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DETECCIÓN DE MICOTOXINAS Aprovechando el potencial del MÉTODO LC-MS/MS

Hunor Farkaš, Jog Raj, y Marko Vasiljević PATENT CO, DOO., Vlade Ćetkovića 1A, 24 211, Mišićevo, Serbia

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¿Qué son las micotoxinas y por qué debemos controlarlas? El pienso de los animales puede estar contaminado con microorganismos, micotoxinas, subproductos animales, contaminantes orgánicos y metales tóxicos. Esta contaminación tiene efectos negativos, tanto para la salud animal como humana. Entre estos contaminantes, las micotoxinas tienen cada vez más relevancia, convirtiéndose en importantes contaminantes de piensos y alimentos. Las micotoxinas son producidas como metabolitos secundarios de varios hongos. Los principales hongos productores de micotoxinas son:

Aspergillus Fusarium Penicillium Las micotoxinas puede provocar micotoxicosis, ocasionando importantes pérdidas económicas al sector ganadero debido a la reducción de la productividad, al incremento de la incidencia de enfermedades y a la disminución del rendimiento reproductivo.

Menor productividad

Las micotoxinas que suponen un mayor riesgo debido a su toxicidad e incidencia son: Aflatoxina B1 (AFB1) Deoxinivalenol (DON) Ocratoxina A (OTA)

CONSECUENCIAS DE LA MICOTOXICOSIS

Zearalenona (ZEA) Fumonisinas (FB1 y FB2) Toxinas T-2

Mayor incidencia de enfermedad

Menor rendimiento reproductivo

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¿Cómo podemos detectar las micotoxinas? Existen numerosos métodos disponibles para la detección de micotoxinas. Los métodos convencionales para el análisis de micotoxinas incluyen: ELISA Cromatografía en capa fina (TLC) Cromatografía Líquida de Alta Eficacia Cromatografía de Gases (CG)

UN VISTAZO RÁPIDO AL MÉTODO DE ANÁLISIS MULTI-MICOTOXINA MEDIANTE LC-MS/MS Dado que es necesario comprobar la contaminación de los piensos para alimentación animal con micotoxinas, PATENT CO ha desarrollado y perfeccionado un método rápido y sencillo basado en la LC-MS/MS para la determinación y cuantificación de todas las micotoxinas (Aflatoxinas B1, B2, G1 y G2; Deoxinivalenol, Zearalenona, Fumonisina B1 y B2, T-2, HT-2 y Ocratoxina A) reguladas en el pienso (Directiva de la UE 2002/32/ EC, 2006/576/EC y 2013/165/EU).

La mayoría de estos métodos emplean una columna de limpieza de extractos en fase sólida y técnicas de inmunoafinidad para evitar interferencias y mejorar la cuantificación de las micotoxinas. La técnica ELISA es el método de elección cuando se requiere un análisis rápidos, pero debe ir seguida de un análisis mediante LC-MS/MS para su confirmación. El método LC-MS/MS es el más sensible y preferido para la detección y cuantificación de micotoxinas en muestras de alimento y pienso.

El método se basa en el principio de “diluir e inyectar” (“dilute and shoot”) que incluye una fase de extracción en dos etapas y la centrifugación de los extractos. Para compensar el efecto de matriz* en la fase de ionización por electrospray, los extractos son mezclados con los estándares internos marcados con [13C] para cada grupo de micotoxinas (13C AB1, 13C DON, 13C ZON, 13C OTA, 13 C FB1 y 13C T-2) antes de su inyección en el equipo de LC-MS/MS. *Efecto de los componentes de la muestra diferentes a la que se quiere analizar sobre un método analítico.

¿CÓMO FUNCIONA EL MÉTODO LC-MS/MS?

El método LC-MS/MS combina la gran capacidad de separación de la cromatografía líquida (LC) con la alta sensibilidad y especificidad de la espectrometría de masas (MS). Este método consta de los siguientes pasos para cuantificar las micotoxinas presentes en la muestra.

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2. INYECCIÓN A HPLC

El primer paso de la técnica consiste en la extracción de las micotoxinas presentes en la muestra (Figura 1).

