afecta a los animales y a las personas, la difusión de la HRTV en Colombia probablemente sea debido a las condiciones geoclimáticas favorables (7).

Finally, tick-borne viruses that cause diseases in humans mainly belong to 3 families: Bunyaviridae, Flaviviridae, and Reoviridae, we actually in Latin America do not know about this vector borne disease, it is necessary to carry out several surveys to establish the prevalence of those viruses in the vectors and humans as well.

Por último, los virus transmitidos por garrapatas que causan enfermedades en humanos pertenecen principalmente a 3 familias: Bunyaviridae, Flaviviridae, y Reoviridae, en Latinoamérica no sabemos acerca de estas enfermedades transmitidas por vectores por lo que es necesario llevar a cabo varios estudios para establecer la prevalencia de aquellos virus en los vectores y los seres humanos.

Salim Mattar V. Ph.D.

Marco González T. M.Sc.

REFERENCES

Bosco-Lauth AM, Panella NA, Root JJ, Gidlewski T, Lash RR, Harmon JR, Burkhalter KL, Godsey MS, Savage HM, Nicholson WL, Komar N, Brault AC. Serological Investigation of Heartland Virus (Bunyaviridae: Phlebovirus) Exposure in Wild and Domestic Animals Adjacent to Human Case Sites in Missouri 2012-2013. Am J Trop Med Hyg. 2015; 92:1163-1167. Bosco-Lauth AM, Panella NA, Root JJ, Gidlewski T, Lash RR, Harmon JR, et al. Serological investigation of heartland virus (Bunyaviridae: Phlebovirus) exposure in wild and domestic animals adjacent to human case sites in Missouri 2012-2013. Am J Trop Med Hyg 2015; 92(6):1163-7. doi: 10.4269/ajtmh.14-0702.

Savage HM1, Godsey MS Jr, Lambert A, Panella NA, Burkhalter KL, Harmon JR, et al. First detection of heartland virus (Bunyaviridae: Phlebovirus) from field collected arthropods. Am J Trop Med Hyg. 2013; 89(3):445-52. doi: 10.4269/ajtmh.13-0209.

Xing Z, Schefers J, Schwabenlander M, Jiao Y, Liang M, Qi X, et al. Novel bunyavirus in domestic and captive farmed animals, Minnesota, USA. Emerg Infect Dis. 2013; 19(9):1487-9. doi: 10.3201/eid1909.130165.

Pastula DM, Turabelidze G, Yates KF, Jones TF, Lambert AJ, Panella AJ. Notes from the field: Heartland virus disease - United States, 20122013. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2014 Mar 28;63(12):270-1.

Muehlenbachs A, Fata CR, Lambert AJ, Paddock CD, Velez JO, Blau DM. Heartland virusassociated death in Tennessee. Clin Infect Dis. 2014; 59(6):845-50. doi: 10.1093/cid/ciu434.

7. Miranda J, Portillo A, Oteo JA, Mattar S. Rickettsia sp. Strain Colombianensi (Rickettsiales: Rickettsiaceae): A New Proposed Rickettsia Detected in Amblyomma dissimile (Acari: Ixodidae) From Iguanas and Free-Living Larvae Ticks From Vegetation. J Med Entomol 2012; 49(4):960-965. DOI: http://dx.doi. org/10.1603/ME11195.

Rev.MVZ Córdoba 21(1):5102-5111, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Effect of environmental factor on some litter traits of sows in the tropics Mexican Efecto de factores ambientales sobre algunas características de la camada de cerdas en el trópico de México Jesús Ek M,* M.Sc, José Segura C, Ph.D, Alejandro Alzina L, M.Sc. Universidad Autónoma de Yucatán, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Km 15.5 carretera Mérida-Xmatkuil, AP 4-116, Mérida, Yucatán, México. * Correspondencia: jeemvz@hotmail.com Received: May 2014; Accepted: April 2015.

ABSTRACT Objective. To determine the effect of environmental factors on litter traits at birth and weaning, and their repeatabilities in four farms in the sub-humid tropics of Mexico. Materials and methods. Data from 46.249 to 50.316 litters for litter size at birth (LSB), number of piglets born alive (NBA), litter weight at birth (LWB), number of piglets weaned (NPW) and litter weight at weaning (LWW) were used. The statistical model for LSB, NBA and LWB included the effects of farm, farrowing year, farrowing season, parity number, simple interactions, random effects of sow and the error term. NPW and LWW were analyzed using the previous model plus the linear and quadratic effects of lactation length (LL). Results. The means for LSB, NBA, LWB, NPW and LWW were 11.7 piglets, 11.0 piglets, 16.1 kg, 10.3 piglets and 61.3 kg, respectively. All effects in the model affected the litter traits. Farrowing year x season interaction was significant for NPW, LWB and LWW. The dry season had the highest LSB, NBA y NPW. First parity sows had higher LSB and NBA means than for second parity sows. Parity increase until parity 4 to decrease thereafter. LL had a quadratic effect on NPW and LWW. Repeatability estimates for LSB, NBA, and LWB were 0.12, 0.12 and 0.14, respectively. Conclusions. All traits studied were influenced by the environmental factors studied. Repeatabilities for LSB, NBA and LWB were low. Key words: Litter size, repeatability, reproduction, seasonal variation (Source:CAB).

RESUMEN Objetivo. Determinar el efecto de factores ambientales sobre características de la camada al nacer y al destete, y sus repetibilidades en cuatro granjas en el trópico sub-húmedo de México. Materiales y métodos. Se utilizaron los datos de 50.316 a 46.249 camadas para el total de lechones nacidos (LSB), lechones nacidos vivos (NBA) y peso de la camada al nacimiento (LWB), lechones destetados (NPW) y peso de la camada al destete (LWW). El modelo estadístico para LSB, NBA y LWB incluyen los efectos de granja, año, época, número de parto, interacciones simples, efecto aleatorio de cerda y error. El modelo para NPW y LWW incluyó los factores anteriores y además, los efectos lineal y cuadrático de largo de lactación (LL). Resultados. Las medias para LSB, NBA, LWB, NPW y LWW fueron 11.7 lechones, 11.0 lechones, 16.1 kg, 10.3 lechones y 61.3 kg, respectivamente. Todos los factores estudiados afectaron las características de la camada. La interacción de año x época fue significativa para NPW, LWB y LWW. La época seca presentó las mayores medias de LSB, NBA y NPW. Las cerdas primer parto obtuvieron medias de LSB y NBA superiores que las cerdas del segundo parto. Las medias 5102

Jesús Ek - Environmental factor on litter traits of sows

5103

por número de parto incrementaron hasta el cuarto, para después disminuir. La LL obtuvo un efecto cuadrático sobre NPW y LWW. Las repetibilidades estimadas para LSB, NBA, y LWW fueron 0.12, 0.12 y 0.14, respectivamente. Conclusiones. Todos los factores ambientales estudiados afectaron las características de la camada al nacer y al destete. Las repetibilidades estimadas fueron bajas. Palabras clave: Repetibilidad, reproducción, tamaño de camada, variación estacional (Fuente:CAB).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Litter size and piglet weight at birth and weaning are components of production that significantly influence the biological efficiency of sows and the profitability of farms. Hyperprolific modern sows have a high reproductive potential, which needs to be optimized according to the environmental and management conditions where they are employed. Important sources of variation in tropical regions are farm, farrowing year, farrowing season, and parity (1,2). In Mexico, there are few studies on the environmental factors affecting the size and litter weight at birth and weaning of sows in commercial pig farms under sub-humid tropical conditions (35). The identification of the factors affecting those components of productivity is necessary to adequate the operation, techniques and technologies of production systems. Furthermore, knowledge of the indicators is important to make better decisions, which means a better return on investment in swine production systems in tropical Mexico.

Los componentes de la producción, tales como el tamaño de la camada y el peso del lechón al nacer y al destete, afectan significativamente la eficiencia biológica de las cerdas y, por consiguiente, el rendimiento de las granjas. Las cerdas modernas hiperprolíficas poseen un gran potencial reproductivo, que es necesario optimizar en función de las condiciones ambientales y de manejo en las que se utilizan. La granja, el año, la época y el número de parto (1,2) son fuentes importantes de variación. En México, en granjas porcinas comerciales bajo condiciones tropicales subhúmedas, existen pocos estudios del efecto de los factores ambientales sobre el tamaño y peso de la camada al nacer y al destete (3-5). Es necesario adecuar el funcionamiento, las técnicas y las tecnologías de los sistemas de producción con el fin de identificar los factores que afectan dichos componentes de productividad. Por otra parte, en México tropical es importante el conocimiento de los indicadores para tomar mejores decisiones, lo que significa un mejor retorno sobre la inversión en los sistemas de producción porcinos.

Besides foregoing, when the best sows are selected early in life, a greater gain in productivity is expected, because highly heritable traits retain that superiority over their productive lifetime. It is therefore important to measure the extent of which this is likely to happen, through the calculation of the repeatability of the trait of interest (6).

Además de lo anterior, cuando se seleccionan las mejores cerdas en los primeros años de vida, se espera un aumento mayor de la productividad, porque las características altamente hereditarias conservan esa superioridad a lo largo de su vida productiva. Por lo tanto, es importante medir el alcance de aquellas que probablemente se presenten por medio del cálculo de la repetibilidad de la característica considerada (6).

The aim of this study was to determine the effect of some environmental factors on litter traits at birth and weaning, and to estimate the repeatability of birth traits in four farms located in the sub-humid tropics of Mexico.

El objetivo de este estudio realizado en cuatro granjas localizadas en las zonas tropicales subhúmedas de México fue determinar el efecto de algunos factores ambientales sobre las características de la camada al nacer y al destete y estimar la repetibilidad de sus rasgos de nacimiento.

MATERIALS AND METHODS Study site. Data from the four typical commercial farms of the state of Yucatan, Mexico, were used to for this retrospective study. Yucatan is located between 19°30′ and 21°35′ north and 90°24′ west. The climate of the region is sub-humid tropical, with an average temperature of 26.6°C, an average rainfall of 1,100 mm, and a relative humidity of 78% (7).

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio del estudio. Para este estudio retrospectivo se utilizaron los datos procedentes de cuatro granjas comerciales típicas del estado de Yucatán, México. Yucatán está localizado entre los 19°30’ y 21°35’ de latitud norte y 90°24’ de longitud oeste. El clima de la región es tropical subhúmedo, con una temperatura promedio de 26,6°C, una precipitación promedio de 1.100 mm, y una humedad relativa del 78% (7).

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Management in farms. Farms 1, 2 and 4 were full cycle farms with 3.900, 1.200 and 550 sows, respectively. Farm 3 was a two-site-type farm (breeding and production) with 320 sows. In all farms, breeding was carried out by artificial insemination; however if sows did get pregnant after three inseminations, natural mating with a boar was used. Estrus detection in sows was performed every day at 6:00 and 18:00 h using a boar, and inseminated two times (12-18 h), after estrus detection. Cross-fostering of piglets was carried out the first two days after birth in all farms. Sows were fed commercial diets according to their productive stage. Young sows (about 200 kg body weight) received 2.6 kg/ day of feed with 3,000 kcal EM/kg, 16% crude protein and 0.8% lysine; whereas sows over 300 kg of body weight received 3.2 kg/day of feed. The four farms produced their own replacements and quarantine the replacement gilts before entering the breeding herd (approximately 24 weeks of age), and they were mated after 210 day of age. Gilt and sows were vaccinated against parvovirus, leptospirosis, swine erysipelas, mycoplasmosis, and pleuropneumonia diseases. Animals. Data from 50.316 litters from 10.340 sows for total piglets born per litter (LSB), number of piglets born alive (NBA) and litter weight at birth (LWB), and 46.249 litters from 10.065 sows for number of piglets weaned (NPW) and litter weight at weaning (LWW) were used. Data were obtained from the computer recording system (PigCHAMP®) of the herds from 2007 to 2012. The main information used was farm name, sow identification, sow parity number, date of

2016

Manejo en las granjas. Las granjas 1, 2 y 4 eran de ciclo completo con 3.900, 1.200 y 550 cerdas, respectivamente. La granja 3 era del tipo de dos sitios (cría y producción) con 320 cerdas. En todas las granjas, la reproducción se llevó a cabo mediante inseminación artificial; sin embargo si las cerdas no quedaban preñadas luego de tres inseminaciones, se utilizó el apareamiento natural con un cerdo macho. La detección del celo en las cerdas se efectuó diariamente a las 6:00 y 18:00 horas usando un cerdo macho y se inseminaron dos veces (12-18 horas) después de la identificación del celo. La transferencia o adopción de lechones se llevó a cabo en todas las granjas en los primeros dos días después del nacimiento. Las cerdas se alimentaron con dietas comerciales de acuerdo con su etapa productiva. Las cerdas jóvenes (alrededor de 200 kg de peso corporal) recibieron 2.6 kg/día de alimentación con 3.000 kcal EM/kg (energía metabolizante), 16% de proteína bruta y 0.8% de lisina; mientras que las cerdas de más de 300 kg de peso corporal recibieron 3.2 kg/día de alimentación. Las cuatro granjas producían sus propios reemplazos y realizaban cuarentena para las cerdas jóvenes de reemplazo antes de entrar en el rebaño de cría (aproximadamente a las 24 semanas de edad), y los apareamientos después de los 210 días de edad. Las cerdas jóvenes y adultas se vacunaron contra parvovirus, leptospirosis, erisipela porcina, micoplasmosis, y enfermedades de pleuroneumonía. Animales. Se utilizó información de 50.316 camadas procedentes de 10.340 cerdas, correspondiente al total de lechones nacidos por camada (TCN), número de lechones nacidos vivos (LNV) y peso de

Table 1. Least squares means and standard errors by source of variation for total piglets born per litter (LSB), number of piglets born alive (NBA), litter weight at birth (LWB), number of piglets weaned (NPW) and litter weight at weaning (LWW) in four farms in the sub-humid tropics of Mexico. Source of

LSB

NBA

33231

11.9±0.03b

8286

12.5±0.04a

3546

9.88±0.05d

5253

10.42±0.04c

Variation

LWB (kg)

NPW

LWW (kg)

11.1±0.02b

16.7±0.04a

11.4±0.04a

16.0±0.05b

30688

10.6±0.02a

62.1±0.19b

7589

10.3±0.03b

9.49±0.05d

64.3±0.24a

13.3±0.08d

3111

8.2±0.05d

46.9±0.35d

9.72±0.04c

14.1±0.07c

4861

9.7±0.04c

53.8±0.28c

Farm

Farrowing season Dry

16122

11.3±0.03a

10.6±0.02a

15.3±0.05a

14879

9.9±0.02a

57.7±0.22a

Rainy

16973

11.2±0.03b

10.4±0.02b

15.1±0.05b

15484

9.6±0.02b

54.8±0.23b

Windy

17221

11.0±0.03c

10.3±0.02c

14.7±0.05c

15886

9.6±0.02b

58.0±0.01a

12245

11.1±0.0d

10.5±0.03d

14.5±0.05e

11361

9.9±0.03a

57.0±0.19ce

9989

10.7±0.0e

10.1±0.03e

15.0±0.04d

9273

9.8±0.03c

55.5±0.20d

8271

11.5±0.0b

10.9±0.03b

16.0±0.05a

7691

9.7±0.03bd

57.4±0.21c

6697

11.6±0.0a

11.0±0.03a

16.0±0.05a

6205

9.5±0.03e

58.2±0.24b

5452

11.5±0.04b

10.7±0.04c

15.6±0.06b

5020

9.5±0.04e

58.7±0.27b

4172

11.3±0.04c

10.4±0.04d

15.2±0.07c

3638

9.9±0.04a

59.8±0.32a

1494

11.1±0.07cd

10.3±0.07e

14.6±0.12e

1330

9.8±0.07abc

56.2±0.57e

1996

10.6±0.07e

9.5±0.06f

13.2±0.13f

1731

9.5±0.06de

51.6±0.61f

Number of farrowing

a,b,c,d

Different literal by main factor and column indicates significant difference (p <0.05).

Jesús Ek - Environmental factor on litter traits of sows

Figure 1. Year by season of farrowing interaction for litter weight at birth (LWB).

5105

Figure 5. Farm by season of farrowing interaction for litter weight at weaning (LWW).

la camada al nacer (PCN), y también información de 46.249 camadas procedentes de 10.065 cerdas correspondiente al número de lechones destetados (LD) y peso de la camada destetada (PCD). Estos datos se obtuvieron mediante el sistema informático de registro (PigCHAMP®) de los rebaños del año 2007 al 2012. La información principal utilizada fue el nombre de la granja, identificación y número de parto de la cerda, fecha de parto y destete, tamaño de la camada y peso en el momento del parto y del destete. Figure 2. Year by season of farrowing interaction for number of piglets weaned (NPW).

Figure 3. Year by season of farrowing interaction for litter weight at weaning (LWW).

Análisis de Datos. El modelo estadístico utilizado para las variables TCN, LNV y PCN incluyó los efectos fijos de granja [1,2,3,4], año de parto (2007, 2008,…, 2012), época de parto (seca, lluviosa y con nortes), número de parto de la cerda [1,2,3,4,5,6,7>8], las interacciones simples significativas, y los efectos aleatorios de cerda (0, σ2c) y el error NID (0, σ2e). La temporada seca comprende los meses de febrero a mayo, la lluviosa de junio a septiembre y la de nortes de octubre a enero. Las cerdas con 8 o más paridades se agruparon, debido al pequeño número de observaciones. Se analizó LD utilizando un modelo similar al descrito anteriormente, más el efecto lineal de LNV y los efectos lineales y cuadráticos de la duración de la lactancia (DL). El modelo para PCD fue similar al utilizado para LD pero incluyendo el efecto lineal de PCN en lugar del utilizado para LNV. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo mediante el procedimiento MIXED (8). Las estimaciones de repetibilidad y los errores estándar se calcularon solamente para TCN, LNV y PCN usando los componentes de varianza entre y dentro de las cerdas producidos mediante el procedimiento MIXED, de acuerdo con la fórmula proporcionada por Falconer y Mackay (6) y Becker (9). No se calcularon las repetibilidades para LD y PCD debido a la transferencia o adopción de lechones practicada en las granjas.

Figure 4. Farm by season of farrowing interaction for litter weight at birth (LWB).

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farrowing and weaning, litter size and weight at farrowing and weaning. Data analysis. The statistical model used for LSB, NBA and LWB included the fixed effects of farm [1,2,3,4], farrowing year (2007,2008,…, 2012) farrowing season (dry, rainy and windy), parity number of the sow [1,2,3,4,5,6,7>8], significant simple interactions, and random effects of sow (0, σ2c) and the error NID (0,σ2e). The dry season covers the months from February to May, the rainy season from June to September and the windy season from October to January. Sows with 8 or more parities were grouped, because of small number of observations. NPW was analyzed using a model similar to that previously described, plus the linear effect of NBA and the linear and quadratic effects of lactation length (LL). The model for LWW was similar to NPW but including the linear effect of LWB instead of NBA. The statistical analyses were carried out using the MIXED procedure (8). Repeatability estimates and standard errors were calculated only for LSB, NBA and LWB using both between and within sow components of variance produced by the MIXED procedure, according to the formula provided by Falconer and Mackay (6) and Becker (9). Repeatabilities for NPW and LWW were not calculated because of cross-foster of piglets practiced in the farms.

RESULTS The overall means and standard deviations for LSB, NBA, LWB, NPW and LWW were 11.7±3.11 piglets, 11.0±3.02 piglets, 16.2±4.35 kg, 10.3±3.12 piglets and 61.3±20.0 kg, respectively. Lactation length had a mean and standard deviation of 22.4±2.9 days. All the factors and interactions included in the models were significant (p<0.05) on the five response variables. The least squares means for the main factors are shown in table 1. The interaction of year x season of farrowings was significant for LWB, NPW, and LWW (Figure 1, 2 and 3, respectively). The highest mean at different season vary with the year. figure 1 and 2 show no trend; with means in different seasons and years; however, figure 3 results shows a trend of increasing LWW starting in 2009. The interaction between farm and farrowing season was significant for LWB and LWW. Figure 4 and 5 show different means of LWB and LWW for farms in different season.

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RESULTADOS Las medias generales y las desviaciones estándar para TCN, LNV, PCN, LD y PCD fueron 11.7±3.11 lechones, 11.0±3.02 lechones, 16.2±4.35 kg, 10.3±3.12 lechones y 61.3±20.0 kg, respectivamente. La duración de lactancia tuvo una media y una desviación estándar de 22.4±2.9 días. Todos los factores e interacciones incluidas en los modelos son significativas (p<0.05) para las cinco variables de respuesta. En la Tabla 1 se muestran Las medias de mínimos cuadrados para los factores principales. La interacción entre el año de parto y la época de parto es significativa para PCN, LD y PCD (Figura 1, 2 y 3, respectivamente). La media más alta en las diferentes temporadas varía con el año. Las figuras 1 y 2 no muestran ninguna tendencia con las medias en diferentes épocas y años; sin embargo, los resultados de la Figura 3 muestran una tendencia al aumento de PCD iniciando en el año 2009. La interacción entre el efecto granja y la época de parto es significativa para PCN y PCD. Las figuras 4 y 5 muestran diferentes medias de PCN y PCD para las granjas en diferentes temporadas. La granja 2 tuvo las medias más altas para TCN, LNV y PCD; la granja 1 tuvo las medias más altas para PCN y LD; y la granja 3 tuvo el peor desempeño. En la temporada seca se presentaron los valores más altos para TCN, LNV, PCN y LD, y la temporada lluviosa el valor más bajo de PCD. Las cerdas del primer parto tuvieron valores más altos de TCN y LNV que las del segundo parto (p<0.05), aumentaron posteriormente hasta el cuarto parto y luego disminuyeron en los siguientes partos. El valor más alto de PCN se obtuvo en los partos 3 y 4, y el mayor LD se encontró en los partos 1 y 6; el mayor PCD se encontró en las cerdas del parto 6. La duración de la lactancia tiene efectos lineales negativos (-1.3±0.056) y cuadráticos positivos (0.037±0.001) sobre LD, y efectos lineales positivos (3.22±0.27) y cuadráticos negativos (-0.012±0.005) sobre PCD. La variable LNV tiene un efecto lineal positivo (0.014±0.004) y la variable PCN tiene un efecto lineal positivo (0.14±0,019) sobre LD y PCD, respectivamente. Los valores correspondientes a la repetibilidad estimada y los errores estándar para TCN, LNV y PCN fueron 0.13±0.004, 0.12±0.004 y 0.14±0.004, respectivamente.

Jesús Ek - Environmental factor on litter traits of sows Farm 2 had the highest means for LSB, NBA and LWW; farm 1 had the highest means for LWB and NPW; and farm 3 had the worst performance. The dry season had the highest LSB, NBA, LWB and NPW, and the rainy season the lowest LWW. First parity sows had higher LSB and NBA than second parity (p<0.05), to increase thereafter until fourth parity and then decreased in the following farrowings. The highest LWB was obtained in farrowings 3 and 4, and the largest NPW was found in both farrowings 1 and 6; the largest LWW was found in sows of parity 6. Lactation length has negative linear (-1.3±0.056), and positive quadratic (0.037±0.001), effects on NPW, and positive linear (3.22±0.27) and negative quadratic (-0.012±0.005) effects on LWW. Positive linear effect of NBA (0.014±0.004) and positive linear effect of LWB (0.14±0.019) on NPW and LWW respectively. The repeatability estimates and standard errors for LSB, NBA, and LWB were 0.13± 0.004, 0.12± 0.004 and 0.14±0.004, respectively.

DISCUSSION The overall means and standard deviations for LSB and NBA were lower than those reported by Abell et al (10) in USA (14.8 and 11.6 pigs, respectively). However, the means here found are higher than mean reported by Diaz et al (11) in Colombia, who obtained 10.8 pigs for NBA. The LWB mean was similar than the mean reported by Chansomboon (1) in Thailand with 16 kg, and higher than those reported by Fraga et al (12) in Brazil and Gourdine et al (13) in Guadeloupe with 15.0 kg and 14.0 kg, respectively. Schwarz et al (14) reported a lower NPW mean (8.4 pigs) in Polish Large White sows. Also, Chansomboon et al (1), Diaz et al (11) and Gomez-Medina et al (5) reported means of 8.57, 10 and 9.44 pigs, respectively. The LWW mean here found is lower than that reported by Gourdine et al (13); however it is similar to the 60.8 kg reported by Sai et al (15). The differences in mean values may be due to geographical location, management and application of differences technologies, and commercial breeds used, as well as population structure and the presence or not of diseases in farms. The effect of farm on litter traits at birth and weaning has been reported by other authors (1,16,17). Farm differences primarily involves the skills and training of staff, housing systems, genetics of the reproductive herd, number of sows, average number of farrowing and implementation of reproductive and feeding techniques provided to the sow in the area of farrowing and lactation.

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DISCUSIÓN Las medias y desviaciones estándar generales para TCN y LNV fueron más bajas que las reportadas por Abell et al (10) en EE.UU. (14.8 y 11.6 cerdos, respectivamente). Sin embargo, las medias aquí encontradas son superiores a las reportadas por Díaz et al (11) en Colombia, quienes obtuvieron 10,.8 cerdos para LNV. La media para PCN es similar a la reportada por Chansomboon (1) en Tailandia con 16 kg, y mayor a la reportada por Fraga et al (12) en Brasil y Gourdine et al (13) en Guadalupe con 15.0 kg y 14.0 kg, respectivamente. Schwarz et al (14) reportaron una media para LD inferior (8.4 cerdos) en las cerdas polacas Large White. También, Chansomboon et al (1), Díaz et al (11) y Gómez-Medina et al (5) reportaron medias de 8.57, 10 y 9.44 cerdos, respectivamente. La media para PCD aquí encontrada es inferior a la reportada por Gourdine et al (13); sin embargo es similar a los 60.8 kg reportados por Sai et al (15). Estas diferencias de las medias se deben principalmente a la ubicación geográfica, manejo y aplicación de diferentes tecnologías y razas comerciales utilizadas, así como a la estructura poblacional y la presencia o no de enfermedades en las granjas. Otros autores (1,16,17) han informado acerca del efecto de granja sobre las características de la camada al nacer y al destete. Las diferencias entre las granjas involucran principalmente las habilidades y el entrenamiento del personal, sistemas de alojamiento, genética del rebaño reproductivo, número de cerdas, número promedio de partos y la aplicación de técnicas de alimentación y de reproducción proporcionadas a la cerda en el área de partos y lactancia. El efecto del año de parto se reportó para TCN y LNV (2,16,17). Es difícil explicar las causas de las diferencias entre los años estudiados en este trabajo, pero se podría atribuir a diferentes condiciones de manejo, diferencias de condiciones climáticas o a la experiencia del personal en el manejo de las cerdas. La interacción entre el año y la época de parto es significativa para PCN, LD y PCD, de manera similar a los resultados reportados por otros autores, bajo condiciones tropicales (1,18,19). Las diferencias para PCN y LD pueden ser debido a diferentes condiciones sanitarias y de manejo entre las temporadas y los años (Figura 1 y 2). Además, las prácticas de manejo adecuado pueden mejorar el PCD; la tendencia de aumento de PCD puede deberse al aumento del consumo de alimento. Sin embargo, la temporada lluviosa presentó las medias más bajas de PCD en todos los años (Figura 3). Se reportó que la combinación de alta temperatura y alta humedad durante la temporada lluviosa

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Effect of farrowing year has been reported for LSB and NBA (2,16,17). Causes of the differences between years studied in this work are difficult to explain but might be attributed to different management conditions, differences in climatic conditions or staff experience in sows management. The interaction of year by season of farrowing was significant for LWB, NPW and LWW, similar to the results reported by other authors, under tropical conditions (1,18,19). The differences for LWB and NPW could be due to management and sanitary differences between seasons and years (Figure 1 and 2). Additionally, appropriate management practices can improve LWW, the trend of increasing LWW might be due to increasing feed intake. However, the rainy season showed lowest means of LWW in all years (Figure 3). The combination of high temperature and high humidity during the rainy season has been reported to be partly associated with reduced appetite (17). According to Chambonson et al (1) the interaction is the result of the combined effects of nutrition (nutritional content and composition of diets), climate (seasonal fluctuations in humidity and temperature), and management during the different years. The effect of season or month on LSB and NBA in tropical regions has been reported by other authors (2,5,16,17,18). Suriyasomboon et al (17) and Tummaruk et al (2) indicate that in the tropics regions the effect of season is due to the high environmental temperature, high humidity, and to a lesser extent to changes in the photoperiod. Negative effect of high ambient temperature affects reproductive traits of sows, either by acting directly on ovarian function or to the hypothalamic-pituitary-ovarian axis level (17). Also, in tropical areas such as Thailand and Brazil, Suriyasomboon et al (20,21) and Freneau et al (22) indicate that the high temperatures have a significant negative effect on ejaculate volume, total sperm counts and the morphology of the spermatozoa of the boars. Table 1 shows a decrease in LSB and NBA from first to second parity, a phenomenon known as the syndrome of the second litter, which has been reported by other authors (23,24). Hoving et al (24) and Schenkel et al (25) indicate that the reduction in litter size after the first farrowing is probably due to a lower rate of ovulation and to an increase in embryo mortality because gilts are more susceptible to lose weight during lactation and have not finished their corporal development yet. First farrowing females with larger NBA may have not enough feed intake during lactation to fulfill their nutritional requirements, so that embryonic survival (and subsequent litter size) in these females is reduced.

2016

está parcialmente asociada con una reducción del apetito (17). Según Chansonboom et al (1), esta interacción es la consecuencia de los efectos combinados de nutrición (contenido nutricional y composición de dietas), clima (fluctuaciones estacionales de humedad y temperatura), y manejo durante los años de estudio. Otros autores (2,5,16,17,18) han reportado el efecto de la época o mes de parto sobre el TCN y LNV en regiones tropicales. Suriyasomboon et al (17) y Tummaruk et al (2) indican que en las regiones tropicales el efecto de la temporada se debe a la alta temperatura ambiental, alta humedad y en menor grado a los cambios del fotoperiodo. La alta temperatura ambiental tiene un efecto negativo sobre las caracteristicas reproductivas de cerdas, ya sea actuando directamente sobre la función ovárica o a nivel del eje hipotálamo-hipófisis-ovárico (17). También, en áreas tropicales tales como Tailandia y Brasil, Suriyasomboon et al (20, 21) y Freneau et al (22) indicaron que las altas temperaturas tienen un efecto negativo significativo sobre el volumen de eyaculado, total de recuento de esperma y morfología de los espermatozoides de los cerdos macho. La Tabla 1 muestra una disminución de TCN y LNV del primer al segundo parto, un fenómeno conocido como el síndrome de la segunda camada, que ha sido reportado por otros autores (23, 24). Hoving et al (24) y Schenkel et al (25) indican que la reducción del tamaño de la camada después del primer parto se debe probablemente a una baja tasa de ovulación y a un incremento de la mortalidad embrionaria. Esto es causado porque las cerdas jóvenes son más susceptibles a perder peso durante la lactancia y aún no han terminado su desarrollo corporal. Es posible que las hembras de primer parto con mayores LNV no hayan recibido suficiente alimentación durante la lactancia para satisfacer sus requerimientos nutricionales, por lo que en estas hembras se reduce la supervivencia embrionaria (y por consiguiente el tamaño de la camada). Otros autores han reportado el efecto del número de parto sobre TCN y LNV (2, 16, 17, 26). Además el efecto del número de parto sobre PCN, LD y PCD ha sido reportado por Tantasuparuk et al (18) y Chansomboon et al (1). El aumento habitual del tamaño de la camada hasta el parto 4 se debe probablemente a un incremento de la tasa de ovulación, la capacidad uterina y la edad de la cerda (27). La repetibilidad estimada para TCN es ligeramente menor (0.14) a la reportada por Nguyen et al (28); mientras que la repetibilidad para LNV es menor a la estimada (0.27) reportada por Adeoye

Jesús Ek - Environmental factor on litter traits of sows The effect of parity number on LSB and NBA has been reported by other authors (2,16,17,26). Also, the effect of parity number on LWB, NPW and LWW has been reported by Tantasuparuk et al (18) and Chansomboon et al (1). The usual increase in litter size up to parity 4 is probably due to the increase in ovulation rate, uterine capacity and age of the sow (27). Estimated repeatability for LSB is slightly lower than that (0.14) reported by Nguyen et al (28); whereas repeatability for NBA is lower than the 0.27 estimate reported by Adeoye et al (29) in native pigs in Nigeria, which is similar that reported by Segura et al (30) under the same conditions of the current study (0.12); however, is higher than the repeatability estimate (0.09) found by Nguyen et al (28). The repeatability here estimated for LWB is higher than that (0.11) reported by Adeoye et al (29), but equal to that (0.13) reported by Segura et al (30). According to Segura et al (30) the difference between repeatability estimates may be due to differences between breeds or genetic commercial lines, environmental conditions and management and statistical methods used. The repeatability means of estimated in this study were low suggesting that to improve these characteristics is more important to improve the management that to use genetic methods. In conclusion, under the conditions of this study, all the environmental factors studied were important sources of variation for all litter traits at birth and weaning. Therefore all of them should be considered in production programs to improve management strategies and herd feeding in order to reduce the effect of both season farrowing and number parity to improve farm’s productivity and profitability. Repeatability estimates were low but within the values reported in the literature.

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et al (29) en cerdos nativos en Nigeria, lo que es similar a lo reportado por Segura et al (30) en las mismas condiciones del presente estudio (0.12); sin embargo, es más alta que la repetibilidad estimada (0.09) encontrada por Nguyen et al (28). La repetibilidad aquí estimada para PCN es mayor que (0.11) la reportada por Adeoye et al (29), pero igual (0.13) a la reportada por Segura et al (30). Según Segura et al (30), la diferencia entre las repetibilidades estimadas puede ser causada por las diferencias entre razas o líneas comerciales genéticas, condiciones ambientales y de manejo y los métodos estadísticos utilizados. La repetibilidad promedio estimada en este estudio fue baja, lo que sugiere que para mejorar estas características es más importante optimizar el manejo que utilizar métodos genéticos. En conclusión, bajo las condiciones de este estudio, todos los factores ambientales analizados fueron importantes fuentes de variación para todas las características de la camada al nacer y al destete. Por lo tanto, se deben considerar todos estos factores en los programas de producción para mejorar las estrategias de manejo y alimentación del hato con el fin de reducir el efecto tanto de la época como del número de parto, y por consiguiente optimizar la productividad y rentabilidad de la granja. La estimación de las repetibilidades fueron bajas pero se encuentra dentro de los valores reportados en la literatura.

REFERENCES 1.

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5112-5123, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Seasons and planting densities interaction on forage production of eight hybrids maize, Ecuador Interacción época/densidad de siembra sobre la producción de ocho híbridos de maíz forrajeros, Ecuador Álvaro Cañadas L,1* Ph.D, Carlos Molina H,1 M.Sc, Diana Rade L,2 M.Sc, Francisco Fernández M,3 M.Sc. 1Instituto

Nacional de Investigaciones Nacionales, Estación Experimental Tropical Pichilingue, Km 5 vía Quevedo - El Empalme, cantón Mocache, Provincia Los Ríos, Ecuador. 2Escuela Superior Politécnica Agropecuaria de Manabí. Docente Investigador del Centro de Investigación de las Carreras de la ESPAM-MFL (CICEM). Campus Politécnico Calceta, Sitio El Limón, Calceta, Ecuador. 3Escuela Superior Politécnica Agropecuaria de Manabí del Centro de Investigación de las Carreras de la ESPAMMFL (CICEM). Campus Politécnico Calceta, Sitio El Limón, Calceta, Ecuador. *Correspondencia: alvarogustavo.canadaslopez@alumni.uni-goettingen.de Received: February 2015; Accepted: June 2015.

ABSTRACT Objective. To assess the interaction effect of the season and planting densities on the production of eight INIAP corn hybrids. Materials and methods. A research process was conducted in 2013. It was applied a split - split plot design with three replication and Tukey test was used. It was evaluated two planting seasons (28 January and 8 April), they were placed in large plots. Two planting densities (65,500 y 125,000 plants/ha), that were located in the subplots and eight INIAP corn hybrids arranged in the sub- subplots. The evaluated variables were Fresh Matter, Dry Matter, Plant Height and Crude Protein Results. Fresh Matter and Crude Protein productions were influenced by planting seasons. Plant densities affected the production of Fresh Matter, Dry Matter and Plant Height, as well as the interaction season by corn INIAP hybrids. While INIAP corn hybrids showed statistical differences in the production of Fresh, Dry Matter, Plant Height and Crude Protein. The eight INIAP hybrids productions were: Fresh Matter (58.86 ton/ha ±5.19); Dry Matter (21.45 ton/ha ±4.71); Plant Height (2.46 m ±0.16) and Crude Protein (10.6±1.12). Conclusions. The performance showed by hybrids INIAP CML-172, INIAP 6021 and INIAP 551 were very acceptable forage material and could be used for silage purposes. Key words: Biological production, forage, plant source protein, silage (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto de la interacción época y densidad de siembra en ocho híbridos de maíz para producción de forraje sobre la obtención de materia fresca MF, seca MS, altura de planta AP y proteína cruda PC. Materiales y métodos. Se empleó un diseño de parcela dos veces dividida con tres repeticiones. Se evaluó el efecto de dos épocas de siembra (28 de enero y el 8 de abril) que se dispusieron en la parcelas grandes, dos densidades de siembra (65.500 y 125.000 plantas/ha) que se ubicaron en las subparcelas y ocho híbridos de maíz INIAP dispuestas en las sub-subparcelas. Las variables evaluadas fueron producción de MF, MS, AP y PC. Resultados. La época de siembra tuvo 5112

Cañadas - Forage maize influenced by seasons and planting densities

5113

su influencia sobre la producción de MF y contenido de PC. La densidad de cultivo y época de siembra afectó la producción de MF, MS y AP por híbridos de maíz. Mientras que los híbridos INIAP de maíz mostraron diferencias estadísticas (p<0.001) en la producción de MF, MS, AP y PC. La producción de los ocho híbridos INIAP fue de MF (58.86 Ton/ha ±5.19); MS (21.45 Ton/ha ±4.71); AP (2.46 m±0.16) y PC (10.6±1.12). Conclusiones. Los rendimientos mostrados por los híbridos INIAP CML 172, INIAP 6021 e INIAP 551 son materiales aceptables con relación a las variables evaluadas y pueden ser empleados especialmente para ensilaje. Palabras clave: Ensilaje, forraje, producción biológica, proteína de fuente vegetal (Fuente: CAB).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

According to Cornejo and Wilkie (1) in the latest National Agricultural Census, Ecuador has an approximate bovine population of 4.5 million, dispersed throughout the nation; 51% in the interAndean region, 37% along the coast and 12% in the Amazon for milk and beef production. This cattle population is on a land extension of 3.35 million hectares of cultivated grassland and 1.12 million hectares of natural grassland (1). Of the total amount, 55% are criollo breed, 43% are Holstein F, Brahman and Cebuina hybrids and others; a small amount corresponds to pure breeds for meat, milk and double purposes. The total number of production units, about 427,000 are in one way or another used for this purpose (1).

De acuerdo a Cornejo y Wilkie (1), en el último Censo Agropecuario Nacional, Ecuador cuenta con una población aproximada de 4.5 millones de bovinos, distribuidos en todo el territorio nacional, el 51% en la región interandina, 37% en el litoral o costa y el 12% en la Amazonía, para la producción de leche y carne. Esta población ganadera se encuentra asentada en una superficie de 3.35 millones de hectáreas de pastos cultivados y 1.12 millones de hectáreas de pastos naturales (1). Del total de las existencias; el 55% pertenecen a la raza criolla, 43% mestizos Holstein F; Brahman; Cebuina y otros; una mínima proporción corresponde a razas puras para la línea carne, leche y doble propósito; siendo el número de unidades de producción, alrededor de 427 mil, que de una u otra manera se dedican a esta actividad (1).

Most of the livestock along the Ecuadorian coast is in areas where lack of rain in the summer results in pasture drying up, thus resulting in a deficit in the supply of cattle feed that results in economic and productive loss, including: absent or diminished heat, weight loss, reduced growth of young animals, birth of weak calves and higher rates of illness and death (2). Corn silage is widely used for lactating dairy cows that require energy-dense feed to maximize milk production. Decreased water availability is a critical element for agricultural sustainability, particularly in semi-arid regions of the world where there is not a sufficient supply of rainfall. To achieve adequate yields it is necessary to complement this water deficit by irrigation (3). The decline of water resources is exacerbated by an increasing demand for quality fodder necessary to obtain milk. To produce high energy corn silage, an adequate supply of water is necessary at the stage of grain filling. Thus, dependence on the production of dry matter in contrast with its availability is an important factor in maize production (4). Many components – environmental, cultural and genetic – quantitatively and qualitatively affect the production of fodder maize. Corn planting density can be increased in order to provide maximum production of dry matter (5). Since grain moisture is not of great interest in silage,

La mayor parte de la ganadería de la costa ecuatoriana se desarrolla en zonas donde los pastos, por la escasez o carencia de lluvia, se secan durante el verano, resultando como consecuencia un déficit en la oferta de alimento para el ganado, que acarrean pérdidas de carácter económico y productivo como son: ausencia o disminución de celo, pérdida de peso, disminución del crecimiento de los animales jóvenes, nacimiento de crías débiles e índices elevados de enfermedades y muertes (2). El ensilado de maíz es empleado extensamente para vacas lecheras lactantes que requieren alimentos ricos en energía con la finalidad de maximizar la producción lechera. El decrecimiento en la disponibilidad de agua es un elemento crítico, para la sostenibilidad de la agricultura, particularmente en regiones semi-áridas del mundo, la cantidad de agua no es suficientemente abastecida por las precipitaciones, por lo que para alcanzar buenos rendimientos sería necesario complementar este déficit hídrico mediante riego (3). La declinación de los recursos hídricos se agrava aún más por el incremento de la demanda de forrajes de calidad necesarios para la obtención de leche. Para la producción de forraje de maíz de alto valor energético se

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maize hybrids with higher leaf area and plant height may be employed. Planting density for silage has been essential for both grain production and fodder (6). It has been determined that optimal seeding density depends on the properties of the hybrid (7). Yilmaz et al (6) reported that fodder and dry matter production were significantly influenced by patterns of planting and seeding corn hybrids. There is a lack of precise information about the time and density planting for eight corn hybrids to produce high yields of fodder. Many experiments have been conducted to determine optimum planting density and sowing times for products developed by the National Institute of Agricultural Research (INIAP) for corn production. However, nothing is known about the behavior of these materials developed by INIAP for fodder production in relation to seasons and planting densities. Thus, the present study aims to evaluate how the time of planting and density affects eight corn hybrids in relation to production of fresh matter (MF), dry matter (MS), plant height (AP), and crude protein (PC) to obtain the greatest amounts of fodder maize in the INIAP Pichilingue Tropical Experimental Station, Ecuador.

MATERIALS AND METHODS Experimental area. This study took place at the Pichilingue Experimental Tropical Station (EETP) located in the West of the Andes Mountains at 75 m above sea level. The representative climatic season in the research area is Pichilingue, at 79°21`W and 1°06`S, with an average annual temperature of 25.47°C, relative humidity at 85.84%, with a heliophany of 898.66 hours light/year, a uni-modal type precipitation with a total of 2.000 mm/year and its distribution is show in in Figure 1.

Figure 1. Monthly distribution of precipitation in relation to the potential evapotranspiration model (red line). The fallow area represents the dry months at the Pichilingue weather station.

Cañadas et al (8) developed a model that predicts the value of evapotranspiration for 2013, which is described below and was applied to determine the hydric balance in the study area:

2016

requiere suministrar adecuadamente de agua en el momento del llenado de grano. De tal manera que, la dependencia de la producción de materia seca sobre la disponibilidad de la misma es un importante factor en la producción del cultivo del maíz (4). Muchos componentes entre ambientales, culturales y genéticos afectan cuantitativamente como cualitativamente la producción del forraje del maíz. La densidad de siembra del maíz puede ser incrementada con la finalidad de proveer el máximo de producción de materia seca (5). Desde que la humedad del grano no es de gran interés para el ensilaje, los híbridos de maíz que tienen áreas foliares mayores y altura de planta pueden ser empleados. La recomendación de la densidad de siembra para el ensilaje ha sido esencial tanto para la producción de grano como para el forraje (6). Se ha determinado que el óptimo de la densidad de siembra depende de las propiedades de los híbridos (7). Yilmaz et al (6), reportaron que el forraje y la producción de materia seca fueron significantemente influenciadas por los patrones de siembra, densidad de siembra e híbridos de maíz. Se carece de información precisa sobre la época y densidad de siembra de ocho híbridos de maíz que permitan obtener altos rendimientos de forrajes. Muchos experimentos han sido conducidos para determinar el óptimo de densidad de siembra y épocas de siembra de los materiales desarrollados por el Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) para producción de grano de maíz. No obstante, nada se sabe del comportamiento de estos materiales desarrollados por INIAP sometidos a la producción de forraje frente al comportamiento de épocas y densidades de siembra. De tal manera, que la presente investigación tiene por objetivo evaluar cómo afecta la época de siembra, densidad de siembra sobre ocho híbridos de maíz en relación a producción de materia fresca (MF), materia seca (MS), altura de planta (AP) y proteína cruda (PC), como base para obtener el máximo provecho de los maíces forrajeros en el área de influencia de la Estación Experimental Tropical Pichilingue del INIAP, Ecuador.

MATERIALES Y MÉTODOS Caracterización del área experimental. La presente investigación se llevó a cabo en la Estación Experimental Tropical Pichilingue (EETP), ubicada en la parte Oeste de la cordillera de Los Andes, a una altura sobre el nivel del mar de 75 m. La estación climatológica representativa del área de investigación es la estación Pichilingue, cuyas coordenadas geográficas son 79°21`W y

Cañadas - Forage maize influenced by seasons and planting densities PET=20.57*Es*(1-HR/100) Where: PET = Evapotranspiration (mm/month) Es = Saturated steam pressure (m bar) HR = Relative humidity The values of monthly evapotranspiration (dotted line) are represented opposite average annual rainfall (Figure 1). These two parameters determined the hydric balance of the Pichilingue station so that the months that showed a deficit in water availability were June, July, August, October and November (Figure 1, benefited area). The province of Los Ríos is within a Tropical RainForest (9). Data collection. Soil preparation for the experiment consisted of: fallow land, tracking, leveling, and preparation of furrows. In the last tilling, triple super phosphate was broadcast (0-46-0) and potassium murate (0-0-60). Fifteen days later, nitrogen was incorporated (corresponding to 150 kg of urea/ha) and at thirty days nitrogen was again applied (corresponding to 150 kg of urea/ha). This was done at the beginning of the rainy season, on January 28, 2013 and April 8, 2013 at the end of the rainy season (Figure 1). The spacing was 20 cm between each plant and 80 cm between rows (65,500 plants/ha) and 20 cm between plants and 40 between rows (125,000 plants/ha), using genetic material developed by INIAP: 1) (6016) L-41-2-6-1-PICHILINGUE-7928- X L- 237-2-1-3-POBLACION-A1XCML-172; 2) (6017) L-37-7-3-4-POZA RICA-8024 X L237-2-1-3-POBLACION-A1 X CML-172; 3) (6020) L-41-2-6-1-PICHILINGUE-7928- X CML-171 X CML172; 4) (6021) L- 41-2-6-1-PICHILINGUE-7928X L-37-7-3-4-2-POZA RICA-8024 X CML-172; 5) L-41-2-6-1-10≠PICHILINGUE-7928- X L 237-7-3-4-2-POB-A1 (INIAP H 553); 6) L-237-2-1-3-6POBLACION-A1-X–(CML-172); 7) INIAP-H-551; 8) INIAP H-601. Statistical analysis. A twice divided plot design was used, two rainy periods were established in large plots and in the subplots two seeding densities were established and in the plots were available sub-subplots eight maize hybrids were established with three replications. Each treatment was established on plots of 100 m2 and a total area of 3,600 m2. Analysis of variance was performed using the SAS program (10), and to test for differences between treatment averages the Tukey test was used at five percent. Fodder production was determined in tons per hectare, harvesting it in from two central rows from the net plot without sampling the last meter at the ends of each row. A digital scale was used

5115

1°06`S, presenta una temperatura promedio anual de 25.47°C, humedad relativa de 85.84%, acogiendo a una heliofanía de 898.66 horas luz/año, su precipitación es de tipo uni-modal, recibiendo un total de 2.000 mm/año y su distribución es representada en la figura 1. Cañadas et al (8), desarrolló un modelo que permitió predecir los valores de evapotranspiración para el año 2013, el cual se describe a continuación y fue aplicado para determinar el balance hídrico en el área de investigación: PET=20.57*Es*(1-HR/100) Donde: PET = Evapotranspiración (mm/mes) Es = Presión de saturación de vapor (m bar) HR = Humedad relativa Los valores de evapotranspiración mensual (Línea punteada) son representados en confrontación con la precipitación promedio anual (Figura 1). Estos dos parámetros determinaron el balance hídrico en la estación Pichilingue, de tal manera que, los meses que presentaron un déficit de disponibilidad de agua fueron junio, julio, agosto, octubre y noviembre (Figura 1, zona achurada). La provincia de Los Ríos pertenece a la formación ecológica de Bosque Húmedo Tropical (9). Obtención de datos. La preparación del suelo del experimento consistió en: un barbecho, rastreo cruzado, nivelación, trazo de surcos. En el último pase de rastra se aplicó al boleo superfosfato triple (0-46-0) y muriato de potasio (0-0-60). Luego de 15 días de la siembra se incorporó nitrógeno (equivalente a 200 kg de urea/ha), a los 30 días se volvió a aplicar nitrógeno (equivalente a 150 kg de urea/ha). La siembra se realizó al inicio de la época de lluvia el 28 de enero del 2013 y el 8 de abril del 2013 en el declive de la época de precipitación (Figura 1). El espaciamiento de siembra, se dispuso de 20 cm entre planta y 80 cm entre surcos (65,500 plantas/ha) y 20 cm entre plantas y 40 entre surcos (125,000 pantas/ha), empleando el material genético desarrollado por INIAP: 1) (6016) L-41-2-6-1-PICHILINGUE-7928- X L- 237-2-1-3-POBLACION-A1XCML-172; 2) (6017) L-37-7-3-4-POZA RICA-8024 X L237-2-1-3-POBLACION-A1 X CML-172; 3) (6020) L-41-2-6-1-PICHILINGUE-7928- X CML-171 X CML172; 4) (6021) L- 41-2-6-1-PICHILINGUE-7928X L-37-7-3-4-2-POZA RICA-8024 X CML-172; 5) L-41-2-6-1-10≠PICHILINGUE-7928- X L 237-7-3-4-2-POB-A1 (INIAP H 553); 6) L-237-2-1-3-6POBLACION-A1-X–(CML-172); 7) INIAP-H-551; 8) INIAP H-601.

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with a 40 kilograms capacity. A 1 kg sample of fresh fodder from each plot was taken, placed in paper bags, and sent to the Quality and Nutrition Laboratory of the Santa Catalina Experimental Station to be oven dried at 70°C for 48 h. The samples were weighed and put in the oven for an additional 12 h to obtain a constant weight and were then weighed to establish the production of dry matter. At the end of the study, ten plants in the net plot were measured at random to determine plant height. The crude protein content was obtained according to the method proposed by AOAC (11).

RESULTS Production of fresh material. In table 1, the analysis of variance is presented for fresh material.

Table 1. Significance of half squares for Fresh Material, Dry Material, Plant Height and Crude Protein for eight INIAP hybrids in two seasons and two planting densities at the Pichilingue Tropical Experimental Station. Source of variation

Degrees of liberty

Repetitions

5.45

2.32

0.26

0.07

Season (E)

956.34***

46.76 ns

0.52 ns

8.76**

Type A Error

1.53

3.14

0.007

0.32

Density (D)

799.26***

0.09**

0.23*

0.84ns

ExD

7.59 ns

86.26 ns

0.03 ns

0.01ns

Type B Error

2.70

28.33

0.02

0.437

INIAP hybrids (H)

ExH

40.16 ns

2.99 ns

0.001ns

0.07 ns

DxH

30.82 ns

51.47***

0.03 ns

0.82 ns

ExDxH

189.75 ns

5.74 ns

0.0003 ns

0.12ns

64.07*** 127.39*** 0.04**

Type C Error 56 263.24 6.36 0.01 Total 96 ns: Not significant *, **, ***: Indicates 0.05, 0.01 and 0.001 probability

2016

Análisis estadístico. Se empleó un diseño de parcela dos veces dividida, dónde en las parcelas grandes se ubicaron dos épocas de lluvia, en las subparcelas se establecieron dos densidades de siembra y en las subsub-parcelas se dispuso de ocho híbridos de maíz con tres repeticiones. Cada tratamiento estuvo instaurado en parcelas de 100 m2 y una superficie total de 3.600 m2. El análisis de varianza se realizó empleando el programa SAS (10), para probar las diferencias entre medias de tratamientos se empleó la prueba de Tukey al cinco por ciento. Se determinó la producción de forraje en toneladas por hectárea, cosechando el forraje de dos surcos centrales de la parcela neta, sin tomar muestras del último metro al extremo de cada surco y se empleó una báscula digital con capacidad de 40 kilogramos. Del forraje fresco de cada parcela se tomó una prueba de 1 kg, luego se colocó en fundas de papel y se enviaron al Laboratorio de Calidad y Nutrición de la Estación Experimental Santa Catalina, para ser deshidratadas en estufa a temperatura de 70°C por 48 h. Las muestras fueron pesadas e introducidas a la estufa por 12 h adicionales hasta obtener un peso constante y se pesaron para establecer la producción de materia seca. Dentro de la parcela neta al final del experimento se midieron diez plantas al azar para fijar la altura de planta. El contenido de proteína cruda se obtuvo de acuerdo a la metodología propuesta por AOAC (11).

12.84***

0.23

RESULTADOS

A high statistical significance (p˂0.001) for density and planting seasons and INIAP maize hybrids were found. The variation coefficients for large plots 2.10%, sub plots 2.81% and sub-subplots 2.13% support the results obtained for this parameter. Using the Tukey measurement test at five percent, the first range of statistical significance was determined (Figure 2A) during the planting season on January 28 2013 and planting density at 125,000 plants/ha (Figure 2B).

Producción de materia fresca. En la tabla 1, se presenta el análisis de varianza para materia fresca. Se detectó una alta significancia estadística (p˂0.001) para densidad y épocas de siembra e híbridos INIAP de maíz. Los coeficientes de variación para parcelas grandes de 2.10%, subparcelas de 2.81% y subsubparcelas 2.13% avalan los resultados obtenidos para este parámetro. Realizada la prueba de medias de Tukey al cinco por ciento, se ubicaron en el primer rango de significancia estadística (Figura 2A) a la época de siembra 28 de enero del 2013 y la densidad de siembra de 125.000 plantas/ ha (Figura 2B).

A high statistical difference (p˂0.001) was detected for INIAP hybrids (Table 2) where the means for MF was presented, and they were placed in three significant mean ranges. The INIAP 551, INIAP H 601, INIAP H 553 hybrids were in the first range and INIAP CML-172 in the second.

Una alta diferencia estadística (p˂0.001) se detectó para los híbridos INIAP (Tabla 2), donde se presenta la comparación de medias para MF, se discriminaron en tres rangos significativos de medias. Estando los híbridos INIAP 551, INIAP H 601, INIAP H 553 en primer rango e INIAP CML-172 en el segundo.

Cañadas - Forage maize influenced by seasons and planting densities A

Figure 2. A. MF production (Ton/ha) for two planting seasons, EETP. B. MF Production (Ton/ha) for two planting densities, EETP.

Production of dry material. A high statistical significance (p˂0.01) was detected for planting densities where the population of 125.000 plants/ ha was placed in the first range with 21.02 Ton/ha and in the second one the density was found (65.500 plants/ha) with a production of 20.95 Ton/ha according to the Tukey test (Table 1). A high statistical discrepancy (p˂0.001) showed INIAP maize hybrids (Table 2), where the averages are observed, the Tukey test discriminated in three average ranges. In the first range was the INIAP 6020 hybrid, in the second INIAP 553, INIAP CML-172 and in the third INAIP 6017, INIAP 6016, INIAP 551, INIAP H 601. The variation coefficients for large plots was 2.10%, subplots 2.81% and sub-sub-plots 2.13% back up the results. Table 2. Statistical significance of half squares for Fresh Material, Dry Material, Plant Height and Crude Protein for eight INIAP hybrids in two seasons and two planting densities at the Pichilingue Tropical Experimental Station. Genotypes MV MS AP INIAP 551 61.58a 18.92c 2.40b a c INIAP H 601 60.92 18.75 2.41b INIAP H 553 60.42a 23.17b 2.44b INIAP CML-172 60.17a 20.42b 2.44b INIAP 6021 59.16b 19.33c 2.45b INIAP 6020 56.58c 28.25a 2.39b c c INIAP 6017 56.56 19.92 2.60ª c c INIAP 6016 55.50 19.17 2.47a Average 58.86 21.45 2.46 Treatments with the same letter indicate statistical equality.

PC 10.50b 9.25d 10.33b 11.66ª 11.42ª 9.51c 8.67d 10.08b 10.62

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Producción de materia seca. Se detectó una alta significancia estadística (p˂0.01) para densidades de siembra, donde la población de 125.000 plantas/ha se ubicó en primer rango con 21.02 Ton/ha y en el segundo se encontró la densidad (65.500 plantas/ha) con una producción de 20.95 Ton/ha de acuerdo con la prueba de Tukey (Tabla 1). Una alta discrepancia estadística (p˂0.001) mostraron los híbridos de maíz INIAP (Tabla 2), donde se observan los promedios, la prueba de Tukey discriminó en tres rangos de promedio. En el primer rango estuvo el híbrido INIAP 6020, en el segundo INIAP 553, INIAP CML-172 y el tercero INAIP 6017, INIAP 6016, INIAP 551, INIAP H 601. Los coeficientes de variación para parcelas grandes de 2.10%, subparcelas de 2.81% y subsubparcelas 2.13% avalan los resultados obtenidos. En la figura 3, se presenta el promedio de la producción de materia seca para la interacción densidad por híbridos INIAP; demostrando la reacción de los diferentes híbridos a la densidad de siembra. La interacción que mayor producción de materia seca destaca fue la densidad 125.000 plantas/ha por el híbrido INIAP 6020 (32.08 Ton/ha). Altura de planta. Esta variable presentó significancia (p˂0.05) para densidades de siembra en concordancia con la altura de planta. De igual manera, se estableció una alta variación estadística (p˂0.01) para híbridos INIAP. Realizada la comparación de medias se determinaron dos rangos de significancia (Tabla 2). En el primer rango se ubicaron INIAP 6017, INIAP 6016 y en el siguiente INIAP 551; INIAP H 601; INIAP H 553; INIAP CML-172; INIAP 6021 e INIAP 6020 (Tabla 2). Los coeficientes de variación para parcelas grandes de 1.50%, subparcelas de 7.14% y subsubparcelas 10.13% son apropiados para investigaciones de campo. Proteína cruda. Se observó significancia estadística (p˂0.05), para el contenido de PC, la cual está influenciada por la época de siembra. Realizada la prueba de Tukey se dividió en dos rangos de clasificación de medias, en el primero se encontró la época de siembra 28 de enero del 2013 con un promedio de 10.45% y el segundo 8 de abril con un promedio de 9.87%. Para híbridos INIAP de maíz se encontró una mayor diferencia estadística en el porcentaje de PC (p˂0.0001). Se detectaron cuatro rangos de medias de acuerdo a Tukey, en el primero se encontró a los híbridos INIAP CML-172 e INIAP 6021, en el segundo INIAP 551, INIAP H 553 e INIAP 6016, en el tercero INIAP 6020 y el cuarto INIAP H 601 e INIAP 6017 (Tabla 2). Los coeficientes de variación para parcelas

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Figure 3. Density interaction for planting INIAP hybrids in relation to production of dry material, Pichilingue Station 2013.

In figure 3, the average dry matter production for density interaction in lNlAP hybrids is presented, showing the reaction of different hybrids to planting density. The interaction that increased production of dry matter density was 125.000 plants/ha for the INIAP 6020 hybrid (32.08 t/ha). Plant height. This variable presented significance (p˂0.05) for planting densities according to plant height. Similarly, a high statistical variation (p˂0.01) was established for INIAP hybrids. By comparing measurements, two ranges of significance were determined (Table 2). In the first range INIAP 6017, INIAP 6016 were placed, and in the following one INIAP 551; INIAP H 601; INIAP H 553; INIAP CML-172; INIAP 6021 and INIAP 6020 (Table 2). The variation coefficients for large lots was 1.50%, subplots 7.14% and sub-subplots 10.13% are appropriate for field studies. Crude protein. A statistical significance was found (p˂0.05), for PC content, which is influenced by the planting season. After doing the Tukey test, it was divided in two mean ranges of classification, in the first the January 28 2013 planting season was found with an average of 10.45% and the second April 8 with an average of 9.87%. For INIAP maize hybrids a major statistical difference was found in the percentage of PC (p˂0.0001). Four mean ranges were detected according to Tukey, in the first one INIAP CML-172 and INIAP 6021 hybrids was found, in the second one INIAP 551, INIAP H 553 and INIAP 6016, in the third INIAP 6020, and in the fourth INIAP H 601 and INIAP 6017 (Table 2). The variation coefficients for large plots at 5.58%, subplots at 6.42% and sub-subplots at 4.70% support the findings in this study.

grandes de 5.58%, subparcelas de 6.42% y subsubparcelas 4.70% avalan los resultados obtenidos en esta investigación.

DISCUSIÓN Influencia sobre materia verde. Una relación directa entre disponibilidad de agua a través de la época de siembran y la producción de materia fresca de maíz fue establecida. Es decir que, a mayor acervo de agua mayor será la producción de materia fresca de maíz. Estos resultados son consistentes con los encontrados por Ramírez et al (12) y Montemayor et al (13), quienes reportaron un incremento de 2.5 veces la producción de materia fresca del maíz pasando de riego gravitacional testigo a un riego más denso de riego por goteo. La producción de materia fresca fue afectada significativa y directamente proporcional con relación a la densidad de siembra; incrementando la densidad de siembra (por ejemplo de 40.000 a 100.000 plantas/ha) en maíz es un método empleado para ampliar la producción de biomasa, debido a los acrecentamientos de los procesos internos, índices de área foliar, intercepción de luz y rango de crecimiento (14). Para la producción total de material fresca, Yilmaz et al (6), concluyeron que, la producción de forraje difiere estadísticamente a lo largo de las densidades de siembra y se incrementa consistentemente a partir de 114.000 plantas/ha, para disminuir a partir de 143.000 planta/ha. Los híbridos de mayor producción promedio de materia fresca fueron INIAP 551 (61.58 Ton/ ha), INIAP H 601 (60.92 Ton/ha), INIAP H 553 (60.42 Ton/ha) e INIAP CML-172 (60.17 Ton/ ha). Estos datos pueden ser comparados con

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DISCUSSION Influence on fresh matter. A direct relationship between water supply at the time of planting and the production of fresh maize was established. That is, a larger supply of water increased the production of fresh maize. These results are consistent with those reported by Ramirez et al (12) and Montemayor et al (13) who reported that the production of fresh maize increased 2.5 times when they went from using gravitational irrigation to a more intense drip irrigation. Fresh matter production was significantly affected proportional to planting. Increasing planting density (from 40.000 to 100.000 plants / ha) is a method employed to increase production of biomass due to increased internal processes, leaf area indexes, light interception, and growth range (14). Regarding total production of fresh material, Yilmaz et al (6), concluded that fodder production differs statistically with planting densities and consistently increases from 114,000 plants/ha, and decreases from 143,000 plant/ha. The hybrids with greater average production of fresh material were INIAP 551 (61.58 Tons/ ha), INIAP H 601 (60.92 Tons/ha), INIAP H 553 (60.42 Tons/ha) and INIAP CML-172 (60.17 Tons/ha). These data can be compared with those obtained in Colombia in the Middle Sinú Valley by Cabrales et al (15), who evaluated 25 fodder maize genotypes and the best ones were Vera-225 (61.13 Tons/ha), SNPL-111 (60.62 Tons/ ha) and ICA-V-156 (60.42 Tons/ha). According to Núñez et al (16) in a study conducted in Mexico with hybrid maize, fodder producers established a density of 80 thousand plants/ha with irrigation and three phases of maturity, with an average of 57.90 Tons/ha of green fodder, and from there we can see that the productivity of hybrid INIAP maize is acceptable. Influence on dry matter. The planting density at 125,000 plants / a used in this study expresses a higher yield production for this parameter. Hence, the use of high densities of corn is a way of optimizing the soil use (17). Turgut et al (18), Yilmaz et al (6), and Budakli-Carpici (19) reported that different densities to maximize dry matter production range from 70,000 to 165,000 plants / ha. This trend was observed in this study. In this investigation, INIAP 6020 hybrid (28.25 Tons/ha), followed by INIAP 553 (23.17 Tons/ha) and INIAP CML-172 (20.42 Tons/ha) were the highest producing materials in dry matter. These data can be confronted with those of Cabrales et al (15) who evaluated 25 fodder maize genotypes

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los obtenidos en Colombia en el valle de Sinú Medio por Cabrales et al (15), donde se realizó la evaluación de 25 genotipos de maíz forrajero y los mejores genotipos fueron Vera-225 (61.13 Ton/ha), SNPL-111 (60.62 Ton/ha) e ICA-V-156 (60.42 Ton/ha). De acuerdo con Núñez et al (16) en su estudio conducido en México con híbridos de maíz productores de forrajes establecidos a una densidad de 80 mil plantas/ha, bajo riego y tres estados de madurez obtuvieron un promedio de 57.90 Ton/ha de forraje verde, de ahí que los rendimientos de los híbridos INIAP de maíz son aceptables. Influencia sobre materia seca. La densidad de siembra de 125.000 plantas/ha empleada en esta investigación expreso su mayor rendimiento para este parámetro de producción. De ahí que, el empleo de altas densidades de siembra del maíz es una forma de optimización del uso del terreno (17). Turgut et al (18), Yilmaz et al (6), BudakliÇarpici (19) reportaron que, diferentes densidades de siembra para maximizar la producción de materia seca van desde 70.000 a 165.000 plantas/ ha. Esta tendencia fue observada en la presente investigación. El híbrido INIAP 6020 (28.25 Ton/ha), seguidos por INIAP 553 (23.17 Ton/ha) e INIAP CML-172 (20.42 Ton/ha) fueron los materiales de alta producción de materia seca observados en esta investigación. Estos datos pueden ser confrontados con los de Cabrales et al (15) quienes, realizaron evaluaciones de 25 genotipos de maíz forrajero en el centro de Investigación de Turipaná de Corpoica, departamento de Córdoba, donde el genotipo HIT 34 mostró un total de 22.00 Ton/ha, Vera 225 registró 20.11 Ton/ha y SNLP 111 produjo 19.20 Ton/ha. Los contenidos más bajos de humedad estarían asociados a plantas más maduras. La interacción que dejó la máxima producción de materia seca, fue la densidad de siembra de 125.000 plantas/ha por el híbrido INIAP 6020 (32.08 Ton/ha). Es decir que, existió una relación directa proporcional entre densidad de siembra y producción de materia seca. Estos resultados son análogos con los encontrados por Budakli-Çarpici et al (19). En este estudio para la época de siembra 8 de abril, las plantas se encontraron con un déficit hídrico para los meses junio y julio (Figura 1), lo cual no crearon las mejores condiciones para soportar una mayor densidad de siembra investigada (Figura 3). Influencia sobre la altura de planta. Se encontró un efecto significativo directamente proporcional entre altura de planta y densidad de siembra. Esta tendencia fue corroborada por Gözübenli (20) quién registró que, la altura de la

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in the Turipaná Investigation Center in Corpoica, Córdoba, where the HIT 34 genotype had a total of 22.00 Tons/ha, Vera 225 recorded 20.11 Tons/ ha and SNLP 111 produced 19.20 Tons/ha. Lower humidity content is associated with more mature plants. The interaction that showed the greatest production of dry matter was the planting density of 125,000 plants/ha by the INIAP 6020 hybrid (32.08 t/ ha). That is, there was a direct proportional relationship between planting density and dry matter production. These results are similar to those found by Budakli-Carpici et al (19). In that study in the April 8 planting season, the plants had a water deficit in June and July (Figure 1), which did not create the best conditions to support a higher planting density (Figure 3). Influence on plant height. A directly proportionally significant effect between plant height and plant density was found. This trend was confirmed by Gözübenli (20) who showed that plant height increases as a result of plant density and the larger maize plants were measured and showed 2.08 m at a planting density of 120.000 plants/ha and the lowest was 1.99 m at a density of 80.000 plants/ ha. Increased maize planting density results in a narrower and longer stem. Studies have revealed that thin stem diameters and large plants were observed at high plant densities (17). In this investigation the hybrids that reached greater height were INIAP 6017 (2.60 m) and INIAP 6016 (2.47 m), while the rest of the materials were homogenous: INIAP 6021 (2.45 m); INIAP 553 (2.44 m); INIAP CML-172 (2.44 m); INIAP H 601 (2.41 m); INIAP 551 (2.40 m) and INIAP 6020 (2.39 m). Acosta (21) highlighted that an average tropical creole maize plant reaches a height of 2.20 to 3.20 m. Data obtained in this study could be compared to a study done by Sánchez et al (22) who studied the response to the selection of tropical varieties of maize in Mexico and reported an average plant height of 2.13 to 2.22 m. On the other hand, Ramírez et al (12) reported in their evaluation on the behavior of fodder maize under different irrigations in Torreón-San Pedro, Coahuila, Mexico, where gravitational irrigation recorded a height of 2.15 m and a greater density by drip irrigation was reached, 2.97 m. Influence on Crude Protein content (PC). Statistical significances for planting seasons (p˂0.05) were found; the Tukey test (5%) was performed, and the January 28, 2013 planting season came in first for PC content to (10.48%), followed by the April 8 2013 planting season (9.87%). These results are consistent with those obtained by Marsalis et al (4) and Gallegos et al

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planta se incrementa como consecuencia de la densidad de siembra y las plantas de maíz más grandes fueron medidas, mostrando 2.08 m bajo una densidad de siembra de 120.000 plantas/ ha y las más bajas fueron de 1.99 m a una densidad de 80.000 plantas/ha. El incremento de la densidad de siembra del maíz causa que el tallo se vuelva angosto y a menudo alto. Investigaciones revelaron que, los diámetros delgados de los tallos y plantas grandes fueron observados a altas densidades de plantas (17). En la presente investigación, los híbridos que alcanzaron la mayor altura fueron INIAP 6017 (2.60 m) e INIAP 6016 (2.47 m), mientras que el resto de materiales fueron homogéneos en la expresión de este carácter: INIAP 6021 (2.45 m); INIAP 553 (2.44 m); INIAP CML-172 (2.44 m); INIAP H 601 (2.41 m); INIAP 551 (2.40 m) e INIAP 6020 (2.39 m). Acosta (21) señaló que un maíz criollo tropical promedio alcanza entre 2.20 a 3.20 m de altura. Los datos obtenidos en esta investigación podrían ser comparados con el estudio conducido por Sánchez et al (22), al estudiar la respuesta a la selección de variedades tropicales de maíz en México, reportaron una altura de planta promedio de 2.13 a 2.22 m. Por otro lado, Ramírez et al (12), reportaron en su evaluación del comportamiento agronómico de maíces forrajeros bajo diferentes tratamientos de riego en Torreón-San Pedro, Coahuila, México, donde el tratamiento de riego gravitacional registró una altura de 2.15 m y a una mayor densidad de riego por goteo alcanzó 2.97 m. Influencia sobre el contenido de Proteína Cruda (PC). Se encontraron significancias estadísticas para épocas de siembra (p˂0.05), realizada la prueba de Tukey (5%) se ubicó en el primer rango de contenido de PC a la época de siembra 28 de enero del 2013 (10.48%), seguido por la época de siembra de 8 de abril del 2013 (9.87%). Estos resultados son consistentes con los obtenidos por Marsalis et al (4) y Gallegos et al (23), quienes sostienen que, el contenido de PC de genotipos de maíz se ve afectada por la aplicación de bajos volúmenes de agua de riego. Cusicanqui y Lauer (24) encontraron un decrecimiento del contenido de PC con el aumento de la densidad de plantación de 44.500 a 104.500 plantas/ha. Estos resultados son respaldados por aquellos estudios conducidos por Cox y Cherney (25) quienes reportaron una reducción de PC a altas densidades de siembra de maíz (116.000 plantas/ha vs. 80.000 plantas/ ha). Esta tendencia no pudo ser observada en la presente investigación (p˃0.05).

Cañadas - Forage maize influenced by seasons and planting densities (23), who argue that the CP content of maize genotypes is affected by low amounts of irrigation water. Cusicanqui and Lauer (24) found a decrease in the PC content with an increase in planting density of 44.500 to 104.500 plants/ha. These results are supported by studies conducted by Cox and Cherney (25), who reported a reduction of PC in high planting densities of maize (116,000 plants/ ha vs. 80,000 plants/ha). This tendency was not observed in this study (p˃0.05). Statistical differences between the INIAP material investigated (p˂0.001) in the PC content. The general average for INIAP hybrids was 10.62% (±1.12). Upon performing the Tukey test at 5%, four ranges were established; in the first range INIAP H 553 (11.67%) and INIAP 6021 (11.42%). INIAP H 601 (10.50%) and INIAP 6016 (10.08%) Were in the second range and in the third was INIAP 6020 (9.50%). In the Municipality of Gómez Palacios, Durango, México, the PC content shown by the fodder maize genotypes San Lorenzo 9.04%, AS-905 9.01% and RS-9022 8.57% (23) were below the PC content for INIAP hybrids. According to the standards of Peña et al (26), ranges of PC percentages from 8–12 are considered low quality levels. In conclusion, the maize crop in the Pichilingue Tropical Experimental Extension of the INIAP›s area of influence is seasonally dependent exclusively on rainfall. Results obtained in this study indicate that the time of maximum rainfall (planting date January 28) had 11.38% greater production of green matter than maize planted at the time of reduced rainfall (April 8 planting date). A reduced seeding density of 125.000 to 65.500 plants/ha reduced the production of green matter by 10.30%. Regarding maize hybrid density interaction, the INIAP 6020 hybrid and 125.000 seeding density was 20.11% greater than the INIAP 551 interaction density by planting 65.500 plants/ha in relation to production of dry material. The behavior of eight hybrids evaluated in these four variables were diverse. Thus, INIAP CML 172 hybrids with a MF production of 60.17 Tons/ha; MS 20.42 Tons/ha; AP 2.44 m and PC 11.66%. The INIAP 6021 hybrid with a MF production of 59.16 Tons/ha; MS 19.33 Tons/ha; AP 2.45 m and PC 10.42%. INIAP 551 hybrid with a MF production of 61.58 Tons/ha; MS 18.92 Tons/ ha; AP 2.40 m and PC 11.66%. The performance of these three INIAP maize hybrids shows they are very acceptable in relation to the variables evaluated and can be spatially used for silage.

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Existió diferencia estadística entre el material investigado de INIAP (p˂0.001) en el contenido de PC. El promedio general de los híbridos INIAP fue de 10.62% (±1.12). Realizada la prueba de Tukey al 5%, se establecieron cuatro rangos encontrándose en el primer rango INIAP H 553 (11.67%) e INIAP 6021 (11.42%). En el segundo rango se ubicó INIAP H 601 (10.50%) e INIAP 6016 (10.08%) y en el tercero INIAP 6020 (9.50%). En el Municipio de Gómez Palacios, Durango, México, los contenidos de PC mostrados por los genotipos de maíz forrajeros San Lorenzo 9.04%, AS-905 9.01% y RS-9022 8.57% (23), estuvieron por debajo del contenido de PC de los híbridos INIAP. Los porcentajes de PC de acuerdo a los estándares de Peña et al (26) rangos de 8 a 12 son considerados como niveles de baja calidad. En conclusión, el cultivo de maíz en el área de influencia de la Extensión Experimental Tropical Pichilingue del INIAP es estacional dependiente exclusivamente de la precipitación pluvial. Los resultados obtenidos en esta investigación indican que, la época de máxima precipitación (fecha de siembra 28 de enero) fue 11.38% mayor en producción de materia verde que la siembra de maíz en la época de disminución de las lluvias (fecha de siembra 8 de abril). Mientras que, al bajar la densidad de siembra de 125.000 a 65.500 plantas/ha significa una reducción de un 10.30% en la producción de materia verde. Con relación a la interacción densidad por híbrido de maíz, el híbrido INIAP 6020 y densidad de siembra 125.000 fue 20.11 % mayor que, la interacción densidad INIAP 551 por densidad de siembra 65.500 plantas/ha en relación a la producción de material seca. El comportamiento de los ocho híbridos evaluados en las cuatro variables evaluadas fue diversa. Así, los híbridos INIAP CML 172 con una producción MF de 60.17 Ton/ha; MS 20.42 Ton/ha; AP 2.44 m y PC 11.66%. El híbrido INIAP 6021 con una producción MF de 59.16 Ton/ha; MS 19.33 Ton/ha; AP 2.45 m y PC 10.42%. Así como el híbrido INIAP 551 con una producción MF de 61.58 Ton/ha; MS 18.92 Ton/ha; AP 2.40 m y PC 11.66%. Los rendimientos mostrados por estos tres híbridos INIAP de maíz son materiales muy aceptables en relación a las variables evaluadas y pueden ser empleados espacialmente para ser ensilados. Se sugiere realizar la evaluación de épocas y densidad de siembra sobre las características nutritivas de estos ocho híbridos de INIAP en relación al contenido de Fibra Detergente Neutra, Fibra Detergente Ácida, Digestibilidad in vitro y Extracto etéreo. Adicionalmente se

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It is recommended that an evaluation of planting times and nutritional characteristics of these eight hybrids INIAP be done regarding the content of neutral detergent fiber, acidic detergent fiber, in vitro digestibility and ethereal extract. Additionally, an economic analysis between maize productions as opposed to fodder production in order to determine its economic viability.

