Bảng 9 Tỷ lệ tro không tan trong acid cao dược liệu LC 3

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng Bảng 1 Độ ẩm của dược liệu thô Linh chi Trang

30

Bảng 2 Tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu thô Linh chi 31

Bảng 3 Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu thô nấm Linh chi

Bảng 4 Bảng kết quả định tính các chất có trong dược liệu nấm Linh chi 31

32

Bảng 5 Bảng kết quả định lượng các chất có trong nấm Linh Chi

Bảng 6 Độ ẩm của cao đặc Linh chi

Bảng 7 Kết quả định tính các chất có trong cao dược liệu nấm Linh Chi 33

35

35

Bảng 8 Hàm lượng tro toàn phần của cao dược liệu LC 36

Bảng 9 Tỷ lệ tro không tan trong acid cao dược liệu LC 36

Bảng 10 Tỷ lệ cắn không tan trong nước của cao dược liệu LC 36

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình Tên hình

Hình 1 Nấm LC trong tự nhiên Hình 2 Nấm LC được trồng nhân tạo Hình 3 Chu kì phát triển của nấm Linh chi Hình 4 Lanosterol Trang

8

8

10

12

Hình 5 Acid gannoderic B

Hình 6 Lucidaciol 12

12

Hình 7 Lucidenic A 12

Hình 8 Nồi chiết nấm Linh Chi 16

Hình 9 Nồi cô dược liệu 16

Hình 10 Nấm Linh Chi sau khi thái mỏng, phơi khô 29

Hình 11 Bột dược liệu nấm Linh Chi 30

Hình 12 Soi màu cao đặc LC

Hình 13 Cao đặc nấm LC 33

33

MỤC LỤC MỞ ĐẦU........................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..........................................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH KHẢO SÁT DƯỢC LIỆU VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO DƯỢC LIỆU................................................................................3 1.1.1. Cách thức xây dựng tiêu chuẩn .....................................................................3 1.1.2. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nói chung......................................4 1.2. TỔNG QUAN VỀ CAO DƯỢC LIỆU................................................................6 1.2.1. Định nghĩa .....................................................................................................6 1.2.2. Phân loại ........................................................................................................6 1.3. TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI...................................................................7 1.3.1. Đặc điểm thực vật..........................................................................................7 1.3.1.1. Khái quát về nấm Linh Chi.....................................................................7 1.3.1.2. Vị trí phân loại của nấm Linh chi...........................................................8 1.3.1.3. Đặc điểm hình thái, phân bố và chu trình sống ......................................8 1.3.2. Thành phần hóa học.....................................................................................10 1.3.2.1. Polisaccharid.........................................................................................10

1.3.2.2. Triterpenoid ..........................................................................................11 1.3.3. Tác dụng sinh học........................................................................................12 1.3.3.1. Công dụng, chỉ định và phối hợp trong dân gian..................................12 1.3.3.2. Tác dụng dược lý đã được nghiên cứu..................................................13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................16 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ.........................................................................16 2.1.1. Nguyên vật liệu............................................................................................16 2.1.1.1. Dược liệu Nấm Linh Chi ......................................................................16 2.1.1.2. Chiết xuất và phân đoạn cao đặc dược liệu Linh chi............................16 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................17 2.1.3. Hóa chất.......................................................................................................17 2.1.4. Trang thiết bị, dụng cụ.................................................................................17 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................18 2.2.1. Khảo sát và đánh giá một số chỉ tiêu của nguyên liệu thô nấm Linh chi....18

2.2.1.1. Mô tả.....................................................................................................18

2.2.1.2. Bột.........................................................................................................18 2.2.1.3. Mất khối lượng do làm khô ..................................................................18 2.2.1.4. Tro toàn phần........................................................................................19 2.2.1.5. Tro không tan trong acid.......................................................................20 2.2.1.6. Định tính...............................................................................................20 2.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao đặc dược liệu từ nấm Linh Chi .................23 2.2.2.1. Tính chất...............................................................................................24 2.2.2.2. Mất khối lượng do làm khô ..................................................................24 2.2.2.3. Độ PH ...................................................................................................24 2.2.2.4. Định tính...............................................................................................25 2.2.2.5. Tro toàn phần........................................................................................26 2.2.2.6. Tro không tan trong acid.......................................................................26 2.2.2.7. Cắn không tan trong nước.....................................................................27 2.2.2.8. Kim loại nặng (Pb)................................................................................27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................29 3.1. KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU THÔ NẤM LINH CHI......................................29 3.1.1. Mô tả............................................................................................................29

3.1.2. Bột................................................................................................................30 3.1.3. Mất khối lượng do làm khô.........................................................................30 3.1.4. Tro toàn phần...............................................................................................31 3.1.5. Tro không tan trong acid .............................................................................31 3.1.6. Định tính......................................................................................................31 3.1.7. Định lượng...................................................................................................33 3.2. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO ĐẶC DƯỢC LIỆU CHO NẤM LINH CHI.....................................................................................................................33 3.2.1. Tính chất:.....................................................................................................33 3.2.2. Mất khối lượng do làm khô.........................................................................34 3.2.3. Độ PH ..........................................................................................................34 3.2.4. Định tính......................................................................................................34 3.2.5. Tro toàn phần...............................................................................................35

3.2.6. Tro không tan trong acid: ............................................................................35 3.2.7. Cắn không tan trong nước. ..........................................................................35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................36 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................38

