Las técnicas de Biología Molecular como una herramienta para el ordenamiento sanitario acuícola M. en C. César Eduardo Gámiz Mejía Asesor Cientifico Uniparts SA de CV
Noviembre, 2013
La acuacultura a nivel mundial
•
FAO (2012). The state of world fisheries and aquaculture. Food And Agriculture Organization Of The United Nations
Producci贸n de M茅xico
Producci贸n por tipo de ambiente
Especies de importancia mundial
Marco de Referencia En México Litoral
11,592.77 km
Aguas Continentales
2.8 millones de hectáreas
Lagunas Costeras
1.5 millones de hectáreas
Estados productores en México Camarón
Sonora, Sinaloa, Nayarit, Tamaulipas, Baja California Sur, Colima y Yucatán
Tilapia, Carpa y Bagre
Aguascalientes, Tlaxcala, Tabasco, Jalisco, Veracruz, Michoacán, Tamaulipas, Zacatecas, Morelos (ornato) y Yucatán
Trucha
Estado de México, Puebla, Michoacán, Hidalgo, Veracruz y Chihuahua
Moluscos bivalvos (ostión) Maricultura y Ornato
Baja California, Baja California Sur y Veracruz ?
Ejemplo de producci贸n en M茅xico
CRONOLOGÍA DE LAS PRINCIPALES ENFERMEDADES DEL CAMARÓN EN MÉXICO Inicio de la Camaronicultura en México
Vibriospp.
H 2S Enteritis Hemocítica 70 - 80
81
82
83
84
HPV
BP
Síndrome de la Melanosis IHHNV Infecciones Bacterianas en Texas
86
87
88
89
90
91
92
AFLATOXIN AS Síndrome de la Melanosis del Conducto Eferente
TSV Abril Mayo
NHP
85
Vibriosis spp
Enfermedades Micóticas ( Lagenidium y Fusarium) y Microsporidios en Tx. BMN en Asia MBV en Asia
IHHNV
BSX
Reo virus
BP en Texas
Microsporidios
Fusarium solani Def. vitamina C. Epicomensales
93
Rickettsias (NHP) en Texas
94
95
96
97
98
WSSV Abril Mayo 99
00 01 02
WSSV y YHV en Texas
HPV
TSV en Texas TSV en Ecuador WSSV en Asia YHV en Asia
GAV en Australia
WSSV en Honduras, Centro y Sudamérica.
Bacterias luminiscentes (Vibrio spp) en Texas
IMNV Brasil
Síndrome de Gaviota (Vibrio spp) IHHNV en Texas
Lv Nodavirus Yucatán Octubre Noviembre ? 03
04
05 06
(EMS / AHPNS Lv Nodavirus Belice Spiroplasmosi s
Colombia (Fecha aproximada)
CRONOLOGÍA DE LAS PRINCIPALES ENFERMEDADES DEL CAMARÓN EN EL MUNDO
201 3
fjg
Tipos de Agentes Infecciosos Relacionados con la Sanidad Acuícola Agentes infecciosos que afectan la salud del pez (Sanidad Acuícola) • Agentes propios de la especie de pez (ejem. Renibacterium sp. Dactylogyrus sp.) • Agentes no específicos (ejm. Aeromonas sp. Diplostomulum sp.-) Agentes infecciosos que afectan la salud del hombre (Inocuidad) • Agentes infecciosos que se transmiten por peces como hospederos intermediarios (ejem.. Gnathostoma sp. ) • Agentes infecciosos que se transmiten por contaminación utilizando los peces o subproductos como vehículos (ejem. Salmonella sp. Vibrio sp. Mycobacterium sp)
Gloquidio en Branquia de Tilapia, Chihuahua,
Algunos Aspectos Importantes de la Sanidad Acuícola en México 1. Inventario de Problemas Sanitarios y Agentes Infecciosos (granja vs silvestre) 2. Ordenamiento Sanitario Acuícola. 3. Certificación de Cuencas con Vocación Acuícola (zonas libres) 4. Certificación de las Unidades de Producción Acuícola. 5. Nutrición y Alimentación. 6. Uso Responsable de Productos Químicos y Medicamentos 7. Formación de Recursos Humanos en sanidad Acuícola 8. Estandarización de las Técnicas de Diagnóstico (método de muestreo, Tec. de Dx. Lab. Molecular etc.) 9. Actualización de las Normas Oficiales Mexicanas (NOMs 010 y 011) 10.Fortalecimiento de los Comités Estatales de Sanidad Acuícola
