nutriFORUM 2019 - Ponencia sobre Fermentación ruminal y digestibilidad : medida in vitro

Fermentación ruminal y digestibilidad: medida in vitro María Dolores Carro Departamento de Producción Agraria ETSIAAB. Universidad Politécnica de Madrid

¿Por qué u)lizar sistemas in vitro en la nutrición de rumiantes? ¿Qué )pos de sistemas in vitro se u)lizan? ¿Cómo se interpretan los resultados obtenidos? ¿Son ú)les los resultados in vitro?

Introducción: Importancia de la fermentación ruminal. Medidas in vivo Sistemas in vitro simples Método in situ Sistemas in vitro complejos: fermentadores Reflexiones finales

Fermentación ruminal CO2 , CH4 PNDR Proteína microbiana Lípidos Degradación y síntesis AGV Lactato NH3

AGV: ácidos grasos volátiles PNDR: proteína del alimento no degradada en el rumen

Alimento, agua, saliva

Fermentación ruminal CO2 , CH4 PNDR Proteína microbiana Lípidos

↓ eficiencia energética

Degradación y síntesis Contaminación medioambiental

AGV Lactato NH3

Urea

↓ salud, bienestar y producción

Fermentación ruminal Digestión intestinal PNDR Proteína microbiana Lípidos Aminoácidos y ácidos grasos

Degradación y síntesis AGV Lactato NH3

Precursores síntesis otros compuestos 75-85% energía

Fuente de energía

Fermentación ruminal: medidas in vivo

CH4

Medida CH4 Cámaras respiratorias Collares recogida gas

Imágenes: AgResearch (Nueva Zelanda)

Fermentación ruminal: medidas in vivo

MOF, PNDR, PMic

Cánula duodenal (flujo duodenal nutrientes)

Cánula ruminal Monitorizar la fermentación: pH, AGV, NH3, láctico, ..

MOF Flujo proteína ¿PNDR? ¿PMic?

(marcadores microbianos; 15N, bases púricas, ..)

MOF: Materia orgánica fermentada; PNDR: proteína no degradable en el rumen; PMic: proteína microbiana

Nutrientes ingeridos

Fermentación ruminal: medidas in vivo

Metodología compleja Elevado coste (económico y laboral)

Animales con doble cánula (rumen y duodeno)

Larga duración

Implicaciones éticas Regulaciones legales

DIFICULTADES

(Real Decreto 53/2013*)

Principio de las 3 Rs: reemplazo, reducción y refinamiento.

* Real Decreto 53/2013, de 1 de febrero, por el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y otros fines científicos, incluyendo la docencia

Introducción: Importancia de la fermentación ruminal. Medidas in vivo Sistemas in vitro simples Método in situ Sistemas in vitro complejos: fermentadores Reflexiones finales

Sistemas in vitro simples ü Diseño depende del uso: - Tipo de trabajo (ensayos de rutina, valoración nutritiva, simulación fermentación ruminal, .. )

- Parámetros a medir (gas, degradabilidad, reacciones metabólicas, ..)

- Poblaciones microbianas (total, cultivos puros, grupos microbianos) - Duración (horas, días, semanas)

Sistemas in vitro simples ü Diseño depende del uso: - Tipo de trabajo (ensayos de rutina, valoración nutritiva, simulación fermentación ruminal, .. )

- Parámetros a medir (gas, degradabilidad, reacciones metabólicas, ..)

- Poblaciones microbianas (total, cultivos puros, grupos microbianos) - Duración (horas, días, semanas)

ü Requisitos: Obligatorios

Opcionales

Control temperatura (39ºC) y pH

Sistema de mezclado

Anaerobiosis

Salida de productos finales

Posibilidad de réplicas

Intercambio gaseoso

Facilidad de uso

Condiciones estériles

Sistemas in vitro simples: Tilley y Terry (1963)

Digestibilidad total in vivo vs. in vitro

ü 0,5 g muestra + 50 ml (1:4 líquido ruminal:solución buffer)

ü 1ª incubación (39ºC, 48 h) ü 2ª incubación en pepsina (39ºC, 48 h) ü Centrifugación, secado y pesado del residuo

Tilley JMA, Terry RA. 1963. A Two-Stage Technique for the in vitro Digestion of Forage Crops. Grass and Forage Science 18:104-111

Bolsas

Botellas (24 bolsas)

% Digestibilidad Tilley y Terry (bolsas)

Sistemas in vitro simples: Tilley y Terry (1963) adaptado al uso de bolsas R2 = 0,90; EE = 5,56 100