MỞ ĐẦU

Ngày nay trên thế giới, xu hướng tìm kiếm và sử dụng các sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên ngày càng tăng. Con người có khuynh hướng sử dụng nhiều thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên vì tính hiệu quả và an toàn của nó đối với cơ thể con người, nó có thể sử dụng thường xuyên và hằng ngày. Việt Nam chúng ta là một nước có thảm thực vật phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loài dược liệu quý. Nhân dân ta vốn có kinh nghiệm lâu đời trong việc dùng thảo dược. Nhiều cây thuốc đã được nghiên cứu kỹ càng về thành phần hóa học, cơ chế tác dụng chữa bệnh và được tiêu chuẩn hóa. Tuy nhiên, trong thực tế, nhiều cây thuốc chữa bệnh trong nhân gian cho đến ngày nay vẫn chưa được nghiên cứu một cách cụ thể và đầy đủ. Nấm Linh Chi (Ganoderma Lucidum) từ xa xưa đã được xem như là dược liệu quý hiếm sử dụng lâu đời, đặc biệt trong điều trị suy nhược thần kinh, mất ngủ, các bệnh về tim mạch, ung thư, thất khớp, tiểu đường, viêm gan (1) (2)…. Ở Trung Quốc, nấm Linh Chi được xem như “thần dược” giúp kéo dài tuổi thọ, ngăn ngừa lão hóa, tăng sức dẻo dai cho cơ thể (2). Với những tính năng và công dụng phong phú của nó đối với sức khỏe, nấm Linh chi được sử dụng không chỉ phổ biến ở các nước phương Đông mà còn khá được ưa chuộng ở các nước phương Tây. Tuy nhiên, cho tới nay những nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý của loài này vẫn còn hạn chế ở VN. Hầu như chưa có tiêu chuẩn đầy đủ nào để làm thước đo đánh giá chất lượng của cao dược liệu này; xây dựng một tiêu chuẩn để định danh, chống nhầm lẫn và xác định được các thành phần có tác dụng dược lý trong dược liệu là việc làm rất cần thiết và không chỉ dùng nó hằng ngày như trước đây với tác dụng là làm thực phẩm chức năng hay làm thuốc đơn thuần mà dựa vào đó tạo tao những sản phẩm mới lạ, mang tính công nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao. Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật và công nghệ, các dược liệu được tổng hợp được ứng dụng rộng rãi và sử dụng ngày càng nhiều. Vì vậy, để phát huy tiềm năng của nguồn dược liệu đáp ứng yêu cầu chăm sóc sức khỏe nhân dân, làm tiền đề tiếp túc tục nghiên cứu và phát triển tạo ra

những sản phẩm có tính ứng dụng cao chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và chiết xuất dược liệu nấm Linh Chi thành dạng cao đặc. Một trong số đó là vấn đề khảo sát (hoặc xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu) và xây dựng các tiêu chuẩn cơ sở cho các sản phẩm cao dược liệu. Đây cũng là một yếu tố cấp bách đối với các nhà hóa dược. Để có thể sử dụng dược liệu làm nguyên liệu làm thuốc hoặc tạo ra các sản phẩm sử dụng rộng rãi thì đòi hỏi cần phải xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng, đồng thời xây dựng các phương pháp thử để đánh giá các tiêu chuẩn đó. Từ những lý do trên, tôi nhận thấy Linh Chi là một loại dược-thực phẩm quý cần được nghiên cứu và phát triển. Để có thể tận dụng được nguồn dinh dưỡng cũng như các dược tính quý của nấm Linh Chi, góp phần đa dạng hóa các sản phẩm, nâng cao giá trị thương mại của nấm Linh Chi. Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây và dựng tiêu chuẩn cơ sở cao dược liệu từ nấm Linh Chi” với các mục tiêu sau:

1. Khảo sát được một số tiêu chuẩn của dược liệu thô nấm Linh Chi. 2. Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cao đặc dược liệu từ cây nấm Linh Chi.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH KHẢO SÁT DƯỢC LIỆU VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO DƯỢC LIỆU

Hiện nay, các nghiên cứu về dược liệu đang được chú trọng và phát triển. Tuy nhiên trong báo cáo, Cục Quản lý Y, Dược cổ truyền đã đưa ra những con số báo động, hàng năm, ngành dược Việt Nam sử dụng khoảng 60.000 tấn dược liệu các loại, trong đó có khoảng 80-85% nhập khẩu (chủ yếu nhập từ Trung Quốc). Như vậy, hiện nay mới chỉ có khoảng 1.400 tấn dược liệu nhập khẩu có nguồn gốc rõ ràng là rất ít so với nhu cầu sử dụng dược liệu hiện nay. Qua đây có thể thấy tình hình dược liệu vận chuyển lậu đang diễn biến phức tạp. Ngoài số liệu dược liệu không rõ nguồn gốc thì hiện người tiêu dùng cũng đang phải đối mặt với những nguy cơ sử dụng các loại dược liệu kém chất lượng, giả. Việc thông quan dược liệu qua cửa khẩu còn rất nhiều hạn chế. Tại các cửa khẩu, cán bộ hải quan chỉ kiểm tra được số lượng, trọng lượng bao hàng, không kiểm tra được chất lượng các dược liệu do việc xây dựng các tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu còn hạn chế và một số các loại dược liệu còn chưa có tiêu chuẩn nào cụ thể (3) (4) Từ đó thông qua việc khảo sát nguyên liệu thô có thể đánh giá được khách quan nguồn nguyên liệu đầu vào và thông qua việc đánh giá này nó được xem như là một tiêu chuẩn mới cho nguyên liệu thô, góp phần vào việc nâng cao tiêu chuẩn của dược liệu nấm Linh Chi từ đó có thể tạo ra được những sản phẩm cao chất lượng hơn.

