От Редактора
Заполнение пробелов в Вашей Программе тестирования производственной среды с помощью Проточной цитометрии
Присутствие бактерий на предприятиях по производству продуктов питания и напитков может повлиять на срок годности и качество продукта. Патогенные микроорганизмы могут даже привести к заболеваниям пищевого происхождения. Вот почему очистка и дезинфекция имеют первостепенное значение для обеспечения безопасности пищевых продуктов, и защиты вашей репутации и вашего бизнеса.
Но бороться с тем, чего вы не видите, не всегда легко и просто. Визуальный осмотр может помочь, но само по себе этого недостаточно. Традиционные микробиологические методы часто не позволяют проводить профилактический контроль и мероприятия непосредственно перед запуском производственных линий, поскольку лабораторные результаты требуют нескольких дней. Тесты ATP, хотя и просты, и быстры, количественно определяют биологические остатки, которые не являются значимым показателем эффективности дезинфекции. Тем не менее, несмотря на эти ограничения, от Вас ожидают быстрого принятия обоснованных решений.
В этом выпуске Spot On мы обсуждаем импедансную проточную цитометрию и то, как она может обеспечить производителям продуктов питания немедленную проверку в любом месте их программ тестирования производственной среды. Я начинаю с рассмотрения 5 самых трудно контролируемых параметров в любой программе производственного тестирования и подробно расскажу о том, почему традиционные методы тестирования могут делать пропуски, например, жизнеспособных, но некультивируемых или психотрофных бактерий - и почему это является проблемой.
Мой коллега Кристиан Илеа продолжит дискуссию об импедансной проточной цитометрии и новом проточном цитометре CytoQuant®. С помощью CytoQuant® производители продуктов питания могут получить мгновенное представление о концентрации бактерий и твердых остатках в их производственной среде. Быстрый взгляд на внутреннюю работу CytoQuant® и то, как он способен количественно определять бактерии и остатки, мгновенно разрешает проблему.
В конце концов, слишком многое поставлено на карту — с точки зрения безопасности потребителей и репутации компании, — чтобы производителям продуктов питания приходилось ждать несколько дней, чтобы получить жизненно важную информацию об их программе очистки и дезинфекции. Именно это побудило нас исследовать проточную цитометрию и, в конечном счете, разработать CytoQuant®.
Я надеюсь, вам понравится этот выпуск Spot On
Стефан Видманн Руководитель группы исследований и разработок, Romer Labs
4 Spot On Выпуск 15 6.0 µm 5.5 µm 5.0 µm 4.5 µm 4.0 µm 3.5 µm 3.0 µm 2.5 µm 2.0 µm
Необычные подозреваемые: 5 Возможных
недочётов в Вашей Программе тестирования производственной
Даже самые тщательно спланированные программы мониторинга очистки и дезинфекции имеют свои слабые места. Стефан Видманн подробно рассматривает пять наиболее вероятных – и наиболее опасных – пробелов в вашей программе мониторинга производственной среды и объясняет, что это такое, почему вы должны контролировать их и что вы можете с этим сделать.
Автор: Стефан Видманн, руководитель группы исследований и разработок Romer Labs
Публикация Romer Labs ® 5
6.0 µm 5.5 µm 5.0 µm 4.5 µm 4.0 µm 3.5 µm 3.0 µm 2.5 µm 2.0 µm
среды
Хотя мы еще не знаем всех видов бактерий, которые могут быть Жизнеспособными, но не поддающимися культивированию, мы пока знаем некоторые из них; они включают в свое число
индикаторные ор-
ганизмы, примеси и патогены.
Жизнеспособные, но не поддающиеся культивированию (VBNC) микроорганизмы.
Долгое время микробиологи предполагали, что любые бактерии, которые не смогли вырасти на обычных питательных средах, были мертвы. Последующие исследования показали, что существует третье состояние помимо культивируемого и мертвого: жизнеспособное, но некультивируемое (VBNC). В целом, бактерии в состоянии VBNC не размножаются, но все еще живы, о чем свидетельствует их метаболическая
активность. Наиболее важным для нас является
тот факт, что они могут стать пригодными для культивирования после реанимации и, таким образом, размножаться в пище. Более того, некоторые патогенные бактерии не будут расти в отсутствие хозяина, и им нужно только выжить в пище до тех пор, пока они не попадут в организм, чтобы вызвать заболевание.