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debe realizar un análisis económico entre la producción de maíz para la producción de grano en contraposición con la producción de maíz forrajero con la finalidad de ver la viabilidad económica de esta práctica de producción.

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5124-5136, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Relationship between gene polymorphism and milk production traits in Teleorman Black Head sheep breed Relación entre el polimorfismo de genes y rasgos de producción de leche en la ovejas Teleorman cabeza negra Gras MA,* Ph.D, Pistol GC, Ph.D, Pelmus RS, Ph.D, Lazar C, Ph.D, Grosu H, Ph.D, Ghita E, Ph.D. National Research-Development Institute for Biology and Nutrition, Animal Biology Laboratory, Calea Bucuresti No.1, Balotesti, Ilfov, 077015, Romania, Tel. number:0040726585870 Fax number: 0040213512080. *Correspondence: mihai.gras@ibna.ro, gras_mihai@yahoo.com Received: November 2014; Accepted: May 2015.

ABSTRACT Objective. This study is a preliminary step of a larger national program aimed to develop a strategy for “in situ” preservation of Teleorman Black Head sheep population. In this paper we estimated the effect of β-lactoglobulin, casein and prolactin on some quantitative and qualitative milk traits in this local sheep population. Material and methods. Genotyping methodology included PCR for CSN3 (A and B alleles) and PCR-RFLP for LGB (A and B alleles) and PRL (T and C alleles), respectively. Repeated milking and milk composition analysis were used for the polymorphism effect estimation. Results. No association between CSN3 polymorphism and milk traits was found. Effect of LGB on production traits was quite constant. Genotype AA performed better than BB. PRL marker effect showed small differences than LGB. Concerning milk, fat and protein yield, AA genotype for PRL had a smaller positive impact than AA genotype for LGB. Regarding fat and protein content, PRL showed a negative effect for AA and positive for BB genotype, respectively. Conclusions. Positive association between LGB and milk yield and composition recommend this candidate gene like marker for a future MAS program. Although PRL gene is also associated with an increased milk quantity, inverse response over milk composition must be considered in MAS strategy. Our study demonstrated that both LGB and PRL markers could became an advent of MAS utilization in Romanian dairy sheep breeding industry. Key words: Biodiversity, gene, molecular markers, preservation, sequences (Source:AGROVOC).

RESUMEN Objetivo. Este estudio es un paso preliminar de un programa nacional más amplio destinado a desarrollar una estrategia para la conservación “in situ”de la población de ovejas Cabeza Negra de Teleorman. En este trabajo se estimó el efecto de la β-lactoglobulina, caseína y prolactina en algunos rasgos cuantitativos y cualitativos de la leche en esta población de ovejas locales. Material y métodos. Metodología de PCR para genotipificación incluido CSN3 (A y B alelos) y PCR-RFLP para LGB (A y B alelos) y PRL (T y C alelos). Análisis y composición de la leche de ordeños repetidos se utilizaron para estimación el efecto del polimorfismo. Resultados. No se encontró asociación entre el polimorfismo y la leche rasgos CSN3. Efecto de LGB en los rasgos de producción era bastante constante. Genotipo AA obtenido mejores resultados que BB. Efecto marcador PRL mostró pequeñas diferencias que LGB. En cuanto a la leche grasa y proteína el genotipo AA para PRL tuvo un impacto positivo más pequeño que el genotipo AA para LGB. En cuanto a contenido de grasa y proteína, PRL mostró un efecto negativo para AA y positivo para BB genotipo. Conclusiones.La asociación positiva entre LGB y la producción 5124

Gras MA - Local sheep preservation

5125

de leche y la composición recomienda este gen candidato como marcador para un futuro programa de MAS. Aunque gen PRL también se asocia con un incrementoen la cantidad de leche, la respuesta inversa sobre composición de la leche debe ser considerado en la estrategia de MAS. Nuestro estudio demostró que los marcadores tanto LGB y PRL podrían venir a ser utilizados en MAS en la industria rumanade cría deovejas lecheras. Palabras clave: Biodiversidad, genes, marcadores moleculares, preservación, secuencias (Fuente: AGROVOC).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

In Romania, sheep are managed in transhumance pastoralist system, using land resources otherwise useless for food production. Local sheep populations are well adapted to the harsh conditions in which they are grazed while still meeting the needs of their keepers. They can walk long distances while grazing, are resistant to diseases and parasites, survive through periods of feeding scarcity and other environmental stressors and have good prolificacy Carta et al (1). These adaptive traits and non-income ecosystem benefits, generally unappreciated, are major reasons to conserve this genetic resource is important. Teleorman Black Head is a dual purpose (milk and meat) local breed with male lambs commercialized for meat in spring, immediately after weaning and the milk used for cheese making. The breed is enlisted in the Domestic Animal Diversity Information System from FAO (http://dad.fao.org/). Selection in these sheep was performed mostly empirical and exclusively on own performance records, without a centralized selection goal. For this reason milk traits have large variability, with milk yield ranging between 160-210 liters, and fat percentage between 6.56-7.16% Pelmus et al (2).

En Rumania, el manejo de las ovejas se realiza mediante el sistema de pastoreo trashumante en zonas donde la tierra no se puede utilizar para la producción de alimentos. Las poblaciones ovinas locales están bien adaptadas a las duras condiciones del terreno donde pastan y donde se satisfacen completamente las necesidades de sus pastores. Pueden recorrer largas distancias mientras se alimentan, son resistentes a enfermedades y parásitos, sobreviven a los períodos de escasez de alimento y a otros factores ambientales de estrés y además tienen buena prolificidad, Carta et al (1). Estas características adaptativas y beneficios ecosistémicos, que por lo general no se valoran, son las principales razones por las que es importante conservar este recurso genético. La raza local Cabeza Negra de Teleorman tiene un doble propósito (leche y carne); los corderos se comercializan para carne en la primavera inmediatamente después del destete y la leche se utiliza en la fabricación de queso. La raza está incluida en el Sistema de Información sobre la Diversidad de los Animales Domésticos de la FAO (http://dad.fao.org/). La selección de estas ovejas se realizó principalmente en forma empírica y exclusivamente de los propios registros de desempeño, sin un objetivo de selección centralizado. Por esta razón, las características lácteas tienen gran variabilidad, con una producción de leche que oscila entre 160 y 210 litros y un porcentaje de grasa entre 6.56 y 7.16%. Pelmus et al (2).

“In situ” conservation, i.e. conservation of breed and the production system in which breed has evolved, is the overall objective of the project. Genetic improvement of milk production is needed if this population is to remain economically viable and, therefore, a critical step toward “in situ” preservation of the breed. Genetic improvement of milk production is needed to keep this breed economically viable. Small farms, absence of animal identification, pedigree structure and recording system, use of multiple rams and low heritability sex linked trait make implementation of a traditional breeding program impossible, but the implementation of MAS program should be feasible (3). Toward this objective, this preliminary study aimed to investigate the polymorphism of three genes known to be associated with milk yield and cheese production in several TBH sheep populations.

El objetivo general del proyecto es la conservación “in situ”, es decir, la conservación de la raza y el sistema de producción en el que la raza ha evolucionado. Se necesita de un mejoramiento genético de la producción de leche para que esta población siga siendo viable económicamente y, por tanto, un paso crítico hacia la conservación “in situ” de la raza. Es necesaria la mejora genética de la producción de leche para mantener esta raza económicamente viable. Las granjas pequeñas, la falta de identificación de los animales, el sistema de registro y la estructura de pedigrí, el uso de múltiples carneros y las características de baja heredabilidad ligada al sexo hacen imposible la implementación de un programa de cría tradicional, pero factible la puesta en práctica del Programa MAS (3). Con este

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Within the cheese industry, a special interest has been placed on the practical applications of the genetic markers in breed development programs and preservation strategies (4). For this purpose, substantial attention was attributed to the genetic structure of native sheep populations and the possible relationship between the genetic variants of milk protein genes and milk related traits (5). Β-lactoglobulin (LGB) is the major whey protein found in the milk of a number of species, accounting for approximate 75% of the albumin fractionencoded by LGB gene. This gene is highly and specifically expressed in bovine mammary gland during lactation. One of the most extensively studied milk protein polymorphisms is the substitution of the amino acid Tyr20 with His in the LGB polypeptide (6) resulting in a saI restriction fragment length polymorphism which permits the genotyping of animals with a PCRRFLP method (7). Caseins (CSN) are a family of milk proteins that exist in several molecular forms (αs1‐, αs2‐, β‐, Κ‐ casein) and are the main proteins present in milk (e.g. 80% in cow milk). Among these isoforms, kappa‐casein (CSN3) was demonstrated to have an important role in improving milk yield in cattle. Genetic variability in the CSN3locushas been reported for several breeds, with allelic frequencies incorporated into studies on genetic diversity among breeds (8). The lactogenic hormone prolactin (PRL), protein encoded by PRL gene plays an important role in milk production (9). It was demonstrated that PRL depletion in sheep was associated with reduction of milk secretion (8), suggesting that this hormone is a functional candidate gene for estimating of variations in milk yield. The PRL gene is located in ovine chromosome 20, in a region where putative QTL for milk, fat, and protein yield (4) and for fat percentage have been identified (10). Also, PRL gene was proposed to be used as a positional molecular marker associated with milk production and milk composition traits (9).

2016

objetivo, el presente estudio preliminar tuvo como objetivo investigar el polimorfismo de tres genes que se sabe están asociados con la producción de leche y la producción de queso en varias poblaciones de ovejas CNT (Cabeza Negra de Teleorman). Dentro de la industria del queso, se ha puesto especial interés en las aplicaciones prácticas de los marcadores genéticos en los programas de desarrollo de razas y las estrategias de conservación (4). Con este fin, se da una atención especial a la estructura genética de las poblaciones nativas de ovejas y la posible relación entre las variantes genéticas de los genes de las proteínas de la leche y las características relacionadas con la leche (5). La B-lactoglobulina (LGB) es la principal proteína del suero que se encuentra en la leche de un número de especies, lo que representa aproximadamente el 75% de la fracción de albúmina codificada por el gen LGB. Este gen se manifiesta elevada y específicamente en la glándula mamaria bovina durante la lactancia. Uno de los polimorfismos de la proteína de la leche mas extensamente estudiados es la sustitución del aminoácido Tyr20 con His en el polipéptido LGB (6), dando como resultado un polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción SaI que permite la determinación del genotipo de los animales con un método RCP-PLFR (7). Las caseínas (CSN) son una familia de proteínas lácteas que existen en varias formas moleculares (αs1-, αs2-, β-, Κ-caseína) y son las principales proteínas presentes en la leche (por ejemplo, 80% en la leche de vaca). Entre estas isoformas, la kappa-caseína (CSN3) demostró tener un papel importante en la mejora de la producción de leche en el ganado. Se reportó la variabilidad genética en el locus CSN3 para varias razas, con frecuencias alélicas incorporadas en los estudios sobre la diversidad genética entre razas (8).

MATERIALS AND METHODS

La hormona prolactina lactogénica (PRL), proteína codificada por el gen PRL, juega un papel importante en la producción de leche (9). Se demostró que la disminución de PRL en las ovejas se asocia con una reducción de la secreción de la leche (8), lo que sugiere que esta hormona es un gen candidato funcional para estimar las variaciones de la producción lechera. El gen PRL se encuentra en el cromosoma 20 de los ovinos, en una región donde se identificó un supuesto locus de caracteres cuantitativos (QTL por sus siglas en inglés) de la leche, producción de proteína (4) y porcentaje de grasa (10). También, se propuso utilizar el gen PRL como un marcador molecular posicional asociado con la producción de leche y las características de composición láctea (9).

Animals and production traits. A total of 81 randomly selected ewes belonging to TBH breed

A partir de esta información, el objetivo de nuestro estudio consistió en evaluar la relación entre el

Starting from these data, the aim of our study was to evaluate the relationship between LGB, CSN and PRL gene polymorphism and the milk production traits in TBH breed using PCR-RFLP technique and general linear models.

Gras MA - Local sheep preservation from National Research Development Institute for Animal Biology and Nutrition (IBNA) flock were used for this study. Milk samples were obtained from each sheep at repeated intervals (14 days) between February - September 2011 and milk yield, fat and protein content were measured. Protein and fat content was quantified using Ecomilk analyzer. Blood samples were collected into a heparinized tube from the jugular vein of each sheep for DNA analysis. Ethical aspects. Blood and milk samples were collected with veterinary assistance, and cared for procedure for sample collection, handle and preservation techniques, in accordance with the Romanian Law 206/2004 for handling and protection of animals used for experimental purposes. The study protocol was approved by the Ethical Committee of the National ResearchDevelopment Institute for Biology and Animal Nutrition, Balotesti, Romania. Genomic DNA extraction. Genomic DNA was extracted from whole blood using a commercial kit (Wizard® Genomic DNA Purification Kit, Promega Corp., USA), according to manufacturer`s recommendations. PCR conditions. PCR was carried out in a total volume of 20 µl, containing 25-75 ng genomic DNA, 200 µM dNTPs (Promega Corp., USA), 0.3 µM each primerand 1.25 units DNA polymerase (GoTaq Polymerase, Promega Corp., USA). PCR amplification was performed ina Corbett Research thermal cycler (Palm – Cycler, CG1-96 model). Thermal profile for LGB and CSN3 genes amplification consisted from an initial denaturation step at 95°C for 10 minutes, followed by 35 amplification cycles of 30 seconds denaturation (at 95°C), annealing for 30 seconds (at 60°C for BLG and at 56°C for CSN3 genes), extension for 30 seconds at 70°C and one step of final extension at 70°C for 10 minutes. The amplified 120 bp long PCR product of LGB gene was digested with RsaI restriction endonuclease (Promega Corp., USA), at 5U/20µl concentration, for 3 hours at 37°C and separated on ethidium bromide-stained 2% agarose gel in TAE buffer. Genotyping of the identified SNP located on CSN3 gene was performed using a set of primers combining one forward (CSN3-TC) and two reverse (CSN3-T and CSN3-C) primers, as shown in table 1. Amplification protocol involved two reactions per sample containing SNP-TC/SNP-T and SNP-TC/ SNP-C primer pairs respectively, as described by Feligini cited by Giambra and Erhardt (5). This

5127

polimorfismo de los genes LGB, CSN y PRL y las características de producción de leche en la raza CNT utilizando la técnica RCP-PLFR y los modelos lineales generales.

MATERIALES Y MÉTODOS Animales y características de producción. Para este estudio se utilizó un rebaño con un total de 81 ovejas pertenecientes a la raza CNT del Instituto Nacional de Desarrollo de la Investigación para Biología Animal y Nutrición (IBNA), las cuales fueron seleccionadas aleatoriamente. Se obtuvieron muestras de leche de cada oveja en intervalos repetidos (14 días) entre febrero y septiembre del año 2011 y se midió la producción de leche, grasa y el contenido proteínico. Los contenidos de proteínas y grasas se cuantificaron utilizando un analizador Ecomilk. Las muestras de sangre para el análisis de ADN se tomaron de la vena yugular de cada oveja en un tubo heparinizado. Aspectos éticos. Las muestras de sangre y leche se recogieron con asistencia veterinaria y cumpliendo con los procedimientos para la toma de muestras, manejo y técnicas de conservación, de conformidad con la Ley rumana 206/2004 sobre el manejo y protección de los animales utilizados para experimentación. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Ético del Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo para la Biología y Nutrición Animal, Balotesti, de Rumania. Extracción de ADN genómico. El ADN genómico se extrajo de la sangre total utilizando un kit comercial (Wizard® Genomic DNA Purification Kit, Promega Corp., EE.UU.), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Condiciones RCP. La RCP se llevó a cabo en un volumen total de 20 µl, que contenía 25-75 ng de ADN genómico, 200 µM dNTPs (desoxirribonucleósidos trifosfato) (Promega Corp., EE.UU.), 0,3 µM de cada cebador y 1,25 unidades de ADN polimerasa (GoTaq Polymerase, Promega Corp., EE.UU.). La amplificación por RCP se realizó en un termociclador Corbett Research (Palm-Cycler, modelo CG1-96). El perfil térmico para la amplificación genética LGB y CSN3 consistió de una etapa de desnaturalización inicial a 95°C durante 10 minutos, seguido por 30 segundos de desnaturalización de 35 ciclos de amplificación (a 95°C), hibridación durante 30 segundos (a 60°C para los genes BLG y a 56°C para los CSN3), la extensión por 30 segundos a 70°C y una etapa de extensión final a 70°C durante 10 minutos. El producto RCP amplificado a 120 pb (pares de base) del gen LGB se digirió con la endonucleasa de restricción RsaI (Promega Corp., EE.UU.), en concentración 5U/20μl, durante 3 horas a 37°C y se separó con una tinción de bromuro de etidio del 2%

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Table 1. Nucleotide sequences of primers used for PCR-RFLP. Orientation

Primer length (bp)

Tm (°C)

ACCTCTCTTCGGAAATGTTCA

CTGTTGGGCTTGCTCTTTGTC

CTTCGATGACAAAATAGCCAA

Gene

Primer sequence (5`→ 3`)

Prolactin (PRL)

kappa-casein (CSN3)

β-lactoglobulin (LGB)

Fw (TC)

AATTGAGTCCATAACTAGGA

Rv (T)

GGGGGGGGGGGGAATTGAGTCCATAACTAGGG

Rv (C)

CAACTCAAGGTCCCTCTCCA

CTTCAGCTCCTCCACGTACA

protocol allowed the two different PCR products (85 bp for T allele and 97 bp for C allele) to be distinguished on 3% (w/v) agarose gel stained with ethidium bromide. For PRL gene, amplification was carried out using the protocol described by Staiger et al (8). A 2.5-kbp fragment spanning intron 2 of the ovine PRL gene amplified was subsequently digested with HaeIII restriction enzyme (Promega Corp., USA). Products of digestion were visualized on a 3% agarose gelstained with ethidium bromide. S t a t i s t i c a l a n a l y s i s . H a r d y-We i n b e r g equilibrium was tested, for each gene, based on Feligini methodology, cited by Giambra (5). Genotype effects are estimated at the QTL positions using Multiple Regression Least Square Method (11). The general model will be defined as: [1] Where is the trait value of sheep j in herd i, μ is overall mean, is fixed effect of herd i, is the effect of molecular marker j and is residual of the model. In matrix notation, model will became: [2] y is the phenotypic values vector, b is a vector of various fixed effects (like sex, farm, breed etc.), u is a vector of marker effects (also fixed), X and M being incidence matrices for vectors b and u. Marker effect was evaluated with the matrix model one previously described: [3] Where is the variance ratio of the error and genetic effect in the model and I is an identity matrix. We assume that just only half of genetic additive variance was captured by markers, then: [4] is genetic additive variance and L representing number of markers. In this case,

term became

Amplicon length (bp) 120 85 (Tallele) 97 (C allele) 2.500

de geles de agarosa en una solución amortiguadora TAE (Tris-acetato-EDTA). La caracterización genética del PSN (polimorfismos de un solo nucleótido) identificado y localizado en el gen CSN3 se realizó utilizando un conjunto de bases que combinan una hacia adelante (CSN3-TC) y dos hacia atrás (CSN3-T y CSN3-C), como se muestra en la tabla 1. El protocolo de amplificación incluyó dos reacciones por muestra que contienen PSN-TC / PSN-T y primer pares SNP-TC / SNP-C, respectivamente, según lo descrito por Feligini y citado por Giambra y Erhardt (5). Este protocolo permitió que los dos productos de PCR diferentes (85 pb para el alelo T y 97 pb para el alelo C) se distinguieran en un gel de agarosa al 3% (w/v) teñido con bromuro de etidio. Para el gen PRL, la amplificación se llevó a cabo utilizando el protocolo descrito por Staiger y colaboradores (8). Un fragmento de 2,5 kpb que abarca el intrón 2 del gen ovino PRL amplificado fue digerido posteriormente con una enzima de restricción HaeIII (Promega Corp., EE.UU.). Los productos de la digestión se visualizaron en un gel de agarosa al 3% gel en tinción con bromuro de etidio. Análisis estadístico. Se probó el equilibrio de Hardy-Weinberg para cada gen, con base en la metodología de Feligini, citado por Giambra (5). Se estimaron los efectos del genotipo en las posiciones de QTL utilizando el método de la regresión múltiple y mínimos cuadrados (11). El modelo general se define como: [1] Donde es el valor característico de ovejas j en el rebaño i, μ es la media global, es el efecto fijo de hato i, es el efecto del marcador molecular j y es residual del modelo. En notación matricial, el modelo se convertirá en: [2] y es el vector valores fenotípicos, b es un vector de varios efectos fijos (como el sexo, la granja, la

Gras MA - Local sheep preservation where studied trait heritability is

For marker codification we use 101 allele coding system, described by Strandén and Christensen (12). Value -1 was assigned to the homozygous genotype for the more frequent allele, 0 for the heterozygous genotype and 1 for less frequent allele. This codification describes a centered coding system with maximum mixing properties in the model. In comparison, we use a different codification for marker effect estimation (0 for allele absence, 1 and 2 respectively for allele number at each locus). A comparison between estimations was performed. Statistical analysis and marker effect estimation was performed in R. For marker effect estimation we use production traits heritability described by Ugarte cited by Pelmus (12): 0.19 for milk yield, 0.17 for fat yield, and 0.17 for fat content, 0.18 for protein yield and 0.47 for protein content.

RESULTS In marker analysis the next steps were followed: gene polymorphism detection, estimation of the genotypic and allelic frequencies and evaluation of the genetic effect of analyzed markers. LGB, CSN3 and PRL polymorphism detection. LGB: PCR amplification of ovine genomic DNA resulted in a 120 bp fragment of the LGB gene including exon 2 (Figure 1A). Restriction fragment was identified after digestion with RsaI endonuclease; in particular two restriction sites (GT/AC) for allele A and only one restriction site for allele B were detected. Allele discrimination was based on size differentiation (bp) of LGB; the three different genotypes, AA (66, 37 and 17 bp), AB (103, 66, 37 and 17 bp) and BB (103 and 17 bp) were detected for Teleorman Black Head sheep (Figure 1B). CSN3: Genotyping of the CSN3 gene was performed using the protocol described by Giambra and Erhardt (5). In our experiments two different PCR products with different length, 85 bp for T allele and 97 bp for C allele were identified (Figure 2). PRL: A 2.5 kbp fragment from PRL gene was amplified successfully (Figure 3A). Digestion with restriction enzyme HaeIII differentiated alleles A and B. Allele A contained 3 restriction sites for HaeIII and resulted in 4 fragments of 1400, 530, 360, and 150 bp, whereas the presence of an additional restriction

5129

raza, etc.), u es un vector de efectos de marcador (también fijo), X y M son matrices de incidencia para los vectores b y u. Se evaluó el efecto marcador con el modelo de matriz descrito anteriormente: [3]

Donde es la relación de la varianza del error y el efecto genético en el modelo e I es una matriz de identidad. Suponemos que solo la mitad de la varianza genética aditiva fue capturada por los marcadores, entonces: [4] es la varianza genética aditiva y L representa el número de marcadores. En este caso,

el término

cambia cuando las características de heredabilidad estudiadas corresponden a . Para la codificación del marcador utilizamos el sistema de codificación de 101 alelos, descritos por Stranden y Christensen (12). Se asignó el valor -1 al genotipo homocigoto para el alelo más frecuente, 0 para el genotipo heterocigoto y 1 para el alelo menos frecuente. Esta codificación describe un sistema centrado de codificación con las máximas propiedades de mezcla en el modelo. En comparación, utilizamos una codificación diferente para la estimación del efecto marcador (0 para la ausencia de alelos, 1 y 2, respectivamente para el número de alelos en cada locus). Se realizó una comparación entre las estimaciones. El análisis estadístico y la estimación del efecto marcador se realizaron en R. Para la estimación del efecto marcador se utilizaron las características de la heredabilidad de producción descrita por Ugarte y citadas por Pelmus (12): 0.19 para producción lechera, 0.17 para la producción de grasa, 0.17 para el contenido de grasa, 0,18 para la producción de proteína y 0.47 para el contenido de proteína.

RESULTADOS En el análisis del marcador se siguieron los siguientes pasos: detección de polimorfismo del gen, estimación genotípica y de las frecuencias alélicas y evaluación del efecto genético de los marcadores analizados. Detección de los polimorfismos LGB, CSN3 y PRL. LGB: ampliación RCP del ADN genómico ovino como producto de un fragmento 120 bp del gen LGB incluyendo exón 2 (Figura 1A).

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 21(1) Enero - Abril

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Figure 2. CNS3 PCR pattern for Teleorman Black Head sheep. 2% agarose gel electrophoresis was used for visualization of C and T alleles of ovine CSN3 gene. Lane 1: DNA ladder. Lanes 2-14: C and T alleles, respectively.

El fragmento de restricción se identificó después de la digestión con RsaI endonucleasa; en particular, se detectaron dos sitios de restricción (GT/AC) para el alelo A y un único sitio de restricción para el alelo B. La discriminación de alelos se basa en el tamaño de diferenciación (pb) de LGB; se detectaron tres genotipos diferentes, AA (66, 37 y 17 pb), AB (103, 66, 37 y 17 pb) y BB (103 y 17 pb) para las ovejas Cabeza Negra de Teleorman (Figura 1B). Figure 1. PCR amplification (1A) and RsaI digestion (1B) of the ovine LGB gene. PCR products of LGB gene were visualized on 2% (w/v) agarose gel. Lane1: DNA ladder; lanes 2-14: ovine samples. RsaI RFPL products were identified on a 2% (w/v) agarose gel. Lane1: DNA ladder; lanes 2, 5, 9, 11 and 12: BB genotype, lanes 3, 7, 8, 10, 13 and 14: AA genotype; lanes 4 and 6: AB genotype.

site in the B allele resulted in 5 fragments of 1400, 510, 360, 150, and 20 bp (Figure 3B). Approx.30% from genotyped animals show additional restriction sites that create a newer fragment of 700bp long. Genotypic and allelicfrequencies for LGB, CSN3 and PRL genes. For LGB gene a proportion of 49% of genotype AA, 37% of AB and 14% of BB were found. The allelic frequency for LGB gene was 68% for A allele and 32% for B allele. Hardy-Weinberg equilibrium test returned the following observed and expected genotypes in our study (Table 2). For LGB gene, the TBH sheep population is in Hardy-Weinberg equilibrium that means their

CSN3: La caracterización del genotipo del gen CSN3 se realizó utilizando el protocolo descrito por Giambra y Erhardt (5). En nuestros experimentos se identificaron dos productos de RCP diferentes con diferente longitud, 85 pb para el alelo T y 97 pb para el alelo C (Figura 2). PRL: Se amplificó exitosamente un fragmento del gen PRL a 2,5 kpb (Figura 3A). La digestión con enzima de restricción HaeIII diferenció los alelos A y B. El alelo A contenía 3 sitios de restricción para HaeIII y tuvo como resultado 4 fragmentos de 1400, 530, 360, y 150 pb, mientras que la presencia de un sitio de restricción adicional en el alelo B dio como resultado 5 fragmentos de 1.400, 510, 360, 150, y 20 pb (Figura 3B). Aproximadamente el 30% de los animales a los que se les caracterizó el genotipo muestran sitios de restricción adicional que crean un nuevo fragmento de 700 pb de longitud. Table 2. Observed and expected genotypes for LGB gene. Observed

Expected

Genotype

χ2 at 2 df and 5% significance

3.85

calculated χ2

1.95

*null hypothesis accepted

3.85 > 1.95*

Gras MA - Local sheep preservation

5131

Figure 3. PCR amplification (3A) and HaeIII RFLP (3B) of the ovine PRL gene. PCR products of PRL gene were visualized on 2% (w/v) agarose gel. Lane1: DNA ladder; lanes 2-8: ovine samples. HaeIII RFLP products of PRL gene were identified on a 3% (w/v) agarose gel. Lane1: DNA ladder; lanes 2, 4, 6, 9: BB genotype; lanes 3 and 5: AA genotype; lanes 7 and 8: AB genotype.

genotype was not affected by selection pressure for or against it. This aspect offer enough space for further implementation of selection program based on homozygosis on LGB gene. The genotypes for CSN3 gene showed a single CT heterozygote genotype, without homozygote individuals. In our study, allelic frequency for casein gene was 50% for C allele and 50% for T allele. Comparison between observed and expected genotypes for Hardy-Weinberg equilibrium test is showed in table 3. Table 3. Observed and expected genotypes for CSN3 gene. Observed

Expected

Genotype

χ2 at 2 df and 5% significance calculated

χ2

3.85 81

20 3.85 < 81*

*null hypothesis is rejected

TBH sheep population is not in Hardy-Weinberg equilibrium for CSN3 gene, due to absence of homozygote genotypes. The allelic frequencies for the genotypes of PRL gene where 39% for AA genotype, 28% forAB and 33% for BB. Allele A has 53% presence, meanwhile B allele just 47%.

Frecuencias alélicas y genotípicas para los genes LGB, CSN3 y PRL. Para el gen LGB se encontró una proporción del 49% del genotipo AA, 37% del AB y 14% de BB. La frecuencia alélica para el gen LGB fue del 68% para el alelo A y del 32% para el alelo B. La prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg produjo los siguientes genotipos observados y esperados en nuestro estudio (Tabla 2). Para el gen LGB, la población ovina CNT está en equilibrio de Hardy-Weinberg, lo que significa que su genotipo no se vio afectado por la presión de la selección a favor o en contra de ella. Este aspecto ofrece espacio suficiente para seguir ejecutando el programa de selección con base en la homocigosis del gen LGB. Los genotipos para el gen CSN3 mostraron un solo genotipo heterocigoto CT, sin individuos homocigotos. En nuestro estudio, la frecuencia alélica para el gen de la caseína fue del 50% para el alelo C y 50% para el alelo T. En la Tabla 3 se muestra la comparación entre los genotipos observados y esperados para la prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg. La población ovina CNT no está en equilibrio de Hardy-Weinberg para el gen CSN3, debido a la ausencia de los genotipos homocigotos.

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Observed and expected genotypes for PRL genotype (Table 4) show a lack of Hardy-Weinberg equilibrium. Hardy-Weinberg disequilibrium for PRL gene pointed some empirical selection in behalf of AA genotype and weighing against AB and BB genotypes. Table 4. Observed and expected genotypes for PRL gene. Observed

Expected

Genotype

χ2 at 2 df and 5% significance

3.85

calculated χ2

3.85 < 8.6*

8.6

*null hypothesis is rejected

Genetic effect on milk production traits. Milk, fat and protein yield perform measured in this studied population (throughout 144 lactation days) at first lactation was lower than breed average (60.71±31.75 kg milk, 4.84±2.61 kg fat and 3.42±1.8 kg protein), but fat and protein content (7.97±1.13% fat and 5.61±0.27% protein) were on the breed level. This diminished production was correlated with a prolonged dry period. In order to estimate the effect of LGB, CSN3 and PRL alleles on milk production traits, we used Multiple Regression Least Square Method for all QTLs. Assuming a balanced effect of alleles, heterozygote effect is set to zero. In this case, CSN3 shows a null effect for all individuals. Effect of markers on homozygotic animals is described in table 5. Table 5. Effect of LGB and PRL homozygotic genotypes over studied traits estimated using balanced marker codification. Genotype Milk production traits

LGB

PRL

Milk yield (kg)

3.23

-3.23

1.81

-1.81

Fat yield (kg)

0.30

-0.30

0.12

-0.12

Fat content (%)

0.13

-0.13

-0.10

0.10

Protein yield (kg)

0.16

-0.16

0.08

-0.08

Protein content (%)

0.02

-0.02

-0.06

0.06

Effect of LGB over production traits is quite constant. Genotype AA performs better then genotypes BB. PRL marker effect showed small differences compared with LGB gene effect. Concerning milk, fat and protein yield AA genotype for PRL had a smaller (also positive) impact than the same genotype identified for LGB gene. Regarding fat and protein content, PRL showed a reversed effect, negative for AA genotype and positive for BB genotype, respectively.

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Las frecuencias alélicas para los genotipos del gen PRL donde el 39% corresponde al genotipo AA, 28% al AB y 33% al BB. El alelo A tiene una presencia del 53%, por su parte alelo B tiene una presencia tan solo del 47%. Los genotipos observados y esperados para los genotipos PRL (Tabla 4) muestran la ausencia del equilibrio de Hardy-Weinberg. Este desequilibrio para el gen PRL indica una selección empírica a favor del genotipo AA y en contra de los genotipos AB y BB. Efecto genético sobre las características de la producción lechera. La leche, la grasa y el desempeño de la producción de proteína medidas en la población estudiada (a lo largo de 144 días de lactancia) en primera lactación fue inferior a la media de la raza (60,71 ± 31,75 kg de leche, 4,84 ± 2,61 kg de grasa y 3,42 ± 1,8 kg de proteína), pero el contenido de grasa y proteína (7,97 ± 1,13% de grasa y 5,61 ± 0,27% de proteína) se encontraba en el nivel de la raza. Esta menor producción se correlaciona con un período de sequía prolongado. Para estimar el efecto de los alelos LGB, CSN3 y PRL en las características de producción de leche, se utilizó la regresión múltiple mínimos cuadrados para todos los QTLs. Suponiendo un efecto equilibrado de alelos, el efecto heterocigotico se establece en cero. En este caso, CSN3 no mostró ningún efecto para el total de individuos. El efecto de los marcadores sobre los animales homocigóticos se describe en la tabla 5. El efecto de LGB sobre las características de la producción es bastante constante. El comportamiento de los genotipos AA es mejor que el de los genotipos BB. El efecto del marcador PRL mostró pequeñas diferencias en comparación con el efecto del gen LGB. En cuanto a la leche, grasa y producción de proteína, el genotipo AA de la PRL tuvo un impacto menor (también positivo) que el mismo genotipo identificado para gen LGB. En cuanto a la grasa y al contenido de proteína, PRL mostró un efecto inverso, negativo para el genotipo AA y positivo para el genotipo BB, respectivamente. La prueba de chi cuadrado de Pearson aplicada a los resultados obtenidos con ambos sistemas de codificación no mostró diferencias entre las estimaciones. En nuestro estudio, utilizamos una codificación diferente para la estimación del efecto marcador (0 para la ausencia de alelos, 1 y 2, respectivamente para el número de alelos en cada locus). Utilizando

Gras MA - Local sheep preservation Pearson chi-squared test applied to the results obtained using both encoding systems showed no difference between estimates. In our study, we use a different codification for marker effect estimation (0 for allele absence, 1 and 2 respectively for allele number at each locus). Using the described codification, in the same model and with the same parameter input, marker effect estimation was slightly higher but with similar pattern (Table 6). Table 6. Effect of LGB and PRL homozygotic genotypes over studied traits estimated using 0, 1 and 2 marker codification. Genotype LGB

Milk production traits

PRL

Milk yield (kg)

4.88

-4.88

2.67

-2.67

Fat yield (kg)

0.46

-0.46

0.18

-0.18

Fat content (%)

0.19

-0.19

-0.13

0.13

Protein yield (kg)

0.25

-0.25

0.12

-0.12

Protein content (%)

0.03

-0.03

-0.07

0.07

The estimated effect of LGB is slightly superior (with 1.65 kg difference for milk yield and 0.01% for protein content) but, as a general rule, is the similar (along the production traits) with the one estimated with 101 allele encoding system. The same rule is applying for PRL gene, but at a lower level, with difference of 0.86 kg for milk yield and 0.01 % for protein content. The differences observed in the estimation of marker effect using “101” and “each allele” encoding systems demonstrated the importance of codification in the design and implementation of the general linear model. For breeding value estimation, based on products like marker effect vector and marker assignation matrix is very important to use the same allele codification for all theindividuals used in the evaluation program.

DISCUSSIONS A possible association between the genetic variants of the LGB gene and milk-related traits was extensively studied by Mateescu and Thonney (4). On the other hand, Giambra and Erhardt (5) has demonstrated that a T→C nucleotide transversion in exon 2 of the LGB gene can be detected using RsaI RFLP; also, this substitution results in the replacement of Tyr20 with His in the β-lactoglobulin polypeptide (8). Until now, the results of genetic studies regarding the allelic variants are conflicting, indicating no relationship between this SNP and milk yield or association

5133

la codificación descrita, en el mismo modelo y con los mismos parámetros de entrada, la estimación del efecto marcador fue ligeramente superior, pero con un patrón similar (Tabla 6). El efecto estimado de LGB es ligeramente superior (con 1.65 kg de diferencia para la producción lechera y 0.01% para el contenido de proteína) pero, como regla general, es similar (a lo largo de las características de producción) a lo estimado mediante el sistema de codificación de 101 alelos. La misma regla se aplica para el gen PRL, pero a un nivel inferior, con una diferencia de 0.86 kg para la producción lechera y 0.01% para el contenido de proteína. Las diferencias observadas en la estimación del efecto marcador mediante los sistemas de codificación “101” y “cada alelo” demostraron la importancia de la codificación en el diseño e implementación del modelo lineal general. Para estimar el valor de la crianza, en base a productos como el vector efecto marcador y la matriz de asignación de marcadores, es muy importante utilizar la misma codificación de alelos para todos los individuos utilizados en el programa de evaluación.

DISCUSIÓN Mateescu y Thonney (4) estudiaron ampliamente una posible relación entre las variantes genéticas del gen LGB y las características relacionadas con la leche. Por otro lado, Giambra y Erhardt (5) demostraron que una transversión de nucleótidos T→C en el exón 2 del gen LGB puede detectarse utilizando RsaI PLFR; por lo tanto, esta sustitución tiene como resultado el reemplazo de Tyr20 con His en los polipéptidos β-lactoglobulina (8). Hasta ahora los resultados de los estudios genéticos respecto a las variantes alélicas son contradictorios, indicando que no hay relación entre este PSN y la producción de leche o la asociación de cualquiera de los alelos A o B con las características de producción láctea. Por ejemplo, el genotipo BB tiende a mostrar una mayor producción de leche en comparación con los genotipos AA y AB de las razas Massese y Sarda (8), mientras que Ramos y colaboradores (13) encontraron un resultado diferente para las razas Serra da Estrela y Merino, con una mayor producción de leche para los genotipos AB y BB. Algunos estudios señalan la superioridad del alelo A. Staiger y colaboradores (8) asociaron el genotipo AA con a una mayor producción lechera para las razas del Valle del Belice y Frisia Oriental. Las frecuencias genotípicas en el locus LGB RsaI calculadas en el presente estudio fueron diferentes a las frecuencias reportadas por Wessels y colaboradores (14) en las ovejas de Frisia Oriental, donde el alelo B

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of either the A or B allele with milk production traits. For example, BB genotype tends to show greater milk production compared with AA and AB genotype on Massese and Sardinian breeds (8), while Ramos et al (13) found a different result for Serra da Estrela and Merino breeds, with greater milk production for AB and BB genotypes. Some studies pointed out superiority of the A allele. Staiger et al (8) associated AA genotype with greater milk yield for Valle del Belice and East Friesian breeds. Genotypic frequencies at the LGB RsaI locus calculated in the present study were different to the frequencies reported by Wessels et al (14) on East Friesian sheep, in which B allele was predominant. In 2010, Staiger et al (8) reported very similar allelic frequencies, 0.69 and 0.31 for the LGB RsaI polymorphism (alleles A and B) on East Friesian breed, in comparison with 0.68 and 0.32 frequencies obtained in our study. Giambra (5) observed an excess of heterozygote genotypes of LGB in Pag sheep breeds. The H-W disequilibrium shows, in author`s opinion, a value of AB genotype over AA and BB genotypes due to an empirical selection. The presence of H-W equilibrium for LGB gene in our studied population underlines the lack of selection pressure on animal genotypes. However, data regarding effect of BLG gene on milk quality and quantity parameters show a positive effect, similarly with the effect found by Staiger et al (8) at Valle del Belice and East Friesian breeds. In our study, CSN3 polymorphism showed equal frequencies (0.5 for both C and T alleles) similar with the frequencies found by Staiger et al (8) in East Friesian breed (0.51 and 0.49, respectively). The present study did not find a significant effect of the CNS3 polymorphism on milk production. By contrast, Staiger et al (8) and Caravaca et al (15) reported a positive association between variants of CSN3 and milk traits in goats. On the other hand, any association between CSN3 locus and milk yield has not been reported in our study. Despite the lack of CSN3 effect, the CSN3 genotyping need further investigation taking into account the number of individuals genotyped and DNA sequencing of C and T amplicons. While the LGB and CSN3 were intensely studied for their association with milk production traits, the effect of PRL genotype was poorly investigated. Gene frequencies for PRL HaeIII locus reported by Ramos et al (13), in the Serra da Estrela and Merino breeds showed that A allele occurs more frequently than B allele. Staiger et al (8) found a different occurrence of B allele, more frequent than A. Serra da Estrela ewes (13) with AA genotype determine a lower

2016

fue el predominante. En el año 2010, Staiger y colaboradores (8) reportaron frecuencias alélicas muy similares, 0.69 y 0.31 para el polimorfismo LGB RsaI (alelos A y B) de la raza Frisia Oriental en comparación con 0.68 y 0..32 obtenidos en nuestro estudio. Giambra (5) observó un exceso de genotipos heterocigotos de LGB en ovejas de raza Pag. Los desequilibrios H-W muestran, en la opinión del autor, un valor del genotipo AB sobre el de los genotipos AA y BB debido a una selección empírica. La presencia del equilibrio H-W en los genes LGB en nuestra población de estudio destaca la falta de presión en la selección sobre los genotipos de los animales. Sin embargo, los datos sobre el efecto del gen BLG sobre la calidad de la leche y los parámetros de cantidad muestran un efecto positivo, de manera similar al efecto encontrado por Staiger y colaboradores (8) en las razas del Valle del Belice y Frisia oriental. En nuestro estudio, el polimorfismo CSN3 mostró frecuencias iguales (0,5 para los alelos C y T), de manera similares a las frecuencias halladas por Staiger y colaboradores (8) en la raza Frisia Oriental (0.51 y 0.49, respectivamente). En el presente estudio no se encontró ningún efecto significativo del polimorfismo CSN3 sobre la producción de leche. Por el contrario, Staiger y colaboradores (8) y Caravaca y colaboradores (15) reportaron una relación positiva entre las variantes de CSN3 y las características de la leche de cabra. Por otro lado, en nuestro estudio no se ha reportado ninguna relación entre el locus CSN3 y la producción lechera. A pesar de la ausencia de efecto de la CSN3, la determinación del genotipo CSN3 requiere de mayor investigación teniendo en cuenta el número de individuos con genotipo ya determinado y la secuencia del ADN de los amplicones C y T. Mientras que LGB y CSN3 se estudiaron intensamente debido a su relación con las características de producción de leche, el efecto del genotipo PRL se investigó muy poco. Las frecuencias genéticas para el locus PRL HaeIII reportadas por Ramos y colaboradores (13), en las razas Serra da Estrela y Merino, mostraron que el alelo A se presenta con más frecuencia que el alelo B. Staiger y colaboradores (8) encontraron una incidencia diferente del alelo B, con mayor frecuencia que el A. Las ovejas Serra da Estrela (13) con el genotipo AA presentan una producción de leche más baja en comparación con los genotipos AB y BB. En nuestro estudio, el alelo B del gen PRL fue ligeramente superado por el alelo A. Además, el desequilibrio H-W estimula los genotipos que contienen el alelo A. Los datos que se obtuvieron en nuestro estudio son totalmente diferentes a los obtenidos por Staiger y colaboradores (8) que reportaron que el

Gras MA - Local sheep preservation milk yield compared with AB and BB genotypes. In our study, B allele of PRL gene is slightly outnumbered by A allele. Also H-W disequilibrium stimulates the genotypes containing Aallele. Data obtained in our study are totally different by those obtained by Staiger et al (8) who reported that A allele has an increased frequency in East Friesian breed. This thing could point some empirical selection criteria that could leads to an excess in the use without knowledge of A allele in selection programs. Like LGB, A allele of the PRL gene have a positive effect on milk production quantitative traits. Similar results are reported by Staiger et al (8) and Ramos et al (14). Like LGB, A allele of the PRL gene had a positive effect on milk production quantitative traits similarly with the results reported by Staiger et al (8) and Ramos et al (13) for East Friesian breed. Same allele produced a decreased of qualitative milk traits (fat and protein content). Approx 30% of the genotyped animals presented additional restriction sites resulting in a new fragment. From this reason, other studies are necessary to assess the PRL polymorphism and amplification fragment sequencing. This preliminary study highlights the opportunity and necessity of the “in situ” preservation program for Teleorman Black Head sheep population. Using molecular biology techniques and mathematical modeling, our study demonstrates a strong association between genetic polymorphism and milk traits. Also, the identified markers might be used in a MAS program, together with the traditional breeding program. The further program evolution will permit the use of both programs (MAS and traditional) using Single Step Genomic BLUP evaluation method. Also, it must be taken into account the coherence and unity of the preservation program, and the evaluation of marker and production should be performed using the same protocol strategies. Future supplementary studies for the validation of these results using an increased number of animals and the designing of a mating program in order to generate breeding rams with optimal genotypes for the two genes with positive effect are needed. Also, future extension of data obtained for TBH population to other sheep breeds from Romania will be taken into account. In conclusions, positive association between LGB and milk yield and composition, recommend this candidate gene, like marker for a future MAS program. Although PRL gene is also associated with an increased milk quantity, the PRL polymorphism investigated in our study could be taking into consideration in a MAS strategy. Teleorman Black Head sheep breed is the most

5135

alelo A tiene un aumento de la frecuencia en la raza Frisia Oriental. Este aspecto podría señalar algunos criterios de selección empíricos que pueden conducir a un exceso en el uso sin conocimiento del alelo A en los programas de selección. Al igual que LGB, el alelo A del gen PRL tiene un efecto positivo en las características cuantitativas de la producción lechera. Staiger y colaboradores (8) y Ramos y colaboradores (14) reportaron resultados similares. Al igual que LGB, el alelo A del gen PRL tuvo un efecto positivo en las características cuantitativas de la producción de leche, de manera similar a los resultados reportados por Staiger y colaboradores (8) y Ramos y colaboradores (13) para la raza Frisia Oriental. Los mismos alelos produjeron una disminución de las características cualitativas de la leche (contenido de grasa y proteína). Aproximadamente el 30% de los animales a los que se les determinó el genotipo presentan sitios de restricción adicionales que resultan en un nuevo fragmento. Por esta razón, es necesario realizar otros estudios con el fin de evaluar el polimorfismo PRL y la amplificación de la secuencia de fragmentos. Este estudio preliminar destaca la oportunidad y necesidad del programa de preservación “in situ” para la población ovina Cabeza Negra de Teleorman. Mediante el uso de técnicas de biología molecular y el modelado matemático, nuestro estudio demuestra una fuerte asociación entre el polimorfismo genético y las características de la leche. Igualmente, los marcadores identificados pueden ser utilizados en un programa MAS, junto con el programa de cría tradicional. La evolución adicional del programa permitirá el uso de ambos programas (MAS y tradicional) utilizando el método de evaluación Genómico BLUP de un solo paso. Por lo tanto, se debe tener en cuenta que la coherencia e integridad del programa de preservación y la evaluación del marcador y de la producción se deben realizar utilizando las mismas estrategias de protocolo. En el futuro es necesario realizar estudios complementarios con el fin de validar estos resultados utilizando un mayor de número de animales y diseñar un programa de apareamiento para generar carneros reproductores con los genotipos óptimos de los dos genes con efecto positivo. De esta manera, se deberá considerar una futura ampliación de la información obtenida para la población de CNT a otras razas ovinas de Rumania. En conclusión, la asociación positiva entre LGB y la producción y la composición de la leche, recomienda este gen candidato, como un marcador para el futuro programa MAS. Aunque el gen PRL también está asociado con al aumento de la cantidad de leche, el polimorfismo PRL investigado en nuestro estudio podría ser tomado en cuenta en una estrategia MAS. La oveja Cabeza Negra de Teleorman es la raza más importante del sur

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important breed from the Southern Romania, exploiting very well poor nutritive forages from this part of the country; further studies are needed to extend the polymorphisms identified in present study to other sheep populations reared in Romania, both LGB and PRL markers could became an advent of MAS utilization in Romanian dairy sheep breeding industryin the future.

de Rumania, con una buena utilización de los forrajes con bajo nivel nutritivo de esta parte del país; se necesitan más estudios para ampliar los polimorfismos identificados en este trabajo a otras poblaciones de ovejas criadas en Rumania; en el futuro, los dos marcadores LGB y PRL se podrían convertir en el comienzo de la utilización del MAS en la industria rumana de cría de ovejas lecheras.

Acknowledgements

Agradecimientos

This work was financially supported from Projects PN 08938-01.01 and PN 0938-04.03, granted by the Romanian Ministry of Education.

Este trabajo recibió apoyo financiero de los Proyectos PN 08938-01.01 y PN 0938-04.03, por parte del Ministerio de Educación de Rumania.

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5137-5144, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Efficiency of threonine utilization in the growing pigs Eficiencia del uso de treonina para cerdos en fase de crecimiento Marcos S Ceron,1 M.Sc, Vladimir de Oliveira,*2 Ph.D, Arlei B de Quadros,2 Ph.D, Clóvis E Gewehr,3 Ph.D, Leonardo T Rocha,2 Zootec, Débora A Alves,2 Zootec. 1Federal

University of Santa Maria (UFSM), Zootecny Departament, Roraima Avenue n° 1000, University City, Camobi District, Zip-code 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil. 2Federal University of Santa Maria, Zootecny Departament. 3University of the State of Santa Catarina (UDESC), Animal production departament, Luiz de Camões Avenue, n° 2090, Conta Dinheiro District, Zip-code 88520000, Lages, SC, Brazil. *Correspondence: vladimir.oliveira@ufsm.br Received: November 2014; Accepted: August 2015.

ABSTRACT Objective. This study aimed to determine the marginal efficiency of threonine utilization in growing pigs by using the nitrogen balance technique. Materials and methods. Twelve castrated pigs with an average live weight of 72±2 kg were housed in metabolic cages maintained in a temperature controlled room of 22±3°C. The treatments consisted of four diets calculated to meet 30, 45, 60 and 70% of the nutritional requirements of standardized ileal digestible threonine. The amino acids others than threonine were maintained at least 15% above threonine requirements, expressed in terms of ideal levels. The amount of feed supplied was calculate to provide 2.6 times the metabolizable energy requirements for maintenance and adjusted daily according to an expected daily gain rate of 0.8 kg. Results. Pigs consumed 1.65 g kg-1 BW0.75 nitrogen daily, on average and 61% was retained and, as a result, 39% was excreted, being 31% through the feces and the remainder (69%) in the urine. The pigs showed a linear retention of threonine in response to the increase of standardized threonine intake. For each gram of standardized threonine intake 0.37 g were lost during the metabolism. Conclusions. It is concluded that for calculating nutritional requirements of standardized threonine of pigs by the factorial method, it is possible to use the utilization marginal efficiency of 0.63. Key words: Diet, essential amino acids, nitrogen, pig production, protein, requirements. (Source: Agrovoc).

RESUMEN Objetivo. El objetivo de este estudio fue determinar la eficiencia marginal del uso de treonina para cerdos en fase de crecimiento, por medio de la técnica de balance de nitrógeno. Material y métodos. Fueron utilizados doce cerdos machos castrados con peso promedio de 72±2 kg alojados en jaulas metabólicas climatizadas a una temperatura ambiente de 22±3°C. Los tratamientos consistieron en cuatro dietas calculadas para 30, 45, 60 y 70% de las necesidades nutricionales de treonina digestible estandarizada. Los demás aminoácidos se añadieron a las dietas para lograr una proporción de al menos 15% de sus necesidades expresadas con relación a la treonina. La cantidad de alimento proporcionado se calculó para suministrar 2.6 veces la energía metabolizable y ajustada todos los dias, según una tasa de ganancia media diaria de 0.8 kg. Resultados. Los cerdos consumieron 1.65 g kg-1 PV0.75 de nitrógeno por dia. En promedio 61% de nitrógeno ingerido se conservó y 39% fue excretado por el 5137

5138

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animal. El 31% se excretó en las heces y el resto (69%) en la orina. Los cerdos mostraron una retención lineal de treonina, con relación al aumento en la ingesta de treonina digestible estandarizada. Por cada gramo de treonina digestible estandarizada ingerido 0.37 g se perdieron durante el metabolismo. Conclusiones. Se concluye que, para el cálculo de las necesidades nutricionales de treonina digestible estandarizada para cerdos por método factorial, es posible utilizar la eficiencia marginal del uso de treonina a 0.63. Palabras clave: Dieta, aminoácidos esenciales, nitrógeno, proteínas, producción de cerdos, requerimientos. (Fuente: Agrovoc).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Threonine is an indispensable amino acid for pigs and is required for both maintenance and growth. It is the primary amino acid constituent of immunoglobulins and represents a significant portion of the proteins secreted by the small intestine (1). Threonine does not undergo transamination and there is no synthesis of threonine by the pigs. Consequently, all the threonine required by pig must be provide in the diet.

La treonina es un aminoácido indispensable para los cerdos y se requiere tanto para su mantenimiento como para su crecimiento. Es el componente fundamental de las inmunoglobulinas y representa una parte significativa de las proteínas secretadas por el intestino delgado (1). No sufre transaminación y no es sintetizada por los cerdos. Por consiguiente, toda la treonina requerida se debe proporcionar en la dieta.

Many experiments were performed in order to determine the nutritional requirements of threonine, and most of them, through the empirical method. However, another method that might be employed to obtain the nutritional requirements of pigs is the factorial one. In that case, the animal’s nutritional requirement is defined according to well laid out physiological factors, such as the maintenance of protein structures and protein deposition (2). The estimated requirements for threonine by the factorial method suppose knowledge about maintenance requirement, rate of protein deposition and the post-absorptive utilization efficiency of threonine. Not all the threonine ingested by pig is recovered in body protein and the inefficiency is linked to the physiological processes, basal losses of amino acids of the integumentary and digestive system, nitrogen catabolism and protein turnover (3).

Se llevaron a cabo muchos experimentos con el fin de determinar los requerimientos nutricionales de treonina y la mayoría de ellos, se realizaron a través del método empírico. Sin embargo, otro método que se puede emplear para obtener los requerimientos nutricionales de los cerdos es el factorial. En ese caso, estos requerimientos se definen de acuerdo con factores fisiológicos bien establecidos, tales como el mantenimiento de las estructuras de la proteína y la deposición de esta (2). Las necesidades estimadas de la treonina por el método factorial suponen el conocimiento de los requerimientos de mantenimiento, la tasa de deposición de la proteína y la eficiencia de utilización posterior a la absorción de la treonina. No toda la treonina ingerida por el cerdo se recupera en las proteínas corporales y esta ineficiencia está vinculada con procesos fisiológicos, pérdidas basales de aminoácidos en los sistemas tegumentario y digestivo, catabolismo del nitrógeno y renovación de proteínas (3).

The knowledge of the amino acid efficiency for protein deposition is crucial to improve protein nutrition, which can result in economic improvements and reducing nitrogen losses in feces and urine. There are relatively few studies conducted to evaluate the marginal efficiency of threonine utilization by pigs. Thus, one study was conducted to determine the marginal efficiency of threonine utilization in pigs.

El conocimiento de la eficiencia de los aminoácidos para la deposición de proteína es fundamental para mejorar la nutrición proteica, lo que da lugar a mejoras económicas y a la reducción de pérdidas de nitrógeno en heces y orina. Se han efectuado relativamente pocos estudios para evaluar la eficiencia marginal de la utilización de treonina en cerdos. Es por eso que se llevó a cabo un estudio para determinar dicha eficiencia.

MATERIAL AND METHODS

MATERIALES Y MÉTODOS

Animals and ambient condition. The experiment was performed with 12 castrated

Los animales y las condiciones ambientales. El experimento se llevó a cabo con 12 cerdos

Ceron - Threonine utilization in growing pigs pigs of commercial line, in the finishing phase, and with an average live weight of 72±2 kg. The animals were housed in metabolic cages, with variable widths and heights in order to adjust the area to the weight of the animal, and kept in a controlled environment in order to achieve the average temperature of 22° Celsius. Experimental design. The experiment was divided into two periods of 12 days (seven days of adaptation to the experimental conditions and five days of collection). The animals were distributed through a balanced changeover design (4) in four experimental diets, with a total of six replications per treatment and considering the animal as the experimental unit. Diet characteristic. The diets were prepared using the concept of ideal protein in order to meet 30%, 45%, 60% and 70% of threonine nutritional conditions suggested by the NRC (3). The other amino acids were calculated to achieve a ratio of, at least, 15% of their requirements expressed in relation to the threonine (5). The calculated and centesimal composition of the experimental diet is presented in table 1. Table 1. Calculated and centesimal composition of pigs diets fed with increasing levels of standardized and digestible threonine. Level of threonine (% of requirements) Ingredients

% Corn Soybean meal Starch Sugar Soybean Oil L_Lysine DL_Methionine L_ Tryptophan Bicalcium Phosphate Limestone Salt Vitamin and mineral premix Total

15.600 10.400 59.870 10.000 1.000 0.060 0.050 0.015 1.500

21.840 14.560 48.930 10.000 1.500 0.080 0.070 0.020 1.500

27.760 18.510 38.500 10.000 2.000 0.100 0.090 0.025 1.500

33.850 22.560 27.810 10.000 2.500 0.120 0.115 0.035 1.500

0.900 0.400 0.200

100.000

Nutritional values calculated ME (Kcal kg-1) CP (%) Threonine (%)a Lysine (%) Methionine (%) MET + Cystine (%) Tryptophan (%) Isoleucine (%) Valine (%) Leucine (%) Phenylalanine (%) PHENYL + TYR (%) Histidine (%) Arginine (%)

3430 6.35 0.18b (100)c 0.32 (178) 0.12 (67) 0.19 (106) 0.06 (33) 0.20 (111) 0.23 (128) 0.41 (228) 0.28 (156) 0.41 (228) 0.12 (67) 0.25 (139)

3421 8.60 0.25 (100) 0.44 (176) 0.16 (64) 0.26 (104) 0.09 (36) 0.28 (112) 0.32 (128) 0.57 (228) 0.39 (156) 0.57 (228) 0.16 (64) 0.35 (140)

3414 10.74 0.31 (100) 0.56 (181) 0.21 (68) 0.33 (106) 0.11 (35) 0.36 (116) 0.41 (132) 0.72 (232) 0.50 (161) 0.73 (235) 0.21 (68) 0.44 (142)

3407 12.95 0.38 (100) 0.68 (179) 0.26 (68) 0.41 (108) 0.14 (37) 0.44 (116) 0.50 (132) 0.88 (232) 0.60 (158) 0.89 (234) 0.25 (66) 0.54 (142)

CP = crude protein; ME = metabolizable energy; MET = methionine; PHENYL = phenylalanine; TYR = tyrosine. aValues expressed as standardized digestible amino acid. bValues obtained by multiplying the coefficient of standardized digestibility by the values of amino acids analyzed in corn and soybean bran. cValues in parentheses represent the relation between lysine and other amino acids in this experiment.

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castrados, de línea comercial, en la etapa de finalización, con un peso vivo promedio de 72±2 kg. Los animales se alojaron en jaulas metabólicas, con medidas de ancho y altura variables con el fin de ajustar el área de acuerdo al peso del animal, y se mantuvieron en un ambiente controlado para lograr una temperatura promedio de 22° Celsius. Diseño experimental. El experimento se dividió en dos periodos de 12 días (siete días de adaptación a las condiciones experimentales y cinco días de recolección). Los animales se distribuyeron en cuatro dietas experimentales, a través de un diseño de transición balanceado (4), con un total de seis repeticiones por tratamiento y considerando el animal como la unidad experimental. Características de la dieta. Las dietas se prepararon empleando el concepto de proteína ideal con el fin de proveer el 30%, 45%, 60% y 70% de las condiciones nutricionales requeridas (CNR) de treonina (3). La cantidad de los demás aminoácidos se calculó para lograr una relación de al menos el 15% de sus requerimientos expresados en relación con la treonina (5). En la Tabla 1 se presenta la composición centesimal calculada de la dieta experimental. Procedimiento experimental. La cantidad de alimento se calculó para satisfacer el consumo de 2,6 veces la energía metabolizable de mantenimiento (250 kcal/kg PV0,60), considerando un ajuste en el consumo diario de alimento de acuerdo con el aumento de peso estimado de 0,8 kg por día. El alimento se distribuyó en cuatro comidas diarias: a las 8:00 h, 11:00 h. 13:00 h, 18:00 h y se proporcionó agua a voluntad. Las heces se recolectaron durante cinco días de acuerdo con el método del indicador, utilizando óxido férrico como un marcador indigestible. Las muestras se empacaron en bolsas plásticas y se mantuvieron en un congelador a -10°C. Al final del período experimental, las heces se homogenizaron y se obtuvieron muestras de 0,5 kg, parcialmente secas y molidas para su análisis posterior. Se drenó la orina en contenedores plásticos que contenían 30 ml de ácido sulfúrico (H2SO4 3,5 M) para impedir la contaminación bacterial y la volatilización del nitrógeno. Se midió el volumen y el pH de la orina cada 12 horas, se recolectó un 5% de la muestra y se almacenó a 4° Celsius. Para cada animal se determinaron los residuos del forraje y los sobrantes, se pesaron y el valor se descontó del consumo de alimento del animal. Se determinó el contenido de aminoácidos del maíz y la soya empleados en las dietas

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Experimental procedure. The amount of feed was calculated to meet the consumption of 2.6 times the metabolizable energy for maintenance (250 kcal kg-1 BW0.60), considering an adjustment on daily feed intake according to the estimated weight gain of 0.8 kg per day. The food was distributed into four meals a day: at 08h:00, 11h:00, 13h:00, 18h:00 and water was provided ad libitum. The feces were collected for five days according to the marker-to-marker approach using ferric oxide as an indigestible marker. The samples were packed into plastic bags and maintained in a freezer at -10° C. At the end of the experimental period, the feces were homogenized and samples of 0.5 kg were obtained, partially dried and grounded for further analysis. The urine was drained into plastic containers containing 30 ml of sulfuric acid (H2SO4 3.5 M) to prevent bacterial contamination and nitrogen volatilization. The volume and urinary pH were measured every 12 hours, and a sample of 5% was collected and stored at 4° Celsius. The waste of feed and leftovers was determined to each animal. Subsequently, the feed leftovers were weighed, and the value was discounted from the animal’s feed intake. The content of corn and soybeans amino acids used in the experimental diets were determined by liquid chromatography after acid hydrolysis. The dry matter of the ingredients, feces, feed and leftovers along with the nitrogen ingredients, feed, feces and urine, were determined by the AOAC methodology (6). The retained nitrogen was obtained by the difference between the nitrogen intake and nitrogen eliminated in feces and urine (nitrogen balance). The protein deposition was calculated by multiplying the retained nitrogen by 0.0625 assuming that nitrogen constitutes 6.25% of the retained proteins (3). The amount of threonine retained was calculated through the difference between the ingested standardized threonine and deposited threonine, assuming that it constitutes 3.79% of the body protein (7). The marginal efficiency of utilization of threonine was obtained by the angular coefficient of the line originated through the regression between the threonine retained and standardized digestible threonine intake (8). Statistical analysis. The obtained data were submit to variance analysis by using a linear model containing animal, time and treatment as main effects. Subsequently, it was performed a

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experimentales mediante cromatografía líquida, después de hidrólisis ácida. La materia seca de los ingredientes, heces, forraje y sobrantes junto con los componentes nitrogenados, forraje, heces y orina, fueron determinados según los métodos descritos por la AOAC (6). El nitrógeno retenido se obtuvo a partir de la diferencia entre la ingesta de nitrógeno y el nitrógeno eliminado en las heces y en la orina (balance de nitrógeno). La deposición de proteína se calculó multiplicando el nitrógeno retenido por 0.0625, asumiendo que el nitrógeno constituye el 6.25% del total de proteínas retenidas (3). La cantidad de treonina retenida se calculó como la diferencia entre la treonina ingerida estandarizada y la treonina retenida, asumiendo que esta constituye el 3,79% de la proteína corporal (7). La eficiencia marginal de utilización de treonina se obtuvo mediante el coeficiente angular de la línea originada por la regresión entre la treonina retenida y el consumo de treonina digestible estandarizada (8). Análisis estadístico. Los datos obtenidos se sometieron a análisis de varianza utilizando el modelo lineal que contiene como efectos principales el animal, el tiempo y el tratamiento. Posteriormente, se llevó a cabo un procedimiento de regresión lineal con las medias ajustadas, utilizando el programa Minitab (9). Aspectos éticos. El protocolo experimental fue aprobado y revisado por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad Federal de Santa María (Dictamen 005/2012).

RESULTADOS Los animales se mantuvieron saludables durante el período experimental. Las muestras de heces y orina fueron obtenidas sin ningún problema. En nuestro experimento la dieta con la relación más alta entre treonina digestible estandarizada y energía metabolizable (TDE:EM) presentó un valor de 1.4 g/Mcal. El consumo de materia seca (CMS) fue diferente entre los tratamientos (p≤0.001). Se presentaron diferencias (p≤0.001) en el nitrógeno fecal entre tratamientos (Tabla 2) y se observó un incremento lineal (p≤0.001) del nitrógeno fecal en función del consumo de nitrógeno de acuerdo con la pendiente de la relación, que es de 0.165 (SE=0.019). El nitrógeno en la orina (NO) se vio afectado por los tratamientos (p≤0.001). El nitrógeno retenido está linealmente relacionado con su consumo (p<0.001). La pendiente de la

Ceron - Threonine utilization in growing pigs procedure of linear regression with the adjusted means, and the use of the Minitab program (9). Ethical aspects. The experimental protocol was reviewed and approved by the Ethics Committee on Animal Experimentation of the Federal University of Santa Maria (Opinion 005/2012).

RESULTS The animals remained healthy during the experimental period. Feces and urine samples were obtained without any problem. In our experiment the diet containing the highest ratio between standardized digestible threonine and metabolizable energy (STD: ME) presented a value of 1.4 g Mcal-1. The dry matter intake (DMI) differed between the treatments (p≤0.001). There were differences (p≤0.001) in fecal nitrogen among treatments (Table 2) and was observed increased linearly (p≤0.001) in fecal nitrogen according to nitrogen intake with the slope of relationship being of 0.165 (SE=0.019). The nitrogen in urine (NU) was influenced by treatments (p≤0.001).

Table 2. Dry matter intake, metabolizable energy intake and nitrogen balance of pigs consuming diets with increasing levels of standardized and digestible threonine (values expressed per day). Levels of threonine in the diet (% of requirements) 30 45 60 70 EPM Prob.* Observations 6 6 6 6 MBW (BW 0.75) 24.28 24.47 24.63 25.06 0.13 0.019 DMI (g kg-1 BW0.75) 92.31 91.06 91.60 91.27 0.12 0.001 MEI (Kcal kg-1BW0.75) 56.9 354.8 353.4 351.4 0.48 0.001 NI (g kg-1 BW0.75) 1.09 1.47 1.84 2.21 0.01 0.001 -1 0.75 NF (g kg BW ) 0.06 0.17 0.25 0.29 0.02 0.001 -1 0.75 NU (g kg BW ) 0.31 0.34 0.50 0.57 0.03 0.001 -1 0.75 NE (g kg BW ) 0.47 0.52 0.75 0.86 0.01 0.001 NA (g kg-1 BW0.75) 1.02 1.30 1.59 1.93 0.03 0.001 NR (g kg-1 BW0.75) 0.71 0.96 1.09 1.35 0.02 0.001 PD (g kg-1 BW0.75) 3.81 4.93 6.08 7.46 0.11 0.001 MBW = metabolic body weight; DMI = dry matter intake; MEI = metabolizable energy intake; NI = nitrogen intake; NF = nitrogen in feces; NU = nitrogen in urine; NE = nitrogen excreted; NA = nitrogen absorbed; NR = nitrogen retained; PD = protein deposition; EPM = mean standard error; BW = body weight; Prob. = Probability. *means adjusted to the treatment effects.

The N retention was linearly (p<0.001) associated with N intake. The slope of regression line relating NU and NI 0.254 (SE=0.026). The slope of relation between retained threonine (RT) and standardized digestible threonine (SDT) intake was 0.63 (SE=0.033).

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línea de regresión relaciona el nitrógeno en la orina (NO) con el consumo de nitrógeno (NC) 0.254 (SE=0.026). La pendiente de relación entre la treonina retenida (TR) y el consumo de treonina digestible estandarizada (TDE) es de 0,63 (SE=0.033).

DISCUSIÓN Una importante suposición en la estimación empírica de la eficiencia de los aminoácidos es que la prueba de estos debe constituir la primera restricción nutricional en las dietas experimentales. La relación (TDE:EM) es menor que la recomendada para la máxima deposición de proteína (2.0 g/Mcal) en cerdos con un peso vivo de 70 kg (3). Además, se suministraron otros aminoácidos diferentes a la treonina para exceder sus requerimientos. Esto indica que la treonina es el primer factor nutricional limitante para la deposición de proteína. No se había previsto la diferencia en CMS ya que la cantidad de esta afecta el contenido de pérdidas endógenas de aminoácidos. Sin embargo, puesto que la diferencia entre el consumo más bajo y el más alto es de solamente 1.3% (Tabla 2), es posible que la pérdida de endógenos de treonina y de otros aminoácidos no se vea afectada significativamente. El nitrógeno encontrado en las heces corresponde a un promedio de digestibilidad aparente en dietas experimentales del 83.5%. El nitrógeno en la orina es consistente con lo esperado ya que esta es la principal vía de excreción de nitrógeno, cuando se encuentra por encima de lo requerido. Los resultados de la retención de nitrógeno están en línea con aquellos encontrados por Libao-Mercado y colaboradores (8) y muestran que la treonina es el primer limitante de la deposición de proteína en las dietas utilizadas en nuestro experimento. La pendiente de la línea de regresión que relaciona NO y NC indica que el 25.4% del nitrógeno consumido se eliminó a través de la orina. Ese valor fue mayor al 16% obtenido por Heger y colaboradores (10) y menor que el valor de 33% mencionado por Libao-Mercado (8). Las diferencias pueden estar relacionadas con la composición de las dietas una vez purificadas con proteína de alto valor biológico como las utilizadas por Heger y colaboradores (10), las cuales tienen la tendencia a producir una menor proporción de pérdidas de consumo de nitrógeno en la orina. Cuando el NO se relaciona con el consumo de nitrógeno digestible (CND) se observa que el nitrógeno eliminado en la orina debido a la no utilización de la deposición de proteínas es de 0.309

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DISCUSSION One important assumption in empirical estimate of amino acids efficiency is that the amino acid test must be the first nutritional constraint in the experimental diets. The ratio STD:ME is lower than the recommended for maximum protein deposition (2.0 g Mcal-1) of pigs with a live weight of 70 kg (3). In addition the amino acids others than threonine were supplies to exceed their requirements. This indicates that threonine was the first limiting nutritional factor for protein deposition. The difference in DMI was not planned because the amount of DMI influences the content of endogenous losses of amino acids. However, since the difference between the lowest and highest consumption was only 1.3 % (Table 2), it is possible that the endogenous loss of threonine and other amino acids were barely affected. The N found in feces indicating mean apparent N digestibility of experimental diets was 83.5%. The N in urine was according to the expectations since the urine is the main route of nitrogen excretion ingested in excess of requirements. The results of N retention are in agreement with Libao-Mercado et al (8) and show that the threonine was first limiting to protein deposition in diets used in our experiment. The slope of regression line relating NU and NI indicated that 25.4% of nitrogen consumed were eliminated through the urine. That value was bigger than 16% obtained by Heger et al (10) and smaller than value of 33% mentioned by LibaoMercado (8). The differences may be associated with the diet composition once purified diets with protein of high biology value as used by Heger et al (10) has a trend to result a lesser proportion of nitrogen intake losses in urine. When NU was associated with digestible nitrogen intake (DNI) we observed that the N eliminated in the urine due to non-use for protein deposition was 0.309 g kg-1 BW0.75 for each gram of DNI above of maintenance needs (Figure 1). The value was bigger than 16% obtained by Heger et al (11) who used purified diet containing a protein source of high biological value. The NU has origin from diet N that’s not used to protein synthesis, intestinal endogenous N secreted and no reabsorbed until the end of small intestine and N absorbed in large intestine. Therefore, these results emphasize again the importance of protein quality on improve N utilization in pig production (12).

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g/kg PV0,75 por cada gramo de CND por encima de las necesidades de mantenimiento (Figura 1). El valor es mayor que el 16% obtenido por Heger y colaboradores, quienes utilizaron una dieta purificada que contiene una fuente de proteínas de alto valor biológico. El NO se origina a partir de dietas con nitrógeno que no es empleado para la síntesis de proteína, por el nitrógeno endógeno intestinal secretado y no es reabsorbido hasta el final del intestino delgado y por el nitrógeno absorbido en el intestino grueso. Por lo tanto, estos resultados ponen de manifiesto una vez más la importancia de la calidad de la proteína para mejorar la utilización del nitrógeno en la producción porcina (12). El valor de la relación entre la treonina retenida TR y el consumo de TDE indica que la eficiencia marginal de TDE para la deposición de proteína es del 63% (Figura 2), la cual es menor al 73.83 y 67% encontrada por de Lange y colaboradores (7), Heger y colaboradores (10) y Heger y colaboradores (13), respectivamente. Estas discrepancias pueden estar explicadas, al menos parcialmente, por las diferencias entre los aspectos metodológicos encontrados en los estudios interrelacionados. Suponiendo que la eficiencia del consumo de treonina digestible estandarizada para la retención de proteína en la proteína corporal es el 63%, esto implica que el 37% de la TDE se pierde debido al inevitable catabolismo mínimo que ocurre incluso cuando el consumo de treonina limita la deposición de proteína. Los principales determinantes fisiológicos de este catabolismo de aminoácidos en cerdos en crecimiento son las pérdidas de aminoácidos endógenos, pérdidas de aminoácidos físicas con la piel y el pelo y pérdidas debido al intercambio proteínico (1). Se considera que la treonina se utiliza con menor eficiencia en la deposición proteica en comparación con otros

Figure 1. Relationship between digestible nitrogen intake and nitrogen in urine.

Ceron - Threonine utilization in growing pigs

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The value of the relation between RT and STD intake indicates that marginal efficiency of SDT for protein deposition is 63% (Figure 2) which is lower than 73, 83 and 67 % found by de Lange et al (7), Heger et al (10) and Heger et al (13), respectively. These discrepancies can be explained at least partially because the differences in the methodological aspects found inter studies. Assuming that 63% is the efficiency of standardized digestible threonine intake to protein retention in body protein implies that 37% of standardized digestible threonine is lost due to inevitable minimum catabolism that occurs even when the threonine intake limits protein deposition. The main physiologic determinants of inevitable minimum catabolism of amino acids in growing pigs are amino acid endogenous losses, physical amino acids losses with skin and hair and losses due to protein turnover (1). It is assumed that threonine is used with lower efficiency to protein deposition compared with other amino acids like lysine and valine, for example (5). Normally it is justified because the intestinal endogenous losses is the major contributing to inevitable catabolism and threonine is particularly important since its participation in intestinal protein mucin is high (14, 15).

Figure 2. Re l a t i o n s h i p b e t w e e n s t a n d a r d i ze d digestible threonine intake and threonine retention in pigs fed with increasing levels of threonine.

aminoácidos como la lisina y la valina, a modo de ejemplo (5). Normalmente se justifica porque las pérdidas endógenas intestinales son las principales contribuyentes del catabolismo inevitable y la treonina es particularmente importante ya que su participación en la proteína de la mucina intestinal es alta (14, 15).

The information about threonine deposition efficiency is essential to the development of requirement estimates by the factorial method, which in turn is the preferred method for estimating the nutritional requirements of pigs (16) and used in most of the simulation models of growth pigs (17).

La información acerca de la eficiencia de la deposición de treonina es fundamental para el desarrollo de las estimaciones de las necesidades mediante el método factorial, que a su vez es el método preferido para la estimación de los requerimientos nutricionales de cerdos (16) y se utiliza en la mayoría de los modelos de simulación de cerdos en crecimiento (17).

In conclusion the marginal efficiency of utilization of 0.63 can be used to calculate the nutritional requirements of threonine by the factorial method.

En conclusión, el valor de la eficiencia marginal de utilización de 0,63 se puede utilizar para calcular los requerimientos nutricionales de treonina por el método factorial.