1.1.1. Cách thức xây dựng tiêu chuẩn

Tiêu chuẩn cơ sở được xây dựng dựa trên các kết quả của một hay nhiều quá trình, dựa trên việc nghiên cứu khoa học và công nghệ, tiến bộ về mặt kỹ thuật, kinh nghiệm của người nghiên cứu cũng như nhu cầu và khả năng thực tiễn. Các tiêu chuẩn quốc gia tương ứng được khuyến khích sử dụng để xây dựng hoặc chấp nhận thành tiêu chuẩn cơ sở.

1.1.2. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nói chung

❖ Tiêu chuẩn cơ sở có thể được xây dựng theo những phương thức cơ bản sau: Chấp nhận tiêu chuẩn quốc gia, tiêu chuẩn khu vực hoặc tiêu chuẩn nước ngoài tương ứng thành tiêu chuẩn cơ sở. Ví dụ như đối với việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu ta tham khảo Dược điển VN V hoặc các Dược điển nước ngoài như: Dược điển Anh, Mỹ, Trung Quốc làm tài liệu tham chiếu. Sửa đổi, bổ sung tiêu chuẩn cơ sở hiện hành. Xây dựng mới tiêu chuẩn cơ sở cho cao dược liệu trên cơ sở sử dụng các kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, các kết quả thử nghiệm, đánh giá, phân tích và thực nghiệm. Đây chính là phương pháp mà bài báo cáo khóa luận này tôi muốn hướng tới để xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cao dược liệu từ nấm Linh Chi. Đồng thời dựa trên cơ sở các quy định tại Dược điển Việt Nam và các văn bản pháp luật liên quan (3) (5). ❖ Thông thường sẽ dựa vào các phương pháp sau để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở: Phương pháp cảm quan: bằng sự quan sát và những mô tả về hình dạng, kích thước, mầu sắc, mùi vị, các đặc điểm của bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệu hoặc đặc điểm thể chất của vật liệu. Từ đó chúng ta có thể nhận biết được từng vị dược liệu, cao dược liệu hay các sản phẩm từ chúng. Phương pháp này chúng ta có thể xác định sơ bộ được tên, bộ phận dùng, công dụng. Định tính: là những phương pháp dùng để nhận biết dược liệu bao gồm các kinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học hay các phương pháp lý hóa. Nhận biết dược liệu dựa theo kinh nghiệm bằng phương pháp đơn giản và truyền thống như sự chìm hay nổi trong nước, tiếng nổ, màu của ngọn lửa hay khói và mùi khi đốt cháy dược liệu… Định tính dược liệu bằng phương pháp vi học, bao gồm: • Vi phẫu: Cấu tạo giải phẫu của các cơ quan thực vật là một đặc điểm quan trọng trong kiểm nghiệm dược liệu. Trong phần lớn các trường hợp, hình dạn và cấu trúc của vách tế bào có ý nghĩa quan trọng nhất trọng nhất trong khảo sát vi học.

• Soi bột: mỗi một dược liệu đều có đặc điểm mô học đặc trưng, chúng được thể hiện một phần qua bột dược liệu. Khảo sát bột dược liệu bằng kính hiển vi để tìm ra những đặc điểm vi học đặc trưng của bột dược liệu, có vai trò trong việc định danh, xác định độ tinh khiết, phân biệt dược liệu này với dược liệu dễ nhầm lẫn, phát hiện giả mạo nếu có và xây dựng tiêu chuẩn dược liệu. • Định tính lý học là việc xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất, năng suất quay cực… của các dược liệu. • Định tính hóa học là phép thử một vài thành phần trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học. Phương pháp tiến hành được trình bày ở các chuyên luận dược liệu cụ thể. • Định tính sắc ký là việc sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao… để phát hiện một số thành phần có trong dược liệu; so sánh với chất chuẩn hay thành phần trong dược liệu chuẩn.

• Định tính huỳnh quang là quan sát sự phát huỳnh quang của bề mặt hay mặt cắt dược liệu hoặc của dịch chiết dược liệu ở điều kiện thường hay sau khi cho tác dụng với acid, kiềm hay thuốc thử. Trừ khi có quy định riêng trong chuyên luận, mẫu thử được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách nguồn sáng khoảng 10 cm. • Định tính vị thăng hoa thường được tiến hành như sau: Đặt một vòng kim loại đường kính khoảng 2 cm, cao khoảng 8 mm lên một tấm kim loại mỏng có kích thước hơi lớn hơn. Trải một lớp mỏng bột dược liệu trong vòng kim loại và đậy kín bằng một phiến kính bên trên có đặt một miếng bông tẩm nước lạnh. Đặt tấm kim loại đã có dược liệu này lên một lưới amiant có 1 lỗ tròn đường kính khoảng 2 cm sao cho vòng kim loại có dược liệu nằm trên lỗ này. Đun nóng nhẹ phía dưới lỗ cho đến khi bột dược liệu bị cháy sém. Nhấc phiến kính ra và để nguội. Quan sát hình dạng và màu sắc của tinh thể chất được thăng hoa đọng lại trên phiến kính bằng kính hiển vi và/hoặc tiến hành phản ứng hóa học thích hợp đối với chất đã được thăng hoa. • Thử tinh khiết: là cách kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu, có thể bao gồm một số hay tất cả các chỉ tiêu sau:

