Medicina regenerativa en retina regenerative medicine in retina

Spelzini, Gonzalo N. / Rev. Ciencia In Situ. 2016, 1(2); 28-33

Artículo de Revisión|Review Article MEDICINA REGENERATIVA EN RETINA Regenerative Medicine in Retina

GONZALO NICOLÁS SPELZINI Laboratorio de Neurobiología del desarrollo, Instituto de Biología Celular y Neurociencia “Prof. Eduardo de Robertis” (IBCN CONICET-UBA), Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires RESUMEN La retina ha sido llamada la parte “accesible” del cerebro debido a su localización cercana a la superficie del cuerpo, siendo el blanco ideal para las terapias celulares. La medicina regenerativa es un campo interdisciplinario que tiene como objetivo la reposición o regeneración de células de tejido u órganos dañados estructural y funcionalmente. Un gran esfuerzo en los últimos años se ha visto reflejado en investigaciones destinadas a reemplazar el tejido dañado. Éstas incluyen las células madre embrionarias, células madre fetales, células mesenquimales de médula ósea, células madre de médula ósea, células madre de cordón umbilical, células madre pluripotentes inducidas, transdiferenciación a partir del epitelio pigmentario de la retina y transdiferenciación a partir de células de Müller. Las múltiples propuestas en estudio que ingresan a los ensayos clínicos aumentan las posibilidades de desarrollar una terapia exitosa.

Palabras clave: Medicina Regenerativa, Células Madre, Transdiferenciación Celular, Regeneración, Retina.

ABSTRACT The retina has been called the “approachable part of the brain,” owing to its location near the body surface, and for this reason it serves as an ideal target for cell therapies. Regenerative medicine is an interdisciplinary field that aims replacement or regeneration of cells from damaged tissue or organs structural and functionally. A major effort in recent years has been reflected in research to replace the damaged tissue. These include embryonic stem cells , foetal stem cells, bone marrow derived- mesenchymal stem cells , bone marrow derived-stem cells, umbilical tissue-derived stem cells , induced pluripotent stem cells, transdifferentiation from the retinal pigment epithelium and transdifferentiation from Müller cells. Multiple regeneration strategies entering clinical trials increase the chances of developing a successful therapy.

Keywords: Regenerative Medicine, Stem Cells, Cell Transdifferentiation, Regeneration, Retina.

Correspondencia: Gonzalo Nicolás Spelzini Correo electrónico: gonzalospelzini@hotmail.com Telf-celular: 1137019236

Aunque la retina es una estructura compleja, muchas enfermedades de la misma pueden ser atribuidas a la degeneración de una monocapa epitelial relativamente simple: el epitelio pigmentario de la retina (EPR). Otras patologías se caracterizan por injuria en las células ganglionares de la retina como el glaucoma. (Ver Figura 1.)

Un gran esfuerzo en los últimos años se ha visto reflejado en investigaciones destinadas a reemplazar el tejido dañado, inicialmente con células madre embrionarias (ESC) y recientemente a través de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y otras fuentes celulares.

Fecha de recepción: 10/08/16 Fecha de aprobación: 20 /10/16 Fecha de publicación: 03/12/16

La medicina regenerativa es un campo emergente e interdisciplinario que tiene como objetivo la reposición o regeneración de células de tejido u órganos dañados estructural y funcionalmente. Para lograrlo utiliza distintos abordajes tecnológicos, basados en el estudio de la biología del desarrollo embrionario, de las propiedades de las células madre y la reprogramación celular. Está vinculada con diversos campos de la ciencia, como la ingeniería genética, la ingeniería de tejidos y la terapia celular.1 Las células madre poseen la habilidad de diferenciarse en distintos tipos celulares, pero también son capaces de dividirse y

Autor (es). Acceso abierto 2016. Este artículo se distribuye bajo los términos de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/ by/4.0/), que permite el uso sin restricciones, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre y cuando otorgue un crédito apropiado al autor original y al origen, proporcione un enlace a La licencia de Creative Commons, e indicar si se realizaron cambios. La exención de Dedicación de dominio público de Creative Commons (http:// creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos facilitados en este artículo, a menos que se indique lo contrario.

