Transtonos de la conducta en ratones transgenicos que sobreexpresan la proteina cardiaca gsa

Méndez, Nahuel et al ./ Rev. Ciencia In Situ. 2016, 1(2); 6-11

GANADOR 5TO PUESTO TOP TEN COCAEM 2015

Artículo original | Original Article TRANSTORNOS DE LA CONDUCTA EN RATONES TRANSGÉNICOS QUE SOBREEXPRESAN LA PROTEÍNA CARDÍACA Gsα Behavioural changes in transgenic mice with cardiac gsα protein overexpression

BUCHHOLZ, BRUNO; GELPI, RICARDO; MÉNDEZ DIODATI, NAHUEL Instituto de Fisiopatología Cardiovascular, Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires - CONICET, Argentina RESUMEN Los pacientes con disautonomías por cardiopatías como el infarto de miocardio y la insuficiencia cardíaca crónica suelen manifestar cambios en la conducta e incluso depresión. Sin embargo, no hay evidencia que relacione la hiperactividad simpática cardíaca primaria sin deterioro de la función ventricular con cambios en la conducta. Objetivo: estudiar los cambios de conducta en ratones transgénicos (TG) con sobreexpresión cardiaca de la proteína GSsα, hiperactividad simpática y aumento de la función cardiaca. Ratones machos jóvenes wild type (WT) y TG fueron observados en su hábitat habitual (home cage) y expuestos individualmente a las pruebas de: “open field” y nado forzado (prueba de Porsolt).

Los ratones TG mostraron una reducción significativa en la locomoción, saltos, giros y actividad vertical en el open field, pero sin cambios de comportamiento en el home cage. En la prueba de Porsolt el tiempo de latencia y de nado fueron significativamente menores en los TG. El Western blot confirmó el aumento de GSsα en corazones TG, sin aumento en áreas del cerebro como la amígdala, bulbo olfatorio, hipocampo, mesencéfalo y cuerpo estriado. En conclusión, los ratones TG con sobreexpresión específica cardiaca de GSsα muestran respuestas conductuales maladaptativas frente al estrés y síntomas similares a depresión, estableciendo así un nuevo vínculo entre la hiperactividad simpática cardíaca y los trastornos de la conducta.

Palabras clave: corazón, sistema nervioso simpático, depresión ABSTRACT Patients with dysautonomias due to cardiac disease such as myocardial infarction and chronic heart failure often exhibit behaviour modifications and depression. However, there is no evidence showing the relationship between behaviour and sympathetic heart hyperactivity without deterioration of ventricular function. We studied behavioural changes in young transgenic (TG) mice with cardiac-specific over-expression of GSsα protein, which show chronically enhanced sympathetic drive and cardiac function. Wild type (WT) and TG male mice were individually observed in their natural habitat (“home cage”); exposed to the “open field”, a environment previously unknown to them, for 2 hours; and assessed with a forced swimming test for 6 minutes. TG mice displayed marked hypoactivity, which was characterised by a significant reduction in locomotion, jumps, turns and vertical activity in open field. However, no behavioural changes were observed in the home cage. Latency time and swimming time in the swimming test were significantly reduced in TG mice. Western blotting confirmed that GSsα protein was markedly increased in the heart of TG mice compared to WT without increase in brain areas potentially involved in behavioural changes (amygdala, olfactory bulb, hippocampus, midbrain and striatum). TG mice with cardiac-specific over-expression of GSsα exhibit blunted behavioural responses to stress and depressive-like symptoms, thus providing a novel link between increased sympathetic cardiac activity and behaviour.