o Mất khối lượng do làm khô. oTro toàn phần và tro không tan trong acid hydrochloric. oCác tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến màu, hư thối. oTỉ lệ vụn nát của dược liệu. oHàm lượng kim loại nặng. oDư lượng các chất bảo vệ thực vật. oXác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác). • Định lượng: là việc xác định hàm lượng một hay một số chất có trong dược liệu bằng phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học. Định lượng bao gồm cả việc xác định hàm lượng chất béo, tinh dầu và xác định hoạt lực bằng các phép thử sinh học.

1.2. TỔNG QUAN VỀ CAO DƯỢC LIỆU 1.2.1. Định nghĩa

Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu, thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp. Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp). Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men làm phân hủy hoạt chất cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách dùng hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác.

1.2.2. Phân loại

Cao thuốc được chia làm 3 loại: Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai). Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc. Cao đặc: Là khối đặc quánh. Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20%.

Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%. Dịch chiết được cô đặc đến khi độ ẩm còn lại không quá 20% ta được cao đặc. Trong trường hợp điều chế cao khô, tiếp tục sấy khô để độ ẩm còn lại không quá 5%. Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 80o C. Nếu không có các thiết bị cô đặc và sấy dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt độ không quá 80oC (5) (6).

1.3. TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI 1.3.1. Đặc điểm thực vật 1.3.1.1. Khái quát về nấm Linh Chi

Chi Ganoderm thế giới có trên 250 loài. Trong đó, loài được sử dụng nhiều nhất cho đến thời điểm hiện tại để chăm sóc sức khỏe là nấm Linh chi Ganoderma luccidum (7). Nấm Linh Chi có tên khoa học là Ganoderma Lucidum. Gọi theo tên Trung Quốc là Lingzhi, theo tiếng Nhật Bản là Reishi, ở Việt Nam thì có tên gọi là nấm Linh chi, nấm Tiên thảo hay nấm Trường Thọ (1) (8). Trong số nhiều tên gọi khác nhau như Chi Linh, Mộc Chi Linh, Linh chi.. thì tên Linh chi là tiêu biểu và mang tính lịch sử. Trong sách “Thần Nông Bản Thảo” ra đời cách đây hơn 2000 năm, tên này đã chính thức được sử dụng (8). Nấm Linh chi thường sống trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu có chất sơ, phát triển mạnh trong điều kiện nóng và ẩm, và nhiều giống hoang dã được tìm thấy ở các vùng cận nhiệt đới của Phương Đông. Từ đầu những năm 1970, nấm Linh Chi đã trở thành một nguồn chính của nấm. Hiện nay nấm Linh Chi đã được trồng trọt nhân bằng cách sử dụng các chất nền như mùn cưa, gỗ... (9)

Giá trị dược liệu của Linh chi được ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc, cách đây hơn 4,000 năm (10). Trong sách Thần nông bản thảo cách đây khoảng 2,000 năm thời nhà Châu và sau đó được học giả nổi tiếng Trung Quốc Lý Thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi” với các tính chất và công dụng khác nhau gồm 6 loại:

Thanh chi (xanh) vị toan bình. Giúp cho sáng mắt, giúp cho an thần, bổ can khí, nhân thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng và thoải mái. Xích chi hoặc Hồng chi (đỏ), có vị đắng, ích tâm khí, chủ vị, tăng trí Hắc chi (đen) ích thận khí, khiến cho đầu óc sản khoái và tinh tường. Bạch chi (trắng) ích phế khí, làm trí nhớ lâu. Hoàng chi (vàng) ích tì khí, trung hòa, an thần. Tử chi (tím đỏ) bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, da tươi đẹp.

1.3.1.2. Vị trí phân loại của nấm Linh chi

Nấm Linh chi được phân loại như sau (8) (11): Giới nấm: Fungi Ngàn nấm đảm: Eumycota Lớp nấm đảm: Basidiomycota Bộ nấm đa tầng: Polyporales Họ nấm Linh chi: Ganodermataceae Chi: Ganoderrma

Loài : Ganoderma Lucidum

1.3.1.3. Đặc điểm hình thái, phân bố và chu trình sống a. Đặc điểm hình thái

Hình 1: Nấm LC trong tự nhiên Hình 2: Nấm LC được trồng nhân tạo Nấm hóa gỗ, sông một năm hay lâu năm (1).Quả thể có cuống dài, ngắn hay hầu như không có cuống và mũ đính lệch hay đính bên, màu nâu đỏ, bóng nhoáng. Mũ nấm mới sinh có dạng cục lồi, tròn; sau khi phát triển có dạng thận, dạng bán cầu, dạng quạt, có khi hầu như tròn. Mặt trên mũ nấm có những vân tròn đồng tâm, lượn sóng nhiều hay ít, hay có vân răng dạng phóng xạ (11). Mặt