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5145-5153, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Productive performance of naked neck chickens that were fed leaf meal shrubs Comportamiento productivo de pollos cuello desnudo que se alimentaron con harina de hojas de arbustos Santos M Herrera G,1* Ph.D, Aslam Díaz C,2 Ph.D. Technical University of Quevedo (UTEQ), Faculty of Animal Science, Carretera de Quevedo a Santo Domingo de los Tsáchilas, km 1 ½, Quevedo, Los Ríos, Ecuador. 2University of Guayaquil, Faculty of Medicine veterinary and Zootechnics. Kennedy Avenue and Delta, Guayaquil, Guayas, Ecuador. *Correspondencia: mallyhe55@hotmail.com 1

Received: April 2015; Accepted: August 2015.

ABSTRACT Objective. To compare the productive performance of naked neck chickens (phases of initiation, growth and final) that were fed meals Gliricidia sepium, Cajanus cajan and Morus alba leaves. Materials and methods. 192 chickens, 1-84 days of age were distributed in a randomized block design with three experimental groups (5% of shrub in the diet), 48 animals/ group, eight replicates/ treatment, six animals/ reply and three animals/ sex in each replicate were used. The control group consumed diet based on corn and soybeans. They were reared on floor. Weighed every seven days. Weight gain, voluntary intake, conversion, balance and efficiency of feed utilization were calculated. Results. The highest total feed intake and average daily gain in rearing were 37.43g 9509.96 g respectively for M. alba (p<0.05), which also presented the best efficiency of energy and protein. Meanwhile, G. sepium showed the lowest values. Conclusions. It is possible to replace 5% of corn and soy in the diet of naked neck chickens, with the inclusion of leaf meal M. alba and get a favorable productive behavior. Key words: Cajanus, consumption, gain, Gliricidia, Morus, poultry (Source: NAL Agricultural Thesaurus).

RESUMEN Objetivo. Comparar el comportamiento productivo de pollos cuello desnudo (fases de inicio, crecimiento y final) que se alimentaron con harinas de hojas de Gliricidia sepium, Cajanus cajan y Morus alba. Materiales y métodos. Se utilizaron 192 pollos, de 1-84 días de edad que se distribuyeron en un diseño de bloques al azar, con tres grupos experimentales (5% de arbustivas en la ración), 48 animales/ grupo, ocho réplicas/ tratamiento, seis animales/ réplica y tres animales/ sexo, en cada réplica. El grupo control consumió dieta a base de maíz y soya. Se criaron en piso. Se pesaron cada siete días. Se calcularon la ganancia de peso, el consumo voluntario, la conversión, el balance y la eficiencia en la utilización de alimentos. Resultados. El mayor consumo total de alimento y la ganancia promedio diaria en la crianza fueron de 9509.96 g y 37.43g, respectivamente, para M. alba (p<0.05), donde también se presentó la mejor eficiencia en el uso de la energía y la proteína. Mientras, la G. sepium presentó los valores más bajos. Conclusiones. Es posible sustituir el 5% de maíz y soya, en la dieta de pollos cuello desnudo, con la inclusión de harina de hojas de M. alba y obtener un favorable comportamiento productivo. Palabras clave: Avicultura, Cajanus, consumo, ganancia, Gliricidia, Morus (Fuente: NAL Tesauro Agrícola). 5145

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2016

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Meals from shrubs leaves such as Gliricidia sepium, Cajanus cajan and Morus alba are alternatives to grains rich in protein and energy, to reduce the cost of feed, in raising monogastric animals (1). G. sepium and C. cajan belong to the Fabaceae or Legumes family and M. alba is Moraceae family. The three plants are cultivated in tropical regions for its high content of protein, energy and minerals (2).

Las harinas de hojas de arbustos como Gliricidia sepium, Morus alba y Cajanus cajan son alternativas a los granos, para reducir el costo de la alimentación, en la crianza de animales monogástricos (1). Gliricidia sepium y Cajanus cajan pertenecen a la familia Fabaceae y Morus alba, a la Moraceae. Las tres plantas se cultivan en las regiones tropicales, por su alto contenido de proteína, energía y minerales (2).

These plants can be used for feeding naked neck camperos chicks considered heterozygous. They tolerate heat better, are more resistant to adverse environmental conditions and increased efficiency in converting nutrients in meat (3).

Estas plantas pueden ser utilizadas para la alimentación de los pollos cuello desnudos heterocigotos que se consideran camperos. Estos animales toleran mejor el calor, tienen mayor resistencia a condiciones ambientales adversas y mayor eficiencia en transformar los nutrientes en carne (3).

However, it is necessary to study the productive performance of naked neck chicks, with the inclusion in the diets of shrubs, as a novel alternative, because of its effect is not known in terms of feed consumption and conversion as well as efficiency nutrient use. The inclusion of 5% leaf meal from M. alba, could improve feed consumption, growth performance and the efficiency of nutrients, compared with the inclusion of G. sepium and C. cajan, which would allow the replacement of corn and soybeans in naked neck chickens diet. Therefore, the objective of this study was to evaluate the productive performance of naked neck chickens fed meal from shrubs (Morus alba, Gliricidia sepium and Cajanus cajan), as replacement of corn and soybean in diet.

MATERIALS AND METHODS Location. The research was conducted in the province of Los Ríos, Republic of Ecuador, a 01°06’ south latitude and 79°29’ west longitude, 75 meters above sea level, with an annual average temperature of 24.70°C, relative humidity 87%, average annual rainfall of 2613 mm, annual heliophany of 886 h and clay loam soil. Planting, harvesting and drying of the plant. M. alba (var. Criolla) and G. sepium planted with cuttings (inclined) of 40 cm, a distance between plants of 40 cm and 1 m between rows, in an area of 5000 m2 which was divided into three batches (1667 m2/ batch) according to the age of the seed (30; 45 or 60 days after regrowth) and fertilized with organic fertilizer (300 kg/ ha/ year). C. cajan will sow 18 kg seed/ ha broadcast, because its objective was as forage. The initial cut

S i n e m b a r g o, e s n e c e s a r i o e s t u d i a r e l comportamiento productivo de estos pollos cuello desnudo, con la inclusión en las dietas de estas plantas arbustivas, como una alternativa novedosa de alimentación, porque no se conoce su efecto en el consumo, la conversión y la eficiencia en el uso de los nutrientes. La inclusión del 5% (p/v) de harina de hojas de Morus alba, pudiera mejorar el consumo, el comportamiento productivo y la eficiencia en el uso de los nutrientes, en comparación con la inclusión de Gliricidia sepium y Cajanus cajan, lo que pudiera permitir la sustitución del maíz y la soya, en la alimentación del pollo de cuello desnudo. El objetivo de esta investigación fue comparar el comportamiento productivo de pollos de cuello desnudo que se alimentaron con harinas de hojas de las plantas arbustivas Morus alba, Gliricidia sepium y Cajanus cajan, para la sustitución del maíz y la soya en su dieta.

MATERIALES Y MÉTODOS Localización. La investigación se realizó en la provincia de Los Ríos, República de Ecuador, a 01°06’ latitud sur y 79°29’ latitud oeste, 75 msnm, con una temperatura promedio anual de 24.70°C, humedad relativa del 87%, precipitación promedio anual de 2613 mm, heliofanía anual de 886 horas y suelo franco arcilloso. Plantación, recolección y secado del vegetal. Morus alba (var. Criolla) y Gliricidia sepium se plantaron con estacas (inclinadas) de 40 cm, a una distancia de narigón de 40 cm y 1 m de camellón, en un área de 5 000 m2 que se dividió

Herrera - Naked neck chickens fed flour shrubs was made after one year of establishment. The foliage (leaves and tender stems) were collected manually, dried in the shade, on a cement floor for three days, homogenized, ground and stored for later use in rations, with successive cuts every 45 days.

5147

en tres lotes (1667 m2/ lote) según, la edad de la semilla (30; 45 o 60 días después del rebrote) y se fertilizó con abono orgánico (300 kg/ha/año). Cajanus cajan se siembró con 18 kg de semilla/ ha, al voleo. El corte inicial se realizó luego de un año de establecimiento. El follaje (hojas y tallos tiernos) se recolectaron de forma manual, se secaron a la sombra, en piso de cemento, por tres días, se homogenizaron, molieron y almacenaron, para su posterior utilización en las raciones, con cortes sucesivos cada 45 días. La composición química promedio de las harinas de Morus alba, Gliricidia sepium y Cajanus cajan fue la siguiente: 92.80; 89 y 94.66% de materia seca (MS), 24.80; 22.90 y 25.27% de proteína cruda (PC), 2.96; 1.94 y 1.13% de calcio (Ca), 0.38; 0.23 y 0.33% de fósforo (P), 12.68; 27.22 y 39.14% de fibra cruda (FC) y 7.10; 8.74 y 7.64 MJ/kg de energía metabolizable (EM).

Chemical analysis of food. The DM, CP, ME, ether extract (EE), NDF, ADF, hemicellulose, cellulose and lignin were determined (4). Animals and diets. Heterozygous naked neck chickens 192 (T451N), 96 males and 96 females, average weights 50 g at one day of age were used. Were vaccinated against Newcastle. The animals were housed in rustic facilities and raised in floor with a bed of 15 cm chip. The area was divided with fences, to assign the animals to different groups and adapted to diets for 14 days. Birds received the ration once daily. The three experimental groups fed flour foliage shrub (treatments I, II and III) at the level of 5%. The control group consumed a corn and soybean basal diet (Table 1). The rations were formulated according to the requirements for these phases (5). All diets were iso-energetic (11 MJ/kg metabolizable energy DM) and iso-protein (19; 17 and 16% crude protein, to rearing phases I, II and III). The animals had free access to water and food.

Análisis químico del alimento. Se determinaron la MS, PC, EM, extracto etéreo (EE), la FND, FAD, hemicelulosa, celulosa y lignina (4). Animales y raciones. Se utilizaron 192 pollos cuello desnudo heterocigóticos (T451N), 96 machos y 96 hembras, con pesos promedios de inicio de 50 g, con un día de edad. Se vacunaron contra Newcastle. Los animales se alojaron en instalaciones rústicas y se criaron en piso, con una cama de viruta de 15 cm. El área se dividió con cercas, para alojar a los animales de los diferentes grupos y se adaptaron a las dietas, durante 14 días. Ellos recibieron la ración una vez al día. Los tres grupos experimentales consumieron la harina de follaje de arbustivas (tratamientos con I, II y III) al 5%. El grupo control consumió como dieta base maíz y soja (Tabla 1). Las raciones se formularon según, los requerimientos para estas fases. Los animales tuvieron libre acceso al agua y al alimento.

Experimental procedure. The animals were weighed weekly, at 7:30 am, before feed distribution, to calculate the average daily gain (ADG), phase and accumulated breeding (accumulated in raising body weight is the result of the difference between the final liveweight less 50 g of liveweight purchase of animals, divided by the 84 day of rearing). Birds were placed under heating for seven days. These heaters were connected four hours before the arrival of the

Table 1. Composition of diets for phase in naked neck chickens that were fed meals shrubs (5% inclusion). Ingredients

Control

Gliricidia sepium

Cajanus cajan

Morus alba

III

Corn, flour

55.29

67.72

70.56

47.68

61.54

61.83

47.39

61.43

61.72

47.50

60.90

62.11

Soy, flour

35.51

22.51

21.01

35.01

21.01

20.00

35.01

21.01

36.00

Fish, flour

2.51

3.50

2.51

1.61

2.99

2.51

1.61

2.99

2.51

1.61

2.99

2.51 7.50

Rice, powder

2.51

2.99

6.01

7.50

2.99

6.01

7.50

2.99

6.01

Calcium carbonate

1.80

1.50

1.21

1.61

1.30

0.99

1.69

1.41

1.10

1.30

0.99

0.70

Sodium chloride

0.35

0.33

0.31

0.29

0.31

0.29

0.31

0.26

0.31

Palm oil

2.79

4.20

3.50

Methionine

0.15

0.20

0.15

0.20

0.22

0.15

0.20

0.22

0.15

0.20

0.22 0.15

Pre-mixture1

0.20

0.24

0.15

0.24

0.20

0.15

0.24

0.20

0.15

0.24

0.20

Di-calcium phosphate

1.30

1.41

1.30

1.21

1.30

1.21

1.30

1.21

1.30

Propionic acid

0.04

Antirust

0.04

Lysine

0.00

0.11

0.07

0.15

0.09

0.15

0.09

0.13

0.09

I, initial phase (0-4 weeks); II, growth phase (5-10 weeks); III, finals (11-12 weeks). 1 Premix of vitamins and minerals, where 1.00 kg of feed contains the following vitamins: A (10000.00 IU), D3 (2000.00 IU), E (10.00 mg), K3 (2.00 mg), B1 (1.00 mg), B2 (5.00 mg), B6 (2.00 mg), B12 (15.00 mg), B3 (125.00 mg), B5 (10.00 mg), B9 (0.25 mg) and biotin (0.02 mg) and micromineral elements: selenium (0.10 mg ), Iron (40.00 mg), copper (12.00 mg), zinc (120.00 mg), Mg (100.00 mg), iodine (2.50 mg) and cobalt (0.75 mg)

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animals. In the area of each of the 32 replicates a trough and manual feeder and 60 watt bulb was installed. Voluntary intake (supply-rejection) was measured once a week. Feed conversion and feed intake were calculated from the liveweight gain. The feed balance and the efficient use of energy and protein, to the weight gain obtained were calculated (such as energy and protein intake divided by the average daily live weight gain). Statistical analysis. The animals were distributed in a randomized block design with three experimental groups (48 animals/ treatment, with 5% shrub in the ration), eight replicates per treatment, six animals per replicate (three animals/ sex) and a group 48 control animals (diet based on corn and soybeans). Data were analyzed by SAS software (Statistical Analysis System), version 9.3 (2013) (6) to evaluate descriptive statistics (mean and standard deviation) and multiple range test Turkey was used to compare means, in the analysis of variance (ANOVA), to 0.05 significance level.

RESULTS The greatest total consumption (p<0.05) was obtained in the control (8644.18 g) diet and with M. alba (9509.96 g) and lowest with G. sepium (8557.04 g). Similarly happened in the growth phase. However, there was no difference in initial and final phase (table 2). The highest final live weight (p<0.05) was obtained in M. alba (3194.04 g) and the lowest in G. sepium (2859.48 g), as in the accumulated average gain rearing. There was no difference in average daily liveweight gain in the initial and final phases, but in the growth phase, the best gains were obtained in M. alba and C. cajan (Table 3).

2016

A nál is is es tadí s tic o. L o s a n i m a l e s s e distribuyeron en un diseño de bloques al azar, con tres grupos experimentales (48 animales/ tratamiento, con 5% (p/v) de arbustivas en la ración), ocho réplicas por tratamiento, seis animales por réplica (tres animales/ sexo) y un grupo control de 48 animales (con la dieta base de maíz y soya). Los datos se analizaron por el software SAS (Statistical Analysis System), versión 9.3 (2013), (5), para evaluar estadígrafos descriptivos (media y desviación estándar) y se utilizó la prueba de múltiples rangos, para la comparación de medias, en el análisis de varianza (ANOVA). Procedimiento experimental. Los animales se pesaron cada siete días, 7:30 horas, antes de la ingestión del alimento, para calcular la ganancia media diaria, por fase y acumulada de la crianza. Se ubicaron debajo de calentadoras, por siete días. Estas calentadoras se conectaron cuatro horas antes de la llegada de los animales. En el área de cada una de las 32 réplicas se instaló un bebedero y comedero manual y un bombillo de 60 watt. Se midió el consumo voluntario (ofertarechazo), una vez a la semana. Se calculó la conversión como el consumo de alimento, entre la ganancia de peso vivo. Se calculó el balance de alimentos y la eficiencia en la utilización de la energía y la proteína, para la ganancia de peso que se obtuvo.

RESULTADOS El mayor consumo total (p<0.05) se obtuvo en la dieta con M. alba (9509.96 g) y la menor con G. sepium (8557.04 g). De igual modo sucedió en la fase de crecimiento. Sin embargo, no hubo diferencia en la fase inicial y final (Tabla 2).

There were no differences in feed conversion in any of the three phases (Table 4).

El más alto peso vivo final (p<0.05) se obtuvo en M. alba (37.43 g) y el menor en G. sepium (33.45 g). Del mismo modo ocurrió con la ganancia de peso vivo, en la fase de crecimiento y con la ganancia acumulada de peso (Tabla 3).

With the food balance calculation showed that all diets covered the nutritional requirements of chickens to gain weight (Table 5) was obtained. The average chemical composition of flours M.

No hubo diferencias en la conversión de alimento, en ninguna de las tres fases (Tabla 4). Es probable que esto se deba a que las cuatro dietas tuvieron contenidos nutricionales similares y el

Table 2. Feed intake (g / animal), by growth phase, naked neck chickens that were fed with 5% flour bushes. Indicators

Control

Gliricidia sepium

Cajanus cajan

Morus alba

EE (±)

Significance

Start phase (28 días)

1146.16

1097.88

1197.52

1350.88

45.33

0.1425

Growth phase (42 días)

5375.64b

5480.10 ab

5709.48 ab

6020.34a

98.42

0.0482

Final phase (14 días)

2122.38

1979.06

1976.62

2138.74

58.90

0.1908

Total consumption

8644.18c

8557.04c

8883.62b

9509.96a

70.58

0.0001

a, b

and

equal Letters in the super-indices are not significantly different at p<0.05

Herrera - Naked neck chickens fed flour shrubs

5149

Table 3. Behaviour productive nude neck chickens were fed 5% flour bushes. Indicators

Control

Gliricidia sepium

Morus alba

SE (±)

Significance

Live weight end, g

Cajanus cajan

3048.52c

2859.48b

3030.42b

3194.04a

44.32

0.0009

Weight gains, g Average/ 24.68 22.85 24.13 day/ start Initial phase (28 days) 690.96 639.92 675.72 Average/ day/ growth 46.72 43.35 47.73 Growth phase (42 days) 1962.18b 1820.76c 2004.60a Average/ day/ end 24.67 24.91 21.44 Final phase 345.38 348.80 300.10 (14 days) Average/ day/ breeding 35.70b 33.45ab 35.48ab Cumulative (84 days) 2998.52b 2809.48c 2980.42b a, b and c equal Letters in the super-indices are not significantly different at p<0.05

27.25

763.08 48.08 2019.42a 25.83

39.57 41.23 -

0.2226 0.0472 -

361.64

15.12

0.3312

37.43a 3144.04a

1.58 32.24

0.0467 0.0007

Table 4. Conversion of nutrients for each phase, in naked neck chickens that were fed with 5% flour bushes. Phases rearing

a, b

Control

Gliricidia sepium

Cajanus cajan

Morus alba

SE (±)

Significance

Home (28 days)

1.66

1.72

1.77

0.02

0.1324

Growth (42 days)

2.73

3.01

2.85

2.98

0.07

0.1807

Final (14 days)

3.07

5.67

6.58

5.91

0.09

0.1462

and

equal Letters in the super-indices are not significantly different at p<0.05

Table 5. Balance of food, growth phase, naked neck chickens consuming meals shrubs (5%). Elements

Control

Gliricidia sepium

Cajanus cajan

Morus alba

III

Consumption/ bird/ day, kg DM

0.04

0.11

0.13

0.04

0.13

0.14

0.04

0.14

0.05

0.14

0.15

Contribution ME, MJ/ kg

7.06

7.18

7.28

7.06

7.11

7.18

7.06

7.11

7.17

7.06

7.11

7.25

Requirement ME, MJ/ bird/ day

7.05

6.93

7.05

6.93

7.05

6.93

7.05

6.93

Difference ME, MJ

0.01

0.13

0.35

0.01

0.06

0.25

0.01

0.06

0.24

0.01

0.06

0.32

Contribution CP, g

220.20

182.30

172.60

220.30

182

176.40

221.20

183.10

177.50

220.80

182.10

173

Requirement CP, g

220

180

170

220

180

170

220

180

170

220

180

170

Difference CP, g

0.20

2.30

2.60

0.30

2.00

6.40

1.20

3.10

7.50

0.80

2.10

Contribution CF,%

3.71

3.85

3.81

5.45

5.70

6.03

6.22

6.47

6.81

4.97

5.20

5.49

Requirement CF,%

Difference CF,%

-0.29

-0.15

-0.19

1.45

1.70

2.03

2.22

2.47

2.81

0.97

1.20

1.49

Contribution Ca,%

1.06

0.96

0.85

1.07

0.95

0.85

1.06

0.94

0.85

1.07

0.95

0.85

Requirement Ca,%

1.05

0.9

0.82

1.05

0.9

0.82

1.05

0.9

0.82

1.05

0.9

0.82

Difference Ca,%

0.01

0.06

0.03

0.02

0.05

0.03

0.01

0.04

0.03

0.02

0.05

0.03

Contribution P,%

0.40

0.41

0.40

0.41

0.40

0.41

0.42

Requirement P,%

0.40

0.01

0.02

ME contribution/ GMD, MJ/ g

0.29

0.15

0.30

0.31

0.16

0.29

0.15

0.33

0.26

0.15

0.28

CP contribution/ GMD, g/ g

8.92

3.90

9.64

4.20

7.08

9.17

3.84

8.28

8.10

3.79

6.70

Difference P,%

I, initial phase (0-4 weeks); II, growth phase (5-10 weeks); III, finals (11-12 weeks)

alba, G. sepium and C. cajan were: 92.80; 89 and 94.66% dry matter (DM), 24.80; 22.90 and 25.27% crude protein (CP), 2.96; 1.94 and 1.13% calcium (Ca), 0.38; 0.23 and 0.33% phosphorus (P), 12.68; 27.22 and 39.14% crude fiber (CF) and 7.10; 8.74 and 7.64 MJ/ kg of metabolizable energy (ME). The study of the efficiency the use of energy and protein diet (table 5) reaffirmed the results of the voluntary consumption and better performance of animals fed M. alba (Tables 2 and 3).

valor de inclusión de las arbustivas fue similar y bajo en los tres tratamientos; lo que no afectó los resultados en comparación con el control. Con el cálculo del balance de alimentos se demostró que todas las dietas cubrieron los requerimientos nutricionales de los pollos, para la ganancia de peso que se obtuvo (Tabla 5). Sin embargo, las dietas con M. alba tuvieron la mayor eficiencia, en el uso de la energía (aporte de MJ entre GMD) y la proteína (aporte de proteína entre GMD), para incrementar el peso vivo (ganancia media diaria), durante toda la crianza y por fases.

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DISCUSSION A lower consumption of M. alba naked neck chickens heterozygotes, with a value of total consumption of 7420 g, but with 6% inclusión was found (1). The results were higher than M. alba, when 10% leaves and branches were included (7). This result may be due to increased palatability of M. alba, less fiber and anti-nutritional elements, as opposed to the lower palatability, the increased presence of fiber and antinutritional factors G. sepium and C. cajan (8). In the leaves of G. sepium have been isolated high in tannins, saponins, coumarins, cyanogenic glycosides, nitrates, protease inhibitor, fitohemoglutininas and phytic acid (9) and C. cajan, high concentrations of amines, phenols, tannins, alkaloids and middle of triterpenes and steroids that affecting the digestibility and voluntary intake. En las hojas de G. sepium se han aislado altos contenidos de taninos, saponinas, cumarinas, glucósidos cianogénicos, nitratos, inhibidor de proteasas, fitohemoglutininas y ácido fítico (10) y las de C. cajan altas concentraciones de aminas, fenoles, taninos, alcaloides y medios de triterpenos y esteroides (11) que afectan la digestibilidad y consumo voluntario. Saponins in M. alba were detected and found polyphenols, coumarins and tannins (11). However, the alkaloid content, reducing compounds and tripterpenos was lower. These lend fodder and less bitter taste palatability (8). M. alba has low diversity of secondary structures which are indicative of reduced palatability (1). Nor has high content of flavonoids that cause stunting of animals and digestibility of proteins. These compounds are inhibitors of consumption, foaming properties and interference with intestinal absorption. The species of higher concentrations should be handled with care supply systems, to avoid digestive disorders (12). This could justify the higher consumption of diets with M. alba, regarding G. sepium and C. cajan. This productive behavior regarding the inclusion of M. alba in poultry diet was positive (13), where the inclusion of 5% mulberry leaf meal in feed for broilers, did not affect weight gain, compared to the control and 968 g were obtained in the startup phase and 955 g in end. With values of 10; 20 and 30% inclusion of M. alba obtained the best results with 10%, but lower than those of this research (7).

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Esta diferencia entre tratamientos, no se debió a su concentración energética, ni proteica de las dietas, porque todas tuvieron igual contenido, sino a la proporción de carbohidratos solubles y estructurales y al valor biológico de la proteína que condujeron a la mejor eficiencia en el aprovechamiento de los nutrientes. El estudio de la eficiencia en el uso de los nutrientes ratificó los resultados del consumo voluntario y el mejor comportamiento de los animales que consumieron M. alba (Tablas 2 y 3).

DISCUSIÓN G. sepium puede ser utilizada para la alimentación de pollos de ceba y es posible que no se afecte el consumo por la presencia de antinutrientes. C. cajan se podría recomendar como una planta favorable, para la alimentación animal, con mejoras de su nutrición y el consumo. El consumo de M. alba fue menor en pollos cuello desnudo heterocigotos, con un valor de consumo total de 7420 g, pero con 6% de inclusión (1). Los resultados fueron superiores respecto a M. alba, al 10% e incluyeron hojas y ramas (6). Este resultado pudo deberse a la mayor palatabilidad de M. alba, la menor cantidad de fibra y elementos anti-nutricionales, en oposición a la menor palatabilidad, presencia de fibra y factores antinutricionales de G. sepium y C. cajan (7). En las hojas de G. sepium y C. cajan se han detectado altos contenidos de taninos, saponinas, cumarinas, glucósidos cianogénicos, nitratos, inhibidor de proteasas, fitohemoglutininas y ácido fítico que afectan la digestibilidad y consumo voluntario (8). Se detectaron saponinas en M. alba y encontraron polifenoles, cumarinas y taninos (9). Sin embargo, el contenido de alcaloides, compuestos reductores y tripterpenos fue menor. Estos le confieren a los forrajes sabor amargo y menor palatabilidad. M. alba posee baja diversidad de estructuras secundarias que son indicadoras de reducción de la palatabilidad. Tampoco posee altos contenidos de flavonoides que producen retardo en el crecimiento de los animales y en la digestibilidad de las proteínas. Estos compuestos son inhibidores del consumo, con propiedades espumantes e interferencia en la absorción intestinal. Las especies de mayores concentraciones deben ser manejadas con cuidado en los sistemas de alimentación, para evitar trastornos digestivos (10). Esto pudiera justificar los mayores consumos de dietas con M. alba, respecto a G. sepium y C. cajan.

Herrera - Naked neck chickens fed flour shrubs Studies in commercial layers with the inclusion of C. cajan showed that the productive behavior was depressed, with increasing flour this plant in the diet, with values over 10% (14). In all cases the superiority of M. alba diets, to obtain favorable liveweight gains in broiler chickens showed bare neck and at least, this shrub has the potential nutritional necessary to replace part of corn and soybeans in feed for broilers. Converting the results was positive and no differences were found in control when inclusion levels were low shrub, 3-6% (1). This is likely to be because the four diets had similar nutritional content and value of inclusion of shrub was similar and low in the three treatments, which did not affect the results compared to the control. Is likely that the inclusion of small amounts of M. alba and the composition of the fiber increase utilization efficiency of the remaining nutrients in the diet (15). This is related to the results in the apparent retention DM, nutrients and low in neutral detergent fiber of M. alba, compared with G. sepium and C. cajan (1). As for the biological value of the protein and amino acid composition M. alba has higher content of essential amino acids that C. cajan and G. sepium (16-18). This could affect the amino acid balance of birds and limit the efficiency in the utilization of protein in C. cajan and G. sepium as replacers other proteins, which did not happen with M. alba. However, M. alba diets had the highest efficiency in the use of energy (MJ contribution between CMD) and protein (protein intake between CMD) to increase live weight (average daily gain) for all parenting and stages. This difference between treatments, their proteinenergy or diets should not have been, because all had the same content, but the proportion of soluble and structural carbohydrates and biological value of the protein leading to improved efficiency in the utilization nutrient. A favorable growth performance, in all cases, by using chickens and improved rustic bareneck was obtained. These animals better tolerate heat, reducing the plumage (19), are more efficient in obtaining greater weight gain, meat yield and mortality is lower. Importantly, in this study only one animal died in the startup phase, by crushing. Regarding the efficiency of the protein, these chickens naked neck protein require 2-3% less than the full plumage, feathers in the

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Este comportamiento productivo, respecto a la inclusión de M. alba en la dieta de aves de corral, fue positivo (11), donde la inclusión del 5% (p/v) de harina de hojas de morera en la alimentación de pollos de engorde, no afectó la ganancia de peso, respecto al control y se obtuvieron 968 g, en la fase de inicio y 955 g en la de finalización. Con valores de 10; 20 y 30% de inclusión de M. alba se obtuvo los mejores resultados con 10%, pero inferiores a los de esta investigación (6). Estudios con la inclusión de C. cajan en gallinas ponedoras comerciales demostraron que el comportamiento productivo se deprimió con el aumento de la harina de esta planta y recomendó valores inferiores al 10%. Se recomendó, no utilizar altos valores de C. cajan en la alimentación de las aves (12). Se demostró la obtención de ganancias de peso favorables en pollos de engorde, con este valor de inclusión de G. sepium aunque, inferiores al resto de las dietas. En todos los casos se demostró la superioridad de las dietas con M. alba, para la obtención de favorables ganancias de peso vivo, en pollos de ceba de cuello desnudo. Los resultados en la conversión fueron positivos y no se encontraron diferencias con el control, cuando los niveles de inclusión de las arbustivas fueron bajos, entre 3-6% (1). Es probable que la inclusión de pequeñas proporciones de M. alba y la composición de su fibra incrementen la eficiencia de utilización del resto de los nutrientes contenidos en la dieta (13). Esto tiene relación con los resultados en la retención aparente de MS, nutrientes y el bajo contenido de fibra detergente neutra de M. alba, en comparación con G. sepium y C. cajan (1). En cuanto al valor biológico de la proteína y composición de aminoácidos M. alba posee mayor contenido de aminoácidos esenciales que C. cajan y G. sepium (14,15,16). Esto pudo afectar el balance de aminoácidos en las aves y limitar la eficiencia en el aprovechamiento de la proteína en C. cajan y G. sepium, como sustitutos de otras proteínas, lo que no sucedió con M. alba. Se obtuvo un comportamiento productivo favorable, en todos los casos, por el uso de pollos rústicos y mejorados de cuello desnudo. Estos animales toleran mejor el calor, por la reducción del plumaje (17), aprovechan mejor la energía, en la obtención de mayor ganancia de peso, rendimiento de carne y la mortalidad es más baja. Es importante destacar que en este trabajo sólo murió un animal, en la

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formation of regular and silent, and therefore use of these nutrients in the formation of muscle (3). You can replace 5% of corn and soy in the diet of naked neck chickens, with the inclusion of leaf meal M. alba and get a favorable productive performance, total consumption of 9509.96 g, average daily gain in breeding, 37.43 g efficient use of nutrients, compared with the inclusion of G. sepium and C. cajan.

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fase de inicio, por aplastamiento. En cuanto a la eficiencia en el uso de la proteína, estos pollos cuello desnudos requieren 2-3% proteína menos que los de plumaje completo, en la formación de plumas y las mudas periódicas, por lo que utilizan estos nutrientes en la formación de músculos (3). Es posible sustituir el 5% (p/v) de maíz y soya, en la dieta de pollos de cuello desnudo, con la inclusión de harina de hojas de M. alba para obtener un comportamiento productivo favorable, en el consumo total, de 9509.96 g, ganancia de peso diaria en la crianza, de 37.43 g y eficiencia en el uso de los nutrientes, en comparación con la inclusión de G. sepium y C. cajan.

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5154-5162, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

The use of new practices for assessment of body condition score El Uso de las nuevas prácticas para la evaluación de la condición corporal Deniz Alic Ural, Ph.D. Adnan Menderes University, Veterinary Faculty, Isikli, Aydin, Turkey. Corresponding: alicdeniz@gmail.com Received: March 2015; Accepted: September 2015.

ABSTRACT Objective. Two body condition scoring systems were compared to those of interpretation of cow’s body condition at a local farm located in Aydin region, Turkey. Materials and methods. A total of 50 head Holstein-Friesian cows at 1st-4rd parity (mid-lactation), raised at a private dairy farm located in Aydin, Turkey was constituted the animal material of the present study. Scores were obtained by use of the primary systems utilized within the US (1-5 scale with 0.25 intervals) and compared to those of Bayer Health Care Animal Health’s BCS Cowdition Smartphone App. Results. The overall means of BCS were found as 3.37± 0 . 0 6 8 a n d 3 . 4 5 ± 0 . 0 6 0 f o r B C S Cowdition a n d USBCS, respectively. The positive correlation among BCS Cowdition and USBCS systems was found as 0.81 in evaluating body condition (p<0.01). The positive linear relationship (p<0.001) was found between BCS Cowdition and USBCS systems (R2=0.66). The linear relationship between the latter assessment methods demonstrated that both usual and digital systems tended to scare cows similarly. Conclusions. This comparison represented progress within the understanding of the relationship between these two systems. Moreover, it may be suggested that BCS Cowdition Smartphone App. may be a good alternative for interpretation of BCS. Key words: Body condition score, dairy cattle, new practices (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. Dos sistemas de puntuación de la condición corporal se compararon con (el) de la interpretación de la condición corporal de las vacas en una granja local ubicada en la región de Aydin, Turquía. Materiales y métodos. Un total de 50 vacas Holstein Friesian en (su) primera a cuarta parición (a mediados de la lactancia), explotadas en una granja lechera privada situada en Aydin, Turquía constituyó el material animal del presente estudio. Las puntuaciones se obtuvieron mediante el uso de los sistemas primarios utilizados dentro de los EE.UU. (1-5 escala con intervalos de 0.25) y se compararon con (el) de BCS Cowdition Smartphone App de Bayer Health Care Salud Animal. Resultados. Los promedios globales de BCS encontrados fueron de 3.37±0.08 y 3.45±0.060 para BCS Cowdition y USBCS, respectivamente. La correlación entre BCS sistemas Cowdition y USBCS (para la evaluación de la condición corporal fue de 0.81 (p<0.01) con un coeficiente de determinación de. Se encontró que la relación lineal positiva (p<0.001) entre BCS Cowdition y sistemas USBCS (R2=0.66). La relación lineal entre los métodos de evaluación demostró que tanto los sistemas usuales y digitales tienden a calificar a las vacas de manera similar. Conclusiones. Esta comparación constituye un avance en la comprensión de la relación entre estos dos sistemas. Por otra parte, se puede sugerir que a pesar de los cambiarlo por un término adecuado entre evaluadores visuales, BCS Cowdition Smartphone App. Puede ser una buena alternativa para la interpretación de BCS. Palabras clave: Condición corporal, ganado lechero, nuevas prácticas (Fuente: CAB). 5154

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Body condition score (BCS) has been recognized as a significant tool for dairy cattle management. Moreover BCS is the foremost method for interpretation of body energy reserves in dairy cows (1-9). It is quite simple and a repeatable system for evaluation of body fat stores (1, 1014) and a considerable attention has been paid to BCS, in terms of estimating tissue mobilization (15). Also, this system is used to preparation of suitable feed plans and determination of nutritional status of cows in dairy farm (16).

La condición corporal (CC) se ha reconocido como una herramienta importante para el manejo de ganado lechero. Además, la CC es el método más importante para la interpretación de las reservas de energía corporal en este ganado (1-9). Es un sistema muy simple y con buena repetibilidad para evaluar las reservas corporales de grasa (1, 10-14); se ha puesto una atención considerable en la CC, en lo que se refiere al cálculo de la movilización de los tejidos (15). Este sistema se utiliza también para la preparación de un plan de alimentación adecuado y para la determinación del estado nutricional de las vacas en la granja lechera (16).

There are some difficulties within the interpretation of BCS systems, through range and variation (2). Furthermore different scoring scales varying from 0 to 4.0 to 5.1 to 4.1 to 5 and 1 to 9 (1). Similarly to US system, the most commonly and probably the foremost scare range applies a scale from 1 to 5, with 1 being emaciated, 2 thin, 3 average, 4 fat and finally 5 obese in Turkey (17). The latter system was then adopted to a method previously described elsewhere (18), was based entirely upon visual assessment, where as another body condition scoring system involved palpation of the specific body parts, employed in some countries such as UK, Ireland and New Zealand (4). There is a general consensus regarding benefits of BCS, whereas only a few percentage of farms (solely 5%), adopted and explored the feasibility of estimating BCS in US. It should also be stressed that the BCS should be updated on each cattle, reinforcing the cost at the farm (5). The feasibility of BCS interpretation from digital images has been the subject of some prior studies (1,4). Regarding the disperancies among aforementioned studies, the present author decided to perform this study. The present author interest to this subject was aroused following awareness of Bayer Healthcare Animal Health’s Innovative BCS Cowdition Smartphone Application, designed for simplification and standardization of the BCS for dairy cows. Therefore the objective of the present work was to better understand and compare the methods of assessing dairy cow BCS, namely visual assessment and digital reports. Hence, the results of this study might have helped researchers and consultants in an attempt to estimate and compare BCS presented from other relevant studies.

MATERIAL AND METHODS Animals. Data for the present study were collected from 50 head Holstein-Friesian cows

Hay algunas dificultades en la interpretación del sistema de CC, en cuanto al rango y la variación (2). Además, las diferentes escalas de puntuación varían de 0 a 4.0 a 5.1 a 4.1 a 5 y de 1 a 9 (1). En Turquía, de manera similar al sistema utilizado en los Estados Unidos, el más común y probablemente más importante rango de calificación aplica una escala de 1 a 5, siendo 1 demacrado, 2 delgado, 3 promedio, 4 graso y finalmente 5 obeso (17). El último sistema fue aplicado luego a un método descrito anteriormente en otra parte (18) y se basa completamente en la evaluación visual, en tanto que el otro sistema de calificación de la condición corporal empleado en algunos países como el Reino Unido, Irlanda y Nueva Zelanda (4) involucra la palpación de partes específicas del cuerpo. Existe un consenso general con respecto a los beneficios de la CC, mientras que solo un pequeño porcentaje de las granjas (tan solo el 5%), adoptó y exploró la viabilidad de la estimación de la CC aprobada en los Estados Unidos. Así que hay que subrayar que la CC debe actualizarse para cada ganado, lo que incrementa el costo en la granja (5). La viabilidad de la interpretación de la CC a partir de imágenes digitales ha sido objeto de algunos estudios anteriores (1, 4). Debido a las discrepancias entre los estudios antes mencionados, este autor decidió realizar este trabajo. El interés del autor en este tema se despertó tras el conocimiento de la aplicación para teléfonos inteligentes BCS Cowdition de Bayer HealthCare Animal Health, diseñada para la simplificación y estandarización de la CC en vacas lecheras. Por consiguiente, el objetivo del presente trabajo fue comprender mejor y comparar los métodos de evaluación de la CC para vacas lecheras, es decir, la evaluación visual y los informes digitales. Por lo tanto, los resultados de este estudio podrían haber ayudado a los investigadores y a los consultores que tratan de estimar y comparar la CC presentada en otros estudios pertinentes.

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at 1st-4rd parity (mid-lactation), have made one or more birth, without any problems related to reproduction, raised at a private dairy farm located in Aydin, Turkey. Experimental design. The United States BCS (USBCS) system (1,18) is based completely upon visual estimation by use of a 1-5 scale with 0.25 intervals, as was also used by some researchers (4). After morning milking in farm, BCS data were collected from 16 January 2015 to 16 February 2015 (4 weeks).This BCS were assessed by two experienced researcher (involving the present author, having MS and PhD degrees in Department of Animal Science, Agricultural Faculty) while assessing BCS on visual observing, flowcharts developed by some authors was used (18). Comparatively and as a second method BCS Cowdition Smartphone Application was enhanced. BCS Cowdition is an innovative enhancement from Bayer Healthcare Animal Health’s. Assessor with detailed descriptive images of cows having different health conditions, and may be downloaded from the internet at available sources. The program is currently available also in English and Turkish. BCS Cowdition may be used to assess health condition, thus BCS for dairy cows. This innovative smart phone technology programme has a five-step BCS system, lasting after downloading of the cow’s photograph, and then was installed on to the smartphone. Afterwards the automated system assesses the BCS. Briefly, the application is based on Bayer Healthcare Animal Health Division’s established 5-step BCS system, allowing the investigator to measure BCS simply by taking photos of each cow individually (Figure 1). Statistical analysis. Data were analyzed performed by ANOVA using General Linear Model (GLM) procedure of SPSS 18.0 for Windows was used for statistical analysis of data (20). The significance of the differences between groups was compared by Duncan’s multiple range tests (21). The relationship between two methods was determined by using Pearson’s correlation analyses and the regression models were estimated by using linear regression analysis (20).

RESULTS In figure 2 the assessment of a cow was shown with BCS Cowdition system by assessor. Finally at step (5th step), the BCS value of cow was found as 3.25 by BCS Cowdition system. The descriptive statistics of BCS that was estimated according to BCS Cowdition and

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MATERIALES Y MÉTODOS Animales. Los datos para este estudio se obtuvieron de 50 vacas de raza Holstein-Frisona entre 1ª y 4ª paridad (lactancia media), con uno o más partos, sin ningún tipo de problemas relacionados con la reproducción, criadas en una granja lechera privada situada en Aydin, Turquía. Diseño experimental. El sistema CC de los Estados Unidos (USBCS) (1,18) se basa completamente en una valoración visual utilizando una escala de 1 a 5 con intervalos de 0.25, tal como ha sido utilizado por algunos investigadores (4). Después del ordeño de la mañana en la granja, se recolectaron los datos de CC desde el 16 de enero 2015 al 16 de febrero de 2015 (4 semanas). Estas CC fueron evaluadas por dos investigadores experimentados (incluyendo al autor de este artículo, que tiene una maestría y un doctorado de la Facultad de Agricultura, Departamento de Ciencia Animal), mientras que para la evaluación del grado de CC se utilizaron observaciones visuales y diagramas de flujo desarrollados por algunos autores (18). Comparativamente y como un segundo método, se mejoró la aplicación para teléfonos inteligentes BCS Cowdition. BCS Cowdition es una mejora innovadora de Bayer HealthCare Animal Health. El evaluador que tiene imágenes descriptivas detalladas de las vacas con diferentes condiciones de salud, se puede descargar de Internet de las fuentes disponibles. El programa está disponible actualmente en inglés y turco. La aplicación BCS Cowdition puede ser utilizada para evaluar el estado de salud y, por lo tanto, la CC de las vacas lecheras. Este programa tecnológico innovador para teléfonos inteligentes cuenta con un sistema de CC de cinco pasos después de descargar la fotografía de la vaca, y que luego se instala en el teléfono inteligente. Después, el sistema automatizado evalúa la CC. En pocas palabras, la aplicación se basa en el sistema de 5 pasos establecido por Bayer HealthCare Animal Health, que le permite al investigador medir la CC simplemente tomando fotos individuales de cada vaca (Figura 1). Análisis estadístico. Los datos obtenidos se analizaron con ANOVA (análisis de varianza) utilizando el procedimiento del Modelo Lineal Generalizado (MLG) del programa SPSS 18.0 (Statistical Package for the Social Sciences) para Windows que se utilizó en el análisis estadístico de los datos (20). Se comparó la significancia de las diferencias entre los grupos utilizando el método de rango múltiple de Duncan (21). La relación entre los dos métodos se determinó mediante el análisis de correlación de Pearson y los modelos de regresión se evaluaron utilizando el análisis de regresión lineal (20).

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Figure 1. The steps of BCS Cowdition system (19).

Figure 2. The assessment of a cow with BCS Cowdition.

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USBCS system were given in table 1. The overall means of BCS were found as 3.37±0.068 and 3.45±0.060 for BCS Cowdition and USBCS, respectively. The means of BCS for BCS Cowdition ranged from 3.16 to 3.54, while the means of BCS were ranged from 3.33 to 3.55 in USBCS system (Table 1). The effects of parity on BCS were found non-significant in two systems (p>0.05). The mean differences among BCS were determined 0.08 unit lower in BCS Cowdition than USBCS systems and this differences were found statistically non-significant (p>0.05). The positive correlation among BCS Cowdition and USBCS systems was found as 0.81 in evaluating body condition (p<0.01). The relationship among BCS Cowdition and USBCS systems was shown in figure 3. The positive linear relationship (p<0.001) was found between two systems (Figure 3). The regression equation for estimating COWDITION from USBCS was COWDITION=0.168+0.928* USBCS (R2=0.66). The equation for estimating USBCS from COWDITION was USBCS=1.042+0714*COWDITION (R2=0.66).

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RESULTADOS En la figura 2 se muestra la evaluación de una vaca con el sistema de evaluación BCS Cowdition. En el último paso (5º paso), el valor de CC de la vaca que se encontró por medio del sistema BCS Cowdition fue de 3.25. La estadística descriptiva para la CC estimada de acuerdo con los sistemas BCS Cowdition y USBCS se presenta en la tabla 1. La medias generales de CC que se encontraron fueron de 3.37±0.068 y 3.45±0.060 para BCS Condición y USBCS, respectivamente. Las medias de CC para BCS Cowdition oscilaron entre 3.16 y 3.54, mientras que las medias de CC estuvieron entre 3.33 y 3.55 en el sistema USBCS (Tabla 1). Se encontró que los efectos de la paridad sobre CC no son significativos en los dos sistemas (p>0.05). Se determinó que las diferencias medias entre CC eran 0,08 unidades menores en el sistema BCS Cowdition que en el USBCS y estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p>0.05). La correlación positiva entre los sistemas BCS Cowdition y USBCS fue de 0,81 en la medición de la condición corporal (p<0.01).

Table 1. Least square means and standard errors of BCS for two systems Parity

B C S Cowdition

USBCS

3.22 ± 0.176

3.37 ± 0.154

3.35 ± 0.100

3.40 ± 0.100

3.16 ± 0.151

3.33 ± 0.124

3.54 ± 0.898

3.55 ± 0.888

Overall

3.37 ± 0.068

3.45 ± 0.060

*: P< 0.05, **: P< 0.01, N.S.: Non-significant

DISCUSSION The overall means of BCS Cowdition and USBCS systems for BCS were found as 3.37±0.068 and 3.45±0.060, respectively. This result was found lower than from findings of Roche et al (22), the same as results of Berry et al (23) and higher from findings of some researchers (9,18,24-27). BCS become important at different lactation stage (Fresh cows, early lactation, mid-lactation, late lactation and dry period). BCS is generally approximately 3 (5-point scale) or 5 (9-point scale) in mid-lactation stage. If cows occur over-form throughout mid-lactation, BCS is become 3.5 to 4.0 (5-point scale) or 6.0 to 7.0 (9-point scale)(6). The results of this study are accordance with literature. Some researchers reported that BCS<2.5 and 4.0<BCS of cows is largely shown impairment

La relación entre los sistemas BCS Cowdition y USBCS se muestra en la figura 3. Se encontró una relación lineal positiva (p<0.001) entre los dos sistemas (Figura 3). La ecuación de regresión para la estimación de COWDITION de USBCS fue: COWDITION = 0.168 + 0.928* USBCS (R2=0.66). La ecuación para la estimación de USBCS de COWDITION fue: USBCS = 1.042 + 0.714* COWDITION (R2=0.66).

DISCUSIÓN Se encontró que las medias generales de los sistemas BCS Cowdition y USBCS para CC fueron de 3.37±0.068 y 3.45±0.060 respectivamente. Este resultado fue menor que el encontrado por Roche et al (22), igual a los resultados de Berry et al (23) y superior a los hallazgos de algunos investigadores (9,18,24-27).

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La CC se vuelve importante en las diferentes etapas de lactancia (vacas frescas, lactancia temprana, lactancia media, lactancia final y el período seco). Por lo general, la CC es de aproximadamente 3 (en la escala de 5 puntos) o de 5 (en la escala de 9 puntos) en la etapa de la lactancia media. Si las vacas tienen producción mayor durante la lactancia media, la CC alcanza un valor de 3.5 a 4.0 (en la escala de 5 puntos) o de 6.0 a 7.0 (en la escala de 9 puntos) (6). Los resultados de este estudio son consistentes con la bibliografía.

Figure 3. The relationship among methods.

of animal welfare (28). The alterations of BCS may originate from different causes. This may be briefly explained within a proper level of nutrition and a well-designed ration, as was also described previously other authors (29). Moreover, these changes are regard to alteration of body weight of cows and conversion of organism tissues in high productivity (12). In this study, the effect of parity on BCS was found statistically non-significant (p>0.05). Similarly, Edmonson et al (18) and Berry et al (25) recorded that parity did not affect BCS. The vast majority of the cows (58%) were evaluated for BCS at 2.5-3.25 points in this study, similarly to what have been described elsewhere (9). One author reported that most of the cows (42%) were situated for BCS at 3-4 points. In other study, Estonian Holstein cows were categorized as thin (28%, BCS≤3.0), moderate (46%, BCS 3.25–3.5) and fat (26%, BCS≥3.75) (30). Some researchers found that 5% of cows were evaluated BCS ≥ 6.0 points at calving and 23% of cows were assessed BCS ≤ 4.0 points. The Pearson correlation coefficient was found as 0.81 in the present study (p<0.01). In a prior study comparing two methods for assessing BCS of dairy cows Scotland, weekly BCS were collected for 3 months. Paired scores (n=2088) between the primary systems utilized in United Kingdom and USA, were moderately correlated (r=0.75, p<0.0001)(4). The positive linear relationship among two systems declared (R2 =0.66) in the present study is similar to Australian and New Zealand BCS systems (R2= 0.61) reported by Roche et al (2). This relationship between USBCS and UKBCS systems were found as

Algunos investigadores informaron que una CC<2.5 y 4.0<CC en las vacas demuestra en gran parte el deterioro del bienestar de los animales (28). Las alteraciones de la CC pueden tener su origen en diferentes causas. Lo anterior se puede explicar brevemente dentro de un nivel adecuado de nutrición y una ración bien diseñada, como lo describieron otros autores previamente (29). Además, estos cambios hacen referencia a la alteración del peso corporal de las vacas y a la conversión de los tejidos del organismo para una alta productividad (12). En este estudio, se encontró que el efecto de la paridad sobre la CC no era estadísticamente significativo (p>0.05). Del mismo modo, Edmondson y colaboradores (18) y Berry et al (25) registraron que la paridad no afectó la CC. La gran mayoría de las vacas (58%) fueron evaluadas en este estudio con una CC entre 2.5 y 3.25 puntos, de manera similar a lo descrito en otra parte (9). Un autor reportó que la mayor parte de las vacas (42%) estaban situadas con una CC entre 3 y 4 puntos. En otro estudio, las vacas Holstein Estonia se clasificaron como delgadas (28%, CC≤3.0), moderadas (46%, CC 3.25 a 3.50) y gordas (26%, CC≥3.75) (30). Algunos investigadores encontraron que el 5% de las vacas se evaluaron con una CC ≥ 6.0 puntos durante el parto y el 23% de ellas se evaluaron con una CC≤4.0 puntos. El coeficiente de correlación de Pearson que se encontró en el presente estudio fue de 0.81 (p<0.01). En un estudio previo realizado en Escocia se compararon los dos métodos de Evaluación del grado de CC de vacas lecheras, se evaluaron los valores de CC semanalmente durante tres meses. Las puntuaciones cotejadas (n=2088) entre el sistema primario utilizado en Reino Unido y en Estados Unidos se correlacionaron moderadamente (r=0.75, p<0.0001) (4). La relación lineal positiva entre los dos sistemas declarados (R2=0.66) en el presente estudio es similar a los sistema de CC de Australia y Nueva

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0.56 in another study (4). Also, Isensee et al (14) reported that the dBCS (dependent BCS) was able to explain the BFT (back fat thickness) better than iBCS (independent BCS) (R2 =0.67). In case of lacking detail, the interpretation of BCS system is not easy. Some researchers were based on photographs with insufficient assessment, and other relevant ones written in lengthy details. All aforementioned factors prevent repetition of the systems (18). New BCS systems should be improved for this reason. Hereby, BCS will be given of beneficial as importance clues in terms of animal health and management practices beneficial. Due to this reasons, widespread distribution of researches in relation to BCS may be used to help interpret results from scores obtained in terms of producer and dairy cattle industry. The positive linear relationship (p<0.001) was found between BCS Cowdition and USBCS systems (R2=0.66). The linear relationship between the latter assessment methods demonstrated that both usual and digital systems tended to scare cows similarly. This comparison represented progress within the understanding of the relationship between these two systems. Moreover, it may be suggested that BCS Cowdition Smartphone App. may be a good alternative for interpretation of BCS. In conclusion subjective BCS from the USBCS and Body Cowdition Smarthphone App. Systems, collected on the same cows in successive 4 weeks, were relatively congruent. Both BCS systems appear to measure body energy reserves in a similar manner, as was also the subject of a prior study assessing UKBCS and USBCS systems (4). Further studies involving more cow population and a larger scale possessing a larger investigation, probably applying this new tool to cows in 1st phase of lactation, and in relation to the corporal condition two weeks before the cow gives birth may be warranted.

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Zelanda (R2=0.61) reportados por Roche et al (2). Se encontró que esta relación entre los sistemas USBCS y UKBCS (CC en el Reino Unido) era de 0.56 en otro estudio (4). De mismo modo, Isensee et al (14) reportaron que la dCC (CC dependiente) puede explicar el BFT (espesor de grasa en la espalda) mejor que la iCC (CC independiente) (R2=0.67). A falta de información detallada, la interpretación del sistema de CC no resulta fácil. Algunos investigadores se basaron en fotografías con una evaluación insuficiente y otros en escritos relevantes muy detallados. Todos los factores mencionados anteriormente evitan la repetición de los sistemas (18). Por esta razón, se deben mejorar los nuevos sistemas CC. Es por esto que la CC será de beneficio como un indicio importante de la salud animal y del manejo usando prácticas beneficiosas. Por lo anterior, la distribución generalizada de investigaciones en relación con CC se puede utilizar para ayudar a interpretar los resultados de las puntuaciones obtenidas en términos del productor y de la industria del ganado lechero. Se encontró una relación lineal positiva (p<0.001) entre los sistemas BCS Cowdition y USBCS (R2=0.66). La relación lineal entre los últimos métodos de evaluación demostró que los dos sistemas, el habitual y el digital, tienden a calificar a las vacas de manera similar. Esta comparación representó un progreso en la comprensión de la relación entre estos dos sistemas. Se puede sugerir además que la aplicación para teléfonos inteligentes BCS Cowdition puede ser una buena alternativa para la interpretación de la CC. En conclusión, las CC subjetivas de los sistemas USBCS y de la aplicación para teléfonos inteligentes Cowdition, recolectadas para las mismas vacas durante 4 semanas sucesivas, fueron relativamente congruentes. Ambos sistemas de CC parecen medir las reservas de energía corporal de una manera similar, el cual fue tema de un estudio anterior evaluado por los sistemas UKCC y USBCS (4). Se justifica la realización de otros estudios en una investigación con un mayor alcance donde se incluya una población más grande y una escala mayor, aplicando probablemente esta nueva herramienta a las vacas en su primera etapa de la lactancia y en relación con la condición corporal, dos semanas antes de que la vaca dé a luz.

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5163-5176, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

The effect of Glycoline® on reproductive efficiency in high-producing dairy cows Efecto del Glycoline® sobre la eficiencia reproductiva en vacas lecheras de alta producción Marcelo Del Campo,1* Ph.D, Marco Gonzalez T,2 M.Sc, Hans Andresen,3 M.Sc, Freddy A. Cea,1 M.Sc. 1Universidad

Santo Tomás, Faculty of Natural Resources and Veterinary Medicine, Temuco, Chile. de Córdoba, Faculty of Veterinary and Zootechnical Medicine, Department of Livestock Sciences, Tropical Biology Research Institute, Montería, Colombia. 3Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Peru. *Correspondence: mrdelcampo@yahoo.es 2Universidad

Received: March 2015; Accepted: November 2015.

ABSTRACT Objective. Determine the effect of Glycoline® on reproductive efficiency in high producing dairy cows. Materials and methods. 100 Holstein cows one month before delivery were selected. About 21 days before parturition they were put in a barn and were randomized in two groups: Glycoline® Group (GG, n=50), 300 g/day of Glycoline® for 21 days antepartum and 250 g/day of GlycoLine® over the following 21 days postpartum, and the Control Group (CG, n=50) with the same feed and silage ration as GG during the same period, but without the addition of Glycoline®. Events and reproductive variables of the cows were recorded for 202 days. The data were systematized, analyzed and statistically compared. Results. Comparisons were made between GG and CG respectively: Retained placenta (0.0 vs. 12.0%; p=0.027), downer cow syndrome (14.3 vs. 44.0%; p=0.002), uterine involution (64.6 vs. 36.4%; p=0.019 ), uterine infection (10.4% vs. 35.5%; p=0.006), no ovarian activity (6.3 vs. 25.6%; p=0.018), follicular cysts (0.0 vs. 18.2%, p = 0.002), luteal structures (25.0 vs. 9.3% ; p=0.058), mean estrus presentation (40.1% vs. 63.5%; p=0.033) inseminated females (79.6 vs. 68.0%; p=0.017), pregnancy rate at day 150 (57.1 vs. 46.0%; p≥0.317 ) and intervals (days): calving to 1st estrus (39.8 vs. 63.2; p≤0.006), calving to IA (62.4 vs. 87.5; p≤0.006) calving to conception (81.7 vs. 93.6; p≤0.006; p=0.103). Conclusions. Results suggest that dietary Glycoline® added in the transition period improves reproductive efficiency of high-producing dairy cows. Key words: Nutritional supplements, reproductive health, reproductive performance, reproductive physiology, reproductive stages (Source: CAB).

RESUMEN Objetivos. Determinar el efecto del Glycoline® sobre la eficiencia reproductiva en vacas lecheras de alta producción. Materiales y Métodos. Se seleccionaron 100 vacas Holstein un mes antes del parto. Alrededor de 21 días antes del parto se ubicaron en un establo y se asignaron al azar a dos Grupos: Grupo Glycoline® (GG; n=50), 300 g/día de Glycoline® durante 21 días preparto y 250 g/día de Glycoline® durante los siguientes 21 días posparto y Grupo Control (GC, n=50) la misma ración de concentrado y ensilaje que el GG durante el mismo período de tiempo, pero sin la adición de Glycoline®. Se registraron los eventos y las variables reproductivas de las vacas durante 202 días. Los datos fueron sistematizados, analizados y comparados estadísticamente. Resultados. Comparaciones entre el GG y GC respectivamente: Retención de placenta (0,0 vs 12.0%; p=0.027), síndrome de vaca caída (14.3 vs 44.0%; p=0.002), involución uterina (64.6 vs 36.4%; p=0.019), infección uterina (10.4% vs 35.5%; p=0.006), sin actividad ovárica (6.3 vs 25.6%; p=0.018), quistes foliculares (0.0 5163

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vs 18.2%, p=0.002), estructuras luteales (25.0 vs 9.3%; p=0.058), promedio presentación de celo (40.1% vs 63.5%; p=0.033), hembras inseminadas (79.6 vs 68.0%; p=0.017), tasa de preñez al día 150 (57.1 vs 46.0%; p≥0.317) y intervalos de tiempo (días): parto 1er -celo (39.8 vs 63.2; p≤0.006), parto-IA (62.4 vs 87.5; p≤0.006) y parto-preñez (81.7 vs 93.6; p≤0.006; p=0.103). Conclusiones. Los resultados sugieren que el Glycoline® adicionado en la dieta en el período de transición, mejora la eficiencia reproductiva de vacas de alta producción. Palabras clave: Desempeño reproductivo, estados reproductivos fisiología reproductiva, salud reproductiva, suplementos nutricionales (Fuente: CAB).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Reproductive efficiency of cows can be assessed by taking into account different parameters. The producer would perhaps consider an efficient reproductive herd to be one in which each female produces a calf before 24-25 months of age and continues to produce a calf each year. However, to produce an annual calf per cow a series of coordinated physiological events must occur within the body of a cow (1).

La eficiencia reproductiva de una hembra bovina puede evaluarse tomando en consideración diferentes parámetros. Tal vez, para el productor tener un rebaño eficiente reproductivamente sería aquel en donde cada hembra produzca una cría antes de los 24-25 meses de edad y que continúe produciendo una cría cada año. Sin embargo, para producir una cría/vaca al año se requiere que sucedan una serie de eventos fisiológicos coordinados que deben ocurrir dentro del organismo de una hembra (1).

It is common knowledge that selecting cows for high milk production negatively influences reproductive efficiency. The negative effect attributed to high milk production on reproduction is related to a number of causes and factors that contribute to low fertility. Among these, some are due to the cow’s environment (management, untrained staff, size of herds, confinement etc.) and others depend on the cow itself (body condition, negative energy balance), increase dry matter intake, increased hepatic irrigation and steroid metabolism (1-3). However, in theory high producing cows should not have greater reproductive problems since they are prepared for this state. The causes that most affect cows occur during the critical transition period (three weeks antepartum and 3 weeks postpartum). In this period the pregnant cow is subject to increased requirements by the fetus, the stress of labor and later due to high milk production. Moreover, after delivery, milk production increases faster than food consumption, exposing cows to a negative energy balance (NEB). All these factors predispose cows to metabolic diseases (ketosis, hypocalcaemia, etc.) and infections (metritis, mastitis) luteal or follicular cysts or anestrus, among others (4). These negatively affect cows at any reproductive stage from conception to pregnancy. The condition of a “reproductively healthy cow” has been described as a cow that reduce the time of uterine involution with the concurrent early resumption of postpartum ovarian activity and

Es de conocimiento popular que la selección de vacas por alta producción de leche influencia negativamente la eficiencia reproductiva. El efecto negativo que se le atribuye a la alta producción de leche sobre la reproducción está relacionado con una serie de causas y factores, que estarían contribuyendo con su baja fertilidad. Entre estos, algunos ajenos a la hembra misma (manejo, personal no entrenado, tamaño de los rebaños, confinamiento etc.) y otros dependientes de ella (condición corporal, balance energético negativo), aumento de consumo de materia seca, aumento de la irrigación sanguínea hepática y del metabolismo esteroideo (1 - 3). Sin embargo, teóricamente las vacas de alta producción no deberían tener mayores problemas reproductivos, ya que están capacitadas para ello. Las causas que más afectan son aquellas que ocurren durante el período crítico de transición (3 semanas preparto y 3 posparto). En este período la vaca gestante se encuentra sometida a altos requerimientos demandados por el feto, por el estrés del parto y posteriormente por la alta producción de leche. Por otro lado, después del parto, es sabido que el consumo de alimentos aumenta más lentamente que la producción de leche, exponiendo a las vacas a un balance energético negativo (BEN). Todos estos factores predisponen las vacas a enfermedades metabólicas (cetosis, hipocalcemia, etc.) así como a infecciones (metritis, mastitis) quistes foliculares o luteales o anestro, entre otros (4). Los efectos de ello afectan negativamente en cualquiera etapa

Del Campo - The effect of Glycoline® on reproductive in dairy cow contribute to regulating the estrous cycle and ovulation (5). For this to happen, the cow’s body must adapt to dramatic metabolic and hormonal changes within very short periods of time. It is estimated that half of the reasons of culling dairy farms is due to an unbalanced diet, which ultimately results in high operating costs. In some countries cows calve 2.5 times or less during their reproductive lives and in many cases they are, on average, culled after the second parturition. Also, raising replacement heifers has a high value and it takes about 1.5 lactation periods to cover those costs (6). According to literature, Glycoline® is a glucogenic supplement, offered on the market as an anticetosic that is preferably added to the diet during the transition period. However, the indirect effect it would have on postpartum reproduction (fertility) has not been studied. Similar studies on other glucogenic products have been directed to elucidate their effect on milk production, hormone levels and some metabolic profiles. The aim of this study was to determine the effect of adding dietary Glycoline® during the transition period on the reproductive efficiency of high producing dairy cows.

MATERIALS AND METHODS Farm. The study was conducted on a dairy farm that kept an average 170±20 Holstein Friesian cows in annual production, free of tuberculosis and brucellosis, with an average annual milk production of 10.000±1.800Kg/cow. The herd had a prior history of metabolic diseases such as ketosis, hypocalcemia and hypomagnesaemia.

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reproductiva, desde la fecundación a la gestación. La condición de una vaca “reproductivamente saludable” ha sido descrita como una condición que favorece la disminución en el tiempo de la involución uterina con la concomitante reactivación ovárica temprana postparto y además contribuye con la regulación de los ciclos estrales y la ovulación (5). Para que esto suceda su organismo debe adaptarse a cambios metabólicos y hormonales dramáticos en periodos muy cortos de tiempo. Se estima que la mitad de las causas de eliminación de las vacas de una explotación lechera deriva de causas de una alimentación desbalanceada; lo que finalmente se traduce en mantener altos costos en la explotación. En algunos países las vacas paren 2.5 veces o menos durante su vida reproductiva y en muchos casos, son eliminadas en promedio al segundo parto. También es conocido que la crianza de vaquillas de reposición tiene un alto valor y que es necesario aproximadamente 1.5 períodos de lactancias para cubrir dichos costos (6). De acuerdo con la literatura, el Glycoline® es un suplemento glucogénico, que se ofrece en el mercado como anticetósico y que se adiciona, preferentemente a la dieta durante el período de transición. Sin embargo, el efecto indirecto que tendría en la reproducción (fertilidad) posparto de la vaca, no ha sido estudiado hasta la fecha. Estudios similares sobre otros glucogénicos, han sido dirigidos a dilucidar, más bien, el efecto que producen en la producción de leche, niveles hormonales y algunas constantes metabólicas. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto que produce la adición del Glycoline® en la dieta en el período de transición sobre la eficiencia reproductiva de vacas lecheras de alta producción.

Management and selection of animals. Cows were milked 2 or 3 times a day according to their individual production. Feed consisted of pasture ryegrass (Lollium anual) and a thoroughly mixed ration (TMR) feeding system. At the eighth month of gestation, cows that had a body condition between ≥2.5 and ≤4.0 (1-5 scale) and showed no physical disorder or disease were selected (Table 1).

MATERIALES Y MÉTODOS

Table 1. Distribution of cows according to parity.

Manejo y selección de animales. Las vacas eran ordeñadas 2 o 3 veces al día de acuerdo con su producción individual. La alimentación consistió en pasturas de Ballica (Lollium anual) y sistema de alimentación de Ración Totalmente Mezclada (TMR). Al octavo mes de gestación, las vacas que mantenían una condición corporal entre ≥2.5 y ≤4.0 (escala de 1-5) y no presentaban ningún trastorno físico o enfermedad, fueron seleccionadas para el estudio (Tabla 1).

Glycoline® Group

Control Group

Parity

No. (%)

1 2 3 4 5 9 Total

12 (24.5) 16 (32.7) 11 (22.4) 5 (10.2) 5 (10.2) 1 (2.0) 50

13 (26.0) 12 (24.0) 16 (32.0) 6 (12.0) 3 (6.0) 0 (0.0) 50

Explotación lechera. Se realizó en una lechería que mantenía un promedio 170±20 vacas Holstein Friesian en producción anual, libres de tuberculosis y brucelosis con un promedio anual de producción de leche de 10.000±1.800Kg/vaca. El hato, tenía antecedentes de presentación de enfermedades metabólicas, tales como cetosis, hipocalcemia e hipomagnesemia.

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The average calving for selected cows (2.5 births) was approximately the same for both groups. Treatment allocation. Before completing 21 days before delivery (280 days gestation) cows were located in a barn with optimum handling and comfort and were randomized into two groups: Glycoline® Group (GG, n=50), Glycoline® 300 g/day for 21 days prepartum, and Glycoline® 250 g/day for the next 21 days postpartum, and the Control Group (CG, n=50) received the same feed and silage as GG for the same period but without adding Glycoline®. The daily Glycoline® dose was mixed with grass silage, oat straw (2.5 kg) and feed (9.0 kg) in a mechanical mixer. Feed was distributed between 8:00 and 9.00 h and was based on the number of cows housed at that time. Cows were observed during the distribution of feed and for an additional 15 min in order to observe rejection or acceptance. Thirty-five to 40 days after calving the cows were examined clinically and genitally by the same veterinarian. All those that had no general health problems or genital infections and have ovarian activity were authorized to be inseminated after the waiting period (50 days). All reproductive events that occurred during the course of this study were recorded (from 30 days before calving). Reproductive data of each female were systematized. To confirm pregnancy, all cows were palpated rectally 40-45 days postinsemination (pIA) and again at 90 and 150 days. Cows that were not pregnant after 2 or 3 inseminations were examined and removed. The following events were determined and compared between groups. Prepartum. Feed consumption (subjective observation): 1= eager, ate eagerly and with pleasure 2= semi-eager, partially rejected 3= rejected, did not eat Parturition birth. Loss before during or immediately after delivery. 1= Abortions 2= Offspring deaths Calving difficulties and retained fetal membranes (RFM): 1= without difficulty, without or minimal assistance 2= with difficulty, moderate to major assistance 3= removal of the placenta with manual or/and pharmacological assistance.

2016

El promedio de pariciones de las vacas seleccionadas (2.5 partos) fue aproximadamente el mismo para ambos grupos. Asignación de tratamientos. Próximas a cumplir 21 días antes del parto (280 días de gestación) las vacas se ubicaron en un establo con condiciones óptimas de manejo y confort y se asignaron al azar a dos Grupos: Grupo Glycoline® (GG; n=50), 300 g/día de Glycoline® durante 21 días preparto y 250 g/día de Glycoline® durante los siguientes 21 días posparto y Grupo Control (GC, n=50) la misma ración de concentrado y silo que el GG , durante el mismo período de tiempo, pero sin la adición de Glycoline®. El Glycoline® fue mezclado diariamente con ensilaje de pasto y paja de avena (2.5 kg) y concentrado (9.0 kg) en un carro mezclador mecánico. La ración se distribuyó entre 8:00-9:00 am, y se calculó con base en el número de vacas estabuladas en ese momento. Las vacas fueron observadas durante la distribución de la ración y por 15 min posteriores con la finalidad de conocer el rechazo o aceptación de su consumo. Treinta y cinco a 40 días después del parto, las vacas fueron examinadas clínica y genitalmente por el mismo veterinario. Todas aquellas, que al examen no presentaron problemas de salud general, que estaban libres de infecciones genitales, y cuyos ovarios presentaban actividad, fueron autorizadas para ser inseminadas, después de periodo de espera voluntario (50 días posparto). Se registraron todos los eventos reproductivos que ocurrieron durante el transcurso del estudio (desde 30 días antes del parto). Los datos reproductivos de cada hembra fueron sistematizados. Para confirmar gestación, todas las vacas fueron palpadas rectalmente a los 40-45 días post-inseminación (pIA) y nuevamente a los 90 y 150 días (pIA). Las vacas que no se preñaron después de 2 o 3 inseminaciones fueron examinadas y eliminadas. Los siguientes eventos fueron determinados y comparados entre los grupos. Preparto. Consumo de la ración (apreciación subjetiva): 1= Ávido, se consume con rapidez y agrado 2= Semi ávido, se rechaza parcialmente 3= Rechazado, no se consume Parto. Pérdidas antes, durante o inmediatamente después del parto: 1= Abortos 2= Crías muertas

Del Campo - The effect of Glycoline® on reproductive in dairy cow Cows that retained the placenta ≥24h postpartum were considered to be RMF. Metabolic diseases: 1= presumed diagnosis, evident symptoms. 2= clinical diagnosis, paresis. Biochemical profiles were not conducted. Both diagnosis were analyzed together under “downer cow syndrome” Postpartum: The state of uterine involution was objectively assessed by rectal examination, on a scale from 1 to 3. 1 = Complete uterine involution: pelvic location, fits in the palm of the hand, or with a slightly greater volume, horns similar in size, without fluctuation, firm consistency and tone. Closed cervix.

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Dificultades en el parto y retención de las membranas fetales (RMF): 1= Sin dificultad, sin asistencia o ayuda mínima 2= Con dificultad, con moderada o considerable asistencia 3= Remoción de la placenta con asistencia manual o tratamiento farmacológico. Se consideró vacas con RMF aquellas que retuvieron la placenta ≥24h posparto. Enfermedades metabólicas: 1= Diagnóstico presunto, signos evidentes 2= Diagnóstico clínico, paresia No se realizaron perfiles bioquímicos de las vacas. Ambos diagnósticos se analizaron en conjunto bajo el concepto de “síndrome de vaca caída”. Posparto: El estado de la involución uterina fue evaluado subjetivamente, a través de examen rectal, utilizando una escala de 1 a 3.

2 = Partial uterine involution: abdominal or pelvic location, larger than a palm, horns different in size, palpable but with difficulty, no fluctuation, firm consistency, with moderate tone. Closed cervix.

1= útero involucionado: Ubicación pélvica, cabe en la palma de la mano, o con un volumen un poco mayor, cuernos similares en tamaño, sin fluctuación, consistencia firme y tono firme. Cérvix cerrado.

3 = lack of uterine involution: abdominal location, larger than the palm, horns different in size, not easily touched, with or without fluctuation, flaccid consistency and lacking tone. Cervix open or semi-open.

2= útero semi-involucionado: Ubicación abdominal o pélvica, volumen mayor que la palma de la mano, cuernos diferentes en tamaño, palpables con cierta dificultad, sin fluctuación, consistencia firme, con tono moderado. Cérvix cerrado.

Genital examination: 1= healthy 2= vaginitis 3= metritis a= endometritis level 1 b= endometritis level 2 c= pyometra

3= útero no involucionado: Ubicación abdominal, volumen mayor que la palma de la mano, cuernos diferentes en tamaño, no se pueden palpar y recorrer fácilmente, con o sin fluctuación, consistencia flácida y sin tono. Cérvix abierto o semiabierto.

Ovarian examination and pathologies: 1= Active, with follicles ≥10mm diameter, and/ or luteal structures: corpus hemorrhagic (CH) and corpora lutea (CL). 2= Non active, with no palpable structures 3= Cysts: follicular (FC) and luteal (LC) Postpartum estrus: They were recorded at fixed and cumulative periods of time (subjective division). Cows were observed 2 times a day (am/pm) by a single operator. Inseminated and pregnant cows: 1= Services per conception 2= Pregnancy rates during fixed and cumulative periods of time (subjective division).

Examen genital: 1= Sana 2= Vaginitis 3= Metritis a= Endometritis grado 1 b= Endometritis grado 2 c= Piometra Examen de ovarios y patologías: 1= Activos, con folículos ≥10mm de diámetro, y/o estructuras luteales: cuerpos hemorrágicos (CH) y cuerpos lúteos (CL). 2= No activos, sin estructuras palpables 3= Quistes: foliculares (QF) y luteales (QL) Celos posparto: Se registraron durante períodos fijos y acumulativos de tiempo (división subjetiva). Las vacas fueron observadas 2 veces al día (am/pm), por un sólo operador.

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Time intervals: 1= Birth, calving to first heat 2= Birth, calving to first service 3= Calving to conception (Open days)

Vacas inseminadas y gestantes: 1= Servicios por concepción 2= Porcentaje de preñez durante períodos fijos y acumulativos de tiempo (división subjetiva).

Statistical analysis. After compiling the data matrix, an exploratory analysis was conducted. Contingency tables were made to compare groups with their respective Chi squared (χ²) or Fischer Exact Test as necessary. To compare averages the Student t test and the MannWhitney U test were used for variables with and without normal distribution.

Lapsos de tiempo: 1= Parto-primer celo 2= Parto-primer servicio (IA) 3= Parto-concepción (Días abiertos)

RESULTS The total number of cows in each group was different according to the variables analyzed. The missing cows were not included for various reasons.

Análisis estadístico. Construida la matriz de datos se realizó un análisis exploratorio de estos. Para la comparación entre los grupos se realizaron tablas de contingencia con sus respectivos Chi cuadrado o Estadístico Exacto de Fischer según correspondía. Para la comparación de promedios se realizó, t de student y U Mann Withney, para las variables con y sin distribución normal.

RESULTADOS

Feed consumption. Mild rejection to consuming feed with Glycoline® was observed on the first day, but after the second day habits normalized and afterwards it was eagerly consumed.

El número total de vacas de cada grupo fue diferente de acuerdo con la variable analizada. Las vacas faltantes no fueron incluidas por diferentes razones.

Abortions and offspring deaths. In both groups abortions took place in the ninth month of pregnancy and deaths occurred during delivery or immediately afterwards. There was no difference between the groups (p=0.487; Table 2). The female: male ratio was no different within or between groups (GG, 1:1 and CG, 1:0.7).

Consumo de la ración. Se observó un leve rechazo a consumir la ración con Glycoline® el primer día, pero a partir del segundo día se normalizó y posteriormente fue consumida con avidez.

