PLANTAS 25 mg/mL ORÉGANO 12.0 mm NIM 12.0 mm COLOIDE 25 µg/mL-1 Plata 11.8 mm Coloidal
-1
CONCENTRACIONES 25 mg/mL-1 25 mg/mL-1 12.0 mm 14.0 mm 12.4 mm 14.0 mm CONCENTRACIONES 25 µg/mL-1 25 µg/mL-1 12.0 mm 13.8 mm
25 mg/mL-1 17.0 mm 17.0 mm
25 mg/mL-1 18,8 mm 19.0 mm
25 µg/mL-1 16.8 mm
25 µg/mL-1 18,8 mm
Tabla 1. Muestra las dosis probadas y los halos de inhibición correspondientes.
Figura 1. Juveniles de Litopenaeus vannamei con opacidad muscular y hepatopáncreas blanquecino 7.5 µg/mL-1de plata coloidal tuvieron halos de inhibición de 16.8 y 18.8 (tabla 1), utilizándose esta última para el biensayo de supervivencia. In vivo: Los organismos inmersos con la bacteria del control positivo, mostraron a los 30 minutos postinoculación opacidad muscular, nado errático, encontrándose la mayoría de los camarones en el fondo con presencia de organismos moribundos a las 2 horas post-inmersión con mortalidad alta a partir de las 3 horas y acumulada del 100% a las 15 horas. Debido a que los organismos del control positivo todos murieron a las 10 horas y los del tratamiento la última mortalidad se registró a las 18 horas el experimento tuvo una duración de 48 horas. Los camarones del control negativo, no mostraron síntomas de enfermos ni mortalidad a las 48 horas. Tratamiento con plata coloidal, la mortalidad de camarones se presentó a las 18 horas post-inoculación con 3
% de supervivencia
en lo publicado por Bell y Lightner (1988)Tran et al.,(2013) y MoralesCovarrubias y Gómez-Gil (2014). Procesamiento de muestras por análisis en fresco. El diagnóstico en fresco general se realizará para revisar alteraciones en los diferentes órganos y tejidos de los organismos se realizará con base con base en los procedimientos publicados por Morales-Covarrubias 2010 y 2013. Análisis bacteriológicos Las muestras fueron procesadas y analizadas utilizando la metodología descrita por Lightner (1996) y la interpretación de resultados se realizó con base en lo publicado por Gómez-Gil (2005). Procesamiento de muestras por análisis en fresco: El diagnóstico en fresco general se realizó con base en los procedimientos publicados por Lightner (1996), Morales-Covarrubias (2010) y Morales-Covarrubias y Gómez-Gil (2014). Análisis estadísticos: Se realizó un análisis de varianza no paramétrico de Kruskal-Wallis (P<0.05) utilizando la prueba de Dunn’s (comparaciones pareadas múltiples) para evaluar el efecto de las plantas y coloide en mortalidad. Los análisis se llevaron a cabo con el programa SigmaStat versión 3.0. Resultados In vitro. La respuesta de inhibición de nim y orégano en concentracionesde 100 y 125 mg/mL-1, resultaron “muy sensible” con halos de inhibición de 17 a 19 mm de diámetro, (Tabla 1.) utilizándose la concentración de 125mg/mL-1 para el bioensayo de supervivencia (prueba in vivo). Las concentraciones de 6.0 µg/mL-1 y
Control + Plata Nim Orégano
Horas
Grafica 1. Porcentaje de sobrevivencia de los tres tratamientos y el control positivo contra horas.