Estandarización de las Técnicas de Diagnóstico Manual de Técnicas de Laboratorio en Sanidad Acuícola
1. Método de Muestreo (selección y envío) 2. Técnica de Diagnostico Presuntivo – Muestras semipermanentes – Muestras permanentes 3. Técnica de Diagnostico de Certeza – Laboratorio(Infraestructura apropiada y capacidad de respuesta en Histopatología, Microbiología, Parasitología, Biología Molecular, Química, etc.) – Personal (capacidad técnica) (Conocimiento, experiencia y destreza, en laboratorio y campo en el desarrollo del método)
Agentes Infecciosos de Importancia en Acuacultura en México • • • • • • • • • • •
Virus (TSV, WSSV, IPN, CCVD, LMBV, Linfocistis, etc) Bacterias (Aeromonas, Vibio, NHP Renibacterium, Edwrdsiella, Flavobacterium, Mycobacterium, Streptococcus, etc…) Hongos (Saprolegnia, Achlya, Ichthyophonus, Branchiomyces, etc….) Protozoarios (Hexamita, Trichodina, Scyphidia, Apiosoma, Epistylis, Chilodonella, etc….) Trematodos Monogéneos (Gyrodactylus, Dactylogyrus, Cichlidogyrus Ligictaluridus, etc…) Trematodos Digéneos (Metacercarias Clinostomun, Dilostomulum, Centrocestus, Neascus, etc.) Cestodos (Bothriocephalus spp. Ligula, Proteocephalus etc…) Nemátodos (Capillaria, Eustrongylides, Contracaecum, Spinitectus, Gnathostoma, Goezia etc…) Acantocéfalos ( Echinorhynchus, Neoechinorhynchus, etc…) Hirudineos (Piscicola, Myzobdella, etc…) Copepodos (Lernaea, Argulus, Ergasilus, Actheres, etc…)
Manual de Pruebas de Diagnóstico para los Animales Acuáticos 2013 Enfermedades de los peces • Necrosis hematopoyética epizoótica (PCR=c, REA y Secuenciación=a) • Infection with Aphanomyces invadans (Síndrome ulcerante epizoótico) (PCR=a) • Infección por Gyrodactylus salaris (PCR= especie) • Necrosis hematopoyética infecciosa (PCR=a) • Infección por el virus de la anemia infecciosa del salmón (RT-PCR=b, secuenciación=a) • Herpesvirosis de la carpa koi (PCR=a) • Virosis del bagre de canal (PCR=a) • Viremia primaveral de la carpa (PCR=a) • Septicemia hemorrágica viral (RT-PCR= b, RT-qPCR=a) • Herpesvirosis del Salmón masou (PCR=a) • Encefalopatía y retinopatía virales (PCR=b, secuenciación=a)
Manual de Pruebas de Diagnóstico para los Animales Acuáticos 2013 ENFERMEDADES DE LOS CRUSTÁCEOS
• Plaga del cangrejo de rio (Aphanomyces astaci) (PCR =b, Secuenciación =a) • Necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (PCR=a) • Mionecrosis infecciosa (RT-PCR anidada=a) • Hepatopancreatitis necrotizante (PCR=a) • Síndrome de Taura (RT-PCR=a) • Enfermedad de las manchas blancas (PCR=a) • Enfermedad de la cola blanca (PCR=a) • Enfermedad de la cabeza amarilla (PCR=a) • Baculovirosis esférica (Penaeus monodon-type baculovirus) (PCR=a) • Baculovirosis tetraédrica (Baculovirus penaei) (PCR=a)
¿Por que biología molecular? • Rapidez de resultados • Especificidad • Sensibilidad • Identificación de variantes genéticas (filogenia) • ¿Precio y facilidad?