Table 2. Number (%) of abortions, offspring deaths and retention of fetal membranes in the Glycoline® and Control groups. Offspring

Glycoline® n=49

Control n=50

Live births

46 (93.9)

44 (88.0)

Abortions

(2.0)

(4.0)

Mortalities

(4.1)

(8.0)

Parturition difficulties and retained fetal membranes. Only 5.0% of the cows of both groups needed minimal assistance during labor and only 1 (2.0%) cow in the CG required major assistance. No GG cow had RMF although 6 (12.0%) of the CG cows did (p=0.027), need manual or/and pharmacological assistance. Presence of metabolic diseases. Downer cow syndrome. The number of cows that had some kind of paresis was 6.1% (3/49) for the GG and 16% (8/50) for the control group (p=0.200). Additionally, 8.2% (4/49) GG cows and 28.0% (14/50) of CG were treated for paresis. Considering both, a highly significant

Abortos y crías muertas. En ambos grupos los abortos ocurrieron en el noveno mes de gestación y las muertes de las crías durante el parto o inmediatamente después. No hubo diferencia entre los grupos (p=0.487; Tabla 2). La proporción hembra:macho no fue diferente dentro ni entre los grupos (GG, 1:1 y GC, 1:0.7). Dificultad en el parto y membranas fetales retenidas. Solo un 5.0% de las vacas de ambos grupos, necesitaron minina ayuda durante el parto y solo 1 (2.0%) vaca del GC requirió considerable asistencia. Ninguna vaca del GG tuvo RMF, sin embargo 6 (12.0%) vacas del GC si la presentaron (p=0.027) y necesitó asistencia manual y farmacológica. Presentación de enfermedades metabólicas. Síndrome de vaca caída. El número de vacas que presentaron algún tipo de paresia fue de 6.1% (3/49) para el GG y de 16% (8/50) para el GC (p=0.200). Además, 8.2% (4/49) vacas del GG y el 28.0% (14/50) del GC fueron tratadas por paresia. Tomando en consideración ambas presentaciones, se observó una diferencia entre los grupos (GG, 14.3%; 7/49 y GC, 44.0%; 22/50) altamente significativa (p=0.002).

Del Campo - The effect of Glycoline® on reproductive in dairy cow

5169

(p=0.002) difference between the groups (GG, 14.3%; 7/49 and CG, 44.0%, 22/50) was observed.

Involución uterina. El estado de involución del útero de acuerdo a la palpación rectal, entre los días 35-45 pos parto se indica en la tabla 3.

Uterine involution. Uterine involution according to rectal palpation 35-45 days postpartum (Table 3).

Condiciones genitales. Todas las hembras, que presentaron una infección del tracto reproductivo, antes del examen posparto o al momento del examen, fueron tratadas (Tabla 4).

Table 3. Distribution of the number (%) of cows in the Glycoline® and Control group according to uterine involution 35-45 days after birth. Uterus involution

Glycoline® (n=48)

Control (n=44)

Complete

31 (64.6)

16 (36.4)

Partial

14 (29.2)

20 (44.5)

Lack

(6.3)

8 (18.2)

* Highly significant between the two groups (p=0.019)

Genital conditions. All females who had reproductive tract infections before the postpartum examination or at the time of the examination were treated (Table 4). Table 4. Distribution of the number (%) of cows in the Glycoline® and Control group according to the diagnosis of the genital tract condition 1-40 days postpartum. Genital examination

Glycoline® n=48

Control n=45

Healthy

43 (89.6)

29 (64.4)

Vaginitis

(2.1)

Endometritis 1

(2.1)

5 (11.1)

Endometritis 2

(6.3)

7 (15.6)

Pyometra

(0.0)

(6.7)

(2.2)

*Highly significant between the two groups (p=0.006).

Ovarian pathologies. No LC were diagnosed in any of the cows in both groups and no FC were found in GG cows; however, 18.2% (8/44) of CG cows presented FC (p=0.002; Table 5). Table 5. Distribution of the number of cows (%) in the Glycoline® and Control group according to ovarian activity (follicles, CH, CL), in the postpartum exam. Ovaries

Glycoline® n=48

Control n=44

Actives

45 (93.8)

33 (62.2)

With luteal structures Inactive

12 3

(25.0)a (6.3)c

(9.1)b

11 (25.6)d

*Percentages between groups (columns) with different superscript are different; ab (p=0.058), cd (p=0.018).

Postpartum estrus. The total number of cows in estrus (1-202 days) tended to be different between groups (GG, 91.8%; 45/49 and CG 76.0%; 38/50, p=0.091). Looked at from

Patologías ováricas. No se diagnosticaron QL en ninguna de las vacas de ambos grupos ni tampoco se presentaron QF en las vacas del GG, sin embargo el 18.2% (8/44) de las vacas del GC presentó QF (p=0.002; Tabla 5). Celo posparto. El número total de vacas que presentó celo (1-202 días) tendió ser diferente entre los grupos (GG, 91.8%; 45/49 y GC 76.0%; 38/50, p=0.091). Mirado desde otro punto, el 8.2% (4/49) de las vacas del GG y el 24.0% (12/50) del GC no presentaron signos externos de celo. El promedio de días de presentación de celos fue diferente entre el GG (40.1±25.7; rango: 7-145; IC: 32.5-47.7) y el GC (63.5±44.9; rango: 11-202 IC: 48.5-78.4; p=0.033, Tabla 6). Vacas inseminadas. El número de vacas inseminadas fue diferente entre ambos grupos (GG, 79.6%; 39/49 y GC, 68.0%; 34/50, p=0.0176). En consecuencia, el número de vacas no inseminadas fue de 10 (20.4%; 4 que presentaron celo y 6 que no presentaron) del GG y 16 (32.0%; 4 que presentaron celo y 12 que no presentaron) del GC. Servicios por concepción. Los servicios por concepción no fueron diferentes entre el GG (2.4) y GC (2.3). Tasa de preñez. No hubo diferencias en la tasa de preñez al día 150, tomando en consideración el total de vacas, entre el GG (57.1%; 28/49) y el GC (46.0%; 23/50; p≥0.317), ni tampoco tomando en consideración solamente, el número de vacas inseminadas entre el GG (71.8%; 28/39) y el GC (67.6% 23/34; p=1.00, Tabla 7). Intervalos de tiempo entre parto-primer celo, parto-primera inseminación y parto-preñez. Estos intervalos de tiempo fueron analizados retrospectivamente una vez finalizado la colección de todos los datos de ambos grupos (Tabla 8).

DISCUSIÓN Una vaca del GG fue eliminada tempranamente por fallecimiento. Asimismo, el número total de vacas, varió en cada grupo, a medida que avanzaba el tiempo debido a que algunas fueron eliminadas por diferentes razones (ver texto), durante el transcurso

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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 21(1) Enero - Abril

another point of view, 8.2% (4/49) of the GG cows and 24.0% (12/50) of CG cows showed no external signs of heat. The average time (days) of estrus presentations were different between the GG (40.1±25.7; range: 7-145; IC: 32.5-47.7) and CG (63.5±44.9; range: 11-202 IC: 48.5-78.4; p=0.033, Table 6). Table 6. Distribution of the number (%) of cows in the Glycoline® and Control group according to the interval of time from calving to first estrus in fixed and cumulative periods. First estrus (days)

Glycoline® (n=45)

Cumulative

Table 7. Distribution of the number (%) of pregnant cows in the Glycoline® and Control group in relation to the total number of inseminated cows in fixed and cumulative time periods. Pregnancy (days)

Glycoline® (n=39) Fixed Accumulative

Fixed Control

(n=34) Accumulative

≤ 60

7 (17.9)

3 (8.8)

61-70

9 (23.1)

16 (41.0)

3 (8.8)

6 (17.6)

(8.8)

71-100

7 (17.9)

23 (59.0)

8 (23.5)

14 (41.2)

101-295

5 (12.8)

28 (71.8)

9 (26.5)

23 (67.6)

Table 8. Time intervals (days) between calving to first heat, calving to first insemination and calving to conception of cows in the Glycoline® and Control groups.

≤18

7 (15.6)

6 (15.8)

(15.8)

19-24

5 (11.1)

(26.7)

(18.4)

25-37

13 (28.9)

(55.6)

6 (15.8)

13 (34.2)

Intervals (days)

Glycoline®

38-46

(17.8)

(73.3)

5 (13.2)

18 (47.4)

Calving/First heat

(n=45)

(n=38)

47-60

(17.8)

(91.1)

20 (52.6)

61-145

(8.9)

39.8±25.9a 7-145 32.1-47.6

63.2±44.3b 11-202 48.6-77.7

(n=39) 62.4±11.2c 36-86 58.8-66.0

(n=34) 87.5±40.0d 44-205 73.3-101.7 (n=34) 93.6±32.7* 52-170 79.4-107.7

146-202

(15.6)

Control (n=38)

2016

45 (100.0)

(2.6)

(5.3)

16 (42.1) 2

(5.3)

36 (94.7) 38 (100.0)

Inseminated cows. The number of inseminated cows was different between groups (GG, 79.6%; 39/49 and CG, 68.0%; 34/50, p=0.0176). Consequently, the number of cows that were not inseminated was 10 (20.4%, 4 that presented estrus 6 that did not) and GG 16 (32.0%, 4 presented estrus and 12 that did not) from the CG. Conception services. Conception rates were not different between the GG (2.4) and CG (2.3). Pregnancy rate. There was no difference, either in pregnancy rate at day 150, taking into account the total number of cows in the GG (57.1%; 28/49) and CG (46.0%; 23/50; p≥0.317) and only the number of cows inseminated between the GG (71.8%; 28/39) and CG (23/33 69.7%; p=1.00, Table 7). Time intervals between calving to first heat, calving to first insemination and calving to pregnancy. These time intervals were analyzed retrospectively once all data were collected from both groups (Table 8).

DISCUSSION A cow from the GG was eliminated early due to death. Also, the total number of cows in each group varied as time went on because some were culled for various reasons (see text). In order to not delay the breeding program of the farm, all cattle that had any problems during the course of the study received special attention and specific treatments were applied according to the diagnosis.

Average±DE Range CI Calving/First IA Average±DE Range CI Calving/CONCEPTION Average±DE Range CI

(n=28) 81.7±32.2* 50-194 69.2-94.1

Control

Percentages between groups (columns) with different superscripts are highly significant (p≤0.006), *(p=0.103). abcd

del estudio. Con el fin de no atrasar el programa reproductivo de la explotación, todas las vacas que presentaron algún problema reproductivo durante el transcurso del estudio, recibieron atención especial y se le aplicó el tratamiento específico de acuerdo con el diagnóstico. Consumo de la ración. Las vacas que consumieron Glycoline®, manifestaron un leve rechazo al consumo el primer día. Como el consumo se normalizó a partir de segundo día, esta observación fue suspendida y se consideró similar al grupo control. Abortos y crías muertas. En el GG hubo 1 aborto (2.0%) y 2 crías muertas (4.1%); en cambio en el GC, se registraron 2 abortos (4.0%) y 4 crías muertas (8.0%; Tabla 2). A pesar que las pérdidas en conjunto (aborto y crías muertas) fueron el doble en el GC (12.0%; 6/50) que las ocurridas en el GG (6.1%; 3/49), no se encontraron diferencias (p=0.487). Este porcentaje de pérdidas está dentro del rango indicado por otros autores (6.0-8.0%) para el GG pero no así para el GC las que en comparación fueron más altas (7). Para ambos grupos, los abortos se presentaron en el noveno mes de gestación y las muertes de las crías ocurrieron durante el parto o inmediatamente

Del Campo - The effect of Glycoline® on reproductive in dairy cow Feed intake. Cows consuming Glycoline ® slightly rejected feed on the first day. Feeding was normalized after the second day so this observation was suspended and was considered eager and similar to CG. Abortions and offspring deaths. In GG there was 1 abortion (2.0%) and 2 dead calves (4.1%); but in the CG there were 2 abortions (4.0%) and 4 deaths (8.0%; Table 2). Despite overall losses (abortion and deaths) were twice in the CG (12.0%; 6/50) than in the GG (6.1%; 3/49), no differences were found (p=0.487). This rate of loss is within the range indicated by other authors (6.0-8.0%) for the GG but not for the CG, which were comparatively higher (7). In both groups, abortions occurred in the ninth month of pregnancy and deaths occurred during or immediately after birth. The causes of the abortions were not attributed to reproductive diseases. Calving difficulties and retained fetal membranes. It is interesting that no cow in the GG needed obstetric intervention during calving. They did not need manual or pharmacological medical treatment to remove the placenta. All cows in this group had placentas that came out without difficulty and were quickly expelled in less than 3 hours. In contrast, only 1 cow in the CG (2.0%) required minimum obstetric aid, while 12.0% (6/50) required manual intervention and pharmacological treatment (p=0.027). This percentage is within what other authors having reported, indicating that RMF occurs in the range of 3.8-15.0% of dairy cows (8). It has been observed that RMF is a predisposing factor in metritis development and that postpartum metritis in cows with RMF has a negative effect on their subsequent reproductive efficiency (1,8,9). In this case, 50% (3/6) of cows from the CG that had RMF later developed metritis and this obviously delayed its return to the farm’s breeding program. Presentation of metabolic diseases. Independent of what group they were in, all cows that showed apparent signs (presumptive, clinical or subclinical diagnosis) of metabolic disease were treated with one or more commercial compounds based on Ca, Mg, P and vitamins or with a neoglucogenic product. Glycoline® is routinely used to prevent ketosis. In this case, the number of cows that had fallen cow syndrome was 3 times higher in the CG than in the GG (22 vs. 7 cows respectively, p=0.002). The direct preventative effect of Glycoline® on “downer cow syndrome” had an indirect positive effect on the

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después. Las causas de los abortos no se atribuyeron a enfermedades de la reproducción. Dificultad en el parto y membranas fetales retenidas. Es interesante mencionar que ninguna vaca del GG necesitó intervención obstétrica en el parto. Tampoco se necesitó ayuda manual o medicamentosa para la extracción de la placenta. En todas las vacas de este grupo la placenta se desprendió sin dificultad y fue expulsada rápidamente dentro de un período no mayor de 3 horas. En cambio, en las vacas del GC 1 (2,0%) vaca necesitó de ayuda obstétrica y el 12.0% (6/50) necesitó de intervención manual y medicamentosa para eliminar la placenta (p=0.027). Este porcentaje está dentro de los reportados por otros autores que han indicado que la RMF ocurre en el rango de 3.815.0% de las vacas de lechería (8). Se ha observado que la RMF es un factor predisponente para el desarrollo de metritis y que la incidencia de las metritis postparto en vacas con RMF tiene un efecto negativo en la eficiencia reproductiva posterior en la vaca (1,8,9). En este caso, el 50% (3/6) de vacas del GC que presentaron RMF desarrollaron metritis posteriormente y esto, obviamente, atrasó su vuelta al programa de reproducción del hato. Presentación de enfermedades metabólicas. Independiente del grupo, todas las vacas que presentaron signos aparentes (diagnóstico presuntivo, subclínicos o clínicos) de enfermedad metabólica, fueron tratadas con uno o más compuestos comerciales con base en Ca, Mg, P y vitaminas o con un producto neoglucogénico. Como se indicó, el Glycoline® rutinariamente se usa como dieta para prevenir la cetosis. En este caso el número de vacas que presentó síndrome de vaca caída fue 3 veces mayor en el GC que en el GG (22 vs 7 vacas respectivamente, p=0.002). El efecto directo del Glycoline® sobre la prevención de presentación de síndrome de vaca caída tuvo un efecto positivo indirecto sobre la fertilidad de las vacas que lo recibieron. Involución uterina. A pesar de ser una apreciación subjetiva a través del examen rectal, este parámetro, es relevante, debido a que indirectamente influencia otras variables reproductivas, como son la presentación del primer celo postparto, los días abiertos etc. Sin duda, la involución uterina retardada predispone además la presentación de metritis. El tiempo de involución uterina en la vaca, como es sabido es variable y oscila entre 25 a 45 días. El que se produzca sin interrupción y en un tiempo razonable traerá consigo un efecto positivo en otros índices reproductivos, como son la presencia de celo más temprano, una tasa de gestación y preñez más alta, por mencionar algunos.

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fertility of the cows that were treated with it. Uterine involution. Despite being a subjective assessment through rectal exams, this parameter is important because it indirectly influences other reproductive variables, such as presentation of first postpartum heat, open days, etc. Certainly, delayed uterine involution further predisposes the presentation of metritis. The time of uterine involution in cows is variable and ranges from 2545 days. When it occurs without interruption and within a reasonable time it has positive effects on other reproductive indices such as earlier estrus and a higher pregnancy rate, among others. Considering combined uterine involution (total and partial), we observed that 93.8% (45/48) of the GG cows showed different degrees of uterine involution (Table 3). Of these 68.9% (31/45) had complete uterine involution and 31.1% (14/45) had partial involution In contrast, 80.0% (36/45) of CG cows showed some degree of uterine involution. Of these cows 44.4% (16/36) had complete uterine involution and 63.9% (20/36) partial (p=0.019) involution. This indicates that Glycoline® had an effect on uterine involution, which had a positive impact on the other variables studied. As indicated, uterine involution and follicular development are interrelated parameters that are involved in the rapid production recovery (10). Genital affections. Cows that had some type of reproductive tract infection before or during postpartum examination were grouped together for data analysis. It was observed that the percentage of cows that had metritis in the GG (10.4%; 5/48), was the 1/3 of those that had it in the CG (35.6%; 16/45; p=0.006). It has been indicated that 20% of dairy cows develop metritis within 21 days postpartum (9) which is twice that observed in the GG and 15% less than the CG. Examination of ovaries, activity and pathologies. The number of cows that had postpartum anestrus was four times lower in GG (6.3%) than in the CG (25.0%; p = 0.019). This clearly indicates the positive effect of Glycoline® on cows fed with it. Considering just the total number of cows with ovarian activity, it can be seen that more than double the GG cows (26.7%; 12/45) had luteal structures compared to CG cows (12.1%; 4/33). However, this difference was greater when the total number of each group was taking, reaching a difference of almost 3 times (25.0% vs. 9.3%, p=0.056 respectively). It can therefore be inferred that Glycoline® had an early indirect effect on recovery of ovarian

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Tomando en consideración la involución uterina en conjunto (total y parcial), se observó que el 93.8% (45/48) de las vacas del GG presentaron diferentes grados de involución uterina (Tabla 3). De estas vacas el 68.9% (31/45) presentaron involución uterina completa y el 31.1% (14/45) parcial. En cambio, el 80.0% (36/45) de las vacas del GC presentaron algún grado de involución uterina. De estas vacas el 44.4% (16/36) presentaron involución uterina completa y el 63.9% (20/36) parcial (p=0.019). Esto indica que el Glycoline® tuvo un efecto sobre la involución del útero, lo cual repercutió positivamente en las otras variables estudiadas. Como se indicó, la involución uterina y el desarrollo folicular son dos parámetros interrelacionados que están involucrados en la rápida recuperación de la producción (10). Afecciones genitales. Las vacas que presentaron algún tipo de afección del tracto reproductivo antes del examen post parto o al examen post parto, fueron consideradas en conjunto para el análisis de estos datos. Se observa que el porcentaje de vacas que presentaron metritis en el GG (10.4%; 5/48), fue un tercio de las que presentaron en el GC (35.6%; 16/45; p=0.006). Se ha indicado que un 20% de las vacas de lechería desarrollan metritis dentro de los 21 días postparto (9), este porcentaje es el doble del que se observa en el GG y un 15% menos que el GC. Examen de ovarios, actividad y patologías. El número de vacas que presentaron anestro posparto fue cuatro veces menor en el GG (6.3%) que en el GC (25.0%; p=0.019). Esto indica claramente el efecto positivo que tuvo el Glycoline® en el grupo de hembras que lo consumieron. Considerando solamente, el total de las vacas con actividad ovárica, se puede apreciar que más del doble de las vacas GG (26.7%; 12/45) presentaron estructuras luteales en comparación con el GC 12.1%; 4/33). Sin embargo, está diferencia fue mayor, si se toma la totalidad de las vacas de cada grupo alcanzando una diferencia de casi 3 veces (25.0% vs 9.3%, respectivamente p=0.056). Se puede inferir entonces que el Glycoline®, tuvo un efecto temprano indirecto en las recuperación de la ciclicidad ovárica, debido probablemente a la más pronta recuperación del eje somatotrófico como ha sido mencionado por otros autores (11, 12). En el GG hubo una vaca que presentó 2 CL y otra de 3 CL mientras que en el GC solo se encontraron vacas con un CL. Se ha indicado que la múltiple ovulación se podría deber al efecto de la alta producción de leche (3). Asimismo, en los últimos años se ha observado un porcentaje más alto

Del Campo - The effect of Glycoline® on reproductive in dairy cow cyclicity, probably due to the more rapid recovery of the somatotropic axis, as has been mentioned by other authors (11, 12). In the GG there was a cow that had 2 CL and another one had 3 CL while in the CG only cows with 1 CL were found. Multiple ovulation could be due to elevated milk production (3). Also, in recent years there has been a higher percentage of twins in Holstein cows. It has been hypothesized that high-producing cows have an increased intake of dry matter and therefore have a greater flow of blood to the intestines and liver, which would result in an increased amount of estrogen produced by the dominant follicle, which would alter the feedback (FSH) causing an increase of it, which would facilitate the development, maturation and ovulation of other follicles (8). Other authors have suggested that a glycogenic diet given in early postpartum would improve follicular development and resumption of the ovarian cycle, but for this to not have a detrimental effect on the embryonic survival rate it should be accompanied by a lypogenic diet given during the reproductive season in order to increase fatty acids, which improve the quality of oocytes and embryo development (13). Glycoline® also had an effect in reducing the formation of ovarian cysts, as no FC and LC were diagnosed in GG cows. Nor was LC diagnosed in any of the CG cows. However, 18.2% (8/44) of the cows from this group had FC (p=0.002). Out of 8 cows treated with hormone therapy, 7 were in estrus and inseminated, which left 3 pregnant and 1 that did not present estrus (Table 5). External signs of first postpartum estrus. Of the 4 cows that showed no estrus in the GG, 2 were diagnosed with downer cow syndrome, 1 had a substantial drop in milk production and the other had a sagging udder. Also, of the 12 cows that did not have estrus in the CG, 4 had downer cow syndrome and 1 had pyometra, 1 had metritis and hoof problems, 1 retained fetal membrane, 1 had follicular cysts, 3 had mastitis, 1 had a sharp decrease in milk production. These factors negatively influenced the presentation of estrus. As noted, until day 60 (10 days after more the voluntary waiting period), 91.1% (41/45) of the GG cows were in estrus, compared to 52.6% (20/38) of the CG (Table 6). That is, only 4 (8.9%) cows of the total missing show estrus in the GG, unlike 18 (47.4%) missing it in the CG. In this regard, it has been indicated that between 15 and 20% of dairy cows are non-cycling before 70 days postpartum; this percentage contrasts with the findings in the CG. Also, in the GG a relatively

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de mellizos en vacas Holstein. Al respecto se ha hipotetizado que las vacas de alta producción aumentan el consumo de materia seca y por ende existe una mayor flujo de sangre en el intestino e hígado lo que traería un aumento del metabolismo del estradiol producido por el folículo dominante, lo que alteraría la retroalimentación de la (FSH) produciendo un aumento de esta, lo que facilitaría el desarrollo, maduración y ovulación de otros folículos (8). Otros autores han sugerido que una dieta glucogénica ofrecida en el posparto temprano favorecería el desarrollo folicular y la reanudación del ciclo ovárico, pero para que esta no tenga un efecto perjudicial en la tasa de sobrevivencia embrionaria debería ser acompañada con una dieta lipogénica dada durante la estación de servicios para aumentar la de ácidos grasos los cuales beneficiarían la calidad de los ovocitos y el desarrollo embrionario (13). El Glycoline®, tuvo también, un efecto en la disminución en la formación de quistes ováricos ya que, no se diagnosticaron QL ni QF en las vacas del GG. Tampoco se diagnosticaron QL en ninguna de las vacas del GC. Sin embargo el 18.2% (8/44) de las vacas de este grupo presentaron QF (p=0.002). De 8 vacas que fueron tratadas con una terapia hormonal, 7 presentaron celo y fueron inseminadas, quedando 3 preñadas y 1 no presentó celo (Tabla 5). Manifestaciones externas del primer celo posparto. De las 4 vacas que no manifestaron celo del GG, 2 fueron diagnosticadas con síndrome de vaca caída, 1 tuvo una baja sustancial en la producción de leche y la otra presentó su ubre descolgada. Asimismo, de las 12 vacas que no presentaron celo en el GC, 4 presentaron síndrome de vaca caída, 1 piometra, 1 metritis y problemas pódales, 1 retención de membranas fetales, 1 con quiste folicular, 3 con mastitis y 1 bajó la producción de leche bruscamente. Estos factores influenciaron negativamente la presentación de signos de celo. Como se observa, hasta el día 60 (pasado 10 días del período de espera voluntario), el 91.1% (41/45) de las vacas del GG habían presentado celo en comparación al 52.6% (20/38) del GC (Tabla 6). Es decir, 4 (8,9%) vacas restaban del total que presentaron celo en el GG a diferencia del GC donde 18 (47.4%) vacas no lo habían presentado. Al respecto se ha indicado que entre el 15 y 20% de las vacas lecheras no ciclan antes de los 70 días después del parto, este porcentaje contrasta con lo encontrado en el GC. También, en el GG se observa una distribución, relativamente más uniforme de los celos durante los períodos elegidos, que la distribución del GC. Sin duda este hecho indica un retraso obvio en la reproducción de este último grupo y afectó indirectamente otras variables (IA, lapsos de tiempo).

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uniform distribution of estrus is seen during the periods chosen than the distribution of CG. This indicates an obvious delay in reproduction of the latter group, which indirectly affected other variables (IA, time periods). Showing estrus and efficiency in estrus detection are crucial factors for AI to occur at the appropriate time in relation to ovulation. With decreased estrus expression and the ability to detect it, it is difficult to perform AI at the right time. External presentation of signs of estrus indirectly impact in a positive way on other reproductive parameters, such as: the interval from calving to first AI, calving-conception etc., making reproduction more efficient and ultimately lowering operating costs (14). Inseminated cows. The total number of inseminated cows was higher in the GG (79.6%, 39/49) than in the CG (68.0%, 34/50; p=0.0176). Of 10 cows that were not inseminated in the GG; 4 showed no estrus, as indicated above, and the remaining 6 that showed estrus were not inseminated due to different problems (2 had late anestrus, 1 had mastitis, 3 had downer cow syndrome) and were subsequently eliminated. In contrast, the number of cows in the CG that were not inseminated reached 32.0% (16/50), 12 did not show estrus and were eliminated and 4 showed signs of estrus but were not inseminated due to different causes (3 had downer cow syndrome, 1 retained fetal membranes and one had severe mastitis). Calving to first estrus. In a study conducted in Japan (7) where 38 high production Holstein cows were used, results showed that, the first postpartum estrus was at 64.4±55.9 days (range 18-149 days), similar to that found in this study in the CG (63.2±44.3, range 11-202 days), and greater than the GG (39.8±25.9 range: 7-145 days, p=0.006). In the GG, cows were in estrus within a shorter period of time and in greater numbers than in the CG. Calving to first AI. Those same Japanese authors (7) indicated that the time span from calving to first IA was 90.6±22.1 (minimum 57, maximum 129); period that was similar to that found for the CG (87.5±40.0), but higher than the GG (62.4±11.2; p=0.001). Open days. The time difference in open days tended to be different between the GG (81.7±32.2) and CG (93.6±32.7, p=0.103). Both periods were lower than those reported by Japanese authors (7) who reported times of 151.3±55.8 and ranges from 66-270. In summary, this was observed in each analyzed

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La expresión de celo y la eficiencia en la detección de celo son factores cruciales para que la IA ocurra en el tiempo apropiado, con relación a la ovulación. Con la expresión disminuida de celo y la habilidad de detectarlo, se dificulta realizar una IA en el tiempo correcto. La presentación externa de signos de celo repercute en forma indirecta positivamente en otros parámetros reproductivos, como son: el intervalo parto-primera IA, intervalo parto-concepción etc., haciendo más eficiente la reproducción y disminuyendo finalmente los costos de la explotación (14). Vacas inseminadas. El número total de vacas inseminadas fue mayor en el GG (79.6%, 39/49) que en el GC (68.0%, 34/50; p=0.0176). De 10 vacas no inseminadas del GG; 4 no presentaron celo, como se indicó anteriormente, y las 6 restantes que manifestaron celo no fueron inseminadas por presentar diferentes problemas (2 anestro tardío, 1 mastitis, 3 síndrome de vaca caída), y posteriormente fueron eliminadas. En contraste, el número de vacas no inseminadas del GC alcanzó el 32.0% (16/50), 12 que no presentaron celo y fueron eliminadas y 4 que manifestaron signos de celo, pero no fueron inseminadas por diferentes causas (3 síndrome de vaca caída, 1 retención de membranas fetales y 1 mastitis grave). Intervalo parto-primer celo. En un trabajo realizado en Japón (7) en donde se emplearon 38 vacas Holstein de alta producción, mostró que el primer celo postparto fue a los 64.4±55.9 días (rango: 18-149 días), similar al encontrado en este trabajo en el GC (63.2±44.3; rango: 11-202 días) y mayor que el GG (39.8±25.9 rango: 7-145 días, p=0.006). En el GG, las vacas presentaron celo en un lapso de tiempo menor y en un mayor número que el GC. Intervalo parto-primera IA. Estos mismos autores japoneses (7), indicaron que el lapso de tiempo del parto a la primera inseminación fue de 90.6±22.1 (mínimo 57, máximo 129); lapso que fue similar a lo encontrado para el GC (87.5±40.0), pero mayor que el GG (62.4±11.2; p=0.001). Días Abiertos. La diferencia de tiempo de días abiertos tendió a ser diferente entre el GG (81.7±32.2) y el GC (93.6±32.7; P=0.103). Ambos lapsos fueron menores a los informados por los autores japoneses (7), quienes reportaron lapsos de tiempo de 151.3±55.8 y con rangos de 66-270. Como se observa, en cada lapso de tiempo analizado, el Glycoline® produjo un efecto positivo sobre el comportamiento reproductivo. Servicios por concepción. Fueron similares entre el GG (2.4) y GC (2.5). Solo se permitió inseminar por 3 veces a 6 vacas de cada grupo debido a su

Del Campo - The effect of Glycoline® on reproductive in dairy cow

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interval of time, indicating the positive effect of Glycoline® on reproductive performance.

alta producción; el resto de vacas recibieron 2 inseminaciones como máximo.

Services per conception. Services per conception were similar between the GG (2.4) and GC (2.5). Only 6 cows could be inseminated 3 times in each group due to high production; the other cows received a maximum of two inseminations.

Tasa de preñez. No hubo diferencias en la tasa total de preñez, tomando en consideración el total de vacas (GG 57.1%, 28/49 y GC, 46.0%, 23/50; p=0.317) o el total de las inseminadas (GG 71.8%; 28/39 y GC 67.6% 23/34, p=1.00). Al analizar este parámetro, en forma individual se podría cometer el error al considerar que ambos grupos son iguales y que el Glycoline® no tendría un efecto positivo real sobre la reproducción. Eso sería una aseveración errónea y una mala interpretación de las variables reproductivas, ya que los parámetros reproductivos, como se ha indicado, deberían ser analizados en conjunto para conocer si existe o no una falla en el manejo reproductivo de la explotación y de esa forma tomar las decisiones correctas para mejorarla. Considerando la diferencia en el número de vacas eliminadas de cada grupo se observa que en el GG se eliminó el 20.4% (10/49) de las vacas a diferencia del 32,0% (16/50) eliminadas en el GC; lo que significó una gran pérdida económica para la explotación.

Pregnancy rate. There was no difference in total pregnancy rate taking into consideration the total number cows (GG 57.1%, 28/49 and CG 46.0%, 23/50; p=0.317) or the total number inseminated (GG 71.8%; 28/39 and CG 67.6% 23/34, p=1.00). Analyzing this parameter individually could lead to mistakenly thinking that both groups are equal and that Glycoline® has no real positive effect on reproduction. That would be wrong and a misinterpretation of reproductive variables, since reproductive parameters, as indicated, should be analyzed together to determine whether or not there is a failure in a farm’s reproductive management and thus make adequate changes to improve. Considering the difference in the number of cows culled from each group, it was observed that the GG had 20.4% (10/49) of the cows removed as opposed to 32.0% (16/50) in the CG, which represents great economic loss for the farm. As for periods of time, it can be indicated that up to day 70 postpartum, 41.0% (16/39) of the GG cows and only 17.6% (6/34) of CG were gestating (Table 7). Analyzing the data and parameters together that were modified by the use of Glycoline® we can infer that in most of them, Glycoline® had a beneficial effect on the different parameters studied. Recent studies have reported relatively high reproductive performance in cows with a similar production (≥10.000Kg milk) when compared with lower production herds, possibly due to better nutritional and reproductive management (15). Concerning this, in a study where, 16 prepartum Holstein Friesian cows were treated with a balanced cation/anion feed and minerals (GRBCA) to support immune status during calving and prevent negative energy balance, only 21.0% of them had metritis, in contrast to 71.0% of the untreated group. Although these percentages were higher than those found in this study (GG: CG 10.4% vs. 35.6%), the proportion of cows with metritis (GG: CG=1: 3.1 vs. GRB-CA: CG=1: 3.5) were similar (6).

En cuanto a los lapsos de tiempo se puede indicar que hasta el día 70 postparto, se encontraban gestando el 41.0% (16/39) de las vacas del GG y solamente el 17.6% (6/34) del GC (Tabla 7). Analizando los datos y los parámetros en conjunto que fueron modificados por el uso del Glycoline®, se puede inferir que en la gran mayoría de ellos, el Glycoline® produjo un efecto beneficiosos en los diferentes parámetros estudiados. Estudios relativamente recientes han comunicado altos rendimientos reproductivos en vacas con una producción similar a la de este trabajo (≥10.000Kg de leche) en comparación con rebaños de menor producción, debido posiblemente, al mejor manejo nutricional y reproductivo empleado en el rebaño (15). Al respecto, en un estudio donde 16 vacas Holstein Friesian en preparto, fueron tratadas con una ración balanceada catiónica/aniónica y elementos minerales (GRB-CA) para apoyar el estatus inmunológico alrededor del parto y prevenir el balance energético negativo, presentaron solo un 21.0% de metritis, en contraste con el 71.0% del grupo no tratado. A pesar de que estos porcentajes fueron más altos, que los encontrados en este trabajo (GG: 10.4% vs GC: 35.6%), las proporciones de vacas con metritis (GG: GC=1:3.1 vs GRB-CA: GC=1:3.5) son parecidas (6). Si los factores que afectan la reproducción no son detectados tempranamente, con seguridad afectarán gravemente la eficiencia reproductiva de

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If factors that affect reproduction are not detected early, they will surely have a severe effect on the reproductive efficiency of cows and high milk production. In conclusion and according to the results, we can say that Glycoline® indirectly produced a beneficial effect on all reproductive variables. Acknowledgements To PRINAL SA, Santiago, Chile and AGQ SL, Madrid, Spain, for funding this study. To Dr. Mario E. Mosqueira and Dr. Claudio A. Parada for their contributions and suggestions during the course of this study, and Ms. Sandra L. Fernandez for her work with data processing.

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las vacas de alta producción lechera. De acuerdo con estos resultados, el Glycoline®, produjo indirectamente un efecto beneficioso en todas las variables reproductivas estudiadas. Agradecimientos Esta investigación fue financiada por PRINAL S.A., Santiago, Chile y AGQ S.L., Madrid, España. Los autores agradecen a los doctores Mario E. Mosqueira y Claudio A. Parada, por los aportes y sugerencias durante el transcurso de este trabajo, así como a la Sra. Sandra L. Fernández por su cooperación en el procesamiento de datos.

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5177-5188, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Digestibility of diets with flour fish silage for the growing of arawana (Osteoglossum bicirrhossum) Digestibilidad de dietas con harina de hidrolizado de pescado, para el levante de arawana (Osteoglossum bicirrhossum) Mario Paz A,1 Ing, John Meneses R,1Ing, Jorge López M,1* Ph.D. 1Universidad

de Nariño, Faculty of Fish Sciences, Department of Hydrobiological Resources, Calle 18 Cr. 50. Ciudad Universitaria Torobajo, San Juan de Pasto, Colombia. *Correspondence: jorgelopezmacias@ gmail.com Received: May 2014; Accepted: June 2015.

ABSTRACT Objective. The purpose of this research was to evaluate the digestibility of different nutritional and energy components of artificial diets containing flour fishsilage used in growing of arawana fingerlings (O. bicirrhossum). Materials and methods. 240 fingerlings distributed in 12 tanks with 20 fish per experimental unit were handled, in a completely randomized design made up of 4 treatments with three replicates, each with inclusions of 0 (0ESH), 10 (10ESH), 20(20ESH) and 30% flour fish silage (30ESH) of treatments T0, T1, T2 and T3 respectively; fromflour fish silagein order to formulate isoenergetic and isonitrogenous diets in the different treatments to avoid sources of miscalculation of the experimental variables. Results. High digestibility coefficients were observed in treatments T1 (10ESH) and T3 (30ESH). The protein, lipid and energy utilization ratios were greater than 60%, which shows the importance of including flour fish silage as a source of protein to improve the various growth parameters. Significant differences between treatments were found in the increase of length (p≤0.05), showing that the T1 was the best treatment with an average of 1.21±0.29 cm. Conclusions. According to the coefficients of digestibility, length increase and benefit – cost ratio, the best treatment was T1 (10ESH) used to feed arawana (O. bicirrhossum), during the growing period, demonstrating the economic and ecological advantages for utilization of this source of protein in aquaculture. Key words: Aquaculture, diets, fish silage, nutrition, protein, silver arawana (Sources: MeSH, FAO).

RESUMEN Objetivo. Analizar la digestibilidad de los diferentes componentes nutricionales y energéticos en dietas balanceadas con niveles de harina de hidrolizado de vísceras de cachama en el alevinaje de arawana (O. bicirrhossum). Materiales y métodos. Se evaluaron 240 alevinos, distribuidos en 12 acuarios a razón de 1 animal/5 L. Se utilizó un diseño completamente al azar, conformado por cuatro tratamientos con tres réplicas cada uno, con inclusiones de 0 (0ESH), 10 (10ESH), 20 (20ESH) y 30% de extracto seco de hidrolizado de vísceras de cachama (30ESH) para los tratamientos T0, T1, T2 y T3 respectivamente; para evitar fuentes de error en el cálculo de las variables experimentales, se formularon dietas isoenergéticas e isonitrogenadas. Resultados. Se detectaron diferencias estadísticas significativas en el incremento de longitud (p≤0.05), indicando que el T1 (10ESH) es el mejor tratamiento con un promedio de talla de 1.21 ±0.29 cm, además, se obtuvieron coeficientes 5177

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de digestibilidad superiores al 60% en los tratamientos T1 (10ESH) y T3 (30ESH) en lo referente a proteína, lípidos y Coeficientes de Utilización Energética (CUE); demostrando la importancia de incluir el extracto seco de hidrolizado de vísceras de cachama, en las dietas de los peces para mejorar las distintas variables zootécnicas, teniendo en cuenta la importancia acuariofílica de la especie. Conclusiones. De acuerdo con los coeficientes de digestibilidad, incrementos de longitud y la relación beneficio – costo el mejor tratamiento fue el T1 (10 ESH) en dietas de levante para O. bicirrhossum; demostrando las ventajas económicas y ecológicas de la incorporación de esta materia prima en la alimentación acuícola. Palabras Clave: Acuacultura, arawana plateada, dietas, ensilado, nutrición, proteína. (Fuentes: DeCS, FAO).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The silver arawana (O. bicirrhossum) is a fish species that inhabits the Amazon River and its tributaries: Putumayo, Caquetá and Orinoco (1). It is characterized as having high commercial value in cultivation destined for human consumption and sport fishing due to their shape and color that make them appealing and attractive to the fish market. This has resulted in the species being listed in the Red Book for freshwater fish, considered endangered (2).

La arawana plateada (O. bicirrhosum) es una especie íctica que habita en el río Amazonas y sus tributarios Putumayo, Caquetá y Orinoco (1), se caracteriza por poseer un alto valor comercial en cultivos destinados a consumo humano, pesca deportiva y debido a sus condiciones de forma y color que lo hacen llamativo y atractivo para el mercado acuarista, ha ocasionado que la especie se encuentre catalogada en el libro rojo de peces de agua dulce como especie en peligro (2).

Most aquaculture feeding trials have been conducted without establishing digestibility coefficients for the diets, which means that the nutritional benefits of one material in comparison with others cannot really be determined. For this reason, one of the most important aspects in assessing the effectiveness of feed is understanding the rate of assimilation that quantifies the ability of the fish to digest and absorb nutrients from its diet. This is essential to formulate practical fish feed diets based on determining nutritional requirements, which in turn are related to the content of digestible nutrients. A diet’s digestibility depends on the age of the animal, its physiology, the physicchemical and biological characteristics of water, the nutritional value of different types of raw materials and how the nutrients interact. In aquaculture production, 15% of the weight comes from viscera, which is removed and poured directly into water sources, thus creating pollution and spreading pathogens to captive and natural fish populations (3).

La mayoría de los ensayos de alimentación acuícola, se han realizado sin establecer los coeficientes de digestibilidad de las dietas; lo cual no permite determinar realmente las ventajas nutricionales de una materia prima en comparación con otras. Por esta razón, uno de los aspectos más importantes en la evaluación de la efectividad de un insumo alimenticio es el conocimiento de la tasa de asimilación, que cuantifica la habilidad del pez para digerir y absorber los nutrientes de la dieta que ingiere. Lo anterior es fundamental para la formulación de dietas prácticas para peces, basadas en la determinación de los requerimientos nutricionales, que a la vez están relacionados con el contenido de nutrientes digestibles. La digestibilidad de una dieta depende de la edad del animal, fisiología, características fisicoquímicas y bacteriológicas del agua, valor nutricional de los distintos tipos de materias primas e interacción de nutrientes. En una producción acuícola, el 15% del peso lo representan las vísceras, las cuales son eliminadas de las explotaciones; vertiéndolas directamente a las fuentes de agua; generando problemas de contaminación y propiciando la propagación de patógenos a las poblaciones de peces en cautiverio y naturales (3).

Techniques to properly dispose of offal that would increase rates of return should be evaluated and implemented to maintain the physicochemical and bacteriological quality of bodies of water and their use in manufacturing balanced diets for fish. Therefore, this study determined the digestibility coefficients to establish the quality of raw materials used in aquaculture production by using dry hydrolyzed cachama viscera in varying percentages and measuring its effect on

La evaluación de técnicas que permitan la disposición correcta de las vísceras e incremento de las tasas de rentabilidad; deben implementarse por su impacto positivo en el mantenimiento de la calidad fisicoquímica, bacteriológica de los cuerpos de agua y la utilización de estos

Paz - Digestibility of diets in growing of arawana the zootechnical parameters of simple growth rate, survival, feed conversion and increased size during the cultivation of silver arawana.

MATERIALS AND METHODS Study site and installations. Field work was conducted on the “VAI” fish station of the Aquaculture Association of Caquetá (ACUICA), which is located in El Quebradón in the northeastern department of Caquetá, on the road to El Doncello, 65 kilometers from Florencia, at the following geo coordinates: 1° 40’ 46” North and 75°16’ 45” West, at 373 meters above sea level, average temperature 26°C and an average rainfall of 3200 mm/year in normal conditions (4). The evaluation was carried out in a greenhouse type system in which 12 100-liter aquariums were placed (90cm long by 30cm wide and 40 cm high). Each unit was equipped with a thermostat, ventilation system and filter to provide the appropriate conditions for the fish species studied. Biological material and management. 500 silver Arawana were initially obtained with an average weight of 1.2±0.2 g., vitelinic larvae. The fish were transferred to the greenhouse where they were randomized into aquariums for a period of four months, three of which were devoted to cultivation and feed and one for study purposes. The aquariums were kept at an average temperature of 30.2±1.6ºC. The acclimation period lasted two weeks, during which labors such as siphoning, 90% daily water exchange, and recording of physicochemical parameters such as temperature and oxygen was done with a YSI 550A probe and pH with Hach equipment to keep the fish in optimal condition. After the yolk sac was absorbed, the fish were fed with commercial flakes with 48% protein for a month, which was gradually replaced with an extruded commercial diet of 45% (p/v) protein, supplied three times a day until the population reached an average standard length of 9.8 ± 0.9 cm. and an average weight of 6.6 ± 2.5 g. These values showed no statistical difference (p>0.05). Later, evaluation of experimental diets was initiated with 240 fish, establishing inclusions at 0 (OESH), 10 (10ESH), 20 (20ESH) and 30% dry hydrolyzed cachama viscera (Piaractus brachypomus) (30ESH) for T0, T1, T2 and T3 treatments respectively, with 20 animals per experimental unit and a daily supply of biomass at 6%, distributed in five meals a day. Raw materials for the diet. The nutritional needs of native fish species grown in captivity can

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subproductos en la fabricación de dietas balanceadas para peces. Por lo anteriormente expuesto, la presente investigación determina los coeficientes de digestibilidad, para establecer la calidad de las materias primas utilizadas en la producción acuícola; a partir de extracto seco de hidrolizado de vísceras de cachama en diferentes porcentajes y el efecto sobre los parámetros zootécnicos de tasa de crecimiento simple, sobrevivencia, conversión alimenticia e incremento de talla durante la fase de levante de arawana plateada.

MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio e instalaciones. El trabajo de campo se realizó en la estación piscícola “VAI” perteneciente a la Asociación de Acuicultores del Caquetá (ACUICA), la cual se encuentra ubicada en la Vereda El Quebradón en el noreste del departamento del Caquetá, en la vía al municipio de El Doncello a una distancia de 65 kilómetros de Florencia con coordenadas geográficas de 1° 40’ 46” latitud Norte y 75° 16’ 45” longitud Oeste, a 373 m.s.n.m., temperatura promedio ambiente de 26ºC y una pluviosidad promedio de 3200 mm/año en condiciones normales (4). La evaluación se llevó a cabo en un sistema tipo invernadero, en el cual se instalaron 12 acuarios de 100 litros (90 cm de largo por 30 cm de ancho y 40 cm de alto). Cada unidad fue dotada de un termostato, sistema de aireación y un filtro, para brindar las condiciones apropiadas para la especie íctica objeto de estudio. Material biológico y manejo. Se obtuvieron inicialmente 500 ejemplares de arawana plateada con un peso promedio de 1.2±0.2 g., los cuales se encontraban en estado de larva vitelínica. Los peces fueron trasladados al sistema tipo invernadero, donde fueron distribuidos aleatoriamente en acuarios por un período de cuatro meses, tres de los cuales se dedicaron al levante y adaptación alimentaria y uno al desarrollo de la investigación. Los acuarios fueron acondicionados a una temperatura promedio de 30.2 ± 1.6ºC. El período de aclimatación de los individuos duró dos semanas, durante las cuales se efectuaron labores de sifoneo, recambio de agua del 90% diario y registro de parámetros fisicoquímicos como temperatura y oxígeno con una sonda YSI 550A y pH con un equipo Hach, para mantener los animales en óptimas condiciones. Después de la reabsorción del saco vitelino, los ejemplares se adaptaron a balanceado comercial en hojuelas con 48% de proteína durante un mes, el cual fue remplazado gradualmente con una dieta comercial extrudizada de 45% (p/v) de proteína,

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be met by providing artificial feed prepared with raw materials that have appropriate digestibility and palatability and that also meet the minimum nutritional requirements for the species under cultivation (3). To formulate the diets meat meal, soybean (Glycine max), fish, corn (Zea mays), wheat bran and bean flour (Phaseolus spp.) was used. Since one of the most expensive raw materials is fishmeal, this study proposed partially replacing this protein with hydrolyzed cachama viscera. Preparing the hydrolyzed product and flour. The process took place in the laboratories of the Universidad de Nariño using 50 kg of cachama viscera which had the fat tissue and gastrointestinal contents removed. This raw material was ground to a homogeneous visceral paste and molasses, plain yogurt and potassium sorbate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) were added in amounts of 15, 3 and 0.2% respectively (5). This was stored in glass and plastic containers for a ripening time of 216 hours during which it reached a pH of 4.10±0.07, optimal for inhibiting the growth of pathogens that could affect the product (6). This process was done in an incubator (Memmert, Schwabach, Germany) at a temperature of 38±2°C. The ripe hydrolyzed product was transferred to a Styrofoam cooler to keep it isolated from moisture and sunlight, maintaining the pH range specified above. The average amount per container did not exceed 60% of the total volume to leave room for gas production due to fermentation; once hydrolysis was established and pH stability achieved, the flour was made by drying the mixture; the hydrolyzed product was poured into stainless steel trays in 4 mm layers and was dried at a temperature of 60°C in an oven (Memmert, Schwabach, Germany) for 14 hours to obtain a hard paste, and then was put through a micro mill (IKA, Staufen, Germany) to produce flour. Bromatologic analysis of ingredients, preparation and balancing the diets. Each selected raw material was milled and sieved to a particle size of 450 microns to facilitate homogenization, and a proximal and energy analysis was performed following the Weende methodology as applied by specialized laboratories at the University of Nariño (Table 1). Isonitrogenous and isocaloric diets were obtained using the commercial program Feedsoft Enterprise (2010) and the Excel Solver (2010) tool using protein levels of not less than 45% and energy that did not exceed 5270 Kcal/kg, as well as the limited use of some ingredients according to sales costs, digestibility and what is recommended by Vazquez (7).

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suministrada tres veces al día hasta que la población alcanzó una longitud estándar promedio de 9.8 ± 0.9 cm. y peso promedio de 6.6 ± 2.5 g. Los anteriores valores no registraron diferencias estadísticas (p>0.05). Posteriormente se inició la evaluación de las dietas experimentales con 240 animales, estableciendo inclusiones de 0 (OESH), 10 (10ESH), 20 (20ESH) y 30% de extracto seco de hidrolizado de vísceras de cachama blanca (Piaractus brachypomus) (30ESH) para los tratamientos T0, T1, T2 y T3 respectivamente, con 20 animales por unidad experimental y suministro diario del 6% de la biomasa, distribuido en cinco comidas al día. Materias primas de las dietas. Las necesidades nutricionales de las especies ícticas nativas, cultivadas en cautiverio, pueden ser cubiertas mediante el suministro de balanceados artificiales preparados con materias primas de digestibilidad y palatabilidad adecuadas que además, cumplan con los requerimientos nutricionales mínimos de la especie objeto de cultivo (3). En la formulación de las dietas se incorporó harinas de carne, soya (Glycine max), pescado, maíz (Zea mays), afrecho de trigo (wheat bran) y harina de frijol (Phaseolus spp.). Considerando que una de las materias primas más costosas es la harina de pescado, el presente ensayo propuso el remplazo parcial de este ingrediente proteico por harina de hidrolizado de vísceras de cachama. Elaboración del hidrolizado y preparación de la harina. El proceso se realizó en los Laboratorios de la Universidad de Nariño, a partir de 50 kg de vísceras de cachama, a los cuales se les retiró el tejido graso y el contenido gastrointestinal, luego esta materia prima se molió hasta obtener una pasta visceral homogénea, se adicionó melaza, yogurt sin sabor y sorbato de potasio (Sigmaaldrich, St. Louis, MO) en cantidades de 15, 3 y 0.2% respectivamente (5). La preparación se almacenó en recipientes plásticos y de cristal, durante un tiempo de maduración de 216 horas, período en el cual se alcanzó un pH de 4.10±0.07, óptimo para la inhibición del crecimiento de patógenos que podían afectar el producto (6), este proceso se llevó a cabo en una incubadora (Memmert, Schwabach, Germany) a temperatura de 38±2°C. El hidrolizado maduro, se transfirió a una nevera de icopor para mantenerlo aislado de humedad y luz solar, conservando el rango de pH anteriormente indicado. La cantidad promedio calculada por recipiente no superó el 60% del volumen total, dejando espacio para la producción de gas como producto de la fermentación; una vez establecida la hidrólisis y alcanzada la estabilidad del pH, se formó su harina a través de un proceso de secado. Para

Paz - Digestibility of diets in growing of arawana Table 1. Approximate analysis (%) and gross energy of the ingredients in different diets prepared with the dry hydrolyzed extract of cachama viscera. Protein (%)*

Ether extract (%)*

Raw fiber (%)*

Energy (Kcal/100g)

Meat flour

63.2

Soy flour

49.7

24.8

623

0.88

4.96

Fish flour

465

52.5

12.7

525

dry hydrolyzed extract of cachama viscera

37.7

26.3

----

577

Ground corn

8.25

4.62

2.03

442

Roasted bean flour

24.0

1.45

8.87

403

Wheat bran

17.4

4.73

7.72

461

Raw material

*Percentage in dry base. Specialized laboratory, Universidad de Nariño, 2010.

Each diet was supplemented with 0.3% commercial mineral and vitamin premix for fish (DSM Nutritional Products, Bogotá, Colombia); Fish oil was also added at 3% carboxymethyl cellulose (CMC) at 1% to provide fiber and a binder and as a digestibility marker chromic oxide (Cr2O3) (Carlo Erba, Sabadell, Barcelona) at 0.9%. To develop treatments they first weighed and mixed the flour and then the micro-ingredients until the greatest possible homogenization was achieved. Each treatment was moistened with 25% water and then the mixture was passed through a sieve with one millimeter mesh. The extruding process was done at the Laboratory of Aquatic Nutrition, Unit for Food Processing at the National Universidad de Colombia using a laboratory micro-extruder (Exteec, Vila, Brazil) to obtain 5mm granules that were then allowed to dry for 24 hours at 60°C and the fish oil was immediately added using a spray method. Sample collection and analysis. They were collected five times daily; two in the morning and three in the afternoon in order to prevent leaching of fecal matter; during feeding and siphoning of the aquarium aeration was discontinued. Then they were stored in previously labeled plastic containers at an average temperature of -10°C. Feces were collected per aquarium to remove pollutants and were stored for treatment. The collection period lasted for 30 days until 50g of sample treatment was collected. Proximate analysis of food and feces was made following the Weende methodology. Likewise, the amount of chromic oxide present in diets and feces was determined according to the Furukawa method (1993) adapted by the specialized laboratory at the University of Nariño, which involves adding 5 ml of concentrated nitric acid to 0.1 g of dry sample to digest for 45 minutes at 105°C, allowing it to cool and adding 0.5 ml of perchloric acid and then heating it to 220°C

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esto, se vertió el hidrolizado en bandejas de acero inoxidable hasta formar una capa de 4 mm de espesor, secando a una temperatura de 60°C en un horno (Memmert, Schwabach, Germany) por un tiempo de 14 horas hasta obtener una pasta dura, finalmente se llevó a un micro molino (IKA, Staufen, Germany) para obtener la harina. Análisis bromatológico de ingredientes, preparación y balanceo de las dietas. Cada una de las materias primas seleccionadas fue molida y tamizada a un tamaño de partícula de 450 micras para facilitar la homogenización, se le realizó un análisis proximal y energético, siguiendo la metodología de Weende aplicado por los laboratorios Especializados de la Universidad de Nariño (Tabla 1). Se obtuvieron dietas isonitrogenadas e isoenergéticas, mediante el programa comercial FeedSoft Enterprise (2010) y la herramienta Solver de Excel (2010), utilizando las restricciones de nivel de proteína no menor al 45% y energía no superior a 5270 Kcal/kg, e inclusiones limitadas de algunos ingredientes, según los costos de venta, digestibilidad y lo recomendado por Vázquez (7). Cada una de las dietas fue suplementada con 0.3% de premezcla vitamínica y mineral comercial para peces (DSM Nutritional Products, Bogotá, Colombia); además se agregó aceite de pescado al 3%, carboximetílcelulosa (CMC) al 1% como aporte de fibra y aglutinante y como marcador de digestibilidad Oxido Crómico (Cr2O3) (Carlo Erba, Sabadell, Barcelona) al 0.9%. En la elaboración de los tratamientos se pesaron y mezclaron primero las harinas y luego los micro-ingredientes hasta lograr la mayor homogenización posible. Se humedeció cada tratamiento con un porcentaje de 25% de agua y luego se pasó la mezcla por un tamiz con ojo de malla de un milímetro. El proceso de extrudización se efectuó en el Laboratorio de Nutrición Acuícola, Unidad de Procesamiento de Alimentos de la Universidad Nacional de Colombia, con ayuda de una microextrusora (Exteec, Vila, Brasil) para laboratorio obteniendo gránulos de 5mm, luego se dejó secar por 24 hora a una temperatura de 60ºC e inmediatamente se añadió el aceite de pescado por medio de un atomizador. Colección de muestras y análisis. Se recolectaron cinco veces al día; dos en la mañana y tres en la tarde, con el fin de evitar la lixiviación de la materia fecal; durante la alimentación y sifoneo de los acuarios se suspendió la aireación. Luego se procedió a almacenarlas en recipientes plásticos previamente rotulados, a una temperatura promedio de -10ºC. Las heces se recolectaron por acuario para facilitar la

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until chromium oxidation is seen in a change in color from green to orange; absorbance is then read at 350nm. An economic analysis was done taking into account the fixed and variable costs of different experimental diets, searching for an alternative feed formula using cachama viscera produced by applying biological silage techniques to include it in the diet of silver arawana. The cost of arawana alevin were considered as well as the cost of raw materials, supplies and labor. Experiment design. A completely random design (DCA) was used that consists of four treatments and three replicates per treatment, 20 per experimental unit for a total of 240 fish. Statistical assumptions were made to determine outliers, normality test (Chi-Square, ShapiroWilk) and homogeneity of variances (Bartlett, Levene). In the variance analysis (ANOVA) with variables that showed statistically significant differences (p<0.05) the Multiple Comparison Tukey test was applied in order to establish the best treatment. Regarding the results of digestibility, the values obtained for each treatment were determined keeping in mind that no statistical analysis was performed because the feces in different replicas were homogenized. Digestibility was calculated according to the following formulas: (8). Digestibility variables Total digestibility coefficient: DT= 100 – 100 * [%Cr2O3 AL/%Cr2O3 H], Where: %Cr2O3 AL: amount of Cr2O3 in feed %Cr2O3 H: amount of Cr2O3 in feces Digestibility coefficient. C D = 1 0 0 – [ ( % C r 2O 3A L / % C r 2O 3H ) * (%NH/%NAL) * 100], Where: %Cr2O3 AL: amount of Cr2O3 in feed %Cr2O3 H: amount of Cr2O3 in feces %NH: amount of nutrients in feces %NAL: amount of nutrients in feed Energy use coefficient. CUE = 100 - [(%Cr2O3AL/%Cr2O3H) * (%EBH/%EBA) * 100], Where: %Cr2O3 AL: amount of Cr2O3 in feed %Cr2O3 H: amount of Cr2O3 in feces %EBH: brute energy in feces %EBA: brute energy in feed Digestible energy. ED = [CUE*EBA)/100],

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eliminación de agentes contaminantes y fueron almacenadas por tratamiento. El período de recolección duró aproximadamente 30 días, hasta obtener 50 g de muestra por tratamiento. Se efectuó el análisis proximal del alimento y las heces siguiendo la metodología de Weende. Igualmente, se determinó la cantidad de óxido crómico presente en las dietas y heces de acuerdo al método de Furakawa (1993) adaptado por los laboratorio especializados de la Universidad de Nariño el cual consiste en añadir 5 ml de ácido nítrico concentrado a una muestra seca de 0.1 g para llevar a digestión por 45 minutos a 105°C, se deja enfriar y se adiciona 0.5 ml de ácido perclórico, luego se calienta a 220°C hasta la oxidación del cromo proceso que se evidencia con el cambio de color de verde a naranja; posteriormente se lee absorbancia a 350nm. Se efectuó un análisis económico teniendo en cuenta los costos fijos y variables de las diferentes dietas experimentales, buscando como alternativa la formulación de un alimento propio generado a partir de vísceras de cachama, aplicando técnicas de ensilaje biológico, para la inclusión de la dieta en la producción de arawana plateada. Para este efecto se consideraron los costos de los alevinos de arawana, el valor de las materias primas utilizadas, insumos y mano de obra en la producción. Diseño experimental. Se utilizó un diseño completamente al azar (DCA) conformado por cuatro tratamientos y tres réplicas por tratamiento, 20 ejemplares por unidad experimental para un total de 240 peces. Se realizaron los supuestos estadísticos para determinar datos atípicos, prueba de normalidad (Chi-Cuadrado, ShapiroWilk) y homogeneidad de varianzas (Bartlett, Levene); en el análisis de varianza (ANAVA) con las variables que presentaron diferencias estadísticas significativas (p<0.05), se procedió a aplicar la Prueba de Comparación Múltiple de Tukey con el propósito de establecer el mejor tratamiento. Con relación a los resultados de digestibilidad se determinaron los valores obtenidos para cada tratamiento, teniendo en cuenta que no se efectuó análisis estadístico debido a que las heces de las diferentes replicas que componían cada tratamiento fueron homogenizadas. La digestibilidad se calculó de acuerdo a las siguientes formulas: (8). Variables de digestibilidad Coeficiente de digestibilidad total. DT= 100 – 100 * [%Cr2O3 AL/%Cr2O3 H],

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Where: CUE: coefficient of energy utilization EBA: Brute Feed Energy

Dónde: %Cr2O3 AL: cantidad de Cr2O3 en el alimento %Cr2O3 H: cantidad de Cr2O3 en las heces

The productive variables were calculated as follows:

Coeficiente de digestibilidad. CD = 100 – [(%Cr2O3AL/%Cr2O3H) * (%NH/%NAL) * 100], Donde: %Cr2O3 AL: cantidad de Cr2O3 en el alimento %Cr2O3 H: cantidad de Cr2O3 en las heces %NH: cantidad de nutrientes en las heces %NAL: cantidad de nutrientes en el alimento

Productive variables Increase in biomass. IB = [BF – BI], Where: BF: final biomass BI: initial biomass Simple growth rate. SGR = [(ln PF – ln PI)/t * 100], Where: PF: final weight PI: initial weight t: sample period

Coeficiente de utilización energética. CUE = 100 - [(%Cr2O3AL/%Cr2O3H) * (%EBH/%EBA) * 100], Donde: %Cr2O3 AL: cantidad de Cr2O3 en el alimento %Cr2O3 H: cantidad de Cr2O3 en las heces %EBH: energía bruta en heces %EBA: energía bruta en el alimento

Size increase. IT = [TF – TI], Where: TF: final size TI: initial size

Energía digestible. ED = [CUE*EBA)/100], Donde: CUE: coeficiente de utilización energética EBA: Energía Bruta de Alimento

Feed conversion. CA = [AC/IP], Where: AC: consumed feed IP: weight increase

Las variables productivas se calcularon asi:

Survival. S = [(NF/NI) * 100], Where: NF: number of animals at the end NI: number of animals at the beginning Analysis of benefit-cost relationship. B/C = [(UB/TE) * 100], Where: UB: brute utility TE: total expenditure

RESULTS The experimental diets were balanced according to the quantities of different raw materials as shown in table 2 and were incorporated to ensure the isonitrogenous and isocaloric conditions of the diets for further evaluation. The greatest values for digestibility, protein, fat and energy utilization coefficients were found in treatment T3 (30 ESH) with a value of 72.5 (Table 3). It is important to highlight that treatments that incorporated hydrolyzed viscera (ESH) at levels of 10 (T1), 20 (T2) and 30

Variables productivas Incremento de biomasa. IB = [BF – BI], Donde: BF: biomasa final BI: biomasa inicial Tasa de crecimiento simple. SGR = [(ln PF – ln PI)/t * 100], Donde: PF: peso final PI: peso inicial t: periodo muestreo Incremento de talla. IT = [TF – TI], Donde: TF: talla final TI: talla inicial Conversión alimenticia. CA = [AC/IP], Donde: AC: alimento consumido IP: incremento de peso Sobrevivencia. S = [(NF/NI) * 100],

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Table 2. Percentage of each raw material to be included per 100g of feed for each treatment including dry hydrolyzed viscera. T0 (%)

T1 (%)

T2 (%)

T3 (%)

Meat flour

26.7

Soy flour

30.8

36.5

Fish flour

Raw material

Hydrolyzed cachama viscera silage Ground corn

5.7

8.9

2.2

Roasted bean flour

6.7

2.2

Wheat bran

Fish oil

Carboxymethyl celullose (CMC)

Chromium oxide

0.9

Vitamin and mineral pre mix

0.3

100

(T3)% digestibility had digestibility percentages greater than 6, 1.7 and 9.4% of the total relative digestibility in relation to control treatment T0 (0 ESH) that consisted of a balanced diet without dry hydrolyzed product. The results of productive variables during 14 days of evaluation establish significant differences in apparent food consumption (p≤0.05), which indicates improved palatability in T0 and T2. Treatments T1 and T3 did not differ significantly according to the Tukey test (p≤0.05), as shown in figure 1.

Figure 1. Apparent consumption of dry extract of viscera hydrolyzed product in the different treatments.

The simple average growth rate (SGR) for silver arawana alevin had increases above 0.09 and 0.88% for T1 (10 ESH) and T2 (20ESH) treatments respectively when compared to control treatment T0 (0ESH) (Table 4). The analysis of variance (p≤0.05) for the increased average length of the different treatments detected statistically significant differences. The Tukey significance test indicated that T1 (10 ESH) recorded the greatest increases, averaging 1.21±0.29 cm, and the lowest value recorded for this variable was T3 (30 ESH) with 0.26±0.15 cm (Figure 2).

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Donde: NF: número de animales al final NI: número de animales al inicio Análisis de relación beneficio – costo. B/C = [(UB/TE) * 100], Donde: UB: utilidad bruta TE: total de egresos Table 3. Digestibility coefficient (%) of protein, ether extract, non-nitrogenized extract and energy utilization coefficient of diets prepared with dry hydrolyzed viscera. Digestibility coefficient (%)

T0 T1 T2 T3 (0ESH) (10ESH) (20ESH) (30ESH)

Total digestibility coefficient (CDT)

63.1

69.1

64.8

72.5

Protein(P)

76.9

78.1

81.2

90.2

90.4

Non-nitrogenized extract (ENN)

53.8

51.6

63.6

Energy use coefficient (CUE)

67.2

72.6

69.2

75.2

Ether extract (EE)

RESULTADOS Las dietas experimentales fueron balanceadas según las cantidades de las diferentes materias primas como se presenta en la tabla 2, las cuales se incorporaron para asegurar las condiciones isoenergéticas e isonitrogenadas de las dietas para su posterior evaluación. Los mayores valores de digestibilidad, de proteína, lípidos y coeficientes de utilización energética se encontraron en el tratamiento T3 (30 ESH) con un valor de 72.5 (Tabla 3). Es importante destacar que los tratamientos que incorporaban extracto seco de hidrolizado de vísceras (ESH) en niveles del 10 (T1), 20 (T2) y 30 (T3) % registraron digestibilidades porcentuales mayores de 6, 1.7 y 9.4%, de la digestibilidad total con relación al tratamiento testigo T0 (0 ESH) constituido por un balanceado sin extracto seco de hidrolizado. Los resultados de las variables productivas durante 14 días de evaluación, establecen diferencias significativas en el consumo aparente del alimento (p≤0.05), lo que permite indicar mejor palatabilidad en los balanceados T0 y T2. Los tratamientos T1 y T3 no presentaron diferencias significativas de acuerdo a la prueba de Tukey (p≤0.05), como lo muestra la figura 1. La tasa promedio de crecimiento simple (SGR) para alevinos de arawana plateada registró incrementos superiores de 0.09 y 0.88% para los tratamientos T1 (10 ESH) y T2 (20ESH) respectivamente en comparación al tratamiento testigo T0 (0ESH) (Tabla 4). El análisis de

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varianza (p≤0.05), para el incremento de longitud promedio de los diferentes tratamientos, detectó diferencias estadísticas significativas. La prueba de significancia de Tukey indicó que el T1 (10 ESH), registró los mejores incrementos con un promedio de 1.21±0.29 cm, el valor más bajo en esta variable lo registró el T3 (30 ESH) con 0.26±0.15 cm (Figura 2).

Figure 2. Increased standard length in the different treatments with dry viscera hydrolyzed product.

Regarding the apparent feed conversion, it was found that there are no statistically significant differences between the averages of the different treatments (p>0.05); (Table 4).

Table 4. Results of productive variables in the different treatments with dry hydrolyzed viscera. TTO

SGR(%)

ITT(cm)

ITD (cm)

R (%)

1.67±1.62a 0.85±0.39ac 0.060±0.39ac 1.95±0.38a

69.48

1.76±1.20a 1.21±0.29ab 0.086±0.29ab 1.50±0.04a

82.64

2.55±1.30a 0.55±0.05bc 0.039±0.05bc 1.57±0.35a

56.56

1.64±1.30a 0.26±0.15c 0.018±0.15c 1.69±0.05a

56.56

TTO = Treatment, SGR = Simple growth rate, ITT = Length increase over 14 days , ITD = Daily length increase, CA=feed conversion, R = Profitability

Con respecto a la conversión alimenticia aparente, se encontró que no existen diferencias estadísticas significativas entre las medias de los diferentes tratamientos (p>0.05); (Tabla 4). La sobrevivencia durante el período experimental fue del 100% para los cuatro tratamientos; observándose una al ta resi stenci a a la manipulación y el estrés, causado por las rutinas de aseo, recambios, recolección de heces y retiro del alimento no consumido, además, de los censos para los registros biométricos. Los parámetros físico-químicos de agua fueron similares en todos los tratamientos, según el análisis de varianza (p>0.05) durante su período de estudio, y están dentro de los rangos requeridos para el cultivo de la arawana plateada (Tabla 5). La relación costo-beneficio estimado, demuestra que todos los tratamientos son viables económicamente, de tal manera que el T1 (10 ESH) registró una relación de 1.82, el tratamiento T0 (0 ESH) con 1.69, y de 1.56 para los tratamientos T2 (20 ESH) y T3 (30 ESH), (Tabla 3, Figura 3).

Survival during the experiment was 100% for the four treatments. They were greatly tolerant of manipulation and stress caused by cleaning routines, changes, fecal collection and uneaten food removal as well as census for biometric records. According to the analysis of variance (p> 0.05), the physical and chemical parameters of water were similar in all treatments during the study period, and are within the ranges required for cultivating silver arawana (Table 5). The cost-benefit estimate shows that all treatments are economically viable; T1 (10 ESH) showed a ratio of 1.82, T0 (0 ESH) 1.69, and treatments T2 (20 ESH) and T3 (30 ESH) 1.56 (Table 3, Figure 3). Table 5. Average physicochemical parameters in the different treatments. Treatment

Oxygen (mg/l)

Temperature (°C)

4.97±0.24a

6.80±0.23a

30.49±1.26a

4.90±0.22a

6.76±0.23a

30.22±1.11a

4.94±0.23a

6.73±0.27a

30.27±0.99a

4.93±0.21a

6.77±0.25a

30.44±1.02a

Figure 3. Cost benefit relationship per treatment.

DISCUSIÓN La investigación confirma que la utilización de materias primas de alta digestibilidad en las dietas para peces, mejora la conversión alimenticia, aumento de las tasas de crecimiento, y reduce el impacto ambiental negativo, generado por el aporte de residuos nitrogenados y fosforados debido a la

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DISCUSSION Research confirms that the use of highly digestible raw materials in fish diets improves feed conversion, increases growth rates and reduces negative environmental impacts generated by the nitrogen and phosphorus waste from disposing of viscera in water bodies (9). Also, it was found that protein digestibility, ether extract and energy for the different treatments showed values higher than 60%, ensuring remodeling processes and cell growth and demonstrating the nutritional quality of the diets represented in the content of essential amino acids, the interaction of nutrients, and the soluble and water-soluble vitamins and minerals found in hydrolyzed cachama viscera (3). Percentage values of digestibility of ether extracts in T1 (10 ESH), T2 (20 ESH), and T3 (30ESH) exceed 85% due to the elevated composition of fatty acid in hydrolyzed fish viscera, particularly unsaturated Omega 3 and Omega 6 fatty acids that have multiple physiological functions related to growth and the immune system and record greater digestibility when compared with fats present in traditional products that are less digestible (10). The increase in weight and height reported in this study are consistent with other studies that show that silver arawana alevin raised in captivity under similar conditions have increased in average weight between 0.15 g/day and 0.20 g/ day (1). The best digestibility values and analysis of productive variables were found in treatments with dry hydrolyzed fish viscera due to the biological quality, amino acids, interaction of nutrients and the presence of nonspecific growth factors in this product (1). Also, similarities with other studies reported increases in daily size from 0.06 cm to 0.08 cm, which shows that diets that include dry hydrolyzed cachama viscera can produce growth up to 1.21 cm in two weeks in total length during the initial developmental phase, which is highly important for fish species that are of interest to the fish industry (12). Feed conversion and feed intake in the different experimental diets did not have statistical differences, showing that the inclusion of different percentages of dry hydrolyzed viscera to feed arawana does not affect yield, keeping in mind that weight increases were also statistically similar in all treatments. In contrast, size was significant in Q1 relative to the other treatments, important for this important species to the fish industry (13).

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eliminación de las vísceras en los cuerpos de agua (9). Asimismo, se comprueba que la digestibilidad de la proteína, extracto etéreo y energía para los diferentes tratamientos registraron valores superiores al 60%, asegurando los procesos de remodelación y crecimiento celular; demostrando la calidad nutricional de las dietas, representada por el contenido de aminoácidos indispensables, la interacción de nutrientes, el aporte de vitaminas liposolubles e hidrosolubles y minerales presentes en el extracto seco de hidrolizado de vísceras de cachama (3). Los valores porcentuales de digestibilidad del extracto etéreo en los tratamientos T1 (10 ESH), T2 (20 ESH), y T3 (30ESH) superan el 85%, debido a la composición elevada de ácidos grasos en los hidrolizados de vísceras de pescado, principalmente de ácidos grasos insaturados de las series omega 3 y omega 6, los cuales tienen múltiples funciones fisiológicas relacionadas con el crecimiento y el sistema inmunológico y registran mejor digestibilidad comparados con las grasas presentes en las materias primas tradicionales que son de menor digestibilidad (10). Los incrementos de peso y talla reportados en esta investigación, están acordes con otros estudios en donde se demuestra que alevinos de arawana plateada levantados en cautiverio en condiciones similares, obtuvieron un incremento de peso promedio entre 0.15 g/día y 0.20 g/día (1). Los mejores valores de digestibilidad y análisis de las variables productivas se encontraron en los tratamientos con extracto seco de hidrolizado de vísceras de pescado, debido a la calidad biológica, composición de aminoácidos, interacción de nutrientes y presencia de factores inespecíficos de crecimiento en esta materia prima (11). De igual manera se presenta similitudes con otros ensayos que reportan incrementos de talla diarios entre 0.06 cm a 0.08 cm., lo que explica que las dietas con inclusiones de extracto seco de hidrolizado de vísceras de cachama pueden alcanzar hasta 1.21 cm quincenales en su longitud total en el desarrollo de su fase inicial, lo cual es de gran importancia para una especie íctica de interés acuariofílico (12). La conversión alimenticia y el consumo de alimento de las distintas dietas experimentales no registraron diferencias estadísticas, lo que demuestra que la inclusión de diferentes porcentajes del extracto seco de hidrolizado de vísceras en la alimentación de arawana, no afecta el rendimiento productivo de la especie, teniendo en cuenta que los incrementos de peso fueron también similares estadísticamente en todos los tratamientos. En contraste la talla fue significativa en el T1 con relación a los demás tratamientos, condición importante para este pez de valor acuariofilico (13).

Paz - Digestibility of diets in growing of arawana The economic analysis has shown the feasibility of using dry extracts of hydrolyzed fish entrails or waste, using it as a partial substitute for fishmeal, an expensive raw material that is increasingly scarce on the market. Therefore, we recommend using this fish waste according to the methodology described in this study as an ecological and economic alternative to reduce production costs and prevent contamination of water sources. The results of this study allow us to conclude that diets with dry hydrolyzed viscera between 10 and 30% (p/v) are adequately digestible and including them at 10% ensures good productive performance in cultivating arawana. We recommend including this raw material in fish feed as a protein source and as a substitute for commercial fish silage. Acknowledgements The Aquaculture Association of Caquetá (ACUICA) for funding this research, to the Universidad Nacional de Colombia, located in Bogota, for academic and logistical support of the Aquaculture Production Engineering program of the Universidad de Nariño and to all people who in one way or another contributed to this research.

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El análisis económico muestra la viabilidad que tiene el uso de extractos secos de hidrolizados biológicos a base de vísceras o desechos de pescados, utilizándolo como un sustituto parcial de la harina de pescado, materia prima costosa y cada vez más escasa en el mercado. Por tanto, se recomienda promover la utilización de estos desechos pesqueros utilizando la metodología descrita en esta investigación como una alternativa ecológica y económica para reducir los costos de producción y evitar la contaminación de los cuerpos de agua. Los resultados del presente estudio permiten concluir que las dietas con extracto seco de hidrolizado de vísceras entre 10 y 30 % (p/v) presentan una digestibilidad adecuada e incluirlos en 10% permite buen desempeño productivo para el levante de arawana, se recomienda la inclusión de esta materia prima en las dietas para peces como fuente proteica y sustituto de la harina de pescado comercial. Agradecimientos A la Asociación de Acuicultores del Caquetá (ACUICA) por la financiación de esta investigación, a la Universidad Nacional de Colombia con sede en Bogotá, por su apoyo académico y logístico, al programa de Ingeniería en producción Acuícola de la Universidad de Nariño y a todas las personas que de alguna u otra manera colaboraron en el desarrollo de la investigación.

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5189-5197, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Feeding habits of Cocobolo Andinoacara pulcher in the cienaga Grande de Lorica, Colombia Hábitos alimentarios de Cocobolo (Andinoacara pulcher) en la ciénaga Grande de Lorica, Colombia Charles W. Olaya-Nieto,1 M.Sc, Liquey Camargo-Herrera,2 Prof. Acuicul, Vanessa Díaz-Sajonero,2 Prof. Acuicul, Fredys F. Segura-Guevara,1* M.Sc. 1Universidad

de Córdoba, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnical Science, Department of Aquatic Sciences, Fisheries Biology Research Laboratory-FBRL. Cra 23 No. 2A-20, Piso 2. Lorica, Colombia. 2Universidad de Córdoba, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnical Science, Department of Aquatic Sciences, Aquaculture Program. Montería, Colombia. *Correspondence: ffsegura@correo.unicordoba.edu.co

ABSTRACT

Received: June 2014; Accepted: April 2015.