Keywords: heart, sympathetic nervous system, depression Correspondencia: Méndez Diodati, Nahuel Dirección postal: Presidente José Evaristo Uriburu 950, 2º piso Ciudad Autónoma de Buenos Aires. CP: 1114 Correo Electrónico: nahuel.nmd@gmail.com

Fecha de recepción: 04/08/16 Fecha de aprobación: 28/09/16 Fecha de publicación: 24/11/16

Autor (es). Acceso abierto 2016. Este artículo se distribuye bajo los términos de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/ by/4.0/), que permite el uso sin restricciones, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre y cuando otorgue un crédito apropiado al autor original y al origen, proporcione un enlace a La licencia de Creative Commons, e indicar si se realizaron cambios. La exención de Dedicación de dominio público de Creative Commons (http:// creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos facilitados en este artículo, a menos que se indique lo contrario.

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INTRODUCCIÓN Los síntomas de ansiedad y depresión son complicaciones comunes en los pacientes con enfermedades cardiovasculares crónicas como la cardiopatía isquémica y la insuficiencia cardíaca, y son factores pronósticos adversos para los pacientes con infarto agudo de miocardio (1), ya que se han asociado con complicaciones secundarias (2-4). Además, el infarto de miocardio y la insuficiencia cardíaca crónica conllevan un aumento del tono simpático y niveles elevados de aminas simpaticomiméticas circulantes (5), incluyendo dopamina y noradrenalina (6), que podrían conducir a un deterioro progresivo de la función miocárdica.

Los ratones transgénicos (TG) que sobreexpresan específicamente en el corazón la subunidad alfa de la proteína G estimulante guanosina 5’-trifosfato (Gssα) responden a las catecolaminas con una función cardíaca incrementada en comparación con los wild type (WT) y, al envejecer, desarrollan insuficiencia cardíaca y miocardiopatía debido a la estimulación simpática excesiva (7). Sin embargo, durante su juventud estos ratones solo presentan el aumento de la actividad simpática sin compromiso miocárdico ni deterioro de la función ventricular izquierda. Sin embargo, el comportamiento de los ratones Gssα durante su manipulación en el bioterio es claramente diferente a los ratones no transgénicos.

Si bien se ha demostrado que las alteraciones en los circuitos cerebrales de aminas simpaticomiméticas están involucradas en la patogénesis de la depresión, no se ha comprobado que los trastornos autonómicos a nivel cardíaco podrían ser responsables per se de los cambios de comportamiento (8).

El objetivo de este trabajo fue determinar si la sobreexpresión cardíaca específica de la proteína Gssα induce cambios conductuales generales y particularmente de características depresivas. Para lograr este objetivo, se estudiaron los cambios de comportamiento locomotor después de la exposición a un evento estresante en ratones jóvenes TG que sobreexpresan la proteína Gssα cardíaca.

MATERIALES Y MÉTODOS Diseño experimental: Se generaron ratones TG con sobreexpresión cardiaca específica de Gssα mediante microinyección de un minigén de Gssα en óvulos de ratones C57BL/6J. Como se ha descrito en un trabajo previo (9), el transgén consistió en un promotor de cadena pesada de sα-miosina de rata ligado a un ADNc que codifica para la isoforma corta de Gssα, y, así, la Gssα cardiaca se sobreexpresa selectivamente en el corazón aproximadamente 3 veces más de lo normal.

Los animales WT de la camada fueron seleccionados como controles durante todo el estudio. Se utilizaron machos jóvenes de 3 a 4 meses de edad, tanto WT como TG. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con los “Guiding Principles in the Care and Use of Vertebrate Animals in Research and Training” de la Sociedad Americana de Ciencia In Situ |Noviembre 2016 | http://www.cienciainsitu.com.ar/

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Fisiología y el protocolo fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires. Todas las pruebas incluyendo la prueba de open field, la prueba de Porsolt, la observación en home cage, así como la eutanasia y disección de los ratones para mediciones de Western blot, se realizaron entre las 11 y las 16 horas.

