Biomonitorización de micotoxinas en animales de producción - Perspectivas y Retos

BIOMONITORIZACIÓN DE MICOTOXINAS EN ANIMALES DE PRODUCCIÓN Pe r s p e c t i va s & R e t o s

Profesor Carlos Augusto Fernandes de Oliveira Departamento de Ingeniería de los Alimentos, Facultad de Zootecnia e Ingeniería de los Alimentos, Universidad de São Paulo, Pirassununga, São Paulo, Brasil.

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Los biomarcadores de exposición han sido ampliamente utilizados para mejorar la evaluación de la exposición a micotoxinas a través de la dieta en humanos. Recientemente, también se ha señalado la utilidad de los biomarcadores para la Biomonitorización de micotoxinas en los animales de producción.

En este artículo, repasaremos los principales biomarcadores empleados para la biomonitorización de la exposición de los animales a una o varias micotoxinas, así como las aplicaciones potenciales de estos biomarcadores con fines diagnósticos y para la evaluación de la eficacia de las medidas de prevención, tales como los adsorbentes minerales.

Micotoxinas & Micotoxicosis Las micotoxicosis son enfermedades

Es importante recordar que, aunque

relacionadas con la exposición

los alimentos puedan contener

a las micotoxinas a través de

micotoxinas individuales, la

la dieta, manifestándose con

contaminación de estos productos

inmunosupresión y toxicidad en

con varias micotoxinas es muy

los órganos diana, con lesiones

común, algo que es cada vez más

en hígado, riñones, tejido epitelial

importante desde la perspectiva de

(piel y membranas mucosas)

la salud humana y animal, debido

y sistema nervioso central,

a los posibles efectos combinados

principalmente, dependiendo del

de diferentes micotoxinas.

tipo de toxina involucrado.

La toxicidad de algunas

Los principales grupos de hongos

micotoxinas puede verse

toxigénicos y sus respectivas

incrementada debido a

micotoxinas pertenecen a los géneros:

interacciones sinérgicas, aditivas o antagonistas

Aspergillus: A. flavus, A. parasiticus y A. nomius: aflatoxinas

cuando aparecen de forma concomitante y son ingeridas por las distintas especies animales.

Fusarium: fumonisinas, tricotecenos, moniliforminas y zearalenona

Aspergillus ochraceus Penicillium: ocratoxinas

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AFLATOXINAS

OCRATOXINA A

FUMONISINAS

Entre las micotoxinas que afectan al

La ocratoxina A (OTA) es una

Se han aislado e identificado hasta

ganado, las aflatoxinas se consideran

importante micotoxina nefrotóxica

28 fumonisinas estructuralmente

compuestos hepatotóxicos,

con efectos inmunotóxicos,

relacionadas, aunque la

teratógenos y genotóxicos, también

teratógenos, carcinogénicos

fumonisina B1 (FB1) es la forma

clasificados como carcinogénicos

y, posiblemente, neurotóxicos,

más predominante y tóxica

para los seres humanos (Grupo

provocando cáncer hepático y

producida por los hongos.

1) por la Agencia Internacional de

renal en muchas especies.

Investigaciones sobre el Cáncer.

La FB1 ha demostrado ser hepatotóxica, nefrotóxica

Las aflatoxinas fueron

y carcinogénica en varios

identificadas en 1961, siendo

estudios con animales,

la aflatoxina B1 (AFB1) el

provocando también

principal tipo de toxina

enfermedades especificas en

producida por Aspergillus

determinadas especies, como

en condiciones naturales.

edema pulmonar porcino y leucoencefalomalacia equina.

DEOXINIVALENOL El deoxinivalenol (DON), también conocido como vomitoxina debido a sus efectos eméticos tras la ingestión, es otra micotoxina producida por especies de Fusarium. Pertenece al grupo

ZEARALENONA

de los tricotecenos clase B y, a menudo, aparecen junto con la

La zearalenona (ZEA) es una

ZEN en ingredientes como el maíz,

micotoxina que se une de manera

la avena, la cebada y el trigo.

competitiva a los receptores

La exposición aguda a DON

de estrógenos, conduciendo

también provoca dolor

a anomalías estrogénicas y

abdominal, salivación,

síndromes degenerativos,

diarrea, leucocitosis y

especialmente en porcino.

hemorragia gastrointestinal (Oliveira et al., 2014).

