BÁO CÁO KHÓA LUẬN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO DƯỢC LIỆU TỪ NẤM LINH CHI

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO DƯỢC LIỆU

vectorstock.com/27117080

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO DƯỢC LIỆU TỪ NẤM LINH CHI WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

iii

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA HỌC

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH HÓA

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO DƯỢC LIỆU TỪ NẤM LINH CHI

Cán bộ hướng dẫn: TS Phạm Văn Vượng Sinh viên Lớp

: Lê Văn Phúc : 15CHD1

Đà Nẵng – Năm 2019

iii

LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Trước hết, xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban đã tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận. Cám ơn các thầy cô Khoa Hóa Học đã quan tâm dìu dắt và truyền kiến thức cho tôi trong 4 năm học vừa qua.

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Văn Vượng đã hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong các phòng thí nghiệm đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thí nghiệm tại trường.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên và khích lệ tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận.

Đà Nẵng, ngày 16 tháng 4 năm 2019 Sinh viên

Lê Văn Phúc

iv

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu

Giải nghĩa

CTCT

Công thức cấu tạo

DĐVN V

Dược điển Việt Nam V

EtOH

Ethanol

LC

Linh Chi

MeOH

Methanol

PL

Phụ lục

PTN

Phòng thí nghiệm

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TT

Thuốc thử

VN

Việt Nam

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 1

Độ ẩm của dược liệu thô Linh chi

30

Bảng 2

Tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu thô Linh chi

31

Bảng 3

Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu thô nấm

31

Linh chi Bảng 4

Bảng kết quả định tính các chất có trong dược liệu

32

nấm Linh chi Bảng 5

Bảng kết quả định lượng các chất có trong nấm Linh

33

Chi Bảng 6

Độ ẩm của cao đặc Linh chi

35

Bảng 7

Kết quả định tính các chất có trong cao dược liệu nấm

35

Linh Chi Bảng 8

Hàm lượng tro toàn phần của cao dược liệu LC

36

Bảng 9

Tỷ lệ tro không tan trong acid cao dược liệu LC

36

Bảng 10

Tỷ lệ cắn không tan trong nước của cao dược liệu LC

36

vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình

Tên hình

Trang

Hình 1

Nấm LC trong tự nhiên

8

Hình 2

Nấm LC được trồng nhân tạo

8

Hình 3

Chu kì phát triển của nấm Linh chi

10

Hình 4

Lanosterol

12

Hình 5

Acid gannoderic B

12

Hình 6

Lucidaciol

12

Hình 7

Lucidenic A

12

Hình 8

Nồi chiết nấm Linh Chi

16

Hình 9

Nồi cô dược liệu

16

Hình 10

Nấm Linh Chi sau khi thái mỏng, phơi khô

29

Hình 11

Bột dược liệu nấm Linh Chi

30

Hình 12

Soi màu cao đặc LC

33

Hình 13

Cao đặc nấm LC

33

vii

MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................... 3 1.1.

TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH KHẢO SÁT DƯỢC LIỆU VÀ XÂY DỰNG

TIÊU CHUẨN CAO DƯỢC LIỆU ................................................................................ 3 1.1.1.

Cách thức xây dựng tiêu chuẩn ..................................................................... 3

1.1.2.

Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nói chung ...................................... 4

1.2.

TỔNG QUAN VỀ CAO DƯỢC LIỆU ................................................................ 6

1.2.1.

Định nghĩa ..................................................................................................... 6

1.2.2.

Phân loại ........................................................................................................ 6

1.3.

TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI ................................................................... 7

1.3.1.

Đặc điểm thực vật .......................................................................................... 7

1.3.1.1.

Khái quát về nấm Linh Chi ..................................................................... 7

1.3.1.2.

Vị trí phân loại của nấm Linh chi ........................................................... 8

1.3.1.3.

Đặc điểm hình thái, phân bố và chu trình sống ...................................... 8

1.3.2.

Thành phần hóa học ..................................................................................... 10

1.3.2.1.

Polisaccharid ......................................................................................... 10

1.3.2.2.

Triterpenoid .......................................................................................... 11

1.3.3.

Tác dụng sinh học ........................................................................................ 12

1.3.3.1.

Công dụng, chỉ định và phối hợp trong dân gian.................................. 12

1.3.3.2.

Tác dụng dược lý đã được nghiên cứu.................................................. 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 16 2.1.

NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ ......................................................................... 16

2.1.1.

Nguyên vật liệu ............................................................................................ 16

2.1.1.1.

Dược liệu Nấm Linh Chi ...................................................................... 16

2.1.1.2.

Chiết xuất và phân đoạn cao đặc dược liệu Linh chi ............................ 16

2.1.2.

Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 17

2.1.3.

Hóa chất ....................................................................................................... 17

2.1.4.

Trang thiết bị, dụng cụ ................................................................................. 17

2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 18

2.2.1.

Khảo sát và đánh giá một số chỉ tiêu của nguyên liệu thô nấm Linh chi. ... 18

viii

2.2.1.1.

Mô tả ..................................................................................................... 18

2.2.1.2.

Bột ......................................................................................................... 18

2.2.1.3.

Mất khối lượng do làm khô .................................................................. 18

2.2.1.4.

Tro toàn phần ........................................................................................ 19

2.2.1.5.

Tro không tan trong acid ....................................................................... 20

2.2.1.6.

Định tính ............................................................................................... 20

2.2.2.

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao đặc dược liệu từ nấm Linh Chi ................. 23

2.2.2.1.

Tính chất ............................................................................................... 24

2.2.2.2.

Mất khối lượng do làm khô .................................................................. 24

2.2.2.3.

Độ PH ................................................................................................... 24

2.2.2.4.

Định tính ............................................................................................... 25

2.2.2.5.

Tro toàn phần ........................................................................................ 26

2.2.2.6.

Tro không tan trong acid ....................................................................... 26

2.2.2.7.

Cắn không tan trong nước..................................................................... 27

2.2.2.8.

Kim loại nặng (Pb) ................................................................................ 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 29 3.1.

KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU THÔ NẤM LINH CHI ...................................... 29

3.1.1.

Mô tả ............................................................................................................ 29

3.1.2.

Bột................................................................................................................ 30

3.1.3.

Mất khối lượng do làm khô ......................................................................... 30

3.1.4.

Tro toàn phần ............................................................................................... 31

3.1.5.

Tro không tan trong acid ............................................................................. 31

3.1.6.

Định tính ...................................................................................................... 31

3.1.7.

Định lượng ................................................................................................... 33

3.2.

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO ĐẶC DƯỢC LIỆU CHO NẤM

LINH CHI. .................................................................................................................... 33 3.2.1.

Tính chất: ..................................................................................................... 33

3.2.2.

Mất khối lượng do làm khô ......................................................................... 34

3.2.3.

Độ PH .......................................................................................................... 34

3.2.4.

Định tính ...................................................................................................... 34

3.2.5.

Tro toàn phần ............................................................................................... 35

ix

3.2.6.

Tro không tan trong acid: ............................................................................ 35

3.2.7.

Cắn không tan trong nước. .......................................................................... 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 36 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................... 38

1

MỞ ĐẦU

Ngày nay trên thế giới, xu hướng tìm kiếm và sử dụng các sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên ngày càng tăng. Con người có khuynh hướng sử dụng nhiều thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên vì tính hiệu quả và an toàn của nó đối với cơ thể con người, nó có thể sử dụng thường xuyên và hằng ngày. Việt Nam chúng ta là một nước có thảm thực vật phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loài dược liệu quý. Nhân dân ta vốn có kinh nghiệm lâu đời trong việc dùng thảo dược. Nhiều cây thuốc đã được nghiên cứu kỹ càng về thành phần hóa học, cơ chế tác dụng chữa bệnh và được tiêu chuẩn hóa. Tuy nhiên, trong thực tế, nhiều cây thuốc chữa bệnh trong nhân gian cho đến ngày nay vẫn chưa được nghiên cứu một cách cụ thể và đầy đủ.

Nấm Linh Chi (Ganoderma Lucidum) từ xa xưa đã được xem như là dược liệu quý hiếm sử dụng lâu đời, đặc biệt trong điều trị suy nhược thần kinh, mất ngủ, các bệnh về tim mạch, ung thư, thất khớp, tiểu đường, viêm gan (1) (2)…. Ở Trung Quốc, nấm Linh Chi được xem như “thần dược” giúp kéo dài tuổi thọ, ngăn ngừa lão hóa, tăng sức dẻo dai cho cơ thể (2). Với những tính năng và công dụng phong phú của nó đối với sức khỏe, nấm Linh chi được sử dụng không chỉ phổ biến ở các nước phương Đông mà còn khá được ưa chuộng ở các nước phương Tây. Tuy nhiên, cho tới nay những nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý của loài này vẫn còn hạn chế ở VN. Hầu như chưa có tiêu chuẩn đầy đủ nào để làm thước đo đánh giá chất lượng của cao dược liệu này; xây dựng một tiêu chuẩn để định danh, chống nhầm lẫn và xác định được các thành phần có tác dụng dược lý trong dược liệu là việc làm rất cần thiết và không chỉ dùng nó hằng ngày như trước đây với tác dụng là làm thực phẩm chức năng hay làm thuốc đơn thuần mà dựa vào đó tạo tao những sản phẩm mới lạ, mang tính công nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao.

Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật và công nghệ, các dược liệu được tổng hợp được ứng dụng rộng rãi và sử dụng ngày càng nhiều. Vì vậy, để phát huy tiềm năng của nguồn dược liệu đáp ứng yêu cầu chăm sóc sức khỏe nhân dân, làm tiền đề tiếp túc tục nghiên cứu và phát triển tạo ra

2

những sản phẩm có tính ứng dụng cao chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và chiết xuất dược liệu nấm Linh Chi thành dạng cao đặc. Một trong số đó là vấn đề khảo sát (hoặc xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu) và xây dựng các tiêu chuẩn cơ sở cho các sản phẩm cao dược liệu. Đây cũng là một yếu tố cấp bách đối với các nhà hóa dược. Để có thể sử dụng dược liệu làm nguyên liệu làm thuốc hoặc tạo ra các sản phẩm sử dụng rộng rãi thì đòi hỏi cần phải xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng, đồng thời xây dựng các phương pháp thử để đánh giá các tiêu chuẩn đó. Từ những lý do trên, tôi nhận thấy Linh Chi là một loại dược-thực phẩm quý cần được nghiên cứu và phát triển. Để có thể tận dụng được nguồn dinh dưỡng cũng như các dược tính quý của nấm Linh Chi, góp

phần đa dạng hóa các

sản phẩm, nâng cao giá trị thương mại của nấm Linh Chi. Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây và dựng tiêu chuẩn cơ sở cao dược liệu từ nấm Linh Chi” với các mục tiêu sau: 1. Khảo sát được một số tiêu chuẩn của dược liệu thô nấm Linh Chi. 2. Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cao đặc dược liệu từ cây nấm Linh Chi.

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.

TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH KHẢO SÁT DƯỢC LIỆU VÀ

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO DƯỢC LIỆU Hiện nay, các nghiên cứu về dược liệu đang được chú trọng và phát triển.

Tuy nhiên trong báo cáo, Cục Quản lý Y, Dược cổ truyền đã đưa ra những con số báo động, hàng năm, ngành dược Việt Nam sử dụng khoảng 60.000 tấn dược liệu các loại, trong đó có khoảng 80-85% nhập khẩu (chủ yếu nhập từ Trung Quốc). Như vậy, hiện nay mới chỉ có khoảng 1.400 tấn dược liệu nhập khẩu có nguồn gốc rõ ràng là rất ít so với nhu cầu sử dụng dược liệu hiện nay. Qua đây có thể thấy tình hình dược liệu vận chuyển lậu đang diễn biến phức tạp. Ngoài số liệu dược liệu không rõ nguồn gốc thì hiện người tiêu dùng cũng đang phải đối mặt với những nguy cơ sử dụng các loại dược liệu kém chất lượng, giả. Việc thông quan dược liệu qua cửa khẩu còn rất nhiều hạn chế. Tại các cửa khẩu, cán bộ hải quan chỉ kiểm tra được số lượng, trọng lượng bao hàng, không kiểm tra được chất lượng các dược liệu do việc xây dựng các tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu còn hạn chế và một số các loại dược liệu còn chưa có tiêu chuẩn nào cụ thể (3) (4) Từ đó thông qua việc khảo sát nguyên liệu thô có thể đánh giá được khách quan nguồn nguyên liệu đầu vào và thông qua việc đánh giá này nó được xem như là một tiêu chuẩn mới cho nguyên liệu thô, góp phần vào việc nâng cao tiêu chuẩn của dược liệu nấm Linh Chi từ đó có thể tạo ra được những sản phẩm cao chất lượng hơn.

1.1.1.

Cách thức xây dựng tiêu chuẩn Tiêu chuẩn cơ sở được xây dựng dựa trên các kết quả của một hay nhiều

quá trình, dựa trên việc nghiên cứu khoa học và công nghệ, tiến bộ về mặt kỹ thuật, kinh nghiệm của người nghiên cứu cũng như nhu cầu và khả năng thực tiễn. Các tiêu chuẩn quốc gia tương ứng được khuyến khích sử dụng để xây dựng hoặc chấp nhận thành tiêu chuẩn cơ sở.

4

1.1.2.

Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nói chung

❖ Tiêu chuẩn cơ sở có thể được xây dựng theo những phương thức cơ bản sau: Chấp nhận tiêu chuẩn quốc gia, tiêu chuẩn khu vực hoặc tiêu chuẩn nước ngoài tương ứng thành tiêu chuẩn cơ sở. Ví dụ như đối với việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu ta tham khảo Dược điển VN V hoặc các Dược điển nước ngoài như: Dược điển Anh, Mỹ, Trung Quốc làm tài liệu tham chiếu.

Sửa đổi, bổ sung tiêu chuẩn cơ sở hiện hành.

Xây dựng mới tiêu chuẩn cơ sở cho cao dược liệu trên cơ sở sử dụng các kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, các kết quả thử nghiệm, đánh giá, phân tích và thực nghiệm. Đây chính là phương pháp mà bài báo cáo khóa luận này tôi muốn hướng tới để xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cao dược liệu từ nấm Linh Chi. Đồng thời dựa trên cơ sở các quy định tại Dược điển Việt Nam và các văn bản pháp luật liên quan (3) (5). ❖ Thông thường sẽ dựa vào các phương pháp sau để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở: Phương pháp cảm quan: bằng sự quan sát và những mô tả về hình dạng, kích thước, mầu sắc, mùi vị, các đặc điểm của bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệu hoặc đặc điểm thể chất của vật liệu. Từ đó chúng ta có thể nhận biết được từng vị dược liệu, cao dược liệu hay các sản phẩm từ chúng. Phương pháp này chúng ta có thể xác định sơ bộ được tên, bộ phận dùng, công dụng. Định tính: là những phương pháp dùng để nhận biết dược liệu bao gồm các kinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học hay các phương pháp lý hóa.

Nhận biết dược liệu dựa theo kinh nghiệm bằng phương pháp đơn giản và truyền thống như sự chìm hay nổi trong nước, tiếng nổ, màu của ngọn lửa hay khói và mùi khi đốt cháy dược liệu… Định tính dược liệu bằng phương pháp vi học, bao gồm: • Vi phẫu: Cấu tạo giải phẫu của các cơ quan thực vật là một đặc điểm quan trọng trong kiểm nghiệm dược liệu. Trong phần lớn các trường hợp, hình dạn và cấu trúc của vách tế bào có ý nghĩa quan trọng nhất trọng nhất trong khảo sát vi học.

5

• Soi bột: mỗi một dược liệu đều có đặc điểm mô học đặc trưng, chúng được thể hiện một phần qua bột dược liệu. Khảo sát bột dược liệu bằng kính hiển vi để tìm ra những đặc điểm vi học đặc trưng của bột dược liệu, có vai trò trong việc định danh, xác định độ tinh khiết, phân biệt dược liệu này với dược liệu dễ nhầm lẫn, phát hiện giả mạo nếu có và xây dựng tiêu chuẩn dược liệu.

• Định tính lý học là việc xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất, năng suất quay cực… của các dược liệu.

• Định tính hóa học là phép thử một vài thành phần trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học. Phương pháp tiến hành được trình bày ở các chuyên luận dược liệu cụ thể.

• Định tính sắc ký là việc sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao… để phát hiện một số thành phần có trong dược liệu; so sánh với chất chuẩn hay thành phần trong dược liệu chuẩn.

• Định tính huỳnh quang là quan sát sự phát huỳnh quang của bề mặt hay mặt cắt dược liệu hoặc của dịch chiết dược liệu ở điều kiện thường hay sau khi cho tác dụng với acid, kiềm hay thuốc thử. Trừ khi có quy định riêng trong chuyên luận, mẫu thử được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách nguồn sáng khoảng 10 cm.

• Định tính vị thăng hoa thường được tiến hành như sau: Đặt một vòng kim loại đường kính khoảng 2 cm, cao khoảng 8 mm lên một tấm kim loại mỏng có kích thước hơi lớn hơn. Trải một lớp mỏng bột dược liệu trong vòng kim loại và đậy kín bằng một phiến kính bên trên có đặt một miếng bông tẩm nước lạnh. Đặt tấm kim loại đã có dược liệu này lên một lưới amiant có 1 lỗ tròn đường kính khoảng 2 cm sao cho vòng kim loại có dược liệu nằm trên lỗ này. Đun nóng nhẹ phía dưới lỗ cho đến khi bột dược liệu bị cháy sém. Nhấc phiến kính ra và để nguội. Quan sát hình dạng và màu sắc của tinh thể chất được thăng hoa đọng lại trên phiến kính bằng kính hiển vi và/hoặc tiến hành phản ứng hóa học thích hợp đối với chất đã được thăng hoa.

• Thử tinh khiết: là cách kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu, có thể bao gồm một số hay tất cả các chỉ tiêu sau:

6

o Mất khối lượng do làm khô. oTro toàn phần và tro không tan trong acid hydrochloric. oCác tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến màu, hư thối. oTỉ lệ vụn nát của dược liệu. oHàm lượng kim loại nặng. oDư lượng các chất bảo vệ thực vật. oXác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác).

• Định lượng: là việc xác định hàm lượng một hay một số chất có trong dược liệu bằng phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học. Định lượng bao gồm cả việc xác định hàm lượng chất béo, tinh dầu và xác định hoạt lực bằng các phép thử sinh học.

1.2.

1.2.1.

TỔNG QUAN VỀ CAO DƯỢC LIỆU Định nghĩa Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy

định các dịch chiết thu được từ dược liệu, thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp.

Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp). Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men làm phân hủy hoạt chất cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách dùng hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác.

1.2.2.

Phân loại Cao thuốc được chia làm 3 loại: Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử

dụng trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai). Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc.

Cao đặc: Là khối đặc quánh. Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20%.

7

Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%. Dịch chiết được cô đặc đến khi độ ẩm còn lại không quá 20% ta được cao đặc. Trong trường hợp điều chế cao khô, tiếp tục sấy khô để độ ẩm còn lại không quá 5%. Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 80o C. Nếu không có các thiết bị cô đặc và sấy dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt độ không quá 80oC (5) (6).

1.3.

TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI

1.3.1.

Đặc điểm thực vật

1.3.1.1. Khái quát về nấm Linh Chi Chi Ganoderm thế giới có trên 250 loài. Trong đó, loài được sử dụng nhiều nhất cho đến thời điểm hiện tại để chăm sóc sức khỏe là nấm Linh chi Ganoderma luccidum (7).