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Figura 1. Micrografía de retina de conejo. Se aprecia su compleja estructura en capas y sus diferentes células: pigmentadas, neuronas y de sostén. 1. Capa de fotorreceptores. 2. Capa nuclear externa. 3. Capa plexiforme externa. 4. Capa nuclear interna. 5. Capa plexiforme interna. 6. Capa ganglionar. Imagen obtenida con objetivo 60X (Olympus UPLANS Apo; oil; NA: 1.35) utilizando el microscopio invertido IX81 (Olympus)..

renovarse indefinidamente en un estado indiferenciado.

Pueden ser clasificadas en dos categorías: según su potencialidad u origen. De acuerdo a su potencialidad, pueden ser omnipotentes (se diferencian en tejidos embrionarios y/o extraembrionarios), pluripotentes (pueden formar solo tejidos de ectodermo, mesodermo y endodermo) y multipotentes (más limitada que el resto, dictaminada por grados previos de diferenciación).2 Según su origen, las células madre pueden obtenerse del macizo celular interno de blastocistos (ESC)3, de tejido fetal, de tejidos adultos, incluido el ojo.4 Una fuente rica de células madre adultas es el tejido óseo, que contiene tanto células madre hematopoyéticas (HSC) como mesenquimales (MSC), alojadas en la médula y el estroma, respectivamente. El cordón umbilical es otra fuente de células madre multipotentes capaces de diferenciarse en una variedad de tipos celulares.

En este artículo de revisión, se tratarán las investigaciones actuales que tengan como objetivo la regeneración retiniana. Se estudiarán las principales enfermedades que potencialmente pueden ser tratadas a través de estas terapias así como las distintas fuentes celulares y estrategias de regeneración actuales. Finalmente, se hará un esbozo acerca de las aplicaciones futuras y los obstáculos que se presentan en el desarrollo de estas terapéuticas.

útil para estudiar el sistema nervioso central. Constituye un blanco ideal para la terapia celular por múltiples razones.

El ojo es fácilmente accesible y hay una abundancia de experticia quirúrgica en el área, facilitada por la estructura transparente de la córnea. Esta transparencia permite un sencillo seguimiento clínico luego de la intervención y permite una documentación precisa a través de la fotografía. La barrera hematorretiniana confiere un grado de inmunidad privilegiado en el ojo sano. Además, si bien dependemos de la vista para la vida diaria, el ojo no es esencial para la vida. Finalmente, muchas de las enfermedades de la retina están muy bien caracterizadas.5 La enfermedad de Stargardt es una enfermedad hereditaria de la retina. Es la causa más común de patología macular en los niños cuya progresión conduce a la ceguera en la adultez. La forma más frecuente es STGD1, autosómica recesiva. Causada por mutaciones en el gen ABCA4, que codifica para una proteína transportadora normalmente expresada en los fotorreceptores.6

Enfermedades retinianas candidatas a terapias celulares de regeneración

La degeneración macular asociada con la edad (AMD) es la principal causa de ceguera irreversible en los mayores de 55 años en todo el mundo. El daño en la mácula provoca la pérdida del campo visual central. Puede ser clasificada en seca o húmeda según la ausencia o presencia de fluido en la mácula, respectivamente. Es una enfermedad degenerativa compleja con un componente hereditario poligénico. Se genera como resultado de una inflamación crónica que conduce a la degeneración del EPR y la membrana de Bruch.7

La retina ha sido llamada la parte “accesible” del cerebro debido a su estructura y localización cercana a la superficie del cuerpo y por ello sirve como un modelo experimental

La retinitis pigmentaria es un trastorno que puede ser causado por varios defectos genéticos. Hay más de 100 mutaciones identificadas y pueden ser heredadas de forma

Desarrollo

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recesiva, dominante o ligada al X. Las células que controlan la visión nocturna (bastones) son más propensas a resultar afectadas, aunque en algunos casos las células del cono retiniano son las que reciben el mayor daño. El principal signo es la presencia de depósitos oscuros en la retina.