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El reto del diagnóstico de las micotoxicosis Desde el descubrimiento de las aflatoxinas a principios de los años 60, la evaluación de los efectos negativos de las micotoxinas en los animales de producción se ha basado en la observación de signos y síntomas de intoxicación, incluyendo el empeoramiento de los parámetros productivos, junto con la información sobre la contaminación por micotoxinas del pienso y/o alimentos.

BIOMARCADORES DE EXPOSICIÓN Los biomarcadores de exposición

El primer biomarcador de

se basan en la cuantificación de

micotoxinas empleado en la

un compuesto específico, sus

producción animal fue la aflatoxina

metabolitos o los productos de su

M1 (AFM1) en leche de animales en

interacción con un compartimento

lactación alimentados con raciones

o fluido corporal, que sea indicativo

contaminadas por aflatoxina B1

de su presencia y la magnitud de la

(AFB1), tal y como se muestra en la

exposición al agente.

Figura 1.

A pesar de la existencia de varios criterios de diagnóstico de la micotoxicosis, el enfoque clásico conlleva importantes limitaciones debido a la variabilidad en la susceptibilidad individual a las

Figura 1. Ruta metabólica de la conversión de aflatoxina B1 conversión en aflatoxina M1 en vacas lecheras.

micotoxinas y a su distribución heterogénea en el pienso.

Metabolismo hepático

AFM1 excretada en leche= 0,3-6,2% AFB1 ingerida (Veldman et al.,1992 )

Ingestión

Aflatoxina B1 en la ración Aflatoxina M1 en leche Excreción en leche

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La información disponible sobre la toxicocinética de las micotoxinas en varios modelos animales sugiere que la exposición a las micotoxinas puede estimarse con precisión mediante biomarcadores presentes en varias muestras biológicas, especialmente en suero.

La presencia del aducto aflatoxina B1-lisina (AFB1-lys) en suero, un producto de la digestión del complejo AFB1-albumina empleado en la biomonitorización de la exposición a aflatoxinas, ha demostrado ser un biomarcador específico de aflatoxicosis en broilers y lechones (Di Gregorio et al., 2017).

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA ACOPLADA A ESPECTOMETRÍA DE MASAS TÁNDEM (LC-MS/MS) En los últimos años, la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) basado en el enfoque de análisis múltiple se ha introducido con éxito en el campo del análisis de micotoxinas, abriendo nuevas posibilidades para la evaluación de marcadores adecuados para las combinaciones de micotoxinas.

En el caso de la fumonisina B1 (FB1), los estudios experimentales indican que la FB1 en plasma y orina son buenos biomarcadores de exposición de cerdos a bajos niveles de FB1 en la dieta, aunque se recomiendan los niveles plasmáticos para evaluar la exposición prolongada (>14 días) (Souto et al., 2017).

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Biomarcadores para la evaluación de la exposición a micotoxinas en animales de producción Un biomarcador ideal debe ser: Especifico Cuantificable Detectable a bajos niveles Obtenido mediante técnicas no invasivas y económicas Estos atributos deberían determinarse para cada toxina potencial en base a sus características toxicocinéticas, lo que implica el estudio de la absorción, distribución, metabolismo/ biotransformación y excreción (ADME) de la toxina a lo largo del

FASES DE LA BIOTRANSFORMACIÓN

tiempo.

En función del perfil toxicocinético de una

En todas las especies, la biotransformación ocurre en dos fases:

determinada micotoxina tras la

Fase I, basada principalmente en reacciones de

ingestión, algunos biomarcadores

hidrólisis, reducción y oxidación.

pueden emplearse para estimar la magnitud y el nivel de

Fase II, que incluye la conjugación de los productos

exposición a través de la dieta

formados en la Fase I.

mediante la cuantificación de sus metabolitos o los productos de interacción en los fluidos corporales.

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PERFIL TOXICOCINÉTICO DE AFLATOXINA B1 En el caso de la AFB1, los metabolitos

Los enzimas del citocromo P450

resultantes de la Fase I incluyen:

del hígado también transforman

Productos hidroxilados: AFM1 y aflatoxina Q1 Productos desmetilados:

la AFB1 en AFB1-8,9-epóxido, su forma procarcinógena que se encuentra unida covalentemente a los ácidos nucleicos, principalmente

aflatoxina P1

ADN (dando lugar al aducto AFB1-

Producto de la reducción

-produciendo el aducto AFB1-lisina)

mediante enzimas

(Di Gregorio et al., 2017).