Nấm Linh Chi có tên khoa học là Ganoderma Lucidum. Gọi theo tên Trung Quốc là Lingzhi, theo tiếng Nhật Bản là Reishi, ở Việt Nam thì có tên gọi là nấm Linh chi, nấm Tiên thảo hay nấm Trường Thọ (1) (8). Trong số nhiều tên gọi khác nhau như Chi Linh, Mộc Chi Linh, Linh chi.. thì tên Linh chi là tiêu biểu và mang tính lịch sử. Trong sách “Thần Nông Bản Thảo” ra đời cách đây hơn 2000 năm, tên này đã chính thức được sử dụng (8).

Nấm Linh chi thường sống trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu có chất sơ, phát triển mạnh trong điều kiện nóng và ẩm, và nhiều giống hoang dã được tìm thấy ở các vùng cận nhiệt đới của Phương Đông. Từ đầu những năm 1970, nấm Linh Chi đã trở thành một nguồn chính của nấm. Hiện nay nấm Linh Chi đã được trồng trọt nhân bằng cách sử dụng các chất nền như mùn cưa, gỗ...

(9) Giá trị dược liệu của Linh chi được ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc, cách đây hơn 4,000 năm (10). Trong sách Thần nông bản thảo cách đây khoảng 2,000 năm thời nhà Châu và sau đó được học giả nổi tiếng Trung Quốc Lý Thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi” với các tính chất và công dụng khác nhau gồm 6 loại:

8

Thanh chi (xanh) vị toan bình. Giúp cho sáng mắt, giúp cho an thần, bổ can khí, nhân thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng và thoải mái.

Xích chi hoặc Hồng chi (đỏ), có vị đắng, ích tâm khí, chủ vị, tăng trí Hắc chi (đen) ích thận khí, khiến cho đầu óc sản khoái và tinh tường.

Bạch chi (trắng) ích phế khí, làm trí nhớ lâu.

Hoàng chi (vàng) ích tì khí, trung hòa, an thần.

Tử chi (tím đỏ) bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, da tươi đẹp.

1.3.1.2. Vị trí phân loại của nấm Linh chi Nấm Linh chi được phân loại như sau (8) (11): Giới nấm: Fungi Ngàn nấm đảm: Eumycota Lớp nấm đảm: Basidiomycota Bộ nấm đa tầng: Polyporales Họ nấm Linh chi: Ganodermataceae Chi: Ganoderrma Loài : Ganoderma Lucidum 1.3.1.3. Đặc điểm hình thái, phân bố và chu trình sống a. Đặc điểm hình thái

Hình 1: Nấm LC trong tự nhiên

Hình 2: Nấm LC được trồng nhân tạo

Nấm hóa gỗ, sông một năm hay lâu năm (1).Quả thể có cuống dài, ngắn hay hầu như không có cuống và mũ đính lệch hay đính bên, màu nâu đỏ, bóng nhoáng. Mũ nấm mới sinh có dạng cục lồi, tròn; sau khi phát triển có dạng thận, dạng bán cầu, dạng quạt, có khi hầu như tròn. Mặt trên mũ nấm có những vân tròn đồng tâm, lượn sóng nhiều hay ít, hay có vân răng dạng phóng xạ (11). Mặt

9

dưới màu nâu nhạt mang các ống rất nhỏ chứa bào tử (1). Mép nấm nhỏ hoặc hơi tù, lượn sóng; hơi chia thùy ở những mũ nấm có kích thước lớn (11).

Mũ mới sinh có màu trắng và có sắc thái vàng lưu huỳnh; sau chuyển sang màu vàng, vàng rỉ sắt, nâu, nâu đỏ, nâu hồng tím… tạo nên một lớp vỏ bóng nhoáng như quét sơn hoặc quét vecni. Kích thước mũ 2-2,5 x 3-30 cm; dày 0,5 đến 2 cm (11).

Cuống nấm thường đính trên phần lõm vào của mũ nấm. Cuống mới hình thành màu trắng, sau chuyển sang vàng, vàng nâu... và phủ vỏ bóng, có màu sắc và cấu trúc tương tự mũ nấm. Cuống hình trụ, gần như tròn hoặc hơi dẹp, kích thước 1-20 x 0,5-4 cm (11).

Bào tử hình bầu dục hoặc hình trứng, cụt đầu, màu gỉ sắt, có một mấu lồi và nhiều gai nhọn. Toàn cây nấm màu nâu đỏ, đỏ vàng hoặc nâu đen (1). b. Phân bố, sinh thái Nấm Linh chi là loài phân bố khắp nơi trên thế giới. Nấm mọc trên gốc, rễ cây sống và cây đã chết, trên rất nhiều gỗ mọc trong rừng và công viên, như cây ăn quả, đặc biệt là cây thuộc bộ Đậu như lim xanh, lim vàng, phượng vĩ,..

(11). Có thể tìm thấy Linh chi ở hầu hết các tỉnh vùng núi, từ Lào Cai đến Lâm Đồng. Ở các vùng rừng trước kia có nhiều cây lim bị khai thác, trên các gốc hoặc thân, cành còn lại đều có thấy nấm mọc vào mùa mưa ẩm như vùng rừng thuộc lâm trường Hương Sơn, tỉnh Hà Tĩnh; vùng rừng thuộc vườn quốc gia Bến En, tỉnh Thanh Hóa và Tam Đảo (Vĩnh Phúc)... (1).

Nấm Linh chi sinh sống chủ yếu bằng bào tử nằm phía dưới của thể quả.

Phần có chức năng sinh dưỡng chính là hệ sợi của nấm mọc ẩn trong gỗ mục hoặc đất. Hiện nay hầu hết các nước đã nghiên cứu và trồng được nấm Linh chi trên giá thể nhân tạo để dùng là thuốc (1). c. Chu trình sống Chu trình sống của nấm (9)được thể hiên qua sơ đồ sau đây:

10

Hình 3: Chu kì phát triển của nấm Linh chi A: Thể quả; B: Mặt ngoài phiến nấm; C: Đảm; D: Sự phối nhân trong đảm; E: Đảm và bào tử đảm; F: Bào tử đảm nảy mầm; G: Sợi nấm đơn nhân; H: Sự phối chất của 2 sợi nấm đơn nhân; I: Sợi nấm song nhân.

1.3.2.

Thành phần hóa học Cho đến nay các nhà khoa học đã tìm ra trong nấm Linh Chi có các hoạt

chất quý như triterpenoid, polisaccharide, peptid, steroid, khoáng chất (7), acid béo no và không no (12), protein, nucleosid (13), ergosterol (2). Và các vitamin.

Hầu hết, nấm Linh chi tưới chứa khoảng 90% nước theo trọng lượng, 10% còn lại gồm protein 10-40%, 2-8% chất béo, 3-28% carbohydrat, 3-32% chất xơ, 810% tro, và một số vitamin và khoáng chất chính như: kali, canxi, photpho, magie, sắt, kẽm, đồng,…

Trong số các thành phần hóa học của nấm Linh có thi thì polisaccharide và triterpenoid được chú hơn cả và được xem là thành phần chính vì tác dụng sinh học đáng kể của chúng (14) (15) (16). Tuy nhiên, số lượng và tỷ lệ phần trăm từng thành phần có trong sản phẩm tự nhiên và thương mại, đã được chứng minh bằng số liệu trong nhiều nghiên cứu (17).

1.3.2.1. Polisaccharide Các polisaccharide được phân lập từ bào tử, thể quả và sợi nấm hoặc tách từ dung dịch môi trường nuôi nấm (15).

Polisaccharide là những thành phần có hàm lượng cao (có thể tới 45%) của nấm Linh Chi (7) gồm các polisaccharide trung tính (β-1-> 3, β-1 -> 6 hôm

11

D-glucan) (18); glucan có tính acid và polyglycan; heteroglucan liên kết protein; arabinoxyglucan (một heteroglucan phân nhánh cao); heteroglucan với liên kết β-1->4 và peptidoglucan (ganoderan A,B và C ) (19). Dây nối (1-3)-β-D-glucan làm cho mạch polisaccharid có dạng xoắn tương tự như tinh bột. (1-3)- β-Dglucan tan trong nước no ngs và tan 1 ít trong nước lạnh. Dung dịch nước của (1-3)-β-D-glucan ở nồng độ cao có độ nhớt (7).

Các β-glucan trong thể quả của Linh chi có thể có cùng khối lượng phân tử nhưng khác nhau về mực độ phân nhánh. Khối lượng phân tử các chất nà vào khoảng 1.050.000 đvc. Dây nhánh trong β-glucan của Linh chi thường là 1->6 .

Tỉ lệ nhánh thay đổi từ 1/3–1/23. Các heteropolisacharide trong Linh chi cấu tạo bởi các đường D–glucose, D–galatose, D–mannose, D–xylose hay L-fucose (7).

1.3.2.2. Triterpenoid Terpen là hợp chất tự nhiên mà bộ khung cơ bản của nó bao gồm 1 hay nhiều đơn vị isopren C5. Triterpenoid là một phân lớp của nhóm terpen có cấu trúc khung C30. Cấu trúc hóa học của triterpenoid trong nấm Linh chi dự trên lanosterol, là một chuyển hóa của lanosterol. Các triterpenoid đã nhận được sự chú ý đáng kể do tác dụng dược ly nổi bật của chúng.

Trong phần không phân cực của thể quá có các triterpenoid tự do với hàm lượng có thể tới 3-5%. Các chất chính là các acid ganoderic A, B, V, D, F, H, I, J, K, L, M, R, S, T, V, X, Y, Z, W; lucidenic A, B, C, D, I, ganoderan A, B, C và lucidenol A, B, C. Các triterpen khác bao gồm ganoderol A và B, acid ganodernic A-D, acid ganodermic. Một số triterpenoid như acid ganoderic A, C, I, J; acid lucidenic A, D, I và lucidon A và C làm cho Linh chi có vị đắng, khác với các loại nấm khác (7).