dưới màu nâu nhạt mang các ống rất nhỏ chứa bào tử (1). Mép nấm nhỏ hoặc hơi tù, lượn sóng; hơi chia thùy ở những mũ nấm có kích thước lớn (11). Mũ mới sinh có màu trắng và có sắc thái vàng lưu huỳnh; sau chuyển sang màu vàng, vàng rỉ sắt, nâu, nâu đỏ, nâu hồng tím… tạo nên một lớp vỏ bóng nhoáng như quét sơn hoặc quét vecni. Kích thước mũ 2-2,5 x 3-30 cm; dày 0,5 đến 2 cm (11). Cuống nấm thường đính trên phần lõm vào của mũ nấm. Cuống mới hình thành màu trắng, sau chuyển sang vàng, vàng nâu... và phủ vỏ bóng, có màu sắc và cấu trúc tương tự mũ nấm. Cuống hình trụ, gần như tròn hoặc hơi dẹp, kích thước 1-20 x 0,5-4 cm (11). Bào tử hình bầu dục hoặc hình trứng, cụt đầu, màu gỉ sắt, có một mấu lồi và nhiều gai nhọn. Toàn cây nấm màu nâu đỏ, đỏ vàng hoặc nâu đen (1).

b. Phân bố, sinh thái

Nấm Linh chi là loài phân bố khắp nơi trên thế giới. Nấm mọc trên gốc, rễ cây sống và cây đã chết, trên rất nhiều gỗ mọc trong rừng và công viên, như cây ăn quả, đặc biệt là cây thuộc bộ Đậu như lim xanh, lim vàng, phượng vĩ,.. (11). Có thể tìm thấy Linh chi ở hầu hết các tỉnh vùng núi, từ Lào Cai đến Lâm Đồng. Ở các vùng rừng trước kia có nhiều cây lim bị khai thác, trên các gốc hoặc thân, cành còn lại đều có thấy nấm mọc vào mùa mưa ẩm như vùng rừng thuộc lâm trường Hương Sơn, tỉnh Hà Tĩnh; vùng rừng thuộc vườn quốc gia Bến En, tỉnh Thanh Hóa và Tam Đảo (Vĩnh Phúc)... (1). Nấm Linh chi sinh sống chủ yếu bằng bào tử nằm phía dưới của thể quả. Phần có chức năng sinh dưỡng chính là hệ sợi của nấm mọc ẩn trong gỗ mục hoặc đất. Hiện nay hầu hết các nước đã nghiên cứu và trồng được nấm Linh chi trên giá thể nhân tạo để dùng là thuốc (1).

c. Chu trình sống

Chu trình sống của nấm (9)được thể hiên qua sơ đồ sau đây:

Hình 3: Chu kì phát triển của nấm Linh chi A: Thể quả; B: Mặt ngoài phiến nấm; C: Đảm; D: Sự phối nhân trong đảm; E: Đảm và bào tử đảm; F: Bào tử đảm nảy mầm; G: Sợi nấm đơn nhân; H: Sự phối chất của 2 sợi nấm đơn nhân; I: Sợi nấm song nhân.

1.3.2. Thành phần hóa học

Cho đến nay các nhà khoa học đã tìm ra trong nấm Linh Chi có các hoạt chất quý như triterpenoid, polisaccharide, peptid, steroid, khoáng chất (7), acid béo no và không no (12), protein, nucleosid (13), ergosterol (2). Và các vitamin. Hầu hết, nấm Linh chi tưới chứa khoảng 90% nước theo trọng lượng, 10% còn lại gồm protein 10-40%, 2-8% chất béo, 3-28% carbohydrat, 3-32% chất xơ, 810% tro, và một số vitamin và khoáng chất chính như: kali, canxi, photpho, magie, sắt, kẽm, đồng,… Trong số các thành phần hóa học của nấm Linh có thi thì polisaccharide và triterpenoid được chú hơn cả và được xem là thành phần chính vì tác dụng sinh học đáng kể của chúng (14) (15) (16). Tuy nhiên, số lượng và tỷ lệ phần trăm từng thành phần có trong sản phẩm tự nhiên và thương mại, đã được chứng minh bằng số liệu trong nhiều nghiên cứu (17).

1.3.2.1. Polisaccharide

Các polisaccharide được phân lập từ bào tử, thể quả và sợi nấm hoặc tách từ dung dịch môi trường nuôi nấm (15). Polisaccharide là những thành phần có hàm lượng cao (có thể tới 45%) của nấm Linh Chi (7) gồm các polisaccharide trung tính (β-1-> 3, β-1 -> 6 hôm

D-glucan) (18); glucan có tính acid và polyglycan; heteroglucan liên kết protein; arabinoxyglucan (một heteroglucan phân nhánh cao); heteroglucan với liên kết β-1->4 và peptidoglucan (ganoderan A,B và C ) (19). Dây nối (1-3)-β-D-glucan làm cho mạch polisaccharid có dạng xoắn tương tự như tinh bột. (1-3)- β-Dglucan tan trong nước no ngs và tan 1 ít trong nước lạnh. Dung dịch nước của (1-3)-β-D-glucan ở nồng độ cao có độ nhớt (7). Các β-glucan trong thể quả của Linh chi có thể có cùng khối lượng phân tử nhưng khác nhau về mực độ phân nhánh. Khối lượng phân tử các chất nà vào khoảng 1.050.000 đvc. Dây nhánh trong β-glucan của Linh chi thường là 1->6 . Tỉ lệ nhánh thay đổi từ 1/3–1/23. Các heteropolisacharide trong Linh chi cấu tạo bởi các đường D–glucose, D–galatose, D–mannose, D–xylose hay L-fucose (7).

