Técnicas de biología molecular
posible construir un mapa de restricción en el que se localizan las posiciones de corte para cada una de las enzimas. El análisis permite localizar un gen de interés en el ADN y facilitar así su aislamiento. El análisis de restricción se utiliza para multitud de aplicaciones, entre ellas, la detección de polimorfismos, la fragmentación del ADN para el Southern blot, el clonaje del ADN, etc.
mara digital sensible a quimioluminiscencia. El ADN (o ARNm) detectado por la sonda aparecerá como una banda. La intensidad de la banda será proporcional a su concentración inicial, y su posición en la membrana tendrá relación con su peso molecular (cuanto más pequeño sea éste, mayor será el espacio recorrido en el gel). 3.1.3. Polimorfismos
3.1.2. Southern blot
La complementariedad de bases de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de dos monocatenarios se denomina hibridación. Una de las aplicaciones más conocidas de la hibridación es la técnica de Southern basada en la capacidad de un fragmento de ADN (sonda) para «buscar», «encontrar» y «fijarse» (hibridar) en un fragmento complementario de ADN. En esta técnica, las moléculas de ADN de doble cadena se digieren con enzimas de restricción y se someten a electroforesis en un gel de agarosa para separar los distintos fragmentos en función de su tamaño. Después, se somete el gel a condiciones alcalinas (solución rica en NaOH) con objeto de separar las dos hebras de ADN. Una vez separadas las moléculas, se transfieren a una membrana de nylon o de nitrocelulosa (filtro), por capilaridad (haciendo pasar agua a través del gel, para que el agua arrastre las moléculas de ADN del gel y las adhiera al filtro). A continuación se baña la membrana en una solución de hibridación que contiene la sonda de interés. Esta sonda está marcada con nucleótidos modificados (biotina, fluoresceína, digoxigenina, etc.) que producirán quimioluminiscencia. La especificidad de la unión se puede modular alterando la estictez o ajuste de la hibridación. Para ello, se modifica principalmente la concentración salina de la solución de hibridación y/o la temperatura a la que ésta se realiza. Condiciones de hibridación de gran estictez pueden identificar secuencias que sólo se diferencien en un nucleótido, mientras que condiciones de baja estringencia permiten identificar nuevas secuencias de ADN (genes) parecidos («emparentados») con la sonda empleada. Al finalizar la hibridación, la membrana se expone a una película radiográfica o a una cá-
Se denomina polimorfismo a la existencia simultánea en una población de genomas con distintos alelos para un locus determinado. El ADN genómico nuclear es extremadamente variable incluso entre individuos de la misma especie. Esta diversidad en el genoma es sinónimo de polimorfismo. Los polimorfismos afectan a regiones codificantes del genoma (polimorfismo génico) y a regiones no codificantes (polimorfismo genético en general). Pueden consistir desde la variación de un par de bases, hasta millones de pares de bases. El primero se conoce como polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Si el polimorfismo se produce en células germinales, se transmite hereditariamente, si es en células somáticas, puede no tener efecto u originar enfermedades como el cáncer. Los polimorfismos se pueden categorizar de distintas maneras, como por ejemplo según sus implicaciones en la salud. Los polimorfismos fisiológicos, o normales, no implican enfermedades (variaciones normales entre razas y estirpes, con un valor en estudios poblacionales y evolutivos). Los polimorfismos patológicos están asociados a diversas enfermedades y condiciones como Alzheimer, diabetes, reacciones a fármacos. etc. Los polimorfismos también se pueden categorizar según el lugar que ocupan: polimorfismos en regiones génicas codificantes (grupo sanguíneo ABO, galactosemia, alfa-1-antitripsina), en regiones génicas no codificantes (regiones reguladoras, afectando a la expresión genética), en regiones no génicas (asociación con enfermedades e identificación genética de individuos; ADN-mini y microsatélites) y en el genoma mitocondrial (espermatozoides con movilidad reducida). Los polimorfismos pueden ser analizados mediante digestión con endonucleasas (restriction fragment length polymorphism, RFLP). Los 247