MATERIALI E METODI Sono state rintracciate nel Salento nove accessioni di pomodoro da serbo, mostrate nella fig. 1, i cui semi sono stati raccolti ed utilizzati nel campo sperimentale presso l’Orto Botanico dell’Università del Salento. Raggiunta la piena maturità i pomodori sono stati raccolti e immediatamente caratterizzati. Si è determinata la percentuale di sostanza secca ponendo i diversi campioni in stufa termo-ventilata a 105°C fino a costanza di peso. Per effettuare l’estrazione dei vari carotenoidi, i vari campioni sminuzzati sono stati omogenati (1:5 p/V) per 10’ a freddo e al riparo dalla luce in etanolo-esano 30:70 contenente lo 0,1% di butil idrossi toluene (BHT) come antiossidante; l’omogenato è stato posto al buio a 4°C in agitazione per 1 ora, quindi filtrato a pressione ridotta e l’operazione è stata ripetuta per tre volte. Dopo l’ultima filtrazione il residuo è stato inoltre estratto con diclorometano (1:2 p/V) e gli estratti combinati in un imbuto separatore. È stata quindi prelevata la fase organica ed evaporata a pressione ridotta a freddo. Il residuo è stato risolubilizzato in 5 mL di diclorometano con lo 0,1% di BHT ed immediatamente utilizzato per la successiva analisi HPLC effettuata usando una colonna C30 Alltech Prontosil (250x4,6 mm 5 mm) termostatata a 18°C in un cromatografo Agilent serie 1100 equipaggiato con un rilevatore DAD settato a 476 nm e con un loop di iniezione da 20 mL. L’eluizione è avvenuta ad un flusso costante di 2 mL/min. utilizzando una miscela di acetonitrile/
8 - Alimenti Funzionali - IV (2012) maggio
propanolo 70:30 con lo 0,1% di BHT (fase A) e diclorometano con lo 0,1% di BHT (fase B) settando lo strumento in modo da realizzare il seguente gradiente di concentrazione: 0’ 99% A, diminuendo linearmente fino a 96% in 20’, poi fino all’85% in altri 25’ e mantenendo queste condizioni fino a 60’. Dopo l’analisi la colonna veniva riequilibrata con le condizioni iniziali per 15’ prima della successiva analisi. L’individuazione dei diversi composti è avvenuta confrontando tempo di ritenzione e spettro di assorbimento con standard di riferimento di all trans luteina, b-carotene e all trans licopene (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) mentre la loro quantificazione mediante rette di taratura realizzate con gli stessi standard. Per l’estrazione delle sostanze fenoliche, i diversi campioni sono stati
omogenati in metanolo all’80% acidificato con HCl 0,01% 1:3 p/V per 10’ a freddo e al riparo dalla luce, l’omogenato è stato quindi posto al buio a 4°C in agitazione per 1 ora, quindi filtrato e l’operazione è stata ripetuta per tre volte. L’estratto è stato quindi evaporato a pressione ridotta e ripreso con un egual volume di acqua acidificata con HCl 0,01% e infine purificato mediante solid phase extraction (SPE) con una colonna C18 polarplus (J.T. Baker). Dopo aver attivato la colonna SPE con 5 volumi di metanolo e 2 di acqua il campione è stato caricato e lavato tre volte con un volume di acqua acidificata con 0,01% di HCl, infine il campione purificato è stato eluito con un volume di metanolo acidificato ed utilizzato per la successiva analisi HPLC svolta con una colonna C18 Agilent ODS (250x4,6
Fig. 1 - Accessioni di pomodoro da serbo recuperate e caratterizzate.