Acid ganoderic A và acid ganoderic B là hai chất thuộc triterpenoid được phân lập lần đầu từ Linh chi vào năm 1982 (20) Cho đến nay người ta phát hiện có hơn 150 triterpenoid được xác định trong quả thể, bào tử và hệ sợi 23 và được phân thành năm nhóm cấu trúc chính (20). Các acid ganoderic A, B, H chỉ được phát hiện trong quả thể, trong khi các acid ganoderic R, S, T là các triterpenoid chính trong sợi nấm.

12

Hàm lượng triterpenoid là khác nhau ở các bộ phận khác nhau và ở các giai đoạn phát triển của nấm. Sự khác nhau của các triterpenoid có thể được sử dụng để phân biệt dược liệu này với các loài khác gần tương tự và sử dụng như một tiêu chuẩn để đáng giá chất lượng của các mẫu Linh chi khác nhau (2) (21).

Dưới đây là cấu trúc hóa học của một số hợp chất hóa học trong nấm Linh chi:

Hình 4: Lanosterol

Hình 6: Lucidaciol

1.3.3.

Hình 5: Acid gannoderic B

Hình 7: Lucidenic A

Tác dụng sinh học

1.3.3.1. Công dụng, chỉ định và phối hợp trong dân gian Trong nhân gian nấm linh chi được sử dụng để: Tăng cường trí nhớ và chức năng hô hấp, chống lão hóa, làm tăng tuổi thọ; an thần, giảm đau, chống oxy hóa, bảo vệ gan, chữa trị viêm gan mãn tính, giải độc, hạ đường huyết, cải thiện chuyển hóa dinh dưỡng, điều trị ho do cảm cúm, ho có đờm, chứng giảm bạch cầu, cơn đau thắt ngực, có tác dụng nhất định đến suy nhược thần kinh, suy nhược tim, đau lá lách, đau dạ dày, đau thận, đau nửa đầu, đau mật. Ngày dùng 2

13

gam đến 5 gam, dưới dạng sắc hoặc thuốc bột, hoặc dạng chè tan. Có thể dùng riêng hoặc phối hợp với Nhân sâm (22) (23).

1.3.3.2. Tác dụng dược lý đã được nghiên cứu ❖ Tác dụng chống khối u Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo đã chứng minh Linh chi có khả năng ức chế phát triển của tế bào khối u (Boh, 2013; Wachtel-Galor et al., 2011). Một số ít nghiên cứu lâm sàng chứng minh vai trò của Linh Chi trong chữa trị một số bệnh ung thư. Ví dụ như, phép trị liệu ung thư tuyến tiền liệt sử dụng hỗn hợp các thảo dược chứa Linh chi làm giảm rõ rệt lượng kháng nguyên đặc hiệu trong tuyến tiền liệt (24).

Mặt khác, trong chữa trị ung thư, Linh chi được sử dụng để phòng ngừa nhiễm trùng cơ hội, chống lại tác dụng phụ của các liệu pháp giảm đau, hạn chế việc sử dụng morphine, ngăn ngừa bệnh tái phát, tăng cường sự phục hồi sức khỏe sau phẫu thuật (23) (24).

Nhiều tác giả đã cho thấy hiệu quả tiêu diệt một số tế bào ung thư của polisacharide như tế bào ung thư bạch cầu chuột (L1210) (25), tế bào ung thư bạch cầu người HL-60 (25), tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC-3 Acid ganoderic T (AG –T) phân lập từ nấm Linh Chi có tác dụng ức chế tế bào ung thư xâm thực và di căn trong cơ thể. ❖ Điều biến miễn dịch Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng kích thích hệ miễn dịch của nấm Linh Chi. Theo Roy (2006), trong các liệu pháp bằng thảo dược hiện nay ở phương Tây, Linh chi chủ yếu được dùng như thuốc bổ, đặc biệt là như chất điều biến miễn dịch. Linh chi được dùng để tăng cường chức năng miễn dịch và đề phòng nhiễm trùng cơ hội trong các phác đồ điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV. Nhờ khả năng điều biến miễn dịch và ức chế sự sản sinh histamine, Linh chi cũng có thể được dùng như tác nhân chống viêm trong điều trị hen suyễn và dị ứng. Linh chi cũng được dùng trong điều trị viêm khớp, viêm phế quản dị ứng (22) (23).

14

❖ Tác dụng hạ huyết áp Các thử nghiệm có kiểm chứng trên người cho thấy cao chiết Linh chi có tác dụng (55mg x 3 lần/ngày) sử dụng trong 1 tháng có tác dụng hạ huyết áp rõ rệt so với giá trị cơ bản của những bệnh nhân cao huyết áp không đáp ứng với nifedipine hay với nimodipine, so với placebo. Một số acid genoderic như acid genoderic B, D, F, H phân lập từ nấm Linh chi có tác dụng chống tăng huyết áp, trong đó acid genoderic F có tác dụng mạnh nhất (7). ❖ Tác dụng kháng khuẩn Theo Wasser (2010), gần đây, nhiều nghiên cứu chứng minh G. lucidum có chứa các thành phần kháng khuẩn có khả năng ức chế một số loại vi khuẩn.

Các thành phần dược tính quan trọng (polysaccharide và triterpenoid) trong Linh chi có khả năng ức chế sự nhân bản của HIV, virus viêm gan siêu vi B, virus Herpes, v.v.

Theo một số nghiên cứu, khả năng tăng cường hệ miễn dịch của Linh chi cũng đóng vai trò trong hoạt tính kháng khuẩn và kháng virus. Dù cơ chế vẫn chưa được xác định, Linh chi mở ra một khả năng mới trong sử dụng Linh Chi kèm theo các liệu pháp nhằm giảm tác hại của các loại thuốc kháng khuẩn, kháng virus (26) (23). ❖ Chống oxy hóa, ngăn ngừa lão hóa da: Nhiều thành phần trong Linh chi, đặc biệt là polysaccharide và triterpenoid, thể hiện khả năng chống oxy hóa in vitro. Các hoạt chất trong Linh chi giúp cơ thể tiêu diệt các gốc tự do, chống oxy hóa, từ đó ngăn ngừa ung thư và các bệnh mãn tính khác, nhờ các tác dụng trên mà nấm Linh Chi được sử dụng trong ngành mỹ phẩm với công dụng tạo ra các loại mỹ phẩm trong bảo vệ sắc đẹp như các loại kem, các loại mặt nạ chống lão hóa… (27) (28) Năm 2002, Yon và Lin 69 đã báo cáo phức hợp polysaccharide-peptid gồm 16 loại amino acid có tác dụng chống oxy hóa.

Năm 2005, Nguyễn Thượng Dong và cộng sự tiến hành trên chuột nhắt trắng, nhận thấy cao nước và cao ethanol 80% chiết xuất từ nấm Linh chi có hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình gây viêm bằng CCl4 (29).

15

Nấm Linh chi thể hiện hoạt tính khử gốc superoxid in vitro điển hình ở các cao cồn, cao MeOH… Theo nhóm nghiên cứu của Trần Thị Văn Thi, cao triterpenoid tổng chiết xuất từ nấm Linh chi có tác dụng chống oxy hóa (ức chế 19.94% sự tăng hàm lượng MDA với liều 484 mg cao/kg thể trọng chuột (30).

Cao cồn và cao nước điều chỉnh về mức bình thường hoạt tính GSH-Px trong gan chuột bị gây tổn thương oxy hóa bằng cyclophosphamid (31).

Năm 2015, Yurkiv B và cộng sự tiến hành nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa trên chuột được gây đái tháo đường bằng strepzotocin, đã nhận thấy nấm làm tăng hoạt động của enzym chống oxy hóa. Từ đó giúp ngăn ngừa stress oxy hóa phát triển phát triển trong tế bào bệnh nhân tiểu đường (32).

16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.

2.1.1.

Nguyên vật liệu

2.1.1.1. Dược liệu Nấm Linh Chi Dùng toàn bộ phần thể quả của nấm Linh Chi để làm nguyên liệu nghiên cứu.

Cắt thành lát mỏng, phơi hoặc sấy khô nấm Linh Chi, đóng gói và bảo quản để tiến hành làm thực nghiệm.

2.1.1.2. Chiết xuất và phân đoạn cao đặc dược liệu Linh chi Mẫu nấm Linh Chi sau khi đã được thái thành các lát mỏng và phơi khô (5 kg), sau đó được chia thành 3 phần và mang đi chiết với nước. Quá trình chiết được diễn ra như sau: nấm Linh Chi được cho và một túi vải lọc và được chiết với nước(3x7 lít) trong một nồi chiết áp xuất dành cho dược liệu (1000 C, 6h), dịch chiết sau đó được để qua một đêm để lắng đi các tạp chất có khích thước nhỏ, hoặc các tạp chất tan được trong nước nóng, sau một đêm toàn bộ cắn không tan lắng xuống đáy và sau đó ta tiếp tục lọc qua vải lọc để thu dịch chiết trước khi đêm đi cô thành cao đặc. Toàn bộ dịch chiết được cô đến 1 lượng nhất định (4 lít) trong 1 máy cô dược liệu sau đó được cô cách thủy ở nhiệt độ 80o C để bay hơi dung môi và thu được cao đặc Linh Chi. Cao đặc được bảo quản để nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao đặc Linh Chi

Hình 8: Nồi chiết nấm Linh Chi

Hình 9: Nồi cô dược liệu

17

2.1.2.

Đối tượng nghiên cứu Nấm Linh chi được thu mua tại địa bàn thành phố Đà Nẵng sau đó được

phơi hoặc sấy khô và xay thành bột được đóng gói bảo quản nơi khô ráo để làm thực nghiệm.

Dùng cao đặc đã thu được từ quy trình chiết và cô đặc để làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao đặc Linh chi.

2.1.3.