1.3.2.2. Triterpenoid

Terpen là hợp chất tự nhiên mà bộ khung cơ bản của nó bao gồm 1 hay nhiều đơn vị isopren C5. Triterpenoid là một phân lớp của nhóm terpen có cấu trúc khung C30. Cấu trúc hóa học của triterpenoid trong nấm Linh chi dự trên lanosterol, là một chuyển hóa của lanosterol. Các triterpenoid đã nhận được sự chú ý đáng kể do tác dụng dược ly nổi bật của chúng. Trong phần không phân cực của thể quá có các triterpenoid tự do với hàm lượng có thể tới 3-5%. Các chất chính là các acid ganoderic A, B, V, D, F, H, I, J, K, L, M, R, S, T, V, X, Y, Z, W; lucidenic A, B, C, D, I, ganoderan A, B, C và lucidenol A, B, C. Các triterpen khác bao gồm ganoderol A và B, acid ganodernic A-D, acid ganodermic. Một số triterpenoid như acid ganoderic A, C, I, J; acid lucidenic A, D, I và lucidon A và C làm cho Linh chi có vị đắng, khác với các loại nấm khác (7). Acid ganoderic A và acid ganoderic B là hai chất thuộc triterpenoid được phân lập lần đầu từ Linh chi vào năm 1982 (20) Cho đến nay người ta phát hiện có hơn 150 triterpenoid được xác định trong quả thể, bào tử và hệ sợi 23 và được phân thành năm nhóm cấu trúc chính (20). Các acid ganoderic A, B, H chỉ được phát hiện trong quả thể, trong khi các acid ganoderic R, S, T là các triterpenoid chính trong sợi nấm.

Hàm lượng triterpenoid là khác nhau ở các bộ phận khác nhau và ở các giai đoạn phát triển của nấm. Sự khác nhau của các triterpenoid có thể được sử dụng để phân biệt dược liệu này với các loài khác gần tương tự và sử dụng như một tiêu chuẩn để đáng giá chất lượng của các mẫu Linh chi khác nhau (2) (21). Dưới đây là cấu trúc hóa học của một số hợp chất hóa học trong nấm Linh

chi:

Hình 4: Lanosterol Hình 5: Acid gannoderic B

Hình 6: Lucidaciol Hình 7: Lucidenic A

1.3.3. Tác dụng sinh học 1.3.3.1. Công dụng, chỉ định và phối hợp trong dân gian

Trong nhân gian nấm linh chi được sử dụng để: Tăng cường trí nhớ và chức năng hô hấp, chống lão hóa, làm tăng tuổi thọ; an thần, giảm đau, chống oxy hóa, bảo vệ gan, chữa trị viêm gan mãn tính, giải độc, hạ đường huyết, cải thiện chuyển hóa dinh dưỡng, điều trị ho do cảm cúm, ho có đờm, chứng giảm bạch cầu, cơn đau thắt ngực, có tác dụng nhất định đến suy nhược thần kinh, suy nhược tim, đau lá lách, đau dạ dày, đau thận, đau nửa đầu, đau mật. Ngày dùng 2

gam đến 5 gam, dưới dạng sắc hoặc thuốc bột, hoặc dạng chè tan. Có thể dùng riêng hoặc phối hợp với Nhân sâm (22) (23).

1.3.3.2. Tác dụng dược lý đã được nghiên cứu

❖ Tác dụng chống khối u Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo đã chứng minh Linh chi có khả năng ức chế phát triển của tế bào khối u (Boh, 2013; Wachtel-Galor et al., 2011). Một số ít nghiên cứu lâm sàng chứng minh vai trò của Linh Chi trong chữa trị một số bệnh ung thư. Ví dụ như, phép trị liệu ung thư tuyến tiền liệt sử dụng hỗn hợp các thảo dược chứa Linh chi làm giảm rõ rệt lượng kháng nguyên đặc hiệu trong tuyến tiền liệt (24). Mặt khác, trong chữa trị ung thư, Linh chi được sử dụng để phòng ngừa nhiễm trùng cơ hội, chống lại tác dụng phụ của các liệu pháp giảm đau, hạn chế việc sử dụng morphine, ngăn ngừa bệnh tái phát, tăng cường sự phục hồi sức khỏe sau phẫu thuật (23) (24). Nhiều tác giả đã cho thấy hiệu quả tiêu diệt một số tế bào ung thư của polisacharide như tế bào ung thư bạch cầu chuột (L1210) (25), tế bào ung thư bạch cầu người HL-60 (25), tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC-3 Acid ganoderic T (AG –T) phân lập từ nấm Linh Chi có tác dụng ức chế tế bào ung thư xâm thực và di căn trong cơ thể. ❖ Điều biến miễn dịch Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng kích thích hệ miễn dịch của nấm Linh Chi. Theo Roy (2006), trong các liệu pháp bằng thảo dược hiện nay ở phương Tây, Linh chi chủ yếu được dùng như thuốc bổ, đặc biệt là như chất điều biến miễn dịch. Linh chi được dùng để tăng cường chức năng miễn dịch và đề phòng nhiễm trùng cơ hội trong các phác đồ điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV. Nhờ khả năng điều biến miễn dịch và ức chế sự sản sinh histamine, Linh chi cũng có thể được dùng như tác nhân chống viêm trong điều trị hen suyễn và dị ứng. Linh chi cũng được dùng trong điều trị viêm khớp, viêm phế quản dị ứng (22) (23).