Существует много причин, по которым бактерии могут перейти в состояние VBNC; голодание, инкубация вне оптимального для роста температурного диапазона, повышенные осмотические
концентрации, уровни концентрации кислорода или воздействие белого света — вот лишь некоторые причины. Специфические особенности рассматриваемого штамма бактерий определяют, что именно заставляет бактерии переходить в это состояние.
Почему Нас это должно волновать?
Некоторые бактерии, способные переходить
в состояние VBNC, представляют опасность для
производства пищевых продуктов. Хотя мы еще не
знаем всех видов бактерий, которые могут стать
VBNC, мы знаем некоторые, которые это делают;
они включают индикаторные организмы (такие как Klebsiella aerogenes и Klebsiella pneumoniae),
примеси (такие как Lactobacillus plantarum и Lactococcus lactis) и патогенные микроорганизмы (такие как Salmonella Typhimurium, Campylobacter coli или Listeria monocytogenes) среди них.
Идентифицировав их, мы должны теперь спросить, могут ли эти бактерии вернуться в полностью культивируемое и потенциально патогенное состояние. Микробиологи долгое время были в неведении по этому вопросу, поскольку трудно полностью отделить бактерии VBNC от культивируемых. Исследователи частично решили эту проблему, используя статистический подход: они разбавляют большое количество бактерий VBNC до такой степени, что практически невозможно сохранить какие-либо культивируемые бактерии. Затем бактерии подсчитываются через определенный промежуток времени. Если наблюдается высокая степень роста, единственный возможный вывод состоит в том, что бактерии покинули состояние VBNC и стали пригодными для культивирования. Еще одним следствием является то, что если они могут вернуться в пригодное для культивирования состояние, они также могут снова стать патогенными. Есть примеры того, как именно это явление приводило к вспышкам. Например, было подозрение на VBNC E. coli O157 во время вспышки в Японии в 1997 году, поскольку общее число Кишечной палочки было незначительно, а шигатоксигенные штаммы, такие как O157, могли вызывать заболевание в очень малых количествах.
Анаэробные и микроаэрофильные бактерии
Анаэробные бактерии или, в более общем смысле, анаэробные микроорганизмы можно разделить на три группы: облигатные, аэро-устойчивые и факультативные. Как следует из их названий, у каждого из них есть особые требования к окружающему их воздуху, или, точнее,
6 Spot On Выпуск 15
№1
№2
к кислороду. Облигатные анаэробы, такие как Clostridioides difficile, подвергаются воздействию кислорода и погибают вскоре после воздействия. Аэротолерантные бактерии, такие как Clostridium botulinum, не могут использовать кислород и не будут ни умирать, ни расти в его присутствии.
Факультативные анаэробы могут использовать
кислород, но не нуждаются в нем для роста, как в случае с кишечной палочкой. Существует также группа микроаэрофильных бактерий, таких как Campylobacter , которым для роста требуется
некоторое количество кислорода, хотя и в гораздо меньших количествах (1-2%), чем в обычном воздухе, но они могут подавляться в аэробных условиях.
Почему нас это должно волновать?
Некоторые патогенные бактерии имеют особые условия для роста. В настоящее время термотолерантные виды Campylobacter вызывают беспокойство у специалистов общественного здравоохранения. В среднем каждая вторая курица заражена Campylobacter, что делает мясо птицы одной из наиболее распространенных причин пищевых отравлений. В ЕС заболевания, вызываемые видами Campylobacter, встречаются в два раза чаще, чем заболевания, вызываемые сальмонеллой. Из анаэробной группы виды Clostridia, такие как C. botulinum ответственен за заболевание пищевого происхождения, известное как ботулизм, часто передаваемое через консервированную (то есть бедную кислородом) пищу, в которой C. botulinum может размножаться и вырабатывать соединение ботулин, которое токсично для человека. Другой вид Clostridia, C. perfringens, является наиболее распространенным источником пищевых отравлений в США и Канаде и вызывает такие симптомы, как спазмы в животе и диарея. Риск заражения C. perfringens особенно сильно коррелирует с продуктами питания, находящимися или хранящимися в теплых условиях в течение более длительных периодов времени, что способствует их росту до инфекционных показателей (104 кое/г).