organismos (6.00%), con mortalidad acumulada del 10.00% a las 28 horas. Los camarones tratados con nim, la mortalidad se presentó a las 13 horas post-inoculación con 8 organismos (16.00%) y mortalidad total de 24.00% a las 28 horas. Los organismos tratados con orégano la mortalidad se presentó a las 10 horas post-inoculación con 11organismos (22.20%), con mortalidad acumulada del 36.00% a las 15 horas (Grafica 1). Se observaron diferencias significativas en los organismos del control positivo contra los organismos tratados (P>0.05), pero no se observaron diferencias significativas entre tratamientos con respecto a mortalidad y alteraciones en órganos y tejidos. Análogamente al análisis no paramétrico se buscó identificar si existían diferencias significativas entre los modelos que describen la supervivencia de los organismos sometidos a los 3 tratamientos, es decir si las curvas de los 3 tratamientos fueron coincidentes, para cumplir este objetivo se realizó análisis de suma de cuadrados residuales o AoRSS, propuesto por Chen (1992).Se probaron modelos de regresión lineal y exponencial para simular la supervivencia de los organismos sometidos a cada uno de los tratamientos, los modelos fueron ajustados por el método de sumatoria mínimos cuadrados (SSQ por sus siglas en inglés) utilizando el algoritmo Newton, incluido en el complemento Solver de Excel 2010®, el modelo exponencial obtuvo el mejor ajuste para los 3 tratamientos (SSQmodexp<SSQmodlin). El análisis mostró que no existen diferencias significativas entre las curvas (P>0.05)
industria acuicola | enero 2015 | 14
Análisis en fresco, 20 organismos moribundos mostraron hepatopáncreas de color blanquecino (figura 1), túbulos vacíos en grado 2 (figura 2a) y presencia de estructuras vermiformes libres con y sin resto de alimento (figura 2b). Intestino con fluido blanquecino y gran cantidad de estructuras vermiformes y células libres del hepatopáncreas. Por histología se revisaron 20 organismos, observándose branquias con infiltración de hemolinfa y núcleos picnóticos; hepatopáncreas con desprendimiento progresivo severo de las células de los túbulos del hepatopáncreas de la parte proximal, hacia la distal, quedando libres en la luz de los conductos tubulares (figura 3) presentando infiltración hemocítica, células con núcleos picnóticos y gran cantidad de estructuras vermiformes en el lumen de los túbulos (figura 4). El órgano linfoide con formación de esferoides, vacuolizaciones e infiltración hemocítica, glándula antenal con infiltración de hemolinfa y el intestino con enteritis hemocítica severa de la región media a la posterior con pérdida de los pliegues del ciego posterior y presencia de estructuras vermiformes en el lumen del intestino. DISCUSIÓN Los signos clínicos de los camarones inoculados por inmersión confirmaron la virulencia y concuerdan con lo reportado por Tran et al 2013 para la enfermedad de Síndrome de Necrosis Hepatopancreática Aguda (AHPNS). Las mortalidades en este trabajo comenzaron a partir de las 2 horas post-inoculación obteniendo una mortalidad acumulada del 100.00% a las 10 horas. Tran et al 2013, reportaron mortalidades del 100% con la cepa pura de Vibrio parahaemolyticus a los dos días para AHPNS, Khalil y Mansour 1997, reportaron mortalidades en tilapias entre las 12 y 72 horas post-inoculación intraperitoneal y encontraron que los productos extracelulares (PEC) causan mayor mortalidad que las bacterias vivas esto debido a la actividad proteolítica y hemolítica de los PEC. Las mayores lesiones se produjeron en hepatopáncreas con desprendimiento celular de la región proximal a la distal causando daños a las células E, E, F y B. Lesiones muy similares a las encontradas en este trabajo han sido reportadas por Tran et al 2013, para AHPNS con la cepa patógena de Vibrio parahaemolyticus la cual se introduce vía oral por los detritos que se encuentran en la columna de agua y el fondo del estanque, colonizando el tracto digestivo, produciendo toxinas y causando en la fase aguda una disfunción de las células del hepatopáncreas (HP), en donde se destruyen las células E, R, F y B, y además producen el desprendimiento de las células epiteliales tubulares de la región proximal a la región distal con inflamación, infiltración hemocítica y necrosis muy marcada del HP. Nelson