Objective. The feeding habits of Cocobolo (Andinoacara pulcher) in the cienaga Grande de Lorica, Sinu river basin, were studied. Materials and methods. The stomach content was analyzed using the Proportion of empty stomachs, Grade of digestion, Frequency of occurrence, numerical Frequency, Gravimetry, relative importance Index (RII) and the gut length-total length relationship. Results. 39.8% of stomachs were empty, 47.1% of preys were fresh and five food groups were identified. Vegetable remains was the most frequent group (63.8%) and the prey with greatest composition in weight (33.5%), while Rest of fishes was the most abundant group (34.7%). It was observed that in low and rising waters, fishes was the most consumed prey, while that in high and falling waters the most consumed prey was vegetable remains. Vegetable remains, detritus and fishes were food groups of secondary relative importance, while Insects and Others were circumstantial or incidental groups. Conclusions. The results achieved indicate that Cocobolo is a fish with omnivores feeding habits with a preference for fishes and vegetable remains. Key words: Diet, feeding, food preferences, trophic levels (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. Se estudiaron los hábitos alimentarios de Cocobolo (Andinoacara pulcher) en la ciénaga Grande de Lorica, cuenca del río Sinú, Colombia. Materiales y Métodos. El contenido estomacal se evaluó con el Coeficiente de vacuidad, Grado de llenado, Grado de digestión, Frecuencia de ocurrencia, Frecuencia numérica, Gravimetría, Índice de importancia relativa y la relación longitud intestinallongitud total. Resultados. El 39.8% de los estómagos se encontró vacío, el 47.1% de las presas en estado fresco y se identificaron cinco grupos alimentarios. Material vegetal fue el grupo más frecuente (63.8%) y con mayor composición por peso (33.5%), mientras que Restos de peces fue el más abundante (34.7%). Se observó que en aguas bajas y en aguas ascendentes, peces fue la presa más consumida, mientras que en aguas altas y aguas descendentes, fue material vegetal. Material vegetal, detritos y restos de peces fueron grupos alimentarios de importancia relativa secundaria, mientras que insectos y otros fueron circunstanciales o incidentales. Conclusiones. Los resultados alcanzados indican que Cocobolo es un pez de hábitos alimentarios omnívoros con preferencia por peces y material vegetal. Palabras clave: Alimentación, dieta, niveles tróficos, preferencias alimentarias (Fuente: CAB). 5189

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Cocobolo (Andinoacara pulcher) (1) is a small fish that has sedentary habits. The males are more colorful and larger than the females, and turn a more vibrant blue in the reproductive season.

El Cocobolo (Andinoacara pulcher) (1) es un pez de tamaño pequeño y hábitos sedentarios, que se caracteriza porque los machos son más coloridos y más grandes que las hembras; acentuando su coloración azul en la época de reproducción.

In Colombia, they are found in the rivers of the Caribbean versant, including the Sinú river basin, as in the case of the Ciénaga Grande de Lorica, where it generally does not form part of the commercial fishery. However, both in the swamp as well as in the basin, it is an important component in the food chain, because it is one of the most consumed fish by large and small predators, such as Ariopsis sp. (2) and Rhamdia quelen (3), respectively. Studies in other geographical areas of the country report that the species consumes worms, crustaceans, insects and live preys (4). On the Ciénaga Grande de Lorica, The length at first maturity is 9.5 cm LT, with prolonged spawning season that extends throughout the year with partial spawning of 954 oocytes (5). The objective of this study was to determine the feeding habits of Cocobolo on the Ciénaga Grande de Lorica as a contribution to knowledge of its biology and ecology and its preservation in the environment and the management of their fishery in the floodplain and in the Sinú basin.

En Colombia, ocurre en los ríos de la vertiente del Caribe, incluyendo la cuenca del río Sinú, como es el caso de la ciénaga Grande de Lorica, en donde presenta poca participación en la pesquería comercial. Sin embargo, tanto en la ciénaga como en la cuenca es un componente importante en la cadena trófica, porque es uno de los peces más consumidos por grandes y pequeños predadores como Barbul de piedra Ariopsis sp. (2) y Liso Rhamdia quelen (3), respectivamente. Estudios realizados en otras áreas geográficas del país reportan que la especie consume gusanos, crustáceos, insectos y presas vivas (4). En la ciénaga Grande de Lorica, la talla media de madurez sexual es de 9.5 cm LT, con época de desove prolongado que se extiende durante el año con desoves parciales de 954 ovocitos (5). El objetivo de este trabajo fue estudiar los hábitos alimentarios de Cocobolo en la ciénaga Grande de Lorica como contribución al conocimiento de su biología y ecología, a su preservación en el medio natural y al ordenamiento de su pesquería en la ciénaga y en la cuenca del Sinú.

MATERIALS AND METHODS

MATERIALES Y MÉTODOS

Study area. This study took place in Ciénaga Grande de Lorica, a body of water located downstream from the Urrá dam, which has a maximum depth of 5 meters in the rainy season. Multi-year average rainfall reaches 1200 mm with a bimodal rainfall and an average temperature of 27°C from the study area to the coastal area of the Caribbean sea (6).

Área de estudio. Este trabajo se realizó en la ciénaga Grande de Lorica, cuerpo de agua ubicado aguas abajo de la represa de Urrá, el cual presenta una profundidad máxima de 5.0 metros en épocas de lluvia. La pluviosidad alcanza valores medios multianuales de 1200 mm, con un régimen bimodal de precipitaciones y la temperatura promedio es de 27°C, incluyendo desde el área de estudio hasta la zona costanera del mar Caribe (6).

Obtaining samples. Musilová et al (1) was followed for species identification. 294 individuals were captured between January and December 2005, except in March, and total length (TL) and standard length (SL) was measured to the nearest cm with a graduated measuring ictiometer (IK2, Aquatic Biotechnology, Spain) and total weight was measured (TW) with an electrical scale 5000 ± 1 g (CS 5000, Ohaus Corporation, USA). The fish were caught with hook and line and castnet, kept cool in 51 liter polyurethane coolers (Cooler Camping 2A16, Rubbermaid, USA) and were transported to the Fisheries Biology Research Laboratory-FBRL of the Universidad de Córdoba in Lorica.

Obtención de las muestras. Se siguió a Musilová et al (1) para la identificación de la especie. Se capturaron 294 individuos entre enero y diciembre 2005, excepto en marzo, y se midió longitud total (LT) y longitud estándar (LS) al cm más cercano con un ictiómetro graduado (IK2, Aquatic Biotechnology, España) y el peso total (WT) con una balanza eléctrica de 5000 ± 1 g (CS 5000, Ohaus Corporation, USA). Los peces fueron capturados con la ayuda de artes de pesca como línea de mano y atarraya, refrigerados en neveras de poliuretano de 51 litros de capacidad (Cooler Camping 2A16, Rubbermaid, USA) para

Olaya-Nieto - Feeding habits of Cocobolo in Colombia Stomach extraction. Following techniques used by Laevastu (7), the fish were dissected and different parts of the digestive tract were located. The stomach and intestines were then removed and stored in plastic bottles containing 250 ml of buffered formalin at 10%. All bottles were labelled to indicate species, sample number and date. The above mentioned information was recorded as well as the site of capture, fishing gear used, size, total weight and gutted weight. Analysis of stomach content. Stomach content was placed in a Petri dish and was examined with a stereoscope (Leica Zoom 2000, Leica Microsystems GmbH, Germany) and microscope (Leica CME, Leica Microsystems GmbH, Germany), separating, identifying and numbering the food or preys present. Identification was performed until the taxonomic level allow according to the degree of digestion of the food, organizing the information by items, preys or groups, and weighing them on an 1500 ± 0.01 g electric scale (Adventurer, Ohaus Corporation, USA). The emptiness coefficient (CV) was estimated as CV = 100* Number of empty stomachs / Total number de analyzed stomachs (8). The degree of digestion (GD) was evaluated according to the state of fresh, partially digested and digested preys (7). Three methods were used to quantify stomach contents, expressed in average monthly and annual values: frequency of occurrence (FO), numeric frequency (FN) and gravimetrics (G) (9). FO = 100* Occurrence of preys from item A/Total number of stomachs with food. FN= 100* Number of preys from item A/Total number of prey. G = 100* Weight of preys from item A/Weight of all prey. To establish the importance of each prey in the diet, the modified relative importance index (RII) was estimated (10): RII = F * G / 1OO where RII represents the relative importance index, F is the frequency of occurrence percentage and G is the weight percentage. This is expressed in a range from 0 to 100, where 0 to 10% represents trophic groups with relatively low importance, 10 to 40% as relatively important and 40 to 100% as groups of relatively high importance. The total length gut-length relation was established according to the Brusle scale (11) and food preferences were analyzed according to

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ser transportados al Laboratorio de Investigación Biológico Pesquera de la Universidad de Córdoba, ubicado en Lorica. Extracción de los estómagos. De acuerdo con las técnicas de Laevastu (7), una vez efectuada la disección de los peces, se ubicaron las diferentes partes del tubo digestivo. Luego se procedió a retirar el estómago y el intestino para conservarlos en frascos plásticos de 250 ml que contenían formol al 10% bufferado. Todos los frascos fueron rotulados, indicando la especie, número de la muestra y fecha. Se registró la información citada arriba más el sitio de captura, arte de pesca utilizao, talla, peso total y peso eviscerado. Análisis del contenido estomacal. El contenido estomacal se colocó en una caja Petri y se examinó al estereoscopio (Leica Zoom 2000, Leica Microsystems GmbH, Alemania) y microscopio (Leica CME, Leica Microsystems GmbH, Alemania), separando, identificando y enumerando el alimento o presas presentes. La identificación se efectuó hasta el nivel taxonómico permitido por el grado de digestión del alimento, ordenándose en ítems, presas o grupos, pesándose en una balanza eléctrica de 1500 ± 0.01 g (Adventurer, Ohaus Corporation, USA). El coeficiente de vacuidad (CV) se estimó con CV = 100* No. estómagos vacíos / No. total de estómagos analizados (8). El grado de digestión (GD) se evaluó de acuerdo con el estado de las presas en Fresco, Medio digerido y Digerido (7). Se utilizaron tres métodos para cuantificar el contenido estomacal, expresado en valores promedios mensuales y anuales: Frecuencia de ocurrencia (FO), Frecuencia numérica (FN) y Gravimetría (G) (9). FO = 100* Ocurrencia de presas del ítem A/No. total de estómagos con alimento FN= 100* No. de presas del ítem A/No. total de presas G = 100* Peso de las presas del ítem A/Peso de todas las presas. Para establecer la importancia de cada presa en la composición de la dieta se estimó el Índice de importancia relativa modificado (IIR) (10): IIR=F*G/1OO, en donde, IIR representa el Índice de importancia relativa, F es el porcentaje de la Frecuencia de ocurrencia y G es el porcentaje gravimétrico. Esta expresión presenta un

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the sizes of the species under study and the water cycle of Ciénaga Grande de Lorica in seven class intervals (7.5-8.5 to 13.5-14.5 cm LT) and taking into account the classification used to define the four levels of Cienaga Grande de Lorica during its annual water cycle: low waters (December, January, February), rising waters (March, April, May), high waters (June, July, August) and falling waters (September, October, November). Descriptive statistics were used, expressing variables as mean ± standard deviation, and a correlation coefficient for the intestinal lengthtotal length relationship was estimated.

RESULTS The minimum recorded size was 7.2 cm TL (March), the maximum was 14.5 cm LT (October and December) and the lowest weight was 9.1 g (March) and the highest 89.1 g (December). The frequency distribution for sizes showed a curve with ranges between 7.0 and 15.0 cm LT, and an average catch size of 10.7 cm LT (n=294) that indicates that 17.3% of individuals were caught below the length at first maturity for both sexes as estimated by Olaya-Nieto et al (5), presenting sexual dimorphism in size given that males are larger than females. The frequency distribution for weight showed ranges between 10.0 and 90.0 g, an average weight of 30.0 g and modal frequency at 20.0 g. 39.8% of stomachs studied were empty, especially in the months of March (100.0%), November (70.0%), December (64.3%), February (56.5%) and April (50.0%), where the maximum values were reached. 47.1% of food consumed was fresh, 29.8% half-digested and 23.1% digested. As shown in figure 1, fresh prey was found in almost every month except March, when all stomachs were empty (CV=100%), reaching highest monthly values except in

Figure 1. Degree of monthly digestion.

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rango de 0 a 100, en donde el rango de 0 a 10% representa grupos tróficos de importancia relativa baja, de 10 a 40% grupos de importancia relativa secundaria y 40 a 100% grupos de importancia relativa alta. Se estableció la relación longitud intestinallongitud total de acuerdo con la escala de Brusle (11), y se analizaron las preferencias alimentarias de acuerdo con las tallas que presenta la especie en estudio y con el ciclo hidrológico de la ciénaga Grande de Lorica, conformándose siete intervalos de clase (7.5-8.5 a 13.5–14.5 cm LT) y teniendo en cuenta la clasificación utilizada para definir los cuatro niveles de la ciénaga Grande de Lorica durante su ciclo hidrológico anual: aguas bajas (diciembre, enero, febrero), aguas ascendentes (marzo, abril, mayo), aguas altas (junio, julio, agosto) y aguas descendentes (septiembre, octubre, noviembre). Se utilizó estadística descriptiva, expresando las variables como media ± desviación estándar y se estimó el coeficiente de correlación a la relación longitud intestinal-longitud total.

RESULTADOS La talla mínima registrada fue de 7.2 cm LT (marzo), la máxima de 14.5 cm LT (octubre y diciembre); mientras que el menor peso fue de 9.1 g (marzo) y el mayor de 89.1 g (diciembre). La distribución de frecuencias de tallas presentó una curva con rangos entre 7.0 y 15.0 cm LT, con talla media de captura de 10.7 cm LT (n =294), lo que indica que el 17.3% de los individuos fueron capturados por debajo de la talla media de madurez para sexos combinados estimada por Olaya-Nieto et al (5), observándose dimorfismo sexual a la talla, puesto que los machos son más grandes que las hembras. La distribución de frecuencias de pesos mostró rangos entre 10.0 y 90.0 g, peso promedio de 30.0 g y frecuencia modal de 20.0 g. Del total de estómagos estudiados, el 39.8% se encontró vacío, destacándose los meses de marzo (100.0%), noviembre (70.0%), diciembre (64.3%), febrero (56.5%) y abril (50.0%), en donde alcanzó sus máximos valores. El 47.1% del alimento consumido estaba en estado fresco, 29.8% medio digerido y 23.1% digerido. Como se observa en la figura 1,las presas en estado fresco se encontraron en casi todos los meses, excepto marzo en donde todos los estómagos estaban vacíos (CV =100%), alcanzando los mayores valores mensuales con excepción de enero (52.4%) y septiembre (36.1%), donde el estado medio digerido fue el principal. Se destaca

Olaya-Nieto - Feeding habits of Cocobolo in Colombia January (52.4%) and September (36.1%), where the predominant state was half-digested prey. It is noteworthy that in November there was an absence of half-digested (0.0%) and digested states (0.0%). Five prey or food groups were identified: vegetable remains, fishes, detritus, insects and other types, which showed the following annual frequency occurrence: vegetable remains(63.8%) was the most common; fishes (62.7%) including scales, spines and fins; detritus (43.5%); insects (14.1%) including Hymenoptera, insect rest and Hymenoptera eggs and other types (3.4%), including snails, worms and nylon. Vegetable remains and rest of fishes were present in every month of the year except March, while detritus was found in every month except March and November, insects were absent in July and November and other types were present in January, May, August and October. The most abundant item or group was rest of fishes (34.7%), which was present every month, followed by vegetable remains (32.7%), detritus (23.1%), insects (7.8%) and other types (1.7%). As in the frequency of occurrence, almost all these items were found throughout the year except in November, when no detritus, insects or other types were found. In greater detail, vegetable remains was more abundant in five months of the study, especially in July (48.8%) and November (60.0%); rest of fishes were more abundant in six months of the year, mainly in May (50.0%); and detritus was more abundant in September (30.6%) on par with vegetable remains. Vegetable remains (33.5%) was the most food group with greatest weight composition, followed by detritus (32.8%), rest of fishes (22.3%), insects (8.3%) and other types (3.1%); being the main food in four months of the year: July (58.7%), October (59.5%), November (86.0%) and December (44.9%), while detritus was greater in January, June, August and September (Figure 2).

la ausencia de los estados medio digerido (0.0%) y digerido (0.0%) en noviemre. Se identificaron cinco presas o grupos alimentarios: Material vegetal, peces, detritos, insectos y otros, los cuales mostraron la siguiente Frecuencia de ocurrencia anual: Material vegetal (63.8%), el más frecuente; peces (62.7%), constituido por escamas, espinas y aletas; detritos (43.5%); insectos (14.1%), conformado por Hymenoptera, restos de insectos y huevos de Hymenoptera y otros (3.4%), compuesto por caracol, lombriz y nailon. Material vegetal y restos de peces estuvieron presentes en todos los meses del año, excepto marzo; mientras que detritos se encontró en todos los meses excepto marzo y noviembre; insectos ausente en julio y noviembre y otros, presente en enero, mayo, agosto y octubre. Restos de peces fue el ítem o grupo más abundante o numeroso (34.7%), presente en todos los meses del año, seguido por material vegetal (32.7%), detritos (23.1%), insectos (7.8%) y otros (1.7%). Al igual que en la Frecuencia de ocurrencia, se encontró a casi todos los ítems presentes durante el año de estudio, con la excepción de noviembre en donde no se encontró detritos, ni insectos, ni otros.. A nivel más detallado, material vegetal fue el más abundante en cinco meses del año de estudio, especialmente en julio (48.8%) y noviembre (60.0%); restos de peces fue el más numeroso en seis meses del año, principalmente en mayo (50.0%); y detritos lo fue en septiembre (30.6%) a la par con Material vegetal. Material vegetal (33.5%) fue el grupo alimentario con mayor composición en peso, seguido por detritos (32.8%), restos de peces (22.3%), insectos (8.3%) y otros (3.1%); siendo el

The gut length-total length relationship (LI-LT) is estimated at 1.1, which places the species as omnivorous according to the scale proposed by Brusle (11). The correlation between the size of the gut and fish size (r = 0.53) is significant at 95% confidence according to the critical values for the correlation coefficients. Analyzing food preferences in relation to size, in only three of the intervals (8.5-9.5, 9.5-10.5 and 10.5-11.5 cm LT) consumption of the five food groups (Vegatable remains, rest of fishes,

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Figure 2. Composition by weight of prey.

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detritus, insects and other types) was found, while at intervals (7.5-8.5, 11.5-12.5 and 12.513.5) other groups were not observed and in the (13.5-14.5) range vegetable remains was not found.

DISCUSSION The emptiness coefficient estimated in this study (39.8%) is higher than reported for yellow Mojarra Caquetaia kraussii (29.2%), from the Cichlidae family in the Urrá dam (12), and which is high for a species that can be considered omnivorous due to the wide trophic spectrum presented. However, this ratio is within the range reported for other cichlids in different areas of South America such as in the Rodo Lake (Uruguay), where Cichlasoma facetum and Gymnogeophagus rhabdotus reached 35.0 and 49.0%, respectively (13). As for the occurrence of different food groups, similarity was found in the variety but not to the extent shown in this work. Atencio-Garcia et al (12) observed that Caquetaia kraussii fish showed the highest occurrence (87.1%) while vegetable remains, other types and insects barely reached 11.3, 6.5 and 1.6%, respectively. In Venezuela, the most frequent groups for A. pulcher and A. coerulopunctatus were vegetable remains (94.0 and 95.0%), detritus (90.0 and 64.0%), insect larvae (72.0 and 73.0%), Coleoptera (26.2 and 32.3%) and Copepoda (21.2 and 25.6%) (14). While, the occurrence of major food groups in Geophagus brasiliensis (Cichlidae) in the Capivari Reservoir in Brazil was fruits and seeds (22.7%), detritus (17.9%), rest of fishes (10.7%), Cladocera (7.0%), Copepoda (6.1%), Trichoptera (3.9%) and Chironomidae (3.9%) (15). The abundance of prey found in this work is very different to that reported by other authors for the Cichlidae family in other geographical areas of Colombia and the rest of South America. Fish (83.3%), insects (1.4%), vegetable remains (9.7%) and others (5.6%) were the largest groups in the diet of Caquetaia kraussii (12). As for composition by weight, fish (95.3%), insects (1.1%), vegetable remains (3.5%) and others (0.1%) were the most important groups in the diet of Caquetaia kraussii (12). Here similarity was not observed between the proportion of trophic groups in the diets of different species, as happened with the frequency of occurrence and numerical frequency. According to the data obtained in this study, the relative importance index indicates that vegetables rest (21.4%), rest of fishes (14.0%) and detritus (14.3%) have secondary relative importance as food groups, while insects (1.2%) and other types

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alimento principal en cuatro meses del año: julio (58.7%), octubre (59.5%), noviembre (86.0%) y diciembre (44.9 %), mientras que detritos lo fue en enero, junio, agosto y septiembre (Figura 2). La relación longitud intestinal-longitud total (LI-LT) se estimó en 1.1, lo que ubica a la especie como omnívora, de acuerdo con la escala propuesta por Brusle (11). La correlación entre el tamaño del intestino y la talla del pez (r =0.53) es significativa al 95% de confianza de acuerdo con los valores críticos para los coeficientes de correlación. Analizando las preferencias alimentarias con respecto a la talla, en sólo tres de los intervalos (8.5-9.5, 9.5-10.5 y 10.5-11.5 cm LT) se encontró el consumo de los cinco grupos alimentarios (material vegetal, resto de peces, detritos, insectos y otros), mientras que en los intervalos (7.5-8.5, 11.5-12.5 y 12.5-13.5) no se observó el grupo otros y en el intervalo (13.5-14.5) no se encontró material vegetal.

DISCUSIÓN El coeficiente de Vacuidad estimado en este trabajo (39.8%) es mayor al reportado para la Mojarra amarilla Caquetaia kraussii (29.2%), especie de la familia Cichlidae en el embalse de Urrá (12), siendo alto para una especie que se puede considerar omnívora debido al amplio espectro trófico que presenta. Sin embargo, este coeficiente se encuentra dentro del rango reportado para otros cíclidos en diferentes áreas de América del Sur como en el lago Rodó (Uruguay), en donde en Cichlasoma facetum y Gymnogeophagus rhabdotus alcanzaron el 35.0 y 49.0%, respectivamente (13). En cuanto a la ocurrencia de los diferentes grupos alimentarios, se encontró similitud en la variedad de ellos pero no en la proporción arrojada por este trabajo. Atencio-García et al (12) observaron que en Caquetaia kraussii peces mostró la mayor ocurrencia (87.1%), mientras que restos vegetales, otros e insectos apenas alcanzaron 11.3, 6.5 y 1.6%, respectivamente. En A. pulcher y A. coerulopunctatus, en Venezuela, material vegetal (94.0 y 95.0%), detritos (90.0 y 64.0%), larvas de insectos (72.0 y 73.0%), Coleoptera (26.2 y 32.3%) y Copepoda (21.2 y 25.6%), fueron los grupos más frecuentes (14). En tanto que la ocurrencia de los principales grupos alimentarios en Geophagus brasiliensis (Cichlidae) en el embalse de Capivari en Brasil, fue: frutas y semillas (22.7%), detritos (17.9%), restos de peces (10.7%), Cladocera (7.0%), Copepoda (6.1%), Trichoptera (3.9%) y Chironomidae (3.9%), (15).

Olaya-Nieto - Feeding habits of Cocobolo in Colombia (0.1%) are circumstantial or incidental prey and have low relative importance. Analyzing the different analysis methods of stomach contents in this work, frequency of occurrence, numerical frequency, gravimetry, as well as the relative importance index (Table 1) shows that the food groups most consumed by Cocobolo are Table 1. Annual values of frequency of occurrence (O), numeric frequency (FN), Gravimetry (G) and Index of relative importance of prey in the stomach of Cocobolo in Ciénaga Grande de Lorica. Feeding groups

FO (%)

FN (%)

G (%)

IIR (%)

Vegetable remains

63.8

32.7

33.5

21.4

Rest of fishes

62.7

34.7

22.3

14.0

Detritus

43.5

23.1

32.8

14.3

Insects

14.1

7.8

8.3

1.2

Others

3.4

1.7

3.1

0.1

100.0

Total

vegetable remains, rest of fishes and detritus, with an omnivorous diet, preferring fishes and vegetable remains. Rojas et al (14) reported an omnivorous diet both for the species under study as well as A. coeruleopunctatus due to consumption of different resources such as phytoplankton, zooplankton, fish, crustacea, insects (Hemiptera, Odonata and Ephemeroptera) and seeds. Therefore, taking into account issues raised by different authors, agreement is reached about eating habits but not concerning the main feed (12, 14-15). It is observed that in low and rising waters, early and mid-year, the most consumed prey was

Figure 3. Feeding preferences of Cocobolo and the water cycle in Ciénaga Grande de Lorica.

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La abundancia de presas encontrada en este trabajo es muy diferente a la reportada por otros autores para la familia Cichlidae en otras áreas geográficas de Colombia y en el resto de Suramérica. Peces (83.3%), insectos (1.4%), restos vegetales (9.7%) y otros (5.6%) fueron los grupos más numerosos en la dieta de Caquetaia kraussii (12). En cuanto a la composición en peso, peces (95.3%), insectos (1.1%), restos vegetales (3.5%) y otros (0.1%) fueron los grupos más importantes en la dieta de Caquetaia kraussii (12). Aquí tampoco se observó similitud entre la proporción de grupos tróficos en las dietas de las diferentes especies, tal y como sucedió con la Frecuencia de ocurrencia y la Frecuencia numérica. De acuerdo con los datos obtenidos en este trabajo, el Índice de importancia relativa indica que material vegetal (21.4%), restos de peces (14.0%) y detritos (14.3%) son grupos alimentarios de importancia relativa secundaria; mientras que insectos (1.2%) y otros (0.1%) son presas circunstanciales o incidentales y de baja importancia relativa. Analizando los diferentes métodos de análisis del contenido estomacal utilizados en este trabajo, Frecuencia de ocurrencia, Frecuencia numérica, Gravimetría, además del Índice de importancia relativa (Tabla 1), se observa que los grupos alimentarios más consumidos por el Cocobolo son material vegetal, restos de peces y detritos, y se infiere que su dieta es omnívora, con preferencia por peces y material vegetal. Rojas et al (14), reportaron una dieta omnívora tanto para la especie en estudio como para A. coeruleopunctatus debido al consumo de diferentes recursos, como fitoplancton, zooplancton, peces, crustacea, insectos (Hemiptera, Odonata y Ephemeroptera) y semillas. Por tanto, hay concordancia en torno al hábito alimentario, pero no con el alimento principal, teniendo en cuenta lo planteado por diferentes autores (12, 14-15). Se observó que en aguas bajas y en aguas ascendentes, principios y mediados del año, peces fue la presa más consumida, seguida por material vegetal y detritos, respectivamente; mientras que en aguas altas y aguas descendentes, tercer y cuarto trimestres del año, fueron material vegetal y peces los grupos tróficos más consumidos (Figura 3). La flexibilidad de los hábitos alimentarios es una característica adaptativa del comportamiento animal, una vez que los ambientes naturales varían espacial o temporalmente, y los peces responden a la baja disponibilidad de alimento alterando su comportamiento (16). La mayoría de las especies de peces parecen experimentar un aumento de

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fish, followed by vegetable remains and detritus, respectively. In high and falling waters, third and fourth quarters of the year, vegetable remains and fish were the most consumed trophic groups (Figure 3). Flexible feeding habits are an adaptive feature of animal behavior when the natural environment varies spatially or temporarily, and fish respond to low food availability by altering their behavior (16). Most fish species seem to experience increased competition in shallow waters, which may be a consequence of reduced volumes of water or because flood areas, which provide food and cover in high waters, are not accessible (17), which leads many species to change their feeding preferences during the water cycle (18), as observed in this study. The results of this study suggest that the Cocobolo has omnivorous feeding habits and a tendency to consume fishes and vegetable remains.

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la competencia en aguas bajas, lo cual puede ser una consecuencia de la reducción del volumen de agua, o que el bosque de inundación, que ofrece alimento y cobertura en el período de aguas altas, no sea accesible (17), por lo que muchas especies también cambian sus preferencias nutricionales durante el ciclo hidrológico (18), tal y como se observó en este trabajo. Los resultados alcanzados en este estudio sugieren que el Cocobolo es un pez de hábitos alimentarios omnívoros con tendencia a consumir peces y material vegetal. Agradecimientos A los pescadores y comercializadores de pescado de la ciénaga Grande de Lorica, cuenca baja del río Sinú, y a la Universidad de Córdoba por la financiación recibida.

Acknowledgments To fishermen and fish traders in Ciénaga Grande de Lorica, lower basin of the Sinú River, and the University of Córdoba for funding received.

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5198-5210, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Supplementation with humic substances affects the innate immunity in layer hens in posfasting phase El suplemento de sustancias húmicas afecta la inmunidad innata en gallinas ponedoras en fase posmuda Rosa Sanmiguel P,1* M.Sc, Iang Rondón B,2 M.Sc. 1Universidad

Cooperativa de Colombia, Faculty of Veterinary and Zootechnical Sciences, Laboratory of Morphophysiology, IMPRONTA Research Group. Calle 14 número 107-59, barrio El Salado, Ibagué, Colombia. 2Universidad del Tolima, Faculty of Veterinary and Zootechnical Sciences, Veterinary Diagnostics Laboratory, Inmuno-biology and Pathogenesis Research Group - GIP. Bloque 33 L105, barrio Santa Helena, Ibagué, Colombia. *Correspondence: rosa.sanmiguel@campusucc.edu.co Received: July 2014; Accepted: February 2015.

ABSTRACT Objective. Asses the effect of supplementation with Humic substances (HS) over some innate immunity parameters (serum bactericidal activity, phagocytosis, bacterial agglutination, respiratory burst and lisozyme activity) in phase after fasting of layer hens. Materials and methods. 120 posfasting phase Hy Line Brown layer hens were taken which were distributed into four groups: The first and the second were supplemented with 0.1 and 0.2% of HS, respectively. The third group was supplemented with 0.25 mg/kg on levamisole hydrochloride and fourth group have no supplementation; during sixty days period. Blood samples were collected on 8th, 30th and 60th of experiment day. Results. The phagocytic index and respiratory burst increased significantly at day 30th in HS supplemented groups. Alike, serum bactericidal activity and lisozyme activity improved on 8 th day, nevertheless, changes were no evident latter. The bacterial agglutination was high in supplemented groups evaluated at everyone times. Conclusions. Results showed that HS behave as immunostimulant in the early phase after fasting layer hens. Key words: Agglutination, bactericide activity, Lisozyme, phagocytosis (Source: DeCS).

RESUMEN Objetivo. Evaluar el efecto de las sustancias húmicas (SH) sobre algunos parámetros de la inmunidad innata (actividad bactericida del suero, fagocitosis, aglutinación bacteriana, explosión respiratoria y actividad de la lisozima) en la fase posmuda de gallinas ponedoras. Materiales y métodos. Se utilizaron 120 gallinas ponedoras Hy Line Brown en la fase de posmuda, las cuales fueron divididas en cuatro grupos: Los dos primeros fueron suplementados con 0.1 y 0.2% de SH respectivamente, el tercer grupo fue suplementado con 0.25 mg/kg de Clorhidrato de levamisol y el cuarto grupo control sin suplemento; durante un período de 60 días. Las muestras sanguíneas se tomaron los días 8, 30 y 60 del experimento. Resultados. El Índice fagocítico y la explosión respiratoria se incrementaron significativamente a partir del día 30 de suplementación con SH. De la misma manera, la actividad bactericida del suero y la actividad de la lisozima aumentaron al día 8; no obstante no se evidenciaron cambios posteriores. La aglutinación bacteriana fue significativamente mayor en los grupos suplementados en todos los tiempos evaluados. Conclusiones. Los resultados demuestran que las SH se comportan como agentes inmunoestimulantes en la fase temprana de la posmuda en gallinas ponedoras Hy Line Brown. Palabras clave: Actividad bactericida, aglutinación, fagocitosis, lisozima (Fuente: DeCS). 5198

Sanmiguel - Humic substances in innate immunity of layer hens

5199

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

During an infection the immune response, whether innate or adaptive, requires an expenditure of energy that can interfere with the production capacity of susceptible animals. Traditionally, handling infectious problems also includes reducing risk factors associated with infection, and pharmacological treatment has mainly been through the use of antibiotics, with the subsequent development of resistance that has been reported (1) coupled with a limited number of new molecules. Additionally, it has been shown that the use of antibiotics can have deleterious effects on the immune response (2). For this reason, we have opted for strategies that increase the immune response of animals against infectious challenges in the environment rather than directly attacking the agent. Thus, there has been a growing use of immunostimulant or immunomodulatory substances that have had a positive impact on the immunological parameters, minimizing the negative effects from an economic, productive and environmental standpoint (3).

Los mecanismos de la respuesta inmune, innata o adaptativa durante una infección demandan un gasto energético que puede interferir con la capacidad productiva de animales susceptibles. Tradicionalmente, el abordaje de los problemas infecciosos incluye, además, de la disminución de los factores de riesgo asociados a la infección, la terapéutica farmacológica principalmente mediante el uso de antibióticos, frente a lo cual ha sido reportado el desarrollo de resistencia (1) aunado a un limitado número de nuevas moléculas. Adicionalmente, se ha demostrado que el uso de antibióticos puede tener efectos deletéreos sobre la respuesta inmune (2). Por esta razón, se ha optado por estrategias que incrementen la capacidad de respuesta inmune de los animales frente a un desafío infeccioso en el medio, más que atacar directamente al agente. Así, ha venido en crecimiento el uso de sustancias inmunoestimulantes o inmunomoduladoras, las cuales impactan positivamente los parámetros inmunológicos; minimizando los efectos negativos desde el punto de vista económico, productivo y medioambiental (3).

In birds, several studies report the use of immunostimulatory substances, including levamisole, probiotics, prebiotics, bursa of Fabricius and thymus extract, vaccine products (3-5).

En aves, existen diversos trabajos que reportan el uso de inmunoestimulantes e incluyen levamisol, probióticos, prebióticos, extracto de bursa de fabricio y timo, productos vacunales (3-5)

Humic substances (SH) are the end product of the biotransformation of organic matter, among which the most common are humic and fulvic acids and melanin (6). Although these substances are not reported in the tables of additives in animal diets, some studies show that they have an important potential to promote growth in broilers and laying hens (7). This could improve productive performance, carcass traits and egg quality. This can even be observed in the final stage of the production cycle, when physiologically a decrease in production and product quality occurs, effects that are diminished when the diet is supplemented with SH (8,9).

Las sustancias húmicas (SH) son el producto final de la biotransformación de la materia orgánica, entre las cuales las más comunes son los ácidos húmicos, fúlvicos y húmicomelánicos (6). Aunque estas sustancias no se reportan en las tablas de aditivos para el diseño de dietas animales, algunos estudios demuestran que éstas tienen un potencial importante como promotores de crecimiento en pollos de engorde y en gallinas ponedoras (7). Este hecho podría mejorar el desempeño productivo, las características de la carcasa y de la calidad de los huevos. Lo anterior puede ser observado, incluso, en la etapa final del ciclo productivo donde fisiológicamente se genera una disminución en la producción y en la calidad del producto, efectos que se menguan suplementando la dieta con SH (8,9).

In the poultry industry there are different methods to extend the productive life of laying hens; a common one is inducing molt (10). The most common methods is the conventional molt program through prolonged fasting with weight loss that leads to a goal weight obtained at 18 weeks. After a complete cessation of egg production for at least 2 weeks, an improved production is achieved, since the laying is improved, as well as egg and shell quality (11). However, these conditions significantly reduce fertility and hatchability in breeding hens (12).

En la industria avícola existen diferentes métodos para extender la vida productiva de las gallinas ponedoras, siendo común la inducción de la muda (10). El más común de estos métodos es el programa de muda convencional mediante ayuno prolongado con pérdida de peso que las lleve al peso obtenido a las 18 semanas de vida. Después de un cese total de la producción de huevos durante al menos 2 semanas se logra una mejor producción, ya que se mejora el porcentaje de postura, la calidad del huevo y de la cáscara (11). No obstante, bajo estas condiciones disminuye

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It has been reported that the stressful nature of molting adversely affects immune response and, in contrast, that the immune response adversely affects molting (13). In this regard, to the extent that stress generated by molting increases adrenal corticosteroids plasma levels, the immune system decreases its effectiveness by reducing the total leukocyte count and the different cellular and antibody responses (13,14). It is also noteworthy that growth performance depends on factors such as nutritional status, health status and immune performance. However, despite the existence of reports on the effects of SH on some production parameters, its effect on the immune response in different phases of production is unknown. This study evaluated the effect of dietary supplementation with 0.1 and 0.2% humic acids on some parameters of innate immunity (serum bactericidal activity, phagocytic index, bacterial agglutination, respiratory burst, lysozyme activity) in commercial laying hens in the post-molt phase.

MATERIALS AND METHODS Experimental conditions. This study was conducted in installations for laying hens on the experimental farm of the Universidad Cooperativa de Colombia in El Salado, Ibague, Colombia, 03°24”N74°56”. The average temperature in the study area was 28.2°C. Ethical aspects. The experiment was carried out under regulations for animal production and welfare endorsed by the Committee on Bioethics of the Universidad de Tolima under the central investigation committee. To conduct this study, the corresponding authorization from the Ethics Committee for Research of the Universidad de Tolima was requested, and a minimum statistical sample of birds (120) was used with 95% confidence, and breeding and sample taking was performed by expert staff to minimize the stress caused by the experiment. Experimental animals. According to the formula of finite populations, 120 clinically healthy Hy Line Brown laying hens in post-molt phase were used, which had been previously vaccinated against Gumboro (Lukert strain), Infectious Viral Bronchitis (Massachusetts strain) and New Castle (B1 strain) from the Laverlam laboratory. The hens were kept on a raised floor, were moved to cage at 16 weeks and underwent traditional molt with prolonged fasting for 12 days and received 5g of calcium carbonate supplements per bird during fasting.

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significativamente la fertilidad y la eclosionabilidad en gallinas reproductoras (12). Se ha reportado que la naturaleza estresante de la muda afecta negativamente la respuesta inmune y, en contraposición, la respuesta inmune afecta negativamente la muda (13). En este sentido, en la medida que el estrés generado por la muda incrementa los niveles de corticoides adrenales plasmáticos, el sistema inmune disminuye su efectividad reduciendo el conteo total de leucocitos y sus diferentes respuestas humorales y celulares (13,14). También es de resaltar que los parámetros productivos de las aves dependen de factores tales como el estado nutricional, estado sanitario y el desempeño inmunológico. No obstante, a pesar de existir reportes acerca del efecto de las SH sobre algunos parámetros productivos, se desconoce su efecto sobre la respuesta inmune en las diferentes fases de producción. La presente investigación evaluó el efecto de la suplementación de la dieta con 0.1 y 0.2% de ácidos húmicos sobre algunos parámetros de la inmunidad innata (actividad bactericida del suero, índice fagocítico, aglutinación bacteriana, explosión respiratoria, actividad de la lisozima) en gallinas ponedoras comerciales en la fase de posmuda.

MATERIALES Y MÉTODOS Condiciones experimentales. Este estudio fue realizado en las instalaciones de gallinas ponedoras enjauladas de la granja experimental de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede El Salado, Ibagué, Colombia, 03°24″N74°56″. La temperatura promedio del área de estudio fue de 28.2°C. Aspectos éticos. El experimento fue realizado bajo la normatividad tanto en producción animal como en bienestar de los mismos, avalado por el comité de Bioética de la Universidad del Tolima adscrito al comité central de investigaciones. Para el desarrollo de este proyecto se solicitó la autorización correspondiente al Comité de ética de Investigaciones de la Universidad del Tolima, en la cual se sustentó una mínima muestra estadística necesaria de aves (120 aves) con 95% de confianza y se realizó un procedimiento de cría y toma de muestras refinado con personal experto que minimice el estrés ocasionado por el experimento. Animales experimentales. De acuerdo con la fórmula de poblaciones finitas se tomaron 120 gallinas ponedoras Hy line brown en fase de producción posmuda, clínicamente sanas, las cuales se vacunaron previamente contra Gumboro (cepa Lukert), Bronquitis Viral infecciosa (cepa Massachussetts) y New Castle (cepa B1) del laboratorio Laverlam. Las gallinas se mantuvieron levantadas en piso, trasladadas a Jaula

Sanmiguel - Humic substances in innate immunity of layer hens Humic substances. Humic substances subjected to the experiment were obtained from the biotransformation of cachaza, a product of sugarcane and alcohol. This underwent a biotechnological process to transform and stabilize organic matter (80% of humic acids) to obtain a pH of 6.4, density of 0.73g/cm3, maximum humidity of 12.32%, and 62.45% ash. This product was supplied by PBA Biotechnology Products. Experimental design. A completely randomized design was used where 120 chickens were divided into four groups for eight weeks in the post-molting phase. Two treatments were supplemented with humic substances (0.1 to 0.2%), and a positive control group was supplemented with levamisole (levamisole hydrochloride 4%) administered in drinking water at a concentration of 0.25 mg/kg day, as well as a negative control group without diet supplements. In each treatment there were 10 experimental units (EU), each comprising 3 hens placed in individual cages of 20 cm x 40 cm x 30 cm in a three level pyramidal module. In all cases the water was supplied automatically ad libitum. Day zero for the experiment was the first postmolt day, once production dropped to 0% feed consumption was started. Blood samples for the corresponding hematologic and innate immunity tests were taken on day 8, 30 and 60 of the experiment. Sample collection. Hens were immobilized by trained staff to obtain blood samples by puncturing the metatarsal vein after disinfecting the area with 70% ethyl alcohol. Disposable syringes, 1 ml 27G x ½, were used. The collection was made in microtubes 1.5 ml with EDTA and dry microtubes (0.3 and 0.7 ml of blood respectively). The phagocytic index and respiratory burst response of white blood cells was evaluated in the blood collected in microtubes with EDTA. The blood collected in microtubes was dry centrifuged at 5000 g for 5 minutes, the serum was grouped according to each experimental unit to evaluate bactericidal activity, lysozyme, and bacterial agglutination. Phagocytic activity test. Whole blood was kept at room temperature and diluted 1:20 in a Hanks Balanced Salt Solution (reference 14175079; Gibco/Invitrogen) with 1% NaCl. Then 60 ul of the dilution was placed in a chamber slide (LabTekII Chamber Slide, 8 wells) along with 250 ul of a E. coli suspension of avian origin to an optical density of 0.80 (1 x 108 CFU). The micro preparation was done in duplicate and incubated for 15 minutes at 40.5ºC. The phagocytic

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a las 16 semanas y sometidas a régimen de muda tradicional con ayuno prolongado durante 12 días y suplementadas con 5 g de carbonato de calcio por ave durante el ayuno. Sustancias húmicas. Las sustancias húmicas sometidas al experimento se obtuvieron de la biotransformación de la cachaza, hoja y vinaza de la producción de azúcar y alcohol. Estos insumos se sometieron a un proceso biotecnológico de transformación y estabilización de la materia orgánica (80% de ácidos húmicos), obteniendo un pH de 6.4, densidad de 0.73g/cm3, humedad máxima de 12.32% y 62.45% de cenizas. Este producto fue suministrado por el ingenio PBA Productos Biotecnológicos. Diseño experimental. Fue realizado un diseño completamente al azar donde 120 gallinas se distribuyeron en cuatro grupos durante ocho semanas en la fase posmuda. Dos tratamientos suplementados con sustancias húmicas (0.1 y 0.2%), un grupo control positivo suplementado con levamisol (Clorhidrato de levamisol al 4%) en el agua de bebida a una concentración de 0.25 mg/kg día y un grupo control negativo sin suplementación en la dieta. En cada tratamiento hubo 10 unidades experimentales (UE) conformadas cada una por 3 gallinas ubicadas en jaulas individuales de 20 cm x 40 cm x 30 cm, en módulo piramidal de tres niveles. En todos los casos el agua se suministró ad libitum con bebedero automático. El día cero para el experimento fue el primer día posmuda en el cual se inició el consumo de alimento una vez la producción bajó al 0%. Las muestras sanguíneas para realizar las correspondientes pruebas hematológicas y de inmunidad innata se tomaron en el día 8, 30 y 60 del experimento. Colecta de muestras. Las gallinas fueron inmovilizadas por personal capacitado para obtener las muestras sanguíneas mediante punción en la vena metatarsiana, previa desinfección del área con alcohol etílico al 70%. Para ello, se utilizaron jeringas estériles desechables de 1 ml, 27 G x ½. La colecta se realizó en microtubos de 1.5 ml con EDTA y microtubos secos (0.3 y 0.7 ml de sangre respectivamente). De la sangre colectada en los microtubos con EDTA se evaluó la respuesta del índice fagocítico y de la explosión respiratoria de las células sanguíneas blancas. La sangre colectada en los microtubos secos se centrifugó a 5000 g durante 5 minutos, se extrajo el suero sanguíneo agrupándose según cada unidad experimental para evaluar la actividad bactericida, de la lisozima y la aglutinación bacteriana. Prueba de actividad fagocitaria. La sangre entera fue mantenida a temperatura ambiente y diluida 1:20 en Solución Salina balanceada de Hanks (referencia 14175079; Gibco/Invitrogen)

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process was stopped by cooling on iced sheets as described by Millet et al (15). It was washed with Hanks saline solution in each chamber and then they were fixed with 300 µl of methanol (99.9% pure) on ice for 5 min, stained with Hemacolor and at least 100 cells per chamber were counted as suggested by Millet et al (15). The results were interpreted as a phagocytic index (IF): Percentage of heterophiles containing bacteria X the average number of bacteria that have been ingested by heterophiles (16). Respiratory burst test. It was performed following the spectrophotometric method described by Mohanty & Sahoo (17). Briefly, 50 µl of blood was placed in a vial with 50 µl of nitro blue tetrazolium (NBT tablet) 0.2% and incubated for 30 minutes at 25°C. Then 1 ml of NN-dimethylformamide was added at 99.8% (reference 161785) to solubilize the reduced formazan and this mixture was centrifuged at 2000 x g for 5 minutes. Then 200 µl of the supernatant was taken in duplicate and plated in a U bottom multiwell plate to read the optical density in an ELISA plate reader at 650 nm. 200 µl of NN-dimethyl formamide was used as a target. Lysozyme activity test. For this test, a bacterial suspension of Micrococcus luteus (lisodeikticus) ATCC 4698 (Reference M3770; Sigma Aldrich, Germany) was prepared to an optical density of 0.60 (1 X 108 CFU). In a multiwell plate with 96 wells 20 µl of serum from the pool of each experimental unit was placed and 180 µl of suspension was added. Reading was performed using a spectrophotometer with a 650 nm filter and was repeated after 10 minutes of incubation at room temperature (15). Bacterial agglutination test. A 1:2 serial dilution was performed with 25 µl of serum to equal volumes of PBS and 25 µl of E. coli solution (108 cells/ml) that was previously inactivated with formalin in a multiwell U bottom plate. The plates were incubated during the night at room temperature and titers were calculated as the reciprocal of the serum dilution that had the highest complete agglutination of the bacterial cells (18). Serum bactericidal activity test. This test was performed using the technique described by Low and Sin (19). Briefly, blood was collected without anticoagulant and kept at room temperature for one hour. Subsequently, it was centrifuged at 2500 g for 5 minutes and the supernatant serum was removed. A bacterial suspension in PBS was prepared from E. coli of avian origin to an optical density of 0.80, which was diluted 1:10 3 times serially.

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con 1% de NaCl. Luego, 60 µl de la dilución fueron depositados en un portaobjetos con cámara (Lab-TekII Chamber Slide, 8 wells), adicionándose 250 µl de una suspensión de E. coli de origen aviar a una densidad óptica de 0.80 (1 x 108 UFC). El micropreparado se hizo por duplicado y fue incubado durante 15 minutos a 40.5ºC. El proceso de fagocitosis fue detenido mediante enfriamiento de las láminas sobre hielo según lo descrito por Millet et al (15). Se realizó un lavado con Solución Salina balanceada de Hanks en cada cámara, luego fueron fijadas con 300 µl de Metanol (99.9% de pureza) sobre hielo durante 5 minutos, se realizó tinción con Hemacolor y se contaron al menos 100 células por cámara, según lo sugerido por Millet et al (15). Los resultados se interpretaron como el índice fagocítico (IF): Porcentaje de heterófilos que contiene bacterias X el número promedio de bacterias que han sido ingeridas por los heterófilos (16). Prueba de explosión respiratoria. Se realizó siguiendo la técnica espectrofotométrica descrita por Mohanty & Sahoo (17). Brevemente, se dispusieron de 50 µl de sangre en un vial con 50 µl de Nitroblue tetrazolium (NBT Tablet) 0.2% y se incubó durante 30 minutos a 25ºC. Luego se adicionó 1 ml de NNdimetil formamida al 99.8% (referencia 161785) para solubilizar el formazán reducido y esta mezcla se centrifugó a 2000 x g durante 5 minutos. Se tomaron 200 µl del sobrenadante por duplicado y se depositó en una placa multipozos de fondo en U para la lectura de la densidad óptica mediante lector de placas de ELISA a 650 nm. Como blanco se utilizaron 200 µl de NN-dimetil formamida. Prueba de actividad de la lisozima. Para esta prueba, se preparó una suspensión bacteriana de Micrococcus luteus (lisodeikticus) ATCC 4698 (referencia M3770; Sigma Aldrich, Alemania) a una densidad óptica de 0.60 (1 X 108 UFC). En una placa multipozos de 96 pozos se colocaron 20 µL de suero sanguíneo provenientes del pool de cada unidad experimental y se adicionaron 180 µl de la suspensión. Se realizó la lectura en un espectrofotómetro con filtro de 650 nm y se repitió a los 10 minutos de incubación a temperatura ambiente (15). Prueba de aglutinación bacteriana. Se realizó un serial de dilución 1:2 con 25 µl de suero sanguíneo a igual volumen de PBS y se adicionó 25 µl de solución de E. coli (108 células/ ml) previamente inactivada con formalina en placa multipozos de fondo en U. Las placas se incubaron en el transcurso de la noche a temperatura ambiente y los títulos se calcularon como el recíproco de la dilución de suero que presentó la más alta aglutinación completa de las células bacterianas (18).

Sanmiguel - Humic substances in innate immunity of layer hens 2 µl of the diluted suspension of the bacteria was incubated with 20 µl of the serum in a vial for 1 hour at 37°C. PBS was used for the control group to replace blood serum. It was massively planted in Trypticase Soy Agar (TSA) and incubated at 37°C for 24 hours, after which UFC counting was done. Statistical analysis. The response variables were analyzed depending on the fulfillment of statistical assumptions and subjected to ANOVA variance analysis followed by a post hoc Tukey test. Nonparametric data were analyzed using Kruskal-Wallis statistics and Dunn’s multiple comparison test. These analysis were performed using Graphpad Prism software version 5.03 (GraphPad software) establishing a p <0.05 value below which the variable values in each treatment were considered significantly different.

RESULTS Parameters of innate immunity. On the eighth day of the experiment, hens supplemented with 0.1% presented better IF than other groups (Figure 1). By day 30, supplementation with SH at 0.1 and 0.2% resulted in a statistically higher IF (p <0.05) than the non-supplemented groups. At day 30, the IF of the supplemented SH groups decreased (36.8 and 36.9) but compared to non-supplemented groups SH (3.9 and 24.5) which showed a statistically higher IF (p <0.05). In treatment 1 it was visibly noticed that the IF decreased over time, and the eighth day of supplementation showed the highest IF (71.75) while on days 30 and 60 it decreased to 36.8 and 36.1 respectively (Table 1). Birds supplemented with 0.1% SH have lower respiratory burst values (p <0.05) than the group A

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Prueba de actividad bactericida del suero. Esta prueba fue realizada mediante la técnica descrita por Low y Sin (19). Brevemente, se colectó la sangre sin anticoagulante, mantenida a temperatura ambiente durante una hora. Posteriormente, se centrifugó a 2500 g por 5 minutos y se extrajo el suero sobrenadante. Se preparó una suspensión bacteriana en PBS de E. coli de origen aviar a una densidad óptica de 0.80, el cual fue diluido 1:10, en 3 ocasiones de forma seriada. Se incubaron 2 µl del diluido de la suspensión de la bacteria con 20 µl del suero en un vial por 1 hora a 37°C. Para el grupo control se usó PBS en remplazo de suero sanguíneo. Se sembró masivamente en Agar Tripticasa Soya (TSA), y se incubó a 37°C durante 24 horas, posterior a lo cual se llevó a cabo el conteo de UFC. Análisis estadístico. Las variables de respuestas fueron analizadas dependiendo del cumplimiento de los supuestos estadísticos y sometidas a un análisis de varianza ANOVA seguido por el test pos hoc de Tukey. Los datos no paramétricos se analizaron mediante el estadístico KruskalWallis y la prueba de comparación múltiple de Dunn. Estos análisis fueron realizados mediante software Graphpad Prism, version 5,03 (GraphPad Sofwtare) estableciendo un valor p<0.05 por debajo del cual se consideraron significativamente diferentes los valores de las variables en cada tratamiento.

RESULTADOS Parámetros de inmunidad innata. En el octavo día del experimento, las gallinas suplementadas con 0.1% presentaron mejor IF que los demás grupos (Figura 1). En el día 30, la suplementación con SH al 0.1 y 0.2% generó un IF estadísticamente C

Figure 1. Effect of SH supplements (%) on the phagocytic index (IF) in different treatments (T1, T2, T3 and T4). T1: 0.1%, T2: 0.2%, T3: 0.25 mg/kg of levamisole, T4: without supplement, day 8 (A), 30 (B) and 60 (C). Different letters indicate statistical differences (p<0.05).

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supplemented with Levamisole on the eighth day and the negative control group on day 30 of the experiment (Figure 2). The groups supplemented with 0.2% SH had higher respiratory burst values than the unsupplemented groups and on day 60 there were no significant differences (p<0.05) (Table 1). Supplementation with 0.1% SH resulted in a significantly greater ABS than the group

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mayor (p<0.05) que los grupos no suplementados. Al día 30, el IF de los grupos suplementados con SH disminuyó (36.8 y 36.9) pero en comparación con los grupos no suplementados con SH (3.9 y 24.5) los cuales presentaron un IF estadísticamente mayor (p<0.05). En el tratamiento 1 se notó visiblemente que el IF disminuyó con el tiempo, así el octavo día de suplementación presentó el mayor IF (71.75) mientras que el día 30 y 60 disminuyó a 36.8 y 36.1 respectivamente (Tabla 1).

Table 1. Phagocytic index, respiratory burst, serum bacteria activity bacterial agglutination in hens with SH supplements. Variables

Treatments

K. W

P value

Phagocytic index

Day 8

71.75ª

(60-80)

55.5b

(49-61)

38.8c

(35-43)

38.7c

(33-41)

0.0001***

Day 30

36.8a

(34-41)

36.9a

(33-40)

31.9b

(26-36)

24.5c

(21-27)

0.004**

Day 60

36.1a

(30-41)

43.9b

(37-49)

46.5bc

(40-54)

51c

(44-58)

0.1073

Respiratory burst

Day 8 Day 30

0.14c 0.12

Day 60

0.14

(0.11-0.16) (0.10-0.14) (0.12-0.15)

0.16bc

(0.12-0.17)

0.18a

(0.16-0.19)

0.16b

(0.13-0.18)

0.0001***

0.12b

(0.10-0.13)

0.0023**

(0.12-0.15)

0.9672

0.14a

(0.12-0.15)

0.12b

(0.10-0.13)

0.14

(0.12-0.15)

0.14

(0.12-0.15) 0.14

Serum bacteria activity

Day 8

115ab

Day 30

117a

Day 60

(107-119)

98.5c

(94-105)

(106-121)

110ab

(102-119)

(80-117)

117.5a

(112-123)

100bc

(88-117)

(81-111)

(58-105)

(8-32)

98.5c

(95-104)

0.0001***

93c

(84-107)

0.0002***

(79-101)

0.07

Bacterial agglutination

Day 8

32a

(32-64)

32ab

(32-32)

16bc

Day 30

32a

(32-64)

48ab

(16-64)

16c

(8-16)

Day 60

64a

(64-128)

48ab

(32-64)

32b

(16-32)

16c 16bc 16c

(8-32)

0.0001***

(16-16)

0.0001***

(16-16)

0.0001***

Median values and quartile ranges (in parentheses) of 120 hens. T1: SH 0.1%, T2: 0.2SH% T3: 0.25 mg / kg levamisole, T4: no supplement. Different letters indicate statistical differences (p <0.05) ** p <0.01

supplemented with 0.2% and the nonsupplemented group on the eighth day (p <0.05). By day 30, SH supplementation had a significantly greater ABS than the unsupplemented groups (p<0.05), as shown in figure 3. Serum bactericidal activity increased on day 30 (p<0.05) and was at the same level on day 60, in which no differences between groups were observed (p>0.05); (Figure 3). As shown in figure 4, on day 8 bacterial agglutination was higher in the groups supplemented with 0.1% SH than in the other groups (p<0.05). On days 30 and 60 it was seen that supplementation with humic substances significantly improves bacterial agglutination activity (p<0.05) On day 30 of the experiment no significant difference in lysozyme activity was found between

Los animales suplementados con 0.1% de SH presentaron menores valores de explosión respiratoria (p<0.05) que el grupo suplementado con Levamisol al día ocho, y que el grupo control negativo, en el día 30 del experimento (Figura 2). Los grupos suplementados con 0.2% de SH presentaron valores de explosión respiratoria mayores que los no suplementados y en el día 60 no hubo diferencias significativas (p<0.05) (Tabla 1). La suplementación con 0.1% de SH presentó una ABS significativamente mayor que el grupo suplementado con 0.2% y que el grupo no suplementado en el día octavo (p<0.05). Para el día 30, la suplementación con SH presentó una ABS significativamente mayor que los grupos no suplementados (p<0.05) como se presenta en la figura 3. La actividad bactericida del suero aumentó el día 30 (p<0.05) y permaneció al mismo nivel el día 60, en el cual no se presentaron diferencias entre grupos (p>0.05) (Figura 3).

Sanmiguel - Humic substances in innate immunity of layer hens A

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Figure 2. Effect of SH supplements on respiratory burst using the Kruskal Wallis test in different treatments (T1, T2, T3 y T4). T1: 0.1%, T2: 0.2%, T3: 0.25 mg/kg of levamisole, T4: without supplement, day 8 (A), 30 (B) and 60 (C). Different letters indicate statistical differences (p<0.05).

Figure 3. Effect of SH supplements on serum bacteria activity in different treatments (T1, T2, T3 y T4). T1: 0.1%, T2: 0.2%, T3: 0.25 mg/kg of levamisole, T4: without supplement, day 8 (A), 30 (B) and 60 (C). Different letters indicate statistical differences (p<0.05).

Figure 4. Effect of SH supplements on bacterial agglutination in different treatments (T1, T2, T3 y T4). T1: 0.1%, T2: 0.2%, T3: 0.25 mg/kg of levamisole, T4: without supplement, day 8 (A), 30 (B) and 60 (C). Different letters indicate statistical differences (p<0.05).

treatments when the DO difference relative to the negative control (p> 0.05) was analyzed. On day 60, the group of hens supplemented with 0.1% SH showed a greater difference in the DO regarding the negative control in comparison with the supplemented group with 0.2% SH (p<0.05) (Table 2).

Como se observa en la figura 4, el día 8, la aglutinación bacteriana fue más alta en los grupos suplementados con 0.1% de SH que en los demás grupos (p<0.05). En los días 30 y 60 se evidenció que la suplementación con sustancias húmicas mejora significativamente la actividad de la aglutinación bacteriana (p<0.05)

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Table 2. Difference in lysozyme activity compared to negative control hens supplemented with SH. Treatments

P value

Day 8

-0.001b (0.001-0.002)

-0.002b (0.014-0.002)

0.004a (0.004-0.002)

0.01**

Day 30

0.001 (0.001-0.004)

0.001 (0.002-0.002)

0.002 (0.001-0.003)

0.848

Day 60

0.001a (0.001-0.003)

-0.003b (0.001-0.008)

0.001a (0.003-0.004)

0,01**

Values in the difference between median values and quartile range (in parenthesis) for the negative control group of 120 hens by Kruskal Wallis. T1: SH 0.1%, T2: 0,2SH% T3 : 0.25 mg / kg levamisole, T4: no supplement. Different letters indicate statistical differences (p <0.05). ** (p <0.01)

DISCUSSION Heterophils are phagocytic microbicidal cells that primarily depend on non-oxidative mechanisms for antimicrobial activity, and since they do not contain catalase or myeloperoxidase, this means the production of hydrogen peroxide is much more limited than in mammalian neutrophils (20). Additionally, it is known that macrophages are capable of trapping foreign antigens and initiating an adaptive immune response phase (21). In this study it was found that the SH improve IF on day 8 and 30 of the post-molting phase, but at day 60 is even lower than the unsupplemented groups, so it is understood that the increase in phagocytic activity generated by SH in the early post-molt stage has limited stimulatory functions and for unknown reasons the phagocytes not soon recover their natural activity quickly, and therefore day 60 is significantly different from the control group. To the authors’ knowledge there are no reports in literature on the effect SH has on these immune parameters. However, similar results were found using other immunostimulatory molecules. Engstad et al (22) demonstrated that human leukocytes increase their immunological activity with β-glucans; however, Chuammitri et al (23) demonstrated that the phagocytic index and bactericidal activity of heterophiles did not show significant differences between those treated with β-glucans and ascorbic acid and those that were untreated, while murine macrophage phagocytosis is increased by Panax ginseng and other immunomodulators (24). Furthermore, reports show that phagocytic activity is influenced by genetics. Swaggerty et al (25) compared the phagocytic and bactericidal activity of chicken heterophiles in fast and slow feathering. The authors demonstrated that fastfeathering chickens showed a higher phagocytic

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El día 30 del experimento, no se encontró diferencia significativa de la actividad de la lisozima entre los tratamientos cuando se analizó la diferencia de DO con respecto al control negativo (p>0.05). El día 60, el grupo de gallinas suplementadas con 0.1% de SH presentó una mayor diferencia en la DO con respecto al control negativo en comparación con el grupo suplementado con 0.2% se SH (p<0.05) (Tabla 2).

DISCUSIÓN Los heterófilos son células fagocíticas y microbicidas que dependen primariamente de mecanismos no oxidativos para la actividad antimicrobiana, ya que no contienen catalasa ni mieloperoxidasa, esto hace que la producción de peróxido de hidrógeno sea mucho menor que en los neutrófilos de los mamíferos (20). Adicionalmente, es conocido que los macrófagos son capaces de atrapar antígenos foráneos e iniciar la fase adaptativa de la respuesta inmune (21). En el presente estudio se encontró que las SH mejoran el IF en el día 8 y 30 de la fase posmuda, pero al día 60 es incluso menor que los grupos no suplementados, por lo cual se deduce que el aumento en la actividad fagocítica generado por las SH en la etapa temprana de la posmuda tiene un límite de funcionalidad estimulatoria y por razones desconocidas los fagocitos no recuperan pronto su natural actividad, por consiguiente al día 60 se refleja en la diferencia significativa con respecto al grupo control. En la literatura no existen reportes, a conocimiento de los autores, del efecto de las SH sobre estos parámetros inmunes. No obstante, con el uso de otras moléculas inmunoestimulantes se han encontrado resultados similares. Así, Engstad et al (22) demostraron que los leucocitos de humanos incrementan su actividad inmunológica con β-glucanos, no obstante, Chuammitri et al (23) demostraron que el índice fagocítico y actividad bactericida de heterófilos no presentaron diferencias significativas entre los tratados con β-glucanos, ácido ascórbico y los no tratados mientras que en murinos la fagocitosis de macrófagos es incrementada por Panax ginseng y otros inmunomoduladores (24). Por otro lado, reportes demuestran que la actividad fagocítica es influenciada por la genética. Swaggerty et al (25) compararon la actividad fagocítica y bactericida de heterófilos de pollos de emplume rápido y emplume lento. Los autores demostraron que los pollos de emplume rápido presentaron mayor índice fagocítico y mayor actividad bactericida. Por tal motivo se sugiere realizar estudios que permitan visualizar la diferencia del efecto de las SH en la respuesta inmune, de acuerdo a diferentes líneas genéticas de pollo de engorde y producción de huevo respectivamente.

Sanmiguel - Humic substances in innate immunity of layer hens index and bactericidal activity. Therefore it is suggested study the difference SH has on the immune response according to the different genetic lines existing in broiler and egg production, respectively. Results found in this work on bacterial agglutination infer that supplementation with SH at 0.1 and 0.2% improves the effects of bacterial agglutination serum in laying hens (p <0.05). Although no published data were found on this species to compare, these results relate to what was presented by Behera et al (18), who conducted a parenteral immunization with glycolic acid on Rohita labeo and reported that the treated group showed a significantly higher difference in bacterial agglutination test on the first day of immunization without obtaining significant differences at days 21 and 42, data that differ from the results presented in this work since SH supplementation significantly improved bacterial agglutination in all sampling (8, 30 60). Lysozyme activity showed significant improvement on day 60 with a supplementation of 0.1% SH. According to Li et al (26), the egg is nature’s richest source of lysozyme. Hence it is relevant to consider whether the increase in thickness of egg albumin is related to an increase in the proportion of Lysozyme, which is in turn transferred at the egg level to breeding hens. The blood serum of chickens supplemented with SH had a higher bacterial agglutination during the entire experiment, even surpassing the positive control group; however, publications on this subject that consider previous results have not been found. Respiratory burst tests showed that at day 30 of the post-molt, hens supplemented with SH had higher oxidative activity. These data agree with Ibuki et al (27), who found that HD11 chicken macrophages treated in vitro with mannobiose increased the production of hydrogen peroxide in comparison to untreated macrophages. Similarly, Babu et al (28) challenged HD11 macrophages with Salmonella enteritidis and found that superoxide anion production was higher than in murine macrophages. Although forced molting is practiced in production systems to increase the productive life of chickens and improve production and egg quality parameters, there is evidence that in the postmolt stage the relationship between pathogens and host is altered. Therefore, eggs produced in the early post-molt period present a higher risk of contamination for humans since the percentage of contaminated eggs is increased (29). Results

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Los resultados evidenciados en este trabajo sobre la aglutinación bacteriana, permiten inferir que la suplementación con SH al 0.1 y 0.2% mejoran el efecto de la aglutinación bacteriana en el suero de gallinas ponedoras (p<0.05); Aunque no se encontraron datos publicados en esta especie para realizar comparaciones, estos resultados tienen relación con los presentados por Behera et al (18) quienes realizaron una inmunización parenteral con ácido glicólico en Rohita labeo reportando que el grupo tratado mostró una diferencia significativamente mayor en la prueba de aglutinación bacteriana el primer día de inmunización sin obtener diferencia significativa a los 21 y 42, datos que difieren de los resultados presentados en este trabajo puesto que la suplementación con SH mejoró significativamente la aglutinación bacteriana en todos los muestreos (día 8, 30 y 60). La actividad de la Lisozima demostró mejorar significativamente el día 60 con una suplementación de 0.1% de SH. De acuerdo con Li et al (26), en la naturaleza el huevo es el recurso más rico en Lisozima. De ahí que es pertinente estudiar si el aumento en el grosor de la albúmina del huevo tiene relación con un aumento en la proporción de Lisozima y a su vez con la inmunidad transferida en el huevo a nivel de reproductoras. El suero sanguíneo de las gallinas suplementadas con SH presentó una mayor aglutinación bacteriana durante todo el tiempo del experimento incluso superando el grupo control positivo, sin embargo de este tema no se encuentran publicaciones sobre resultados previos. Los resultados de la prueba de explosión respiratoria demostraron que al día 30 de la posmuda las gallinas suplementadas con SH presentaban una mayor actividad oxidativa. Estos datos concuerdan con Ibuki et al (27), quienes encontraron que los macrófagos de pollo HD11 tratados in vitro con manobiosa incrementan la producción de peróxido de hidrógeno comparado con macrófagos no tratados. Igualmente, Babu et al (28) desafiaron macrófagos HD11 con Salmonella enteritidis y encontraron que la producción de anión superóxido era mayor que en los macrófagos de origen murino. A pesar que la muda forzada se realiza en la práctica de sistemas de producción para prolongar la vida productiva de las gallinas para mejorar los parámetros productivos y de calidad de los huevos, se ha evidenciado que en la etapa posmuda se altera la relación entre los patógenos y el hospedador, por consiguiente los huevos producidos en el período temprano de la posmuda representan un mayor riesgo de contaminación para el consumo humano aumentándose el porcentaje

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reported in this study show that supplementing laying hens in the post-molt phase generated significant increases in IF, lysozyme activity and serum bactericidal activity during the early postmolt stage (Day 8 and 30), whereas the same supplementation in the mid post-molt stage (day 60) decreases IF markedly and does not present stimulatory effects on respiratory burst activity or lysozyme, however bacterial agglutination is stimulated at all measured times. In conclusion, information in this study suggests that supplementation of laying hens during the postmolt phase with SH from the biotransformation of cachaza, leaf and sugar cane vinasse, can act as stimulants on the parameters of innate immunity evaluated in laying hens particularly in the early stage of this phase, considering that it had higher IF (Day 8 and 30), bacterial agglutination increased during the whole experiment (day 8, 30 and 60), even surpassing the control group, increasing bactericidal activity of the serum on day 8 and 30, and lysozyme activity was significantly better on day 60 of supplementation. Acknowledgments The present study was carried out thanks to the financial and logistical contribution at the University of Tolima and the Universidad Cooperativa de Colombia. Thanks to Felipe Velasquez Rodriguez and Adriana Claudia Cely of the Universidad Cooperativa de Colombia and to the Veterinary Diagnostic Laboratory at the Universidad de Tolima.

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de huevos contaminados (29). Los resultados reportados en esta investigación demuestran que suplementando las gallinas ponedoras en la fase posmuda se generan incrementos significativos en el IF, actividad de la lisozima y actividad bactericida del suero durante la etapa temprana de la posmuda (día 8 y 30), mientras que con la misma suplementación en la etapa media de la posmuda (día 60) decrece marcadamente el IF, y no presenta efecto estimulante sobre la explosión respiratoria ni la actividad de la lisozima, no obstante la aglutinación bacteriana es estimulada en todos los tiempos medidos. En conclusión, la información obtenida en la presente investigación indica que la suplementación de gallinas ponedoras durante la fase de posmuda con SH provenientes de la biotransformación de la cachaza, hoja y vinaza de caña de azúcar pueden actuar como estimulantes de los parámetros de la inmunidad innata evaluados en gallinas ponedoras particularmente en la etapa temprana de dicha fase, teniendo en cuenta que presentó mayor IF (día 8 y 30), se incrementó la aglutinación bacteriana durante todo el tiempo del experimento (día 8, 30 y 60) incluso superando el grupo control, aumentó la actividad bactericida del suero el día 8 y 30, y la actividad de la lisozima fue significativamente mejor el día 60 de suplementación. Agradecimientos El presente estudio se realizó gracias a la contribución financiera y logística de la Universidad del Tolima, y la Universidad Cooperativa de Colombia. Agradecimientos a Felipe Velásquez, Claudia Rodríguez y Adriana Cely de la Universidad Cooperativa de Colombia así como al Laboratorio de Diagnostico Veterinario de la Universidad del Tolima.

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5211-5221, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Spatial and temporal length distribution of Zungaro zungaro caught in the Orinoco River Basin of Colombia Distribución espacial y temporal de tallas de captura de Zungaro zungaro en la Orinoquia colombiana Hernando Ramírez-Gil,1 Ph.D. 1Universidad

de los Llanos, Faculty of Basic and Engineering Sciences, Department of Basics, Investigation group: Evaluation, handling and conservation of hydrobiological and fishing resources, km 12 Vía Puerto López, Vereda Barcelona, Villavicencio, Meta, Colombia. *Correspondence: hramirezgil@ gmail.com Recived: February 2014; Accepted: March 2015.

ABSTRACT Objetive. To determine the effect of fishing on capture size of both male and female Zungaro zungaro catfish, historical records of size and spatial distribution of the species were analyzed from the Orinoco Basin in Colombian. Materials and methods. Information was collected by sampling fishing port landings in the region between 1979 and 2011. Each specimen was measured, weighed and sexed. With 5411 records, the average size at capture were compared in time and among the different ports. Size at 50% maturity was estimated by quinquennium. Results. The average commercial capture sizes of Z. zungaro ranged from 35 to 161 cm standard length, with differences between males and females. From 1979 to 2011, in Puerto Lopez, the size at sexual maturity decreased from 123.8 to 83.4 cm in females and from 93.3 to 61 in males. In the annual cycle the greater average capture size in females was from April to July and for males from May to June. Average annual length is higher in the higher parts of the Meta and Guaviare river drainages. In the last quinquennium the size at 50% maturity had fallen 10 cm in females and 5 cm in males and it is higher than the average capture size. Conclusions. Populations of Z. zungaro in the Colombian Orinoco River Basin have been affected by overfishing and selective fishing of females. Key words: Overfishing, population dynamics, river fisheries, sexual selection (Source: ASFA).

RESUMEN Objetivo. Determinar el grado de afección en la población de Zungaro zungaro a partir del análisis del comportamiento histórico y espacial de las tallas de captura de hembras y machos de la especie en la Orinoquia colombiana. Materiales y métodos. La información fue colectada mediante muestreos a los desembarcos en puertos pesqueros de la región entre 1979 y 2011. Cada ejemplar fue medido, pesado y sexado. Con 5411 registros, se estableció la distribución de las tallas medias de captura, que se compararon en el tiempo y entre los diferentes puertos. Se estimó la talla de madurez gonadal (TMG) por quinquenios. Resultados. El rango de las tallas de captura comercial Z. zungaro fue de 35 a 161 cm longitud estándar (LS), con diferencia entre machos y hembras. Entre los años 1979 a 2011, en Puerto López, la talla promedio de captura anual (LS) disminuyó de 123.8 a 83.4 cm en hembras y de 93.3 a 61 cm en machos. En el ciclo anual la mayor talla promedio de captura de hembras se presenta en abril a julio y de machos en mayo y junio. La talla promedio de captura anual (TPCA) es superior en las partes altas de los ríos Meta y Guaviare. En el último quinquenio la TMG ha disminuido 10 cm en las hembras y cinco cm en los machos y es superior a la TPCA. Conclusiones. Hay afectación sobre la población explotada de Z. zungaro por sobrepesca por crecimiento y pesca selectiva de hembras en la Orinoquia colombiana. Palabras clave: Dinámica de poblaciones, pesca fluvial, selección sexual, sobrepesca, (Source: ASFA). 5211

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INTRODUCTION

INTRODUCCION

The Zungaro genus belongs to a commercially used group of catfish that reaches large sizes (1), distributed in the basins of the Orinoco (24), Amazonas (5) and Parana Rivers, Paraguay (1). The species is characterized by reproductive migration in one annual spawning period with high relative fertility, free eggs without parental care, and rapid embryogenesis (6). In the Orinoco Z. zungaro (4,7,8), it occupies the second place in size within the group of big catfish with females reaching a standard length of 165 cm (LS) and males with lengths reported up to 138 cm LS (2). Size of gonadal maturity was estimated in the upper Rio Meta at 127 cm LS for females and 107 cm for males (2). In the Orinoco it has two annual migrations, the first reproductive one in the months of March to June and the second for food from September to December (2). In addition, the intrinsic value of the species, as it holds great social and economic importance in food security for the coastal population of the Arauca, Meta, Guaviare and Orinoco Rivers, and given its high price in the market it is part of a value chain that goes from the fisherman to the major consumer centers.

El género Zungaro pertenece al grupo de siluriformes explotados comercialmente que alcanza grandes tallas (1), se distribuye en las cuencas del Orinoco (2-4), Amazonas (5) y Paraná, Paraguay (1). Sus especies se caracterizan por presentar migración reproductiva en un sólo período de desove al año, alta fecundidad relativa, huevos libres, sin cuidado parental y rápida embriogénesis (6). En la Orinoquia se reporta la especie Z. zungaro (4,7,8), que ocupa el segundo lugar en tamaño dentro del grupo de los grandes bagres con hembras que alcanzan tallas de 165 cm de Longitud estándar (LS) y machos con longitudes hasta 138 cm LS (2). La talla de madurez gonadal se estimó, en el alto río Meta en 127 cm LS para hembras y en 107 cm LS para los machos (2). En la Orinoquia, presenta dos migraciones anuales, la primera en los meses de marzo a junio de tipo reproductivo y la segunda de carácter alimenticio de septiembre a diciembre (2). Además, del valor intrínseco de la especie, su extracción reviste importancia social y económica como aporte a la seguridad alimentaria para la población ribereña de los ríos Arauca, Meta, Guaviare y Orinoco, y dado su alto precio en el mercado como fuente de recursos económicos, en una cadena de valor que va desde el pescador a los grandes centros de consumo.