№3
Аномалия Большого количества агаровых пластин По некоторым оценкам, только 1% бактерий можно культивировать с помощью имеющихся в настоящее время в нашем распоряжении знаний и технологий. “Аномалия большого количества агаровых пластин” — это термин, который мы используем для описания наблюдения, что количество микроскопических клеток значительно выше, чем соответствующее количество “колониеобразующих единиц” на агаровых пластинках. Пара примеров может лучше всего проиллюстрировать это явление: в то время как 50% микроорганизмов флоры полости рта можно культивировать с помощью агаровых пластин, большая часть желудочно-кишечной флоры вообще не может быть культивирована. Причин для этого множество, но сообщество организмов, окружающих рассматриваемый вид, включая другие бактерии, а также растения и животных, может играть важную роль. Методы подсчета аэробных пластинок основаны на очень общих средах, которые не поддерживают рост большинства групп бактерий. Технически, это на самом деле не является частью аномалии большого количества агаровых пластин, поскольку некоторые бактерии способны расти на специальных агаровых пластинах в особых условиях (таких как анаэробные или микроаэрофильные условия).
Почему нас это должно волновать?
Аномалия большого количества агаровых пластин не создает существенных проблем при ежедневных испытаниях, поскольку количество аэробных пластин для индикаторных микроорганизмов специфично для данной производственной среды и, как таковое, всегда относительно
установленного базового уровня, определенного
для этой производственной среды. Однако пластинчатые методы требуют очень
Все методы на основе пластин требуют очень много времени и инкубационного периода до десяти дней, в зависимости от действующего протокола.
Публикация Romer Labs ® 7
Психротрофные
виды Pseudomonas являются микроорганизмами, наиболее часто ответственными за порчу охлажденного
мяса, хранящегося в аэробных условиях.
много времени и требуют инкубационного периода продолжительностью до трех дней, в зависимости от действующего протокола. Существуют
прямые методы, которые не требуют стадии культивирования для подсчета бактерий; микроскопы обеспечивают всестороннее представление
о бактериях, но также отнимают много времени. В
то время как прямые методы, такие как проточная
цитометрия, широко распространены в водоочистных сооружениях, они не распространены в пищевой промышленности.
Психротрофные бактерии
Психротрофные бактерии могут расти при температурах до 0 °C, при оптимальных и максимальных температурах роста выше 15 °C. Это делает такие микробы особенно опасными для пищевых
продуктов и напитков, таких как сырое мясо и молоко, хранящихся при низких температурах
в течение более длительного периода времени. Психротрофными группами бактерий, наиболее
часто встречающимися в пищевых продуктах, являются грамотрицательные виды Pseudomonas, Aeromonas , Achromobacter, Serratia, Alcaligenes , Chromobacterium и Flavobacterium, а также грамположительные виды, такие как Bacillus, Clostridium, Corynebacterium , Streptococcus , Lactobacillus
и Microbacteria . Известно также, что Listeria monocytogenes и некоторые штаммы Clostridium botulinum способны размножаться при низких температурах.
Почему нас это должно волновать?
Психротрофные бактерии являются дополнением и могут значительно снизить качество и
срок годности пищевых продуктов. Охлажден-
ные производственные помещения и резервуары
для хранения, создают благоприятную среду для
размножения этих видов бактерий. Например,
в охлажденном молоке Pseudomonas fluorescens
может продуцировать как протеазы, так и липазы. Следовательно, виды, принадлежащие к роду Pseudomonas , считаются обычно ответственны-
ми за технологические трудности, поскольку вырабатываемые ими протеазы и липазы могут вызывать разложение молочного жира и белков, придавая молоку сероватый цвет и горький вкус. Виды Pseudomonas являются микроорганизмами, наиболее часто ответственными за порчу охлажденного мяса, хранящегося в аэробных условиях. Хорошо известно, что виды Pseudomonas очень устойчивы и способны выдерживать стрессовые условия окружающей среды, которые подавляют рост других микроорганизмов, вызывающих порчу. В охлажденном сыром мясе в вакуумной упаковке в микрофлоре в большинстве случаев преобладают психротрофные молочнокислые бактерии. Кроме того, рост патогенных микроорганизмов при хранении в холодильнике может привести к серьезным заболеваниям.