Pruebas de comportamiento: a) Actividad en el open field: Se evaluó la actividad motora espontánea y el comportamiento depresivo de los animales (WT: n=15; TG: n=13), colocándolos individualmente en 2 cubos de acrílico (2 ratones observados en total en cada experimento) transparentes abiertos (30×30 cm) (Coulbourn Instruments, EE.UU.), midiendo la actividad de los ratones durante 2 horas, la cual fue registrada por una computadora. Un software específico fue utilizado para registrar la distancia ambulatoria total, los saltos y los giros en sentido horario. La actividad vertical, se evaluó manualmente por medio del análisis de una grabación de video del experimento. La caja se limpió y desodorizó después de cada animal utilizando una solución de 10% de detergente neutro en agua y, posteriormente, alcohol en solución al 70%. b) Prueba de natación forzada (prueba de Porsolt) El open field mostró evidencia indirecta de comportamiento similar a la depresión en los ratones TG. Para confirmar estas conductas, los ratones (WT: n=10 TG: n=8) fueron colocados individualmente en un vaso de precipitados de vidrio de 2 litros (20 cm de diámetro, 30 cm de altura) con agua común (22° C) hasta 25 cm desde la parte inferior (de modo que el ratón no pudiera tocar el fondo) y a 5 cm desde el borde superior (de modo que el ratón no pudiera escapar). Los animales se vieron obligados a nadar durante un período de 6 minutos. La duración total de natación (tiempo de nado) y el tiempo de nado desde el principio hasta la primera pausa (tiempo de latencia) fueron registrados por 2 experimentadores distintos. c) Comportamiento espontáneo en home cage Los ratones, WT (n=9) y TG (n=9), fueron alojados individualmente en sus jaulas durante una semana antes del comienzo de los análisis de comportamiento.

Los animales fueron filmados digitalmente en el bioterio durante dos horas. Se evaluaron las actividades relacionadas con la locomoción (tiempo de movimiento), y los comportamientos sociales (alimentación, acicalamiento y tiempo de sueño).

Estudio de Western blot: Se prepararon lisados de proteína total a partir del ventrículo izquierdo homogeneizado de los corazones y a partir de diferentes áreas del encéfalo (amígdala, cuerpo estriado, hipocampo, bulbo olfatorio y mesencéfalo) de l

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los animales WT (n=4) y TG (n=4). Se separaron fracciones de membrana a partir de lisados totales sometiéndolas a centrifugación a 100.000 g durante 45 min. A continuación, el sedimento de membrana se suspendió en un buffer de extracción. Las proteínas se separaron en 8% de SDSPAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se sondearon con el anticuerpo (Chemicon). El anticuerpo secundario fue un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano picante. Los blots fueron revelados con ECL y escaneados y se midieron densidades de banda Gssα que se expresaron como unidades arbitrarias.

Estadística: Se realizó un ANOVA de dos vías para medidas repetidas para analizar la actividad locomotora en el open field en toda la sesión, seguido de pruebas post hoc de Bonferroni.

Se llevó a cabo la prueba de “t” para evaluar los Western blot de la proteína Gssα. Se realizó un ANOVA de una vía seguido del test de Bonferroni para la prueba de Porsolt y los estudios en home cage.

Los valores fueron expresados como la media aritmética ± el error estándar de la media. Un valor de P<0,05 fue considerado significativo. El software utilizado para los cálculos fue GraphPad Prism 6 RESULTADOS Proteína Gssα en corazón y encéfalo La Figura 1 muestra el Western blot de ratones Gssα en el corazón y diferentes áreas del encéfalo. La proteína Gssαse sobreexpresa significativamente, como se esperaba, en el corazón de los ratones TG en comparación con ratones WT de la misma edad. Sin embargo, la proteína Gssα no se incrementó en áreas del encéfalo relacionadas con trastornos de comportamiento, tales como la amígdala, el bulbo olfatorio, el mesencéfalo, el hipocampo, e incluso disminuyó en el cuerpo estriado de los TG en comparación con los WT.

Figura 1: Expresión de GS-alfa en encéfalo y corazón.

Figura 2: Resultados de test de open-field.