75

Forrajes Concentrados energéticos Concentrados proteicos

50

25 25

50

75

100

% Digestibilidad Tilley y Terry (tubos) 2 incubaciones (1ª líquido ruminal; 2ª pepsina) Mabjeesh et al. 2000. J. Dairy Sci. 83:2289–2294

Sistemas in vitro simples: sistema de producción de gas (Menke et al. 1979) ü Cantidad de gas producido en la fermentación ruminal es proporcional a la cantidad de materia orgánica (MO) fermentada 1 mol hexosa + H2O 1 mol hexosa + H2 1 mol hexosa

2 acético + 2 CO2 + 4 H2 2 propiónico + 2 H2O

CO2 + 4 H2

CH4 + 2 H2O

1 butírico + 2 CO2 + 2 H2

● Resultados para 89 dietas con digestibilidad in vivo de la MO (DMO; g/kg MO) conocida DMO = 7,56 Gas24h + 353 R2 = 0,82 ; RSD =37 DMO = 13,3 Gas24h – 0,05 (Gas24h)2 + 511 Proteína + 76 Lípidos + 81,2 R2 = 0,96 ; RSD = 19 Menke et al. 1979. The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feeding-stuffs from thegas production when they are incubated with rumen liquor in vitro. J. Agric. Sci. Cam. 92: 217-222

Sistemas in vitro simples: sistema de producción de gas (Menke et al. 1979)

Medida de la producción de gas (2, 4, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 36, 48, 56, 72 y 96 h)

Incubación (39ºC, 96 h)

Sistemas automáticos de medida

Menke et al. 1979. The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feeding-stuffs from thegas production when they are incubated with rumen liquor in vitro. J. Agric. Sci. Cam. 92: 217-222

Sistemas in vitro simples: sistema de producción de gas Gas (ml/g materia seca)

Medida dinámica

Cebada grano

300

Heno de avena

Can9dad potencial de gas

Paja de cebada

Ritmo de producción (ml/h)

200

Orujo de aceituna 100

0 0

6

12

18

24

30

36

42

48

54

60

66

Tiempo de medida (h)

72

78

84

90

96

≈ ritmo de fermentación

Sistemas in vitro simples: sistema de producción de gas Gas = PPG (1 -­‐ e (-­‐c (t -­‐ Lag)))

Gas (ml/g materia seca)

Cebada grano

300

PPG: producción potencial de gas c: ritmo fraccional de producción Lag: tiempo antes de comenzar la producción de gas

Heno de avena Paja de cebada

200

Orujo de aceituna

RMPG = (PPG c) / 2 [ln (2) + (c Lag)] DEMS = [(DMS96 c) / (c + kp)] e (– c Lag)

100

0 0

6

12

18

24

30

36

42

48

54

60

66

72

Tiempo de medida (h) RMPG: ritmo medio de producción de gas DDEMS: degradabilidad efectiva de la materia seca (diferentes ritmos de paso)

78

84

90

96

Sistemas in vitro simples: sistema de producción de gas Gas (ml/g materia seca) 300

Cebada grano

RMPG (ml/h)

Cebada grano 200

Heno de avena Paja de cebada

9,13

82,9

55,9

36,9

5,31

62,3

36,2

21,6

52,0

23,6

14,8

49,3

36,4

25,0

Heno de avena Paja de cebada 3,62

Orujo de aceituna

100

DMS96h (%) DEMS2,5% (%) DEMS6% (%)

4,27 Orujo de aceituna

0 0

6

12

18

24

30

ü Permite clasificar las materias primas (valor rela9vo) Ob9enen ariables n función del nivel produc9vo 36 ü 42 48 54 60valores 66 72 v78 84 90 e96 Tiempo de medida (h)

RMPG: ritmo medio de producción de gas DDEMS: degradabilidad efectiva de la materia seca (diferentes ritmos de paso)

Sistemas in vitro simples: sistema de producción de gas ü Permite monitorizar la fermentación ruminal: CH4, AGV, NH3-­‐N, lactato, etc.

Gran uso en inves9gación: evaluación de adi9vos, nuevas materias primas, etc.

Sistemas in vitro simples: sistema de producción de gas Ventajas Técnica simple y con bajo coste Requiere solo una pequeña can9dad muestra Ú9l para es9mar el contenido energé9co de materias primas Desventajas Requiere inóculo ruminal (animales fistulados, matadero) No aporta información sobre la degradación de la proteína ni el crecimiento microbiano

Introducción: Importancia de la fermentación ruminal. Medidas in vivo Sistemas in vitro simples Método in situ Sistemas in vitro complejos: fermentadores Reflexiones finales

Medida de la degradabilidad ruminal (proteína): método in situ ü Medida de la degradación del alimento en el rumen durante diferentes 9empos Deg. PB (%) 100

75

1. Incubación en bolsas 2. Extracción a diferentes tiempos (3, 6, 9, 12, 24, 36 y 48 h)

50

25

0

3. Lavado y análisis del residuo (N, MO, …)

0

12

24

36 Tiempo de incubación (h)

Tiempo de incubación (h)

Mehrez, AZ, Ørskov ER. 1977. A study of the artificial fibre bag technique for determining the digestibility of feeds in the rumen. J. Agric. Sci. 88:645-650.