Hóa chất Các loại thuốc thử dùng trong định tính: thuốc thử anthron, dung dịch

phenol 5%, acid sulfuric đậm đặc, thuốc thử Mayer và Dragendorff Dung môi, hóa chất: chloroform, ethanol 950, NH4OH đậm đặc, HgCl2, EtOH 96o, KI, HCl(đặc, 6N, 2N, 0.1N), Bi(NO3)3, HNO3 30%, NaOH 0.1N, Na2CO3, 2M, n-hexan, ethyl acetate, MeOH, AlCl3, NaOH, H2SO4 đặc, phenol, nước cất 1 lần.

Một số hóa chất khác dùng cho phản ứng: H2SO4, HCl, HNO3, Na2CO3, NaOH 10%, FeCl3 5%, và các hóa chất khác thuộc khoa Hóa trường Đại Học Sư Phạm Đà Nẵng.

2.1.4.

Trang thiết bị, dụng cụ

•

Máy siêu âm.

•

Máy đo pH.

•

Máy ly tâm

•

Cân phân tích.

•

Nồi cách thủy.

•

Lò nung.

•

Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, cốc thủy tinh có

.

mỏ…

•

Các máy xay dược liệu, bếp điện, bếp đun cách thủy, tủ sấy, lò nung, thiết bị đun hồi lưu…

•

Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc Khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.

18

2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.

Khảo sát và đánh giá một số chỉ tiêu của nguyên liệu thô nấm Linh

chi.

Dựa trên các tiêu chí trong Dược điển Việt Nam V về tiêu chuẩn dược liệu ta khảo sát một số chỉ tiêu sau: • Mô tả • Bột • Mất khối lượng do làm khô • Tro toàn phần • Tro không tan trong acid • Định tính • Định lượng 2.2.1.1. Mô tả Dựa vào cảm quan bên ngoài ta chúng ta có thể dùng mắt để kiểm tra hình thái, màu sắc, mùi vị, kích thước bằng cách đo trực tiếp. Mẫu dược liệu phải đạt tiêu chuẩn đã yêu cầu như trong phần dược điển đã quy định.

2.2.1.2. Bột Cũng như phần mô tả nấm Linh Chi sau khi đã xay thành bột thì được kiểm tra (trong phương pháp trong bài báo cáo này chỉ kiểm tra về mặt cảm quan, vì điều kiện phòng thí nghiệm không cho phép nên không thể soi được dưới kính hiển vi) 2.2.1.3. Mất khối lượng do làm khô Dược liệu phải được làm thành mảnh nhỏ đường kính không quá 3 mm; lượng đem thử từ 2 gam đến 5 gam; chiều dày lớp mẫu thử đem sấy là 5 mm và không quá 10 mm đối với dược liệu có cấu tạo xốp. Nhiệt độ và thời gian sấy theo yêu cầu của chuyên luận riêng (PL9.6 DĐVN V) Tiến hành như sau: Dùng dụng cụ dùng để sấy bằng thủy tinh rộng miệng đáy bằng có nắp mài làm bì đựng mẫu thử; làm khô bì trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 1000C, sau đó để trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng rồi cân để xác

19

định khối lượng bì. Cân ngay vào bì này một lượng chính xác 1 gam mẫu thử với sai số <= 10 %. Sau đó 1 gam bột dược liệu Linh Chi này được dát mỏng thành lớp mỏng trên bề mặt bì đựng (có độ dày không quá 5 mm). Tiến hành làm khô trong tủ sấy ở 1000C (± 2 °C ) trong vòng 5h, sau khi sấy cho nhanh bì đựng chứa mẫu vào bình hút ẩm và làm nguội tới nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm có silica gel rồi cân ngay. ❖ Độ ẩm của nguyên liệu thô nấm Linh Chi được tính theo công thức: 𝐴(%) =

(𝑀1 + 𝑀) − 𝑀2 ∗ 100 (𝐼) 𝑀

❖ Trong đó: o M: khối lượng mẫu thô (g); o M1: khối lượng bì trước khi nung(g); o M2: khối lượng bì sau khi nung (g); 2.2.1.4. Tro toàn phần Cho 2 gam bột LC vào một chén sứ đã nung và cân bì. Nung ở nhiệt độ không quá 450oC tới khi không còn carbon, làm nguội rồi cân. Bằng cách này mà tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít nước nóng cho vào khối chất đã than hoá, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc không tro. Rửa đũa thuỷ tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc. Cho giấy lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng. Hòa dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450oC đến khi khối lượng không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo dược liệu đã làm khô trong không khí (PL 9.8 DĐVN IV). ❖ Hàm lương tro toàn phần theo %(X) của cao dược liệu được tính theo công thức: 𝑋 (%) =

𝑀2 − 𝑀1 ∗ 100 (𝐼𝐼) 𝑀

❖ Trong đó: o M: khối lượng mẫu thô (g); o M1: khối lượng bì trước khi nung(g); o M2: khối lượng bì sau khi nung (g);

20

2.2.1.5. Tro không tan trong acid Cho 25 ml dung dịch acid hydrochloric 2M (TT) vào tro toàn phần, đun sôi 5 min, lọc để tập trung những chất không tan vào một phễu thủy tinh xốp đã cân bì, hoặc vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 500 °C đến khối lượng không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với dược liệu đã làm khô trong không khí ❖ Hàm lương tro không tan trong acid theo %(Y) của cao dược liệu được tính theo công thức: 𝑌(%) =

𝑀2 − 𝑀1 ∗ 100 (𝐼𝐼𝐼) 𝑀

❖ Trong đó: o M: khối lượng mẫu thử (g); o M1: khối lượng bì (g); o M2: khối lượng bì sau khi thêm acid và nung (g); 2.2.1.6. Định tính Dùng các phản ứng hóa học đặc trưng để tịnh tính các thành phần có trong nấm Linh Chi Chiết xuất: Các thành phần trong dược liệu (thể quả) được tách ra từ các phân đoạn nhờ các dung môi có độ phân cực khác nhau như ether, cồn, nước… để có được dịch chiết phù hợp cho từng phản ứng hóa học đặc trưng trước khi tiến hành định tính. a. Định tính Polysaccharide: Lấy 2 g bột dược liệu, thêm 20 ml ethanol 96%, đun sôi hồi lưu 1h, lọc, lấy 1ml dung dịch làm mẫu thử để thử định tính.

Có nhiều phương pháp để phát hiện polysaccharide chẳng hạn như: ❖ Nhận biết bằng anthrone: Cho 4-5 giọt acid sulfuric vào mẫu thử, để trong 5 phút. Thêm thuốc thử Arthrone vào, nếu có polysaccharide sẽ xuất hiện màu xanh ngọc.

21

❖ Nhận biết bằng phenol: Thêm 1ml phenol 5% vào ống nghiệm chứa mẫu thử, lắc đều sau đó dùng pipet cho 5ml dung dịch acid sulfuric đặc chảy nhanh vào ống nghiệm, lắc đều cho đồng nhất, nếu có polysaccharides sẽ xuất hiện màu vàng. b. Định tính tritecpenoids Chiết 2 gam bột nấm bằng 20ml diethyl ether trong bình hồi lưu. Lấy 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5 ml acetic anhydride, thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chu1yển dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet thêm 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy từ từ xuống đáy ống nghiệm. , lớp dung dịch phía trên dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. Kết luận trong nấm Linh chi đỏ có chứa triterpenoids c. Định tính alkaloid Lấy 10g bột LC ngâm nguội trong dung dịch prollius trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn.Lọc và đun dung môi đến cạn, thu được cặn.

Hòa tan cặn trong dung dịch HCl1% đun ấm cho dễ tan. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayervà Dragendorff Dung dịch prollius là hỗn hợp gồm: chloroform: ethanol 95o: NH4OH đậm đặc theo tỉ lệ là 8:8:1 (môi trường phải có tính base). ❖ Thử bằng thuốc thử Mayer Thuốc thử Mayer: hòa tan 1,36 gam HgCl2 trong 60 ml nước cất và 5g KI trong 10ml nước cất. Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. ❖ Thử bằng thuốc thử Dragendorff Thuốc thử Dragendorff: hòa tan 8 gam Bi(NO3)3 trong 25 ml HNO3 30% (D = 1,18). Hòa tan 28g KI và 1ml HCl 6N trong 5ml nước cất. Hỗn hợp 2 dung dịch này lại để yên trong tủ lạnh 5oC sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu để che sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu vài tuần.

22

Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu. d. Phương pháp định tính hợp chất Saponin Chiết 10 gam dược liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc.

Cô dịch lọc bốc hơi đến cắn khô. Dùng cắn để làm các phản ứng định tính. ❖ Thử nghiệm tính tạo bọt Saponin có tính tạo bọt, nên đây là một trong những phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin.

Phương pháp tiến hành: hòa tan một lượng cắn tương ứng với 1 g dược liệu vào 5 ml nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 10 ml, lắc mạnh dọc theo chiều ống nghiệm trong 1 phút. Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả.

• Bọt bền trong 15 phút •

Bọt bền trong 30 phút

•

Bọt bền trong 60 phút

❖ Thử nghiệm Fontan – Kaudel Lấy một lượng cắn tương ứng với 1gam bột dược liệu, đun nóng nhẹ trên cách thủy để hòa tan với 10 ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm. Ống 1: thêm 2 ml HCl 0,1N (pH =1) Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0,1N (pH =13) Lắc mạnh dọc theo chiều ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bọt trong cả 2 ống nghiệm: • Nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau, thì sơ bộ xác định là có saponin triterpenoids.

• Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác định là có saponin steroid. e. Phương pháp định tính acid hữu cơ Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể Na2CO3, hơ nhẹ qua ngọn lửa. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận là có acid hữu cơ.

23

2.2.1.7.

Định lượng các chất có trong nấm Linh chi (theo phương pháp cân)

Cân chính xác 20 g bột dược liệu của toàn bộ thể quả nấm Linh chi đã được xay thành bột (đã được đo độ ẩm) chiết soxhlet với khoảng 100 ml nhexane (TT) để loại chất béo (khoảng 6 giờ), lấy bã bay hết hơi n-hexane. Sau đó chiết bằng 100 ml MeOH (TT). Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn. Hòa tan cắn trong 20 ml nước rồi lắc với n-butanol bão hòa nước (TT) đến khi lớp n-butanol nhạt màu. Gộp dịch n-butanol, rửa 3 lần bằng nước cất.

Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn, hòa tan cắn bằng 2ml ethanol 96% rồi chuyển vào một cốc đã được xác định khối lượng trước. Bốc hơi trên cách thủy được cắn. Sấy khô cắn ở 105ºC trong 3 giờ.

Cân cắn. ❖ Tính hàm lượng tổng chất chiết được trong dược liệu khô kiệt theo công thức: 𝑋 (%) =

𝑀𝑐 ∗ 100 ∗ 100 𝑀𝑡 ∗ (100 − 𝐴)

❖ Trong đó: o X: hàm lượng dược chất có trong dược liệu (%); o Mc: là khối lượng cắn thu được (g); o Mt: là khối lượng mẫu thử (g); o A: là hàm ẩm dược liệu (%) 2.2.2.

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao đặc dược liệu từ nấm Linh Chi Dựa trên các tiêu chí tiêu chuẩn chung của cao đặc dược liệu theo Dược

điển Việt Nam 5, ta tiến hành xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao đặc dược liệu Linh Chi với các đặc tính sau: • Tính chất • Mất khối lượng do làm khô • Độ PH • Định tính • Tro toàn phần

24

• Tro không tan trong acid • Cắn không tan trong nước • Kim loại nặng 2.2.2.1. Tính chất Thử bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu về tính chất gồm: ❖ Màu sắc: ta lấy 1gam chế phẩm, cho vào một chén sứ men trắng hoặc một đĩa thủy tinh, dát cao dược liệu thành 1 lớp mỏng trên đĩa thủy tinh để tạo thành một lớp dễ quan sát, quan sát dưới ánh sáng tự nhiên. ❖ Muồi, vị : cho 1gam chế phẩm vào một cốc chứa 500ml nước đã đun sôi, hòa tan cao trong nước, sau đó nếm thử vị ❖ Trạng thái: cho 1gam chế phẩm ra 1 đĩa thủy tinh, để nghiên đĩa thủy tinh để kiểm tra độ chảy của cao, sờ từ đó để kiểm tra và xác định độ mềm, dẻo..

2.2.2.2. Mất khối lượng do làm khô Tiến hành theo phương pháp xác định mất khối lượng do làm khô (Phụ lục 9.6, DĐVN V) như đối với dược liệu thô của nấm Linh chi.

Dùng dụng cụ dùng để sấy bằng thủy tinh rộng miệng đáy bằng có nắp mài làm bì đựng mẫu thử; làm khô bì trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 100 0C rồi cân để xác định khối lượng bì. Cân ngay vào bì này một lượng chính xác 1g mẫu thử với sai số <= 10 %. Sau đó 1gam cao này được dát thành một lớp mỏng (có độ dày không quá 5 mm). Tiến hành làm khô trong tủ sấy ở 1000 C (± 2°C) đến khối lượng không đổi (tức là sự chênh lệch khối lượng sau khi sấy thêm 1h trong tủ sấy hoặc 6h trong bình hút ẩm so với lần sấy trước đó không quá 0,5mg), sau khi sấy cho nhanh các chén sứ vào bình hút ẩm và làm nguội tới nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm có silica gel rồi cân ngay. Độ ẩm của cao đặc Linh Chi được tính theo công thức (I) 2.2.2.3. Độ PH Lấy 1 gam chế phẩm pha trong 100ml nước cất sa đó tiến hành đo pH bằng máy đo PH AL 20-Aqualitic, kết quả thu được sẽ là dung dịch cao đặc Linh chi 1% (kl/tt).

25

2.2.2.4. Định tính Đối với cao đặc Linh chi ta cần định tính các thành là polysaccharide, triterpenes là chất có hoạt tính sinh học chính trong nấm Linh Chi. a. Định tính triterpenoids Lấy 0,5 g chế phẩm, thêm 50 ml ethanol 90 % (TT), lắc đều, đun hồi lưu trong cách thủy 30 phút, để nguội và lọc, bay hơi dịch lọc trên cách thủy đến còn khoảng 10 ml, chuyển vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch chiết để làm các phản ứng sau đây: Ống 1: thêm 3-4 giọt axit H2SO4, sau 5 phút cho thuốc thử anthron 1%, phản ứng tạo tủa màu xanh. Ống 2: Thêm 1ml dung dịch phenol 5%, sau đó thêm 5ml dung dịch H2SO4 đặc, phản ứng sẽ xuất hiện màu vàng. b. Định tính tính triterpenes Lấy 0.5 gam chế phẩm hòa 20ml diethylether sau đó đun trong bình hồi lưu 30 phút. Lấy 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Thêm 1 - 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy từ từ xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. c. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4).

Bản mỏng: Silica gel G. Dung môi khai triển: Ether dầu hỏa (60 °C đến 90 °C) – ether ethylic – acid formic (1 5: 5: 1 ) . Dung dịch thử: Lấy 2g bột thô dược liệu, thêm 30 ml methanol (TT), đun hồi lưu trong 30 min, lọc. Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong 2 ml methanol (TT). Dung dịch đối chiếu: Lấy 2 gam bột thô Linh chi (mẫu chuẩn) tiến hành chiết như mẫu thử.

Cách tiến hành Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 10 cm đến 12 cm, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí, quan sát dưới sáng từ ngoại ở bước sóng 366 nm. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (có ít nhất 4 vết phát quang màu vàng

26

ánh xanh, trong đó có vết thứ hai từ trên xuống có cường độ đậm hơn nhiều so với các vết khác). (Tham khảo) 2.2.2.5. Tro toàn phần Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong 30 phút, để nguội trong bình hút ẩm rồi cân, ghi lại khối lượng của chén sứ. Cho 1 gam cao dược liệu vào chén sứ trên và mang đi nung. Nung ở nhiệt độ không quá 450 °c tới khi không còn carbon, làm nguội trong bình hút ẩm có silica gel rồi cân. Bằng cách này mà tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít nước nóng cho vào khối chất đã than hóa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc không tro. Rửa đũa thủy tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc. Cho giấy lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng. Tập trung dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450°C đến khi khối lượng không đổi. ❖ Hàm lương tro toàn phần theo %(X) của cao dược liệu được tính theo công thức: 𝑋 ( %) =

𝑀2 − 𝑀1 ∗ 100 (𝐼𝐼) 𝑀

❖ Trong đó: o M1: khối lượng chén (g); o M2: khối lượng chén sau khi nung o M: khối lượng mẫu thử (g); o A: độ ẩm của mẫu thử (%); 2.2.2.6. Tro không tan trong acid Cho 25 ml dung dịch acid hydrocloric 2 M (TT) vào tro toàn phần, đun sôi 5 min, lọc để tập trung những chất không tan vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 500 °C đến khối lượng không đổi. ❖ Hàm lương tro không tan trong acid theo %(Y) của cao dược liệu được tính theo công thức: 𝑋 (%) =

𝑀2 − 𝑀1 ∗ 100 𝑀

27

❖ Trong đó: o M: khối lượng mẫu thử (g); o M1: khối lượng bì chứa tro toàn phần (g); o M2: khối lượng bì sau khi thêm acid và nung (g); 2.2.2.7. Cắn không tan trong nước Hòa tan 1,0 g chế phẩm trong 50 ml nước cất nóng, lọc qua giấy lọc đã cân bì, rửa cắn và giấy lọc bằng nước cất cho tới khi nước rửa không màu, sấy cắn và giấy lọc ở 100 °C trong 3 h, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 min, cân nhanh để xác định khối lượng cắn. ❖ Hàm lương cắn không tan trong nước theo %(X) của cao dược liệu được tính theo công thức: 𝑋 (%) =

𝑀2 − 𝑀1 ∗ 100 𝑀

❖ Trong đó: o M: khối lượng mẫu thử (g); o M1: khối lượng giấy lọc trước khi nung (g); o M2: khối lượng giấy lọc sau khi nung; 2.2.2.8. Kim loại nặng (Pb) Dung dịch thử: Lấy một lượng chế phẩm như chỉ dẫn trong chuyên luận (không quá 2 g) cho vào một chén nung sứ. Thêm 4 ml dung dịch magnesi sulfat 25 % trong acid sulfuric 1 M (TT). Trộn đều bằng một đũa thủy tinh nhỏ rồi đun nóng cẩn thận. Nếu hỗn hợp là một chất lỏng thì làm bay hơi từ từ trên cách thủy đến khô. Đốt dần để chế phẩm cháy hết và tiếp tục đốt cho đến khi thu được cắn có màu gần trắng hay ít nhất là xám nhạt. Tiến hành nung ở nhiệt độ không quá 800 °C. Để nguội. Làm ẩm cắn bằng vài giọt dung dịch acid sulfuric 1M (TT).

Bốc hơi, nung lại và để nguội. Toàn bộ thời gian nung không được quá 2h. Hòa tan cắn trong dung dịch acid hydrocloric 2 M (TT) 2 lần, mỗi lần dùng 5 ml.

Thêm 0,1 ml dung dịch phenolphtalein (TT), cho từng giọt amoniac (TT) đến khi có màu hồng. Để nguội, thêm acid acetic băng (TT) đến khi dung dịch mất màu và thêm thừa 0,5 ml nữa. Lọc nếu cần và pha loãng dung dịch với nước thành 20 ml.

28

Dung dịch đối chiếu: Tiến hành theo chỉ dẫn ở phần dung dịch thử, dùng một thể tích dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) như đã ghi trong chuyên luận thay cho chế phẩm. Thêm 2 ml dung dịch thử vào 10 ml dung dịch thu được.

Dung dịch kiểm tra: Tiến hành theo chỉ dẫn ở phần dung dịch thử, dùng lượng chế phẩm như lượng dùng để chuẩn bị dung dịch thử và thể tích dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) như thể tích dùng để chuẩn bị dung dịch đối chiếu. Thêm 2 ml dung dịch thử vào 10 ml dung dịch thu được.