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Actividad locomotora Los datos promedio de las dos horas de las variables estudiadas en el open field se muestran en la Figura 3, mientras que los datos separados de la primera y la segunda hora se muestran en la Tabla I. Para la distancia ambulatoria, saltos, giros en sentido horario y la actividad vertical, los datos fueron significativamente diferentes durante el período de seguimiento de dos horas (Figura 2), y en la primera y segunda hora (Tabla I).

Comportamientos de depresión Basándonos en los datos anteriores del open field, y para evaluar más específicamente el estado de depresión de los ratones TG que sobreexpresan Gssα,-

se los sometió a la prueba de Porsolt, una prueba bien establecida, validada y ampliamente utilizada para controlar comportamientos similares a la depresión en roedores y como screening para efectos de medicación antidepresiva en ratones. La Figura 3 muestra el tiempo de latencia y el tiempo de nado para los grupos de ratones durante la prueba de Porsolt. El tiempo de latencia fue de 101,96 ± 11,21 segundos en el grupo WT y de a 57,54 ± 4,10 segundos en el grupo TG (p <0,05). El tiempo de nado fue de 3,42 ± 0,33 minutos en el grupo WT y de 2,21 ± 0,31 minutos en el grupo TG (p <0,05). Como puede observarse, estos dos parámetros de tiempo se encuentran claramente disminuidos en los ratones TG Gssα, lo que sugiere que estos animales presentan un comportamiento depresivo

Tabla I. Comportamiento en el open field separadas por hora Distancia ambulatoria (cm)

Saltos (cantidad)

Giros (cantidad)

Actividad vertical (cantidad)

WT (n=15)

9785 ± 928

95 ± 13

26 ± 5

157 ± 17

TG (n=13)

7065 ± 542*

26 ± 4**

13 ± 1

93 ± 12

WT (n=15)

3439± 564

39 ± 10

7±2

68 ± 14

TG (n=13)

1533 ± 411*

6 ± 2**

2 ± 1*

21 ± 10

Primera hora

Segunda hora

*P<0.05 vs. WT; **P<0.01 vs. WT

Figura 3: Resultados de test de Porsolt Comportamiento espontáneo en el home cage Las observaciones regulares de cada jaula en el entorno habitual (bioterio) revelaron que ningún grupo de ratones mostró anormalidades significativas en las interacciones sociales o en los comportamientos no sociales, incluyendo el acicalamiento, la exploración de la jaula (tiempo en movimiento), el tiempo de sueño, o la conducta alimentaria (Tabla II). Estas observaciones sugieren que los ratones TG no mostraron respuestas de comportamiento anormal cuando están tranquilos y en reposo en su hábitat normal.

Tabla II. Comportamiento en el home cage

Tiempo de sueño (minutos)

Tiempo en movimiento (minutos)

Alimentación (cantidad)

Acicalamiento (cantidad)

WT (n=9)

68 ± 6

38 ± 6

3±1

6±1

TG (n=9)

58 ± 7

47 ± 7

3±1

5±1

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DISCUSIÓN Este estudio ha demostrado respuestas de comportamiento alteradas en ratones transgénicos que sobreexpresan específicamente la proteína Gsα en el corazón y que muestran hiperactividad simpática periférica. Esto se pone de manifiesto en la hipoactividad en el open field, que a su vez refleja un estado de depresión, cuando se lo analiza en conjunto con los datos obtenidos de la prueba de natación forzada (prueba de Porsolt). Es de particular importancia señalar que la motilidad y los estudios de comportamiento social que se realizaron en el hábitat cotidiano (home cage) no mostraron comportamientos alterados en los ratones transgénicos, lo que sugiere que el estrés es responsable de inducir las manifestaciones de trastornos de conducta.