La clínica es variada; en general comienza con ceguera nocturna y pérdida progresiva del campo visual periférico, llevando a visión túnel y finalmente amaurosis.8 El glaucoma es una enfermedad que daña el nervio óptico del ojo. El nervio óptico se conecta a la retina y está formado por axones de las células ganglionares de la retina (CGR). En un ojo sano, un líquido claro llamado humor acuoso circula dentro de la parte frontal del ojo.

Para mantener una presión constante y normal en el ojo, éste produce continuamente una pequeña cantidad de humor acuoso, mientras que una cantidad igual del líquido sale del ojo. Durante esta enfermedad, el humor acuoso no fluye hacia afuera del ojo correctamente. La presión del líquido que queda en el ojo aumenta y, con el tiempo, causa daño axonal que puede progresar a la muerte celular de las CGR.9 Fuentes potenciales de células para el tratamiento de enfermedades retinianas Células madre embrionarias humanas (hESC) El EPR derivado de hESC muestra muchas de las características propias del EPR incluida su morfología, polaridad, fagocitosis, uniones estrechas y reciclaje de retinal. En estudios con modelos animales con AMD (roedores y primates), estos tejidos han demostrado sobrevivir, madurar e integrarse en los huéspedes mediante una inyección en el espacio submacular luego de una vitrectomía. Los resultados preliminares de una prueba clínica reportada por ACT (Advanced Cell Technology) indican que estas células muestran la capacidad de restaurar la visión, sin evidencia de formación de teratoma o pérdida de visión a los 4 meses del procedimiento.

Pese a las conclusiones alentadoras, la fuente de células embrionarias es ampliamente cuestionada por sus implicancias bioéticas.10,11,12 Células madre fetales humanas Las células madre fetales derivan de una gran variedad de tejidos embrionarios y extraembrionarios. Recientemente, células madre fetales neurales fueron aisladas a partir de tejido cerebral mediante disociación enzimática de fetos abortados donados (16-20 semanas de gestación). Estas células fueron identificadas por la expresión del marcador de superficie celular CD133 y expandidas en condiciones de cultivo para inducir la formación de rosetas. Una vez disociadas, estas células en suspensión se inyectaron al espacio subretinal de ratas RCS, las cuales sobrevivieron y migraron a través de la retina alejándose del sitio de inyección. Parámetros de función visual e histología retiniana muestran una mejora en las ratas tratadas, aunque el mecanismo exacto de reparación se desconoce.

Estas células fueron desarrolladas por Stem Cells Inc.13

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Células mesenquimales de médula ósea Las células mesenquimales de médula ósea guardan la promesa de una fuente alternativa de terapia celular.

Fueron inyectadas en el espacio subretiniano de modelos de ratones para retinitis pigmentaria donde se observó una mejoría en la morfología de EPR. Se realizó el mismo procedimiento en ratas RCS (Royal College Surgeon) el cual revirtió el declive de la agudeza y campo visuales.

En este último experimento, las células no demostraron diferencias de supervivencia de acuerdo al grado de inmunosupresión del huésped, sugiriendo que las células madre mesenquimales son menos inmunogénicas que otras fuentes de células madre alogénicas.

Células madre de médula ósea En ratones se ha demostrado que las células madre endógenas migran al espacio subretiniano en retinas lesionadas para iniciar la reparación. Se han inyectado células madre de médula ósea alogénicas vía vena lateral de la cola poco tiempo después de inducir daño en la retina. Estas células migraron a la retina, proliferaron, y expresaron RPE65 (proteína específica del EPR). Esta expresión sugiere que las células trasplantadas se están adaptando apropiadamente al nuevo nicho. En humanos, la inyección intravítrea de células madre de médula ósea en tres individuos con retinitis pigmentaria no mostró efectos adversos de relevancia, aunque tampoco se observó una mejoría en los parámetros visuales.14, 15 Células madre de cordón umbilical Estas células forman parte de la categoría de células madre adultas multipotentes. Se obtienen mediante digestión enzimática y pueden expandirse en cultivos celulares. Suspensiones de las mismas fueron inyectadas en el espacio subretiniano de 80 ratas RCS, mostrando una mejoría en los parámetros visuales respecto al control. Se cree que el mecanismo de reparación es parácrino, dado que estas células no cambian su morfología y se ha hallado que secretan altos niveles de BDNF, factor neurotrófico derivado del cerebro, conocido por mejorar la supervivencia neuronal. A partir de estos hallazgos, Janssen Research and Development ha iniciado pruebas clínicas en individuos con AMD seca.