48

Medida de la degradabilidad ruminal (proteína): método in situ

Medida dinámica

Deg. PB (%) 100

100 – (A+B) = Fracción no degradable

Deg. PB = A + B (1 – e –Kd * t)

B

Fracción insoluble potencialmente degradable

DEPB = (A + B * kd) / (kd + kp)

A

Fracción soluble

Kd = ritmo de degradación (%/h)

75

50

25

0 0

12

24

36

DEN: Degradabilidad efectiva del PB Kp = ritmo de paso a través del rumen

48

Tiempo de incubación (h)

Tiempo de incubación (h)

§ Método usado por NRC, INRA y AFRC

Ørskov ER, McDonald I. 1979. The estimation of protein degradability in the rumen from incubation measurements weighted according to rate of passage.

J Agr Sci Camb. 92:499-503.

Medida de la degradabilidad ruminal (proteína): método in situ ü Permite es9mar la degradabilidad en diferentes situaciones produc9vas NRC (2001) Proteína degradable en el rumen (% proteína) Ingestión de materia seca (% PV) 2% 4%

Proteína bypass (% proteína) 2% 4%

Cebada grano (aplastada)

81,9

76,3

18,1

23,7

Harina de gluten de maíz

36,2

25,4

63,8

74,6

↓ tiempo en rumen, ↓ degradabilidad PB Mayor ↓ materias de degradación lenta Cebada: ↓ 5,6 puntos Gluten maíz: ↓ 10,8 puntos

↓ tiempo en rumen, ↑ bypass Mayor ↓ materias de degradación lenta Cebada: ↑ 5,6 puntos Gluten maíz: ↑ 10,8 puntos

NRC. 2001. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. Seventh revised edition. The National Academic Press. Washington D.C., USA.

Medida de la degradabilidad ruminal (proteína): método in situ ü Permite es9mar la degradabilidad en diferentes situaciones produc9vas NRC (2001) Proteína degradable en el rumen (% proteína) Ingestión de materia seca (% PV) 2% 4%

Proteína bypass (% proteína) 2% 4%

Cebada grano (aplastada)

81,9

76,3

18,1

23,7

Harina de gluten de maíz

36,2

25,4

63,8

74,6

AFRC (1992)

Ritmos de paso variables según el nivel de ingestión (2%/h (bajo); 5%/h (< 2xmant.); 8%/h (vacas lecheras)

CNCPS (1992)

Estima el ritmo de paso mediante ecuaciones (nivel de ingestión, % forraje)

INRA (2007)

Asumía un ritmo de paso constante (6%/h)

INRA (2018)

Estima 3 ritmos de paso (forraje, concentrado y líquido) a partir de ecuaciones (nivel de ingestión y % concentrado)

NRC. 2001. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. Seventh revised edition. The National Academic Press. Washington D.C., USA.

Medida de la degradabilidad ruminal (proteína): método in situ

Ventajas Técnica con buenos resultados (referencia) Permite es9mar degradabilidades para diferentes situaciones produc9vas Desventajas Necesidad de animales fistulados en el rumen Muy laboriosa y costosa económicamente Tiene algunas imprecisiones ● Solubilidad ≠ degradabilidad

Sobreestima la DEPB

● Contaminación microbiana (residuos no degradados)

Subestima la DEPB

PNDR + PMic

(importante en materias fibrosas con baja PB)

Medida de la degradabilidad ruminal de la proteína: método in vitro (sistema de Cornell) PROTEÍNA Buffer borato-fosfato NH3-N A1

Fracción soluble Fracción insoluble

Soluble A1 A2

Fracciones proteicas del sistema CNCPS (v6.5)

Solucíón FND

Insoluble

Soluble

B1 B2

C

A1 A2 B1

Solucíón FAD

Insoluble Soluble B2

C

Insoluble

A1 A2 B1 B2

A1: Amoníaco, Degradabilidad total, ritmo muy alto (200%/h) A2: Proteína, AA, péptidos; Degradabilidad muy alta, ritmo alto (10-40%/h) B1: Proteína; Degradabilidad media, ritmo medio (3-20%/h) B2: Proteína unida a la FND; Degradabilidad baja, ritmo lento (0,05-2%/h) C: Proteína unida a la FAD; Indegradable e indigestible

C

Cálculo Degradabilidad efectiva Kp: variable, ecuaciones

(nivel de ingestión, % forraje)

Sniffen et al. 1992. A net carbohydrate and protein system for evaluating cattle diets: II. Carbohydrate and protein availability. J. Anim. Sci. 70: 3562–3577.