En nuestro estudio la proteína Gsα se sobreexpresa sólo en el corazón, y no se vio incrementada en las partes del encéfalo medidas que podrían estar involucrados en la fisiopatología de la depresión, (amígdala, hipocampo, bulbo olfatorio, cuerpo estriado, y mesencéfalo). Esto sugiere que las alteraciones de comportamiento en estos ratones son secundarias a la hiperactividad simpática periférica. Este es el primer caso de hipoactividad y depresión activadas por estrés, en ratones transgénicos sin alteraciones en la función cardiaca e hiperactividad simpática periférica. Previamente se demostró que estos ratones transgénicos desarrollan insuficiencia cardíaca y miocardiopatía a los 8-12 meses de edad (7). Sin embargo, los ratones transgénicos estudiados en el presente trabajo eran de aproximadamente 3-4 meses de edad con función cardíaca normal.

Esta disociación en el tiempo entre la aparición de la alteración del comportamiento y la enfermedad cardíaca es relevante, ya que se podría pensar que la hiperactividad simpática presente en estos animales, cuando son jóvenes, puede ser la causa no sólo de la enfermedad cardíaca, sino también de la depresión.

La presencia de ansiedad, depresión o simplemente de alteraciones del comportamiento no específicas en pacientes con enfermedades cardiovasculares, sobre todo en la cardiopatía isquémica y la insuficiencia cardíaca, han sido reconocidos desde hace mucho tiempo (1). Sin embargo, la causa de estas alteraciones en el sistema nervioso central siempre ha sido considerada como una consecuencia de la condición cardiovascular, ya que fueron observadas en pacientes que tenían previamente enfermedad cardíaca.

A pesar de que las alteraciones celulares responsables de la depresión no se conocen aún en detalle, los niveles alterados de monoaminas en diferentes áreas del encéfalo y su rol en los trastornos de depresión han sido ampliamente evaluados. Esta hipótesis implica una disminución de dopamina, noradrenalina, y serotonina como mecanismos responsables de esta condición (10).

Chen y Williams demostraron un papel importante de la adrenalina y el nervio vago como influencias en los sistemas noradrenérgicos centrales, a los que se atribuye un papel en el procesamiento de la memoria para experiencias de activación emocional (11). Los resultados también ilustran cómo las interacciones entre estos dos sistemas periféricos, el neuroendócrino y el autonómico,

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tienen una función importante en la activación y el mantenimiento de niveles elevados de actividad central en respuesta a los eventos emocionalmente sobresalientes.

La capacidad del sistema nervioso autónomo periférico de modular las funciones cerebrales también se ha demostrado en pacientes (12). En particular, el tono vagal disminuido en los pacientes se asoció con una mayor predisposición a la depresión (13). También, Hopp y colaboradores observaron que un alto control vagal cardíaco protege contra los síntomas depresivos futuros bajo condiciones de alto estrés social (14). En general, los pacientes con trastornos depresivos mayores tienen mayor frecuencia cardíaca y una menor variabilidad de la frecuencia cardíaca en comparación con los controles sanos. Esto tiene importantes implicaciones clínicas teniendo en cuenta que bajos niveles de variabilidad en la frecuencia cardíaca se han asociado con un mayor riesgo de mortalidad por cualquier causa (15). Como los ratones en nuestros modelos tienen una mayor frecuencia cardíaca basal junto a variaciones circadianas y frecuencia cardíaca alteradas, sería racional pensar que el desequilibrio autonómico y la alteración en la regulación de algunas funciones cardiacas podrían estar relacionados con las conductas depresivas halladas.

Por lo tanto, los ratones transgénicos que sobreexpresan la proteína Gsα en el corazón, pero no en el encéfalo, muestran alteraciones motoras compatibles con signos de depresión, cuando estos ratones se extraen de su jaula habitual y son sometidos a condiciones de estrés.

Una característica única de este estudio es que el comportamiento alterado surge en un modelo transgénico cardíaco de hiperactividad simpática periférica, pero el aumento de la proteína expresada en el corazón no se sobreexpresó en el encéfalo.

Coflictos de intereses: Ninguno para declarar.

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