N7-guanina), y a la albúmina sérica

citoplasmáticas: aflatoxicol Todos estos compuestos pueden excretarse en orina, bilis y heces

(Oliveira et al., 2014). La tasa de excreción de AFM1 en leche de vaca oscila entre el 0,3% y el 6,2% de la AFB1 ingerida, en función de la fase de la lactación y el volumen de leche producido. En aves de corral, los principales productos de la biotransformación de la AFB1 son AFM1 y aflatoxicol, que pueden encontrarse en huevos.

En este contexto, la AFB1, sus aductos en suero sanguíneo (AFB1-lisina) y orina (AFB1N7-guanina), así como el metabolito AFM1 en orina y leche, pueden considerarse como biomarcadores validos de exposición a AFB1.

AFM1 AFM1 & AFLATOXICOL

PERFIL TOXICOCINÉTICO DE FUMONISINAS Las fumonisinas son el grupo de micotoxinas descubierto más recientemente. Desde su aislamiento en 1988, se han asociado a enfermedades como la encefalomalacia equina y el edema pulmonar porcino.

La biodisponibilidad de la FB1 tras su ingestión normalmente es inferior al

Sin embargo, se pueden encontrar residuos de FB1 en plasma y orina de cerdos que han recibido una dosis oral de 3,1-9,0 mg FB1/kg pienso, observándose una buena correlación entre los la FB1 ingerida y los niveles residuales en plasma u orina (Souto et al., 2017).

6% en varias especies. Además, la FB1 tiene una corta vida media (<24 h), recuperándose menos el 2% en orina.

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PERFIL TOXICOCINÉTICO DE ZEARALENONA La zearalenona es un compuesto estrogénico derivado del ácido resorcílico, producido para especies de Fusarium, tales como F. roseum

(F. graminearum), F. culmorum y F. equisetum, entre otros.

En los mamíferos, la zearalenona puede reducirse a sus análogos estereoisómeros hidroxi, α-zearalenol y β-zearalenol (α- y β-ZOL).

También se puede formar un conjugado de ácido glucurónico, preferiblemente en el grupo 14-hidroxil fenólico.

En cerdos, la vida media de la ZEA es de 87 horas tras la administración

PERFIL TOXICOCINÉTICO DE OCRATOXINA

PERFIL TOXICOCINÉTICO DE DON

intravenosa u oral. Los lechones han demostrado tener una tasa de

Los tricotecenos, incluyendo el DON,

El grupo de las ocratoxinas incluye

excreción del 37% de ZEA en 24

se absorbe fácil y rápidamente a

7 toxinas relacionadas, aunque

horas (Gambacorta et al. 2013).

través del tracto gastrointestinal

solamente se ha descrito la OTA

tras la exposición. Los estudios

como contaminante natural de los

realizados en varias especies revelan

granos.

una disponibilidad del DON del 5060%, lo que implica una absorción eficiente.

Un importante metabolito del DON es el deepoxi deoxinivalenol (DOM-I), producido por microorganismos del tracto intestinal de varias especies, especialmente en rumiantes. Además, el DON puede ser sulfonado o conjugado con acido glucurónico,

Tras su ingestión, la OTA puede permanecer en el suero unido a proteínas, llegando a los riñones, los músculos y el hígado.

Tiene una alta capacidad de unión a proteínas plasmáticas (hasta el 99%), con una vida media plasmática estimada de 35 días (Dietrich et al., 2005).

dando lugar a deoxinivalenol

También sufre una

glucurónido (DON-GlcA), y

biotransformación por enzimas

excretado en orina.

del citocromo P450 para dar

Tanto el DON en orina como el DON-GlcA se consideran como biomarcadores validos para la estimación de exposición de DON a través de la dieta (Nagl

et al, 2015).

metabolitos hidroxiocratoxina A, principalmente ocratoxina alfa (OTα).

Tanto la OTα como la OTA puede excretarse en orina, aunque por ahora, la OTA en orina no se ha validado como biomarcador de exposición a OTA en la dieta.

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Aplicación de biomarcadores de micotoxinas en producción animal

Por razones prácticas, los biomarcadores de exposición a las micotoxinas de interés en la producción animal son aquellos que pueden medirse en plasma,

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE MICOTOXICOSIS

mientras que la orina es la muestra empleada con mayor frecuencia en la biomonitorización de micotoxinas

En animales de producción, la

Sin embargo, hasta la fecha se

en personas, ya que se trata de

primera aplicación importante de

han llevado a cabo pocos estudios

una muestra sencilla de obtener de

los biomarcadores de exposición a

para determinar las curvas dosis-

forma no invasiva.

las micotoxinas es el diagnóstico

respuesta que relacionen los

diferencial de las micotoxicosis,

síntomas de las micotoxinas en los

ya que los signos y los síntomas

animales de producción con las

de las distintas micotoxinas no son

concentraciones del biomarcador.

muy evidentes o característicos.

