Spis tre ci
Ewolucjonizm neodarwinowski: wp yw doboru na
Zmiany chromosomów w procesie ewolucji
D9 Filogeogra ia, zegary molekularne i drzewa ilogenetyczne
Wykorzystanie specy iczno ci sekwencji do badania kwasów
E2 Reakcja a cuchowa polimerazy (PCR) i zwi zana z ni technologia
aminokwasy do rybosomów w porz dku zgodnym z sekwencj mRNA, co zapewnia ich czenie we w a ciwej kolejno ci (Rys. 3). W komórkach znajduje si zwykle 31–40 indywidualnych rodzajów tRNA, z których ka dy wi e jeden konkretny z 20 aminokwasów. W rezultacie na jeden aminokwas mo e przypada wi cej ni jeden tRNA. Warianty tRNA wi ce ten sam aminokwas nosz nazw izoakceptorów. Przed rozpocz ciem translacji ka dy aminokwas zostaje kowalencyjnie po czony ze swym tRNA, który rozpoznaje nast pnie wskazuj ce na kodony w mRNA. Wi zanie aminokwasu z odpowiednim tRNA nazywamy aminoacylacj lub adowaniem. Ka dy aminokwas jest kowalentnie wi zany z ko cem ramienia akceptora tRNA przez enzym nazywany syntetaz aminoacylo tRNA. Dla poszczególnych aminokwasów istniej odr bne takie enzymy, z których ka dy mo e adowa wszystkie izoakceptory tRNA swojego aminokwasu.
Splicing
Rysunek 2. Splicing pre-mRNA. Pierwotny transkrypt zawiera introny (pola czarne), eksony (pola jasno szare) oraz obszary niepodlegaj ce translacji 3’ i 5’. Po splicingu cz steczki mRNA introny s usuni te i cz steczka jest gotowa do przy czania czapeczki na ko cu 5’ oraz dodawania poli-A na ko cu 3’, przed eksportem do cytoplazmy w celu translacji
Po do czeniu odpowiedniego aminokwasu tRNA rozpoznaje jego kodon w mRNA, pozwalaj c umie ci ten aminokwas we w a ciwej pozycji, zgodnie z sekwencj mRNA. Zapewnia to dok adn translacj kodów zawartych w mRNA na odpowiadaj c im sekwencj aminokwasów. Rozpoznanie kodonu odbywa si za po rednictwem p tli antykodonu w tRNA, a dok adniej trzech nukleotydów tworz cych antykodon, który wi e kodon przez komplementarne parowanie zasad. Kiedy dwa aminokwasy s do siebie zbli one, enzym transferaza peptydylowa tworzy mi dzy nimi wi zanie peptydowe, i w ten sposób nast puje wyd u anie powstaj cego a cucha polipeptydowego. Cztery zasady obecne w DNA mog utworzy 64 kodony. Trzy z nich dziaaj jako sygna y do zatrzymania procesu translacji, a pozosta e 61 koduje 20 aminokwasów, z których sk adaj si bia ka (Sekcja A3).
Rybosomy istniej jako oddzielne wielkie i ma e podjednostki. Pierwszy krok translacji polega na zwi zaniu podjednostki ma ej rybosomu z mRNA. Translacja zaczyna si zwykle od sekwencji AUG (w bakteriach czasami wykorzystywane s GUG lub UUG) koduj cej metionin i nazywanej kodonem inicjuj cym translacji.
Translacja przebiega wzd u mRNA, poczynaj c od miejsca inicjacji, przy czym aminokwasy czone s wi zaniami peptydowymi. Pocz tkowa metionina jest usuwana z powstaj cego polipeptydu. RNA matrycowe (mRNA) mog uczestniczy w translacji równocze nie w wielu rybosomach, tworz c struktury zwane polisomami. Proces translacji zatrzymuj kodony terminacyjne (Sekcja A3).
Polipeptydy s dalej przetwarzane przez enzymy mody ikuj ce niektóre aminokwasy. Mo e to obejmowa dodawanie niewielkich grup chemicznych; przyk adami takich procesów s : metylacja, hydroksylacja i formylowanie. Cz sto dodawane s a cuchy cukrów w procesie zwanym glikozylacj . Ogólnie bior c, wszystkie bia ka wystaj ce poza komórk s glikozylowane. Proces ten odbywa si w aparatach Golgiego. Konkretny przyk ad dotyczy ludzkich erytrocytów, gdy krew grupy A ma N-acetylogalaktozamin w a cuchu polisacharydowym, zwan substancj H. We krwi grupy B zamiast niej jest galaktoza, a komórki krwi grupy AB maj obydwie substancje przy czone do odr bnych a cuchów. We krwi grupy 0 wyst puje niezmody ikowana substancja H.