❖ Tác dụng hạ huyết áp Các thử nghiệm có kiểm chứng trên người cho thấy cao chiết Linh chi có tác dụng (55mg x 3 lần/ngày) sử dụng trong 1 tháng có tác dụng hạ huyết áp rõ rệt so với giá trị cơ bản của những bệnh nhân cao huyết áp không đáp ứng với nifedipine hay với nimodipine, so với placebo. Một số acid genoderic như acid genoderic B, D, F, H phân lập từ nấm Linh chi có tác dụng chống tăng huyết áp, trong đó acid genoderic F có tác dụng mạnh nhất (7). ❖ Tác dụng kháng khuẩn Theo Wasser (2010), gần đây, nhiều nghiên cứu chứng minh G. lucidum có chứa các thành phần kháng khuẩn có khả năng ức chế một số loại vi khuẩn. Các thành phần dược tính quan trọng (polysaccharide và triterpenoid) trong Linh chi có khả năng ức chế sự nhân bản của HIV, virus viêm gan siêu vi B, virus Herpes, v.v. Theo một số nghiên cứu, khả năng tăng cường hệ miễn dịch của Linh chi cũng đóng vai trò trong hoạt tính kháng khuẩn và kháng virus. Dù cơ chế vẫn chưa được xác định, Linh chi mở ra một khả năng mới trong sử dụng Linh Chi kèm theo các liệu pháp nhằm giảm tác hại của các loại thuốc kháng khuẩn, kháng virus (26) (23). ❖ Chống oxy hóa, ngăn ngừa lão hóa da: Nhiều thành phần trong Linh chi, đặc biệt là polysaccharide và triterpenoid, thể hiện khả năng chống oxy hóa in vitro. Các hoạt chất trong Linh chi giúp cơ thể tiêu diệt các gốc tự do, chống oxy hóa, từ đó ngăn ngừa ung thư và các bệnh mãn tính khác, nhờ các tác dụng trên mà nấm Linh Chi được sử dụng trong ngành mỹ phẩm với công dụng tạo ra các loại mỹ phẩm trong bảo vệ sắc đẹp như các loại kem, các loại mặt nạ chống lão hóa… (27) (28)

Năm 2002, Yon và Lin 69 đã báo cáo phức hợp polysaccharide-peptid gồm 16 loại amino acid có tác dụng chống oxy hóa. Năm 2005, Nguyễn Thượng Dong và cộng sự tiến hành trên chuột nhắt trắng, nhận thấy cao nước và cao ethanol 80% chiết xuất từ nấm Linh chi có hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình gây viêm bằng CCl4 (29).

Nấm Linh chi thể hiện hoạt tính khử gốc superoxid in vitro điển hình ở các cao cồn, cao MeOH… Theo nhóm nghiên cứu của Trần Thị Văn Thi, cao triterpenoid tổng chiết xuất từ nấm Linh chi có tác dụng chống oxy hóa (ức chế 19.94% sự tăng hàm lượng MDA với liều 484 mg cao/kg thể trọng chuột (30). Cao cồn và cao nước điều chỉnh về mức bình thường hoạt tính GSH-Px trong gan chuột bị gây tổn thương oxy hóa bằng cyclophosphamid (31). Năm 2015, Yurkiv B và cộng sự tiến hành nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa trên chuột được gây đái tháo đường bằng strepzotocin, đã nhận thấy nấm làm tăng hoạt động của enzym chống oxy hóa. Từ đó giúp ngăn ngừa stress oxy hóa phát triển phát triển trong tế bào bệnh nhân tiểu đường (32).

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 2.1.1. Nguyên vật liệu 2.1.1.1. Dược liệu Nấm Linh Chi

Dùng toàn bộ phần thể quả của nấm Linh Chi để làm nguyên liệu nghiên cứu. Cắt thành lát mỏng, phơi hoặc sấy khô nấm Linh Chi, đóng gói và bảo quản để tiến hành làm thực nghiệm.

2.1.1.2. Chiết xuất và phân đoạn cao đặc dược liệu Linh chi

Mẫu nấm Linh Chi sau khi đã được thái thành các lát mỏng và phơi khô (5 kg), sau đó được chia thành 3 phần và mang đi chiết với nước. Quá trình chiết được diễn ra như sau: nấm Linh Chi được cho và một túi vải lọc và được chiết với nước(3x7 lít) trong một nồi chiết áp xuất dành cho dược liệu (1000 C, 6h), dịch chiết sau đó được để qua một đêm để lắng đi các tạp chất có khích thước nhỏ, hoặc các tạp chất tan được trong nước nóng, sau một đêm toàn bộ cắn không tan lắng xuống đáy và sau đó ta tiếp tục lọc qua vải lọc để thu dịch chiết trước khi đêm đi cô thành cao đặc. Toàn bộ dịch chiết được cô đến 1 lượng nhất định (4 lít) trong 1 máy cô dược liệu sau đó được cô cách thủy ở nhiệt độ 80o C để bay hơi dung môi và thu được cao đặc Linh Chi. Cao đặc được bảo quản để nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao đặc Linh Chi

Hình 8: Nồi chiết nấm Linh Chi Hình 9: Nồi cô dược liệu

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu

Nấm Linh chi được thu mua tại địa bàn thành phố Đà Nẵng sau đó được phơi hoặc sấy khô và xay thành bột được đóng gói bảo quản nơi khô ráo để làm thực nghiệm. Dùng cao đặc đã thu được từ quy trình chiết và cô đặc để làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao đặc Linh chi.