In 2009 commercial quantities of Z. Zungaro in the Colombian Orinoco were in fourth place among the fish species sold in the region, with a contribution of 86 t (2). Annual landings have declined, for example in Puerto Lopez, they went from 50 t in 1985 to 32.3 t in 2009 (2). This decline in landings as well as the large specimens found, the migratory nature of the species and the lack of a conservation program, led it to be included in the Red Book of freshwater fishes of Colombia 2012, in the category of vulnerable (9). This study was done in order to determine if fishery is affecting a population under fishing pressure by analyzing the historical and spatial behavior of catch sizes of males and females of the species.

MATERIALS AND METHODS Area of study. The information for this study was collected in the principal landing centers of Z. zungaro in the Colombian Orinoquia. Río Meta. Puerto López (4º05’N and 72º57’O), Cabuyaro (4º18’N and 72º48’O), Puerto Guadalupe (4º20’N and 72º21O), Puerto Gaitán (4º20’N and 72º05’O) and Puerto Carreño (4º11’N and 67º28’O). Río Guaviare. San José del Guaviare (2º34’N and 72º38’O), Inírida (3º52’N and 67º55’O), as can be seen in figure 1.

Las cantidades comercializadas de Z. zungaro en la Orinoquia colombiana, ocuparon en el año 2009 el cuarto lugar entre las especies de peces comercializadas en la región, con un aporte de 86 t (2). Sus desembarcos anuales han descendido, por ejemplo en Puerto López, pasaron de 50 t en el año 1985 a 32,3 t en el 2009 (2). Esta disminución en los desembarcos unida al gran tamaño que alcanzan los ejemplares, al carácter migratorio de la especie y a la falta de un programa para su conservación, llevó a que se considerara en el Libro Rojo de peces dulceacuícolas de Colombia 2012, en la categoría de vulnerable (9). El presente trabajo se adelantó con el objetivo de determinar si la pesquería está afectando la población bajo presión de pesca, mediante el análisis del comportamiento histórico y espacial de las tallas de captura de hembras y machos de la especie.

MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio. La información para el presente trabajo, fue colectada en los centros de desembarco principales de las pesquerías de Z. zungaro en la Orinoquia colombiana. Río Meta. Puerto López (4º05’N y 72º57’O), Cabuyaro (4º18’N y 72º48’O), Puerto Guadalupe (4º20’N y 72º21O), Puerto Gaitán (4º20’N y 72º05’O) y Puerto Carreño (4º11’N y 67º28’O).

Ramírez-Gil - Spatial and temporal length distribution of Zungaro zungaro

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Río Guaviare. San José del Guaviare (2º34’N y 72º38’O), Inírida (3º52’N y 67º55’O), como se puede apreciar en la figura 1. Fase de campo. La información fue obtenida mediante muestreos realizados a las capturas desembarcadas, cada ejemplar de la especie fue medido (LS) con una cinta métrica de 0.01m de aproximación, pesado (eviscerado) con una balanza de 100 kg de capacidad y 0.5 kg de aproximación, sexado macroscópicamente y clasificado en inmaduro o maduro, considerando maduro al macho que al presionar la gónada liberaba esperma o a la hembra con huevos visibles. Figure 1. Main landing ports for Zungaro zungaro in the Colombian Orinoco.

Field phase. Information was obtained from samples taken at landings. Each specimen was measured (LS) with a 0.01m tape measure, weighed (gutted) with a 100 kg capacity scale with 0.5 kg approximation, macroscopically sexed and classified as immature or mature; a male was considered to be mature when pressed gonads released sperm and a female had visible eggs. Information was taken at different times, with a monthly sampling in Puerto Lopez between 1979 and 1986, Cabuyaro from 1987-1990 and 1992-1995, and Puerto Guadalupe in 1989, 1990, 1993 and 1994, in Puerto Gaitán with two monthly monitoring times from 1999-2001. In the period from 1987-2003, four monthly surveys were done in Puerto Lopez. Data from 2007 to 2011, with daily sampling efforts in Puerto Lopez, Puerto Gaitán, Puerto Carreño, San José del Guaviare and Inírida, belong to the database of the Fisheries and Aquaculture Sector, provided by the management for Fisheries and Aquaculture of the National Institute of Rural Development - INCODER and the National Authority for Aquaculture and Fisheries - AUNAP. Given the proximity of Puerto Lopez, Cabuyaro, Puerto Guadeloupe and Puerto Gaitán, length data collected in these collection centers were grouped into just one report to facilitate analysis and are herein designated Upper Meta River. Average capture size. 5411 records were analyzed to find variations in the distribution of average size in time and space. The historical record of the Upper Meta River from 1979 to 2011 was consulted, and in space the average size found in the different collection centers

La frecuencia de toma de información presentó variaciones, con un muestreo mensual en Puerto López entre los años 1979 y 1986, en Cabuyaro en los años 1987 a 1990 y de 1992 a 1995 y en Puerto Guadalupe en los años 1989, 1990, 1993 y 1994. En Puerto Gaitán con dos seguimientos mensuales en los años 1999 al 2001. En el período 1987 a 2003 en Puerto López se hicieron cuatro muestreos mensuales. Los datos de 2007 a 2011, con esfuerzo de muestreo diario en Puerto López, Puerto Gaitán, Puerto Carreño, San José del Guaviare e Inírida, corresponden a la base de datos del Sistema Sectorial Pesquero y Acuícola, suministrada por la Subgerencia de Pesca y Acuicultura del Instituto Nacional de Desarrollo Rural – INCODER y la Autoridad Nacional de Acuicultura y Pesca – AUNAP. Dada la cercanía entre Puerto López, Cabuyaro, Puerto Guadalupe y Puerto Gaitán los datos de tallas de captura de estos centros de acopio fueron agrupados en uno sólo para facilitar el análisis y se denominó en este documento parte alta del río Meta. Tallas promedio de captura. A partir de 5411 registros, se analizaron las variaciones en la distribución de las tallas promedio de captura en el tiempo y en el espacio. En el tiempo los registros históricos de la parte alta del río Meta desde el año 1979 hasta 2011 y en el espacio la talla promedio entre los diferentes centros de acopio de la Orinoquia. Para establecer si existían diferencias significativas de tallas entre sexos, entre y dentro de ciclos anuales y espacialmente, se aplicó la prueba de Levene para establecer si había homocedasticidad de varianza, para posteriormente utilizar pruebas paramétricas (Anova y Tukey) o no paramétricas (KruskallWallis y Mann-Whitney) según el caso, utilizando el paquete estadístico SigmaPlot 11(Jandel) con significancia α=0.05.

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along the Orinoco was used. To establish whether there were significant differences in size between the sexes as well as between and within yearly cycles and spatially, Levene’s test was applied to establish whether there was homoscedasticity variance for later parametric tests (ANOVA and Tukey) or nonparametric (Kruskall Wallis and Mann-Whitney) as appropriate, using the SigmaPlot 11 (Jandel) statistical package with α=0.05 significance. Temporal analysis was based on records obtained in Puerto Lopez (upper Meta River) in 30 years of follow-up work. Size at maturity. LS data for mature males and females were compared using the Student t statistic test to establish whether there were significant differences between records of both sexes. The size of gonadal maturity was calculated for females (n=2372) and males (n=1821), grouping data by quinquennium. At every quinquennium, 30 class marks were established and for each one an absolute, relative and accumulated frequency was estimated. The relative cumulative frequency was linearized (TFRA) using the equation:

From the lineal regression between the class mark and this transformation, a and b parameters were estimated in the logistics curve:

Where gonadal maturity (TMG) is considered the size at 50%, measurement that was used to make comparisons between quinquennium.

RESULTS Commercial catch sizes of Z. Zungaro in the Colombian Orinoco were within a range of 35 to 161 cm LS, with significant differences (p<0.05) between males and females. Variations in average catch sizes were evident in both time (within the hydrological and interannual cycle), and space, considering their geographic distribution. Average capture size. In Puerto López from 1979-2011 the average annual catch size was between 123.8±7.6 cm LS in 1991 and 83.4±29.2 cm in 2011 for females and between 93.3±22 in 1997 and 61±16 cm in 2011 in males. In figure 2 a gradual tendency to diminish in size can be observed in the average annual catch sizes of the males in comparison with the

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Para los análisis temporales se tomaron como base los registros obtenidos en Puerto López (parte alta del río Meta), de 30 años de seguimiento. Talla de madurez gonadal. Los datos de LS de machos y hembras maduros se compararon mediante la prueba estadística t de Student, para establecer si había diferencia significativa entre los registros de los dos sexos. La talla de madurez gonadal se calculó para hembras (n=2372) y para machos (n=1821), agrupando los datos por quinquenios. Para cada quinquenio se establecieron 30 marcas de clase y para cada una de ellas se estimaron la frecuencia absoluta, la relativa y la relativa acumulada. La frecuencia relativa acumulada se linealizó (Tfra) mediante la ecuación:

A partir de la regresión lineal entre la marca de clase y esta transformación se estimaron los parámetros a y b de la curva logística:

Donde talla de madurez gonadal (TMG) se considera la talla al 50%, medida que se utilizó para las comparaciones entre quinquenios.

RESULTADOS Las tallas de captura comercial de Z. zungaro en la Orinoquia colombiana se ajustaron a un rango de 35 a 161 cm de LS, con diferencia significativa (p<0.05) entre machos y hembras. Se presentó variación en las tallas promedio de captura tanto en el tiempo (dentro del ciclo hidrológico e interanual), como en el espacio considerando su distribución geográfica. Tallas promedio de captura. En Puerto López, entre los años 1979 a 2011 la talla promedio de captura anual osciló entre 123.8±7.6 cm LS en 1991 y 83.4±29.2 cm en 2011 en las hembras y entre 93.3±22 en 1997 y 61±16 cm en 2011 en los machos. En la figura 2, se observa que hay una tendencia gradual hacia la disminución de la diferencia entre las tallas promedio de captura anual de los machos comparadas con las de las hembras; en los primeros 15 años de registros (1979 a 1993), la diferencia promedio de este parámetro entre los dos sexos fue de 35.8±8.1cm, que se redujo a 23.4±7.2 cm en los siguiente 10 años (1994-2002) y finalmente a 17.7±4.2 cm, en los últimos siete años (2005–2011). Este comportamiento se generó por la disminución a través del tiempo de la talla promedio de captura anual de las hembras.

Ramírez-Gil - Spatial and temporal length distribution of Zungaro zungaro females; in the first 15 years of records (1979 a 1993) the average difference in this parameter between the two sexes was 35.8±8.1cm, which decreased to 23.4±7.2 cm over the next 10 years (1994-2002) and finally reached 17.7±4.2 cm in the last seven years (2005–2011). This behavior was due to a decrease over time of the average annual capture size of females.

Figure 2. Average sizes (LS cm) and standard deviation of Z. zungaro catches (males and females) in Puerto Lopez. Period 1979-2011.

Within the hydrological cycle, the behavior of the average size of monthly catch (TPCM) in the upper Meta River (Figure 3) was analyzed, and significant differences (p<0.05) were found in the size of females captured April to July (between 113 and 124 cm LS) with respect to the other months of the year (between 74 and 102 cm LS). This dynamic was also observed in males for the months of May and June (p<0.05), with significantly higher sizes (between 75 and 109 cm LS) than in the rest of the annual cycle (between 62 and 73 cm). The season with largest sizes coincides with the breeding season of the species in the period of rising waters.

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Dentro del ciclo hidrológico, se analizó el comportamiento de la talla promedio de captura mensual (TPCM) en la parte alta del río Meta (Figura 3), encontrándose que existe diferencia significativa (p<0.05) en la talla de las hembras capturadas en los meses de abril a julio (entre 113 y 124 cm LS) con respecto a los demás meses del año (entre 74 y 102 cm de LS). Esta dinámica también se observó en los machos para los meses de mayo y junio (p<0.05), con tallas significativamente más altas (entre 75 y 109 cm LS) que en el resto del ciclo anual (entre 62 y 73 cm). La temporada de mayores tamaños coincide con la época reproductiva de la especie en el período de aguas ascendentes. Para analizar la distribución espacial de tallas entre centros de acopio, se agruparon los registros del total de la población desembarcada en cada puerto en los años 2007 a 2011. Al hacer la comparación entre los dos puertos del río Meta, Puerto López en la parte alta y Puerto Carreño en la parte baja, se encontró que no había diferencia (p>0.05) en la talla promedio de captura mensual (Figura 4). En contraste en el río Guaviare, las tallas de los ejemplares capturados en San José del Guaviare (parte alta) fueron significativamente mayores (p<0.05) a las de los explotados en Inírida (parte baja), como se puede apreciar en la figura 5. La TPCA de las hembras en San José del Guaviare en el período estudiado fue de 102.9 ±26.8 cm LS y la de los machos de 78.9 ±24.6 cm, mientras que en Inírida fue de 59.5 ±8.8 cm en las hembras y 68±9.1 cm en los machos. Talla de madurez gonadal (TMG). La talla de madurez gonadal de las hembras de Z. zungaro fue significativamente diferente de la de los machos (p<0.05), por lo anterior se presentan los resultados separados por sexo. En la parte alta del río Meta, los datos reportados para los 30 años se agruparon y la TMG se estimó por quinquenios, como se presenta en la figura 6. Entre 1979 y 1993 la TMG de las hembras permaneció estable por encima de los 119 cm LS y a partir de ese año descendió diez centímetros hasta ubicarse alrededor de 109 cm en el período 2006-2011. En los machos la talla de madurez se registraba por encima de 80 cm LS, pero en el último quinquenio disminuyó a 75 cm, comportamiento que es normal en poblaciones pesqueras sometidas a explotación comercial.

Figure 3. Average size of monthly catch of Z. zungaro males and females in the upper Meta River throughout the water cycle (average 19792011).

Al comparar los estimativos de TMG de los ejemplares desembarcados en las partes altas de los ríos Meta y Guaviare (Puerto López, último

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To analyze the spatial distribution of sizes between collection centers, total population records landed in each port in the years 2007 to 2011 were grouped together. When comparing the two ports of the Meta River, Puerto Lopez at the top and Puerto Carreño at the bottom, no difference (p>0.05) in average monthly catch size was found (Figure 4).

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quinquenio, y San José del Guaviare), se observó que en la población del río Meta esta medida fue menor en hembras (108.8 cm LS) y en machos (74.9 cm), que en el grupo del río Guaviare donde la TMG de las hembras fué de 113.6 cm LS y la de los machos de 88.3 cm (Figura 7). En el período estudiado la talla promedio de captura anual de las hembras ha sido inferior a la TMG a través del tiempo (Figura 8) acentuándose la diferencia en el último quinquenio. En los machos en el primer quinquenio analizado la TPCA fue superior a la TMG y en los quinquenios siguientes la dinámica se invirtió; sin embargo, el valor de estos dos parámetros ha sido muy cercano.

Figure 4. Comparison of average monthly catch sizes in Puerto Lopez and Puerto Carreño (2007, 2008, 2010, 2011). In May there are no records in Puerto Carreño due to the closure period.

In contrast with the Guaviare River, sizes of fish caught in San José del Guaviare (upper part) were significantly higher (p<0.05) than those in Inírida (lower part), as seen in figure 5. The TPCA of females in San José del Guaviare during the period studied was 102.9±26.8 cm LS and that of males 78.9±24.6 cm, while in Inírida it was 59.5±8.8 cm in females and 68±9.1 cm in males.

Figure 5. Monthly comparison of average catch sizes marketed in the upper Guaviare River (San Jose) and the lower area (Inírida). Period: 2007, 2008, 2010, 2011.

Size at gonadal maturity (TMG). The size at gonadal maturity for Z. Zungaro females was significantly different from that of males (p<0.05), so that the results are reported by sex. In the Upper Meta River the reported data over 30 years was grouped and the TMG was estimated in quinquennium, as shown in figure 6. From 1979-1993 the TMG of females remained stable and above 119 cm LS, and from that year dropped ten centimeters to settle around 109 cm in 2006-2011. In males the size at maturity was recorded at over 80 cm LS, but in the last five years decreased to 75 cm, which is normal behavior in commercially exploited fish stocks.

Figure 6. Historical variation for five year periods (30 years) of the sizes at gonadal maturity of Z. zungaro males and females in the upper Meta River.

Ramírez-Gil - Spatial and temporal length distribution of Zungaro zungaro Comparing the estimates of TMG of fish landed in the upper parts of the Meta and Guaviare Rivers (Puerto Lopez, last quinquennium, and San José del Guaviare), we observed that in the Meta River this measurement was lower in females (108.8 cm LS) and males (74.9 cm) than in the group in the Guaviare River where the TMG of females was 113.6 cm LS and that of males was 88.3 cm (Figure 7).

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Para la parte alta del río Guaviare la TPCA de las hembras (102.9 ±26.8 cm LS) es inferior a la TMG (108.8 cm LS), similar en los machos la TPCA (78.9±24.6 cm LS) es menor a la TMG (88.3 cm).

Figure 8. Comparison of size at gonadal maturity and average catch size at five-year periods in the upper Meta River.

Figure 7. Spatial variation of length at gonadal maturity (TMG) of Z. zungaro males and females between the upper parts of the Meta and Guaviare (2007-2011) rivers.

In the period studied, the average annual catch size of females has been below the TMG over time (Figure 8), accentuating the difference in the last five years. In males in the first five years the TPCA analyzed was superior to TMG and in the following quinquenniums the dynamics were reversed; however, the value of these two parameters was very close. At the head of the Guaviare River the TPCA of females (102.9 ± 26.8 cm LS) is less than the TMG (108.8 cm LS), in males the TPCA (78.9 ± 24.6 cm LS) is lower than TMG (88.3 cm).

DISCUSSION Average catch sizes. The difference between the size of females and males found in this study is consistent with the report of sexual dimorphism indicating higher growth rates in females than in males (2). Females reach sizes of up to 165 cm LS and males 138 cm (2), higher than those

DISCUSIÓN Tallas promedio de captura. La diferencia entre las tallas de las hembras y los machos encontrada en este estudio, concuerda con el reporte de dimorfismo sexual que indica mayor tasa de crecimiento en las hembras que en los machos (2); las hembras alcanzan tallas hasta de 165 cm LS y los machos de 138 cm (2), superiores a la reportadas para Z. jahu del rio Cuaiba (cuenca del río Paraguay) de 163 cm longitud furcal (10). De acuerdo con los resultados históricos encontrados en el presente trabajo se observa disminución progresiva en las tallas medias de captura de las hembras y los machos, con una caída abrupta entre los años 2005 a 2011, como consecuencia del efecto inevitable de las pesquerías que remueven los ejemplares de las clases más grandes o más viejos de la población (11-13). Cuando hay diferencia en la talla de los dos sexos, los ejemplares del sexo de mayor tamaño son más vulnerables a la presión de pesca y la disminución en la talla de este sexo es más notoria (11), lo que se evidenció claramente en el caso de Z. zungaro en el alto Meta, donde la selección de los artes de pesca dirigida hacia las hembras se reflejó en la reducción de las tallas

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reported for river Z. jahu in the Cuaibá River (Paraguay River Basin) of 163 cm in length (10). According to historical results found in this study, a progressive decrease is observed in the average size of captured females and males, with a sharp drop from 2005 to 2011 as a result of the inevitable effect that fisheries have when they remove larger or older fish from the population (11-13). When there is a difference in size between the two sexes, larger fish are more vulnerable to fishing pressure and a decrease in the size of that sex is more noticeable (11), which was clearly evident in the case Z. zungaro in the upper Meta, where fishing selectivity directed towards females was reflected in the reduction of the average size of catch, greater in females. Also variations were observed in the average monthly catch size. Larger sizes were found in the months corresponding to the reproductive period of the species, April to June (2), when the nets select especially females due to increased circular perimeter because of enlarged gonads, increasing mortality for this population group, as has been described for other fisheries (14). Fisheries exploit the population according to their size frequency distribution (15), and larger sizes of Z. zungaro were reported in the upper parts of rivers where adults and minors are concentrated and in the lower parts where juveniles are found. Reproductive migration of adults has been seen towards the headwaters of the Arauca, Meta and Guaviare (2) rivers, but not of juveniles that, it is assumed, gradually head upriver but not in bulk. This move upstream of juveniles with sizes above 35 cm would primarily be related to migration of bocachico, Prochilodus mariae, their main food and other prey that are not as abundant as Mylossoma duriventre, Leporinus sp., Astyanax spp. and Triportheus ssp. (during the period of falling and low water), when they leave the lagoons and flooded areas to go upriver. Z. Zungaro is thought to make short migrations that could be similar to Z. jau, in which a linear path of 31.4 km was estimated over a year (16), since they are usually found in the main channel of rivers and whitewater pipes, in deep depressions below wooded sections or waterfalls (2, 16), where they wait for their food to pass by, without having to chasse prey, hence the morphological appearance of robust structure and an almost square head, which differs in body frame when compared with other large migratory catfish of the same group.

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medias de captura, de mayor magnitud en las hembras. Igualmente se observaron variaciones en las tallas promedio de captura mensuales. Los mayores tamaños se presentaron en los meses que corresponden al período reproductivo de la especie, abril a junio (2), cuando las redes seleccionan en especial a las hembras por el incremento en su perímetro circular debido a sus gónadas, lo que incrementa la mortalidad por pesca para este grupo de la población, tal como ha sido descrito para otras pesquerías (14). La pesquería explota ejemplares de la población de acuerdo con su distribución de frecuencia de tallas (15), así las mayores tallas de ejemplares de Z. zungaro, se reportaron en las partes altas de los ríos donde se concentran los adultos y las menores en las partes bajas donde se encuentran los juveniles. Se ha observado migración reproductiva de adultos de la especie a las cabeceras de los ríos Arauca, Meta y Guaviare (2), pero no de juveniles los que se asume ascienden paulatinamente cauce arriba, pero no de forma masiva. Ese desplazamiento aguas arriba de juveniles con tallas superiores a los 35 cm, estaría principalmente relacionado con la migración del bocachico, Prochilodus mariae, su principal alimento y de otras presas que lo acompañan en menor abundancia como Mylossoma duriventre, Leporinus sp., Astyanax spp. y Triportheus ssp. (durante el período de aguas descendentes y aguas bajas), cuando estas abandonan las lagunas y áreas inundadas para remontar el río. Se considera que Z. zungaro realiza migraciones cortas que podrían ser similares a las de Z. jau especie para la cual se estimó un recorrido lineal de 31.4 km a lo largo de un año (16) ya que generalmente se encuentra en el cauce principal de ríos y caños de aguas blancas, refugiado en depresiones profundas debajo de palizadas o en chorros de raudales (2, 16), donde se dedica a esperar que pase su alimento, sin perseguir demasiado las presas, de allí la apariencia morfológica de la especie de estructura robusta y cabeza casi cuadrangular, la cual difiere en contextura corporal cuando se le compara con los otros grandes bagres migratorios del grupo de los Siluriformes. Talla de madurez gonadal. La TMG de las hembras ha disminuido desde el quinquenio 19941998, situación que se acentúo entre 2006-2011; en los machos la TMG ha sido superior a 80 cm de LS, sin embargo en el último quinquenio (20062011) bajo significativamente, comportamiento que sugiere que por efecto de la actividad pesquera,

Ramírez-Gil - Spatial and temporal length distribution of Zungaro zungaro Size of gonadal maturity. The TMG of females has declined since 1994-1998, a situation that increased from 2006-2011; TMG in males was higher than 80 cm LS, but in the last five years (2006-2011) it decreased significantly, suggesting that the effects of fishing, larger and older individuals are declining in population, resulting in early maturity of fish at smaller sizes, as has been reported in other fisheries (10, 11, 13, 17, 18, 19). This can also affect the reproductive period, as this tends to be wider seasonal and spatially with parental at older ages when compared to younger (13). The decrease in TMG adversely affects the rate of population growth by eliminating fish that have high reproductive value (11, 19), since size is affected by maternal size, as has been amply demonstrated, since longer and older females produce larger and stronger eggs and larvae, with a greater chance of survival than those of younger females (11, 13, 20). Reproduction at younger ages and smaller sizes reduces fertility (20), resilience to environmental change (17, 19), and increases the sensitivity of larvae to climate variations, which increases sensitivity of recruitment to changes due to climate (13). Spatial results also indicate that females and males of the upper Guaviare River maintain a TMG greater than those recorded in the upper Meta River. Fishery in the upper Guaviare River is relatively recent, since geographical isolation and public order problems have limited its development, in contrast to the more than 50 years of fishing tradition in the upper Meta River. Even so, the TMG of females in upper Guaviare River is less than what the historical records indicate in the upper Meta River in 2006-2011, showing that as in Meta, in that area high pressure is being exerted on fish specimens of larger size, the females. It is clear that historically and spatially the TPCA of females was lower than the TMG, which means that fishing pressure has been exerted on specimens that did not reach TMG, which is considered the optimum catch length, which suggests that overfishing relative to growth exists. Additionally, the TPCA is below the 10th percentile of the maturity curve in Puerto López and in the 30th percentile in San José del Guaviare, which may result in the low numbers of this sex that can reproduce at least once before they are caught, jeopardizing the stability of the species in the basins of the Meta and Guaviare rivers. In conclusion, the negative impact of fisheries on the species was noted, which may affect future

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los individuos de mayor tamaño y edad están disminuyendo en la población, favoreciendo la maduración temprana de los ejemplares a menores tallas, como se ha reportado en otras pesquerías (10, 11, 13, 17, 18, 19). Lo anterior también puede afectar el período reproductivo, ya que este tiende a ser más amplio estacional y espacialmente con parentales de mayor edad al compararlos con los más jóvenes (13). La disminución en la TMG afecta negativamente la tasa de crecimiento poblacional, por la eliminación de los ejemplares de alto valor reproductivo (11, 19) ya que se ha demostrado ampliamente el efecto maternal dependiente del tamaño, en el que las hembras de mayor longitud y edad producen huevos y larvas más grandes y fuertes, con mayores probabilidades de sobrevivencia que los de hembras más jóvenes (11, 13, 20); la reproducción a edades más tempranas y menores tamaños reduce la fecundidad (20), la resiliencia a cambios ambientales (17, 19) y aumenta la sensibilidad de las larvas a variaciones climáticas, lo que incrementa la sensibilidad del reclutamiento a cambios interanuales por el clima (13). Espacialmente también los resultados indican que las hembras y machos de la parte alta del río Guaviare mantienen una TMG mayor que los registrados en la parte alta del río Meta. La pesquería en el alto río Guaviare es relativamente reciente, ya que el aislamiento geográfico y los problemas de orden público han limitado su desarrollo, en contraste con la tradición pesquera de más de 50 años en el alto río Meta. Aun así la TMG de las hembras en el alto río Guaviare es inferior a los registros históricos del alto río Meta anteriores al quinquenio 2006-2011, demostrando que como en el Meta, en esa zona también se está ejerciendo alta presión pesquera sobre los ejemplares de mayor talla, las hembras. Es claro que histórica y espacialmente la TPCA de las hembras ha sido inferior a la TMG, lo que implica que la presión de pesca se ha ejercido sobre ejemplares que no alcanzaron la TMG, que se estimaría la longitud óptima de captura, lo que hace pensar que hay sobrepesca relativa al crecimiento. A esto se suma que la TPCA se encuentra por debajo del percentil 10 de la curva de madurez en Puerto López y en el percentil 30 en San José del Guaviare, lo que puede estar conduciendo a que un bajo número de ejemplares de este sexo llegue a reproducirse al menos una vez antes de ser capturados, poniendo en riesgo la estabilidad de la especie en las cuencas de los ríos Meta y Guaviare. En conclusión se evidenció el impacto negativo de la pesquería sobre la especie que podría afectar en el futuro la productividad debido a disminuciones

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productivity due to declines in recruitment and in the rate of population growth, given that overfishing and selective fishing of adult females is a practice. Extending the closure period of three months starting in April is recommended to facilitate migration and increase parental reproductive success of the species in the area. The significant difference in size between males and females in the TMG Z. zungaro, as well as the dynamic variation of this parameter in the population over time, demonstrates the urgent need to directly monitor and record catches and individualized long-term analysis by gender that will help detect and establish measures to ensure a sustainable exploitation of this resource.

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en el reclutamiento y en la tasa de crecimiento poblacional, dada la sobrepesca por crecimiento y la pesca selectiva de hembras adultas. Se recomienda ampliar el periodo de veda a tres meses iniciando en el mes de abril, a fin de facilitar la migración de los parentales y aumentar el éxito reproductivo de la especie en la zona. La diferencia significativa de tallas entre machos y hembras en la TMG de Z. zungaro, como también la variación dinámica de este parámetro en la población a lo largo del tiempo, demuestra la imperante necesidad de estar haciendo un seguimiento directo a las capturas y un registro y análisis individualizado a largo plazo por sexo que permitan detectar y establecer a tiempo medidas para garantizar la explotación sustentable de este recurso.

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5222-5236, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

First approach to molecular epidemiology of bovine tuberculosis in Colombia Primera aproximación a la epidemiología molecular de la tuberculosis bovina en Colombia Jimena Jojoa-Jojoa, M.Sc, Maira Wintaco M,1 M.Sc, Francisco Osorio R,2 MV, Gloria Puerto-Castro,1* M.Sc, Martha Guerrero-Guerrero,1 Bact. 1Instituto

Nacional de Salud, Dirección de Investigación en Salud Pública, Grupo de Micobacterias, Avenida Calle 26 # 51-20 Bogotá D.C. Colombia. 2Instituto Colombiano Agropecuario ICA, Programa de Brucelosis y Tuberculosis bovina, Carrera 41 #17-81 Bogotá D.C. Colombia.*Correspondencia: gpuerto@ins.gov.co Received: March 2015; Accepted:June 2015.

ABSTRACT Objective. To investigate the presence of Mycobacterium bovis and other Mycobacterium species in samples of cattle and buffalo in Colombia, to start the molecular characterization of M. bovis in the country. Material and methods. 492 samples were collected from herds identified with the presence of infected animals through the PPD, by the Group of Bovine Tuberculosis ICA Colombian Agricultural Institute in eight departments of Colombia. Lymph nodes of head, thorax and abdomen, gross lesions of tissues with tuberculosis, nasal swabs, milk, blood and fresh cheeses were included. Samples were subjected to detection of Mycobacterium bovis and other mycobacteria by conventional microbiological analysis and PCR-6110 and spoligotyping molecular assays. Results. In the samples analyzed especially in lymph nodes, Mycobacterium bovis was demonstrated with genotypes reported and not previously reported in the world, as well as M. tuberculosis in Antioquia, Cundinamarca, Boyacá and Magdalena departments. Conclusions. In Colombia there are at least 7 genotypes of M. bovis that are infected and sick cattle and buffalo from four different departments becoming serious threat to public health. Key words: Bovine tuberculosis, Mycobacterium bovis, diagnostic, molecular epidemiology, zoonosis (Sources: DeSC, MeSH).

RESUMEN Objetivo. Investigar la presencia de Mycobacterium bovis y otras especies de Mycobacterium en muestras de ganado bovino y búfalino en Colombia e iniciar la caracterización molecular de M. bovis en el país. Materiales y métodos. 492 muestras fueron recogidas de hatos identificados con presencia de animales infectados a través de la prueba de PPD, por el Grupo de Tuberculosis Bovina del Instituto Colombiano Agropecuario ICA en ocho departamentos de Colombia. Se incluyeron ganglios linfáticos de cabeza, tórax y abdomen, tejidos con lesiones macroscópicas de tuberculosis, hisopos nasales, leche, sangre y quesos frescos. Las muestras se sometieron a investigación de Mycobacterium bovis y otras micobacterias mediante el análisis microbiológico convencional y pruebas moleculares de PCR-IS6110 y spoligotyping. Resultados. En las muestras analizadas especialmente en los ganglios linfáticos, se evidenció Mycobacterium bovis con genotipos reportados y no reportados previamente en el mundo, así como M. tuberculosis en los departamentos de Antioquia, Cundinamarca, Magdalena y Boyacá. Conclusiones. En Colombia existen al menos 7 genotipos de M. bovis que se encuentran infectando y enfermando a bovinos y bufalinos de cuatro diferentes departamentos del país constituyéndose en seria amenaza para la salud pública. Palabras clave: Tuberculosis bovina, Mycobacterium bovis, diagnóstico, epidemiología molecular, zoonosis (Fuentes: DeSC, MeSH). 5222

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Mycobacterium bovis, the causative agent of tuberculosis in cattle, is also a pathogen for large numbers of animals as wild cats, domestic animals and human or nonhuman primates among others; therefore is considered an important zoonotic agent (1). Although M. tuberculosis is the most common etiologic agent of human tuberculosis, this can also be caused by Mycobacterium bovis, the main etiological agent of bovine tuberculosis; hence the importance in knowledge the distribution of this pathogen in the cattle and the identification of other potential reservoirs in Colombia in order to contribute to public health policies in the country, considering that described multiple cases of human tuberculosis caused by M. bovis and multiresistant M. bovis in HIV infected patients in the world (2).

Mycobacterium bovis, agente causal de la tuberculosis en el ganado, es también un patógeno para gran número de animales como los felinos silvestres, animales domésticos y primates humanos y no humanos, entre otros, por lo cual es considerado un agente zoonótico importante (1). Aunque M. tuberculosis es el agente etiológico más frecuente de la tuberculosis humana, ésta también puede ser producida por M. bovis; de ahí la importancia en el conocimiento de la distribución de éste patógeno en el ganado, así como la identificación de otros posibles reservorios en Colombia, con el fin de contribuir a las políticas de salud pública en el país; teniendo en cuenta que se han descrito varios casos de tuberculosis humana causada por M. bovis y M. bovis multirresistente en pacientes infectados con VIH en el mundo (2).

In the industrialized countries, the incident of bovine tuberculosis in animals and human beings has diminished with the pasteurization processes of milk and the judicious managing of the programs of elimination. Meanwhile, into developing countries the bovine tuberculosis has a significant impact owed probably to the generalized lack of pasteurization process for the country and absence of documentation on the sanitary condition of the production lines bovine (3). In Colombia, the Colombian Agricultural Institute ICA, within the program of eradication of tuberculosis and brucellosis, has established the use of tuberculin (PPD) or derivative protean purified, for the diagnosis of the bovine tuberculosis in these animals. This program has normalized that the animals with positive PPD must be sacrificed, whereas the cattle estates with two negative results in the consecutive years must be declared like free of tuberculosis by ICA (4). Although the PPD is a good tool to identify positives cattles for M. bovis and initiate the sanitation of farms for the control and eradication of bovine tuberculosis, this test has limitations in sensitivity and specificity and therefore may show false positive, generating economic losses (5, 6). This joined the national epidemiological and economic context, is essential improve, simplify and extend the diagnosis using more sensitive and specific tests, indicate that with greater certainty about the behaviors continue to animals, to contribute to the eradication of the disease, as well and the saving of resources within the National Program of Bovine Tuberculosis Eradication (7).

En los países industrializados la incidencia de tuberculosis bovina en animales y humanos ha disminuido por los procesos de la pasteurización de la leche y el manejo adecuado de los programas de eliminación. Mientras tanto, en los países en vía de desarrollo la tuberculosis bovina tiene un mayor impacto, debido probablemente a la carencia de procesos de pasteurización generalizados para el país y a la ausencia de documentación sobre el estado sanitario de las cadenas de producción bovina (3). En Colombia el Instituto Colombiano Agropecuario ICA, dentro del programa de erradicación de la tuberculosis y la brucelosis, tiene establecido el uso de la tuberculina (PPD) o derivado proteico purificado, para el diagnóstico de la tuberculosis bovina en estos animales. Este programa establece que los animales PPD positivos deben ser sacrificados y las fincas puestas en cuarentena, mientras que las fincas ganaderas con animales PPD negativos en dos años consecutivos, son declaradas como libres de tuberculosis por el ICA (4). Aunque la PPD es una herramienta que permite identificar animales positivos para M. bovis y así iniciar el saneamiento de las fincas para el control y erradicación de la tuberculosis bovina, esta prueba presenta limitaciones de sensibilidad y especificidad y por lo tanto puede mostrar falsos positivos; generando pérdidas económicas (5, 6). Lo anterior unido al contexto epidemiológico y económico nacional, hace prioritario mejorar, simplificar y extender el diagnóstico usando pruebas más sensibles y específicas, que con mayor especificidad indiquen sobre las conductas a seguir con los animales, para contribuir con la erradicación de la enfermedad, así como al ahorro de recursos en el marco del Programa Nacional de Erradicación de Tuberculosis Bovina (7).

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In Colombia, the prevalence of bovine tuberculosis detected postmortem is inaccurate and the number of farms officially certified since free of tuberculosis, has increased dramatically in the last years (4). In 2014, Colombia produced 6.717 million liters of milk and more than 837 million kilograms of beef (8), which meant a high proportion of revenue of currencies for the nation, therefore, a better knowledge and documentation of the situation of bovine tuberculosis it becomes necessary in order to adapt and to improve the epidemiological vigilance of this pathology guaranteeing the free revenue of the colombian products to the world markets (7). In the field of the microbiological diagnosis of the bovine tuberculosis, this is delayed and costly, and is known that the excretion of the Mycobacterium in the milk is intermittent and less than 30% of the infected animals eliminate the Mycobacterium for this way (9). P r e v i o u s s t u d i e s h a ve b e e n s u c c e s s f u l documenting the applicability of the PCR based in IS6110 as molecular method of detection of the members of the M. tuberculosis complex causative of tuberculosis in animals (10-12), especially for direct detection of M. bovis in tissues of bovine and milk where they have brought that provides rapid diagnosis of the disease. On the other hand, in recent years, the develop of an alternative technology of molecular classification of the members of the complex M. tuberculosis called spoligotyping has been successfully applied in the investigations of molecular epidemiology of the tuberculosis, with special usefulness in bovine tuberculosis (13-16). Considering the absence of true information and in order to document the current situation of the bovine tuberculosis in Colombia, that enables the adjustment of control measures in the frame of National Program of control and eradication of the bovine tuberculosis, we developed our first national investigation using the conventional and molecular tools.

MATERIALS AND METHODS Study type. An observational analytical study was developed in cattle estates from eight Colombians departments, selected based in the results of tuberculin tests applied by the Colombian Agricultural Institute (ICA), within national epidemiological vigilance program for trace the M. bovis causing of bovine tuberculosis (17).

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En Colombia, la prevalencia de tuberculosis bovina detectada post mortem es inexacta y el número de fincas oficialmente certificadas como libres de tuberculosis se ha incrementado en los últimos años (4). En el año 2014 Colombia produjo 6.717 millones de litros de leche y más de 837 millones de kilos de carne bovina (8), lo cual significó una alta proporción del ingreso de divisas para la nación, por lo tanto, un mejor conocimiento y documentación de la situación de tuberculosis bovina se hace necesario con el fin de adecuar y mejorar la vigilancia epidemiológica de esta patología garantizando el libre ingreso de los productos colombianos a los mercados mundiales (7). En el campo del diagnóstico microbiológico de la tuberculosis bovina, el cual es demorado y costoso, se sabe que la excreción de Mycobacterium en la leche es intermitente y menos del 30% de los animales infectados eliminan la micobacteria por esta vía (9). Previos estudios han sido exitosos en documentar la aplicabilidad de la PCR basada en IS6110 como método molecular de detección de los miembros del complejo M. tuberculosis causantes de la tuberculosis en animales (10-12), especialmente para la detección directa de M. bovis en tejidos de bovinos y leche donde han reportado que proporciona un rápido diagnóstico de la enfermedad. Por otra parte, en años recientes, se desarrolló una técnica alternativa de tipificación molecular de los miembros del complejo M. tuberculosis denominada spoligotyping que ha sido exitosamente aplicada en las investigaciones de epidemiologia molecular de la tuberculosis, con especial utilidad en tuberculosis bovina (13-16). En vista de la ausencia de información y con el fin de documentar la situación actual de la tuberculosis bovina en Colombia para hacer posible la adecuación de las medidas de control en el marco del programa nacional de control y erradicación de la tuberculosis bovina, se planteó el desarrollo de la primera investigación a nivel nacional usando las herramientas convencionales y moleculares.

MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio. Se realizó un estudio observacional analítico en fincas ganaderas de ocho departamentos de Colombia, seleccionadas con base en los resultados de las pruebas de tuberculina que aplica el Instituto Colombiano Agropecuario, (ICA), dentro del programa de vigilancia epidemiológica nacional, para la circulación de M. bovis causante de tuberculosis bovina (17).

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Samples included in the study. Samples of lymph node of head, thorax and abdomen, and woven from tubercular injuries of bovines and buffaloes sacrificed according to resolution of the ICA were taken. The animals not slaughtered from positives farms were undergoing to collection of nasal swab, blood or milk according to the criterion of ICA veterinarians. Also, were included in this study raw milk and fresh cheeses samples from municipalities where there were estates included in the study.

Muestras incluidas en el estudio. Se tomaron muestras de ganglios linfáticos de cabeza, tórax y abdomen así como de tejidos con lesiones tuberculosas de bovinos y bufalinos sacrificados según resolución del ICA. A los animales no sacrificados de las fincas positivas se les tomó hisopado nasal, sangre o leche según criterio de los médicos veterinarios del ICA. También se incluyeron muestras de leche cruda y quesos frescos de municipios con fincas PPD positivas, incluidas en el estudio.

Specimen collection and transport. The samples were gathered during the years 2008 to 2010, in cattle estates identified by ICA as positives to the tuberculin and in the plants of benefit, which were transported preserving the cold chain, to the Mycobacteria’s Laboratory at the National Institute of Health (INS) in Bogota Colombia.

Toma de muestras y transporte. Las muestras fueron recolectadas durante los años 2008 a 2010, en fincas ganaderas identificadas por el ICA como positivas a la tuberculina y en las plantas de beneficio, las cuales fueron transportadas al laboratorio de Micobacterias del Instituto Nacional de Salud (INS) en Bogotá Colombia, conservando la cadena de frio.

Processing of samples, lymph node and tissues with macroscopic lesions. 2 to 5 g of samples previously washed, were individually macerated into sterile mortars. 1g of this macerated was placed into falcon plastic vial of 50 ml with 9ml of acid oxalic (4%) at 37°C during 20 minutes, after which we neutralized by NaOH (4 %) in the presence of red of phenol (1%). It was centrifuged to 4000xg for 10 minutes at 4°C. The supernatant was discarded and the sediment was washed by centrifugation twice and was resuspended with distilled sterile water (18-19).

Procesamiento de las muestras de ganglios linfáticos y tejidos con lesiones macroscópicas. De 2 a 5 g de muestra p r e v i a m e n t e l ava d a , f u e r o n m a c e ra d o s individualmente en morteros estériles. 1g del macerado se colocó en tubo falcón plástico de 50 ml con 9 ml de ácido oxálico (4%) a 370C durante 20 minutos, después de lo cual se neutralizó con NaOH (4%) en presencia de rojo de fenol (1%). Se centrifugó a 4000xg por 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se descartó y el sedimento fue lavado 2 veces por centrifugación y se resuspendió en agua destilada estéril (18-19).

Processing of milk samples. Aseptically were collected 50ml of milk, which were centrifuged for 30 minutes at 4.000xg and 4ºC. 21ml of the sediment was decontaminated with 3 ml of lauryl sulfate of sodium, incubating at ambient temperature during 30 minutes. Later, this was centrifuged during 30 minutes at 4.000xg and 4°C. The supernatant was discarded and the sediment was re-suspended with distilled sterile water (18-19).

Procesamiento de las muestras de leche. 50ml de leche recogida en forma aséptica, fueron centrifugados a 4.000xg por 30 minutos a 4ºC. 21 ml del sedimento se descontaminó con 3 ml de lauril sulfato de sodio incubando a temperatura ambiente por 30 minutos. Posteriormente se centrifugó a 4.000xg por 30 minutos a 4°C y se descartó el sobrenadante el sedimento se resuspendió con agua destilada estéril (18-19).

Processing of nasal swabs samples. The samples of nasal swabs were dissolved by washing of hyssop, in 10ml of PBS. This product was centrifuged at 4.000xg during 30 minutes at 4°C. The supernatant was discarded, preserving the sediment, which was decontaminated by Kudoh method (18-19).

Procesamiento de las muestras de hisopado nasal. Las muestras de hisopado nasal se disolvieron lavando el hisopo en 10 ml de PBS. Posteriormente se centrifugó a 4.000xg por 30 minutos a 4°C y se descartó el sobrenadante, conservando el sedimento, que fue descontaminado por el método de Kudoh (18-19).

Processing of blood samples. Samples of blood were subjected to centrifugation at 2.000 xg during10 minutes at 4ºC, to recover the white blood cells, which were lysates by adding 1 volume of sodium deoxycholate (0.4%) incubating at ambient temperature 30 minutes. Later, were centrifuged at 4.000xg during 30

Procesamiento de las muestras de sangre. Las muestras de sangre se sometieron a centrifugación a 2.000xg por 30 minutos a 4ºC, para recuperar los glóbulos blancos, los cuales fueron lisados adicionando 1 volumen de deoxicolato de sodio (0.4%) incubando a temperatura ambiente por 30 minutos.

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minutes and 4°C. The supernatant was discarded and the sediment was re-suspended with 1 ml distilled sterile water (18-19). Bacilloscopy. The sediment obtained by processing of each one of the samples of lymph nodes, tissues with gross lesions, blood, swabs and milk, were extended on slide to realize bacilloscopy, staining with the Ziehl-Neelsen coloration to looking the presence of bacilli acid alcohol resistant (BAAR), by observation of 100 fields with a white light microscope(18-19). Culture. The sediment obtained by processing of each one of the samples of lymph nodes and tissues with gross lesions, blood, swab or milk, was cultured by duplicate in culture middles: Lowenstein-Jensen and Stonebrink-Giraldo’s modified (STG). The cultures were incubated at 37ºC for growth readings, weekly up to completing 12 weeks when the negative cultures were discarded. The cultures with growth were submitted to Ziehl Neelsen coloration and those who presented BAAR were investigated by phenotypic tests of identification (18-19). Phenotypic identification of species. The tests of species identification were carried out bearing in mind the recommendations from CDC of Atlanta. The cultures that presented growth were colored by Ziehl Neelsen to check the purity. So, those were processed by biochemical and enzymatic tests: niacin detection, nitrates reduction, catalase activity and semi quantitative catalase, tween hydrolysis, enzymatic activity of pyrazinamide and the acid phosphatase. In addition, we determined the inhibition of growth in LJ containing NaCl (5%); 2-tiofencarboxilic acid Hydrazide (TCH) and Hydroxylamine (HAS); in MacConkey agar, in Sauton and Sauton Picric (2%) (18-19). DNA Extraction. An aliquot of 1 g macerated or sediment obtained by processing of each one of samples of lymph nodes and tissues with gross lesions, blood, swab or milk, were submitted to extraction of DNA according to the recommendations of van Soolingen et al (20), method based in CTAB, chloroform-isoamyl alcohol, and precipitating with isopropanol. Every DNA sample obtained was re-suspended in a buffer TE 0.1X. The quantification of the DNA was realized in the gel of agarose to 0.8% (w/v) by bromide of ethidium 0.5 ug/mL using DNA Ladder High MW Invitrogen (Cat Nº 10496-016) as reference pattern (20). Genotypic Identification. An aliquot of macerated or sediment obtained by processing of each one of samples of lymph nodes and tissues

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Posteriormente, se centrifugó a 4.000xg por 30 minutos a 4°C. Se descartó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 1 ml de agua destilada estéril (18-19). Baciloscopia. El sedimento obtenido del procesamiento de cada una de las muestras de ganglios linfáticos, tejidos con lesiones macroscópicas, sangre, hisopado y leche, fue extendido sobre lámina para realizar baciloscopia usando la tinción de Ziehl Neelsen buscando la presencia de bacilos ácido alcohol resistentes mediante observación de 100 campos con microscopio óptico de luz blanca (18-19). Cultivo. El sedimento obtenido del procesamiento de cada una de las muestras de ganglios linfáticos y tejidos con lesiones macroscopicas, sangre, hisopado o leche, fue cultivado por duplicado en medio de cultivo Lowenstein-Jensen y Stonebrink modificado por Giraldo (STG). Los cultivos fueron incubados a 37ºC con lecturas del crecimiento semanal hasta completar 12 semanas cuando los cultivos negativos fueron descartados. Los cultivos con crecimiento se sometieron a coloración de Ziehl Neelsen y los que presentaron BAAR fueron sometidos a pruebas de identificación fenotípica (18-19). Identificación fenotípica de especie. Las pruebas de identificación de especie se llevaron a cabo teniendo en cuenta las recomendaciones del CDC de Atlanta. Los cultivos que presentaron crecimiento fueron coloreados con Ziehl Neelsen para verificar la pureza. Posteriormente se sometieron a las pruebas bioquímicas y enzimáticas tales como la detección de niacina, reducción de nitratos, actividad de catalasa y catalasa semicuantitativa en medio LJ, hidrólisis de tween, detección de la actividad enzimática de pirazinamidasa y de fosfatasa ácida. Además, se les realizó pruebas de inhibición del crecimiento en medio LJ conteniendo NaCl (5%), Hidracida del ácido 2-tiofencarboxilico (TCH), Hidroxilamina (HA) y en agar MacConkey, Sauton y Sauton Pícrico (2%) (18-19). Extracción de ADN. Una alícuota de 1 g del macerado o sedimento obtenido del procesamiento de las muestras de ganglios linfáticos y tejidos con lesiones macroscópicas, sangre, hisopado o leche, fue sometida a proceso de extracción de ADN según las recomendaciones de van Soolingen et al (20) basadas en el método de CTAB y cloroformo-alcohol isoamílico precipitando con isopropanol. Cada muestra de ADN obtenido fue resuspendida en buffer TE 0.1X. La cuantificación del DNA se realizó en gel de agarosa al 0.8% (p/v) con bromuro de etidio 0.5 ug/ mL, utilizando High DNA MW Ladder de Invitrogen (Cat Nº 10496-016) como patrón de referencia (20).

Jojoa - Mycobacterium bovis in cattle production in Colombia with gross lesions, blood, swab or milk, were submitted to identification of Mycobacterium belonging to the M. tuberculosis complex by amplification PCR-IS6110. For the discrimination of the members of the complex, specifically the M. bovis, we used the molecular methodology of spoligotyping. PCR-IS6110. The detection of the sequence of insertion IS6110, typical of M. tuberculosis complex, previous standardization, were developed through a PCR-IS6110 described by Kremer et al (21) in a mixture of reaction of the final volume of 50µl that it contained 1.5mM of MgCl2, 0.125mM of dNTP’s; 0.125 µM of each primers INS1 (5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’) and INS2 (5’-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3’) to amplified a 245 bp fragment of IS6110 insertion sequence. We used the C1000 Thermal Cycler Bio-Rad ® to program of one initial cycle of denaturalization at 96ºC, 5min and 30 cycles of 96ºC x1min, 65ºCx1min and 72ºCx1min with a final extension of 72ºC x 7min. The amplification product was visualized in agarose gel (1.5%) (w/v) with bromide of ethidium using molecular weight marker 50pb (Sigma®). Spoligotyping. The discrimination of M bovis from other members of M. tuberculosis complex, was realized using the molecular methodology of spoligotyping before described by Kamerbeer et al (22). From macerated or sediment obtained by processing of each one of samples of lymph nodes and tissues with gross lesions, blood, swab or milk and positive cultures a region of the locus DR amplifies with primers specifics DRa and DRb and the products of amplification hybridize in a membrane (Immunetics) in which oligonucleotides synthetic they have been covalently close. The detection is realized using streptavidin peroxidase brought together (Roche Diagnostics Ltd, UK) and the casing ECL (GE, Biotech). The results were translated from binary code to octal code for comparison. Analysis of results. Several databases were created in spreadsheets Excel 2007 for every analysis types, one for each characterization of animals and microbiological results of studied animals by culture, ZN and molecular markers PCR-IS6110 and spoligotyping. The results of spoligotyping were comparison with the molecular patterns found in the International base SpolDB4 of the Institute Pasteur of the Guadeloupe (23), equally, comparison was made with the database of M bovis spoligotypes (24) to determine the SIT (spoligo international type), family and international location.

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Identificación genotípica. Una alícuota del macerado o sedimento obtenido del procesamiento de las muestras de ganglios linfáticos y tejidos con lesiones macroscópicas, sangre, hisopado o leche, fue sometida a la amplificación por PCR-IS6110, para la identificación de micobacterias pertenecientes al complejo M. tuberculosis. Para la discriminación de los integrantes del complejo tuberculosis y específicamente el M. bovis, se realizó la metodología molecular de spoligotyping. PCR-IS6110. La detección de la secuencia de inserción IS6110 típica del complejo M. tuberculosis, se realizó previa estandarización, a través de una PCR-IS6110 descrita por Kremer et al (21), en una mezcla de reacción con volumen final de 50µl que contenía 1.5mM de MgCl2, 0.125mM de dNTP’s; 0.125 µM de cada uno de los primer INS1 (5’ a 3’ CGTGAGGGCATCGAGGTGGC) e INS2 (5’ a 3’ GCGTAGGCGTCGGTGACAAA) para amplificar un fragmento de 245 pb de la secuencia de inserción IS6110. La reacción se realizó en un C1000 Thermal Cycler Biorad® usando 1 ciclo de desnaturalización inicial de 96ºC de 5min, 30 ciclos de 96ºC x1min, 65ºCx1min y 72ºCx1min con una extensión final de 72ºC x 7min. El producto de amplificación se visualizó en gel de agarosa al 1.5 % (p/v) con bromuro de etidio utilizando marcador de talla molecular de 50pb (Sigma®). Spoligotyping. La discriminación del M. bovis y demás miembros del complejo, se realizó utilizando la metodología molecular de spoligotyping previamente descrita por Kamerbeer et al (22), a partir del macerado o sedimento obtenido del procesamiento de las muestras de ganglios linfáticos y tejidos con lesiones macroscópicas, sangre, hisopado o leche y a partir de cultivos positivos. Una región del locus DR se amplificó con primers específicos DRa y DRb y los productos de amplificación se hibridaron en una membrana (Immunetics) en la cual oligonucleótidos sintéticos habían sido covalentemente unidos, la detección se realizó utilizando streptavidina peroxidasa conjugada (Roche Diagnostics Ltd, UK) y el estuche ECL (GE,Biotech). Los resultados fueron traducidos a código binario y código octal para la comparación. Análisis de resultados. Se generaron varias bases de datos en hojas de cálculo Excel 2007 para cada tipo de análisis, cada una para la caracterización de los animales y los resultados microbiológicos mediante cultivo, ZN y marcadores moleculares PCR-IS6110 y spoligotyping. Los resultados de spoligotyping fueron comparados con los patrones moleculares encontrados en la base Internacional SpolDB4 del Instituto Pasteur de la Guadalupe (23),

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Descriptive analysis. Descriptive analysis was realized of the animals characteristics studied according to the department and municipality of origin.

igualmente se realizó comparación con la base de datos de M. bovis spoligotype Database (24) para determinar su SIT (spoligo internacional type), familia y ubicación internacional.

Independence analysis. To identify the relation between the animals’ variables as species, sex and race with the Mycobacterium infection was used independence tests at 0.05 significance level, If the awaited counts are superior to 5, the probability corresponds to a distribution of chi- square. If the counts are low, the probability corresponds to Fisher’s exact test (25).

Análisis descriptivo. Se realizó análisis descriptivo de las características de los animales estudiados teniendo en cuenta departamento y municipio de origen.

Ethics statement. The Ethic Committee from National Institute of Health endorsed the study, considering that was an investigation without risk. The blood, tissues and nasal swabs samples from the cattle used for culture and/or DNA extraction, were collected under the directive of the Colombian Agricultural Institute, (ICA) within national epidemiological vigilance program (17) and their use in the present study for other purposes as to trace the M. bovis causing of bovine tuberculosis were not routine.

RESULTS Origin of samples. 492 samples were studied in total. 86.6% was from bovine and 13.4% from buffaloes. The bovine ones of those who took the samples were of race Holstein (39.2%) and Zebu (22.1%), whereas the buffaloes were principally from race Murra (26%). To both species, the samples they belonged principally from females: 81.5% in bovines and 56.1% in buffaloes.

Análisis de independencia. Para identificar la relación entre las variables de los animales como: especie, sexo y raza con la infección por Mycobacterium, se utilizaron pruebas de independencia con un nivel de significancia de 0.05; si los recuentos esperados eran superiores a cinco, la probabilidad correspondía a una distribución de Chi cuadrado, si los recuentos eran bajos se realizó una prueba de Fisher exact (25). Aspectos Éticos: El Comité de Ética del Instituto Nacional de Salud avaló la investigación, teniendo en cuenta que se consideró como una investigación sin riesgo. Las muestras de sangre, leche, tejidos e hisopos nasales de los bovinos, utilizadas para los cultivos y extracción de ADN se recolectaron bajo las directrices del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), dentro del Programa de Vigilancia Epidemiológica Nacional de la tuberculosis bovina (17) y su uso en el presente estudio para otros propósitos como el rastreo de M. bovis causante de tuberculosis bovina no era rutinario.

RESULTADOS Procedencia de las muestras. En total se estudiaron 492 muestras; tomadas de bovinos (86.6%) y tomadas de bufalinos (13.4%). Las razas de los bovinos fueron, Holstein (39.2%) y Cebú (22.1%), mientras que la raza de los bufalinos fue principalmente la Murra (26%). En ambas especie las muestras provinieron principalmente de hembras: 81.5% en bovinos y 56.1% en bufalinos, de los departamentos de Cundinamarca n=197 (40%) seguido de Boyacá n=107 (21.74%), Magdalena n=94 (19.10%) y Antioquia n=84 (17.07%); los demás departamentos aportaron menor proporción de muestras (Figura 1). Tipo de muestras estudiadas. En la tabla 1 se observa el tipo de muestras estudiadas según el tipo de bovino y el departamento de procedencia.

Figure 1. Departments of origin of the samples included in the study and the M bovis isolated.

Resultados de la investigación microbiológica Coloración de Zielh Neelsen. Se obtuvo 7.11% (n=35) de positividad que mostró una concordancia del 85.71% con respecto a los resultados del cultivo. La totalidad de las muestras que fueron positivas

Jojoa-Jojoa - Mycobacterium bovis in cattle production in Colombia The samples were from Cundinamarca’s department n=197 (40%), followed by Boyacá n=107 (21.74%), Magdalena n=94 (19.10%) and Antioquia n=84 (17.07%); other departments contributed with minor proportion of samples. (Figure1). Type of samples studied. In the table 1 we discriminate the type of sample studied according to class of cattle and department of origin. Microbiological Investigation. Zielh Neelsen coloration. Were obtained 7.11% (n=35) positive samples that showed a concordance of 85.71% with regard to the culture results. The totality of positive samples by this procedure, were samples of ganglions, 54.28% from bovine and 45.71% from buffaloes. Culture Investigation. In 492 studied samples we found 23.98% (n=118) positive samples to culture, of which 18.64% (n=22) were of nasal swabs, 1.69% (n=2) of milk and 79.66% (n=94) of lymphatic ganglions. In turn, 73.73% of these samples were from bovines and 26.27% from buffaloes. The phenotypic identification of the positive cultures showed M. bovis in 71.19% (n=86) of them and 14.4% (n=17) M. tuberculosis complex, whereas 7.62% (n=9) corresponded to M. tuberculosis and 5.08% (n=6) to Mycobacterium spp. it’s interesting to highlight that all isolations of M. bovis were achieved from lymphatic ganglions samples, whereas the M. tuberculosis and the M. sp were obtained principally of nasal swabs (n=22) and in minor proportion from ganglions (n=8) and from milk (n=2). The isolations achieved by this culture methodology coming only from Antioquia, Cundinamarca, Boyacá and Magdalena departments, also specifically from seven municipalities: Chibolo, Chiquinquirá, Puerto Nare, Santa Rosa de Osos, Simijaca, Tarazá y Yondó. In total 10 estates had positive cultures to Mycobacterium (Table 2).

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por este procedimiento eran muestras de ganglios linfáticos provenientes en el 54.28% de bovinos y el 45.71% de bufalinos. Investigación por cultivo. En las 492 muestras estudiadas se encontró 23.98% (n=118) de positividad al cultivo, de las cuales 18.64% (n=22) eran muestras de hisopado nasal, 1.69% (n=2) de leches y 79.66% (n=94) de ganglios linfáticos. Al mismo tiempo el 73.73% de estas muestras provenían de bovinos y 26.27% de bufalinos. La identificación fenotípica de los cultivos positivos mostró M. bovis en el 71.19%(n=86) de ellos y 14.4% (n=17) de M. tuberculosis complex, mientras que el 7.62%(n=9) correspondieron a M. tuberculosis y 5.08% (n=6) correspondieron a Mycobacterium spp. Es interesante resaltar que todos los aislamientos de M. bovis se lograron a partir de muestras de ganglios linfáticos, mientras que el M. tuberculosis y el M. spp se obtuvieron principalmente de hisopados nasales (n=22) y en menor proporción de ganglios linfáticos (n=8) y de leches (n=2). Los aislamientos logrados por esta metodología de cultivo provenían únicamente de los departamentos de Antioquia, Cundinamarca, Boyacá y Magdalena, también específicamente de siete municipios: Chibolo, Chiquinquirá, Puerto Nare, Santa Rosa de Osos, Simijaca, Tarazá y Yondó. En total 10 fincas tuvieron cultivos positivos para Mycobacterium (Tabla 2). Investigación molecular Resultados de PCR-IS6110. La metodología molecular de amplificación en cadena de la polimerasa usando como blanco molecular la secuencia de inserción IS6110 que es especifica del complejo tuberculosis, presentó una positividad del 51.02% (n=251) por lo cual fue dos veces más sensible que el cultivo y siete veces más sensible que la coloración de ZN. Resultados de spoligotyping. 47.56% (n=234) muestras fueron positivas por esta metodología,

Table 1. Samples enrolled in this study, discriminated by type and from origin department. Department

Specie

Ganglions/tissues

Nasal swabs

Blood

Raw Milk

Fresh Cheese

Total

Buffaloes

Bovine

Boyacá

Bovine

107 2

Antioquia

Cesar

Bovine

Córdoba

Bovine

Cundinamarca

Bovine

197

Magdalena

Bovine

Nariño

Bovine

Risaralda

Bovine

Total

238

173

492

5230

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Table 2. Microbiological and molecular results from samples studied by year and department. SAMPLE year

2008 2008 2008

2008

2009 2009 2009 2009

2009

N° 19

Animal specie

Origen

6 bovineos

Ganglions

13 buffaloes

POSITIVE RESULTS Depto/ municip

Z-N

CULTURE

Choco,

PCR-

Specie

IS6110

(spoligotyping)

1 M.tb comp NR

Antioquia

bovines

Ganglions

Antioquia:

9 M. bovis SB01075

Santa Rosa

buffaloes

Ganglions

Antioquia:

buffaloes

Ganglions

Antioquia:

8 M. bovis SB0822

Yondó

3 M. bovis SB0121

1 M.tb comp NR

bovines

Ganglions

Córdoba,

bovines

Ganglions

Cundinamarca:

Antioquia

Cesar:

Cáceres

Antioquia Nemocón 2

bovines

Ganglions

bovines

Ganglions

1 M.tb comp NR 1 MANU-2(54)

Bosconia 58

bovines

Ganglions

Cundinamarca:

3 M. bovis SB01075

Simijaca

2 M.tb comp NR

1 Mtb U(523)

6 ND

bovines

Hisopado nasal

Cundinamarca:

5 Mtb U(523)

Simijaca

4 Mtb U(1146) 4 M.tb comp NR

2009

4 MANU-2(54) 25 Mtb T1(53) 1 ND

2009

bovines

Leche cruda

Cundinamarca:

bovines

Nasal swabs

Magdalena:

2 M.tb comp NR

4 M.tb comp NR

Simijaca Chibolo

54 MANU-2(54) 12 Mtb U(523)

2009

1 Mtb U(1146) 2 Mtb T1(53) 1 ND

2009

2010

bovines

Raw Milk

Magdalena:

1 Mtb U(523)

buffaloes

Ganglions

Antioquia:

9 M. bovis SB0121

Puerto Nare, Taraza

4 M. bovis SB0822

2 M. bovis SB0961

2 M. bovis SB0120

1 M. bovis SB0295

2 M. tb comp NR

4 ND

bovines

Ganglions

Boyacá:

44 M. bovis SB01075

Chiquinquirá

6 M. tb comp NR

2 MANU-2(54)

8 ND

bovines

Blood

Cundinamarca:

5 M. tb comp NR

Chibolo

1 ND

Simijaca

2010

3 MANU-2(54) 2 MANU-2(1190) 2 ND

bovines

Fresh Cheese

Boyacá,

4 M. tb comp NR

Cundinamarca,

2010

Nariño: Pasto, 492

Risaralda

118

257

Jojoa-Jojoa - Mycobacterium bovis in cattle production in Colombia

5231

Molecular investigation Results of PCR-IS6110. The molecular methodology of amplification by polymerase chain reaction using as molecular target the insertion sequence IS6110 that is specific of the Mycobacterium tuberculosis complex, It present a positivity of 51.02% (n=251) for which it was two times more sensitively that the culture and seven times more sensitive that ZNâ&#x20AC;&#x2122;s coloration. Results of spoligotyping. 47.56% (n=234) of samples showed positivity for this methodology with a pattern belonging to M bovis in the 34.13% (n=86) and 65.87% (n=148) with a pattern from M tuberculosis. We identified 36 different genotypes and there were 22 samples that did not present pattern since did not achieve hybridization, although they amplified (Figure 2). Among the isolations with pattern from M. bovis family, 7 were spoligotypes before reported: SB1075 (56 isolations), SB0822 (12 isolations), SB0961 (2 isolations), SB0121 (12 isolations), SB0295 (1 isolations) SB1190 (1 isolation) and 1 spoligotype SB0120 (2 isolations). Therefore, the great majority of samples that presented pattern from the M. bovis family already had reported in the database of M. bovis Spoligotype (24). Among the samples with spoligotypes not belonging to M. bovis family, we found six families where the majority was constituted by MANU 2 SIT 54 (n=64), followed by the genotype of M. tuberculosis NR (n=31) not reported, and for the genotype T1 SIT 53 (n=27). Also, there were present the genotypes U SIT 523; U SIT 1146 and MANU 2 SIT 1190 with 19, 5 and 2 isolates respectively (Figure 3). Like the results show, from the culture methodology we can observed that the nasal swabs (n=115) were the main contributors of genotypes, different from M. bovis family, though also some ones came from ganglions (n=16) milk (n=3), blood (n=10) and cheeses (n=4). Relation between variables of the herd and the presence of Mycobacterium tuberculosis complex in the animals. In the evaluation of possible factors related to the presence of Mycobacterium belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex in animals (according to the test of PCR-IS6110), met significant association for 79.8% of positivity versus 20.21% healthy animals from Magdalenaâ&#x20AC;&#x2122;s department (p<0.0001). In contrast, Cundinamarca show minor risk of having Mycobacterium (p<0.0001, Table 3).

Figure 2. Dendogram of relation from spoligotypes of M. tuberculosis complex identified in the study.

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identificando un patrón perteneciente a M. bovis en el 34.13% (n=86) de ellas y 65.87% (n=148) presentaron un patrón perteneciente a M. tuberculosis. Se identificaron 36 genotipos diferentes y hubo 22 muestras que no presentaron patrón debido a que no lograron hibridar aunque amplificaron (Figura 2).

Figure 3. Distribution of M. tuberculosis genotypes not belonging to M bovis family identified in the study.

Tabla 3. Resultados de las pruebas de Chi-cuadrado entre la presencia de Mycobacterium, las características del animal y procedencia. Positiveo

Negative

PR > Tables*

Real

Expected

Real

Expected

Antioquia

0.8273

51%

50%

49%

50%

Boyacá

Factors

0.1003

58%

50%

42%

50%

Cesar

50%

100%

50%

Córdoba

50%

100%

50%

Cundinamarca

<0.0001

36%

50%

64%

50%

Magdalena

<0.0001

80%

50%

20%

50%

0.5637

33%

50%

67%

50%

100%

50%

44%

42%

40%

43%

30%

26%

23%

19%

11%

56%

42%

26%

35%

38%

29%

20%

16%

Nariño Risaralda

Entre los aislamientos con patrón de familias M. bovis, se encontraron 7 spoligotypes reportado previamente: SB1075 (56 aislamientos), SB0822 (12 aislamientos), SB0961 (2 aislamientos), SB0121 (12 aislamientos), SB0295 (1 aislamiento) SB 1190 (1 aislamiento) y SB0120 (2 aislamientos). Por lo tanto, la gran mayoría de muestras que presentaron patrón de esta familia, M. bovis, ya se habían reportado en la base de datos de M. bovis spoligotype Database (24). Entre las muestras con spoligotypes de patrón no perteneciente a la familia M. bovis se encontraron seis familias donde la familia mayoritaria estuvo constituida por el genotipo MANU 2 SIT 54 (n=64), seguido por el genotipo de M. tuberculosis NR (n=31) no reportado y por el genotipo T1 SIT 53 (n=27). También estaban presentes los genotipos U SIT 523; U SIT 1146 y MANU 2 SIT 1190 con 19, 5 y 2 muestras respectivamente (Figura 3). Igual que lo visto en los resultados de la metodología de cultivo, se observó que los hisopados nasales (n=115) son los que aportan los genotipos de familias diferentes al M. bovis; aunque también se encontraron en las nuestras de ganglios linfáticos (n=16) en leches (n=3), en sangre (n=10) y en quesos (n=4).

To other risk factors such as: species, sex within species, or race for cattle (buffaloes only report to one species), were found in Holstein, was found that have a negative percentage above than expected exhibiting a lesser presence of mycobacteria which should randomly. Contrary, in Zebu having values above those expected for animal reports with mycobacterial infection (Table 3).

Relación entre variables del hato y la presencia de micobacterias del complejo M. tuberculosis en los animales. En la evaluación de posibles factores relacionados con la presencia de micobacterias del complejo M. tuberculosis en los animales (según la prueba de PCR-IS6110), se encontró asociación significativa para animales provenientes del departamento de Magdalena (p<0.0001) con 79.8% de positividad versus 20.21% sanos. Contrariamente, Cundinamarca mostró menor riesgo de tener micobacterias (p<0.0001, Tabla 3). Al relacionar los otros factores de riesgo como la especie, el sexo dentro de cada especie, o la raza para los bovinos (para búfalos sólo se reporta una especie), se encontró que los Holstein tienen un porcentaje de negativos por encima de lo esperado, es decir, muestran una menor presencia de micobacterias que las que se debería al azar. Contrario a la Cebú que presenta valores por encima de los esperados para los reportes de animales con micobacterias (Tabla 3).

DISCUSSION

DISCUSIÓN

By the present research, it was possible to demonstrate for the first time that in Colombia exist at least 7 genotypes of M. bovis, which are

Mediante esta investigación se pudo evidenciar por primera vez que en Colombia existen al menos 7 genotipos de M. bovis que se encuentran infectando y

Specie

Buffalo

Bovine

Buffaloes Bovine Female Male Female Male Holstein Cebú

0.9306

0.2084

0.4087

<0.0001

Jojoa-Jojoa - Mycobacterium bovis in cattle production in Colombia

5233

infecting and sicken to bovines and buffaloes from four different Colombian’s departments. This is constituted in a serious threat of zoonosis not only for the manipulators of the estates infected, but also for the manipulators of the productive chain and the final consumers. This finding highlights the recommendation to strengthen surveillance for compliance with Decree 1880 of 2011 on guidelines for the marketing of raw milk for human consumption (26).

enfermando a bovinos y bufalinos de cuatro diferentes departamentos del país, lo cual constituye una seria amenaza para la salud pública por la posibilidad de zoonosis no sólo a los manipuladores de las fincas infectadas sino también para los manipuladores de la cadena productiva y los consumidores finales. Este hallazgo también genera la recomendación de fortalecer la vigilancia para el cumplimiento del decreto 1880 de 2011 sobre los lineamientos de la comercialización de leche cruda para el consumo humano (26).

The genotype SB1075 that was the majoritary found in our study has been reported infecting cattle from United Kingdom and has been confirmed that is slightly frequent in the world’s statistics. Similar situation happens with the other 2 frequent genotypes in this study: the SB0822 and the SB0121 previously reported in Holland, Spain and Latin America (Brazil and Mexico)(27).

El genotipo SB1075 que fue el más frecuente encontrado en nuestro estudio, ha sido reportado infectando ganado del Reino Unido y se ha confirmado que es poco frecuente en las estadísticas mundiales; similar situación sucede con los otros dos genotipos frecuentes en el presente estudio: el SB0822 y el SB0121 reportados previamente en Holanda, España y en Latinoamérica en Brasil y México. (27)

Therefore, it is extremely beneficial correlate the findings of present study with the very low infections incidence, historically observed and demonstrated by PPD and by microbiological investigation into Latin american human population (28), with the reported in colombian population where a single case caused by M. bovis, was confirmed in the INS in 2012 suggesting low infectivity/virulence of M. bovis circulating in Colombia, specifically from the mentioned departments.

Por lo anterior, es muy importante correlacionar los hallazgos del presente estudio, con la baja incidencia de infección, demostrada por PPD y por investigación microbiológica, a nivel poblacional en humanos de Latinoamérica (28), y a lo históricamente evidenciado en Colombia, donde un único caso de tuberculosis causado por M. bovis fue confirmado en el INS en el año 2012 lo cual sugiere una baja infectividad/ virulencia del M. bovis circulante en Colombia, específicamente en los departamentos mencionados.

Since by means of the statistical analysis it was possible to demonstrate that the high presence of M. bovis and not bovis was statistically significant in Magdalena’s department, it is there where principally there must be intensified the measures of vigilance and control in farms and products by the ICA.

Debido a que mediante el análisis estadístico se pudo evidenciar que la mayor presencia de Mycobacterium bovis y no bovis fue estadísticamente significativa en las fincas de Magdalena, es allí donde principalmente se deben intensificar las medidas de vigilancia y control de los predios y productos por parte del ICA.

Another powerful finding, it constitutes to have demonstrated that exists a considerable proportion of animals and samples carrying M. tuberculosis of different genotypes between which there stands out the MANU 2 and the T1, that are consider ancestors of the M. tuberculosis complex, which have a minor virulence for the bovine/buffalo, as for human being. Though possibly they are responsible for the positive tuberculin results in the herds, neither produce disease in the cattle and they do not even affect them in the magnitude that it does the M. bovis that is really pathogenic for the cattle and they could be competing for the host, displacing the M. bovis in ranching (29). In this regard, there exist studies that demonstrate that the M. tuberculosis find in the ranching it’s a reflection of the situation of tuberculosis in human beings in such regions (30-32). This finding puts

Un hallazgo bien importante lo constituye el haber demostrado que existe una considerable proporción de muestras de animales portadores de M. tuberculosis de diferentes genotipos entre los que sobresale el MANU 2 y el T1 que se consideran ancestros del complejo M. tuberculosis, que tienen una menor virulencia para el bovino/bufalino al igual que para el humano y que aunque posiblemente estos sean responsables de los resultados de tuberculina positiva en los hatos, no producen enfermedad en el ganado ni los afectan en la magnitud que lo hace el M. bovis que si es patógeno para el ganado y pudieran estar compitiendo por el hospedero, desplazando al M. bovis de las ganaderías. (29) A este respecto, existen estudios que demuestran que el encontrar M. tuberculosis en las ganaderías, es un reflejo de la situación de la tuberculosis en humanos en tales regiones (30-32) lo cual pone en evidencia la necesidad de realizar mayores esfuerzos para el control de la tuberculosis en humanos en Colombia.

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of present the significant efforts that are needed for the control of tuberculosis in human beings in Colombia. Nevertheless, the true role of this M. tuberculosis, found in the studied animals, must be investigated at depth since this one can be the source responsible for the maintenance of the human tuberculosis in endemic form in our country. It is necessary to highlight the fact that it becomes necessary to complement this investigation with the study of other animals that they find in the estates so positives as negative, to demonstrate the presence of animals carrying Mycobacterium in subclinical state that they can be the reservoirs of this Mycobacterium. The results of this investigation constitute topics of interest to Public Health & Social Protection’s responsible from Colombia, since it is their competition and responsibility developed the control of tuberculosis human as well as the prevention of the zoonosis. In short and according to our findings, it is advisable to restore the program of epidemiological vigilance of the bovine tuberculosis using the methodologies proved in the present study, initially in the departments where we found positivity to M. bovis and/or M. tuberculosis. Secondly one recommends realizing studies more deep with relation to the presence of Mycobacterium tuberculosis complex, different from the M. bovis as they are the MANU 2 and the T1 genotypes both in the wild environment as in the manipulators of the bovine production chain. This study confirmed the circulation in Antioquia, Boyacá, Cundinamarca and Magdalena departments of at least 7 genotypes of Mycobacterium bovis, causing bovine tuberculosis in cattle from ranches. This information is useful for programs surveillance in public health and animal health addressed to articulation of joint actions to build regulatory frameworks for the elimination and control of zoonoses, all of which contribute to improve competitiveness in the chain cattle production, and will impact the fulfillment of international animal health standards to increase access to world markets, improving the economy and directly benefiting to public health. Acknowledgements All personnel working in the National Program for Prevention and Control of Bovine Tuberculosis and Brucellosis ICA in Colombia, for its accompaniment to the sampling areas.