Medida de la diges)bilidad intes)nal: técnica de las bolsas móviles 1. Incubación en el rumen: PNDR (proteína no degradada)

NRC (2001)

3. Recuperación de bolsas en heces 2. Incubación de PNDR en bolsas en duodeno

Medida de la diges)bilidad intes)nal: método in vitro Calsamiglia y Stern (1995) NRC (2001); CNCPS (1992)

1. Incubación en el rumen: PNDR 2. Incubación con pepsina 3. Incubación con pancreatina

Calsamiglia S., Stern M.D. 1995. A three-step in vitro procedure for estimating intestinal digestion of protein in ruminants. J. Anim. Sci.. 73: 1459-1465.

Introducción: Importancia de la fermentación ruminal. Medidas in vivo Sistemas in vitro simples Método in situ Sistemas in vitro complejos: fermentadores Reflexiones finales

Sistemas in vitro complejos: fermentadores ü Mejor simulación de la fermentación ruminal que los sistemas in vitro más simples ü Información más completa ü Necesidad de más equipamiento y mayores cantidades de alimento ü Elevado coste económico y laboral (no apto para evaluación rutinaria)

Fermentadores de flujo semicontinuo (Rusitec) Czerkawski J.W., Breckenridge G. 1976. Br. J. Nutr. 38:371-84

Fermentadores de flujo continuo Hoover et al. 1976. J. Anim. Sci. 43: 528—534

Fermentadores de flujo semicontinuo (Rusitec) Motor

Fermentadores (39ºC)

Saliva artificial Efluente líquido Bolsas (gas) Incubación: 14 d Czerkawski J.W., Breckenridge G. 1976. Br. J. Nutr. 38:371-84

Alimento (1 vez/día)

Fermentadores de flujo semicontinuo (Rusitec) Motor

Medidas

Degradabilidad de la dieta Saliva artificial (15N): síntesis PMic Efluente líquido: AGV, NH3, láctico Bolsas (gas): metano

Czerkawski J.W., Breckenridge G. 1976. Br. J. Nutr. 38:371-84

pH Actividad enzimática Análisis microbiota (PCR, secuenciación masiva, …)

Fermentadores de flujo continuo

Sistema interno de agitación Fermentadores (placa, 39ºC) Saliva artificial

Incubación : 8-10 d Hoover et al. 1976. J. Anim. Sci. 43: 528—534

Fermentadores de flujo continuo

Aporte alimento sin apertura del fermentador (2-3 veces/d)

Sistema agitación interna

Efluente líquido y sólido: AGV, NH3, láctico, síntesis PMic

pH: - regulación precisa - monitorización continua

Gaseado continuo con N o CO2 (anaerobiosis) pH Actividad enzimática Análisis microbiota (PCR, secuenciación masiva, …)

¡No recogida del gas!

Hoover et al. 1976. J. Anim. Sci. 43: 528—534

Sistemas in vitro complejos: fermentadores ü Muy utilizados en investigación 180 estudios

(J. Dairy Sci.; J. Anim. Sci.)

ü Permiten realizar estudios en condiciones controladas durante un período prolongado ü Se obtienen parámetros fermentativos similares a los registrados in vivo

ü Microbiota diferente a la del rumen (no mantienen protozoos)

Mateos I., Ranilla M.J., Saro C., Carro M.D. 2015. Animal. 11: 1939-1948

¿Por qué u)lizar sistemas in vitro en la nutrición de rumiantes? ¿Qué )pos de sistemas in vitro se u)lizan? ¿Cómo se interpretan los resultados obtenidos? ¿Son ú)les los resultados in vitro?

Reflexiones finales Los sistemas in vitro son herramientas muy útiles para la valoración nutritiva en rumiantes (datos en tablas de valoración de alimentos) La técnica de producción de gas es un método sencillo y barato para obtener información sobre el valor energético de los alimentos, mientras que la técnica in situ es referencia para medir la degradabilidad ruminal de la proteína Los fermentadores son sistemas complejos, laboriosos y caros, pero aportan gran cantidad de información sobre la fermentación ruminal Los sistemas in vitro suponen una clara alternativa a las pruebas con animales, pero no las sustituyen completamente

¡Muchas gracias por su atención!

María Dolores Carro mariadolores.carro@upm.es