2.1.3. Hóa chất

Các loại thuốc thử dùng trong định tính: thuốc thử anthron, dung dịch phenol 5%, acid sulfuric đậm đặc, thuốc thử Mayer và Dragendorff Dung môi, hóa chất: chloroform, ethanol 950, NH4OH đậm đặc, HgCl2, EtOH 96o , KI, HCl(đặc, 6N, 2N, 0.1N), Bi(NO3)3, HNO3 30%, NaOH 0.1N, Na2CO3, 2M, n-hexan, ethyl acetate, MeOH, AlCl3, NaOH, H2SO4 đặc, phenol, nước cất 1 lần. Một số hóa chất khác dùng cho phản ứng: H2SO4, HCl, HNO3, Na2CO3, NaOH 10%, FeCl3 5%, và các hóa chất khác thuộc khoa Hóa trường Đại Học Sư Phạm Đà Nẵng.

2.1.4. Trang thiết bị, dụng cụ

• Máy siêu âm.

• Máy đo pH. • Máy ly tâm .

• Cân phân tích. • Nồi cách thủy.

• Lò nung. • Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, cốc thủy tinh có mỏ… • Các máy xay dược liệu, bếp điện, bếp đun cách thủy, tủ sấy, lò nung, thiết bị đun hồi lưu… • Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc Khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Khảo sát và đánh giá một số chỉ tiêu của nguyên liệu thô nấm Linh chi.

Dựa trên các tiêu chí trong Dược điển Việt Nam V về tiêu chuẩn dược liệu ta khảo sát một số chỉ tiêu sau: • Mô tả • Bột • Mất khối lượng do làm khô • Tro toàn phần • Tro không tan trong acid

• Định tính • Định lượng

2.2.1.1. Mô tả

Dựa vào cảm quan bên ngoài ta chúng ta có thể dùng mắt để kiểm tra hình thái, màu sắc, mùi vị, kích thước bằng cách đo trực tiếp. Mẫu dược liệu phải đạt tiêu chuẩn đã yêu cầu như trong phần dược điển đã quy định.

2.2.1.2. Bột

Cũng như phần mô tả nấm Linh Chi sau khi đã xay thành bột thì được kiểm tra (trong phương pháp trong bài báo cáo này chỉ kiểm tra về mặt cảm quan, vì điều kiện phòng thí nghiệm không cho phép nên không thể soi được dưới kính hiển vi)

2.2.1.3. Mất khối lượng do làm khô

Dược liệu phải được làm thành mảnh nhỏ đường kính không quá 3 mm; lượng đem thử từ 2 gam đến 5 gam; chiều dày lớp mẫu thử đem sấy là 5 mm và không quá 10 mm đối với dược liệu có cấu tạo xốp. Nhiệt độ và thời gian sấy theo yêu cầu của chuyên luận riêng (PL9.6 DĐVN V) Tiến hành như sau: Dùng dụng cụ dùng để sấy bằng thủy tinh rộng miệng đáy bằng có nắp mài làm bì đựng mẫu thử; làm khô bì trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 1000C, sau đó để trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng rồi cân để xác

định khối lượng bì. Cân ngay vào bì này một lượng chính xác 1 gam mẫu thử với sai số <= 10 %. Sau đó 1 gam bột dược liệu Linh Chi này được dát mỏng thành lớp mỏng trên bề mặt bì đựng (có độ dày không quá 5 mm). Tiến hành làm khô trong tủ sấy ở 1000C (± 2 °C ) trong vòng 5h, sau khi sấy cho nhanh bì đựng chứa mẫu vào bình hút ẩm và làm nguội tới nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm có silica gel rồi cân ngay. ❖ Độ ẩm của nguyên liệu thô nấm Linh Chi được tính theo công thức: (��1 +��)−��2 �� ∗100(��)

❖ Trong đó: o M: khối lượng mẫu thô (g); o M1: khối lượng bì trước khi nung(g); o M2: khối lượng bì sau khi nung (g);

2.2.1.4. Tro toàn phần

Cho 2 gam bột LC vào một chén sứ đã nung và cân bì. Nung ở nhiệt độ không quá 450oC tới khi không còn carbon, làm nguội rồi cân. Bằng cách này mà tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít nước nóng cho vào khối chất đã than hoá, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc không tro. Rửa đũa thuỷ tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc. Cho giấy lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng. Hòa dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450oC đến khi khối lượng không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo dược liệu đã làm khô trong không khí (PL 9.8 DĐVN IV). ❖ Hàm lương tro toàn phần theo %(X) của cao dược liệu được tính theo công thức:

��2 −��1 �� ∗100(����)

❖ Trong đó: o M: khối lượng mẫu thô (g); o M1: khối lượng bì trước khi nung(g); o M2: khối lượng bì sau khi nung (g);