№5
Биопленки Микроорганизмы способны колонизировать поверхности, образуя полимерную матрицу, в которой может присутствовать множество видов микроорганизмов; это известно как биопленка. Фактические данные показывают, что способность образовываться и выживать в биопленках не ограничивается определенными группами микроорганизмов. На самом деле подавляющее большинство бактерий способны образовывать биопленки. Таким образом, биопленки могут состоять либо из монокультур, либо из нескольких различных видов микроорганизмов. Некоторые исследователи предположили, что сложная структура смешанных биопленок делает их более стабильными и устойчивыми к воздействию чистящих химических средств. Первоначальная популяция, которая связывается с поверхностью, может изменять свойства этой поверхности, позволяя тем, которые появляются позже, прилипать посредством межклеточной ассоциации;
8 Spot On Выпуск 15
№ 4
в некоторых случаях прикрепление второго вида может повысить стабильность популяции биопленки. Например, исследования показывают, что L. monocytogenes с большей вероятностью прилипает к стали в присутствии Pseudomonas
Почему нас это должно волновать?
Биопленки, образующиеся на оборудовании для обработки пищевых продуктов и других поверхностях, контактирующих с пищевыми продуктами, являются постоянным источником загрязнения, угрожая общему качеству и безопасности пищевых продуктов и, возможно, приводя к болезням пищевого происхождения, а также экономическим потерям. Известно, что микроорганизмы, вызывающие порчу, являются причиной почти трети потерь в цепочках поставок продуктов питания, что делает предотвращение образования биопленок и борьбу с ними приоритетной задачей в пищевой промышленности. Микроорганизмы, которые образуются или размножаются в биопленках, более устойчивы к дезинфекции, что делает их проблематичными в широком спектре отраслей пищевой промышленности. Другие последствия биопленок, такие как коррозия металлических поверхностей, являются еще одной серьезной проблемой в пищевой промышленности. В любом случае наличие биопленок на пищевой фабрике ставит под угрозу здоровье человека. Степень риска зависит от вида бактерий, образующих эту трехмерную живую структуру.
Как нам устранить эти пробелы?
Потенциал проточной цитометрии
Производители продуктов питания, как правило, имеют в своем распоряжении не так уж много вариантов. Те, которые обеспечивают хоть какую-то точность, такие как витальное окрашивание в сочетании с микроскопами, могут количественно определять бактерии VBNC, но требуют много времени и специального оборудования. Все группы анаэробных и микроаэрофильных бактерий, за заметным исключением факультативных анаэробов, могут расти на классических агаровых
пластинах, но только при тщательно контролируемом уровне кислорода. Однако агаровые пластины не являются панацеей. Агаровые пластины способны подсчитывать
только приблизительно 1% известных видов бактерий, и для получения результатов требуются дни – до 10 дней в случае психротрофных бактерий. Методы АТФ, хотя и быстрые, не позволяют
количественно определить бактерии и имеют лишь ограниченное применение при обнаружении бактерий в биопленках; кинетические данные из свободно взвешенных планктонных
клеток не следует использовать в качестве эталона, поскольку высвобождение АТФ для биопленок намного ниже. Более того, следы АТФ, поступающие из остатков пищи или грибов, могут легко затмить АТФ, выделяемый бактериями, поскольку эукариотические клетки содержат в 10 миллионов
раз больше АТФ, чем прокариотические клетки. Соответственно, устройства ATP, используемые для обнаружения биопленок, как правило, имеют гораздо более высокий предел обнаружения, что означает, что они не так чувствительны, как при обнаружении свободно плавающих бактерий. Каждый из этих пяти случаев показал, насколько трудно бывает обнаружить бактерии и остатки на поверхностях пищевых продуктов; недостатки наиболее распространенных методов обнаружения, таких как чашки Петри и тестирование на АТФ, столь же очевидны, сколь и хорошо документированы.
Что могут сделать производители продуктов питания, чтобы устранить пробелы, оставленные культуральными методами и тестированием на АТФ? В следующей статье мой коллега Кристиан Илеа обсудит потенциал импедансной проточной цитометрии и проточного цитометра CytoQuant®, нового решения, которое мгновенно определяет количество бактерий и остаточных частиц на поверхностях.
Следы АТФ, поступающие из остатков пищи или грибов, могут легко затмить АТФ, выделяемый бактериями, поскольку эукариотические клетки содержат в 10 миллионов раз больше АТФ, чем прокариотические клетки.
Публикация Romer Labs ® 9
10 Spot On Выпуск 15
Революция или Простая Эволюция?