Kierunek translacji
Rysunek 3. Rola tRNA w translacji
(plamiste) rozmieszczenie allela I B w innych cz ciach wiata mo e by wynikiem dryfu b d selekcji przez choroby. Antygen A i B to grupy cukrowe obecne na powierzchniach erytrocytów, a tak e w wielu bakteriach i niektórych wirusach. Przebieg i ostro wielu chorób pozostaje w zwi zku z grupami krwi. Na przyk ad: I A zwi ksza podatno na osp prawdziw w populacjach niezaszczepionych przeciwko tej chrobie, dobór naturalny móg wi c t grup eliminowa . Pierwotny negatywny dobór lub dryf genetyczny mog y spowodowa eksplozj demograficzn w niektórych plemionach, których migracje i inwazje, niekiedy w wielkiej skali, mog y rozprzestrzeni allele na ró nych kontynentach. Najazdy hord Mongo ów na Europ Wschodni i Bliski Wschód w wiekach XII i XIII zaproponowano jako wyja nienie cz sto ci I B na tych obszarach, koncepcja ta nie t umaczy jednak wysokiej cz sto ci tego allela w Afryce Zachodniej. Takie hipotezy atwo si formu uje, ale ich weryfikacja jest prawie niemo liwa.
Częstości w procentach
25–30
15–25
5–15
0–5
Rysunek 1. Globalna dystrybucja allela IB ludzkiej grupy krwi B w systemie AB0
Gatunki pier cieniowe
Kiedy jaki gatunek opanowuje dostatecznie du y obszar, populacje yj ce na kracach jego zasi gu mog ró nicowa si w stopniu wystarczaj cym do utworzenia nowych gatunków. Jest to szczególnie widoczne, gdy zasi g okr a przeszkod wykluczaj c zamieszkanie, a nast pnie jego kra ce nak adaj si na siebie. Tak powstaj gatunki pier cieniowe. Jednym z przyk adów jest mewa polarna (Laurus glaucoides) otaczaj ca swym zasi giem Arktyk . W Europie jej zasi gi nak adaj si z zasi gami mewy srebrzystej (Laurus argentatus) i nieco mniejszej mewy ó tonogiej (Larus fuscus). W ten sposób sama odleg o ogranicza przep yw genów w obr bie populacji o wielkim zasi gu w stopniu wystarczaj cym do powstawania na jego kracach prekursorów nowych gatunków, je li centralna cz zasi gu zostanie usuni ta. Sk onno wielu gatunków ptaków do gniazdowania i rozmna ania si w pobli u
miejsc w asnych narodzin mo e ogranicza przep yw genów mimo wielkich migracji sezonowych.
Zegary molekularne
Mutacje zdarzaj si z cz sto ci wzgl dnie sta , okre lon g ównie przez prawdopodobie stwo b dów replikacji DNA. Cz z nich jest nieszkodliwa (niektóre mog by neutralne), w zwi zku z czym utrzymuj si w populacjach, a ich cz sto ci wzrastaj w nast pstwie dryfu genetycznego lub doboru naturalnego. Proporcja ta zale y od tego, jak ci le konkretny produkt bia kowy (lub RNA) jest zachowywany przez dobór (Sekcja D2). Ró nice mi dzy populacjami i gatunkami, w miar akumulacji, pozwalaj ocenia stopie rozbie no ci mi dzy nimi. Niektóre bia ka (np. ibrynopeptydy) zmieniaj si stosunkowo szybko i s u yteczne w badaniach gatunków blisko spokrewnionych, inne natomiast (np. cytochrom c i rybosomalne RNA) ewoluuj powoli i mog by wykorzystywane do ledzenia dywergencji wywodz cych si od najwcze niejszych ywych organizmów (Rys. 2). Tempo zmian dowolnej wybranej sekwencji jest w przybli eniu sta e, dlatego mo e pe ni funkcj zegara molekularnego
Zegary wymagaj kalibracji. W tym przypadku opiera si ona na dowodach ze skamienia o ci pozwalaj cych ustali granice porównywanych linii taksonomicznych. Dla hemoglobiny tempo zmian aminokwasów wynosi 1,2 zmiany pojedynczej pozycji aminokwasu na 109 lat (czyli: 1,2 × 10–9 pozycja–1 rok–1). Dla ibrynopeptydów warto ta jest wy sza: 8,3 × 10–9 (mniejsze zachowanie), a dla histonu H4 tylko 0,01 × 10–9 (bardzo wysokie zachowanie). Zmiany sekwencji bia kowych wydaj si zachodzi w jednakowym tempie u myszy i wielorybów, bardziej w skali lat ni pokole . Tempa zmian w niekoduj cych obszarach genomów oraz zmian synonimicznych w koduj cych loci s wy sze, przy czym zmiany u myszy wydaj si (w skali pokole ) szybsze ni u wielorybów. Sugeruje to znaczny wp yw doboru naturalnego na sta o tempa zmian bia ek w czasie w powi zaniu ze zmian rodowiska. Przypuszczenie to, je li s uszne, potwierdza hipotez , e dobór naturalny, bardziej ni dryf neutralnych mutacji, przyczynia si do wi kszo ci zmian aminokwasowych. Istniej w tpliwo ci co do stabilno ci zegarów molekularnych. Mog one ‘przy piesza ’ w okresach szybkiej ewolucji, takiej jak radiacja adaptacyjna ssaków po wygini ciu dinozaurów i wielu innych zwierz t pod koniec okresu kredowego. Mog równie ‘zwalnia chód’ w okresach stagnacji. Wskazania zegara molekularnego sugeruj , e g ówne grupy ssaków wyodr bni y si znacznie wcze niej ni 65 milionów lat temu, cho pierwsze kopalne dowody ich istnienia s ewidentnie znacznie m odsze. U gatunków o d ugich cyklach reprodukcyjnych obserwujemy wi cej mutacji w stosunku do liczby pokole , przy czym tempo mutacji jest wy sze u samców ni u samic. W spermatogenezie jest wi cej podzia ów komórkowych ni w oogenezie, dlatego tempo mutacji w przeliczeniu na lata oraz szybko ‘tykanie’ zegarów molekularnych mog zale e od liczby podzia ów mitotycznych w komórkach rozrodczych.
