Análisis de micotoxinas en piensos

ANÁLISIS DE MICOTOXINAS EN PIENSOS Josefa Tolosa Profesora Asociada, Universitat de València

L

Desde el punto de vista de la seguridad alimentaria, las micotoxinas más importantes son las aflatoxinas, ocratoxina A, zearalenona, fumonisinas, y tricotecenos

as micotoxinas son sustancias tóxicas producidas por hongos micotoxigénicos en productos

agrícolas, principalmente cereales.

Vías de entrada de las micotoxinas Ingestión

Inhalación

Absorción cutánea

Efectos de las micotoxinas Producen efectos adversos sobre la salud del hombre y de los animales Hígado

Riñón

Sistema nervioso

AFECTAN

Sistema endocrino

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Sistema inmunitario

Figura 1. Exposición a micotoxinas a través de la ingesta en humanos y animales (Tolosa, 2017)

Alimentación animal Piensos a base de cereales y otras materias primas

Alimentación humana Micotoxinas en alimentos destinados a alimentación humana (cereales, pasta, frutos secos...)

Los cereales constituyen la materia prima principal en la formulación de los piensos,

Productos de origen animal Micotoxinas en productos derivados de animales con piensos contaminados

Uno de los problemas de gran interés es la presencia de micotoxinas en piensos, ya que éstas pueden transferirse a tejidos y productos derivados (carne, leche, huevos) de los animales alimentados con piensos contaminados (Figura 1).

(Santos et al., 2011), por lo que las micotoxinas se han convertido en uno de los grandes retos del sector ganadero, afectando también a otros eslabones de la cadena, como almacenistas,

La seguridad alimentaria es un gran reto del sector ganadero al afectar a la salud animal y, a su vez, a la cadena alimentaria

fabricantes y ganaderos.

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La obligación de aplicar los límites reglamentarios establecidos ha impulsado el desarrollo de técnicas analíticas para el análisis de micotoxinas en alimentos y piensos que cumplan con los sistemas de control y requerimientos de calidad establecidos.

Métodos inmunoquímicos

Métodos rápidos de detección El principio de funcionamiento de estos métodos es la reacción antígeno-anticuerpo, siendo el antígeno una micotoxina modificada, que una vez producida se convierte en una señal que permite la cuantificación de ésta.

El principal inconveniente de los

Desventajas

Entre los métodos rápidos se incluyen aquellos métodos cualitativos o semicuantitativos que permiten un análisis rápido, económico, con bajo componente instrumental y sencillo de manejar,

métodos inmunoquímicos reside en que legalmente los positivos han de confirmarse por técnicas con mayor selectividad, como la espectrometría de masas (EM).

empleados principalmente para realizar un screening de un gran número de muestras

La mayoría de los métodos rápidos

Inmunoensayos

(González-Sapienza & Venancio, 2011).

La técnica más empleada es el Ensayo de Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA) competitivo directo (Figura 2), comercializada en forma de kits compuestos

son ensayos inmunoquímicos

de microplacas cubiertas con el anticuerpo

basados en el empleo de

de la micotoxina, reactivos y estándares

anticuerpos como elementos de

necesarios para realizar el análisis.

reconocimiento específico de la micotoxina diana, utilizados rutina en las fábricas de pienso.

Permiten una importante simplificación

Ventajas

comúnmente como análisis de

de la etapa de preparación de las muestras, ya que requieren pequeños volúmenes de muestra y procedimientos de purificación más sencillos.

Método rápido, simple, específico y

Desventajas

cuantitativo.

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La aparición de reacciones cruzadas con micotoxinas del mismo grupo o las interferencias con la matriz.

Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas se basa en la capacidad de un anticuerpo específico para distinguir la estructura tridimensional de una micotoxina determinada.

La técnica requiere de una extracción sencilla de la muestra con un disolvente.

Tras el desarrollo del kit, se genera una reacción colorimétrica inversamente proporcional a la concentración de micotoxina en la muestra, medida por el lector de ELISA a una absorbancia de 450 nm.