Проточная цитометрия
и
проверка мойки
и дезинфекции на
предприятиях пищевой
промышленности
Безопасность пищевых продуктов во многом зависит от гигиенических условий на предприятиях по производству пищевых продуктов. Высокий уровень бактерий, вызывающих порчу, может повлиять на срок годности и качество пищевых продуктов, в то время как присутствие патогенных микроорганизмов (таких как сальмонелла и листерия) может привести к серьезным заболеваниям. Производители продуктов питания должны тщательно следить за чистотой и отсутствием патогенных микроорганизмов в своей производственной среде, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение конечного продукта. Но как это делается в настоящее время?
Автор: Кристиан Илеа, руководитель отдела маркетинга и управления продуктами Romer Labs
Публикация Romer Labs ® 11
Производите-
лям продуктов
питания нужен быстрый метод, который непосредственно определяет количество как бактерий, так и
частиц остатков и не зависит от дезинфицирующих средств и температуры.
Визуальный осмотр
Хотя визуальный осмотр является необходимым условием, сам по себе он недостаточен. Это субъективный и неточный способ проверки качества очистки. Что еще более важно, даже если на поверхности нет видимых следов, это не означает, что она безупречна. Визуальный осмотр не может гарантировать, что все остатки пищи от предыдущего использования были удалены или что дезинфицирующее средство эффективно снизило уровень микробов на поверхности.
Подсчет микробов культуральными методами
Это традиционные методы контроля за гигиеной
рабочей среды. Как правило, существует два способа
отбора проб: контактный и смывы с поверхности.
При использовании контактных методов пластины
или предметные стекла помещаются на поверхность,
с которой отбирается образец, а затем инкубируют-
ся. Отбор проб на основе смывов проводится с помощью тампонов или губок, затем промываемых в буферном растворе, который после инокулируется в стерильные среды и инкубируется. Основным
ограничением этих традиционных методов определения микробов является количество времени, необходимое для получения результатов. Кроме того, большинство видов бактерий невозможно культивировать на агаре, явление, известное как аномалия большого количества агаровых пластин.
Обнаружение АТФ Аденозинтрифосфат (АТФ) - это нуклеотид, который клетки используют для доставки энергии. Его можно рассматривать как молекулярную “денежную единицу" для энергии во всех живых клетках. Энергия передается, когда АТФ распадается на нуклеозид и свободный фосфат. Гидролиз ковалентных связей
фосфатов высвобождает энергию, которая используется для реакций. Коммерческие тест-системы АТФ
используют реакцию люциферин / люцифераза, которая очень распространена в природе, для генерации света с использованием энергии, обеспечиваемой АТФ. Чем больше света излучается, тем больше присутствует АТФ, что может косвенно указывать на большее количество остатков пищи или (потенциально) на большее количество микроорганизмов.
Однако есть одно важное предостережение: поскольку эти системы основаны на ферментативной реакции, потенциальные ингибиторы или неоптималь-
ные условия окружающей среды могут привести к
ошибочным результатам. Температура окружающей
среды может увеличить время реакции, в то время
как свет может затруднить получение правильных
показаний. Кроме того, дезинфицирующие средства
могут влиять на реакцию, а это означает, что может
не быть реальной корреляции между живыми бактериями, присутствующими на поверхности, и результатами измерения АТФ. Следовательно, методы на
основе АТФ обычно используются для тестирования
поверхностей перед нанесением дезинфицирующего средства.
Методы ATP имеют еще один недостаток: их применимость зависит от характера обрабатываемых пищевых продуктов. Большинство пищевых продуктов оставляют после себя остатки, содержащие большое количество АТФ, которое на несколько порядков превышает количество, содержащееся в бактериальных клетках. Практически это означает, что системы ATP нельзя использовать для оценки микробного загрязнения поверхностей на большинстве предприятий пищевой промышленности. Хотя ни одна бактерия не может быть подсчитана напрямую, системы ATP широко используются, поскольку результаты генерируются в течение нескольких секунд, что до сих пор не было доступно ни в одной другой общедоступной технологии.
Итак, почему мы не можем иметь все это? Святой грааль проверки чистоты и
дезинфекции
Что нужно производителям продуктов
питания, так это быстрый метод, который непосредственно определяет количество как бактерий, так и частиц остатков и не зависит от дезинфицирующих
средств и температуры. Хотя это кажется недостижимым, базовая технология для достижения этой цели уже существует и применяется сегодня.