Técnicas moleculares de utilidad en acuacultura • PCR (RT-PCR, qPCR) • Ingeniería molecular (iRNA) • Microarreglos • Secuenciación (Sanger y masiva)
Flujo de trabajo en BiologĂa Molecular
Todos los métodos de purificación de ácidos nucleicos deben: • Romper efectivamente las células o el tejido
• Desnaturalizar proteínas y complejos de nucleoproteínas • Inactivar las nucleasas endogeanas • Purificar el ácido nucleico especifico
Métodos de extracción de ácidos nucleicos • Extracción por solventes orgánicos • Salting out • Extracción por soportes sólidos • Extracción por partículas paramagnéticas (PMP)
Soportes solidos y PMP
VS
¿Extracción manual ó automatizada? • Consistencia en la extracción • Pureza • Menos tiempo de trabajo en el laboratorio • Sin contaminación cruzada • Sin errores del usuario
Maxwell 16 Varios tipos de muestras
¿Como funciona? 1. Homogenizado y mezclado de la muestra 2. Recuperación de las PMP 3. Unión de los ácidos nucleicos a las PMP 4. Lavados consecutivos 5. Elución del ácidos nucleico
Tipos de kits • Maxwell® 16 Blood DNA Purification Kit • Maxwell® 16 LEV Blood Kit • Maxwell® 16 Buccal Swab LEV DNA Purification Kit • Maxwell® 16 FFPE Plus LEV DNA Purification Kit • Maxwell® 16 Cell DNA Purification Kit • Maxwell® 16 Cell LEV DNA Purification Kit • Maxwell® 16 Tissue DNA Purification Kit • Maxwell® 16 LEV simplyRNA Cells Kit • Maxwell® 16 LEV simplyRNA Tissue Kit • Maxwell® 16 Total RNA Purification Kit • Maxwell® 16 Viral Total Nucleic Acid Purification Kit • Maxwell® 16 Polyhistidine Protein Purification Kit
DNA genómico – Tipos de muestras Tejido ~ 45 minutos
•
Animal
Sangre/Celulas ~35 minutos
•
Sangre completa (50-400uL)
–
Hasta 1.2cm de cola de ratón
•
Capa leucocitaria (≤500µL)
–
Hasta 50mg
•
Cultivo celular de mamífero e insecto
•
*Plantas
•
Insectos completos
•
Gusanos completos
– Hasta 5 x 106 celulas •
Bacterias Gram (-)
•
*Bacterias Gram (+)
• *Levaduras *pueden requerir un tratamiento enzimático previo
DNA genómico – Tejido Maxwell® 16
Dos pasos, un día
•
Los plungers homogenizan directamente el tejido y las células
•
El buffer de lisis altera proteínas y membranas
•
No requiere digestión con proteinasa K!!!
Otros métodos
Tres pasos, dos días
B
H
I
L
P
S T1cm T0.5cm
5uL de elución •
Sin digestión de noche entera con Proteinase K
•
DNA de alto peso molecular intácto
Pu lm
1
ila oph Dro s
ón
Varios tejidos de ratón (50mg)
Ho ja de t
om ate
DNA genómico – Tejido
3
5uL de elución
5
Sin contaminación cruzada •
400uL de sangre completa de hombre y mujer en cartuchos alternados •
DNA amplificado usando primers Y específicos multiplex. •
No se detecta contaminación cruzada
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 ♂ +
L
M F M F M F M F M F M F M F M
F
- L
•
Pleopodos o branquias de 1-5 organismos
•
Kits Maxwell-16 Cell LEV DNA purification kit y Maxwell 16 Tissue LEV total RNA Purification kit
Análisis filogenético de TSV
Ventajas del Maxwell 16 • Procesamiento de 1-16 muestras simultaneas • Pureza adecuada para reacciones posteriores de biología molecular • Pocos pasos (preparación del cartucho y colocación de la muestra) • Protocolo rápido de extracción ~45 min
Como ayuda este tipo de herramientas a la acuacultura • Monitoreo de una mayor cantidad de muestras • Diagnóstico más rápido en el caso de brotes • Consistencia de los resultados (equipo automatizado)
Flujo de trabajo en BiologĂa Molecular
¡¡GRACIAS!!
¿Preguntas?
Las técnicas de Biología Molecular como una herramienta para el ordenamiento sanitario acuícola M. en C. César Eduardo Gámiz Mejía Asesor Cientifico Uniparts SA de CV
Noviembre, 2013