Figura 2. Esquema del análisis de micotoxinas mediante ELISA competitivo (Ortiz et al., 2014)

Mycotoxin-enzyme conjugate Mycotoxin Anti-mycotoxin antibody Substrate

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Inmunoensayos basados en membranas Ensayo Flow-through/Lateral flow test

Figura 3. Ensayo Flow-through

Bloque de conjugado Bloque de muestra

Línea control

Línea test

Membrana

Bloque adsorbente

Base adhesiva

Se trata de un ELISA competitivo directo que consiste en tiras compuestas de un bloque donde se coloca la muestra, otro donde está el conjugado, una membrana, un bloque adsorbente y una base adhesiva, en la que el anticuerpo anti-micotoxina se une a la superficie de una membrana (Figura 3).

Es un método semicuantitativo, muy sencillo, rápido y estable, siendo una técnica muy útil para tomar decisiones a pie de campo o de fábrica.

Extracción mediante columnas de inmunoafinidad Las columnas de inmunoafinidad han sido comúnmente empleadas por su facilidad de uso y su alta selectividad (Figura 4).

Ventajas

Destacan la elevada especificidad, requiere extractos iniciales poco limpios y ofrece altas recuperaciones y pureza de los extractos. Sin embargo, no son reutilizables y presentan un coste relativamente elevado.

Aunque el método de columnas de inmunoafinidad fue originalmente desarrollado para la cuantificación mediante fluorometría, en la actualidad las columnas han sido utilizadas para la purificación y concentración de las micotoxinas para su detección posterior mediante cromatografía líquida y/o gaseosa.

Adición del extracto a analizar

Acondicionamiento previo de las columnas

Tras este lavado, las micotoxinas se eluyen mediante la adición de un disolvente que provoca la desnaturalización de los anticuerpos (Soriano et al., 2007).

Figura 4. Esquema de empleo de columnas de inmunoafinidad

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La micotoxina se une específicamente a los anticuerpos monoclonales presentes en la columna, mientras que el resto de compuestos son eliminados mediante adición de un líquido de lavado.

Técnicas cromatográficas

Métodos instrumentales Cromatografía líquida de alta resolución

Cromatografía de gases

La cromatografía líquida de alta resolución

Por lo que respecta a la cromatografía de

(HPLC) constituye la técnica de elección para

gases (GC), su empleo es menos común

el análisis de micotoxinas, o para confirmación

debido a que la mayoría de las micotoxinas

de resultados positivos por ELISA, ya que son

no son suficientemente volátiles y, por

sensibles, reproducibles, exactos y presentan

lo tanto, tienen que ser derivatizadas,

un mayor grado de automatización.

incrementando el tiempo de análisis.

Las técnicas espectrométricas de absorción y emisión más empleadas son la detección ultravioleta (UV) y la fluorescencia (FL), siendo preferible esta última cuando las micotoxinas presentan fluorescencia natural.

No obstante, el acoplamiento de HPLC a detectores de MS ha permitido el desarrollo

El principal grupo de micotoxinas analizadas mediante GC son los tricotecenos, obteniéndose límites de detección y coeficientes de variación adecuados previa reacción de silanización (Rodríguez-Carrasco et al., 2012; Escrivá et al., 2016).

de nuevas metodologías para la detección y cuantificación de micotoxinas y el establecimiento de métodos multirresiduo, que abarcan micotoxinas de diferentes familias, convirtiéndose en uno de los métodos de elección para llevar a cabo análisis multi-micotoxina (Tolosa, 2017).

Todo esto, unido a los bajos límites de cuantificación y sobre todo al hecho de que permite confirmar la presencia de micotoxinas de forma inequívoca está haciendo que esta técnica se esté

El empleo de las técnicas cromatográficas requiere de una preparación previa de la muestra, empleándose diferentes métodos de extracción y purificación dependiendo de las micotoxinas a analizar y de la matriz alimentaria, como por ejemplo las columnas de inmunoafinidad u otros procedimientos basados en la extracción sólido-líquido (Quechers, DMFS, etc.) o líquido-líquido (DLLME).

considerando cada vez más como la mejor

El coste del equipo y de su mantenimiento

opción para el análisis de micotoxinas.

es elevado y se requiere de un alto grado de preparación del analista, por lo que estas técnicas no son empleadas como primera opción a nivel de campo o fábrica cuando se requieren resultados rápidos, sino más bien como técnicas de confirmación y/o cuantificación.

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