Técnicas de biología molecular
(dNTP) agregados a la mezcla de reacción. La temperatura a la que se realiza el tercer paso está condicionada por aquella a la cual «trabaja» la enzima ADN polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, apareamiento, extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicación de numerosos ciclos «en cadena» da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los iniciadores. La técnica general de PCR puede tener diversas variaciones. Las más comunes son las denominada PCR larga (LPCR) utilizada para amplificar regiones genómicas entre 5-40 kb, y la PCR anidada, en la que se aumenta la especificidad añadiendo dos cebadores nuevos dentro del fragmento diana, con lo que se obtienen fragmentos más cortos pero más específicos. 3.2. Estudio de la expresión genética
Las técnicas que se describen a continuación evalúan la expresión «funcional» del genoma. 3.2.1. Northern blot
Esta técnica, como el Southern blot, se basa en el principio de hibridación, pero en este caso el ácido nucleico utilizado es el ARN total o ARNm previamente aislado en lugar del ADN. Para ello, se separan en bandas (de distinto tamaño) las diferentes moléculas de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa. A continuación, se transfieren las moléculas de ARN del gel a una membrana de nitrocelulosa o de nylon (soporte) y se incuba la membrana con una solución que contenga la sonda de ADN (específica para cada ARNm) marcada (hibridación). Finalmente, se detecta la sonda hibridada por autorradiografía o mediante una cámara digital sensible a la quimioluminiscencia. El Northern blot mide la expresión del genoma, es decir, la cantidad de un determinado ARNm. La posición de la banda indica el tamaño de la especie de ARNm que se ha detectado, y la intensidad de la banda la concentración de este ARNm (expresión). La
intensidad de las bandas se evalúa mediante análisis informáticos de densitometría. 3.2.2. Western blot
La técnica del Western blot permite evaluar la cantidad existente de una proteína concreta en una muestra determinada. Consiste en realizar un extracto de todas las proteínas del tejido o cultivo celular objeto de estudio y separarlas por su peso molecular mediante electroforesis en gel de acrilamida y dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE). Las proteínas se transferirán posteriormente a una membrana de nitrocelulosa. La proteína cuya expresión se quiere determinar se detecta mediante un anticuerpo específico (anticuerpo primario). Este anticuerpo primario será reconocido a su vez mediante otro anticuerpo (anticuerpo secundario) marcado (quimioluminiscencia). Al igual que se ha descrito anteriormente para el Southern o Northern blot, las membranas se expondrán a una película de autorradiografía o a una cámara digital sensible a la quimioluminiscencia. La proteína se detecta en forma de banda, cuya intensidad es proporcional a su cantidad en el tejido. 3.2.3. Hibridación in situ
Las secuencias de ADN (o ARNm) también pueden localizarse directamente en muestras de tejido mediante hibridación in situ. En este caso, el tejido objeto de estudio se fija y baña en una solución de hibridación semejante a la descrita anteriormente. La ventaja que ofrece esta técnica es que permite la localización precisa en el tejido de una secuencia determinada de ADN (o ARNm) y, por tanto, la identificación del tipo celular que expresa esa secuencia. 3.2.4. RT-PCR
Es una técnica que permite de una manera cuantitativa (incluso a tiempo real) examinar la expresión de un ARNm determinado sin necesidad de transferencias o sondas marcadas. Permite cuantificar ARNm que se encuentren a muy baja concentración. Para ello, el ARNm a cuantificar se copia en ADN (ADNc) mediante la acción de una enzima de origen viral denominada transcriptasa reversa (RT). Posteriormente este ADNc se amplifica mediante una PCR convencional. El fragmento amplifi249