Представление проточной
цитометрии Проточная цитометрия (FCM) относится к группе методов, которые используют оптические или электрические сигналы для обнаружения и измерения определенных физических или химических свойств клеток и частиц, взвешенных в жидкости. Около 300 исследований, проведенных в период с 2000 по 2018 год, оценивали FCM как инструмент для характеристики микробиологического качества воды. Это исследование смогло проиллюстрировать ценность FCM для очистки, распределения и повторного использования воды. В настоящее время существует множество исследований, документирующих успешное применение FCM, достаточно надежных, чтобы предположить, что он может разумно и реалистично получить широкое распространение в качестве обычного метода оценки качества воды.
Какое отношение все это имеет к оценке эффективности очистки и дезинфекции на предприятиях пищевой промышленности? Методы, ранее применявшиеся для определения качества воды, часто были ограничены низкой чувствительностью, высокими требованиями к трудозатратам и времени, восприимчивостью к помехам со стороны ингибирующих соединений и трудностями в различении жизнеспособных и нежизнеспособных клеток. (Все это звучит знакомо, не так ли?) Но будьте осторож-
12 Spot On Выпуск 15
ны: флуоресцентные проточные цитометры, как правило, являются громоздкими и дорогостоящими устройствами, для работы с которыми требуется высококвалифицированный персонал.
Использование возможностей
проточной цитометрии в портативном
устройстве
Чтобы сделать FCM жизнеспособным решением
для проверки очистки на предприятиях пищевой промышленности, он должен быть представлен в портативном формате, простом и удобном в использовании, но при этом достаточно точным, чтобы обеспечить надежный подсчет бактерий и остатков частиц в образцах с производственной среды. Это стало возможным благодаря использованию импедансной проточной цитометрии. Импедансная проточная цитометрия — это особый вид проточной цитометрии: вместо оптических систем, таких как лазерная технология, импедансные проточные цитометры используют переменный ток с различной частотой, что позволяет устройству обнаруживать и подсчитывать клетки и остаточные частицы отдельно. В то время как оптические проточные цитометры способны только подсчитывать клетки, помеченные красителями, импедансный проточный цитометр может выполнять ту же операцию без какой-либо необходимости в маркировке. По сравнению с другими проточными цитометрическими приборами они компактны, портативны и работают на аккумуляторах, что позволяет использовать их непосредственно на месте отбора образца.
Как импедансные проточные
цитометры могут отличать клетки от остаточных частиц?
Электромагнитные свойства бактерий позволяют проточным цитометрам отличать их от других частиц. Цитоплазма и клеточная мембрана бактерии изменяют электрическое поле уникальными и идентифицируемыми способами. В то время как электрический ток будет проходить через металлические частицы в основном беспрепятственно, непроводящие частицы сопротивляются полю. Интактные бактерии, однако, напоминают как непроводящие, так и проводящие частицы: клеточная мембрана препятствует проникновению в нее низких частот, в результате чего они напоминают непроводящие частицы; однако на высоких частотах электрический ток проникает через мембрану. Микроэлектроды в импедансном проточном
цитометре генерируют эти электрические поля и позволяют устройству количественно определять
изменения проводимости и сопротивления с точки зрения отдельных измерений интактных клеток и частиц.
Применение импедансной проточной
цитометрии для обеспечения
безопасности
пищевых продуктов:
внедрение CytoQuant®
Как упоминалось выше, одним из преимуществ импедансных проточных цитометров перед другими типами цитометрических устройств является их портативность. Лёгкие, небольшие и мобильные, они работают вне лабораторий на предприятиях, где гигиена является первостепенной заботой. Импедансный проточный цитометр CytoQuant® предназначен для использования именно в таких областях, включая пищевые производства и чистые помещения. Импедансная проточная цитометрия даёт значительные преимущества производителям продуктов питания, желающим проверить свою безопасность и программы очистки производственных линий: быстрое и раздельное количественное определение бактерий и остатков частиц (которые могут служить показателем эффективности очистки), чувствительность метода, надёжность набора и самого цитометра. Система CytoQuant ® проста в использовании, так как прибор выполняет всю работу, за исключением отбора проб. Тест начинается со взятия смыва с заранее определенной площади (например, 20 x 20 см) тестируемой поверхности. Для продолжения процедуры тампон помещают в пробирку, содержащую запатентованный раствор, а затем пробирку с тампоном встряхивают, чтобы приостановить размножение бактерий. При тестировании промывочных вод образец помещают непосредственно в пустую пробирку, затем добавляют несколько капель раствора электролита.