Células madre pluripotentes inducidas (iPSC) Las células madre pluripotentes inducidas son células adultas que han sido genéticamente reprogramadas para pasar a un estado similar a células madre embrionarias, al obligarlas a expresar los genes y los factores importantes para el mantenimiento de las propiedades definitorias de las células madre embrionarias. Las iPSC de ratones se registraron por primera vez en 2006, a partir de fibroblastos, y las humanas se documentaron a finales de 2007.

La expresión de cuatro factores de transcripción, Oct4, Sox2, Myc and Klf4 (llamados factores de Yamanaka), permite reprogramar células adultas diferenciadas a otras con características embrionarias.16 Otros grupos han logrado similares resultados a través de diferentes Ciencia In Situ |Noviembre 2016 | http://www.cienciainsitu.com.ar/

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combinaciones, tales como Oct4, Sox2, Nanog y Lin28, las cuales evitan el uso de Myc, un conocido protooncogén.17 Las células del EPR derivadas de iPSC forman monocapas que exhiben polaridad, uniones estrechas, fagocitosis y expresan genes vitales para el ciclo visual. Trasplantes de estas células en ratas RCS han demostrado mejorar la función visual después de 13 semanas. Un grupo en Japón liderado por la Dra. Takahashi se convirtió en el primero en realizar un estudio piloto para evaluar la seguridad del tratamiento de AMD húmeda realizado con iPSC a partir de biopsias de 4 mm de piel del brazo de los pacientes. Un paciente fue trasplantado en 2014 utilizando una lámina celular de EPR a partir de iPSC. Debido a una mutación, las células iPSC del segundo paciente no pasaron la validación genómica.18, 19, 20 El grupo considera usar en adelante iPSC alogénicas obtenidas de un centro de investigación de la Universidad de Kioto (CiRA) debido a que han demostrado en animales la mínima o nula respuesta inmune cuando coincide el HLA. El estudio será retomado en 2017.21, 22, 23 (Ver Figura 2.)

Figura 2. Una vez desarrollada, la lámina de EPR será trasplantada al sitio afectado en el ojo, previa eliminación de tejido neovascular.

Los pacientes se someterán a un seguimiento y monitoreo de hasta cuatro años post trasplante.

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Transdiferenciación in situ a partir del EPR La transdiferenciación se puso de manifiesto por primera vez en 1987, cuando Harold Weintraub y su equipo demostraron que el factor de transcripción MyoD era suficiente para inducir la diferenciación de fibroblastos a miocitos. En particular, se ha conseguido inducir la diferenciación de fibroblastos de ratón a miocitos cardíacos y neuronas con las combinaciones apropiadas de solo 3 factores de transcripción en cada caso.24 (Ver Figura 3.)

El embrión de pollo puede regenerar su retina por transdiferenciación del EPR y por activación de células madre/progenitoras presentes en el margen ciliar. Estos eventos pueden ocurrir concomitantemente cuando una fuente externa de FGF2 se presenta luego de una injuria (retinectomía). Durante el proceso de transdiferenciación, el EPR pierde su pigmento y es reprogramado a neuroepitelio, que se diferencia para reconstituir las diferentes capas de la retina neural. Las células somáticas de mamíferos pueden

Figura 3. A. La lesión y ablación pueden inducir a que células diferenciadas tomen otro destino celular, proceso conocido como transdiferenciación. La transdiferenciación puede ocurrir directamente sin revertir a fenotipos inmaduros. B. También puede, a través de una desdiferenciación previa, rediferenciarse a un nuevo fenotipo maduro. C. Las combinaciones de tres factores de transcripción convierten a los fibroblastos en otros tipos celulares diferenciados, como neuronas.