1. EXTRACCIÓN

5.00 g muestra homogeneizada. El extracto se inyecta en la columna de LC que contiene una fase estacionaria y pasa por una fase móvil a alta presión (Ver parámetros en Tabla 1).

Extracción con 20ml ACN/Agua/Ácido fórmico=80:19.9:0.1; 60 min; temperatura ambiente.

Las interacciones químicas que se producen entre los componentes de la muestra y las fases estacionaria y móvil determina que tengan diferentes tasas de migración, lo que permite su separación.

Centrifugación a 4200 rpm durante 5 min. Extracción con 20ml ACN/Agua/Ácido fórmico=20:89.9:0.1; 60min; temperatura ambiente.

Columna HPLC

Eclipse XDB-C18 4.6x50mm, 1,8µm (p/n:927975-902)

Columna de protección HPLC Eclipse Plus C18 Grd.2.1 x12.5mm.5m (p/n:821125-936)

Centrifugación a 4200 rpm durante 5 min.

Fase móvil

A: 0.1% ácido fórmico, 5mM formiato de amonio en agua

B: 0.1% ácido fórmico, 5mM formiato de amonio en metanol

Programa de gradientes

Combinación de sobrenadantes y centrifugación a 4200rpm durante 5 min. Transferencia de 50 μL de extracto final filtrado al vial de HPLC y adición de 20 μL de la mezcla de solución de trabajo con estándares internos marcados con 13C. . Inyección de5µL Figura 1. Procedimiento de extracción para HPLC.

Tiempo [Min]

B [%]

0,00 45

4,00 45

4,10 75

13,00 75

15,00 100

17,00 100

Flujo Volumen de inyección

17,01 45 Tiempo posterior

5min

0.22 mL/min 5 µL

Tabla 1. Parámetros para la HPLC: Composición, Gradiente, Flujo y Volumen de inyección.


3. ENSAYO DE DILUCIÓN ISOTÓPICA ESTABLE (SIDA)

Figura 2. Ensayo de dilución isotópica estable (SIDA): Cromatograma

Micotoxina [13C] Toxina Margen de Rango de trabajo calibración [ng/ml] lineal (µg/kg) AB1 AB2 [13C] AB1

0,05 - 5

0,4 - 40

AG1 AG2 DON [13C] DON

8,0 - 800

Please [13C] Enable

0,2 - 20

64 - 6400 1.6 - 160

Sun [13C] Sun

2 - 200

16 - 1600

T-2 [13C] T-2

1,2 - 120

9,6 - 960

HT-2 FB1 [ C] FB1 13

5 - 500

40 - 4000

FB2

Tabla 2. Estándares internos marcados para cada grupo de micotoxinas.

4. ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Para compensar el efecto de matriz de la ionización por electrospray, los extractos son mezclados con estándares internos marcados con [13C] para cada grupo de micotoxinas (Tabla 2).

La muestra es nebulizada e ionizada para obtener partículas cargadas que migran bajo el efecto de un gran vacío a través de múltiples analizadores de masa gracias a la aplicación de campos magnéticos.

Los resultados se expresan en μg/kg o ppb en relación al pienso con un contenido de humedad del 12%

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¿QUÉ INGREDIENTES PUEDEN ANALIZARSE Y CÓMO DE FIABLES SON LOS RESULTADOS? El método LC-MS/MS ha sido validado con éxito para:

Maíz

Pienso compuesto

Trigo Cebada

Harina de soja

Salvado de trigo

Harina de girasol

TMR (Ración Mezclada Total)

Con el fin de valorar este método, los parámetros de rendimiento fueron obtenidos mediante validación interna, añadiendo una mezcla de 11 estándares de 11 micotoxinas a las muestras en blanco, con dos niveles de cuantificación (LOQ y 10xLOQ) y en 12 replicados. La Desviación Estándar Relativa de Repetibilidad (RSDr) del método fue del 2,3% al 13,4%, y las recuperaciones aparentes oscilaron entre el 62% y el 115% para todos los analitos.

RSDr:

2,5-13,4% Recuperaciones aparentes:

62-115%

Se concluye que el método de “dilución e inyección”, con la adición de los estándares internos marcados con [13C], es capaz de determinar todas las micotoxinas reguladas en la UE en alimentos y piensos compuestos para alimentación animal.

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