После смешивания образца пользователь вставляет пробирку в CytoQuant ®. Две иглы проникают в нижнюю часть пробирки, соединяя жидкость с системой подачи в устройстве. Затем, после того как раствор попадает в проточную систему, он проходит между электродами в проточной ячейке. Через 30 секунд устройство отображает результаты на экране, отдельно для бактерий и частиц.
Революция или Эволюция?
Мобильный проточный цитометр CytoQuant® позволяет сразу проверить качество процедур очистки и дезинфекции на предприятиях пищевой промышленности и в других областях, где гигиена имеет решающее значение. Благодаря непосредственному количественному определению бактерий и остатков на поверхностях без негативного влияния дезинфицирующих средств или температуры, он обеспечивает существенные преимущества по сравнению с устройствами ATP, а 30-секундное время до результата делает его идеальным дополнением к программам контроля гигиены, в которых уже используются методы культивирования. Учитывая огромный потенциал импедансной проточной цитометрии, она может рассматриваться
как равная или даже заменяющая культуральные методы в качестве стандарта в проверке очистки. Это сравнимо с настоящей революцией в этой области.
Импедансные проточные цитометры используют переменный ток с различной частотой, что позволяет устройству обнаруживать и подсчитывать клетки и остаточные частицы отдельно.
Публикация Romer Labs ® 13
Импедансная
проточная
цитометрия
является мощным вариантом проточной
цитометрии, поскольку она очень надежна
и может использоваться
для оценки клеточных
характеристик, которые иначе невозможно
измерить без использования
молекулярных
меток, таких
как целостность клеточной мембраны.
цитометрия и ее
использование для мониторинга производственной
среды и оборудования в пищевой промышленности
Что такое проточная цитометрия, как она работает и какое применение она может
найти в мониторинге производственной среды в пищевой промышленности?
Флорин Соптика и Стефан Видманн отвечают на эти и многие другие вопросы.
Автор: Флорин Соптика, менеджер по продуктам Romer Labs;
и Стефан Видманн, руководитель группы исследований и разработок Romer Labs
Что такое проточная цитометрия?
Проточная цитометрия относится к группе методов, которые используют лазер или электрическое поле для подсчета клеток, взвешенных в жидкости, и определения некоторых их физических или химических свойств. Оптимально, когда только одна клетка за раз проходит через микро-жидкостной канал цитометра, который обнаруживает изменения длины волны света или электрического заряда при прохождении каждой клетки или других частиц. Поскольку проточная цитометрия обычно требует больших и дорогих устройств, а также сложных подготовитель-
ных этапов, этот метод традиционно ограничивался лабораторным использованием в таких областях применения, как исследования и медицина.
Применение импедансной проточной
цитометрии для подсчета как клеток, так и остаточных частиц Импедансная проточная цитометрия основана на технологии, лежащей в основе счетчиков частиц Coulter, которые могут определять размер и подсчитывать взвешенные в электролитах частицы на основе изменений импеданса, вызванных замещением электролитов частицами. Измеряя несколько
частот одновременно для каждой проходящей частицы, импедансная проточная цитометрия позволяет различать частицы не только по размеру, но и
Как
по электрическим свойствам. Это мощный вариант проточной цитометрии, поскольку он очень надежен и может быть использован для оценки клеточных характеристик, которые иначе невозможно измерить без использования молекулярных меток, таких как целостность клеточной мембраны. Поэтому вместо лазера импедансный проточный цитометр использует переменный ток, изменяющиеся частоты которого позволяют устройству обнаруживать, измерять размер и отдельно подсчитывать клетки, с не поврежденной мембраной, и другие частицы. По сравнению с другими устройствами для проточной цитометрии импедансные проточные цитометры могут быть легкими, портативными и работать на аккумуляторах, что позволяет использовать их непосредственно в месте взятия проб. Как импедансные проточные цитометры определяют разницу между клетками и другими частицами?
Импедансная проточная цитометрия использует уникальные электромагнитные свойства клеточной мембраны и цитоплазмы для отличия бактерий от других частиц. Мембрана и цитоплазма клетки влияют на электрическое поле способом, который отличается от других частиц в образце. Пример с использованием металлических (проводящих) частиц, непроводящих частиц и неповрежденных клеток может наиболее наглядно проиллюстрировать этот принцип. Независимо от частоты электрического поля, проводимость металлических частиц
проточная цитометрия выявляет бактерии
Бактерии (выделены красным цветом) другие частицы проходят через калиброванный
Микроэлектроды
Импедансная проточная
импедансная
подсчёта цитометра.