Por otro lado, el coste del análisis

En condiciones ideales, el

es un importante obstáculo para

diagnóstico preliminar de una posible

la aplicación rutinaria de los

micotoxicosis podría confirmarse

biomarcadores para confirmar el

en base al nivel de metabolitos

diagnóstico de la micotoxicosis,

detectados en plasma u orina

ya que requiere de equipos de

de los animales afectados.

laboratorio específicos y personal altamente cualificado para poder obtener resultados fiables.

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EVALUACIÓN DE LA EFICIENCIA DE ADSORBENTES DE MICOTOXINAS Una posible aplicación más atractiva

Sin embargo, los protocolos

de los biomarcadores de exposición

in vivo suelen ser costosos y laboriosos, ya que requieren la administración de distintos niveles de toxinas, con y sin el adsorbente, para poder evaluar su efecto sobre la productividad.

a las micotoxinas en los animales de producción, y que podría tener una buena relación coste-beneficio, es la evaluación de la eficiencia de los adsorbentes empleados a gran escala para prevenir los

En este contexto, el uso de biomarcadores para estimar la biodisponibilidad de las micotoxinas en estudios in vivo de la eficiencia de los adsorbentes podría reducir los costes, además de ser una estrategia

Además, estos estudios

más práctica que permita la

requieren la recopilación de

estandarización de los ensayos

El criterio más importante para la

datos histopatológicos y clínicos,

experimentales y posibilitando

evaluación de un adsorbente es la

entre otros problemas, lo que

la evaluación de los adsorbentes

estabilidad de la unión adsorbente-

aumenta el coste y el trabajo

en condiciones de campo.

toxina en un amplio rango de pH,

involucrado (European Food

tal y como se espera que ocurra a

Safety Authority, 2010).

efectos tóxicos de las micotoxinas.

lo largo del tracto gastrointestinal.

Dado que los adsorbentes varían ampliamente en cuanto a su composición y propiedades físicoquímicas, es necesario evaluar su eficacia mediante estudios in vitro e in vivo (Di Gregorio et al., 2014).

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EMPLEO DE AFM1 PARA EVALUAR LA EFICIENCIA DE ADSORBENTES

El primer biomarcador empleado para evaluar la eficiencia de los adsorbentes probablemente fue la AFM1 en leche de vaca.

Un buen ejemplo de este tipo de enfoque fue el estudio realizado por Diaz et al. (2004)

EMPLEO DE AFB1-LISINA PARA EVALUAR LA EFICIENCIA DE ADSORBENTES

Carão (2016) y Di Gregorio et al.

(2017) evaluaron la eficiencia de adsorbentes comerciales basados en HSCAS, empleando como biomarcador el aducto AFB1-lisina en el suero de broilers y cerdos alimentados con dietas con 500 y 1.100 µg/kg de AFB1.

en el que la concentración de AFM1 en leche de vacas

En cerdos, el HSCAS redujo

alimentadas con cuatro tipos

los niveles de AFB1-lisina en

diferentes de adsorbentes

un 53-72% entre los días 7

comerciales y 55 µg/kg AFB1

y 21 de exposición continua

se redujo en un 31-65%.

a pienso contaminado (Di

Gregorio et al., 2017).

Edrington et al. (1996) emplearon tres tipos de adsorbentes (Silicato de aluminio calcio y sodio hidratado -HSCAS-, carbón activado y HSCAS ácido) en el pienso de pavos colostomizados e intoxicados con 0,75 mg/ kg de AFB1. Se observó una reducción de la excreción urinaria de AFM1 en un 52-72% 48 horas después de la ingestión del pienso contaminado.

Figura 2. Resumen de los procedimientos implicados en la evaluación de la eficiencia de los adsorbentes mediante la medición del aducto AFB1-lisina en suero de animales de granja

Sin embargo, el mismo adsorbente comercial empleado en broilers no produjo resultados satisfactorios en la reducción de los efectos tóxicos de la AFB1 (Carão, 2016), ya que no hubo una reducción en la concentración de AFB1-lisina en el suero de las aves intoxicadas.