Dung dịch mẫu trắng: Hỗn hợp gồm 10 ml nước và 2 ml dung dịch thử.

Lấy 12 ml của mỗi dung dịch trên, thêm 2 ml dung dịch đệm acetat pH 3,5(TT).

Lắc đều và thêm dung dịch thu được vào 1,2 ml dung dịch thioacetamide (TT), lắc đều ngay. Quan sát các dung dịch sau 2 min.

Tính thích hợp của phép thử: Dung dịch đối chiếu phải có màu nâu nhạt khi so sánh với dung dịch mẫu trắng và dung dịch kiểm tra phải có màu ít nhất là đậm bằng màu của dung dịch đối chiếu. Đánh giá kết quả: Màu nâu của dung dịch thử, nếu có, không được đậm hơn màu của dung dịch đối chiếu. Nếu như khó đánh giá kết quả, lọc các dung dịch qua màng lọc 0,45μm nếu không có chỉ dẫn khác. Tiến hành lọc chậm và đều với áp lực lên piston nhẹ nhàng và liên tục.

So sánh màu sắc của các vết trên màng lọc thu được từ các dung dịch.

29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU THÔ NẤM LINH CHI

3.1.

Từ các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đưa ra tiêu chuẩn cho dược liệu thô cho toàn bộ thể quả tươi, phơi khô và xay của nấm nấm Linh Chi (Ganoderma Lucidum) được trình bày như sau: 3.1.1.

Mô tả

Nấm Linh chi có thể mọc thành cụm hoặc đơn lẻ. Phần thịt của thể quả nấm có màu nâu, mềm xốp nhưng hóa gỗ theo thời gian. Thể quả của nấm gồm có hai phần, mũ nấm và cuống nấm (phần phiến đối diện với cuống nấm). Trên mũ nấm có hai vách, bào tử hình thành phía bên trong giữa hai vách. Đây là đặc điểm giúp phân biệt nấm Linh chi với các loài khác. Mũ nấm ban đầu có hình chùy; khi trưởng thành có hình bán nguyệt, hình quạt hoặc hình thận, kích thước thay đổi nhiều (dài 5-18 cm, rộng 2-25 cm, dày 1-2 cm). Mặt trên mũ nấm sáng bóng, màu nâu đỏ, có vân đồng tâm, lượn sóng và vân tán xạ; mặt dưới có màu nâu nhạt, có các ống rất nhỏ chứa bào tử. Cuống nấm dài, hình trụ tròn, có màu nâu bóng. Kích thước cuống nấm nằm trong khoảng 1-1,5cm x 15-20cm. Đầu cuống lệch một bên mũ, hoặc đôi khi nằm giữa trung tâm mũ.

Nấm Linh Chi sau khi cắt và phơi khô thì nhạt màu hơn, bên trong có màu nâu nhạt, nhạt màu hơn so với phía trên mũ nấm.

Hình 10: Nấm Linh Chi sau khi thái mỏng, phơi khô

30

3.1.2.

Bột

Bột (thể quả) có màu vàng nâu, có mùi thơm nhẹ của Linh Chi, vị đắng.

Hình 11: Bột dược liệu nấm Linh Chi 3.1.3.

Mất khối lượng do làm khô Bảng 1: Độ ẩm của dược liệu thô Linh Chi Khối lượng

Khối lượng mẫu

Khối lượng sau

Độ ẩm

chén (M1)

(M)

khi nung (M2)

(A%)

Lần 1

73,967

1,002

74,915

5,48

Lần 2

88,789

1,001

89,734

5,59

Lần 3

72,277

1,001

73,222

5,52

Trung bình

5,3+-0,07

Kết quả được tính theo công thức (I) Nhận xét: độ ẩm các mẫu dược liệu TTH trung bình khoảng 6,7%. Tuy nhiên, trong quá trình thực nghiệm khi độ ẩm dược liệu khoảng 17% dược liệu vẫn được bảo quản tốt, không bị hỏng hay ẩm mốc, mối mọt. Do vậy qui định hàm ẩm dược liệu không quá 17%.

31

3.1.4.

Tro toàn phần Bảng 2: Tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu thô Linh Chi Khối lượng chén

Khối lượng mẫu

Khối lượng sau

Tro toàn

(g)

(g)

khi nung (g)

phần (%)

1

34,691

2,002

34,731

1,99

2

34,705

2,001

34,750

2,24

3

34,414

2,001

34,456

2,12

STT

Trung bình

2,11±0,13

Kết quả được tính theo công thức (II) 3.1.5.

Tro không tan trong acid

Sau khi tiến hành theo phương pháp trên ta được kết quả sau: Bảng 3: Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu thô nấm LC Khối lượng chén Khối lượng (g)

mẫu(g)

Khối lượng sau

Tro toàn phần

khi nung (g)

(%)

Lần 1

34,691

2,002

34,697

0,347

Lần 2

34,705

2,001

34,711

0,329

Lần 3

34,141

2,001

34,421

0,395

Trung bình

3.1.6.

0,357±0,04

Định tính Có các phản ứng đặc trưng của các chất trong dược liệu, đặc biệt là làm

phản ứng định tính polisaccarids và tritecpeniod

32

Bảng 4: Bảng kết quả định tính các chất có trong dược liệu nấm Linh Chi Kết quả sơ bộ Nhóm chất

Phản ứng định tính

Kết quả

Kết luận

thuốc thử Thuốc thử Anthrone 1%, Polisaccaride

+

H2SO4 đặc Dung dịch phenol 5%

Có +

+1ml dd H2SO4 đặc Tritecpeniod

Dd H2SO4 đặc

+

Alkaloid

Thuốc thử Mayer

-

Thuốc thử Dragendorff

-

Có

Không có

* Thử nghiệm tính tạo bọt:

Saponin

Bọt bền trong 15 phút

+

Bọt bền trong 30 phút:

++

Bọt bền trong 60 phút

+++

Có

Thử nghiệm Fontan – Kaudel:( xác định có sap-

(Saponin

(Saponin

onin triterpenoid hay sap-

Triterpenoid)

Triterpenoid)

onin steroid)

Cho vài tinh thể Na2CO3 vào dịch chiết nấm, hơ Axit hữu cơ

nóng. Nếu có bọt khí sủi lên thì kết luận có acid hữu cơ

+

Có

33

3.1.7.

Định lượng Kết quả được trình bày trong bảng sau: Bảng 5: Bảng kết quả định lượng các chất có trong nấm Linh Chi

STT

Khối lượng

Khối lượng

dược liệu (g)

cắn (g)

Hàm ẩm dược liệu (%)

Hàm lượng dược chất tổng (%)

Lần 1

20,001

0,305

3,22

Lần 2

20,002

0,303

3,20

Lần 3

20,002

0,305 Trung bình

3.2.

5,3%

3,22 3,21±0,1

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO ĐẶC DƯỢC LIỆU CHO

NẤM LINH CHI. Từ những nghiên cứu và dựa theo DĐVN IV tôi đề xuất tiêu chuẩn cơ sở cao đặc dược liệu nấm Linh Chi như sau: 3.2.1.

Tính chất: Sau khi thử cảm quan ta thấy Cao đặc Linh Chi là một khối mềm, đồng

nhất, khi để trong lọ sẽ có màu nâu đen (như hình 9), khi dát mỏng soi dưới ánh sáng tự nhiên sẽ có màu nâu đỏ (như hình 8), có mùi thơm đặc trưng của đường, vị hơi đắng, ngọt.

Hình 12: Soi màu cao đặc LC

Hình 13: Cao đặc nấm LC

34

3.2.2.

Mất khối lượng do làm khô Bảng 6: Độ ẩm của cao đặc Linh Chi Khối lượng chén

Khối lượng mẫu

Khối lượng sau

Độ ẩm

(g)

khi nung (g)

(g)

(g) Lần 1

74,008

1,002

74,842

16,67

Lần 2

88,812

1,001

89,645

16,68

Lần 3

72,316

1,002

73,146

16,81

Trung bình

3.2.3.

16,72±0,2

Độ PH Độ pH của dung dịch cao 1% (kl/tt) là từ 7-7,6

3.2.4.

Định tính Chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của polisacarids và

tritecpnoid từ cây nấm Linh Chi.

Bảng 7: Kết quả định tính các chất có trong cao dược liệu nấm Linh Chi Kết quả sơ bộ Nhóm chất

Phản ứng định tính

Kết quả

Kết luận

thuốc thử Thuốc thử Anthrone 1%,

+

H2SO4 đặc Polisaccaride

Có Dung dịch phenol 5% +1ml

+

dd H2SO4 đặc Tritecpenoid

Dd H2SO4 đặc

+

Có

35

3.2.5.

Tro toàn phần Bảng 8: Hàm lượng tro toàn phần của cao dược liệu LC

STT

Khối lượng

Khối lượng

chén(g)

mẫu(g)

Khối lượng sau

Tro toàn phần (%)

khi nung(g)

Lần 1

35,187

1,002

35,211

2,395

Lần 2

34,782

1,001

34,804

2,197

Lần 3

34,621

1,002

34,644

2,295

Trung bình 3.2.6.

2.296±0,1

Tro không tan trong acid: Bảng 9: Tỷ lệ tro không tan trong acid cao dược liệu LC Khối lượng tro

Khối lượng mẫu(g)

Tro toàn phần (%)

M2 – M1(g) Lần 1

0,017

1,002

1,696

Lần 2

0,011

1,001

1,098

Lần 3

0,013

1,002

1,297

Trung bình

3.2.7.

1,363(+- 0,3)

Cắn không tan trong nước.

Bảng 10: Tỷ lệ cắn không tan trong nước của cao dược liệu LC

STT

Khối lượng

Khối lượng

giấy lọc(g)

mẫu(g)

Khối lượng sau

Tro toàn phần (%)

khi nung(g)

Lần 1

0,841

1,001

0,895

5,394

Lần 2

0,840

1,001

0,889

4,895

Lần 3

0,823

1,002

0,867

4,391

Trung bình 3.2.8.