Nota: Las figuras se pueden apreciar en color en www.cienciainsitu.com.ar

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reprogramarse mediante la expresión ectópica de diversos factores. Actualmente, diversos grupos de investigación estudian mecanismos de regeneración in situ a través del estudio de factores que inducen la transdiferenciación de células diferenciadas.25, 26, 27, 28 Transdiferenciación a partir de células de Müller En 2001, Fischer y Reh Here demostraron que la retina de pollo postnatal tiene el potencial de generar nuevas neuronas. En respuesta a un daño agudo, células de Müller reingresan al ciclo celular, y poco después expresan CASH1, Pax6 Y Chx10, factores de transcripción expresados por células progenitoras en retinas de embrión de pollo. Estas células se distribuyen por las capas nucleares externa e interna de la retina, algunas se diferencian a neuronas, otras forman células de Müller y la gran mayoría permanece indiferenciada.

Estudios recientes han revelado importantes mecanismos que subyacen en la reprogramación celular de la glía en pez cebra (Danio rerio) que pueden conducir a nuevas estrategias de regeneración retiniana en mamíferos.La plasticidad celular in vivo que se observa en organismos adultos ha reavivado el interés por el desarrollo de estrategias de regeneración a partir de células somáticas maduras. Las ventajas de la utilización de las células gliales de Müller radica en que abundan en la retina, no hay rechazo inmune ni implicancias éticas. Recientes estudios muestran que el factor de transcripción Brn-3b juega un rol central en la diferenciación, sobrevida y crecimiento axonal de las células ganglionares de la retina, así como en la promoción de la diferenciación de estas celulas gliales en CGR.29, 30, 31, 32 Conclusiones Las terapias con células madre para enfermedades de la retina están en transición luego de más de una década de investigación preclínica, y varios ensayos clínicos están actualmente reclutando. Estos ensayos utilizan células madre embrionarias humanas de cordón, fetal y umbilical, células madre y mesenquimales derivadas de médula ósea e iPSC para el tratamiento de trastornos visuales, como la degeneración macular relacionada con la edad, la enfermedad de Stargardt y la retinitis pigmentaria.

Los resultados de estas pruebas clínicas están colmados de expectativas, no sólo para determinar la seguridad y eficacia sino también para dilucidar los niveles de inmunosupresión requeridos y determinar qué método de entrega es preferible (EPR en suspensión o lámina celular).

Más de una década de analizar las claves del desarrollo que participan en la generación de la retina y la biología de células madre, junto con una amplia investigación quirúrgica, han dado diferentes enfoques celulares para hacer frente a estas retinopatías.

Una terapia celular ideal debe tener una alta eficacia, baja tasa de fracaso, ser reproducible a través de un rango de fenotipos y no requerir inmunosupresión. El tejido preferentemente debería ser fácil de propagar con pocas o nulas implicancias éticas. También tendría que ser 32

económica y utilizar pocos recursos.

Las estrategias de regeneración por medio de transdiferenciación cumplen con muchas de estas características. Sin embargo, las investigaciones se encuentran todavía lejos de la fase clínica. Si estas estrategias pudieran aplicarse con éxito a las personas, es posible que constituyan una vía directa alternativa a la génesis de poblaciones celulares diferenciadas, que eliminaría la necesidad de células madre pluripotenciales y permitiría, por ejemplo, la conversión directa de las células de la piel de un paciente en células diferenciadas empleadas en trasplantes.

Si estos abordajes se traducirán en tratamientos efectivos es el primer y más importante tema a tratar. Las múltiples propuestas en estudio que ingresan a los ensayos clínicos aumentan las posibilidades de desarrollar una terapia exitosa.

Agradecimientos: Esta revisión no tiene como objeto ser una recopilación definitiva del trabajo realizado en el campo de regeneración retiniana. Agradezco a los Dres. Viviana Sánchez y Gabriel Scicolone, directores del Laboratorio de Neurobiología del desarrollo del IBCN, así como a los becarios Juan Guillermo Mahecha, Mara Medori, Alejandro Nieto y Cindy Olmos.

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