VENTAJAS DEL USO DE LA AFB1-LISINA EN SUERO PARA LA EVALUACIÓN DE LOS ADSORBENTES DE AFLATOXINAS: Mayor precisión gracias a la evaluación de la exposición a nivel individual.

Menor coste de los estudios in vivo al necesitarse menor número de animales en los análisis de laboratorio.

La posibilidad de obtener resultados en con mayor rapidez.

(Di Gregorio et al., 2017) En la Figura 2 se muestra un resumen del procedimiento para la evaluación de la eficiencia de los adsorbentes empleando el aducto AFB1-lisina.

Sin embargo, una importante limitación del análisis rutinario

Estos resultados demuestran

del aducto AFB1-lisina es la

la potencial utilidad de la

necesidad de establecer unos

AFB1-lisina como biomarcador

estándares de referencia que

específico de AFB1 para la

aún no están disponibles

evaluación de la eficacia de las

comercialmente (Jager et al., 2016) pero que podrían ser sintetizados en laboratorios especializados (Sass et al., 2014).

intervenciones químicas de protección en cerdos y broilers.

Análisis

AFB1-lisina

AFB1 Adsorbente

Enzimas hepáticos P450

AFB1-albumen en sangre

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Biomarcadores de exposición a múltiples micotoxinas en la dieta Recientemente, la cromatografía

Hoy en día, la cromatografía líquida

En este contexto, se han

líquida acoplada a espectrometría

acoplada a espectrometría de

desarrollado métodos analíticos

de masas en tándem (LC-MS/MS)

masas en tándem (LC-MS/MS), en

para la determinación de varias

centrado en el análisis de múltiples

combinación con una fuente de

micotoxinas en plasma de

analitos se ha implementado en el

ionización en electrospray (ESI) es,

cerdo (Devreese et al. 2012).

análisis de micotoxinas, incluyendo

sin duda, la herramienta de análisis

Sin embargo, la influencia del

la evaluación de biomarcadores

más eficaz para la determinación

efecto matriz es el mayor reto a

adecuados para la determinación de

cuantitativa y cualitativa de

la hora de desarrollar métodos

la exposición de las personas.

micotoxinas en muestras naturales.

cuantitativos multianalitos. Por

El desarrollo de nuevas técnicas ha

Concretamente, el uso de

sido importante en lo que respecta

LC-MS/MS permite aumentar

a los biomarcadores de múltiples

la sensibilidad y selectividad

micotoxinas, permitiendo:

analítica, ya que los métodos

La obtención de datos más realistas sobre la exposición, ya que en condiciones reales los individuos son expuestos a una mezcla de micotoxinas.

La posible evaluación de riesgos para un conjunto de micotoxinas y los posibles efectos de su interacción.

No obstante, la preparación de las muestras continúa siendo un reto desde el punto de vista del desarrollo de métodos de análisis de múltiples micotoxinas debido a la existencia del efecto matriz y un amplio rango de propiedades químicas de las micotoxinas y sus metabolitos.

basados en MS/MS emplean información sobre el ion molecular de un determinado analito y de sus productos iónicos, ofreciendo un elevado nivel de confianza para la identificación del analito diana.

Los espectrómetros de masas modernos son cada vez más versátiles en lo que respecta a las posibles combinaciones en un único dispositivo, distintas fuentes de ionización y diferentes analizadores.

La mayor ventaja de los equipos

ello, se están invirtiendo grandes esfuerzos para obtener resultados precisos, especialmente la inclusión de un paso de limpieza de la muestra (p. ej., empleando QuEChERS) y la compensación de la supresión/ potenciación de la señal mediante el uso de estándares ajustados a la matriz.

Los biomarcadores son una herramienta útil para la evaluación de la exposición a micotoxinas, ya que permiten confirmar el diagnóstico de las micotoxicosis y la identificación individual de animales que están en riesgo pero que no muestran signos de intoxicación.

existentes es que permite refinar los

El empleo de biomarcadores

métodos de análisis, posibilitando el

séricos para la estimación de la

análisis de un rango más amplio de

biodisponibilidad de micotoxinas

moléculas en un único dispositivo.

en estudios in vivo de la eficacia de adsorbentes parece prometedor, al reducir el coste de los ensayos, especialmente en el caso de la AFB1 y FB1, y posiblemente para DON. Sin embargo, será necesario realizar más estudios de validación que proporcionen información de base fisiológica en animales de producción sobre la toxicocinética de los biomarcadores séricos de micotoxinas combinadas.

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