• Wektory retrowirusowe. Retrowirusów mo na u ywa do infekowania komórek we wczesnych stadiach embrionalnych, przed implantacj . Zainfekowany zarodek jest nast pnie przenoszony do macicy samicy znajduj cej si w stanie ci y urojonej. Transgen przeniesiony przez wektor retrowirusowy skutecznie integruje si z genomem gospodarza, jego rozmiar jest jednak ograniczony, a u ycie retrowirusów ma swoje implikacje w zakresie bezpiecze stwa.
• Mikroiniekcje. Ta metoda polega na wstrzykiwaniu DNA bezpo rednio do j dra zap odnionej komórki jajowej ogl danej pod mikroskopem. Mimo trudno ci technicznych, jest to dzi szeroko stosowana metoda tworzenia zwierz t transgenicznych.
• Zarodkowe komórki macierzyste. Komórki znajduj ce si w fazie blastocyst wczesnych zarodków mysich pobiera si i hoduje w kulturze komórkowej. Nazywamy je zarodkowymi komórkami macierzystymi (ES) (Sekcja G4). Maj one zdolno ró nicowania si na wszystkie inne typy komórek. Komórki ES mog by genetycznie mody ikowane w laboratorium i inkorporowane do blastocyst w celu implementacji (Rys. 1). Powstaje w ten sposób zwierz chimeryczne zawieraj ce transgeny tylko w niektórych komórkach. Jednak e, transgeny mog znajdowa si w niektórych gametach i wówczas zostan przekazane potomstwu, które b dzie je mia o we wszystkich swoich komórkach.
Transgenicznych zwierz t u ywa si jako narz dzi badawczych oraz do produkcji rekombinowanych bia ek. W dziedzinie bada naukowych istniej dwa g ówne zastosowania:
• Badania funkcji genów. Technologi transgeniczn z u yciem myszy doprowadzono do perfekcji w pocz tkach lat osiemdziesi tych. Od tamtej pory do organizmów tych zwierz t wprowadzano setki ró nych genów. Badanie cech genetycznie zmienionego zwierz cia pozwala uzyska informacje o funkcjonowaniu transferowanych genów. Studia te przyczyni y si walnie do zrozumienia regulacji i funkcji genów. Wariantem tej techniki jest u ywanie transferu genów do ich uszkadzania i/lub zak ócania ich funkcji. Myszy z knockoutem, pozbawione funkcjonalnych form specy icznych genów, dostarczaj informacji o ich funkcjonowaniu.
• Systemy modelowania chorób ludzkich. W warunkach laboratoryjnych tworzy si zwierz ta transgeniczne do celów symulacji chorób ludzkich, w których przebiegu istotn rol odgrywaj uszkodzone geny. Modele z u yciem ca ych zwierz t wykorzystuje si do obserwacji procesów powstawania i rozwoju chorób oraz do testowania nowych leków. Metod t stosuje si m.in. do modelowania choroby Alzheimera i reumatoidalnego zapalenia stawów, a transgeniczne myszy, zwane onkomyszami, preparowane do nosicielstwa onkogenów i innych defektów genetycznych zwi kszaj cych podatno na choroby nowotworowe, s wa nymi narzdziami w badaniach nad rakiem. Istnieje tak e wiele modeli zwierz cych ludzkich dziedzicznych chorób jednogenowych.
Rolnictwo
Konwencjonalna produkcja leków wa nych w praktyce medycznej i w rolnictwie jest kosztowna. Wiele irm farmaceutycznych dostrzega korzy ci wynikaj ce z u ywania mody ikowanych genetycznie zwierz t lub ro lin jako bioreaktorów w procesach produkcyjnych.
Kultura laboratoryjna
Blastocysta (zarodek mysi we wczesnej fazie rozwoju)
Transfekcja z transgenem
Iniekcja powrotna do blastocysty
Transgen
Implantacja w myszy płci żeńskiej
Rysunek 1. Transfer genów z u yciem embrionalnych komórek macierzystych (ES)
W badaniach na zwierz tach bardzo korzystne jest konstruowanie transgenów z odpowiednimi sekwencjami regulatorowymi (Sekcja A7), by mog y podlega ekspresji w cia ach samic z laktacj . Taka metoda produkcji rekombinowanych bia ek