Kim loại nặng: không quá 10ppm

4,893±0,5

36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ❖

Kết luận

Sau khi khảo sát và đánh giá một số chỉ tiêu về dược liệu thô nấm Linh Chi ta đưa ra một kết luận như sau: + Mô tả: Thể quả dạng hình thận, hình tròn hay hình quạt, hóa gỗ,cứng, đường kính 5 cm đến 18 cm, dày 1 cm đến 2 cm. Mặt trên màu nâu vàng đến nâu đỏ, bóng loáng như đánh vecni, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép mỏng, nhẵn, hơi lượn sóng. Mặt dưới màu vàng nâu đến nâu nhạt với các lỗ nhỏ li ti.

Phần trong xốp, màu trắng đến nâu nhạt. Cuống hình trụ, đính lệch, có khi phân nhánh, dài 6 cm đến 10 cm, đường kính 1 cm đến 3,5 cm, màu nâu đỏ đến nâu đen.

Mùi thơm nhẹ, vị đắng đúng như mô tả về nấm Linh Chi trong DDVN V. + Bột: Màu vàng nâu, có mùi thơm nhẹ của Linh Chi, vị hơi đắng nhẹ. + Mất khối lượng do làm khô: không quá 6%, đứng được yêu cầu về hàm ẩm của nguyên liệu thôi nấm Linh Chi trên cơ sở DDVN V (không quá17%). + Tro toàn phần: không quá 3%. + Tro không tan trong acid: không quá 0,5%. + Định tính: Có các phản ứng đặc trưng của polisaccaride và tritecpenoid là những chất đặc trưng cho dược liệu nấm Linh Chi. + Định lượng: sau khi định lượng chất chiết được trong dược liệu ta thấy thành phần các chất chiết được là 3,21% (không ít hơn 3%) 

Từ kết quả của một số phép thử trên ta thấy nguyên liệu cho quá

trình chiết tách và thu cao đặc để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở đáp ứng tốt yêu cầu về nguyên liệu thô dược liệu nấm Linh Chi theo quy định của dược điển. Đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cao đặc từ dược liệu nấm Linh Chi với các chỉ tiêu như sau:

36

37

+ Tính chất: là một khối mềm, đồng nhất, khi để trong lọ sẽ có màu nâu đen, khi dát mỏng soi dưới ánh sáng tự nhiên sẽ có màu nâu đỏ, có mùi thơm đặc trưng của đường, vị hơi đắng, ngọt… + Mất khối lượng do làm khô: không quá 17% đáp ứng được yêu cầu của DDVN về yêu cầu của cao đặc được liệu (không quá 20%) + Độ pH: PH từ 7-7.6. + Định tính: Thể hiện phép thử định tính của polisaccaride và tritecpenoid. + Tro toàn phần: không quá 3%

.

+ Tro không tan trong acid: không quá 1,5%. + Cắn không tan trong nước: không quá 5% (so với các cao dược liệu khác là không quá 10%) + Kim loại nặng: không quá 10 ppm. ❖

Kiến nghị

- Xây dựng thêm chỉ tiêu về độ vô khuẩn cho cao dược liệu nấm Linh Chi. - Tiếp tục nghiên cứu và nâng cao bộ tiêu chuẩn dược liệu và cao dược liệu trên, cập nhật và sửa đổi để phù hợp với sự phát triển của khoa học kỹ thuật.

- Vận dụng tiêu chuẩn xây dựng trong kiểm soát chất lượng dược liệu, cao dược liệu.

- Trên cơ sở cao đặc dược liệu nấm Linh Chi có thể tạo ra được các sản phẩm có tính ứng dụng và mang lại hiệu quả kinh tế cao.

37

38

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đỗ Tất Lợi. Những cây thước và vị thuốc quý ở Việt Nam. s.l. : Nhà xuất bản Hà Nội., 2005.

2. American herbal pharmacopoeia and therapeutic com.

3. Bộ y tế. Sổ tay đăng kí thuốc (ban hành kèm theo quyết định số 07/QD – QLD ngày 11/1 về việc ban hành sổ tay hướng dẫn đăng kí thuốc), phục lục. 2013.

4. Bộ Y Tế. Thông tư số 09/2010/TT của Bộ Y tế Hướng dẫn việc quản lý chất lượng thuốc. 2010.

5. bộ y tế. Dược điển Việt Nam V. : Nhà xuất bản y học, Hà Nội, 2017.

6. Bộ Y Tế. Dược liệu học tập 2. Hà Nội : Nhà xuất bản Y học Hà Nội, 2013.

7. Dược liệu học, tập 1. s.l. : Nhà xuất bản Y Học Hà Nội, 2013. 135-139.

8. Nguyễn Phương Đại Nguyên. Nấm Linh chi ở Tây Nguyên. s.l. : Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, 2013.

9. Nguyễn Lân Dũng. Công nghệ nuôi trồng nấm – Tập 1, 2. s.l. : Nhà xuất bản nông nghiệp, 2002.

10. Kessler, McGonagle, Zhao, Nelson, Hughes, Eshleman & Kendler. 1994, Lifetime and 12-month prevalence of DSM-III-R psychiatric disorders in the United States: results from the National Comorbidity Survey. Archives of general psychiatry.

11. Trịnh Tam Kiệt . Nấm lớn Việt Nam, TẬP 1. s.l. : NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, 2011. 41, 135-137.

12. Nguyễn Anh Dũng. Góp phần vào việc nghiên cứu các thành tố hóa học của Ganoderma lucidum.. s.l. : Tạp chí dược học, 1995.

13. Falandyz. Selenium in edible mushrooms. s.l. : Journal of Environmental Science and Health Part , 2008. 256-259.

38

39

14. Structural and immunological studies of a major polysaccharide from spores of Ganoderma lucidum (Fr.) : Carbohydrate research, 2001.

15. Karst. Bao, Liu, Fang, & Li. s.l. Chromatographic and electrophoretic methods for Lingzhi pharmacologically active components. Huie, Carmen W, Xin Di. s.l. : Journal of Chromatography, 2004.

16. Baby, Sabulal, Anil John Johnson, and Balaji Govindan. 2015, Secondary metabolites from Ganoderma.

17. Jiang, Slivova, Valachovicova, Harvey. s.l.Ganoderma lucidum inhibits proliferation and induces apoptosis in human prostate cancer cells PC-3. : International journal of oncology, 2004.

18. Liu, Zhenguang. 2016a, Ganoderma lucidum polysaccharides encapsulated in liposome as an adjuvant to promote Th1-bias immune response.

19. Phạm Bảo Trương và Nguyễn Minh Thủy. Tối ưu hóa quá trình trích ly polisaccharid và titan trong nấm Linh chi đỏ. s.l. : Tạp chí Khoa học trường đại học Cần Thơ, 2015.

20. Ma B, Wei Ren, Zhou Y, Ma J, Ruan Y. Tritecpenoids from the spores of Genoderma lucidium. 2011.

21. Iris F. F. Bezie and Sissi Whachter-Garlor. Herbal Medicine: Biomolercular and Clinical Aspects. 2011.

22. Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh. 2000, Nấm ăn, nấm dược liệu-Công dụng và công nghệ nuôi trồng. NXB Hà Nội 23. American Herbal Pharmacopeia and Therapeutic Compendium: Reishi Mushroom, Ganoderma lucidum. Coates. s.l. : Standards of Analysis, Quality Control, and Therapeutics. USA Canada: Santa Cruz, 2010, Encyclopedia of dietary supplements.

24. Nguyen V. 2015, Cytotoxic and anti-angiogenic effects of lanostane triterpenoids from Ganoderma lucidum. Phytochemistry letters.

39

40

25. Koyama, Imaizumi, T., Akiba, Kinoshita, . Antinociceptive components of Ganoderma lucidum. 1997.

26. Ferreira. 2015, Chemical features of Ganoderma polysaccharides with antioxidant, antitumor and antimicrobial activities.

27. Wachtel-Galo. 2011, Ganoderma lucidum (Lingzhi or Reishi). In Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects. 2nd edition. CRC Press/Taylor & Francis.

28. Wu. 2016, Mushroom cosmetics: the present and future. Cosmetics 3: 1–13.

29. Nguyễn Thượng Don, Bùi Thị Bằng, Nguyễn Thị Thu Hương. Nguyên cứu tác dụng chống oxy hóa của 3 loại nấm Linh chitrên mô hình gây viêm bằng CCl4. s.l. : Tạp Chí dược liệu, 2005.

30. Trần Thị Văn Thi, Nguyễn Thị Hoài. Khảo xác tác dugj dược lý của phân đoạn tritecpenoids từ nấm Linh chi. s.l. : Tạp chí dược liệu, 2012.

31. Mai Thành Chung, Nguyễn Thị Thu Hương. khảo sát hoạt tính từ gốc tự do superoxid và tác dụng tên glutanthion peroxidase trong gan của nấm Linh Chi đỏ và vàng. s.l. : Tạp chí dược liệu, 2012.

32. Yurkiv, B., Wasser, S. P., Nevo, E., & Sybirna, N. Antioxidant effects of medicinal mushrooms Agaricus brasiliensis and Ganoderma lucidum (higher Basidiomycetes): evidence from animal studies. s.l. : International journal of medicinal mushrooms, 2015.

33. Mau, Jeng-Leun, Hsiu-Ching Lin, and Chin-Chu Chen. 2001, Non-volatile components of several medicinal mushrooms. Food Research International, 34(6), ., pp.

521-526.

34. Bộ Y Tế. Dược điển Việt Nam IV. s.l. : nhà xuất bản y học Hà Nội, 2009.

35. Li. 2013b, A new ganoderic acid from Ganoderma lucidum mycelia and its stability., pp. Fitoterapia 84 (2013): 115-122.

40

41

41