канал ячейки
14 Spot On Выпуск 15
в канале ячейки подсчёта, генерируют электрические поля на высоких и низких частотах.
позволит электрическому полю беспрепятственно
проходить через них. Напротив, непроводящие частицы, такие как полистирол, будут сопротивляться
электрическому полю; ток будет распространяться
только в жидкой среде, что приводит к измеримому
смещению объема, коррелирующему с частицами
в проточном канале. Однако интактные клетки
уникальны тем, что они напоминают как непроводящие, так и металлические частицы, в зависимости от частоты электрического поля. На низких частотах изолирующее качество мембраны клетки
препятствует проникновению в нее электрического
поля, что приводит к такому же смещению, как и в случае непроводящих частиц. Однако более высо -
кие частоты могут частично проникать через мембрану; таким образом, клетки подобны по проводимости металлическим частицам. Микроэлектроды
в импедансных проточных цитометрах генерируют
поля как на низких, так и на высоких частотах, что
позволяет устройству обнаруживать эти изменения
в проводимости и сопротивлении и соотносить их
в точных количествах либо к интактным клеткам, либо к другим частицам. Детектор идентифициру-
ет цель как бактерию на основе различной степе -
ни импеданса или проводимости на этих частотах.
Затем пользователь получает отдельные подсчеты
неповрежденных клеток и других частиц.
Как сравнить импедансную проточную
цитометрию с культуральными методами?
Методы культивирования, в частности использование агаровых пластин, являются традиционным подходом к мониторингу санитарных условий в пищевой промышленности.
Однако культуральные методы, хотя и хорошо зарекомендовавшие себя, имеют ряд недостатков, связанных с их скоростью и масштабом. Методы культивирования являются медленными, и бактериям требуется от одного до десяти дней, чтобы вырасти в подсчитываемые колонии. Эти методы измеряют только то, что можно культивировать в конкретных условиях данного тестового цикла; для
вида или другой группы бактерий может потребоваться определенный агар или жидкая среда при точной температуре, степени освещенности или влажности, и это лишь некоторые переменные. Культуральные методы также не могут претендовать на всестороннее измерение всех бактерий в образце. “Аномалия большого количества агаровых пластин”, загадка, хорошо известная в микробиологии, заключается в том, что только небольшая часть бактерий в среде обитания может быть восстановлена путем культивирования. Бактерии в жизнеспособном, но некультивируемом состоянии (VBNC) живы, но из-за стресса, особенностей или неоптимальных факторов окружающей среды не могут расти на агаре или в жидких средах. В некоторых случаях их можно культивировать после реанимации, что, опять же, отнимает много времени. Некоторые патогенные бактерии, такие как E. coli O157, как известно, переходят в состояние VBNC только для того, чтобы размножаться на более поздних стадиях пищевой цепи или в организме человека-хозяина
после приема внутрь. Кроме того, анаэробным и микроаэрофильным бактериям требуется отсутствие кислорода или уровни кислорода ниже, чем при нормальных атмосферных условиях, соответственно. Бактерии из
этих групп, которые можно культивировать, требуют особых условий инкубации, что увеличивает стоимость аналитических тестов.
Импедансные проточные цитометры подсчитывают все бактерии, проходящие через проточный канал, независимо от их состояния (культивируемые; жизнеспособные, но не поддающиеся культивированию VBNC; некультивируемые; спящие) или требований к росту. Такое прямое, немедленное количественное определение расширяет рамки программы гигиенического контроля; бактерии, которые не размножаются до тех пор, пока не вступят в контакт с пищей или потенциальными хозяевами, также могут быть целью с помощью импедансной проточной цитометрии. Это также позволяет принимать немедленные меры в тех случаях, когда очистка и дезинфекция идут не по плану.
Импедансный проточный
цитометр подсчитывает все бактерии, проходящие через проточный канал, независимо от их состояния (культивируемые; жизнеспособные, но не поддающиеся культивированию VBNC;
некультивируемые; спящие) или требований к росту.
Бактерии другие частицы изменяют электрическое поле, проходя между электродами.
Уникальный отпечаток пальца бактерий: электрическое поле может проникать через клеточную мембрану бактерий только на высоких частотах. На низких частотах, изолирующая способность мембраны предотвращает это.
Публикация Romer Labs ® 15