2016

No obstante, el verdadero papel del M. tuberculosis encontrado en los animales estudiados, debe ser investigado a profundidad puesto que este puede ser la fuente responsable del mantenimiento de la tuberculosis humana en forma endémica en nuestro país. Es importante resaltar el hecho que se hace necesario complementar esta investigación con el estudio de animales que se encuentran en las fincas tanto positivas como negativas para evidenciar la presencia de animales portadores de micobacterias en forma subclínica que pueden ser los reservorios de estas micobacterias. Los resultados de esta investigación constituyen temas de interés para el Ministerio de Salud y Protección Social de Colombia puesto que es de su competencia y responsabilidad el control de tuberculosis humana así como la prevención de las zoonosis. En resumen y partiendo de nuestros hallazgos es recomendable instaurar el programa de vigilancia epidemiológica de la tuberculosis bovina haciendo uso de las metodologías probadas en el presente estudio, inicialmente en los departamentos donde se encontró positividad para M. bovis y/o M. tuberculosis. En segundo lugar se recomienda realizar estudios más profundos con relación a la presencia de micobacterias del complejo tuberculosis diferentes del M. bovis, como son el genotipo MANU 2 y el T1 tanto en el ambiente silvestre como en los manipuladores de la cadena de producción bovina. El presente estudio permitió confirmar la circulación en los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Magdalena de al menos 7 genotipos de Mycobacterium bovis causante de tuberculosis bovina en animales provenientes de fincas ganaderas. Está información es útil para los Programas de vigilancia epidemiológica en salud pública y salud animal, direccionado a la articulación de acciones conjuntas que permitan construir marcos normativos para la eliminación y control de la zoonosis, todo lo cual contribuye al mejoramiento de la competitividad en la cadena de producción bovina, y que repercutirá en el cumplimiento de los estándares zoosanitarios internacionales para incrementar el acceso a mercados mundiales, el mejoramiento de la economía del país y el beneficio directo a la salud pública. Agradecimientos A todo el personal que trabaja en el Programa Nacional de Prevención y Control de la Tuberculosis Bovina y la Brucelosis del ICA en Colombia, por su acompañamiento a las zonas de muestreo.

Jojoa-Jojoa - Mycobacterium bovis in cattle production in Colombia

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5237-5249, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Persistence of pathogens in liquid pig manure processed in manure tanks and biodigesters Persistencia de patógenos en porcinaza líquida procesada en tanques estercoleros y biodigestores Oscar Betancur H,1 Ph.D, Antonio Betancourt E,2 Ph.D, Julián Estrada A,3 Ph.D, Francisco Henao U,3* Ph.D. 1Elanco,

Animal Health, Transversal 18 96-41, Bogotá D.C., Colombia 2Corpoica, 140 street No 26 - 93, tower 2, Apartment 202, Floridablanca, Santander 3 Caldas University, Faculty of Agricultural Sciences, Doctorate in Agricultural Sciences, Headquarters 65 street Nº 26-10, Manizales, Colombia. *Correspondence: fhenao@ucaldas.edu.co.

Received: November 2014; Accepted: July 2015.

ABSTRACT Objective. To evaluate the persistence of virus, bacteria, mold, yeast and parasites in liquid pig manure, processed in biodigesters and manure tanks in the central-western part of Colombia. Materials and methods. A directed observational study analyzed descriptively was carried out in three pig farms located where the manure tanks were assembled and its biodigesters were used. A sampling of liquid pig manure was taken to assess the presence of 26 pathogens at the beginning of the study and another one at the end of the process in manure tanks and biodigesters. For the manure tank, a 250 liters tank was filled with fresh pig manure and was analyzed after three days of storage. The biodigesters were of continuous flow and its effluents were analyzed, according to the specific hydraulic retention times. The diagnostic techniques were those recommended specifically for each microorganism and were carried out in certified labs by the Colombian Animal Health authority. Results. Of the 26 pathogens that were investigated, 15 appeared in the fresh pig manure used in pig manure tanks and 12 in the one used in biodigestors. In manure tanks, Porcine Circovirus type 2 (PCV2), mold, yeast, Salmonella spp., Balantidium coli and Strongylids did not persist. In biodigesters, PCV2, yeast, Strongylids, B. coli and Strongyloides spp., did not persist. Conclusions. In both manure tanks and biodigesters, a variation could be seen in pathogen persistency, indicating that they act as transformation systems of pig manure for the removal of the latter, as long as the storage times are increased if the efficiency wants to be improved. Key words: Bacteria, mould, parasite, virus, yeast (Source: CAB).

RESUMEN Objetivo. Evaluar la persistencia de virus, bacterias, mohos, levaduras, y parásitos en porcinaza líquida, procesada en biodigestores y tanques estercoleros en el centro–occidente de Colombia. Materiales y Métodos. Se realizó un estudio de observación dirigida analizada descriptivamente en tres explotaciones porcinas, donde se montaron tanques estercoleros y se aprovecharon sus biodigestores. Se realizó un muestreo de porcinaza fresca para analizar la presencia de 26 patógenos al comienzo del estudio y otro al final del proceso de estercoleros y biodigestores; los muestreos se repitieron en dos momentos en las tres granjas. Para el estercolero, se llenó un tanque de 250 litros 5237

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con porcinaza fresca y se analizó después de tres días de almacenamiento. Los biodigestores fueron de flujo continuo, y se analizaron sus efluentes, según los tiempos de retención hidráulica específicos. Las técnicas diagnósticas fueron las recomendadas específicamente para cada microorganismo y se ejecutaron en laboratorios certificados por la autoridad sanitaria colombiana. Resultados. De los 26 patógenos investigados se detectaron 15 en la porcinaza fresca usada en estercoleros y 12 en la utilizada en biodigestores. En tanques estercoleros Circovirus Porcino tipo 2 (PCV2), mohos, levaduras, Salmonella spp., Balantidium coli y estrongilidos no persistieron. En biodigestores PCV2, levaduras, estrongilidos, B. coli y Strongyloides spp., no persistieron. Conclusiones. Tanto en estercoleros como biodigestores se observó variación en la persistencia de agentes patógenos, indicando que funcionan como sistemas de transformación de la porcinaza para la remoción de éstos, siempre y cuando se aumenten los tiempos de almacenamiento si se quiere mejorar su eficiencia. Palabras clave: Bacterias, levaduras, mohos, parásitos, virus (Fuente: CAB).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Pork is the most consumed animal protein in the world and the demand continues to grow. Its share of the world market is 37.4%, which makes pig farming a highly important agricultural activity in the world (1). According to the Colombian Association of Pig Farmers (2), in Colombia the domestic pork market reached 3,030,043 heads slaughtered in 2013, which represents approximately 254,000 tons of meat and indicates a growth of 2.2% compared to 2012. This growth is expected to continue in the coming years; per capita consumption in Colombia is 6.7 kg, which shows great future business opportunities. However, the large amount of pig manure that is produced daily limits the expansion of this industry, since it is associated with pollution and transmission of pathogens. Therefore, it is imperative to adequately dispose of and process pig manure so that it goes from being a source of pollution and health problems to a source of income for the producer. Proper use of pig manure may lead to it being used as a strategic bio-fertilizer or as raw material for animal feed.

La carne de cerdo es la proteína de origen animal que más se consume en el mundo y su demanda sigue creciendo, su participación en el mercado mundial es del 37.4% lo cual convierte a la porcicultura en una actividad pecuaria de gran importancia en el planeta (1). Según la Asociación Colombiana de Porcicultores (2), en Colombia la oferta de porcinos en el mercado interno alcanzó 3’030.043 de cabezas beneficiadas en el 2013, que representan aproximadamente 254.000 toneladas de carne, indicando un crecimiento de 2.2% en comparación al año 2012, y se espera que siga su crecimiento en los próximos años; el consumo per cápita en Colombia es de 6.7 Kg lo cual muestra una gran oportunidad de negocio a futuro. Sin embargo, la gran cantidad de porcinaza que se produce a diario limita la expansión de la industria porcina, dado que se le asocia con problemas de contaminación y de transmisión de patógenos; surge, por tanto, el imperativo de hacer una adecuada disposición y procesamiento de la porcinaza para que de un generador de problemas de contaminación y salud se transforme en una fuente de ingresos para el productor. El adecuado uso de la porcinaza puede permitir su utilización estratégica como biofertilizante o como materia prima para la alimentación animal.

Pig manure consists of feces, urine, bedding waste, rinse water, secretions (nose, throat, vagina, uterus, mammary gland, etc.), skin, hair, blood residue, and food waste. Organisms present in this mixture have the potential to persist in products derived from processing pig manure (3). To reduce the risk of contamination, pig manure should be treated using methods that ensure safety. Diverse biological, physical and chemical processes to control pathogens in pig manure have been reported in literature, including: silage, composting, drying, earthworm composting, and the use of biodigesters, generally preceded by storage in manure tanks. For proper operation, with the exception of manure tanks, it is necessary to separate solid and liquid fractions of pig manure to aid in eliminating pathogens (4).

La porcinaza, se compone de heces, orina, residuos de cama, agua de lavado, secreciones (nariz, garganta, vagina, útero, glándula mamaria, etc.), descamación cutánea, pelos, residuos de alimento y sangre. Los organismos presentes en esta mezcla tienen el potencial de persistir en los productos obtenidos del procesamiento de la porcinaza (3). Para disminuir el riesgo de contaminación, la porcinaza debe ser tratada por algún método que garantice su inocuidad. Se han reportado en la literatura diferentes procesos biológicos, físicos y químicos para el

Betancur - Persistence of pathogens in liquid pig manure To process liquid pig manure in the pork industry in Colombia, it is common to use manure tanks and biodigesters. Manure tanks are designed to store manure (5); in the case of pig manure, the manure tank is used to store the complete mixture without prior separation. Normally storage time is three days, after which its contents are dumped in a fertilization field or an anaerobic fermentation system in a digester. So far, no formal reports have been done on the effectiveness of manure tanks in eliminating pathogens; Fongaro et al (6) reported the presence of Salmonella spp. and PCV2 in fresh liquid pig manure collected from a manure tank, without taking into consideration the time period it was retained in order to establish the capacity this system has to remove pathogens. The manure tank, therefore, is not strictly a mechanism to process pig manure. It is important to clarify that in some farms tanks similar to manure tanks are used to store effluent from the biodigesters. Biodigesters are bio-reaction systems built to submit the liquid phase of agricultural waste, manure or industrial effluents to anaerobic fermentation in order to recover energy and materials (biogas, bio-fertilizer, and potentially useful substrates in various agricultural and agro-industrial processes) (7). Notably, biodigesters also offer the possibility to control the spread of pathogens (8), main factors that influence pathogen reduction, which include: microbial competition, nutrient availability (9), temperature, pH, concentration of free ammonia and volatile fatty acids, biodigester design, and hydraulic retention time (HRT) or average time that the raw material is kept within the digester (10). To ensure an adequate biodigestion process, it is important that pig manure be sufficiently homogenized, and HRT should be sufficient to prevent endogenous bacteria from being expelled at a higher rate than that of reproduction (11). In this regard, Massé et al (12) reported significant reductions in the concentration of total and fecal coliforms, Escherichia coli, Salmonella spp., Campylobacter spp. and Yersinia enterocolitica when HRT was used for 7 to 14 days. In this sense, the Chen et al group (13) found that the rate of pathogen removal becomes more efficient as HRT increases from 11 to 25 days. This study was done to help clarify real health risks from pig manure by evaluating the persistence of virus, bacteria, mold, yeast, and parasites in liquid pig manure processed in biodigesters and manure tanks in central-western Colombia.

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control de agentes patógenos en porcinaza, entre ellos están: el ensilaje, el compostaje, el secado, el lombricompostaje, y el uso de biodigestores, regularmente precedido del almacenamiento en tanques denominados estercoleros. Para el adecuado funcionamiento de estos procedimientos, con la excepción de los estercoleros, se requiere la separación de las fracciones sólida y líquida de la porcinaza, a lo cual se le atribuyen efectos benéficos en la eliminación de patógenos (4). Para el procesamiento de la fase líquida de la porcinaza en la industria porcícola colombiana es común acudir a los estercoleros y a los biodigestores. Un estercolero es un tanque diseñado para almacenar estiércol (5), en el caso particular de la porcinaza, el estercolero se utiliza para almacenar la mezcla completa sin previa separación; regularmente el tiempo de almacenamiento es de tres días, al cabo de los cuales se conduce su contenido a un campo de fertilización o a un sistema de fermentación anaeróbica en un biodigestor. Hasta el momento no se conocen reportes formales sobre la efectividad de los tanques estercoleros en la eliminación de patógenos, Fongaro et al (6) reportan la presencia de Salmonella spp., y PCV2 en porcinaza fresca líquida colectada desde un tanque estercolero, sin considerar tiempos de retención que establezcan la capacidad de este sistema en la remoción de patógenos. El estercolero, por tanto, no es estrictamente un mecanismo de procesamiento de la porcinaza. Es importante aclarar que en algunas granjas se usan tanques similares a los estercoleros para almacenar el efluente de los biodigestores. Los biodigestores, son sistemas de biorreacción construidos para someter la fase líquida de los desechos agrícolas, estiércol o efluentes industriales, a fermentación anaeróbica con el propósito de recuperar energía y materiales (biogás, biofertilizante, y posibles sustratos útiles en diversos procesos agropecuarios y agroindustriales) (7). Cabe destacar que los biodigestores también ofrecen la posibilidad de controlar la diseminación de agentes patógenos (8), los principales factores que influyen en la reducción de patógenos por este medio, incluyen: competición microbiana, disponibilidad de nutrientes (9), temperatura, pH, concentración de amonio libre y de ácidos grasos volátiles, diseño del biodigestor, y tiempo de retención hidráulica (TRH) o tiempo promedio que la materia prima se mantiene dentro del biodigestor (10). Es importante que para poder asegurar un adecuado proceso de biodigestión, es necesario que la porcinaza esté

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MATERIALS AND METHODS Type of study. A descriptively analyzed directed observational study was conducted. Study site and population. The study was conducted in three full-cycle pig farms in central western Colombia, on a farm located in Pereira at 4°50’34” N; 75°46’02” W, on 800 sows (large farm), at an altitude of 1261 meters, average temperature of 25-30°C; another on 500 sows (median farm) in Villamaría at 5°01’46” N; 75°31’36” W, at 1850 meters, with an average temperature of 21-22°C; and 280 sows (small farm) in Santa Rosa de Cabal, at 4°50’34” N; 75°46’02” W, at 1450 meters, average temperature 22 to 26°C. Treatment routes and sampling days. In 2013 fresh pig manure was sampled at baseline (June 4) and again when each route was processed (06, 07 and June 11); sampling was repeated on three farms (July 29 for fresh pig manure and July 31, August 01 and 05 for processed pig manure). On each farm a 250 plastic liter container was used as a manure tank, which was filled with 250 liters of fresh pig manure (38 kg solid and 212 L liquid parts) and was stored for three days. Continuous flow polyethylene tube biodigesters (14) were used in the study with the following HRT: 2.55 days on the small farm, 2.65 days on the median farm and 6.8 days on the large farm. Manure tanks were sampled at the end of the third day of storage and the biodigesters according to the respective HRT; sampling was conducted following the regulations of the Colombian Technical Standards NTC-ISO 5667-1 (15). Samples were transported in sterile sealable bags with 75g and 150g frozen Biothermics® gels according to manufacturer’s indications to preserve it at 4-8°C, and the samples arrived at the laboratory in a period of less than 24 hours. Pathogens and diagnostic techniques. In fresh pig manure the presence of the following pathogens (Table 1) was analyzed: All the diagnostic tests were done in laboratories backed by the Colombian Agricultural Institute (ICA). Selection criteria. The inclusion of the above pathogens in this study was done using the following criteria: PRRS, PCV2, PPV, L. intracellularis, A. pleuroneumoniae, for its high prevalence and economic impact. PCV1 was considered the control of PCV2. A. suum, E. coli, L. monocytogenes, Salmonella spp., Giardia spp., Leptospira spp., S. aureus due to the zoonotic

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suficientemente homogenizada, y que el TRH, sea el necesario para evitar que las bacterias endógenas sean expulsadas a una tasa superior a la de su reproducción (11). Al respecto, Massé et al (12) reportan reducciones significativas en la concentración de coliformes totales y fecales, Escherichia coli, Salmonella spp., Campylobacter spp. y Yersinia enterocolitica cuando se usan TRH de 7 a 14 días. En este mismo sentido, el grupo de Chen et al (13), encontró que la tasa de eliminación de patógenos se hace más eficiente conforme se aumenta el TRH de 11 a 25 días. El presente trabajo se realizó con el propósito de contribuir a esclarecer el verdadero riesgo sanitario de la porcinaza mediante la evaluación de la persistencia de virus, bacterias, mohos, levaduras, y parásitos en porcinaza líquida, procesada en biodigestores y tanques estercoleros en el centro–occidente de Colombia.

MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio. Se realizó un estudio de observación dirigida analizada descriptivamente. Sitio y población de estudio. Se realizó un estudio en tres explotaciones porcinas de ciclo completo del centro occidente de Colombia, una granja ubicada en Pereira a 4°50’34” N; 75°46’02” O, de 800 madres (granja grande), a una altitud de 1261 msnm, y con temperatura media de 25-30°C; otra de 500 madres (granja mediana) en Villamaría a 5°01’46” N; 75°31’36” O, a 1850 msnm, y con una temperatura media de 21-22°C; y una de 280 madres (granja pequeña) en Santa Rosa de Cabal, a 4°50’34” N; 75°46’02” O, a 1450 msnm, y 22-26°C de temperatura media. Rutas de tratamiento y días de muestreo. Durante el año 2013 se hizo un muestreo de porcinaza fresca al comienzo del estudio (04 de junio) y otro al final del proceso de cada ruta (06, 07 y 11 de junio); el muestreo se repitió en las tres granjas (29 de julio para la porcinaza fresca, y 31 de julio, 01 y 05 de agosto para la porcinaza procesada). En cada granja se usó un recipiente plástico de 250 litros de capacidad, como estercolero, que se llenó con 250 litros de porcinaza fresca (38 kg de la fracción sólida y 212 L de la fracción líquida) y se almacenó por tres días. En el estudio se usaron biodigestores tubulares de polietileno y de flujo continuo (14), con los siguientes TRH: 2.55 días en la granja pequeña, 2.65 días en la mediana y 6.8 días en la granja grande. Los estercoleros se muestrearon al final del tercer día de almacenamiento y los biodigestores, de acuerdo con el TRH respectivo;

Betancur - Persistence of pathogens in liquid pig manure Table 1. Studied microorganisms and diagnostic methods. Microorganism

Diagnostic methods

Porcine Parvovirus (PPV), Porcine Circovirus type 1 (PCV1), PCV2, Porcine Herpesvirus type 1 (HVP1) or the Aujesky disease virus

PCR multiplex (16)

Actinobacillus pleuropneumoniae and Lawsonia intracellularis

Conventional PCR (17, 18)

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS)

Nested RT-PCR (19)

Clostridium sulfite reducers

TSN agar count (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)

Aerobic mesophilic bacteria

Count in Petrifilm mesophilic plates (3M™, St. Paul, MN) with agar Plate Count (MerckMillipore, Billerica, MA)

Staphylococcus aureus

Count in Baird Parker culture medium with DNA (3M™, St. Paul, MN), to determine the production of DNAasa

Total coliforms and E. coli

Count in Bilis red Violet agar with glucoronide (3M™, St. Paul, MN)

Mold and yeast

Count in mold and yeast Petrifilm plates

Salmonella spp.

Sequential incubation of 25 g sample in lactose broth (3M ™, St. Paul, MN), Rappaport broth (3M ™, St. Paul, MN), Hektoen agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), Bismuth sulphite agar (MerckMillipore, Billerica, MA) and Trypticase agar (Merck-Millipore, Billerica, MA), Gram stain, oxidase test (Merck-Millipore, Billerica, MA) and agglutination with polyvalent antiserum “O” (Prolab, Antioquia, Col)

Listeria monocytogenes

Incubation in 25 g of Fraser sample broth (Merck-Millipore, Billerica, MA), and ELFA test (Enzyme Linked Fluorescent Assay) in miniVIDAS (BioMérieux, Craponne, Fr)

Leptospira spp.

Filtration with clarifying paper and 0.45 micron cellulose acetate membrane, with subsequent centrifugation and sediment planting in EMJH medium (Ellinghausen and McCullough as modified by Johnson and Harris) (Difco ™, Detroit, MI) and evaluated weekly for four weeks using darkfield microscopy.

Ascaris suum, Trichuris suis, B. coli, Strongyloides spp., strongylids, Metastrongylus spp., and coccidias

McMaster Sloss. Coccidia are incubated with a solution of potassium permanganate at 1% for 24-48 hours, and then the respective micrometer measurements are performed on the sporulated oocysts,

Giardia intestinalis

Ritchie

Cryptosporidium parvum

Zielh-Neelsen cold stain

(3M™, St. Paul, MN)

risk involved. The virus for Aujesky’s disease because of the risk it represents despite not being officially reported in Colombia. Aerobic mesophilic bacteria, total coliforms, Clostridium sulfite reducers, molds and yeasts since over time they are indicators of microbial activity. The other bacteria and parasites (T. suis, B. coli, G. intestinalis, Strongyloides spp., Metastrongylus spp., coccidia and strongylid) because of their economic impact, epidemiological importance and because they are potentially pathogenic to other species, including humans. In this study the persistence of viruses, parasites, A. pleuropneumoniae, Leptospira spp., L.

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el muestreo se realizó siguiendo las pautas de la Norma Técnica Colombiana NTC-ISO 5667-1 (15). Las muestras se transportaron en bolsas estériles con cierre hermético, acompañadas de geles Biothermics® de 75 g y 150 g congelados según indicaciones del fabricante para conservar el frío de 4-8ºC, y llegaron al laboratorio en un periodo inferior a 24 horas después de tomada la muestra. Patógenos y técnicas diagnósticas. En la porcinaza fresca se analizó la presencia de los siguientes patógenos (Tabla 1): Todas las pruebas diagnósticas se ejecutaron en laboratorios avalados por el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA). Criterios de selección. La inclusión de los patógenos anteriores en esta investigación se hizo bajo los siguientes criterios: PRRS, PCV2, PVP, L. intracellularis, A. pleuroneumoniae, por su prevalencia y alto impacto económico. El PCV1 se consideró como control del PCV2. A. suum, E. coli, L. monocitogenes, Salmonella spp., Giardia spp., Leptospira spp., S. aureus por el riesgo zoonótico que conllevan. El virus de la enfermedad de Aujesky por el riesgo que esta representa a pesar de no estar reportado oficialmente en Colombia. Mesófilos aerobios, coliformes totales, Clostridium sulfito reductores, mohos y levaduras por ser indicadores de actividad microbiana en el tiempo. El resto de bacterias y parásitos (T. suis, B. coli, G. intestinalis, Strongyloides spp., Metastrongylus spp., coccidias y estrongilidos) por su impacto económico, su importancia epidemiológica y por ser potencialmente patógenas para otras especies, incluidos los humanos. En el presente estudio la persistencia de virus, parásitos, A. pleuroneumoniae, Leptospira spp., L. monocytogenes, L. intracellularis y Salmonella spp., se valoró a partir de la presencia del organismo, en tanto que para los organismos diagnosticados por recuento (mesófilos aerobios, S. aureus, coliformes totales, E. coli, Clostridium sulfito reductores, mohos, levaduras), la persistencia dependió de que el número final de cada agente superara los niveles máximos permitidos de acuerdo con los valores de referencia de la tabla 2.

RESULTADOS En la tabla 3 se aprecia que de los 26 patógenos estudiados, solo se encontraron 15 en la porcinaza fresca con la cual se llenaron los estercoleros; al tercer día de almacenamiento en esta vía se comprobó la persistencia de 9 de

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monocytogenes, L. intracellularis and Salmonella spp., was assessed from the presence of the organism, while for those diagnosed by counting (aerobic mesophilic bacteria, S. aureus, total coliforms, E. coli, Clostridium sulfite reducers, molds, yeasts), persistence depended on the final number of each agent in excess of the maximum permitted levels according to the reference values in table 2.

RESULTS

Table 3. Pathogens found in manure tanks on three farms in central western Colombia. GG M1

GM M2

GP M2

DI P DI P DI P DI P DI P DI P PPV PCV1 PCV2

PRRS HVP1 L. intracellularis

Aerobic mesophilic bacteria

S. aureus

Mold

Yeast

Clostridium sulfite reducers Total coliform

E. coli

A. pleuropneumoniae

+ +

L. monocytogenes Salmonella spp.

Leptospira spp. A. suum C. parvum T. suis B. coli

Table 2. Maximum counts adopted for ruminant feed. Microorganism

Maximum amount CFU/g

Source

Aerobic mesophilic bacteria

10x107

(20)

S. aureus

10x104

(21)

Molds

10x104

(20)

Yeast

10x104

(20)

Clostridium sulfite reducers

20x101

(20)

Total coliforms

10x104

(20)

E.coli

10x101

(22)

CFU/g: Colony-forming units/gram

Table 3 shows that of the 26 pathogens studied, only 15 were found in fresh pig manure which the manure tanks were filled with; after three days of storage 9 of them persisted (L. intracellularis, mesophilic aerobic, E. coli, total coliforms, S. aureus, Clostridium sulfite reducers, L. monocytogenes, Strongyloides spp., coccidia); therefore, the other 6 disappeared during this period. E. coli, total coliforms, and Clostridium sulfite reducers persisted on the 3 farms; aerobic mesophilic bacteria persisted in the 3 farms but only in the largest it persisted in 2 samples; S. aureus persisted on the 3 farms, and did not

PATHOGEN

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Metastrongylus spp. G. intestinalis Strongylids

Strongyloides spp.

Coccidia

+ + +

+ +

GG: large farm; GM: median farm; GP: small farm; M1: sampling 1; M2: sampling 2; DI: initial diagnosis (fresh pig manure); P: persistence; (+): presence of pathogen agent.

ellos (L. intracellularis, mesófilos aerobios, E. coli, coliformes totales, S. aureus, Clostridium sulfito reductores, L. monocytogenes, Strongyloides spp., coccidias), por tanto los otros 6 desaparecieron durante este período. E. coli, coliformes totales, Clostridium sulfito reductores, persistieron siempre en las 3 granjas; mesófilos aerobios persistieron en las 3 granjas pero solo en la grande persistieron en los 2 muestreos; S. aureus persistió en las 3 granjas, y en la grande no persistió en un muestreo; L. intracellularis persistió en la granja grande, en la mediana apareció solo en uno de los muestreos y no persistió y en la pequeña apareció en los 2 muestreos pero solo persistió en uno. Strongyloides spp., solo persistió en un muestreo de la granja mediana. Para el caso de coccidias estas persistieron en las 3 granjas, excepto en el segundo muestreo de la granja pequeña. En los datos registrados en la tabla 4, se percibe que 12 de los 26 agentes incluidos en el estudio fueron diagnosticados inicialmente en la porcinaza líquida empleada para alimentar los biodigestores, 8 de ellos persistieron (L. intracellularis, mesófilos aerobios, S. aureus, Clostridium sulfito reductores, coliformes totales, E. coli, Salmonella spp., coccidias). E. coli persistió siempre en las 3 granjas; L. intracellularis persistió en la granja pequeña, en la mediana apareció solo en uno de los muestreos y persistió y en la grande apareció en los 2 muestreos pero solo persistió en uno. Los mesófilos aerobios persistieron en las 3 granjas aunque solo en el primer muestreo. S. aureus persistió en la granja mediana y en la pequeña en uno de los muestreos, mientras en la granja grande no persistió. Para el caso de Salmonella spp., estas aparecieron solo en el primer muestreo de las 3 granjas y persistieron en la mediana y pequeña, en la grande no persistieron. Los Clostridium sulfito reductores persistieron en las granjas mediana y pequeña, y en la grande a pesar que apareció en los 2 muestreos solo persistió en uno de ellos. Se observaron coccidias en uno solo de los muestreos de las granjas grande y pequeña, y en ambos casos persistieron.

Betancur - Persistence of pathogens in liquid pig manure

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Table 4. Pathogens found in biodigesters on three farms in central western Colombia. GG

PATHOGEN DI

GM DI

GP DI

PPV PCV1 PCV2

PRRS HVP1 +

Aerobic mesophilic bacteria

S. aureus

L. intracellularis

A. pleuropneumoniae + +

Mold Yeast

Clostridium sulfite reducers

Total coliform

E. coli

+ +

L. monocytogenes Salmonella spp.

Leptospira spp. A. suum C. parvum T. suis B. coli Metastrongylus spp. G. intestinalis Strongylids

Strongyloides spp. Coccidia

+ +

GG: large farm; GM: median farm; GP: small farm; M1: sampling 1; M2: sampling 2; DI: initial diagnosis (fresh pig manure); P: persistence; (+): presence of pathogen agent.

persist in one sampling of the large farm; L. intracellularis persisted in the largest farm, in the median one it appeared in only one of the samples and did not persist, and in the small one it appeared in two samples but only persisted in one. Strongyloides spp., persisted only in a sampling of the median farm. Coccidia persisted on the 3 farms, except in the second sampling of the small farm. In data recorded in table 4, it can be seen that 12 of the 26 agents included in the study were initially diagnosed in liquid pig manure used to feed biodigesters, and 8 persisted (L. intracellularis, aerobic mesophilic bacteria, S. aureus, Clostridium sulfite reducers, total coliforms, E. coli, Salmonella spp., coccidia). E. coli persisted in the 3 farms; L. intracellularis persisted in the small farm, appeared in the median one in only one of the samples and persisted, and appeared in the large farm in the 2 samples but persisted in just one. Aerobic mesophilic bacteria persisted in the 3 farms but only in the first sampling. S. aureus persisted in median and on the small farm in one of the

DISCUSIÓN A la porcinaza se le atribuye un papel protagónico en la transmisión de agentes patógenos diversos (virus, bacterias, mohos, levaduras y parásitos), por lo cual se limita considerablemente su uso en procesos agropecuarios y agroindustriales. Por experiencias previas se sabe que ciertos agentes etiológicos pueden ser removidos total o parcialmente en el procesamiento de la porcinaza, mediante el uso de estercoleros, biodigestores, secado al sol, ensilaje, lombricompostaje y elaboración de harina de lombriz. El uso estratégico de la porcinaza, bien en biofertilización bien en alimentación animal, podría hacerse antecedido de procesos similares a los mencionados, y su verdadero rol en la transmisión de patógenos estaría determinado por la persistencia de los mismos al final de cada uno, o dicho de otra manera por el poder de remoción de estos procedimientos. De los 26 patógenos inicialmente investigados aparecieron 15 en la porcinaza fresca usada para los estercoleros y 12 en la utilizada en

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samples, while in the large farm it did not persist. In the case of Salmonella spp., these appeared only with the first sampling of the 3 farms and persisted in the median and small one, but in the large farm it did not persist. Clostridium sulfite reducers persisted in the medium and small farms, and the large one, in spite of appearing in the 2 samples, persisted in just one. Coccidia was observed in just one of the samples of the large and small farms, and persisted in both cases.

DISCUSSION Pig manure is considered to have a leading role in the transmission of various pathogens (virus, bacteria, molds, yeasts and parasites), so its use in agricultural and agro-industrial processes is considerably limited. From previous experience we know that certain etiological agents can be removed completely or partially by processing pig manure using tanks, biodigesters, sun-drying, silage, worm composting and by manufacturing worm flour. The strategic use of pig manure, either in biofertilization or in animal feed, could be possible if preceded by similar processes, and its true role in the transmission of pathogens would be determined by persistence in the end product, or in other words, if these procedures are able to remove them. Of the 26 pathogens initially investigated, 15 were found in fresh pig manure used in the manure tanks, and 12 in manure used in the biodigesters, perhaps because they were not present in the farms studied (negative farms), or due to differences in health and biosecurity conditions, or due to very low prevalence at the time of sampling. Also, the presence of antibiotic residues that modify the bacterial populations in pig manure should not be ruled out (23). Meanwhile, persistence could be due to short storage processing times, especially in the case of high amounts of pathogens. For this reason, some authors (13, 24) consider longer retention times than those used in this study to be necessary. In the viruses evaluated in this research, only PCV2 was found in both fresh pig manure used for the process and biodigesters (Tables 3 and 4), and in both cases it was removed. This virus has been found by other authors in liquid pig manure and has persisted in this environment even after 30-40 days (6); these authors argue that PCV2, a DNA virus, is resistant to disinfection and is commonly excreted in pig feces and urine; for those reasons, they are considered bioindicators of environmental quality. Although in this study it was not possible to pinpoint what caused the removal of the viruses found in fresh

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biodigestores, debido quizá a que o no se presentan en las granjas estudiadas (granjas negativas), o a las diferencias en las condiciones sanitarias y de bioseguridad, o por una prevalencia muy baja en el momento del muestreo. Además, no debe descartarse la presencia de residuos de antibióticos que modifiquen las poblaciones bacterianas en la porcinaza (23). Por su parte la persistencia podría deberse a los bajos tiempos del proceso de almacenamiento, sobre todo frente a cargas de patógenos altas; en este sentido, algunos autores (13, 24) consideran tiempos de retención mayores a los desarrollados en este estudio. De los virus evaluados en esta investigación sólo se encontró el PCV2 tanto en la porcinaza fresca usada para el proceso en estercoleros y biodigestores (Tablas 3 y 4), y en ambos casos fue removido. Este virus ha sido hallado por otros autores en porcinaza líquida y ha persistido en este medio aún después de 30 a 40 días (6); estos mismos autores aducen que PCV2, por ser un virus DNA es resistente a la desinfección y es comúnmente excretado en las heces y orina de los cerdos; por esas razones, son considerados bioindicadores de calidad ambiental. Aunque en este estudio no es posible precisar la causa de la remoción de los virus que se encontraron en la porcinaza fresca, existe evidencia que en la porcinaza líquida algunos compuestos proteolíticos o el ion amonio tienen efectos deletereos sobre éstos agentes (23). En el caso de L. intracellularis, hubo persistencia tanto en los tanques estercoleros como en los biodigestores. A pesar de la importancia clínica y económica de L. intracellularis, no ha sido considerada en los estudios la eficiencia de biodigestores o estercoleros en el tratamiento de la porcinaza, posiblemente porque es un agente patógeno que no afecta a otras especies de interés pecuario, ni es zoonótica, o por las dificultades que se presentan para su cultivo e identificación. Últimamente, se ha recomendado su identificación por PCR; sin embargo, la utilización de esta técnica puede indicar un patrón erróneo en el valor de persistencia encontrado, dada su capacidad de utilizar DNA a partir de células muertas (13). En este estudio se encontró persistencia de mesófilos aerobios tanto en los tanques estercoleros, como en los biodigestores. En el caso de los tanques estercoleros, podría explicarse por las condiciones ecológicas dentro de los tanques, puesto que durante el almacenamiento de porcinaza, se presentan condiciones aerobias en la superficie, pero después de 30 cm de profundidad, las condiciones anaerobias

Betancur - Persistence of pathogens in liquid pig manure pig manure, there is evidence that in liquid pig manure there are some proteolytic or ammonium ion compounds that have deleterious effects on these agents (23). In the case of L. intracellularis, there was persistence both in manure tanks and biodigesters. Despite the clinical and economic importance of L. intracellularis, its efficiency has not been considered in studies of biodigesters or manure tanks to treat pig manure, possibly because it is a pathogen that does not affect other species of agricultural interest, it is not zoonotic, or due to difficulties in cultivating and identifying it. Lately, identifying it by PCR has been recommended; however, this technique may indicate an erroneous pattern in the persistence value found, given their ability to use DNA from dead cells (13). In this study the persistence of aerobic mesophilic bacteria was found both in manure tanks and biodigesters. For manure tanks, it could be explained by the environmental conditions within the tanks, since during pig manure storage aerobic conditions are present on the surface, but 30 cm from the surface anaerobic conditions prevail (25). Biodigesters in this study showed persistence in only one sample. Chen et al (13) mention that different HRT lead to modifying the structure of the microbial community, which can have an effect on the survival of pathogenic bacteria. S. aureus persisted both in the manure tanks and biodigesters. This is a facultative anaerobic bacteria, and this could favor its survival in both systems. Although the ammonium present in the liquid excreta has a bactericidal effect, given the lower cell permeability of gram positive cocci it is less susceptible than other bacteria (26). According to Poudel et al (27), it is only possible to eliminate S. aureus after a HRT of 10 days, and this study reinforces this approach, since the longest HRT was 6.8 days. As for molds and yeasts, persistence was not found in manure tanks or biodigesters. There are few data on yeast and mold counts in animal manure (4). Greater amounts of bacteria than mold has been found in pig manure treated by anaerobic digestion because bacteria has a greater role in converting organic waste during this process (28). This study demonstrates the efficiency of treatment systems for liquid pig manure to remove these agents, given its susceptibility to ammonia and humic substances (28).

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prevalecen (25). En el caso de los biodigestores de este trabajo, se presentó persistencia en solo una de las muestras. Chen et al (13), mencionan que diferentes TRH conducen a la modificación de la estructura de la comunidad microbiana, que puede tener un efecto en la supervivencia de las bacterias patógenas. S. aureus persistió tanto en los tanques estercoleros como en los biodigestores. Esta bacteria es anaeróbica facultativa, y esta característica pudo favorecer su supervivencia en ambos sistemas. Aunque el amonio presente en las excretas líquidas tiene un efecto bactericida, los cocos gram positivos dada su menor permeabilidad celular son menos susceptibles a éste que otras bacterias (26). Según Poudel et al (27), solo es posible eliminar la población de S. aureus después de un TRH de 10 días, y en este estudio se refuerza dicho planteamiento, debido a que el TRH de mayor duración fue de 6.8 días. En cuanto a mohos y levaduras, no hubo persistencia ni en los tanques estercoleros, ni en los biodigestores. Existen pocos datos sobre los recuentos de levaduras y mohos en los estiércoles animales (4). Se han encontrado mayor cantidad de bacterias que de hongos en porcinaza tratada por digestión anaerobia, debido a que las bacterias tienen un rol más importante en la conversión de residuos orgánicos durante este proceso (28). El presente estudio demuestra la eficiencia de los sistemas de tratamiento de porcinaza líquida para remover estos agentes, dada su susceptibilidad al amonio y sustancias húmicas (28). Por su parte, se encontró persistencia de Salmonella spp., en los biodigestores, más no en los tanques estercoleros. Bajo las condiciones de este estudio, este agente no mostró persistencia en dichos tanques; las posibles razones de esta eliminación, podrían ser las altas concentraciones de amonio (26), y presencia de flora autóctona que compite directamente por el sustrato (9). Otros autores han encontrado persistencia de Salmonella spp. en porcinaza tratada por biodigestores anaerobios después de 30 a 40 días, aunque no siempre las cepas eran patogénicas (6). Aumentos de los TRH benefician la inactivación de Salmonella spp. (13). En este estudio, los bajos tiempos de retención probablemente no permitieron la remoción completa de Salmonella spp., en los efluentes de los biodigestores. Quizá las variaciones encontradas entre los autores consultados y los resultados de este estudio, se podrían explicar por la técnica de ausencia o presencia que se utilizó, donde se evaluaron 25 g de muestra que permite detectar muy bajas poblaciones

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Meanwhile, Salmonella spp. was found to be persistent in biodigesters but not in manure tanks. Under the conditions of this study, this agent did not show persistence in the tanks. Possible reasons for this elimination could be high concentrations of ammonium (26) and the presence of native flora which directly competes due to the substrate (9). Other authors have found Salmonella spp. to persist in pig manure treated in anaerobic biodigesters even after 3040 days, although the strains were not always pathogenic (6). Increased HRT contributes to inactivating Salmonella spp. (13). In this study, short retention times probably did not allow the complete removal of Salmonella spp., in biodigester effluent. Perhaps variations found among the authors consulted and the results of this study could be explained by the absence or presence technique, where 25g of sample was used to detect very low amounts of Salmonella spp., which would depend on the prevalence of the disease on each farm. Clostridium sulfite reducers persist in manure tanks and biodigesters. This can be explained because it is an anaerobic spore form that can resist and multiply in low redox potentials, and it is therefore likely to survive the anaerobic digestion of manure (3). The persistence of this bacteria has been reported in psychrophilic anaerobic digestion processes of pig manure using sequential batch reactors (12). Total coliforms and E. coli persisted both in manure tanks and biodigesters. Son et al (26) added 2% urea (ammonium) in manure tanks and after two weeks obtained <5 CFU/g values for total coliforms and E. coli due to the pH increase. Unlike this study, the manure tanks received no treatment. It can clearly be seen that retention times required for complete elimination of coliforms within a biodigester are greater than those in this study (maximum 6.8 days). Anaerobic digestion has been highly efficient in removing E. coli with a HRT of 25 days (13). In this study E. coli persisted on all farms at all times; this can be explained by the short storage time. A difficulty that may arise when evaluating continuous flow anaerobic digesters is the lack of correlation between HRT and the reduction of pathogens such as E. coli, since a certain amount of pig manure passes quickly through the biodigester, since these biodigesters are continuously fed fresh pig manure. Low retention times could not only lead to increased survival of the pathogenic but also to increased problems with odors of effluents (29). Adding urea (ammonium) or increasing retention times

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de Salmonella spp., lo cual va a depender de la prevalencia de la enfermedad en cada granja. Clostridium sulfito reductores persistieron en los tanques estercoleros, y en los biodigestores. Esto puede explicarse porque son anaerobios formadores de esporas que pueden soportar y multiplicarse en potenciales de oxido-reducción bajos, por lo tanto, es probable que logren sobrevivir a la digestión anaerobia del estiércol (3). La persistencia de estas bacterias ha sido reportada en procesos de digestión anaeróbica psicrófila de porcinaza usando reactores secuenciales discontinuos (12). Los coliformes totales y E.coli persistieron tanto en los tanques estercoleros como en los biodigestores. Son et al (26), adicionaron 2% de urea (amonio) a estercoleros y después de dos semanas obtuvieron valores <5 UFC/g para coliformes totales y E.coli, por efecto del aumento del pH. A diferencia de este estudio, los tanques estercoleros no recibieron ningún tratamiento. Puede observarse claramente que los tiempos de retención requeridos para la completa eliminación de la población de coliformes dentro de un biodigestor, son mayores que los de este estudio (máximo 6.8 días). La digestión anaerobia ha exhibido alta eficiencia en la remoción de E. coli con TRH de 25 días (13). En este trabajo E. coli persistió en todas las granjas y en todo momento; explicado por el poco tiempo de almacenamiento. Una dificultad que puede surgir de la evaluación de biodigestores anaerobios de flujo continuo, es la falta de correlación entre el TRH y la reducción de patógenos como E. coli, debido a que una cierta cantidad de porcinaza pasa más rápido a través del biodigestor, dado que son biodigestores que continuamente son alimentados con porcinaza fresca. Un bajo tiempo de retención no sólo podría conducir a un aumento de la supervivencia de patógenos, sino también a incrementar los problemas con los malos olores de los efluentes (29). La adición de urea (amonio) o la prolongación del tiempo de retención son alternativas a evaluar en trabajos posteriores para minimizar el riesgo que representan estos microorganismos. L. monocytogenes solo fue observada y persistió en una muestra en estercolero. Es posible que la combinación de un ambiente pobre en materia orgánica, rico en sal y con un pH alcalino, favorezca la supervivencia de este patógeno reconocido por soportar condiciones extremas de estrés (30).

Betancur - Persistence of pathogens in liquid pig manure are alternatives to be evaluated in further studies in order to minimize the risk posed by these microorganisms. L. monocytogenes was observed and persisted in one sample manure tank. It is possible that the combination of an environment poor in organic matter, rich in salt, and an alkaline pH favored the survival of this pathogen that is known to withstand extreme stress conditions (30). As for parasites in the manure, persistence of B. coli or Strongylid is not observed, while coccidia persisted. As Son et al (26) observed, conditions that favor high ammonium concentrations may inactivate parasites. As for Strongyloides spp., persistence was observed but it is known that free-living states of Strongyloides spp., have a short duration and are negatively affected by adverse environmental conditions. The persistence of coccidia may be explained by the liquid medium which favors the development of parasites and additionally due to its ability to form oocytes that are highly resistant to unfavorable environmental conditions. In nature, oocytes probably survive for weeks or months. In the case of biodigesters, persistence of Strongylid and Strongyloides spp., was not found, but coccidian was found. Biological considerations of these parasites described in pig manure tanks apply similarly to biodigesters. Cañon-Franco et al (24) evaluated the efficiency of anaerobic digesters in eliminating parasites after 15 days of HRT, finding that the time is insufficient for complete removal of Isospora suis oocytes and different species of Eimeria such as Strongyloides ransomi eggs. In this study the results are similar in terms of the persistence of coccidia, but not in terms of Strongyloides spp. The persistence of coccidia on both routes could be explained by its cystic nature, which is very resistant to adverse environmental conditions. In this study, retention times were low compared to reports in literature, however, it was possible to eliminate some of the parasites. Very short HRT does not allow adequate removal of pathogens, particularly of parasite eggs, which have greater resistance to environmental stress as compared to viruses and bacteria (8). In this study the results for manure tanks show that PCV2, molds, yeasts, Salmonella spp., B. coli and Strongylid did not persist, while L. intracellularis, aerobic mesophilic bacteria, S. aureus, Clostridium sulfite reducers, total coliforms, E. coli, L. monocytogenes, Strongyloides spp., and coccidia did persist. On the other hand, in the biodigesters it can be seen that PCV2, yeast, strongylid, B. coli and Strongyloides spp. did not persist,

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En cuanto a parásitos en el estercolero, no se observó persistencia de B. coli ni de estrongilidos, mientras las coccidias si persistieron. Como lo menciona Son et al (26), condiciones que favorezcan altas concentraciones de amonio pueden inactivar parásitos. En cuanto a los Strongyloides spp., se observó persistencia, al respecto, se sabe que los estados de vida libre de Strongyloides spp., tienen corta duración y son afectadas negativamente por las condiciones adversas del ambiente. La persistencia de coccidias puede explicarse por trabajarse en un medio líquido que es favorable para el desarrollo de estos parásitos y adicionalmente por su capacidad de formar ooquistes muy resistentes a condiciones ambientales desfavorables. En la naturaleza, los ooquistes probablemente sobreviven por semanas o meses. En el caso de los biodigestores, no se encontró persistencia de estrongilidos ni Strongyloides spp., pero sí de coccidias. Las consideraciones biológicas de estos parásitos descritas en los tanques estercoleros, aplican de la misma manera para los biodigestores. Cañon-Franco et al (24), evaluaron la eficiencia de biodigestores anaerobios en la eliminación de parásitos después de 15 días de TRH, encontrando que ese tiempo es insuficiente para la eliminación completa de ooquistes de Isospora suis y diferentes especies de Eimeria, así como huevos de Strongyloides ransomi. En este trabajo los resultados son semejantes en cuanto a la persistencia de coccidias, pero no en cuanto a Strongyloides spp. La persistencia de coccidias en ambas rutas podría explicarse por su naturaleza quística, las cuales son formas muy resistentes a las condiciones adversas del ambiente. En este trabajo los tiempos de retención fueron bajos respecto a los reportes encontrados en la literatura, sin embargo, fue posible la eliminación de algunos de los parásitos considerados. TRH muy cortos no permiten una adecuada eliminación de patógenos, en particular de huevos de parásitos, los cuales tienen una mayor resistencia al estrés ambiental comparado con virus y bacterias (8). En el presente trabajo los resultados en tanques estercoleros muestran que PCV2, mohos, levaduras, Salmonella spp., B. coli y estrongilidos no persistieron; mientras que L. intracellularis, mesófilos aerobios, S.aureus, Clostridium sulfito reductores, coliformes totales, E. coli, L. monocytogenes, Strongyloides spp., y coccidias si persistieron. De otro lado, en los biodigestores se aprecia que PCV2, levaduras, estrongilidos, B. coli y Strongyloides spp., no persistieron; mientras que L. intracellularis, mesófilos aerobios, S.aureus, Clostridium sulfito reductores, coliformes totales, E. coli, Salmonella spp., L. monocytogenes, y coccidias si lo hicieron.

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while L. intracellularis, aerobic mesophilic bacteria, S. aureus, Clostridium sulfite reducers, total coliforms, E. coli, Salmonella spp., L. monocytogenes, and coccidia did. Under the conditions of this study it was not possible to guarantee the safety of pig manure since some pathogens managed to persist in spite of various treatments. However, both manure tanks and biodigesters showed variations in persistence, indicating that they work as systems to transform pig manure to remove some pathogens, though it is necessary to increase storage times to improve efficiency, which, for the biodigesters, can be improved by increasing the size or by using less wash water in the facilities. It is important to consider for further studies if the eggs or larvae of parasites, as well as viruses and bacteria, found to be persistent are viable or not. In the case of Salmonella spp., it is necessary to verify whether they are pathogenic or nonpathogenic strains, and for E. coli differentiate the type of adhesins, since these are specific to each species; for pigs K88, K99 for cattle.

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Bajo las condiciones de este estudio no es posible garantizar la inocuidad de la porcinaza puesto que algunos agentes patógenos lograron persistir a los diversos tratamientos. Sin embargo, tanto en estercoleros como biodigestores se observó variación en la persistencia, indicando que funcionan como sistemas de transformación de la porcinaza para la remoción de algunos patógenos, siendo necesario aumentar los tiempos de almacenamiento si se quiere mejorar su eficiencia, el cual, en el caso de los biodigestores, puede aumentarse por una ampliación en su tamaño, o por la utilización de menor cantidad de agua de lavado en las instalaciones. Es importante considerar para estudios posteriores, si los huevos o larvas de parásitos, así como los virus y bacterias en los que se encontró persistencia son viables o no. En el caso de Salmonella spp., verificar si se trata de cepas patógenas o apatógenas y para E. coli diferenciar el tipo de adhesinas pues estas son específicas para cada especie K88 para porcinos, K99 para bovinos.

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5250-5257, 2016. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL

Heritabilities and genetic trends for reproductive traits in a population of Romosinuano cattle in Colombia Heredabilidades y tendencias genéticas para características reproductivas en una población de ganado Romosinuano en Colombia Oscar Vergara G,1* Dr.Sc, Gustavo Ossa S,2 Ph.D, Julieth Cabrera A,1 MVZ, Juan Simanca S,1 Esp, Juan Pérez G,2 Esp. 1Universidad

de Córdoba, Faculty of Veterinary and Zootechnical Medicine, Tropical Animal Production Research Group, Montería, Colombia. 2Corporación Colombiana de Investigaciones Agropecuarias CORPOICA, National Program for Animal Genetics and Biotechnology, C.I. Turipaná, Cereté, Colombia. *Correspondence: overgara@correo.unicordoba.edu.co

Received: August 2014; Accepted: July 2015.

ABSTRACT Objective. The aim of this study was to estimate heritabilities and genetic trends for reproductive traits in a beef cattle population Romosinuano. Material and methods. Age at first calving (AFC), first calving interval (FCI), and second calving interval (SCI) were evaluated from a database generated from 1951 to 2011 by Research Center Turipana. Unicaracter animal model was used, which included fixed of contemporary group (year-season), random direct genetic additives effects and residual. Estimates of variance components and genetic parameters were obtained through Restricted Maximum Likelihood procedure, using AIREMLF90 program. Genetic trends were calculated as a linear regression of weighted averages of breeding values over the years, using the REG procedure of Statistical Analysis System. Results. The indices of heritability for additive genetic effects were 0.04 ± 0.05 for AFC, 0.06 ± 0.06 for FCI, and 0.09 ± 0.06 for SCI. Conclusions. Low heritabilities indicating that should improve nutritional and management conditions in the herd, so that they can better express the traits evaluated. The estimated genetic trends were near zero, which shows that the objective of the CI Turipaná regarding this population has complied fully preserving the genetic variability of the breed Romosinuano. Key words: Additive genetic, creole, EPDs, reproduction (Source: CAB, USDA).

RESUMEN Objetivo. Estimar heredabilidades y tendencias genéticas para características reproductivas en una población de ganado Romosinuano. Materiales y métodos. Se evaluaron los registros de edad al primer parto (EPP), primer intervalo entre partos (PIEP) y segundo intervalo entre partos (SIEP), desde el año 1951 hasta 2011 de ganado Romosinuano del Centro de Investigación Turipaná. Se empleó un modelo animal unicaracter que incluyó los efectos fijos del grupo contemporáneo (año-época de nacimiento), efectos aleatorios genéticos aditivos directos del animal y residual. Las estimaciones de los componentes de varianza y los parámetros genéticos se obtuvieron a través del procedimiento de Máxima Verosimilitud Restringida, mediante el programa de AIREMLF90. Las tendencias genéticas 5250

Vergara - Heredabilidades y tendencias genéticas en ganado Romosinuano

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fueron calculadas como una regresión lineal de las medias ponderadas de los valores genéticos sobre los años, usando el procedimiento REG de Statistical Analysis System. Resultados. Los índices de heredabilidad para efectos genéticos aditivos directos fueron 0.04±0.05 para EPP, 0.06±0.06 para PIEP y 0.09±0.06 para SIEP. Conclusiones. Las heredabilidades bajas indican que se debe mejorar las condiciones de nutrición y de manejo en el hato para que se puedan expresar mejor las características evaluadas. Las tendencias genéticas estimadas arrojaron valores cercanos a cero, lo cual demuestra que el objetivo del C.I Turipaná con respecto a esta población se ha cumplido a cabalidad, preservando la variabilidad genética de la raza Romosinuano. Palabras clave: Criollo, DEPs, genético aditivo, reproducción (Fuente: CAB, USDA).

INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

The profitability of a cattle company requires the use of highly productive animals but they are adapted to the environment where they are handled (1). The age at first calving and calving intervals are two highly important parameters in assessing the reproductive efficiency of cattle populations. These two parameters in native cattle breeds reveal their potential to adapt to environmental conditions, which is greatly important in estimating the reproductive performance of these animals (2).

La rentabilidad de una empresa ganadera requiere de la utilización de animales altamente productivos, pero que estén adaptados al medio donde se manejan (1). La edad al primer parto y el intervalo entre partos son dos parámetros de gran importancia en la evaluación de la eficiencia reproductiva de las poblaciones bovinas. Estos dos parámetros en las razas bovinas criollas, revelan su potencial de adaptación con las condiciones ambientales, siendo de gran importancia para estimar el desempeño reproductivo de estos animales (2).

The study and knowledge of genetic parameters of reproductive traits of the Romosinuano breed are indispensable to not only better understand the breed, but also to develop and implement conservation and breeding programs that contribute to creating competitive and sustainable livestock systems in the areas of influence of the breed. On the other hand, heredability of most reproductive traits in beef and milk cattle are low. However, this does not imply that genetic gain in reproductive performance is not possible (3). For this reason, the objetive of this study was to estimate heritability and genetic trends for traits of age at first calving and first and second calving intervals for the Romosinuano breed at the Turipaná Research Center.

MATERIALS AND METHODS Location. The study was conducted at the Turipaná Research Center (CORPOICA) located in Cereté, Cordoba, Colombia. The area belongs to the agro-ecological classification of tropical rainforest located at 75°42’ W and 8° 50’ N, 20 meters above sea level, average temperature 28°C, relative humidity 83% and annual rainfall of 1200 mm. Animals and data. For age at first calving (AFC), 1079 records collected from 1957 to 2007 were used, for first calving interval (FCI) and second

El estudio y conocimiento de los parámetros genéticos de los caracteres de reproducción de la raza Romosinuano, son indispensables, no solo para obtener un mayor conocimiento de la raza, sino también para desarrollar e implementar programas de conservación y de mejoramiento genético, que contribuyan a la creación de sistemas pecuarios competitivos y sostenibles en las zonas de influencia de la raza. Por otro lado, las heredabilidades de la mayoría de las características reproductivas en ganado de carne y leche son bajas. Sin embargo, esto no implica que la ganancia genética para el desempeño reproductivo no sea posible (3). Por tal razón, el presente estudio tuvo como objetivo, estimar heredabilidades y tendencias genéticas para los caracteres edad al primer parto, primer y segundo intervalo de partos de la raza Romosinuano del Centro de Investigación Turipaná.

MATERIALES Y MÉTODOS Localización. El estudio se realizó en el Centro de Investigación Turipaná (Corpoica), localizado en el municipio de Cereté, Córdoba, Colombia. La zona pertenece a la clasificación agroecológica de bosque húmedo tropical, ubicado a 75°42’ longitud Oeste y 8°50’ latitud Norte, altitud de 20 msnm, temperatura media de 28ºC, humedad relativa de 83% y precipitación media anual de 1200 mm.

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calving interval (SCI) 894 and 813 records were used from the year 1957-2011 from the database generated by the Turipaná Research Center for the Romosinuano breed. Currently, at the Turipaná Research Center, animals from the Romosinuano breed are handled in a system of alternating or rotational grazing meadows with Angleton (Dichatum aristatum) and Tanzania (Panicum sp) and a permanent supply of mineral salt and water. During the dry season the animals receive a corn silage supplement. It has a mating system circulate between cow and bull, which prevents an increase of inbreeding. Data were analyzed using single trait models, and variance and covariance components were estimated using the Restricted Maximum Likelihood procedure. AIREMLF90 (4.5) software from the University of Georgia was used, which uses the average information algorithm. The following animal model was used: y=Xb + Z + Where: y = observation vector for AFC, FCI or SCI; β = vector of fixed effects for contemporary group (year-season of birth); a = vector of additive direct genetic random effects; e = residual vector; X = incidence matrix relating records to fixed effects of contemporary group; Z= incidence matrix relating records to additive direct genetic random effects. Genetic trends were calculated as a linear regression of the genetic values averages for the respective years, using the REG procedure of Statistical Analysis System - SAS (6). This program also was used to depurate the database.

RESULTS The averages for AFC, FCI and SCI are presented in table 1. The heritability for AFC was 0.04±0.05, for FCI to 0.06±0.06 and for SCI 0.09±0.06.

Table 1. Average (days) age at first calving, first interval between calving and the second calving interval. PARAMETER

AFC

FCI

1079

894

813

Average

1158.4

408.8

394.7

Standard deviation

285.6

88.3

82.5

Coefficient of variation

24.65

21.56

20.9

2016

Animales y datos. Para la característica edad al primer parto (EPP), se utilizaron 1079 registros recolectados desde el año 1957 hasta el 2007, para el primer intervalo entre partos (PIEP) y segundo intervalo entre partos (SIEP), se utilizaron 894 y 813 registros desde el año 1957 hasta 2011, de la base datos generada por el Centro de Investigación Turipaná para la raza Romosinuano. Actualmente, en el Centro de Investigación Turipaná los animales de la raza Romosinuano se manejan en un sistema de pastoreo alterno o rotacional con praderas de Ángleton (Dichatum aristatum) y Tanzania (Panicum sp), con suministro permanente de sal mineral y agua. Durante la época seca, los animales son suplementados con ensilaje de maíz. Se cuenta con un sistema de apareamiento circular entre vaca y toro, el cual evita el aumento de la consanguinidad. Predicciones genéticas y parámetros genéticos. Los datos fueron analizados mediante modelos unicarácter, los componentes de varianza y covarianza se calcularon utilizando el procedimiento de Máxima Verosimilitud Restringida. Para ello, se utilizó el software AIREMLF90 (4,5) de la Universidad de Georgia, el cual utiliza algoritmo de información promedio. El modelo animal usado fue el siguiente: y=Xb + Z + Dónde: y = vector de observaciones para EPP, PIEP o SIEP; β = vector de efectos fijos de grupo contemporáneo (año-época de nacimiento); a = vector de efectos aleatorios genéticos aditivos directos; e = vector de residuales; X = matriz de incidencia que relaciona los registros a los efectos fijos de grupo contemporáneo; Z= matriz de incidencia que relaciona los registros a los efectos aleatorios genéticos aditivos directos. Las tendencias genéticas se calcularon como una regresión lineal de las medias ponderadas de los valores genéticos sobre los respectivos años, usando el procedimiento REG de Statistical Analysis System - SAS (6). Este programa, además fue utilizado para la depuración de la base de datos.

SCI

RESULTADOS Los promedios para EPP, PIEP y SIEP se presentan en la Tabla 1. La heredabilidad para la EPP fue

Vergara - Heredabilidades y tendencias genéticas en ganado Romosinuano Genetic trends for AFC, FCI, and SCI can be observed in figures 1, 2 and 3, respectively.

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de 0.04 ± 0.05, para PIEP de 0.06 ± 0.06 y para SIEP de 0.09 ± 0.06. Las tendencias genéticas para la EPP, PIEP y SIEP se observan en las figuras 1, 2 y 3, respectivamente.

Figure 1. Genetic trends for age at first calving, according to the cow’s year of birth. Figure 2. Genetic trends for the first calving interval, according to the cow’s year of birth.

En la tabla 2, se observan las ecuaciones de regresión de las tendencias genéticas para las características en estudio. Además, se puede notar que la tendencia genética para PIEP no fue significativa, caso contrario ocurrió para EPP y SIEP.

DISCUSIÓN Figure 3. Genetic trends for the second calving interval, according to the cow’s year of birth.

In table 2, regression equations for trends in genetic traits under study are observed. Additionally, genetic tendency to FCI was not significant, but just the opposite occurs in AFC and SCI. Table 2. Genetic trends of reproductive traits. Trait

Regression equation

P >F

y= 168.70 – 0.086x

0.0957

0.0288

FCI

y= -24.79 + 0.013x

0.0104

0.4628

SCI

y= -195.96 + 0.101x

0.2498

0.0001

AFC

DISCUSSION Age at first calving (AFC). The estimated average for AFC was 38.61 ± 9.52 months, a similar result (38.21 and 36.8 ± 4.7 months) to reports by Ossa et al (2) and Rocha et al (7) for Romosinuano and Blanco Orejinegro cattle,

Edad al primer parto (EPP). La media estimada para EPP fue de 38.61±9.52 meses, este resultado fue similar (38.21 y 36.8±4.7 meses) a los reportados por Ossa et al (2) y Rocha et al (7) en ganado Romosinuano y Blanco Orejinegro, respectivamente. De igual forma, varios trabajos realizados en Colombia y otros paises, con diferentes razas bovinas, se encontraron resultados similares (37.7±10,1; 36.36±4.9 y 38.9±3.9 meses) a los hallados en el presente estudio (8-10). Mientras que, Martínez et al (11) y Azevedo et al (12), encontraron resultados inferiores (32.5±6.24 y 34.58 ± 6.21 meses), en ganado Sanmartinero y Chianina, respectivamente. La EPP obtenida en esta investigación se considera aceptable, teniendo en cuenta el sistema de producción basado en pastoreo con gramíneas de mediana calidad nutricional y el efecto de factores ambientales sobre la disponibilidad de forraje durante el algunos meses del año, lo cual confirma la capacidad de adaptación de la raza Romosinuano a las condiciones adversas del trópico bajo colombiano. Esta adaptabilidad proporciona una mayor vida productiva a las vacas, que expresado en términos de

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respectively. Similarly, several studies carried out in Colombia and other countries with different cattle breeds found similar results (37.7 ± 10.1; 36.36 ± 4.9 and 38.9 ± 3.9 months) to those in this study (8-10). Martinez et al (11) and Azevedo et al (12) found lower results (32.5 ± 6.24 and 34.58 ± 6.21 months) in Sanmartinero and Chianina cattle, respectively. AFC obtained in this investigation is considered acceptable given the production system based on grazing on grasses with average nutritional quality and the effect of environmental factors on availability of forage during some months of the year, confirming the ability of the Romosinuano breed to adapt to adverse conditions in the Colombian tropics. This adaptability provides increased productive life of cows, that expressed in terms of profitability, will enable a greater amount calves per cow in the herd. However, a much lower value for this trait by providing better food and nutrition and implementing good management practices for heifers. The estimated heritability of AFC was similar to that reported by Espinoza et al (8) in a population of Zebu cattle (0.09) in Cuba. While Ossa et al (2) and Suarez et al (13) found higher heredability values (0.16 ± 0.086 and 0.16 ± 0.08) than those in this study in the Romosinuano breed. Several studies carried out in other breeds of beef cattle in different regions of this country and others reported higher heritability values for AFC (0.15 ± 0.026, 0.14 and 0.15 ± 0.01) than those in this study (7, 14, 15). According to the estimated heritability value for AFC, these types of variations depend only 4% on the differences between animal additives and 96% on other sources of variation. Most scientific papers that have studied reproductive traits in cattle have reported lower inheritance values, which they attribute to environmental influences or because reproduction is mainly controlled by non-additive genetic effects, so a good response to selection for this trait is not expected (2, 7, 8, 13-15). Genetic trend values for AFC showed very variable behavior during the assessment period, where it can be observed (Figure 1) that over the years there is a decreasing trend, with an average annual decrease of -0.08581 ± 0.03807 days/ year (p=0.0288; Table 1). This annual value is less than what is reported by Ossa et al (16), who reported results of -0.33 days/year when evaluating the same breed, using records from the same research center that this study used, but over different time periods. Similarly, Martinez et al (11), obtained an average annual decrease of 16.71 days in a study of Sanmartinero cows.

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rentabilidad, permitirá tener una mayor cantidad de terneros por vaca en el hato. No obstante, se puede obtener un valor mucho menor para esta característica, proporcionando una mejor alimentación y nutrición e implementando buenas prácticas de manejo para las novillas. La heredabilidad estimada para EPP fue similar a la reportada por Espinoza et al (8) en una población de ganado Cebú (0.09) en Cuba. Mientras que, Ossa et al (2) y Suarez et al (13), encontraron valores de heredabilidad superiores (0.16 ± 0.086 y 0.16 ± 0.08) a los del presente estudio, en animales de la raza Romosinuano. Varios trabajos realizados en otras razas de ganado de carne en diferentes regiones del país, como por fuera de este, reportan valores de heredabilidad para EPP superiores (0.15 ± 0.026, 0.14 y 0.15 ± 0.01) a los del presente estudio (7, 14, 15) De acuerdo al valor estimado de heredabilidad para la EPP, las variaciones de este carácter dependen solamente de un 4% de las diferencias entre los genotipos aditivos de los animales y el 96% de otras fuentes de variación. La mayoría de artículos científicos que han estudiado las características reproductivas del ganado bovino reportan valores de herencias bajos, lo cual se lo atribuyen a la influencia ambiental que se ejerce sobre estas o que la reproducción esta mayormente controlada por efectos genéticos no aditivos, por lo que no se espera que haya una buena respuesta a la selección para este carácter (2, 7, 8, 13-15). Los valores de las tendencias genéticas para EPP, presentan un comportamiento muy variable en el periodo evaluado, donde se observa (Figura 1) que existe una tendencia decreciente a través de los años, con una disminución anual promedio de -0.08581 ± 0.03807 días/año (p=0.0288; Tabla 1). Este valor anual es inferior a lo reportado por Ossa et al (16), quienes reportaron resultados de –0.33 días/año evaluando la misma raza, con registros del mismo centro de investigación del presente trabajo, pero comprendiendo periodos de tiempo diferente. De igual manera, Martínez et al (11), obtuvieron una disminución promedio anual de 16.71 días en un estudio realizado en hembras de ganado Sanmartinero. Como puede observarse, la tendencia genética anual de los efectos genéticos directos fue negativa y significativa, aunque cercana a cero, indicando que durante el periodo evaluado para esta característica la variabilidad genética ha cambiado poco. Lo cual puede deberse a que el hato pertenece a un programa de conservación nacional, donde el objetivo es mantener la variabilidad genética, por lo que posiblemente

Vergara - Heredabilidades y tendencias genéticas en ganado Romosinuano As shown, the annual genetic trend of direct genetic effects was negative and significant, although close to zero, indicating that during the period evaluated for this trait there has been little genetic variability. This may be because the herd belonged to a national conservation program where the aim is to maintain genetic variability, where a circular mating system is possibly used, as well as introducing replacements cows and bulls that have conditioned this trait’s stability and possibly conserved genetic variability. First and second calving interval (FCI and SCI). The mean FCI obtained in this study was lower than those reported by several authors (547 ± 142, 469 ± 9 475 ± 114, 517 ± 4 and 458 ± 96 days, respectively) in different breeds of beef cattle (7 10-12, 17). The average SIEP was lower than that reported by Rocha et al (7) for Blanco Orejinegro cattle (487 ± 132 days), and Silveira et al (17) in Nellore cattle (453 ± 4 days). The average FCI and SCI for animals in this study is considered good, since in terms of production it represents a birth rate between 85 and 92%. Therefore, it is important to note that reproductive traits reflect how an animal adapts to a production system in a given environment (11). The CI is the most important reproductive manifestation in any animal production system and its importance derives from the regular production of calves, which is the primary objective of any meat or milk producing system, and this is achieved by seeking an ideal CI over 365 days to maximize the ability generate income over the cow’s useful life, since excellent reproductive performance is critical to the profitability of cattle production systems (3,11,18). The heredability value obtained in this study was low for both the FCI and the SCI, which coincides with the found for Vergara et al (19) in a population of crossbreed Angus, Blanco Orejinegro and Cebu (FCI=0.11±0.006 and SCI=0.18±0.11). Likewise, for the heritability of FCI were reported low values (0.014±0.13 and 0.03±0.13), compared with those in this study (12, 20). Heritability values obtained for FCI and SCI in the Turipaná RC herd indicate that these traits are mainly affected by environmental and additive genetic factors rather than additive genetic factors. Therefore, heritability estimates suggest that the response to direct selection for these characters would be low; thus, the improvement strategy for this population would be to implement better management systems

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el empleo de sistema de apareamiento circular, introducción de remplazos de vacas y toros han condicionado la estabilidad para la característica evaluada y la posible conservación de la variabilidad genética. Primer y segundo intervalo entre partos (PIEP y SIEP). La media del PIEP obtenida en este trabajo fue inferior a las reportadas por varios autores (547 ± 142, 469 ± 9, 475 ± 114, 517 ± 4 y 458 ± 96 días, respectivamente), en diferentes razas bovinas de carne (7, 10-12, 17). La media del SIEP fue inferior a la reportada por Rocha et al (7) en ganado Blanco Orejinegro (487 ± 132 días) y Silveira et al (17) en ganado Nelore (453 ± 4 días). El promedio del PIEP y el SIEP en los animales de este estudio es considerado bueno, ya que en términos productivos representaría un índice de natalidad entre el 85 y 92%. Por lo tanto, es importante resaltar que las características reproductivas son el reflejo de la adaptación de un animal a un sistema de producción en un determinado ambiente (11). El IEP es la manifestación reproductiva más importante en cualquier sistema de producción animal y su importancia deriva de la producción regular de terneros, el cual es el objetivo primario de cualquier sistema de producción de carne o leche y esto se logra buscando un IEP ideal de 365 días, para maximizar la capacidad de la vaca de generar ingresos con respecto a su vida útil, ya que un excelente desempeño reproductivo es de suma importancia para la rentabilidad de los sistemas de producción bovina (3,11,18). El valor de heredabilidad obtenido en este estudio fue bajo, tanto para el PIEP como para el SIEP, coincidiendo con lo encontrado por Vergara et al (19) en una población de bovinos cruzados de las razas Angus, Blanco Orejinegro y Cebú (PIEP=0.11±0.006 y SIEP=0.18±0.11). Asimismo, para la heredabilidad del PIEP se reportan valores bajos (0.13±0.014 y 0.03±0.13), respecto al de este estudio (12,20). Los valores de heredabilidad obtenidos para PIEP y SIEP en el hato del CI Turipaná indican que, estas características están mayormente afectadas por factores ambientales y genéticos no aditivo, que por factores genéticos aditivos. Por lo tanto, los estimados de heredabilidad sugieren que la respuesta a la selección directa para estos caracteres será poca, así que la estrategia de mejoramiento para esta población sería la de implementar mejores sistemas de manejo, como la alimentación o recurrir a los sistemas de cruzamiento para aprovechar los efectos no aditivos de los nuevos paquetes

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such as improving feed or resorting to crossing breeds to take advantage of the non-additive effects of new genetic packages from different breeds, but this would be detrimental to the conservation of breed by the CI Turipaná. Regarding genetic trends estimated for FCI and SCI, it shows that it was not significant for FCI (p=0.4628) for the assessed period, while for SIEP it was (p=0.0001; Table 2). These values were higher in mathematical terms, but not in productive terms compared to those reported by Vergara et al (19) who obtained a FCI value of -0.32 ± 0.09 (p<0.01) days/year and -1.16±0.48 (p<0.05) days/year for SCI. As can be seen, annual genetic trends of direct effects as measured by the regression coefficient were very close to zero, indicating that during the period evaluated for these traits there was little genetic progress for the reasons stated above for AFC. In conclusion, heritability for the traits studied was low, indicating that these reproductive parameters are largely influenced by environmental and non-genetic factors and if desired reducing the averages of the traits studied, nutritional management measures mainly would cause a positive effect. The estimated genetic trends showed positive and negative averages that were close to zero, which shows that the objective of the Turipaná Research Center regarding this population has fully complied with preserving genetic variability in the Romosinuano breed. Acknowledgments To the Turipaná RC (Corpoica) for providing the information for this study.

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genéticos provenientes de diferentes razas, pero esto iría en detrimento de la conservación de la raza por parte del CI Turipaná. En relación a las tendencias genéticas estimadas para PIEP y SIEP, se observa que para PIEP no fue significativa (p=0.4628) para el periodo evaluado, mientras que para SIEP sí lo fue (p=0.0001; Tabla 2). Estos valores fueron superiores, en términos matemáticos, mas no productivos, respecto a los reportados por Vergara et al (19), quienes obtuvieron para PIEP un valor de -0.32 ± 0.09 (p<0.01) días/años y de -1.16 ± 0.48 (p<0.05) días/año para SIEP. Como se puede observar, las tendencias genéticas anuales de los efectos directos, medidas según el coeficiente de regresión, fueron muy cercanas a cero, lo que indica que durante el periodo evaluado para estas características hubo poco progreso genético, por las razones expuestas anteriormente para EPP. En conclusión las heredabilidades para los caracteres estudiados fueron bajas, indicado que dichos parámetros reproductivos son afectados en gran parte por factores ambientales y no genéticos y que si desean reducir los promedios de los caracteres estudiados, medidas de manejo nutricional, principalmente, ocasionarían un efecto positivo. Las tendencias genéticas estimadas arrojaron valores promedios positivo y negativos cercanos a cero, lo cual demuestra que el objetivo del CI Turipaná con respecto a esta población se ha cumplido a cabalidad, preservando la variabilidad genética de la raza Romosinuano. Agradecimientos Al CI Turipaná (Corpoica), por facilitar la información para el desarrollo de ésta investigación.

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5258-5264, 2016. ISSN: 0122-0268 BRIEF COMUNICATION

Proximate composition analysis posterior to the cryopreservation of Chaetoceros calcitrans Análisis de la composición proximal de Chaetoceros calcitrans posterior a su criopreservación Joan Salas-Leiva,1* Ph.D, Enrique Dupré M,1 M.Sc, Dayana Salas-Leiva,2 Ph.D. 1Universidad

Católica del Norte, Facultad de Ciencias del Mar, Departamento de Acuicultura, Larrondo 1281, Coquimbo, Chile. 2Dalhousie University, Centre for Comparative Genomics & Evolutionary Bioinformatics, Halifax, Nova Scotia, B3H 4R2, Canada. *Correspondencia: jsalasleiva@gmail.com Received: March 2015; Accepted: May 2015.

ABSTRACT Objective. The effect of cryopreservation on the proximate composition of microalgae Chaetoceros calcitrans was evaluated. Materials and methods. C. calcitrans was cultured and cryopreserved using 5% (v/v) dimethylsulfoxide as cryoprotectant. The freezing was controlled at a rate of 3°C/min, up to -60°C and then the microalgae were immersed in liquid nitrogen (-196°C). After storage in liquid nitrogen, microalgae were rapidly thawed out and subcultured. The percentage of proteins, lipids and carbohydrates was analyzed using absorption spectrophotometry and the organic matter was studied by gravimetric analysis. Results. There was no significant variation between the proximate composition of C. calcitrans cryopreserved and the controls (p>0.05). Conclusion. Our results show that, despite low cell recovery after the preservation of this organism at low temperatures, there is no apparent loss of nutritional characteristics caused by the storing process at low temperatures. Key words: Diatom, freezing, nutrients, storage viability (Source: AGROVOG, DeCS).

RESUMEN Objetivo. En este estudio se evaluó el efecto de la técnica de criopreservación sobre la composición proximal de la microalga Chaetoceros calcitrans. Materiales y métodos. C. calcitrans fue cultivada y criopreservada empleando dimetilsulfóxido al 5% (v/v) como crioprotector. La congelación fue controlada a una tasa de 3°C/min, hasta llegar a -60°C y luego las microalgas fueron sumergidas en nitrógeno líquido (-196°C). Posteriormente, las microalgas fueron descongeladas de manera rápida y nuevamente cultivadas. Seguidamente se analizó la cantidad porcentual de proteínas, lípidos y carbohidratos, empleando espectrofotometría de absorción y la materia orgánica por gravimetría. Resultados. Los resultados indicaron que la composición proximal posterior a la criopreservación no evidencia diferencias significativas respecto a los controles no criopreservados (p>0.05). Conclusiones. Los resultados indican que pese a la baja viabilidad post-criopreservación de C. calcitrans, no hay pérdida aparente de la composición nutricional debida al almacenamiento a bajas temperaturas. Palabras clave: Almacenamiento, congelación, diatomea, nutrientes, viabilidad (Fuente: AGROVOG, DeCS).

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Salas-Leiva - Nutrients of Chaetoceros calcitrans cryopreserved

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Microalgae are a rich source of proteins, lipids and carbohydrates. They are used in aquaculture as food source in at least one stage of the life cycle of fish, mollusks and crustaceans. In hatcheries, sub-culture is generally used to maintain different strains of microalgae. This could potentially introduce biological contamination in the culture, subsequent loss of the strains, an increase of the farming costs, and at the same time, can affect the biochemical or genetic characteristics of the strains. Those problems can be tackled by maintaining collections of cryopreserved cultures, which aim to keep viable strains during long periods of time with minimal changes in their characteristics (1).

Las microalgas son una fuente rica de proteínas, lípidos y carbohidratos. Estas son usadas en acuicultura como alimento en al menos una etapa del ciclo de vida de peces, moluscos y crustáceos. En granjas productoras, generalmente, el mantenimiento de las cepas de microalgas se lleva a cabo por subcultivo, lo cual puede traer consigo problemas como la contaminación de la cepas y la pérdida de las mismas, un aumento en los costos de producción y también puede incidir en el cambio de las características de las cepas por las cuales fueron seleccionadas como fuentes nutricionales. Las colecciones de cultivo criopreservadas representan la solución a estos problemas, ya que permiten mantener cultivos sin contaminación, viables a lo largo del tiempo y con cambios mínimos en sus características (1).

Microalgae cryopreservation is applied for various purposes. In cases where microalgae are used as nutritional sources, with low cell viability after cryopreservation as in the case of Chaetoceros calcitrans (viability <40%) (2), it is necessary to study whether the survivor cells have similar or different proximate composition to the one observed before freezing. SanchezSaavedra and Nuñez-Zarco (3) indicate that a low storage temperature of 4°C (during 1 to 6 weeks) influences cell density and proximal composition in cultures of the diatoms Navicula sp, N. incerta, N. thermalis and Nitzschia laevis. The purpose of this study was to analyze the proximate composition of the diatom C. calcitrans before and after one cycle of cryopreservation. C. calcitrans is an important source of omega 3 (C≥20) and polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFA, mainly eicosapentaenoic acid: EPA, 20: 5 n-3). These nutrients make this microalga attractive for feeding filter-feeding mollusks, echinoderms, crustaceans and some zooplankton taxa (4).

MATERIALS AND METHODS Cultivation and Cryopreservation. Batch cultures of C. calcitrans using micro-filtered sterile sea water were grown. Culture conditions, cryopreservation protocol and viability estimations are broadly described in Salas-Leiva and Dupré (2). A brief description of the cryopreservartion protocol is presented here: dimethylsulfoxide (Me2SO, 10%) (Sigma, St. Louis, MO) was added to the cells at 4 and 25°C in complete darkness (1:1 proportion in mL). Each suspension (microalgae-cryoprotectant) was introduced into 0.5 mL straws (IMV France) and incubated during 15 or 45 min [treatments 6: OC-0445 and 18: OC-2515 in Salas-Leiva and Dupré (2)]. Straws were subsequently frozen to -60°C at a rate

En microalgas la criopreservación ha tomado mucha fuerza por las ventajas anteriormente mencionadas. Sin embargo, cuando la viabilidad posterior a la criopreservación es baja, como lo es en el caso de Chaetoceros calcitrans (viabilidad <40%) (2), es necesario indagar si los microorganismos sobrevivientes presentan una composición proximal similar a la observada en la cepa antes de ser criopreservada, es decir, si la cepa conserva las características nutricionales iniciales. Resultados obtenidos por Sánchez-Saavedra y Nuñez-Zarco (3) indican que el almacenamiento a baja temperatura de refrigeración (4°C) (durante 1 a 6 semanas) influye en la densidad celular y en la composición proximal de los cultivos de las diatomeas Navicula sp, N. incerta, N. thermalis y Nitzschia laevis. El propósito de este estudio fue analizar la composición proximal de la diatomea C. calcitrans antes y después de un ciclo de criopreservación. C. calcitrans es una fuente importante de ácidos grasos omega 3 de cadena larga (C≥20) y ácidos grasos poliinsaturados (n-3 PUFA), principalmente ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5 n-3). Dichos nutrientes hacen que esta microalga sea utilizada en la alimentación de moluscos filtradores, crustáceos y también en zooplancton (4).

MATERIALES Y MÉTODOS Cultivo y criopreservación. Se realizaron cultivos tipo batch de C. calcitrans empleando agua de mar envejecida microfiltrada y autoclavada. Las condiciones de cultivo, criopreservación y estimaciones de viabilidad se encuentran descritas en Salas-Leiva y Dupré (2). El protocolo de criopreservación empleó dimetilsulfoxido (Me2SO) (Sigma, St. Louis, MO) al 10% (v/v), el cual fue adicionado en proporción 1:1

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of 3°C/min and then stored in liquid nitrogen (-196°C). The viabilities of the treatments that had significant differences were 15.6±8.4% (OC0445) and 31.7±7.7% (OC-2515). The recovered (thawed out treatments) and control cells (cells never cryopreserved from the same original strain used to cryopreserve) were inoculated into beakers of 250 mL and kept for 5 days. Then, an intermediate culture was grown in a volume of 1400 mL and five days later were transferred to bottles of 5 L. For conditions and culture media review Salas-Leiva and Dupré (2). Proximate composition. Thorough nutrient analysis methods are complex and costly to implement; for instance gas or liquid chromatography can be used to observe small variations in the levels of fatty acids and amino acid profiles. This research selected a basic and simple methodology, with good sensitivity and low cost that can potentially be used in small laboratories or in variable ground conditions in producing farms. The analysis was done for the recovered cells and the control. After six days of culture (stationary phase), a sample of 2 L of each of the three cultures was removed and centrifuged at 6000 r.p.m. for 6 min. The pellets were washed with isotonic ammonium formate (3.4%) to remove salts, and dried at 70°C until a constant weight was obtained. The ash-free dry weight was obtained by subjecting the sample to 500°C for 6 h. The percentage of proteins, lipids, carbohydrates, and organic matter of the three cultures was determined for C. calcitrans. Proximal analyses were performed using colorimetric techniques, with an absorption spectrophotometer Shimadsu (UV150-02). Proteins, lipids and carbohydrates were analyzed with techniques in references (5) to (7). Serum albumin, cholesterol and glycogen were used as standards (Sigma, St. Louis, MO). The organic matter in the samples was studied by gravimetric analyses according to Costard et al (8). Statistical Analysis. The experimental design was a completely randomized block with one single factor and four levels. Three replicates were done and the result for each nutritional component was recorded as percentage of dry weight. For the analysis of variance, we first tested normality, homogeneity of variance and random data sequence with the Shapiro-Wilks, Barlett’s and runs tests respectively, and Tukey’s test for additivity. A one-way ANOVA for each nutrient was done separately. For all analyzes, we used SAS 9.3.1®.

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(microalga:crioprotector) para una concentración final de 5% (v/v). El Me 2SO fue añadido a la suspensión de microalgas a 4 y 25ºC en oscuridad completa. Así, la concentración final del crioprotector fue de 5% (v/v). Cada suspensión (microalgas-crioprotector) se introdujo en pajuelas de 0.5 mL (IMV, Francia) y se dejó incubar 15 o 45 min dependiendo del tratamiento [tratamiento 6: OC-0445 y 18: OC-2515, ver Salas-Leiva y Dupré (2)]. Posteriormente las pajuelas fueron congeladas hasta -60°C con una tasa de 3ºC/min y luego sumergidas en nitrógeno líquido. Las viabilidades de los tratamientos mencionados fueron de 15.6±8.4% para OC-0445 y 31.7±7.7% para OC-2515. Los dos tratamientos descongelados y el cultivo control (nunca criopreservado) se inocularon en vasos de precipitado de 250 mL para iniciar un nuevo cultivo. Transcurridos 5 días en vasos de precipitado de 250 mL, se llevaron a cultivo intermedio con volumen de 1400 mL y cinco días después fueron transferidos a botellas de 5 L. Las condiciones y medios de cultivo fueron las mismas presentadas en Salas-Leiva y Dupré (2). Análisis de composición proximal. Para el análisis minucioso de nutrientes existen métodos complejos con implementación de alto costo, como cromatografía de gases o líquida que permiten observar variaciones mínimas en los niveles de ácidos grasos y los perfiles aminoacídicos. Esta investigación seleccionó una metodología basica y sencilla, con buena sensitividad y bajo costo que potencialmente puede ser usada en pequeños laboratorios o en variadas condiciones de campo en granjas productoras. El análisis fue llevado a cabo con las celulas de los tratamientos descongelados y el control. Luego de seis dias de cultivo, se extrajeron muestras de 2 L de cada uno de los tres cultivos y se centrifugaron a 6.000 r.p.m. por 6 min. Los pellets fueron lavados con formiato de amonio isotónico (3.4%) para eliminar las sales y, se secaron a 70ºC hasta que se obtuvo un peso constante. El peso de la ceniza, se obtuvo sometiendo la muestra a 500ºC por 6 horas en una mufla (Raypa). Se determinó el porcentaje de proteínas, lípidos, carbohidratos y materia orgánica a los tres cultivos de C. calcitrans. Los análisis proximales se realizaron mediante técnicas colorimétricas, con un espectrofotómetro de absorción Shimadsu (UV150-02). La estimación de proteínas, lípidos y los carbohidratos fue realizada con las técnicas expuestas en las referencias (5-7); los estándares fueron albúmina sérica, colesterol y glucógeno (Sigma, St. Louis, MO). La estimación de materia orgánica de las muestras se realizó

Salas-Leiva - Nutrients of Chaetoceros calcitrans cryopreserved

RESULTS The results indicated that the percentages of protein and lipid of the control were slightly greater than those of the thawed out treatments (Table 1). Carbohydrates in treatment OC0445 were slightly higher than those in the control and treatment OC-2515. In the case of organic matter, both treatments had slightly higher values than the control (Table 1). All treatments, fulfilled the assumptions of normality, homogeneity of variance, data independence and additivity (p>0.05). ANOVA indicated that the proximate composition of microalgae subjected to cryopreservation (OC-0445 treatment and OC-2515) and the control was not significantly different (Table 2).

Table 1. Proximate composition of Chaetoceros calcitrans (percentaje of dry weight), control (not cryopreserved); O.M. (Organic matter); treatments: OC-0445 and OC-2515 (microalgae under cryopreservation). (±): Standard deviation. Treatment

Protein

Lipids

Carbohydrates

O.M

Control

30.2 ± 1.1

15.5 ± 1.5

10.6 ± 0.1

40.8 ± 1.1

OC-0445

28.3 ± 1.7

14.5 ± 0.9

11.3 ± 0.3

46.0 ± 2.1

OC-2515

28.6 ± 1.2

14.3 ± 1.6

10.3 ± 1.4

44.6 ± 4.4

Table 2. Factorial Analysis of Variance (ANOVA) randomized block for: Proteins, lipids, carbohydrates and organic matter. Degrees of freedom (df), sum of squares (SS), Square of the mean (SM), F (statistics) and P (significance level). df

F-value

p-value

Proteins

Source

6.409

3.204

1.19

0.393

Replica

0.329

0.164

0.06

0.942

Error

10.764

Total

17.502

2.691

Lipids

2.406

1.203

0.71

0.544

Replica

5.323

2.662

1.57

0.313

Error

6.761

Total

14.490

1.690

Carbohydrates

1.521

0.760

1.55

0.317

Replica

2.417

1.209

2.47

0.2

Error

1.958

Total

5.897

0.489

Organic mater

50.32

25.16

2.13

0.234

Replica

7.12

3.56

0.30

0.755

Error

47.22

Total

104.66

11.810

DISCUSSION Under the conditions used in this experiment, viable cells of C. calcitrans seem to maintain their initial nutrient composition after one cycle of cryopreservation, despite a viability of

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mediante desecación, incineración y gravimetría según Costard et al (8). Análisis estadístico. El diseño experimental fue de bloques completamente al azar con sólo un factor y cuatro niveles. Se efectuaron 3 réplicas y las variables de respuesta de cada componente nutricional fueron registradas en porcentajes de peso seco. Para el análisis de varianza se procedió a probar los supuestos de normalidad, homogeneidad de varianzas y sucesión aleatoria de datos con los test de Shapiro-Wilks, Bartlett y test de rachas respectivamente, además, se realizó el test de aditividad de Tukey específico para el modelo estadístico. Comprobados todos los supuestos se efectuó una ANOVA de una sola vía para cada uno de los nutrientes por separado. Todos los análisis se realizaron con el programa S.A.S 9.3.1®.

RESULTADOS Los resultados indicaron que los porcentajes de proteínas y lípidos del control fueron levemente mayores a la de los tratamientos congelados (Tabla 1). Los carbohidratos del tratamiento OC-0445 fueron ligeramente superiores a los del control y del tratamiento OC-2515, mientras que la materia orgánica de los dos tratamientos fue superior a la del control (Tabla 1). Todos los tratamientos evaluados cumplieron los supuestos de normalidad, homogeneidad de varianzas, independencia de datos y aditividad (p>0.05). El ANOVA indicó que la composición proximal de las microalgas sometidas a criopreservación (tratamiento OC-0445 y OC-2515) y la del control, no fueron diferentes (Tabla 2).

DISCUSIÓN Bajo las condiciones utilizadas en este experimento, las células viables de C. calcitrans parecen mantener sus características nutricionales iniciales, después de un ciclo de la criopreservación, pese a que el número de células viables estuvo únicamente entre 15 y 35%. Algo similar fue reportado por Nakanishi et al (9) en cuatro tipos de microalgas, en los que el contenido de clorofila no cambió significativamente después de ser criopreservadas durante 15 años. En la actualidad existen pocos reportes sobre el estudio de la composición proximal de las microalgas después de ser criopreservadas. Dentro de estos reportes, se encuentra el de Esquivel et al (10) en Chaetoceros sp. en el cual los porcentajes de proteína, carbohidratos y lípidos de las microalgas criopreservadas, presentan una reducción de los componentes nutricionales con respecto a cultivos control no criopreservados. La reducción de algunos componentes en las muestras congeladas es el resultado de la ruptura celular que ocurre a bajas

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approximately 15 to 35%. Something similar was reported by Nakanishi et al (9) in four types of microalgae, in those cells chlorophyll content did not show any significant change after being cryopreserved for 15 years. Among the few reports on the study of the proximate composition of microalgae after being cryopreserved, Esquivel et al (10) in Chaetoceros sp. found reduced percentages of protein, carbohydrate and lipids in cryopreserved microalgae respect to controls. The reduction in some components in frozen samples can be attributed to “cell leakage” which occurs at low temperatures (membrane damage causing loss of cell content). Nuñes-Zarco y Sánchez-Saavedra (11) mentioned that refrigeration of benthic diatoms Navicula incerta and Amphiprora paludosa at 4°C causes small changes in the proximate composition (mainly lipids and organic matter). Subsequently Sanchez-Saavedra and Nuñez-Zarco (3) noted that storage at 4°C in darkness, causes an increase in protein content in Navicula sp, N. incerta and Nitzschia laevis, but an increase in the lipid content is only observed in N. incerta under those conditions. According to these researchers this change in the lipid content is consistent with that shown by plant cells after cooling at 5°C, where the lipid content typically increases at the cell membrane to prevent formation of intracellular ice. Proximal changes in composition after storage at low temperatures are a type of species-specific response. The above mentioned results are not fully comparable to our research because they applied different preservation procedures. Nonetheless, we can suggest that the microalgae in our study retained the ability to grow and synthesize the basic components of biomass in similar proportions of the original strain. Here we have to highlight that most of the chemical and metabolic reactions are reduced exponentially at low temperatures, and differences in cells stored at -20°C respect to those stored at -100°C are expected (i.e. the lower the storage temperature, the smaller the change occurring in the cells). This means that the use of temperatures below the eutectic point of the mixture (cells-cryoprotectant solution) prevents damage of the cell for long periods of storage (12). According to Brown et al (13), diatoms generally present protein composition ranging from 30±10%, lipids between 14±5% and 7±3% carbohydrates. Our data fall within those ranges. The nutritional contents observed in our investigation are close to the ones reported for C. calcitrans, C. muelleri, C. gracilis and Chaetoceros sp. (14), and the slight observed

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temperaturas (daños a las membranas que causan pérdida de contenido celular). Nuñez-Zarco y Sánchez-Saavedra (11) mencionan que la conservación de las diatomeas bentónicas Amphiprora paludosa y Navicula incerta a 4°C, provoca pequeñas modificaciones en la composición bioquímica (principalmente lípidos y materia orgánica) con respecto a los controles. Posteriormente Sánchez-Saavedra y Núñez-Zarco (3) observaron que el almacenamiento a 4°C en oscuridad, provoca un aumento en el contenido de proteína en las diatomeas Navicula sp, N. incerta y Nitzschia laevis y un aumento en el contenido de lípidos únicamente en N. incerta (bajo esas condiciones). De acuerdo a estos investigadores este cambio en el porcentaje de lípidos es consistente con los datos sobre las células vegetales después de refrigeración a 5°C, donde el contenido de lípidos típicamente aumenta en la membrana celular para prevenir la formación de hielo intracelular. Los cambios en composición proximal después del almacenamiento a bajas temperaturas son un tipo de respuesta especie-específica. Los resultados obtenidos en el presente estudio, no son completamente comparables con los arriba mencionados puesto que fueron obtenidos mediante técnicas de conservación distintas. No obstante, si se puede mencionar que las microalgas viables luego de criopreservación a -196°C mantuvieron la capacidad de sintetizar los componentes básicos de su biomasa en proporciones similares a las de la cepa original. Cabe anotar que la mayoría de las reacciones químicas y metabólicas se reducen exponencialmente a temperaturas bajas y se pueden esperar diferencias en las células almacenadas a -20ºC con respecto a las almacenadas a -100°C (p.e. cuánto más baja es la temperatura de almacenamiento, menor es el cambio que ocurre en las células). Esto significa que el uso de temperaturas por debajo de punto eutéctico de la mezcla (células-solución crioprotectora), previene el deterioro de la célula durante largos períodos de almacenamiento (12). De acuerdo a Brown et al (13), las diatomeas en general presentan una composición en proteínas que varían entre 30±10%, lípidos entre 14±5% y carbohidratos 7±3%, rangos entre los que se encuentran los datos de composición bioquímica obtenidos en este estudio. Por otra parte los contenidos nutricionales (proteínas, lípidos y carbohidratos) observados en esta investigación presentan valores cercanos a los reportados en C. calcitrans, C. muelleri, C. gracilis y Chaetoceros sp. (14). Las diferencias observadas en composición bioquímica entre los reportes citados con respecto a los de la presente

Salas-Leiva - Nutrients of Chaetoceros calcitrans cryopreserved

differences can be due to several factors (i.e. photoperiod, culture media, harvesting stage, temperature, salinity, strain specificity) that affect the proximate composition (14). In cases where cryopreservation is carried out with strains that have been previously cryopreserved (i.e. sequential cryopreservation), the storage technique may induce directional selection favoring those cells that are more adapted to counteract the effect of low temperatures (i.e. cells with a highly flexible cell wall, natural production of cryoprotectants, gene expression and protein accumulation associated with responses to low temperature (AFPs), or DNA methylation responses to protect against low temperatures)(15). This could be detected by the use of molecular tools such rtPCR analyzing transcription factors and/or molecular analysis of HSPs (heat shock proteins). Finally, our research supports positively the idea that cryopreservation is an effective technique of preservation of microalgae while their nutritional characteristics is maintained during long periods of time. Acknowledgements. The authors thank Mr. Raúl Vera for his support in the laboratory of Biochemistry at the Universidad Cátolica del Norte (Chile).

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investigación pueden atribuirse a diversos factores del cultivo de las microalgas como: fotoperíodo, medio de cultivo, etapa de cosecha, temperatura, salinidad, especificidad de la cepa, las cuales influyen en la composición bioquímica (14). En casos donde la criopreservación es llevada a cabo secuencialmente, es posible que ésta produzca algún tipo de selección direccional hacia células que son más aptas para contrarrestar el efecto de las bajas temperaturas [p.e. pared celular más flexible, producción de precursores de crioprotectores naturales, expresión de genes y acumulación de proteínas asociadas a respuestas a baja temperatura (AFPs) y respuestas de metilación de ADN para protegerse del frío (15). Esto podría detectarse mediante el uso de herramientas moleculares como RT-PCR, analizando factores de transcripción y/o análisis molecular de proteínas HSP (heat shock proteins). Finalmente, esta investigación apoya positivamente la idea de que la criopreservación es un proceso efectivo para la preservación de microalgas debido a que mantiene sus características nutricionales. Agradecimientos. Los autores agradecen al Señor Raúl Vera por el apoyo en el laboratorio de Bioquímica de la Universidad Católica del Norte (Chile).

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Rev.MVZ Córdoba 21(1):5265-5271, 2016. ISSN: 0122-0268 BRIEF COMUNICATION

Hematological parameters in shortnose guitarfish Zapteryx brevirostris Müller and Henle, 1841 (Chondrichthyes, Rhinobatidae) Parámetros hematológicos en guitarra shortnose Zapteryx brevirostris especies Müller y Henle, 1841 (Chondrichthyes, Rhinobatidae) Nathalia Barreto B,1 MV, Daniela Ferrer MV,2 Ph.D, Paula Baldassin,3 Ph.D, Denise Bobany M,2* M.Sc. Veterinary Medical autonomous. 2University Center Serra dos Orgãos – UNIFESO - Center of Science for Health - Course of Veterinary Medicine - Estrada da Prata s/n -Teresópolis – RJ –Brasil – CEP: 25.976-340. 3Veterinary Medical from Aquário de Ubatuba – Rua Ponciano Eugênio Duarte, 203 – Ubatuba -SP – Brasil – CEP: 11680-000. *Correspondence: debobany@gmail.com 1

Received: October 2014; Accepted: March 2015.

ABSTRACT Objective. In view of the deficiency of information in the area of clinical pathology of elasmobranchs, mainly of the physiological parameters, the aim of this work was to study hematological parameters of the Zapteryx brevirostris species. Materials and methods. Four specimens apparently healthy of Zapteryx brevirostris; three females and a male were used. These animals are all pertaining ones to the Aquarium of Ubatuba, São Paulo (Brazil). Results. The obtained average of hematological values for the Zapteryx brevirostris were: Red Blood Cells were - 0.96 x 106/µL, Packed Cell Volume - 24.3% and White Blood Cells - 36.8 x 103/µL. Conclusion. Although the small N, which decreases the accuracy, this research has scientific value because the situation of vulnerability of Zapteryx brevirostris, suggesting other studies. Key words: Clinical Pathology, elasmobranchs, hematology (Source: DeSC, BVS).

RESUMEN Objetivo. En vista de la carencia de información en el área de patología clínica de los elasmobranquios, especialmente en lo que respecta a los parámetros fisiopatológicos, el objetivo de este trabajo fue el de obtener parámetros de la hematología de la especie Zapteryx brevirostris. Materiales y método. Cuatro animales clínicamente saludables de Zapteryx brevirostris; tres hembras y un macho fueron utilizados, todos procedentes del Acuario de Ubatuba, S. P. Resultados. Los valores promedio de hematología para el Zapteryx brevirostris fueron: glóbulos rojos - 0.96 x 106/ µL, volumen de los hematíes - 24.3 % y glóbulos blancos 36.8 x 103/ µL. Conclusiones. A pesar de la pequeña N, que disminuye la precisión, la investigación tiene valor científico debido a que Zapteryx brevirostris es una especie vulnerable; sugiriendo otros estudios. Palabras clave: Elasmobranquios, hematología, patología clínica (Fuente: DeSC, BVS).

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INTRODUCTION

INTRODUCCIÓN

Brazil has extraordinary richness related to marine animals. However, little is known about the biology of each one of its forms, mainly regarding aspects of the disease in these animals and about the interactions between pathogens and hosts in natural environments.

Brasil tiene una extraordinaria riqueza relacionada con los animales marinos. Sin embargo, se conoce poco acerca de la biología de cada una de sus formas, principalmente en lo que se refiere a los aspectos de la enfermedad en estos animales y las interacciones entre los agentes patógenos y los huéspedes en entornos naturales.

The study of rays is of ecological interest because the invasion of man in the sea, so predatory, has caused great impact on the marine ecosystem, interfering not only in reproduction and survival of the rays, but also of countless beings to live there. The appreciation of the study of species in danger of extinction or vulnerable is of great importance for the ecological balance (1). The Elasmobranchs are of great importance in the trophic chain, by the fact that they are animals of top or near the top of the marine food chain, and the decrease in its abundance can cause imbalance in trophic interactions within the community (2). Only two genera of rays are found in the Brazilian coast, Zapteryx and Rhinobatos being that the genus Rhinobatos contains two species: Rhinobatos horkelli and Rhinobatos percellens, while the genre Zapteryx contains a single species: Zapteryx brevirostris, named commonly by “lane-viola short guy” or “banjo” (2,3). It should be remembered that the species Zapteryx brevirostris is already considered vulnerable, as stated on the red list of Endangered Species, from 2006, the IUCN (International Union for Conservation of Nature and Natural Resources), and it takes 14 years to be able to have its population doubled (2). Meet the blood values in order to obtain a better assessment of the State of health of animals is so important to the veterinary practitioner as are the history and physical examination of the animal, contributing to the diagnosis of possible changes caused by disease or other environmental factors. Hematological tests are considered, although routines are still rare for fish. The few published works, mainly about the rays, are old, and the variables used in the studies as climate, geographic distribution, eating habits, destruction of natural habitats among others may have changed a lot since the preparation of same. These works provide fickle results regarding nomenclature, cellular differentiation, maturation and functioning of blood cells of fishes (4- 5). Second Hrubec and Smith (4) hematological techniques used to mammals are generally applicable to fish with slight modifications and

El estudio de las rayas es de interés ecológico debido a que la invasión del hombre en el mar como depredador, tiene un gran impacto en el ecosistema marino interfiriendo no solo en la reproducción sino también en la supervivencia de las rayas, así como también en las innumerables especies que viven allí. El reconocimiento del estudio de las especies que se encuentran en peligro de extinción o que son vulnerables es de gran importancia para el equilibrio ecológico (1). Los elasmobranquios son de gran importancia en la cadena trófica, por el hecho de ser animales de la parte superior o cerca de la parte superior de la cadena alimenticia marina y dado que la disminución de su presencia puede causar un desequilibrio en las interacciones tróficas dentro de la comunidad (2). En la costa brasileña solo se encuentran dos géneros de rayas, Zapteryx y Rhinobatos, teniendo este último género dos especies: Rhinobatos horkelli y Rhinobatos percellens, mientras que el género Zapteryx tiene una sola especie: Zapteryx brevirostris, llamada comúnmente “viola-cara-curta” o “guitarra chica” (2, 3). Se debe recordar que la especie Zapteryx brevirostris ya es considerada como vulnerable, según se indica en la Lista Roja de Especies Amenazadas de 2006 de la UICN (Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza y los Recursos Naturales), ya que tarda 14 años para duplicar su población (2). Conocer los valores de los parámetros sanguíneos para hacer una mejor evaluación del estado de salud de los animales es tan importante para el médico veterinario como también lo son la historia y el examen físico del animal, lo que contribuye al diagnóstico de posibles cambios causados por enfermedades u otros factores ambientales. Se considera realizar pruebas hematológicas a pesar de que algunas rutinas son poco frecuentes para peces. Las pocas investigaciones publicadas, principalmente sobre rayas, son antiguas y las variables utilizadas en los estudios como el clima,

Barreto - Hematological parameters in shortnose guitarfish Zapteryx brevirostris Stoskopf (6) reports that, until recently, the Hematology of fish was considered a technique post mortem. The blood sample can be obtained by different ways; however, the caudal vein is used more often, even with the possibility of obtaining a sample straight from the heart (4). The blood of rays easily suffers hemolysis, and therefore should be transferred immediately to a tube containing anticoagulant. The best results are obtained with 1 to 3 mL of blood in the syringe (4). There are controversies regarding the type of anticoagulant to be used in the blood sample. A solution that combines two anticoagulant compounds, heparin and EDTA that seems to be more effective with Elasmobranch blood than either compound used individually (6). Occasionally, if the fish is stressed, and the fish are very sensitive to manipulation, blood can clot even with the presence of blood thinner, and may not be visible in the tube, but preventing the correct count of thrombocytes and leucocytes (4). Hrubec and Smith (4) state that the erythrocyte may vary with the different environments that the fish live and the water quality conditions, although these changes are not well characterized. According to Smith et al (6), the count of leukocytes in hemocytometer is the best method to determine the total count of leukocytes of fish by eliminating the interference of the erythrocytes nucleus. The aim of study was to investigate hematological parameters of Shortnose Guitarfish (Zapteryx brevirostris), evaluating the techniques of collection and staining.

MATERIALS AND METHODS Study location. This study was done with animals housed since April 2007 in the Aquarium of Ubatuba, northern coast of São Paulo- Brazil, Latitude -23.4509, Longitude -45.0647, Altitude 2 m and the Koeppen Classification climate: Af. Animals in the study. Four animals were used of the Zapteryx brevirostris species being three females and one male. Procedures performed. Although adults, animals had small sizes and weighed less than a pound each, therefore, due to low body weight was only possible withdrawal of 0.1 ml of blood for carrying out the examinations, contradicting the Hrubec and Smith (4) indication. The blood

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la distribución geográfica, los hábitos alimenticios, la destrucción de los hábitats naturales, entre otros, pueden haber cambiado significativamente desde cuando se realizaron. Estos trabajos proporcionan resultados inconstantes en cuanto a la nomenclatura, diferenciación celular, maduración y funcionamiento de las células sanguíneas de los peces (4-5). Las segundas técnicas hematológicas de Hrubec y Smith (4) utilizadas en mamíferos se aplican generalmente a peces con ligeras modificaciones; Stoskopf (6) informa que hasta hace poco, la hematología de los peces se consideraba una técnica post mortem. Es posible obtener muestras de sangre de diferentes maneras; sin embargo, se utiliza más a menudo la vena caudal, aun con la posibilidad de obtener una muestra directamente del corazón (4). La sangre de las rayas fácilmente sufre hemólisis y, por lo tanto, se debe trasladar inmediatamente a un tubo que contenga un anticoagulante. Los mejores resultados se obtienen con 1 a 3 ml de sangre en la jeringa (4). Existe una controversia en cuanto al tipo de anticoagulante que se debe utilizar en la muestra de sangre. Una solución que combina dos compuestos anticoagulantes, heparina y EDTA (ácido etilendiaminotetracético), parece ser más eficaz con la sangre del elasmobranquio que el compuesto utilizado individualmente (6). Ocasionalmente, si el pez se encuentra estresado y si es muy sensible a la manipulación, la sangre puede coagularse inclusive en presencia del anticoagulante, y puede no ser visible en el tubo, impidiendo el recuento correcto de trombocitos y leucocitos (4). Hrubec y Smith (4) establecieron que los eritrocitos pueden variar con los diferentes entornos donde el pez vive y las condiciones de calidad del agua, aún cuando estos cambios no se encuentren bien caracterizados. Según Smith y colaboradores (6), el recuento de leucocitos en el hemocitómetro es el mejor método para determinar la cantidad total de leucocitos en los peces al eliminar la interferencia en el núcleo de los eritrocitos. El objetivo del estudio fue investigar los parámetros hematológicos del pez guitarra de nariz corta (Zapteryx brevirostris), evaluando las técnicas de recolección y de tinción.

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sample was collected by venipuncture, using a 1 ml syringe (syringe of insulin BD brand) and a needle 13 x 4.5 mm, of the ventral part of the tail, where is located the caliber caudal vein, as indicate Hrubec and Smith (4) and Smith et al (6). The animal was placed in a box containing saltwater and oxygenation and the whole procedure was done with the animal contained physically without using any anaesthetic drug as can be seen in figures 1A- 1B. This procedure

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MATERIALES Y MÉTODOS Ubicación del estudio. Este estudio se realizó con animales albergados desde abril de 2007 en el Acuario de Ubatuba, costa norte de Sao Paulo, Brasil, Latitud -23.4509, Longitud -45.0647, Altitud 2 m y clasificación climática de Koppen: Af. Animales en el estudio. Se utilizaron cuatro animales de la especie Zapteryx brevirostris, tres hembras y un macho. Procedimientos realizados. Aunque adultos, los animales tenían tamaños pequeños y pesaron menos de una libra cada uno, por lo tanto, debido al bajo peso corporal, solo fue posible retirar 0,1 ml de sangre para realizar los exámenes, lo que contradice la indicación de Hrubec y Smith (4). La muestra de sangre se recogió por punción venosa, utilizando una jeringa de 1 ml (jeringa de insulina de marca BD) y una aguja de 13 x 4,5 mm, en la parte ventral de la cola, donde se encuentra la vena caudal, como lo indican Hrubec y Smith (4) y Smith y colaboradores (6). El animal se colocó en una caja con salmuera y oxigenación y todo el procedimiento se realizó manteniendo el animal en el contenedor sin utilizar ningún anestésico, como puede verse en las figuras 1A y 1B. Este procedimiento causa estrés, lo que puede afectar los resultados obtenidos. Inmediatamente después de la punción venosa, la sangre se trasvasó a un Eppendorf (Axygen) que contenía ácido etildiaminotetraacético (EDTA) (EDTA Vacutainer BD 26). Después de la homogenización de la sangre con anticoagulante y la identificación del Eppendorf, las muestras se procesaron en dos lugares: el recuento completo se realizó en una Cámara de Neubauer (Böco, Alemania) en el Acuario de Ubatuba y volumen de hematocritos se envió a un laboratorio privado de la ciudad, llamado MedLabor. Utilizando las técnicas estándar, se realizó el eritrograma con la determinación de glóbulos rojos (hemocitómetro) y hematocritos (microhematocrito) y el leucograma, determinando únicamente los glóbulos blancos mediante la técnica desarrollada por Smith y colaboradores (6).

B Figure 1. A. Blood collection of a male specimen of the Zapteryx brevirostris species obtained of the caudal vein. B. Ideal place for venipuncture.

Aspectos éticos. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética para el trato de animales de UNIFESO, en una reunión ordinaria celebrada el 30/03/2007.

Barreto - Hematological parameters in shortnose guitarfish Zapteryx brevirostris causes stress, which can affect the results obtained. I m m e d i a t e l y a f t e r ve n i p u n c t u r e , b l o o d was transferred to an eppendorf (Axygen) containing ethylene diamino-acid tetra-acetic acid (EDTA) (EDTA Vacutainer 26 BD). After the homogenization of blood with anticoagulant and the identification of eppendorf, the samples were processed in two locations: the entire count held in Newbauer Chamber (Boeco Germany) was made in the Aquário de Ubatuba and packed cell volume was sent in a private lab of the city, called MedLabor. The eritrogram, with determination of red blood cell (hemocytometer) and packed cell volume (microhematocrit) was done using standard techniques and the leucogram, with determination only of white blood cell using the technique developed by Smith et al (6). Ethical aspects. This study was approved by the Ethics Committee in dealing with Animals of UNIFESO, at the ordinary meeting held on 30/03/2007.

RESULTS The results obtained for hematological values of one male and three females of the species Zapteryx brevirostris relative to Red Blood Cell (RBC), Packed Cell Volume (PCV) and White Blood Cells (WBC) are described in tables 1 and 2 respectively.

Table 1. Hematological Parameters values of an exemplary male of the Zapteryx brevirostris species. Animal No 2

Date

RBC

PCV

WBC

10/04/2007

0.54

46.2

RBC Red Blood Cell x 106/ mm3 WBC White Blood Cell x 103/ µL PCV Packed Cell Volume %

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RESULTADOS Los resultados obtenidos para los valores hematológicos de un macho y tres hembras de la especie Zapteryx brevirostris relativos a los glóbulos rojos (GR), el volumen celular empaquetado (VCE) (hematocritos) y los glóbulos blancos (GB), se describen respectivamente en las tablas 1 y 2. Los resultados de la media de los valores hematológicos de las especies Zapteryx brevirostris pertenecientes a los glóbulos rojos, hematocrito y glóbulos blancos se describen en la tabla 3. La sangre del animal Nº 1 (hembra) se coaguló inmediatamente después del contacto con el anticoagulante y por tanto este animal no se consideró en el análisis estadístico de los datos. Durante el procedimiento de toma de una segunda muestra de sangre se observó que exhibía signos de estrés, lo que pudo haber causado la coagulación de la muestra extraída. El uso del anticoagulante EDTA demostró ser efectivo para su propósito cuando se utilizó en la toma de muestras de sangre de ejemplares de la especie Zapteryx brevirostris, con excepción del animal Nº 1. Table 2. Hematological Parameters values of two females of the Zapteryx brevirostris species Animal

Date

RBC

PCV

WBC

Nº 3

06/04/2007

1.48

28.2

Nº 4

13/04/2007

0.87

36.0

RBC Red Blood Cell x 106/ mm3 WBC White Blood Cell x 103/ µL PCV Packed Cell Volume %

Table 3. Hematological Parameters values for mean, standard deviation and range (minimummaximum) in Zapteryx brevirostris (n = 3). Variable

Mean

Standard deviation

RBC

0.96

0.48

0.4

1.5

PCV

24.3

5.1

18.6

30.1

WBC

36.8

9.03

26.6

47.0

The results of the means for hematological values of species Zapteryx brevirostris pertaining to red blood cell, packed cell volume and white blood cell are described in table 3.

RBC Red Blood Cell x 106/ mm3 WBC White Blood Cell x 103/ µL PCV Packed Cell Volume %

The animal’s blood number 1 (female) has undergone coagulation immediately after contact with blood thinner, so that animal was not considered in the statistical analysis of the data. During the procedure of collecting the blood sample on this copy it was observed that the same exhibited signs of stress, which may have caused the clotting of the extracted sample.

DISCUSIÓN

Lower limit

Upper limit

Los valores promedio de los glóbulos rojos para Zapteryx brevirostris que se encontraron en esta trabajo fueron de 0,96 x 106 / mm3 con una desviación estándar de 0,48, menor que la reportada por Rodrigues y colaboradores (7), la cual fue de 0,343 x 106 / mm3 con una desviación

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The use of the anticoagulant EDTA proved to be effective in its purpose when they were used in blood samples collected from specimens of species Zapteryx brevirostris, with exception of the animal nº 1.

DISCUSSION The average values of red blood cell for Zapteryx brevirostris found in this work was 0.96 x 106/ mm3 with standard deviation of 0.48, less than reported by Rodrigues et al (7) which was of 0.343 x 106/ mm3 with standard deviation of 0.058. If compared with other species of the same genus, as in the case of Rhinobatos horkelli, this difference increases, because the average red blood cell is 0.303 x 106/ mm3, with standard deviation of 0.066. In addition to this fact, the averages found by the authors are also not within the values of the lower limit and upper limit described in this work, which are respectively 0.4 x 106/ mm3 and 1.5 x 106/mm3 for red blood cell. The value of the packed cell volume found on this work was 24.3% with a standard deviation of 5.1 while Wilhelm Filho et al (8) reported a packed cell volume value for the sort Zapteryx brevirostris of 19.0% with standard deviation of 5.7. Brito (9) studying 53 specimens of four species of the genus Potamotrygon have found an average of 21.5% with standard deviation between 0,81 and 4,6 and Rodrigues et al (7) described a mean value for the packed cell volume of species Rhinobatos percellens of 20.5% and standard deviation of 0.5, greater than the value reported by Wilhelm Filho et al (8) to the packed cell volume 19.0% and standard deviation of 5.7 of species Zapteryx brevirostris. However, the averages of the values of packed cell volume (19.0% and 20.5%) cited by the authors are within the values of the range reported in this work are of 18.6% for the lower bound and 30.1% for the upper bound. The average values for the white blood cell were not cited by any of the authors studied, thus the mean values found in this work, 36.8 x 103/ µL for white blood cell average, standard deviation of 9.03 and the range of 26.6 x 103/ µL for lower limit and 47.0 x 103/ µL for upper bound cannot be analyzed once are unpublished values for this hematological parameters for the species of rays. Due to the low number of animals from Aquarium of Ubatuba available for the study, which decreases the accuracy, the hematological findings of Zapteryx brevirostris in this research should be considered as preliminary.

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estándar de 0,058. Si se compara con otras especies del mismo género, como en el caso de Rhinobatos horkelli, esta diferencia aumenta, ya que el promedio de los glóbulos rojos es de 0,303 x 10 6 / mm 3, con una desviación estándar de 0,066. Además de este hecho, los promedios encontrados por los autores, por tanto, no se encuentran dentro de los valores del límite inferior y límite superior descritos en este trabajo, que son 0,4 x 106 / mm3 y 1,5 x 106 / mm3 respectivamente, para glóbulos rojos. El valor del hematocrito que se encuentra en este estudio fue de 24,3%, con una desviación estándar de 5,1, mientras que Wilhelm Filho y colaboradores (8) reportaron un valor de hematocritos para la clase Zapteryx brevirostris de 19,0% con una desviación estándar de 5,7. Brito (9), en el estudio de 53 ejemplares de cuatro especies del género Potamotrygon, encontró un promedio de 21,5% con una desviación estándar entre 0,81 y 4,6 y Rodrigues y colaboradores (7) describieron un valor medio para el volumen de hematocritos de las especies Rhinobatos percellens de 20,5% y una desviación estándar de 0,5, mayor que el valor reportado por Wilhelm Filho y colaboradores (8) con hematocritos de 19,0% y una desviación estándar de 5,7 para la especie Zapteryx brevirostris. Sin embargo, el promedio de los valores de los hematocritos (19,0% y 20,5%) citado por los autores, se encuentra dentro de los valores del rango reportado en este trabajo que son de 18,6% para el límite inferior y de 30,1% para el límite superior. Los valores promedio de glóbulos blancos no fueron citados por ninguno de los autores estudiados, por lo que los valores medios que se encontraron en este trabajo fueron de 36,8 x 103 / µl para los glóbulos blancos en promedio, con una desviación estándar de 9,03 y un rango de 26,6 x 103 / µl para el límite inferior y de 47,0 x 103 / µl para el límite superior, no pudieron ser analizados debido a que son valores inéditos de esos parámetros hematológicos para las especies de rayas. El bajo número de animales en el Acuario de Ubatuba disponibles para el estudio disminuye la precisión, los hallazgos hematológicos para Zapteryx brevirostris en esta investigación deben ser considerados como preliminares. Los rangos de referencia reportados en este estudio son de importancia científica, debido al hecho de que la Zapteryx brevirostris se encuentra en una situación de vulnerabilidad y se pueden utilizar para ayudar en el manejo de

Barreto - Hematological parameters in shortnose guitarfish Zapteryx brevirostris The reference ranges reported in this study are of scientific importance, due to the fact that the Zapteryx brevirostris be in a situation of vulnerability, and can be used to aid in the management of aquarium stingrays and to create a baseline for health monitoring of the Zapteryx brevirostris wild. The results show that further studies should be made to better techniques of data collection and standardization of hematological parameters.

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las rayas en el acuario y para la creación de una línea de base para vigilar la salud de la Zapteryx brevirostris en estado salvaje. Los resultados muestran que se deben efectuar más estudios para mejorar las técnicas de recolección de datos y la estandarización de los parámetros hematológicos.

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Oliveira AT, Lemos JRG, Santos MQ de C, Pereira C do N, Dias MT, Marcon JL. Parâmetros sanguíneos da arraia de água doce Potamotrygon orbignyi Castelnau, 1855 (Potamotrygonidae) da Bacia do Rio Negro, Amazonas, Brasil. [online] EMBRAPA; 2010. URL available in: https://www.embrapa.br/amapa/buscade-publicacoes/-/publicacao/878613/ parametros-sanguineos-da-arraia-de-aguadoce-potamotrygon-orbignyi-castelnau1855-potamotrygonidae-da-bacia-do-rionegro-amazonas-brasil

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Revista MVZ Córdoba Instrucciones para los autores La Revista MVZ Córdoba es una publicación científica de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Córdoba, Montería, Colombia. Se publican artículos de procedencia nacional e internacional que estén relacionados con las ciencias agropecuarias en la modalidad de artículos originales de investigación, revisiones de literatura, comunicaciones breves y casos clínicos. Los temas que publica la Revista MVZ Córdoba tienen correspondencia con la medicina veterinaria, zootecnia, acuicultura, biología, biotecnología, ciencias básicas biomédicas, salud pública y otros tópicos de interés de las ciencias agropecuarias. La revista está dirigida a los profesionales de la medicina veterinaria, zootecnia, salud pública, epidemiología, acuicultura, biología, ciencias básicas biomédicas y biotecnología. “La revista MVZ Córdoba apoya las políticas para registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y del International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), puesto que se reconoce la importancia de esas iniciativas para el registro y divulgación internacional de información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, desde el 2007, en la revista MVZ Córdoba solamente se publican los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de los Registros de Ensayos Clínicos validados por los criterios establecidos por OMS e ICMJE, cuyas direcciones están disponibles en el sitio web del ICMJE. El número de identificación se registra al final del resumen”.

Requisitos y normas generales para publicación de artículos Los interesados deberán enviar al editor, debidamente diligenciados y firmados por cada uno de los autores, los formularios: Presentación de artículos y autorevisión, los cuales se encuentran disponibles en el link: http://www.unicordoba.edu.co/ revistas/revistamvz/index.htm

Preparación de artículos El artículo debe ser redactado en tercera persona, escrito en procesador de palabras, a espacio sencillo, con letra verdana a 12 puntos, en una sola columna, con márgenes de 3 cm. El artículo, incluyendo tablas, figuras, referencias, leyenda de tablas y de figuras, no debe exceder las 6000 palabras para artículos originales y revisiones de literatura; 3000 para comunicaciones breves y casos clínicos. Se aceptan artículos en español e inglés y a partir del año 2015, deberán ser enviados en los dos idiomas, anexando la certificación de traducción que corresponda. En el artículo se usará la palabra “Figura” para referirse a todas las ilustraciones (gráficas de datos, fotografías o dibujos originales). Las figuras deben ser de buena calidad, con trazos limpios, bien definidos y texto legible; y sus márgenes deben ser de máximo 1 cm. Las fotografías deben ser nítidas, bien enfocadas y con iluminación balanceada. Todas las tablas y figuras deben ser tituladas, las tablas en la parte superior y las figuras en la parte inferior, numeradas y citadas en el artículo, sin recuadros. Las tablas no se admiten en formato de imagen y todas deben anexarse al final del texto en páginas separadas. El número máximo entre tablas y figuras será de 8. Cada figura debe enviarse por separado con las siguientes especificaciones: formato TIFF, resolución: 300 pixeles por pulgada y 16 cm de ancho. En caso de incluir fotografías, se deben enviar los archivos originales e indicar la fuente, con los siguientes requerimientos: formato jpg, resolución de 180 pixeles por pulgada y 26 cm de ancho. Si se utiliza Microsoft Excel para gráficos de datos, se debe remitir el archivo en formato xls o xlsx.

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Recepción y evaluación de los artículos Una vez recibido un artículo para posible publicación, se le comunicará formalmente al autor corresponsal su recepción y se verificará el cumplimiento de normas y requisitos. Concluida la etapa anterior, el artículo será enviado confidencialmente a dos árbitros externos a la institución mediante la modalidad de doble ciego para que lo evalúen. Se recurrirá a un tercer árbitro en caso de discrepancia. En todos los casos se tomarán las medidas necesarias para que el artículo no presente elementos que permitan que los árbitros identifiquen a los autores. El editor será el único responsable de comunicar a los autores el resultado de la evaluación. El Comité Editorial y el editor se reservan el derecho de rechazar los artículos que no cumplan con los requisitos y las normas, así como el derecho de introducir (con la aprobación de los autores) los cambios editoriales inherentes a normas gramaticales, compaginación, maquetación y reparto del espacio editorial. Si el artículo es aprobado, se le enviará una prueba de galera al autor corresponsal, quien será el único responsable de socializar, corregir y aprobar la versión final del artículo junto con los coautores. La revista MVZ Córdoba se acoge a los requisitos generales de uniformidad para revistas biomédicas (normas de Vancouver) con algunas modificaciones que se mencionan a continuación. 1. Estructura de los artículos originales: Los títulos se deben escribir en mayúscula sostenida, alineados a la izquierda y resaltados con negrita. Deben contener la siguiente información: 1.1. Título del artículo: Deberá ser escrito en español e inglés, en minúscula y resaltado con negrita, este último debajo del primero dejando doble espacio y en tamaño de 10 puntos. El título debe ser preciso e informativo, sin abreviaturas y de máximo 15 palabras. Los nombres en latín se escribirán en cursiva. Debe incluir debajo del título en inglés, un título abreviado del mismo en inglés, máximo de 8 palabras.

1.2. Autores: Son aquellos que participan en la planeación, ejecución, elaboración, discusión y escritura del artículo. El nombre de los autores se deberá escribir de la siguiente manera: El primer nombre, primer apellido y la inicial en mayúscula del segundo apellido seguida de coma, salvo excepciones de firmas registradas, de credo u otras. También se podrán incluir los dos apellidos unidos por un guión (Arrieta-Contreras) seguidos de coma y por un superíndice que indica la filiación de cada autor y el último título o grado académico obtenido por el autor (se requiere como mínimo el título de profesional o tecnólogo. No se aceptan candidaturas). Se utilizarán las siguientes abreviaturas según el caso: Especialización (Esp.), maestría (M.Sc.), doctorado (Ph.D.) o la abreviatura del título profesional. Se deberá indicar con un asterisco el autor corresponsal y escribir su correo electrónico, el cual aparecerá en el artículo y por tanto será público. La filiación institucional de los autores deberá ser jerarquizada: Institución, Facultad, Departamento, Instituto, Laboratorio, Grupo de estudio, etc., dirección postal, ciudad y país. Ejemplo: Determinación de bacterias ácido lácticas termoresistentes Determination of bacteria acid lactic thermoresistant Lactic acid bacteria Mario Pérez B,1* Ph.D, Vanessa ArrietaContreras,2 M.Sc, Diva Almentero S,1 Lic. 1 Universidad

de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico, A.A. Nro. 354, Montería, Colombia. 2Lactoanálisis. Calle 27 Nro. 18-62 Montería, Colombia. *Correspondencia: elcorreopig@servidor.com 1.3. Resumen: Debe ser estructurado y tener máximo 250 palabras y mínimo 150, escritas en un solo párrafo. Deberá ofrecer una idea clara del contenido del artículo incluyendo los subtítulos: objetivo, materiales y métodos, resultados y conclusiones, resaltados con negrita. Después de cada subtítulo se debe escribir un punto y seguido a partir del cual se inicia la redacción del texto de cada sección.

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1.4. Palabras clave: Son términos cortos que definen el contenido del artículo, su clasificación y permiten localizarlo en un archivo automatizado. Se sugiere emplear seis palabras, como máximo, que no estén contenidas en el título del artículo, escritas en orden alfabético. Se deben usar los términos de la lista MeSH u otro tesauro acorde con el tema de investigación, tales como DeCS, BIREME, NLM, CAB thesaurus, AGROVOC thesaurus, tesauro de ASFA, tesauro de biología animal IEDCYT, tesauro ambiental para Colombia, National agricultural library, etc., e indicar al final de ellas, el o los tesauros utilizados escritos entre paréntesis y en cursiva así: Palabras clave: Extramedular, nódulos linfáticos, plasmocitoma (Fuentes: DeSC, CAB). 1.5. Abstract: Es el mismo resumen en español traducido al inglés; debe tener la misma estructura y contenido. 1.6. Key words: Deben ser las mismas palabras clave de español traducidas al inglés. 1.7. Introducción: Debe indicar claramente el propósito de la investigación, relacionando igualmente en forma selectiva la literatura pertinente. No se pueden incluir datos ni conclusiones del trabajo que se está dando a conocer. Esta sección deberá finalizar con el objetivo general. 1.8. Materiales y métodos: Se deben describir claramente los procedimientos empleados en la investigación, lo cual incluye diseño estadístico y análisis de datos. Esta sección deberá ser estructurada (con subtítulos) para especificar tipo de estudio, sitio, condiciones geo-climáticas, coordenadas del sitio de estudio, pacientes o animales de estudio, métodos de laboratorio, aspectos éticos, análisis de resultados, etc. Los subtítulos deberán ser resaltados con negrita y después de cada uno de ellos se debe colocar un punto y seguido a partir del cual se inicia la redacción del texto. 1.8.1. Aspectos éticos: Se hará una breve descripción de los procedimientos de manejo de pacientes (humanos o animales)

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y de los riesgos y las garantías de seguridad ofrecidas durante el estudio, de acuerdo con el tipo de investigación realizada. Se deberá declarar que la investigación solo se inició cuando se obtuvo la autorización de los entes implicados. Es necesario adjuntar el formulario de consentimiento informado de participantes (humanos), así como la certificación de la aprobación del proyecto emitida por el Comité de Ética. Los documentos de soporte deben ser escritos en papel membretado de la institución correspondiente y luego escaneados para su remisión. A modo de ejemplo se cita el siguiente texto: “Las muestras fueron recolectadas por estudiantes de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, de la Universidad de Córdoba, quienes tuvieron en cuenta para los procedimientos de recolección de muestras, manejo y conservación, las normas éticas, técnicas, científicas y administrativas para la investigación en animales contenidas en la Ley 84 (Congreso Nacional de Colombia, 1989). Durante el estudio, se mantuvo la confidencialidad de la información de predios muestreados y animales positivos. La investigación fue aprobada por el Comité de Ética del Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico de la Universidad de Córdoba, mediante la Resolución 012009 de febrero 1 de 2014”. Además, en esta sección se deben citar las reglamentaciones existentes y vigentes de cada país, incluyendo producción limpia, conservación del medio ambiente, así como aquellas de regulación internacional de obligatorio cumplimiento global. 1.9. Resultados: Corresponde a la información de los hallazgos, pero sin incluir comentarios ni referencias a otros trabajos. Se sugiere utilizar tablas y figuras. Los resultados se deben expresar en tiempo pasado, anotando el nivel de significancia estadística entre paréntesis (p≤ 0.05, p≤0.01, p>0.05). Las tablas y figuras deberán citarse en esta sección en estricto orden. La citación en el texto se podrá hacer de dos maneras: a)... como se puede apreciar en la tabla 2; o b)…éxito de captura de 0.1313 individuos/horas-red (Tabla 1).

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Las unidades de medida se citarán de acuerdo con el sistema métrico decimal y se deberá dejar un espacio entre el número y la unidad, excepto para los signos de porcentaje (%), grados centígrados (ºC) y pesos ($) que siempre irán unidos a la cifra. Las unidades de medida no deben ser usadas en plural ni llevar punto final (Ejemplo: kg en lugar de kgs, kg.). Cuando una unidad de medida rige para varios números, sólo acompañará al último valor (Ejemplo: 8 - 15 kg en lugar de 8 kg – 15 kg). Los decimales no se deben expresar con coma, sino con punto. Todos los compuestos y reactivos, así como los equipos utilizados, deberán incluir entre paréntesis la casa matriz productora, ciudad sede y estado o país (Ejemplo: Sigma, St. Louis, MO). No se deberán incluir nombres comerciales en el texto y siempre se hará referencia al principio activo. 1.10. Discusión: Es la interpretación de los resultados obtenidos y la contrastación de los mismos con estudios relacionados que hayan realizado otros autores. Se debe destacar las limitaciones del estudio y evitar especulaciones. Es necesario incluir las conclusiones del estudio y las recomendaciones para futuras investigaciones. 1.11. Agradecimientos: Relacione el nombre de las personas, instituciones, empresas, laboratorios, fincas, etc., que hayan colaborado con la investigación (financiación, logística, etc.). Esta sección no es obligatoria, pero es recomendable. Tiene un máximo de 50 palabras. 1.12. Referencias: Deben numerarse consecutivamente según el orden en que se mencionen por primera vez en el texto, por medio de números arábigos entre paréntesis (1). En esta sección deben aparecer solamente aquellos artículos directamente relacionados con la investigación, para evitar revisiones bibliográficas extensas. Si un artículo tiene de uno a seis autores, en la referencia se deben incluir todos; pero si son más, después del sexto se escribe la expresión et al, la cual debe ir sin cursiva y sin puntuación (et al). Los títulos de las revistas serán abreviados (nombre corto, sin puntuación) según el estilo empleado en el IndexMedicus. (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=journals).

La lista de referencias se presentará en una hoja aparte, en estricto orden de aparición en el texto, no en orden alfabético. Para los artículos originales se aceptarán hasta 30 referencias; para las revisiones de literatura, hasta 50 y para la presentación de casos clínicos y comunicaciones breves, hasta 15. Los resúmenes de congresos, seminarios, eventos, cursos, presentaciones, informes técnicos, boletines, comunicaciones personales, consultas electrónicas no indexadas, monografías, sitios web, así como los trabajos de grado de pregrado, no se aceptan como referencias. Las referencias deben ser actualizadas y no mayores a 10 años de antigüedad. En caso de ser necesario, se podrán incluir con la debida justificación, pero no podrán sobrepasar el 20% del total de las referencias. Solamente se pueden incluir hasta dos referencias que sean de libros. 2. Comunicaciones breves: Deben tener el mismo contenido estructural de los artículos originales. La extensión será mínimo de 1.800 palabras y máximo de 3.000. 3. Casos clínicos: El contenido estructural es similar al de las comunicaciones breves, pero el resumen no es estructurado. Además, después de la introducción se incluirá la evaluación del paciente (subtítulos: anamnesis, hallazgos al examen clínico, ayudas diagnósticas, etc., resaltados con negrita), enfoque de tratamiento. 4. Revisiones de literatura: Consisten en un análisis crítico de la literatura publicada en torno a un tema de actualidad, interés y pertinencia para las ciencias pecuarias. Deben ajustarse a las normas anteriores, sin incluir las secciones de materiales y métodos, resultados y discusión; en su lugar, se utilizarán los títulos y subtítulos (resaltados con negrita) necesarios y relacionados con el tema que se aborda. Los autores deberán argumentar, sustentar o controvertir la información contenida en la revisión. Además, deberán hacer un aporte crítico sobre las fortalezas, debilidades y oportunidades de investigación del tema propuesto. Generalmente, el editor es quien hace la invitación a los autores expertos y reconocidos para que hagan estas contribuciones.

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Derechos de impresión y copia: Los autores se comprometen a ceder a la Revista MVZ Córdoba los derechos de reimpresión del material publicado. La traducción o publicación parcial o total de la Revista requerirá del permiso escrito del editor. La Revista MVZ Córdoba y la Universidad de Córdoba no se responsabilizan por las opiniones y los resultados expresados por los autores. Los contenidos publicados en la Revista MVZ Córdoba están bajo la licencia “Atribución – Sin Derivar – No comercial” de Creative Commons, 3.0 cuyo texto completo se puede consultar en: http://co.creativecommons. org/tipos-de-licencias/. Correspondencia: Nombre completo del autor corresponsal, dirección laboral y residencial, correo electrónico, teléfono celular y teléfono fijo. Esta información se debe diligenciar en el Formulario de declaración para los autores. La Revista MVZ Córdoba se compromete con el manejo confidencial de la información suministrada por los autores. Consultas: Deben ser realizadas exclusivamente por el autor corresponsal, quien será el único responsable de la comunicación administrativa con la revista, escribiendo siempre en el asunto del correo remisorio el nombre del artículo que se desea consultar, a los correos: editormvzcordoba@gmail.com, revistamvz@ unicordoba.edu.co y revistamvz@gmail.com. Certificaciones: Serán expedidas a los árbitros una vez entreguen el dictamen del artículo. A los autores solo se entregarán cuando el artículo haya sido evaluado, aprobado y corregido para publicación. La Revista MVZ Córdoba no se compromete con la publicación diligente de artículos relacionados con la obtención de grados académicos (M.Sc., Ph.D.), fuentes de financiación, informes finales de proyectos de investigación, etc., y por lo tanto dichos artículos estarán sometidos a la misma reglamentación vigente.

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Identidad de autores: Será manejada bajo estricta reserva por el equipo editorial de la revista. Los artículos retirados por los autores y los rechazados para su publicación por el Comité Editorial serán archivados en la base de datos histórica de la revista y sus contenidos no serán utilizados bajo ninguna circunstancia. Plagio y autoplagio: Los autores deberán respetar y reconocer todas las fuentes de información en la obtención de datos, figuras, fotografías, etc., dando el crédito respectivo a los autores consultados. El incumplimiento de esta norma será causal de retiro inmediato del artículo cuando se descubra durante el proceso de sometimiento. En caso de detectarse con posterioridad a la publicación, bien sea por miembros de la revista o por el reclamo o denuncia de otros autores, la Revista MVZ Córdoba, previa verificación, publicará la correspondiente nota de retractación. La Revista MVZ Córdoba corregirá oportunamente los errores tipográficos o de otra índole que pudieran haberse presentado con la publicación de cualquier artículo. Se aceptarán solicitudes de retractación debidamente argumentadas. Cambios en la autoría: Pueden ser por incorporación, supresión o modificación en el orden inicialmente remitido. En cualquier caso, el autor corresponsal deberá enviar una carta al editor, en la que justifique tales cambios y en la que aparezcan las firmas de los implicados. En ningún caso los cambios serán permitidos después de la aprobación del artículo. Comité Editorial de la Revista MVZ Córdoba Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Teléfonos: (57) (4) 756 90 27 Montería - Colombia Editor: Marco González Tous. MVZ., M.Sc. editormvzcordoba@gmail.com. http://revistas.unicordoba.edu.co/revistamvz/.

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Journal MVZ Córdoba Instructions to Authors The Journal MVZ Cordoba is a scientific publication of the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechny of the University of Córdoba, Montería, Colombia. It publishes national and international articles related to the agricultural sciences in the form of original investigation, literature reviews, short communications and clinical cases. The subjects that are published in Journal MVZ Córdoba correspond to veterinary medicine and zootechny, agriculture, biology, biotechnology, biomedical basic sciences, public health and other subjects of interest in agricultural sciences. The magazine is directed to professionals in veterinary and zootechny medicine, public health, epidemiology, aquaculture, biology, biomedical basic sciences and biotechnology. “The Journal MVZ Cordoba follows the policies of the World Health Organization (WHO) and of International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), for clinical trials registration, recognizing the importance of those initiatives for international dissemination of information on clinical research, in open access. Therefore, since 2007 the Journal MVZ Córdoba only publishes articles from clinical investigations that have received an identification number in one of the Clinical Trial Registries validated by criteria established by WHO and ICMJE, whose addresses are available on the ICMJE website. The identification number is listed at the end of the abstract”.

Requirements and general guidelines for article publication Interested parties should send the following forms to the editor, duly filled out and signed by each one of the authors: Presentation of articles and self-review, which can be found in the link: http:// www.unicordoba.edu.co/revistas/ revistamvz/index.htm

Article preparation The article should be written in third person, using a word processor, single spaced, in 12 point Verdana Font, in one column with 3 cm margins. The article, including tables, figures, references, table and figure legends should not exceed 6.000 words for original articles and literature reviews; 3.000 for short communications and clinical cases. Articles in Spanish and in English are accepted and from 2015 they should be sent in the two languages, annexing the corresponding translation certificate. In the article will use the word “Figure” to refer to all the illustrations (graphs, photographs and original drawings). The figures should be of good quality, with well defined, clean lines and legible text; margins should be maximum 1 cm. Photographs should be neat, in focus and with balanced lighting. All tables and figures should have titles, tables in the upper part and figures in the lower part, numbered and cited in the article, without boxes. Tables in image format are not accepted and they all should be annexed at the end of the text in separate pages. The maximum amount of tables and figures will be 8. Each figure should be sent separately with the following specifications: TIFF format, resolution: 300 pixels per inch and 16 cm wide. When including photographs, original files should be sent, indicating the source, with the following requirements: jpg format, 180 pixels per inch and 26 cm wide. If Microsoft Excel is used for graphs, the file should be sent in xls or xlsx format

Receiving and evaluating articles When an article for possible publication is received, the corresponding author will be formally notified of the receipt of the article and

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compliance with guidelines and requirements will be verified. After that step, the article will be confidentially sent to two referees, external to the institution, using the double blind method for evaluation. In case of discrepancy, a third referee will be used. In each case the necessary measures will be taken so that the article does not contain elements that allow the referees to identify the authors. The editor will be the only one responsible for communicating the result of the evaluation to the authors. The Editorial Committee and the Editor reserve the right to reject articles that do not comply with the requirements and guidelines, as well as the right to introduce (with the approval of the authors) editorial changes pertaining to grammatical rules, makeup, layout and distribution of editorial space. If the article is approved, a galley proof will be sent to the corresponding author, who will be the only one responsible for socializing, correcting and approving the final version of the article with the coauthors. The Journal MVZ Cordoba conforms to the general uniformity guidelines for biomedical magazines (Vancouver style) with some modifications as mentioned below. 1. Structure of original articles: Titles should be capitalized, text left aligned and in boldface type. They should contain the following information: 1.1. Title of the article: This should be written in Spanish and English, in lower case and in bold, underneath the first line with double spacing and 10 point font. The title should be precise and informative, without abbreviations and a maximum of 15 words. Names in Latin should be written in cursive. Under the title in English an abbreviated title in English should be included with a maximum of 8 words. 1.2. Authors: Are those that participate in the planning, execution, preparation, discussion and writing of the article. The name of the authors should be written in the following way: The first name, first surname and the initial of the second surname in capitals followed by a comma, except in the case of registered signatures, creed or other types. Two surnames could be included if they are joined by a hyphen

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(Arrieta-Contreras), followed by a comma and by a superscript that indicates the relationship of each author and the last title or academic degree obtained by the author (the professional or technologist title is required as a minimum. Candidates are not accepted). The following abbreviations will be used according to the case: Specialization (Esp.), Masters (M.Sc.), doctorate (Ph.D.) or the abbreviation of the professional title. The name of the corresponding author should be marked with an asterisk and the email should be included, which will appear in the article and will therefore be public. The institutional affiliation of the authors should be organized hierarchically: Institution, Faculty, Department, Institute, Laboratory, Study Group, etc., address, city and country. Example: Determination of Thermo-resistant Lactic Acid Bacteria Determinación de bacterias ácido lácticas termoresistentes Lactic Acid Bacteria Mario Pérez B,1* Ph.D, Vanessa ArrietaContreras,2 M.Sc, Diva Almentero S,1 Lic. 1 Universidad

de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico, A.A. Nro. 354, Montería, Colombia. 2 Lactoanalysis. Calle 27 Nro. 18-62 Montería, Colombia. *Correspondence: elcorreopig@servidor.com 1.3. Abstract: It should be structured and have a maximum of 250 words and a minimum of 150, written in one paragraph. It should offer a clear idea of the content of the article including subtitles: objective, materials and methods, results and conclusions, in boldface type. Each subtitle should be followed with a period and space, after which the text of each section should begin. 1.4. Key words: These are short terms that define the content of the article, classify it

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and allow it to be found in an automated file. A suggestion is to use a maximum of six words that are not in the title of the article, written in alphabetical order. The terms in the MeSH list or another thesaurus should be used according to the subject of the investigation, such as DeCS, BIREME, NLM, CAB thesaurus, AGROVOC thesaurus, ASFA thesaurus, IEDCYT animal biology thesaurus, environmental thesaurus for Colombia, National Agricultural library, etc., and indicate at the end the thesaurus used, written in parenthesis and in italic type: Key words: Extramedullary, lymph nodes, plasmacytoma (Source: DeSC, CAB). 1.5. Resumen: This is the same summary in English translated to Spanish; it should have the same structure and content. 1.6. Palabras clave: These should be the same key words in English translated into Spanish. 1.7. Introduction: It should clearly indicate the purpose of the investigation, as well as selectively connecting pertinent literature. Data and conclusions on the work that is being discussed should not be included. This section should end with a general objective. 1.8. Materials and methods: Procedures used in the investigation should be clearly described, including statistical design and data analysis. This section should be structured (with subtitles) to specify the type of study, location, geo-climatic conditions, study location coordinates, patients or animals in the study, laboratory methods, ethical aspects, results analysis, etc. Subtitles should be in boldface type, followed by a period and space, and then the text. 1.8.1. Ethical aspects: A brief description of the procedures for handling patients (humans or animals) and the safety risks and guarantees offered during the study according to the type of investigation carried out. It should be stated that the investigation began only after obtaining the authorization of the entities involved. The informed consent form of the participants (humans) and the approval certification

issued by the Ethical Committee should be annexed. Support documents should be on the letterhead of the corresponding institution and then scanned and sent in. As an example, the following text is cited: “Samples were collected by students of the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechny of the Universidad de Córdoba, who took into account the procedures for sample collection, handling and preservation, techniques, and the scientific, administrative and ethical standards for animal investigation contained in Law 84 (Colombian National Congress, 1989). During the study, the confidentiality of information about sampled farms and positive animals was maintained. The investigation was approved by the Ethical Committee of the Institute of Tropical Biological Investigations of the Universidad de Córdoba by means of Resolution 012009 on February 1, 2014”. Additionally, in this section existing and in force regulations of each country should be cited, including clean production and preservation of the environment, as well as those pertaining to international regulations of compulsory global compliance. 1.9. Results: This is the information on the findings, without including comments or references from other studies. The use of tables and figures is suggested. The results should be expressed in the past, noting the level of statistical significance in parenthesis (p≤ 0.05, p≤0.01, p>0.05). Tables and figures should be cited in this section in strict order. Text citation could be done in two ways: a) …as can be seen in Table 2; or b) …capture success of 0.1313 individuals/ hours-network (Table 1). Units of measurement will be cited according to the decimal metric system and a space between the number and the unit should be left except for percent signs (%), centigrade degrees (ºC) and pesos ($) which should always be next to the amount. Units of measurement should not be used in plural or have a final period (example: kg instead of kgs, kg.). When a unit of measurement is used for several numbers, only the last value will have the sign (example: 8 – 15 kg

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instead of 8 kg â&#x20AC;&#x201C; 15 kg). Decimals should not be written with commas, but with periods. All the composites, reagents and equipment used should include in parenthesis the main production company, headquarter city, state and country (example: Sigma, St. Louis, MO). No commercial names should be included in the text and the active ingredient will always be referenced. 1.10. Discussion: This is the interpretation of the results obtained and comparison with related studies done by other authors. The limitations of the study should be highlighted and speculations avoided. Conclusions of the study and recommendations for future investigations should be included. 1.11. Acknowledgments: Relate the names of the people, institutions, businesses, laboratories, farms, etc., that have collaborated with the investigation (financing, logistics, etc.). This section is not obligatory though it is recommended. Maximum 50 words. 1.12. References: These should be numbered consecutively according to the order they are first mentioned, using Arabic numerals in parenthesis (1). Only those articles directly related to the investigation should appear in this section in order to avoid extensive bibliography reviews. If an article has from one to six authors, all of them should be included in the reference; but if there are more, after the sixth one the expression et al should be written, in italics and without punctuation (et al). Journal titles will be abbreviated (short name, no punctuation) according to the style used in the IndexMedicus. (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/sites/entrez?db=journals). The list of references will be submitted on a separate page, in strict order as they appear in the text, not in alphabetic order. For original articles up to 30 references will be accepted; for literature reviews, up to 50

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and for the presentation of clinical cases and short communications, up to 15. Summaries of conferences, seminaries, events, courses, presentations, technical reports, newsletters, personal statements, non-indexed electronic consultations, monographs, websites and undergraduate graduate work are not accepted as references. References should be up to date and not be older than 10 years. If necessary, they could be included with proper justification but cannot go beyond 20% of the total amount of references. Only two books can be included as references. 2. Short communications: These should have the same structural content as the original articles. Minimum 1.800 words and maximum 3.000. 3. Clinical cases: Structural content is similar to that of short communications, but the summary is not structured. Additionally, after the introduction an evaluation of the patient will be included (subtitles: anamnesis, clinical exam findings, diagnostic aids, etc., in boldface type), treatment approach. 4. Literature reviews: These consist of a critical analysis of literature published on a timely subject of interest and pertinent to animal sciences. The above guidelines should be adhered to, without including materials and methods, results and discussion sections; in its place, use the necessary titles and subtitles (in boldface type) related to the subject considered. Authors should discuss, sustain or dispute the information in the review. Additionally, they should make a critical contribution on the strengths, weaknesses and investigation opportunities of the proposed subject. Generally, the editor is the one that invites expert and known authors to make these contributions.

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Printing and copy rights: Authors are bound to cede reprinting rights of the published material to Journal MVZ Córdoba. Translation or partial or total publication of the magazine requires written permission from the Editor. The Journal MVZ Córdoba and the Universidad de Córdoba are not responsible for the opinions and results expressed by the authors. Content published in the Journal MVZ Córdoba are under the license “Attribution – No Derivs – Noncommercial” from Creative Commons, 3.0 whose complete text can be consulted in: http://co.creativecommons.org/tipos-delicencias/. Correspondence: Complete name of the corresponding author, work and home address, email, cell phone and landline. This information should be filled out on the Author declaration form. The Journal MVZ Córdoba will keep all information provided by the authors confidential. Consultation: This should be done exclusively by the corresponding author, who will be the only one responsible for administrative communication with the Journal. The name of the article to be consulted should be included in the subject line of the email and sent to the following emails: editormvzcordoba@gmail. com, revistamvz@unicordoba.edu.co and revistamvz@gmail.com. Certificates: These will be issued to the referees once the opinion on the article is delivered. These will only be issued to the authors when the article has been evaluated, approved and corrected for publication. The Journal MVZ Córdoba does not make any commitments to the speedy publication of articles related to obtaining academic degrees (M.Sc., Ph.D.), funding sources, final reports on investigation projects, etc., and therefore those articles will be subject to the same current regulations.

Identity of the authors: Will be held strictly confidential by the editorial team of the journal. Articles withdrawn by the authors and those rejected by the Editorial Committee for publication will be filed in the historic data base of the journal and its contents will not be used under any circumstances. Plagiarism and self-plagiarism: Authors should respect and acknowledge all sources of information in obtaining data, figures, photographs, etc., giving respective credit to the consulted authors. Incompliance with this rule will cause the immediate withdrawal of the article when discovered during the submission process. In case of being detected after publication, whether by members of the journal or because of a complaint or report from other authors, the Journal MVZ Córdoba, after verification, will publish the corresponding retraction notice. Journal MVZ Córdoba will correct typographical or any other type of errors in any published article. Duly argued retraction requests will be accepted. Changes in authorship: Can be due to incorporation, suppression or modification in the order initially sent. In any case the corresponding author should send a letter to the editor justifying such changes and include the signature of the involved parties. Under no condition will changes be allowed after the article is approved. Editorial Committee of the Journal MVZ Cordoba Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Telephone: (57) (4) 756 90 27 Montería - Colombia Editor: Marco González Tous. MVZ., M.Sc. editormvzcordoba@gmail.com.

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Árbitros de la Rev.MVZ Córdoba 21(1) 2016 Referees of the Journal MVZ Córdoba 21(1) 2016 Alfonso T. C. Karoll, Ph.D. Alzate T. Luz, M.Sc. Arroyo S. Barbara, Ph.D. Atencio G. Víctor, M.Sc. Avellaneda C. Juan, Ph.D. Ávila S. Narciso, Ph.D. Cataldi Angel, Ph.D. Eslava E. Pedro, M.Sc. Figueiredo Marcelo, Ph.D. García M. Luis, Ph.D. García N. Lury, M.Sc. González C. Rafael, Ph.D. González H. Luís, Ph.D. Gutiérrez P. Oscar, Ph.D. Herrera R. Ana, M.Sc. Isaza L. Octavio, M.Sc. Laurino D. Nelson, Ph.D. Luna P. Carlos, Ph.D. Martínez A. Yordan, Ph.D. Milián S. Feliciano, Ph.D. Montañez V. Oziel, Ph.D. Palma G. José, Ph.D. Pérez S. Rosa, Ph.D. Prieto G. Martha, Ph.D. Reyes G. José, Ph.D. Rigón R. Carlos, Ph.D. Rocha S. José, Ph.D. Rodríguez F. Adriana, Ph.D. Sánchez B. María, M.Sc. Santos A. Marisol, M.Sc. Şevik Murat, Ph.D. Silveira A. Geraldo, Ph.D. Taphorn B. Donald, Ph.D. Tavares D. Marcos, Ph.D. Torres R. José, M.Sc. Tufarelli Vincenzo, Ph.D.

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Brasil. Corporación Universitaria Lasallista, Colombia. Universidad de Cartagena, Colombia. Universidad de Córdoba, Colombia. Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Ecuador. Universidad del Mar, México. INTA, Argentina. Universidad del Magdalena, Colombia. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Brasil. Universidad de Colima, México. Universidad del Pacifico, Colombia. Universidad de Cartagena, Colombia. Universidad del Amazonía, Colombia. Universidad Nacional Autónoma de México. Universidad de Antioquia, Colombia. Universidad de Caldas, Colombia. Federal University of Pelotas, Brasil. Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, México. Universidad de Granma, Cuba. INIFAP, México. Universidad de Guadalajara, México. Universidad de Colima, Colima, México. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, México. Universidad de Córdoba, Colombia. Centro Universitario del Sur, México. Universidade Federal de Santa Maria, Brasil. Universidade Federal do Piauí, Brasil. Universidad del Magdalena, Colombia. Universidad Cooperativa de Colombia, Colombia. INVEMAR, Colombia. Veterinary Control Institute, Konya, Turkey. Universidade Federal de Minas Gerais, Brasil. UNELLEZ, Venezuela. Embrapa Amapá, Brasil. Universidad Autónoma de Chapingo, México. University of Bari, Bari, Italy.